WO2009157510A1 - 菌捕集担体カートリッジ、担体処理装置および菌の計測方法 - Google Patents

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WO2009157510A1
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bacteria
liquid
container
thermoplastic
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PCT/JP2009/061587
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野田　英之
雅弘 岡野定
内田　憲孝
範人 久野
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株式会社日立製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
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    • G01N1/2208—Devices for withdrawing samples in the gaseous state involving separation of sample components during sampling with impactors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N1/22—Devices for withdrawing samples in the gaseous state
    • G01N1/2273—Atmospheric sampling

Definitions

  • the present invention relates to a collection container for airborne bacteria, adherent bacteria, and falling bacteria, an apparatus using the container, and a bacteria counting method.
  • Bio clean rooms, pharmaceuticals, and food industry production lines require microbial monitoring for environmental management, counting airborne, falling, and adherent bacteria.
  • the measuring method is defined by ISO 14698-1 of the International Standard Organization for Biocontamination Management of Cleanrooms, and the cleanliness measured by this method is classified by grade.
  • a method for measuring airborne bacteria a method using an airborne bacteria sampler (see Patent Document 1) that naturally drops airborne bacteria or sucks a certain amount of air is generally used. In these methods, bacteria are collected on an agar plate medium within a certain time and expressed by the number of colonies generated after the culture. The agar medium is cultured in a thermostat for 2 to 7 days, and the number of colonies generated is visually counted.
  • the number of colonies in each medium is averaged to obtain the number of floating bacteria.
  • CPC cell culture facility
  • the number of bacteria is ⁇ 10 CFU (Colony Forming Unit) / m 3 (grade A (in the safety cabinet): ⁇ 1 CFU / m 3 , grade B (workplace around the safety cabinet): ⁇ 10 CFU / m 3 ).
  • ATP method in which luciferase and luciferin, which are luminescence reagents, are added to ATP (adenosine triphosphate) contained in a microorganism and the bioluminescence is measured.
  • Dust containing bacteria is collected on an agar medium held in a petri dish with an airborne bacteria sampler, and then developed into a solution system, and ATP is extracted from the bacteria by a reagent reaction.
  • the extracted ATP is measured by a bioluminescence method, and the amount of ATP is calculated from the obtained luminescence intensity. Since the amount of ATP and the number of bacteria are in a proportional relationship, the number of airborne bacteria can be calculated from the amount of ATP.
  • a general measurement flow of airborne bacteria using the ATP method is as follows. 1. 1. Collection of bacteria by airborne bacterial sampler 2. Collection of collected bacteria and development to solution system 3. Elimination of dead bacteria in bacterial solution and exogenous ATP not derived from bacteria 4. ATP extraction in live bacteria Bioluminescence, measurement, and counting by adding a luminescent reagent
  • An impactor-type sampler in the form of a porous nozzle is used, and dust contained in 1 mm 3 of air is collected on a flat plate medium in a petri dish in 10 to 20 minutes (see Non-Patent Document 1). The recovery rate of the bacteria is 90% or more. In a good clean room or safety cabinet with high cleanliness, it takes about 20 minutes to collect several bacteria.
  • the bacteria collected on the plate medium by collection are peeled off from the surface and collected as a liquid sample in a separately prepared container.
  • it is necessary to surely remove the bacteria trapped on the medium, and it is important to select the skill of the operator and the solution.
  • Non-Patent Document 3 For the above measurement flows 3 and 4, Development of reagents has progressed (see Non-Patent Document 3), and it has become possible to easily delete dead bacteria and foreign ATP and extract ATP in bacteria.
  • Non-Patent Document 1 the lower limit of detection of ATP is 1 ⁇ 10 ⁇ 17 mol (10 amol), which corresponds to a sensitivity of about 10 bacteria when converted to the number of bacteria.
  • Non-Patent Document 1 culture at 35 ° C. for 6 hours may be sandwiched between steps 1 and 2 of the measurement flow. Many ( Figure 9 of Non-Patent Document 1 (paper)).
  • a photomultiplier tube has been used as a photodetector of a microorganism counting device equipped with a luminometer for ATP measurement or a luminometer using ATP emission.
  • a single photon counting method photon counting method that digitally processes the signal of the photomultiplier tube is adopted.
  • the optical arrangement since the intensity of light is attenuated by the square of the distance from the light emitting point, it is said that the sample container containing the light emitting substance should be brought closer to the light receiving surface.
  • the light from the light emitting point diverges in a spherical shape, an optical arrangement for efficiently collecting it on the light receiving surface is important.
  • the light recovery efficiency is often defined by the solid angle. According to this, it is important to achieve high sensitivity by bringing the light receiving surface closer to the container and preparing a large light receiving surface for the light emitting area. It is. It is also effective to surround the container holder with a mirror member so that light is forcibly reflected by the mirror surface and guided to the light receiving surface.
  • the falling bacteria and adhered bacteria can be measured in the same process after the measurement flow 2.
  • the chemiluminescence detection device Since the chemiluminescence detection device has been made highly sensitive, it is possible to measure the amount of 1 amol of ATP, so that it can be detected in principle if several bacteria are present.
  • the collection of collected bacteria and deployment to solution systems are currently manual operations, and it is necessary to acquire the skill of the operator to collect all the bacteria, and the collection tool itself is contaminated. And lose the reliability and reproducibility of the results.
  • the culture-free ATP method which can confirm the cleanliness within one hour, can be applied to a bioclean room cleanliness monitor, the product shipping efficiency will be significantly improved, and the product stock The plant maintenance is not necessary and can be shipped on the same day.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and provides a structure of a bacteria-collecting carrier container and a carrier processing apparatus that can fully extract collected bacteria into a solution system with a high recovery rate.
  • the present invention provides a device and an apparatus that enable detection from one bacterium by an ATP method that requires no culture.
  • an upper lid having a plurality of through holes, a liquid storage tank portion having a filter on the bottom surface, a container having an air suction path, and a support base for installing a thermoplastic carrier such as gelatin prepare.
  • the upper lid, the container, and the support base are integrated, and the support base is sandwiched between the container and the upper lid.
  • the support base is installed in the liquid storage tank inside the container without being in contact with the upper lid and in contact with the filter on the bottom surface of the container.
  • These housings are hereinafter referred to as bacteria collection carrier cartridges.
  • a plurality of through holes in the upper lid of the bacteria collection carrier cartridge serve as an impactor nozzle that is a means for collecting floating bacteria together with air and a liquid supply dispensing nozzle introduction hole for supplying liquid to the liquid storage tank Use.
  • a thermoplastic carrier that causes a sol-gel phase transition in a temperature-dependent manner is placed on a support.
  • a carrier having a transition temperature of 37 ° C. is prepared.
  • a separate collector that sucks gas with a suction fan is prepared separately, and a collection carrier cartridge is installed on the head of the collector. Air is sucked through the suction path of the container portion of the collection carrier cartridge, and dust containing bacteria in the air is collected on the surface of the gel-like carrier by the principle of the impactor.
  • the carrier processing apparatus includes a liquid supply dispensing nozzle, a liquid supply mechanism, a liquid heating mechanism, and a filtration suction pump.
  • a liquid supply dispensing nozzle is inserted into the liquid supply dispensing nozzle introduction hole of the upper lid, and hot water ( ⁇ 37 ° C.) is supplied onto the filter. Stop the suction pump for filtration when supplying liquid.
  • Hot water supplied onto the filter is stored over time in the liquid storage tank. When hot water comes into contact with a carrier that undergoes a sol-gel phase transition at 37 ° C., the gel-like carrier changes to a sol state, and the sol-formed carrier can be mixed with hot water and handled as a liquid.
  • the suction pump of the filtration device When the carrier is made into a sol, mixed with hot water and diluted, the suction pump of the filtration device is driven, and the mixed liquid is suction filtered through the filter of the collection carrier cartridge.
  • a filter that does not allow bacteria to pass through and has a gap only bacteria are captured on the filter after suction filtration.
  • the polymer and dust that become the background of the luminescence reaction pass through the filter by filtration and are removed from the suction pump.
  • an ATP extract is added on the filter, and ATP molecules are extracted from the inside of the bacteria captured on the filter by filtration.
  • a dedicated chemiluminescence measuring device and a luciferin / luciferase luminescence reagent are prepared, and the ATP extract after the ATP extraction reaction is mixed with the luminescence reagent.
  • the amount of luminescence is measured with a chemiluminescence measuring device.
  • the ATP amount is calculated from the obtained luminescence intensity, and the number of bacteria is further calculated based on the ATP amount and counted.
  • the cartridge according to the present invention has the effect of exhibiting the collection performance equivalent to that of the collection carrier in the prior art by collecting airborne bacteria, falling bacteria, and adherent bacteria with a gel-like carrier.
  • the collection carrier can be phase-transformed into a sol, diluted as it is, and handled as a liquid mixed with warm water. The removal process by peeling using a liquid becomes unnecessary.
  • the sol formation 100% of the bacteria can be recovered in the liquid, and there is an effect that extremely high recovery efficiency is achieved by filtering the liquid component.
  • the bacterial suspension according to the present invention has a small liquid volume, the bacterial concentration is high and the bacterial utilization efficiency is also high.
  • the liquid volume becomes substantially zero, and the concentration and utilization efficiency of the bacteria are drastically increased.
  • the present invention has an effect that the measurement accuracy and sensitivity in the inspection of airborne bacteria, falling bacteria, and adherent bacteria are high, and results can be obtained easily and quickly.
  • FIG. 3 is a diagram (1) illustrating a configuration of a bacteria-collecting carrier cartridge according to Embodiment 1.
  • FIG. 3 is a diagram (2) showing the configuration of the bacteria collection carrier cartridge according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram (1) illustrating a structure of an upper lid according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram (2) illustrating the structure of the upper lid according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram (1) illustrating a structure of a carrier support base according to the first embodiment.
  • FIG. 3 is a diagram (2) illustrating a structure of a carrier support base according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram (3) illustrating a structure of a carrier support base according to the first embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram (1) illustrating an operation principle of a carrier processing apparatus according to a second embodiment.
  • FIG. 6B is a diagram (2) illustrating the operation principle of the carrier processing apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram (3) showing an operation principle of the carrier processing apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a diagram (4) showing an operation principle of the carrier processing apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram (5) illustrating an operation principle of the carrier processing apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 10 is a diagram (6) illustrating an operation principle of the carrier processing apparatus according to the second embodiment. It is a figure which shows the external appearance of the automatic microbe count apparatus by Embodiment 3.
  • FIG. 10 is a flowchart for explaining a procedure for measuring viable bacteria using the automatic bacterial count apparatus according to Embodiment 3. It is a figure which shows the ATP light emission curve with respect to the elapsed time obtained with the automatic microbe count apparatus by Embodiment 3.
  • FIG. 10 is a flowchart for explaining a procedure for measuring viable bacteria using the automatic bacterial count apparatus according to Embodiment 3. It is a figure which shows the ATP light emission curve with respect to the elapsed time obtained with
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between ATP concentration and luminescence intensity obtained by the apparatus for counting the number of bacteria according to Embodiment 3. It is a bacteria number dependence graph of the horizontal axis
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a bacteria collection carrier cartridge according to Embodiment 1.
  • FIG. 1A is a completed assembly diagram and a permeation diagram of the bacteria collection carrier cartridge 1 of the present invention.
  • FIG. 1B is shown in the form of an exploded view for easy explanation of the schematic configuration.
  • the bacteria collection carrier cartridge 1 includes an upper lid 2, a dispensing nozzle guide 5, a thermoplastic carrier 15, a carrier support 7, a liquid storage container 9, and an outer cylinder 10.
  • the upper lid 2 is formed with a first through hole 3 located on the same central axis as the dispensing nozzle guide 5 and a second through hole 4 for the impactor nozzle along the z axis.
  • the dispensing nozzle guide 5 is inserted into the third through hole 8 of the carrier support base 7 and has a structure that is suspended and fixed at the upper umbrella structure.
  • the dispensing nozzle guide 5 may be integrally formed with the carrier support base 7.
  • the thermoplastic carrier 15 for collecting bacteria is installed on the carrier support 7, is installed so as to cover the umbrella portion of the dispensing nozzle guide 5, and has a fifth through hole 14.
  • the second through-hole 4 has a carrier support 7 and a dispensing nozzle guide 5 attached thereto, and is placed on the carrier support 7 with a thermoplastic polymer that has been made into a sol form by applying heat, and has a temperature around room temperature. , Gel and harden. It is formed when gelling and solidifying on the carrier support base 7.
  • the thermoplastic carrier 15 may be formed in a donut shape by die cutting, and it may be fitted into the carrier support base 7 later.
  • the carrier support base 7 includes a plurality of fourth through holes 13 on a flat plate as well as the third through hole 8 into which the dispensing nozzle guide 5 is inserted at the center.
  • the liquid storage container 9 is a mortar-shaped or trumpet-shaped cup.
  • the bottom surface is an open shape, and a bacteria collection filter 11 is installed in the fifth through hole 14, and the bacteria collection filter 11 is fixed to the bottom of the liquid storage container 9 with a donut-shaped stop plate 12.
  • the Since the outer cylinder 10 is larger than the diameter of the liquid storage container 9, the gap 6 is formed between the outer cylinder 10 and the liquid storage container 9 after the bacteria collection carrier cartridge 1 is assembled as shown in FIG. 1A.
  • the liquid storage container 9 and the outer cylinder 10 are shown in an exploded manner (FIG. 1B). However, the liquid storage container 9 and the outer cylinder 10 may be connected by bridges arranged in several places. .
  • the gap 6 is used as an intake port through which air flows into the second through hole 4 for the impactor nozzle.
  • each part is preferably one that can be autoclaved from the viewpoint of sterilization before use, and polypropylene, polyether ketone ketone (PEEK), which is a resin material having a high melting point, and stainless steel and the like are suitable for metals.
  • PEEK polyether ketone ketone
  • FIG. 2 is a schematic view of the upper lid 2 as viewed from the xy plane.
  • the second through hole 4 of the impactor nozzle is single in FIG. 2A and porous in FIG. 2B.
  • the capacity of the suction fan of the collector is small, so the flow rate of each impactor nozzle can be increased by using the porous type in Fig. 2B due to the flow resistance. It is possible to increase the collection efficiency of floating bacteria.
  • the number of holes is 100 to 600, the hole diameter is 0.6 mm or less, and the interval between the holes is several mm.
  • the capacity of the suction fan can be increased. Therefore, it is preferable that the impactor nozzle of FIG.
  • the advantage of the single type of impactor nozzle is that bacteria can be collected in a narrow area, so that the bacteria collection carrier cartridge 1 can be designed and manufactured in a small size.
  • the outer diameter dimension of the bacteria collection carrier cartridge 1 may be about 10 mm.
  • the outer diameter dimension is used to arrange the number of holes. At least about 40 mm is required.
  • FIG. 3 is a schematic view of the carrier support 7 viewed from the xy plane.
  • a plurality of fourth through holes 13 are formed in a sector shape and a radial shape around the third through hole 8.
  • a plurality of circular fourth through holes 13 are formed at regular intervals in the center of the third through hole 8.
  • FIG. 3C shows the carrier support 7 using the mesh 18.
  • thermoplastic carrier 15 is installed on the carrier support 7.
  • the area of the support portion 17 of the carrier support 7 may be smaller. In that case, it is better to use the carrier support 7 of FIG. 3A.
  • the thermoplastic polymer is made into a sol, the liquefied carrier polymer passes through the fourth through hole and falls into the liquid storage container 9.
  • the amount of liquid that will remain on is reduced. In other words, the smaller the area of the support portion 17, the more efficiently the bacteria captured on the thermoplastic carrier 15 can be recovered in the liquid storage container 9.
  • FIG. 3C shows one of the forms that can be supported by the carrier support 7 even if the thermoplastic carrier 15 is relatively soft in a gel state. Since the area of the support portion is small, the amount of liquid remaining on the support portion 17 of the carrier support base 7 can be reduced.
  • the thermoplastic carrier 15 can be most stably supported, but the residual liquid amount on the carrier support 7 increases.
  • the surface of the carrier support 7 may be water-repellent.
  • the carrier support 7 is used as a prefilter for trapping dust other than the bacteria 19 (FIG. 4).
  • dust 20 is present on the thermoplastic carrier 15.
  • the size of the microbial cells is, for example, the carrier support 7 formed by the fourth through holes 13 having a size larger than 1 micron or about 10 times the size.
  • the thermoplastic carrier 15 is a polymer that changes from a gel to a sol state when heated to 30 ° C. or higher and is completely liquefied at 37 to 40 ° C., for example, gelatin, a mixture of gelatin and glycerol, and N-acryloyl.
  • a 10: 1 copolymer of glycinamide and N-methacryloyl-N'-biotinylpropylenediamine (MBPDA) is used.
  • thermoplastic carrier 15 When the thermoplastic carrier 15 is heated to 30 ° C. or higher, for example, 37 ° C., and the polymer liquid in a sol state is suction filtered, as shown in FIGS. 5 (A) and 5 (B), bacteria are collected from the thermoplastic carrier 15. Bacteria are collected on the filter 11.
  • the solification method of the thermoplastic carrier 15 will be described in the second embodiment using the carrier treatment apparatus of FIG. 6, but the fungus 19 is transformed into the fungus collection filter 11 by the mortar shape or the trumpet shape of the liquid storage container 9. It is collected in the upper narrow area and further concentrated.
  • the environment of the concentrated bacteria 19 is ideally zero in liquid amount, and the concentration of the bacteria can be freely controlled by controlling the amount of liquid added next.
  • the diameter of the effective surface of the bacteria collection filter 11 is about several millimeters to 10 millimeters, a liquid can be added at a level of several microliters to 100 microliters to produce a bacterial suspension in the liquid storage container 9.
  • concentration of the microbe 19 which collected 1 mm ⁇ 3 > (1000 liter) air with the collector is concentrated on the microbe collection filter 11 by 10,000 times to 100,000 times.
  • the bacteria collection filter 11 may be made of any material that allows the solution to pass therethrough but does not allow the bacteria to pass, and may be in either a HEPA (High Efficiency-Particulate Air) shape or a pore shape.
  • HEPA High Efficiency-Particulate Air
  • a pore shape For example, in consideration of the size of the bacteria, any material that does not allow passage of a substance of 0.45 microns or more may be used.
  • FIG. 6 is a diagram showing a schematic configuration of the carrier processing apparatus according to the second embodiment.
  • the carrier processing apparatus includes a liquid supply unit, a temperature control unit, and a filtration control unit, dissolves the thermoplastic carrier 15 in the bacteria collection carrier cartridge 1, filters and sucks it, and collects the bacteria on the bacteria collection filter 11. To do.
  • the steps of the entire apparatus are automatically and continuously controlled using the first control device 35.
  • the bacteria collection carrier cartridge 1 is set on the first plate member 21.
  • the plate of the first plate-like member 21 at the place where the bacteria-collecting carrier cartridge 1 is set is penetrated, and the bacteria liquid suction nozzle 31 is inserted into the bacteria-collecting carrier cartridge 1 via the first plate-like member 21. It can come into contact with the bottom.
  • a first dispensing nozzle 22 is located above the bacteria collection carrier cartridge 1 along the Z axis at the center of the first through-hole 3, and the first dispensing nozzle 22
  • the first nozzle holder 23 is fixed to the first actuator 26, and is fixed to the nozzle holder 23. Due to the movement of the first actuator 26, the first dispensing nozzle 22 can be introduced into the first through hole 3 of the bacteria collection carrier cartridge 1, passes through the dispensing nozzle guide 5, and passes through the bacteria collection filter. It can approach to just above 11.
  • the first dispensing nozzle 22 is connected to the first pipe 24, the second pipe 26, and the third pipe 28, and the third pipe nozzle 22 is connected to the third pipe 28 via the pipe heater 25 and the first liquid feed pump 27.
  • the liquid pipe 28 is accommodated in the first solution reservoir 29.
  • the first solution reservoir 29 is installed on the solution reservoir heater 30. Although it has been described that three pipes are interposed between the first dispensing nozzle 22 and the first solution reservoir 29, one pipe may be used. In this case, a peristaltic or diaphragm pump may be used as the first liquid feed pump 27.
  • the first liquid feed pump 27 may be a syringe pump that uses a syringe in addition to them.
  • the solution moves to the first pipe 24 without being heated to the set temperature while the liquid moves in the liquid feeding process.
  • a sheathed heater is used, a pipe is wound around the heater surface a plurality of times to heat a long pipe distance.
  • a silicon rubber heater is used, it is preferable to wrap the heater around the pipe for a long distance to heat the long pipe distance.
  • a plate-like resistance heating type, a Peltier element type, or the like is used as the solution reservoir heater 30 . The temperatures of the pipe heater 25 and the solution reservoir heater 30 are monitored by a temperature measuring device such as a thermocouple element, and are kept constant.
  • the fungus liquid suction nozzle 31 is located below the center z-axis of the fungus collection filter 11 of the fungus collection carrier cartridge 1 and is fixed to the second actuator 32.
  • the bacterial solution suction nozzle 31 comes into contact with the donut-shaped stop plate 12 that fixes the bacteria collection filter 11 of the bacteria collection carrier cartridge 1.
  • An O-ring rubber is attached to the tip of the fungus liquid suction nozzle 31, and comes into close contact with the doughnut-shaped stop plate 12, and a leak-free connection is obtained between the fungus collection filter 11.
  • the fungus liquid suction nozzle 31 is connected to a suction pump 34 such as an aspirator via a fourth pipe 33. ON / OFF control of the suction pump 34 and vertical movement of the second actuator 32 are controlled by the first controller 35.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the operation principle of the carrier processing apparatus (FIG. 6) according to the second embodiment.
  • the bacteria collection process using the collector has already been completed, and the bacteria 19 are captured on the thermoplastic carrier 15.
  • a process of installing the bacteria collection carrier cartridge 1 in the processing apparatus of FIG. 6 and collecting the bacteria on the bacteria collection carrier filter 11 will be described.
  • the upper lid 2 is omitted for the sake of simplicity.
  • the thermoplastic carrier 15 used here is gelatin and is solated at 37 ° C., that is, changes from solid to liquid.
  • FIG. 7A shows that the first actuator 26 is driven in response to the processing start instruction given from the first control device 35, and the first dispensing nozzle 22 is the dispensing nozzle of the bacteria collection carrier cartridge 1.
  • a state is shown in which the guide 5 is approached to the bacteria collection filter 11 in the liquid storage container 9.
  • the heated solution 37 supplied from the first solution reservoir 29 has just been dispensed from the first dispensing nozzle 22.
  • the heating solution 37 it is preferable to use a phosphate buffer or sterilized water.
  • a phosphate buffer at 40 ° C. was used.
  • this temperature of 40 ° C. is a result of preliminary measurement in the liquid storage container 9.
  • the pre-stage pipe heater 25 is set to a temperature of 80 ° C., and is stored when supplied from the first dispensing nozzle 22 to the liquid storage container 9 at a flow rate of 1 mL / min while fluctuating in the range of 45 to 50 ° C. It is an average temperature measured in the container 9.
  • the pipe heater 25 is used for heating the solution, but the pipe heater 25 and the solution reservoir heater 30 may be used together or the solution reservoir heater 30 may be used alone.
  • FIG. 7B shows a situation in which dispensing has started and 5 minutes have elapsed.
  • the internal volume sandwiched between the bacteria collection filter 11 and the carrier support 7 of the liquid storage container 9 is 5 mL, and the state of FIG. 7B is where the thermoplastic carrier 15 has just started to contact the heated solution 37.
  • FIG. 7C shows a state where further dispensing is continued, about 7 mL of the heated solution 37 is supplied into the liquid storage container 9, and the supply is further stopped. Furthermore, in FIG. 7C, the polymer of the thermoplastic carrier undergoes sol transition, and shows the initial state of liquefaction. FIG. 7D shows that after a few minutes, the polymer of the thermoplastic carrier has completely liquefied and a mixed liquid 38 of heated liquid and polymer is formed. The bacterium 19 is suspended and a microbial suspension is formed.
  • the thermoplastic carrier is sol-transferred by the heated solution from the dispensing nozzle.
  • the sol-transfer may be performed by heating the carrier support.
  • FIG. 7E shows a state immediately before the fungus liquid suction nozzle 31 is raised, the donut-shaped stopper plate 12 and the O-ring 36 on the fungus liquid suction nozzle 31 are in close contact, and suction is started. Such close contact may be performed in any of the steps of FIGS. 7A to 7D.
  • FIG. 7F shows a situation in which the suction pump 34 is activated, the heated liquid / polymer mixed liquid 38 is drained through the bacteria collection filter 11, and the draining is finished.
  • the bacteria 19 captured on the thermoplastic carrier 15 can be collected on the bacteria collection carrier filter 11.
  • the heated solution 37 is supplied and the heated liquid and polymer mixed liquid 38 is discharged once by suction, but the fungus 19 is collected on the fungus collecting filter 11 by repeating a plurality of times. May be. By repeating the process a plurality of times, impurities on the bacteria collection filter 11 and solid residues of gelatin as the thermoplastic carrier 15 can be further liquefied and removed while warming on the filter.
  • the feature of the carrier treatment apparatus of the present invention is that the heated liquid 37 is supplied onto the bacteria collection filter 11, and the thermoplastic carrier 15 can be liquefied and filtered from a position close to the filter. Thereby, the temperature on the bacteria collection filter 11 can be kept high, and furthermore, the concentration of the thermoplastic polymer on the bacteria collection filter 11 can be controlled by low concentration by dilution with the heating solution 37. This is convenient as a means for preventing clogging of the bacteria collection filter 11.
  • the airflow 75 generated by the suction of the collector 74 shown in FIG. 14 passes through the second through hole 4, passes through the gap 6, and is exhausted through the exhaust port of the collector 74.
  • the bacteria 19 deviating from the air flow 75 are captured on the surface of the thermoplastic carrier 15.
  • the distance between the upper lid 2 and the thermoplastic carrier 15 is 1: 1 or 1: 2 with respect to the diameter of the second through hole 4.
  • the collection rate increases more at the ratio interval.
  • thermoplastic carrier 15 of the bacteria collection carrier cartridge 1 may be used as a sol transfer method. In that case, it is necessary to remove the upper lid 2.
  • FIG. 8 is a schematic configuration diagram of an automatic bacterial count measuring device 60 in which the mechanism unit and the chemiluminescence measuring mechanism unit of the carrier processing apparatus according to the second embodiment are systemized.
  • a mechanism that can automatically process from ATP extraction of bacteria 19 to luminescence measurement is added, and is proportional to the number of bacteria 19 collected in the bacteria collection carrier cartridge 1.
  • the amount of ATP measured is a device that measures luminescence and calculates the number of bacteria 19. Since the carrier processing mechanism is as described in the second embodiment, the description thereof is omitted here.
  • the chemiluminescence measurement mechanism will be described.
  • the ATP measurement container 70 is set in the first container holder 39.
  • the first container holder 39 is installed on the second plate member 40.
  • the photodetector 41 can be moved in the z-axis direction by the third actuator 42.
  • the centers of the ATP measurement container 70, the first container holder 39, and the photodetector 41 are aligned so as to be on the same axis in the z-axis direction.
  • the photodetector 41 is preferably a photomultiplier tube (PMT) in terms of sensitivity.
  • PMT photomultiplier tube
  • sensitivity as high as that of PMT is not necessary, and semiconductor elements such as photodiodes may be used when a reduction in device cost is important.
  • PMT photomultiplier tube
  • the movement of the z-axis position by the third actuator 42 is used to control the detection sensitivity. Since the intensity of light is attenuated by the square of the distance from the light emitting point, it is preferable to bring the sample container containing the light emitting substance closer to the light receiving surface. However, when measuring a measurement target having a high ATP concentration, it is also effective to widen the detection upper limit in a form in which the detector is moved away, and this automatic bacterial count measurement apparatus makes it possible.
  • the liquid operation unit used for the luminescence measurement includes the second dispensing nozzle 43, the second liquid feed pump 44, and the second dispensing liquid serving as a liquid outlet when dispensing the liquid containing ATP into the ATP measurement container 70.
  • the fifth pipe 45 connecting the injection nozzle 43 and the second dispensing nozzle 43 are fixed, and the second nozzle holder 46 includes the second dispensing nozzle 43 and the fifth pipe 45.
  • the position of the second dispensing nozzle 43 can be controlled by the fourth actuator 47 in the z-axis direction. Further, the fourth actuator 47 and the third actuator as means for carrying out the carrier processing are attached to the fifth actuator, and the position can be controlled also in the y-axis direction.
  • a tube installation holder 49 capable of installing a plurality of sets (three sets in this case) of solution reservoir tubes is installed, and the first reagent tube 50, the second reagent tube 51, the first In the third reagent tube 52, an ATP elimination reagent, an ATP extraction reagent, an ATP luminescence reagent, and the like are introduced. These reagents are dispensed using the second dispensing nozzle 43 and dispensed into the bacteria collection carrier cartridge 1 and the ATP measurement container 70.
  • All the processes of the automatic bacterial count measuring device 60 are continuously and automatically controlled using the second control device 53.
  • an ATP measurement container 70, a first reagent tube 50 containing an ATP erasing reagent, a second reagent tube 51 containing an ATP extraction reagent, and a third reagent tube 52 containing an ATP luminescent reagent are placed in a tube installation holder. 49 (S901).
  • the bacteria collection carrier cartridge 1 is attached to a trap for collecting floating bacteria, and the bacteria collection carrier cartridge 1 that collects the bacteria 19 or the bacteria collection carrier cartridge 1 that collects the falling bacteria, or The bacteria collection carrier cartridge 1 that collects the attached bacteria is placed on the second plate member 40 (S902).
  • the inside of the automatic bacteria count device 60 is a light-shielded housing for light emission measurement.
  • the light shielding door 72 is removed through a window 71 attached to the apparatus. Or it installs using the drawer 73 which can draw out the 2nd plate-shaped member 40 (FIG. 13).
  • the inside of the device is shielded from light.
  • the first dispensing nozzle 22 In response to the processing start instruction given from the second control device 35, first, the first dispensing nozzle 22 reaches just above the bacteria collection filter 11 in the liquid storage container 9 of the bacteria collection carrier cartridge 1. It moves and dispenses the heated solution 37 supplied from the first solution reservoir 29 (S903). The dispensing amount can be set arbitrarily. After completion of the dispensing, a waiting time for the liquefaction reaction of the thermoplastic carrier 15 is passed (S904), and the mixed liquid 38 of the heated liquid and the polymer is suction filtered through the bacteria collection filter 11 by the bacteria suction nozzle 31. (S905). When the steps S903 to S905 are completed, the bacteria 19 are collected on the bacteria collection carrier filter 11.
  • a step for measuring the amount of ATP in the living bacteria is performed.
  • the second dispensing nozzle 43 dispenses the ATP erasing reagent, and dispenses the dispensed ATP erasing reagent onto the bacteria collection filter 11 (S906).
  • the ATP extraction reagent is separated from the second reagent tube 51 by the second dispensing nozzle 43, and the separated ATP extraction reagent is placed on the bacteria collection filter 11. (S910), and ATP is extracted from the bacteria.
  • the ATP luminescence reagent is dispensed from the third reagent tube 52 by the second dispensing nozzle 43, and the dispensed ATP luminescence reagent is dispensed into the ATP measurement container 70 ( S908), background measurement of the luminescent reagent is started (S909). After 30 seconds to 1 minute, which is the waiting time for the ATP extraction reaction (S911), the ATP extraction is introduced into the liquid storage container 9 of the bacteria collection carrier cartridge 1 by the second dispensing nozzle 43 and reacted with the bacteria 19.
  • the reagent is dispensed, the dispensed ATP extraction reagent is dispensed into the ATP measurement container 70 (S912), and the biochemiluminescence of ATP is measured (S913).
  • the number of bacteria is calculated from the measured ATP emission intensity (S914).
  • FIG. 10 is a typical example of the ATP emission time curve graph 54 in which the horizontal axis represents the measurement time and the vertical axis represents the number of photons per unit second (Count Per Second: CPS).
  • CPS Counter Per Second
  • the background signal 55 before dispensing the luminescent reagent is acquired for 100 seconds, and then the ATP emission signal 56 for 250 seconds is acquired 100 seconds later.
  • a flash type (high sensitivity type) luminescent reagent having a peak value 57 in signal intensity in a few seconds is used.
  • FIG. 11 is a calibration curve graph 58 in which the difference between the peak value 57 of FIG. 10 and the value of the background signal 55 is digitized and plotted for each concentration.
  • the calibration curve is linear from a very low concentration of 1 amol to 100000 amol, that is, a quantitative intensity change is obtained.
  • the number of bacteria can be calculated from the calibration curve graph 58, and the data can be automatically output (S911). It can be calculated because the amount of ATP contained by the bacteria is determined.
  • Bacillus subtilis is 17 amol / bacteria
  • Staphylococcus aureus is 1.52 amol / bacteria
  • Escherichia coli is 1-2 amol / bacteria.
  • FIG. 12 is a result of confirming detection sensitivity and detection accuracy in E. coli using a suspension obtained by diluting a standard strain (Easy QA Ball E. coli 10,000 cfu of Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) with pure water as a model sample. .
  • the number of bacteria is controlled by spotting the suspension on the thermoplastic carrier 15 of the bacteria-collecting carrier cartridge 1 and changing the amount of spotting.
  • the luminescence is plotted with the number of bacteria on the horizontal axis and the emission intensity on the vertical axis. It is a microbe number dependence graph 59 of intensity
  • the ATP amount per CFU of 1 to 5 CFU was 0.6, 2.7, 2.9, 5.7, and 8.3 (ATP: 12 CPS / amol). That is, the average was 1.2 amol per CFU.
  • the catalog value of the standard strain is 1.5 amol / CFU, and the broken line in FIG. 12 is an ideal calibration curve when created based on the catalog value. The experimental results agree with the values of the ideal calibration curve, indicating that measurement with high reliability and accuracy is possible. It also shows that it is a highly sensitive device that can measure from 1 CFU.
  • SYMBOLS 1 Bacteria collection carrier cartridge, 2 ... Top cover, 3 ... 1st through-hole, 4 ... 2nd through-hole, 5 ... Dispensing nozzle guide, 6 ... Gap, 7 ... Carrier support stand, 8 ... 3rd Through hole, 9 ... Liquid storage container, 10 ... Outer cylinder, 11 ... Bacteria collection filter, 12 ... Donut shaped stop plate, 13 ... Fourth through hole, 14 ... Fifth through hole, 15 ... Thermoplastic carrier , 17 ... support part, 18 ... mesh, 19 ... bacteria, 20 ... dust, 21 ... first plate-like member, 22 ... first dispensing nozzle, 23 ... first nozzle holder, 24 ...

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Abstract

　担体に捕集した菌を効率よく溶液化し、フィルタ上で濃縮する際の菌の回収量のばらつきを防止するディスポーザブルな菌捕集担体カートリッジと担体処理装置を提供する。複数の貫通孔を有する上蓋と、フィルタを底面に持つ液体貯蔵槽部と空気吸引路を併せ持つすり鉢状の容器と、ゼラチン等の熱可塑性担体を設置するための支持台とで構成されたカートリッジと、液体供給用分注ノズルと液体供給機構、液体加熱機構、ろ過用吸引ポンプで構成される担体処理装置を用意する。すり鉢状容器の底面に設置されたフィルタ上に温水を供給し、液体貯蔵槽に蓄えることで担体を温水と接触させる。温水との接触により担体はゾル化し、温水と混合され、希釈されたところで、ろ過装置の吸引ポンプを駆動させ、フィルタを介して混合液体を吸引ろ過する。

Description

菌捕集担体カートリッジ、担体処理装置および菌の計測方法
　本発明は、空中浮遊菌、付着菌、落下菌の捕集容器、ならびにこの容器を用いた装置および菌計数法に関する。
　バイオクリーンルーム、製薬、食品工業の生産ラインでは、環境管理のための微生物モニタリングが必要で、空中浮遊菌、落下菌、付着菌を計数する。測定方法は、クリーンルームの生物汚染管理の国際標準化機構ISO14698-1で定められており、該手法により測定された清浄度は、グレードで分類される。空中浮遊菌の測定方法は、浮遊菌の自然落下や一定量の空気を吸引する空中浮遊細菌サンプラ（特許文献１参照）を利用したものが一般的に用いられている。これらの方法では、寒天平板培地上に一定時間内に菌を補集し、培養後発生したコロニー数をもって表わすものである。上記寒天培地を恒温機中にて２～７日間培養し、発生したコロニー数を目視で数える。そして、各培地のコロニー数を平均して浮遊菌数とする。なお、クリーンルームにおいて高い清浄度が要求される無菌医薬品の製造施設や細胞を生産する細胞培養施設（CPC）では、上述したグレード分類において、グレードAやグレードBを常時保ち管理する必要がある。これは、空中の微粒子数で、≦３，５３０個／ｍ３、菌数で、≦１０ＣＦＵ（Colony Forming Unit）／ｍ３に値する（グレードＡ（安全キャビネット内）：≦１ＣＦＵ／ｍ３、グレードＢ（安全キャビネット周辺作業場）：≦１０ＣＦＵ／ｍ３）、である。
　一方、微生物中に含まれるＡＴＰ（アデノシン３リン酸）に、発光試薬であるルシフェラーゼ及びルシフェリンを添加して、その生物発光を測定する方法（ＡＴＰ法）がある。空中浮遊菌サンプラでシャーレ内に保持された寒天培地に菌を含む塵埃を回収し、その後、溶液系に展開し、試薬反応で菌中からＡＴＰを抽出する。抽出したＡＴＰを生物発光法で測定し、得られた発光強度からＡＴＰ量を算出する。ＡＴＰ量と菌数は比例関係にあるので、ＡＴＰ量から空中浮遊菌数を算出できる。
　ＡＴＰ法を用いた空中浮遊菌の一般的な計測フローは以下のとおりである。
１．空中浮遊細菌サンプラによる菌の集菌
２．採取した菌の回収、溶液系への展開
３．菌液中の死菌消去と菌由来ではない外来のＡＴＰ消去
４．生菌中のＡＴＰ抽出
５．発光試薬添加による生物発光、測定、計数
　上記計測フロー1について、
　多孔ノズル形態のインパクタ方式サンプラが用いられ、１０～２０分で空気１ｍｍ３に含まれる塵埃をシャーレ内の平板培地上に回収する（非特許文献１参照）。菌の回収率は９０％以上である。清浄度の高い良好なクリーンルームや安全キャビネット内では、２０分ほどの時間をかけて、数個の菌を集める。
　上記計測フロー２について、
　捕集により平板培地上に採取された菌を、表面から剥離させて、別に用意した容器に液体サンプルとして回収する。菌を全量回収するには、培地上に捕捉された菌の取り出しを確実に行う必要があり、作業者のスキルと溶液の選定が重要である。また、ここで、回収するツール自身が汚染していると正確な計数ができなくなってしまうという課題がある。
　上記計測フロー３、４について、
　試薬の開発が進み（非特許文献３参照）、簡便に死菌と外来ＡＴＰの消去、菌中ＡＴＰの抽出が行なえるようになった。アピラーゼとアデノシンリン酸デアミナーゼを主成分とするＡＴＰ消去試薬を測定対象の液体サンプルに加え、３０分反応させ、その後、界面活性剤を主成分とするＡＴＰ抽出試薬を加え、３０～６０秒反応させる。これにより、生菌由来のＡＴＰのみを測定する準備が整う。
　上記計測フロー５について、
　発光試薬を生菌由来のＡＴＰを抽出した後の抽出液に添加、もしくは生菌由来のＡＴＰを抽出した後の抽出液を回収して、発光試薬に添加、混合することによる生物化学発光を光検出器で検出する。菌数はＡＴＰ量に比例するので、ＡＴＰ発光量から菌数を算出する。
　ＡＴＰ発光測定において、ＡＴＰ発光を高い感度でかつ高い精度で測定するためには、高感度な検出器を用いること及び検出器と発光反応場との光学配置による高い集光を実現することが重要である。さらに、装置外や発光物質以外からの光、いわゆる迷光が、装置内へ侵入すると測光精度が低下するので、迷光の侵入を極力抑止させる遮光機構を実現することが重要である。非特許文献１（論文）の図２によると、ＡＴＰの検出下限は１×１０－１７ｍｏｌ（１０ａｍｏｌ）であり、菌数に換算すると、ほぼ１０菌程度の感度に相当する。空中浮遊菌を対象にすると、１個の菌から測定できる検出感度が要求されるため、非特許文献１では、３５℃、６時間の培養を上記計測フローの１と２の工程に挟む場合が多い（非特許文献１（論文）の図９）。
　最近では、分注機と検出器を同一装置内の遮光された空間に配置した生物発光検出システムで、ＡＴＰ量を1ａｍｏｌから計測できるようになった（非特許文献２（論文）の図３）。
　高感度検出器に関しては、従来から、光電子増倍管が、ＡＴＰ測定用のルミノメータやＡＴＰ発光を利用したルミノメータを具備した微生物計数装置の光検出器として用いられている。さらなる高感度仕様の場合には、光電子増倍管の信号をデジタル処理する単一光子計数法（フォトンカウンティング法）が採用される。次に、光学配置に関しては、光の強度は発光点からの距離の２乗で減衰するため、発光物質を含む試料容器を受光面に近づけるのが良いとされている。また、発光点からの光は球状に発散するため、受光面へ効率よく回収するための光学配置が重要となる。なお、光の回収効率は立体角でしばしば定義されるが、それによれば、受光面を容器に近づけること、発光エリアに対して大きな受光面を用意することが高感度化を実現する上で重要である。また、強制的に光を鏡面で反射させて、受光面に誘導するように容器ホルダを鏡面部材で取り囲むことも有効である。
　なお、計測フロー２、３、４の順番は順不同で、３、４を先に行い、それから２でＡＴＰ抽出済みの菌液を回収する実施形態もある。
　また、計測フロー１で落下菌や付着菌を、専用の担体で捕集すれば、計測フロー２以降は同じ工程で、落下菌、付着菌の測定が可能である。
特開２０００－３００２４６号公報 特開２０００－３１４７３８号公報 特開平７－８３８３１号公報
空気清浄第３８巻第５号　pp.２１-２６,２０００ 第２６回空気清浄とコンタミネーション研究大会予稿集　pp.２４０-２４２,２００８ Nippon Nogeikagaku Kaishi Vol.78,No.7,pp.630-635,2004
　化学発光検出装置の高感度化により、１ａｍｏｌのＡＴＰ量を計測できるようになったため、数個の菌が存在すれば原理的には検出できる。しかしながら、採取した菌の回収、溶液系への展開では、現状、マニュアル操作であり、菌を全量回収するには作業者のスキル習得が必要であり、また、回収するツール自体が汚染されていると、結果の信頼性・再現性を失う。短時間培養を行なうことで菌数を１０倍程度増殖させてから計測する方法もあるが、菌種の違いや培地の栄養条件下で菌の増殖率は変わるため、正確な計数は困難である。工業的価値の面からは、従来の培養法と異なり、１時間以内で清浄度を確認できる培養不要のＡＴＰ法をバイオクリーンルーム清浄度モニタに適用できれば、商品の出荷効率が著しく向上し、商品ストック用のプラント整備が不要となり、即日出荷できるようになる。
　本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、採取した菌を高い回収率をもって全自動で溶液系へ展開することができる菌捕集担体容器の構成および担体処理装置を提供する。特に、培養不要なＡＴＰ法による菌の計数方法で、1菌からの検出を可能とするデバイスおよび装置を提供する。
　上記課題を解決するために、複数の貫通孔を有する上蓋と、フィルタを底面に持つ液体貯蔵槽部と空気吸引路を併せ持つ容器と、ゼラチン等の熱可塑性担体を設置するための支持台とを用意する。上蓋、容器、支持台は一体化されたもので、支持台は容器と上蓋の間に挟まれた構成とする。支持台は上蓋と接することなく、また、容器底面のフィルタとも接しない配置で容器内部の液体貯蔵槽部に設置される。これらのハウジングを以下、菌捕集担体カートリッジと記述する。
　菌捕集担体カートリッジの上蓋の複数の貫通孔は、浮遊菌を空気とともに通過させて捕集する手段であるインパクタノズルと液体貯蔵槽に液体を供給するための液体供給用分注ノズル導入孔として利用する。支持台上に温度依存的にゾルーゲル相転移を起こす熱可塑性担体を設置する。ここで、例えば３７℃を転移温度とする担体を用意する。
　吸引ファンで気体を吸込む捕集機を別途用意し、捕集担体カートリッジを捕集機のヘッドに設置する。捕集担体カートリッジの容器部の吸引路を介して空気を吸引し、インパクタの原理で空気中の菌を含む塵埃をゲル状の担体表面に集菌する。
　塵埃捕集が終了した後、カートリッジを捕集機から取外し、担体処理装置に設置する。担体処理装置は液体供給用分注ノズルと液体供給機構、液体加熱機構、ろ過用吸引ポンプで構成される。上蓋の液体供給用分注ノズル導入孔に、液体供給用分注ノズルを挿入し、フィルタ上に温水（≧３７℃）を供給する。液体供給時はろ過用吸引ポンプを停止しておく。フィルタ上に供給される温水は液体貯蔵槽に時間とともに蓄えられる。３７℃でゾルーゲル相転移が起こる担体に温水が接触することで、ゲル状の担体はゾル状態へと変化し、ゾル化した担体は温水と混ざり、液体として扱うことができるようになる。担体がゾル化し、温水と混合され、希釈されたところで、ろ過装置の吸引ポンプを駆動させ、捕集担体カートリッジのフィルタを介して混合液体を吸引ろ過する。細菌が通過しない形状、隙間を有するフィルタを用いることで、吸引ろ過後、菌のみがフィルタ上に捕獲される。発光反応のバックグラウンドとなる高分子やダストはろ過により、フィルタを通過し、吸引ポンプより排除される。
　次に、フィルタ上にＡＴＰ抽出液を加え、ろ過によりフィルタ上に捕獲された菌の内部からＡＴＰ分子を抽出する。抽出後、専用の化学発光測定装置とルシフェリン・ルシフェラーゼの発光試薬を用意し、ＡＴＰ抽出反応を終えた該ＡＴＰ抽出液を発光試薬と混合する。化学発光計測装置により発光量を計測する。得られた発光強度からＡＴＰ量を、さらにＡＴＰ量をもとに菌数を算出し、計数する。
　さらなる本発明の特徴は、以下本発明を実施するための最良の形態および添付図面によって明らかになるものである。
　本発明によるカートリッジは、第１に、ゲル状の担体で空中浮遊菌、落下菌、付着菌を集菌することにより、従来技術における捕集担体と同等の捕集性能を発揮できる効果がある。第２に、捕集担体をゾル状に相転移させ、そのまま希釈し、捕集担体を温水と混合した液体として取り扱うことができるため、この工程において菌懸濁液となり、培地という固体表面からの液体を用いた剥離による取出し工程が不要となる。ゾル化により、液体中に菌を１００％回収でき、液体成分をろ過することで、極めて高い回収効率が達成される、という効果がある。また煩雑な取出し工程を加温液体の添加という単純な工程に置きかえることが可能となり、自動化、システム構成の簡略化、迅速化、再現性向上、汚染リスク低減などの効果がある。
　本発明による菌懸濁液は液量が少ないため、菌の濃度が高く、菌の利用効率も高い。また菌懸濁液をろ過等して菌懸濁液中の菌をフィルタ上に捕捉することにより、液量を実質的にゼロとし、菌の濃度や利用効率が飛躍的に高くなる効果がある。また水溶性や粒径の小さい夾雑物の影響を排除でき、信頼性が高い効果がある。つまり菌の計測を高感度、高精度かつ自動的に行える利点がある。
　従って、本発明は空中浮遊菌、落下菌、付着菌検査における測定精度と感度が高く、簡便迅速に結果が得られる、という効果がある。
実施の形態１による菌捕集担体カートリッジの構成を示す図（１）である。 実施の形態１による菌捕集担体カートリッジの構成を示す図（２）である。 実施の形態１による上蓋の構造を示す図（１）である。 実施の形態１による上蓋の構造を示す図（２）である。 実施の形態１による担体支持台の構造を示す図（１）である。 実施の形態１による担体支持台の構造を示す図（２）である。 実施の形態１による担体支持台の構造を示す図（３）である。 実施の形態１による担体支持台７をプレフィルタとして利用した模式図である。 実施の形態１による熱可塑性担体上の菌を菌捕集フィルタ上に集菌する様子を示す模式図（１）である。 実施の形態１による熱可塑性担体上の菌を菌捕集フィルタ上に集菌する様子を示す模式図（２）である。 実施の形態２による担体処理装置の外観を示す図である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（１）である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（２）である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（３）である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（４）である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（５）である。 実施の形態２による担体処理装置の動作原理を示す図（６）である。 実施の形態３による自動菌数計測装置の外観を示す図である。 実施の形態３による自動菌数計測装置を用いて生菌を測定する手順を説明するためのフローチャートである。 実施の形態３による自動菌数計測装置で得られた経過時間に対するATP発光曲線を示す図である。 実施の形態３による動菌数計測装置で得られたATP濃度と発光強度の関係を示すグラフである。 実施の形態３による自動菌数計測装置で測定した横軸菌数、縦軸発光強度の菌数依存性グラフである。 実施の形態３による自動菌数計測装置に捕集担体カートリッジを設置する様子を示す模式図（１）である。 実施の形態３による自動菌数計測装置に捕集担体カートリッジを設置する様子を示す模式図（２）である。 実施の形態２による捕集担体カートリッジを捕集機に設置して使用する様子を示し、インパクタの原理を示す模式図（１）である。 実施の形態２による捕集担体カートリッジを捕集機に設置して使用する様子を示し、インパクタの原理を示す模式図（２）である。
　以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
　（実施の形態１）
　図１は、実施の形態１に係る菌捕集担体カートリッジの概略構成を示す図である。図１Ａは本発明の菌捕集担体カートリッジ１の組立完成図とその透過図である。図１Ｂは概略構成の説明を容易にするため、分解図の形態で図示したものである。菌捕集担体カートリッジ１は、上蓋２、分注ノズルガイド５、熱可塑性担体１５、担体支持台７、液体貯蔵容器９、外筒１０で構成される。
　上蓋２には、分注ノズルガイド５と同じ中心軸上に位置する第１の貫通孔３とインパクタノズル用の第２の貫通孔４がｚ軸に沿って形成されている。
　分注ノズルガイド５は、担体支持台７の第３の貫通孔８に挿入されるもので、上部の傘構造の部分でぶら下がり固定される構造となっている。ここで、分注ノズルガイド５は担体支持台７と一体成型されたものでも良い。
　菌を集菌する熱可塑性担体１５は、担体支持台７の上に設置され、分注ノズルガイド５の傘部分を覆うように設置され、第５の貫通孔１４を有している。第２の貫通孔４は、担体支持台７と分注ノズルガイド５を取り付けた状態で、熱を加えてゾル化状態にした熱可塑性ポリマーを担体支持台７上に載せて、室温付近に温度を下げ、ゲル化して固める。担体支持台７上でゲル化して固める際に形成されるものである。もちろん、熱可塑性担体１５をドーナツ状に型抜きにより形成し、それを後から、担体支持台７に嵌めこんでも良い。
　担体支持台７は、中心に分注ノズルガイド５を挿入する第３の貫通孔８だけでなく、平板上に複数の第４の貫通孔１３で構成されている。液体貯蔵容器９は、すり鉢形状またはラッパ形状のカップである。底面は開放形となっており、その第５の貫通孔１４には、菌捕集フィルタ１１を設置し、菌捕集フィルタ１１はドーナツ状の止め板１２で液体貯蔵容器９の底部に固定される。外筒１０は、液体貯蔵容器９の直径よりも大きいため、図１Ａのように菌捕集担体カートリッジ１組立て後には、ギャップ６が外筒１０と液体貯蔵容器９の間に形成される。説明上、液体貯蔵容器９と外筒１０を分解して図示しているが（図1Ｂ）、液体貯蔵容器９と外筒１０は、数箇所に這わせたブリッジで連結されるようにするとよい。ギャップ６は、インパクタノズル用の第２の貫通孔４内に空気を流入する吸気口として使用する。
　各部の材質は、使用前の滅菌処理の観点からオートクレーブ可能であるものが良く、融点の高い樹脂材料であるポリプロピレン、ポリエーテルケトンケトン（ＰＥＥＫ）、さらに金属では、ステンレス等が好適である。ディスポーザブルの面では、ポリプロピレン、ＰＥＥＫ材が好適である。
　上蓋２、分注ノズルガイド５、支持台７、液体貯蔵容器９と外筒１０のそれぞれを別々に製作した後、手作業で各部材を装着する製作方法でも良いが、射出成型を用いて、可能なかぎり一体成型で製作するのが好ましい。
　図２は、上蓋２をｘ-ｙ平面から見た模式図である。インパクタノズルの第２の貫通孔４が、図２Ａでは単一であり、図２Ｂは多孔である。持ち運び可能なポータブルタイプの捕集機を用いる場合、捕集機の吸引ファンの容量が小さいため、流路抵抗上、図２Ｂの多孔型を用いた方が各インパクタノズルの流速を早めることができ、浮遊菌の捕集効率を高めることができる。孔の数は、１００から６００個、孔径は０．６ｍｍ以下、孔の間隔は数ｍｍで配列されるのが一般的である。大きさに制限のない設置型の捕集機を用いる場合では、吸引ファンの容量を大きくできるため、図２Ａのインパクタノズルが単一型の上蓋２を用いるのが良い。インパクタノズルの単一型の利点は、狭い領域に菌を集めることができるため、菌捕集担体カートリッジ１を小さく設計および製作できる。例えば、図２Ａの上蓋を用いる場合、菌捕集担体カートリッジ１の外径寸法は１０ｍｍ程度でもかまわないが、図２Ｂの上蓋を用いる場合では、外径寸法は上記の孔数を配列するために、最低でも４０ｍｍ程度は必要となる。
　図３は、担体支持台７をｘ-ｙ平面から見た模式図である。図３Ａでは、第３の貫通孔８を中心に複数の第４の貫通孔１３が扇形形状で放射状に形成されている。図３Ｂでは、第３の貫通孔８の中心に円形の複数の第４の貫通孔１３が一定間隔で複数形成されている。図３Ｃは、メッシュ１８を利用した担体支持台７である。
　担体支持台７上には、熱可塑性担体１５が設置される。熱可塑性担体１５の硬度によって、図３Ａ、Ｂ、Ｃの形態を使い分けるのが良い。熱可塑性担体１５がゲル状態で硬いほど、担体支持台７の支持部１７の面積は小さくてもよい。その場合、図３Ａの担体支持台７を用いる方が良い。熱可塑性ポリマーのゾル化の際には、液化した担体ポリマーは、第４の貫通孔を通過して、液体貯蔵容器９内に落下するが、支持部１７の領域面積が小さいほど、支持部１７上に残留するであろう液体量が減る。言い換えれば、支持部１７の領域面積が小さいほど熱可塑性担体１５上に捕捉された菌を効率よく液体貯蔵容器９に回収できる。
　図３Ｃは、熱可塑性担体１５がゲル状態で比較的柔らかくても担体支持台７で支持できる形態の一つである。支持部の面積が小さいため、担体支持台７の支持部１７上に残留する液体量を減らすことができる。
　図３Ｂを用いれば、最も安定に熱可塑性担体１５を支持できるが、担体支持台７の残留液体量は増えてしまう。残留液体量を低減する方法として、担体支持台７の表面を撥水加工しても良い。
　熱可塑性担体１５を支持する機能以外に、もう一つの機能追加として、菌１９以外のダストをトラップするプレフィルタとして担体支持台７を利用する形態もある（図４）。熱可塑性担体１５上には菌１９以外にもダスト２０が存在している。菌体の大きさは、例えば1ミクロンより大きい、または、その１０倍程度の大きさの第４の貫通孔１３で形成された担体支持台７を使用する。
　熱可塑性担体１５は、３０℃以上に熱せられるとゲルからゾル状態に転移し、３７～４０℃で完全に液化する高分子であり、例えば、ゼラチンやゼラチンとグリセロールの混合物、さらに、N-アクリロイルグリシンアミドとN-メタクロイル-N'-ビオチニルプロピレンジアミン（MBPDA）の10:1の共重合ポリマーなどを使用する。
　熱可塑性担体１５を３０℃以上、例えば３７℃に熱して、ゾル状態にしたポリマー液体を吸引ろ過すると、図５（Ａ）（Ｂ）に示すように、熱可塑性担体１５上から、菌捕集フィルタ１１上に集菌される。熱可塑性担体１５のゾル化法は、図６の担体処理装置を用いて、実施の形態２で説明するが、液体貯蔵容器９のすり鉢形状またはラッパ形状により、菌１９は、菌捕集フィルタ１１上の狭い領域に集められ、さらに濃縮される。ここで、濃縮された菌１９の環境は、理想的には液量がゼロであり、次に加えられる液体の量の制御で、菌の濃度を自由に制御できる。菌捕集フィルタ１１の有効面の直径が数ｍｍから１０ｍｍ程度であると、数マイクロリットル～１００マイクロリットルのレベルで液体を添加して、菌懸濁液を液体貯蔵容器９内に作製できる。結果的には、１ｍｍ３（１０００リットル）の空気を捕集機で捕集した菌１９の濃度が、菌捕集フィルタ１１上で、1万倍から１０万倍に濃縮されたことになる。
　菌捕集フィルタ１１は、溶液を通過させ菌は通過させない材質であればよく、ＨＥＰＡ(High Efficiency Particulate Air)形状、ポア形状の何れでもよい。例えば、菌の大きさを考慮し、０．４５ミクロン以上の物質の通過を許さないものであればよい。
　（実施の形態２）
　図６は、実施の形態２による担体処理装置の概略構成を示す図である。担体処理装置は、液体供給部と温度制御部とろ過制御部で構成され、菌捕集担体カートリッジ１内の熱可塑性担体１５を溶解し、ろ過吸引して、菌捕集フィルタ１１上に集菌するものである。装置全体の工程は、第１の制御装置３５を用いて連続的に自動制御されるものである。
　図６において、菌捕集担体カートリッジ１は、第１の板状部材２１にセットされる。菌捕集担体カートリッジ１のセット場所の第１の板状部材２１の板は、貫通しており、菌液吸引ノズル３１が、第１の板状部材２１を介して菌捕集担体カートリッジ１の底面と接触できるようになっている。
　まず、液体供給部と温度制御部について説明する。
　第１の貫通孔３の中心のＺ軸上に沿って、菌捕集担体カートリッジ１の上部に第１の分注ノズル２２が位置しており、第１の分注ノズル２２は、第１のノズルホルダ２３に固定され、さらに、第１のノズルホルダ２３は、第１のアクチュエータ２６に固定されている。第１のアクチュエータ２６の移動により、第１の分注ノズル２２は、菌捕集担体カートリッジ１の第１の貫通孔３内に導入でき、分注ノズルガイド５内を通り抜けて、菌捕集フィルタ１１の直上まで接近できる。第１の分注ノズル２２は、第１の配管２４、第２の配管２６、第３の配管２８と繋がっており、配管加熱ヒータ２５、第１の送液ポンプ２７を介して、第３の液体配管２８は、第１の溶液溜め２９に収められている。第１の溶液溜め２９は、溶液溜めヒータ３０の上に設置されている。第１の分注ノズル２２と第１の溶液溜め２９の間に３本の配管を介していると説明したが、配管は１本でもかまわない。この場合、第１の送液ポンプ２７にペリスタティック型やダイヤフラム型のポンプを使用すると良い。なお、第１の送液ポンプ２７は、それら以外にシリンジを使用するシリンジポンプでも良い。配管加熱ヒータ２５は、遠赤外線セラミックヒータ、シーズヒータや、シリコンラバーヒータ等を用いる。遠赤外線セラミックヒータを用いるのであれば、コイル状にした配管をヒータ内部に挿入し、長い配管距離を加熱するのが良い。配管長が短い場合、送液工程で液体が移動する間に、溶液が設定温度まで温まらずに第１の配管２４に移動してしまうからである。シーズヒータを用いるのであれば、ヒータ面に螺旋状に配管を複数回巻き付けて、長い配管距離を加熱する。シリコンラバーヒータを用いるのであれば、ヒータを配管に長い距離巻き付けて、長い配管距離を加熱するのが良い。何れのヒータを選択した場合でも、配管加熱ヒータ２５を断熱材で覆い、外部への熱量の発散を抑制するのが良い。溶液溜めヒータ３０には、板状の抵抗加熱型やペルチェ素子型、等を用いる。配管加熱ヒータ２５、溶液溜めヒータ３０の温度は、熱電対素子等の温度測定器でモニタし、一定に保つようにする。
　次に、ろ過制御部について説明する。
　菌捕集担体カートリッジ１の菌捕集フィルタ１１の中心のｚ軸に沿った下方に、菌液吸引ノズル３１はあり、第２のアクチュエータ３２に固定されている。第２のアクチュエータ３２の移動により、菌液吸引ノズル３１は、菌捕集担体カートリッジ１の菌捕集フィルタ１１を固定するドーナツ状の止め板１２と接触する。菌液吸引ノズル３１の先端には、Oリングゴムが装着されており、ドーナツ状の止め板１２と接触した際に密着し、リークのない接続が菌捕集フィルタ１１との間で得られる。菌液吸引ノズル３１は、第４の配管３３を介してアスピレータ等の吸引ポンプ３４と繋がっている。吸引ポンプ３４のＯＮ/ＯＦＦ制御、第２のアクチュエータ３２の上下移動は、第１の制御装置３５により制御される。
　図７は、実施の形態２による担体処理装置（図６）の動作原理を説明する図である。既に、捕集機を用いた菌捕集工程は済んでおり、菌１９は熱可塑性担体１５上に捕捉されている。その菌捕集担体カートリッジ１を、図６の処理装置に設置し、菌捕集担体フィルタ１１上に集菌する工程を説明する。なお、図では簡単のため、上蓋２を省いて図示している。ここで用いた熱可塑性担体１５は、ゼラチンであり、３７℃を境にゾル化、即ち固体から液体へと変化する。
　図７Ａは、第１の制御装置３５から与えられた処理開始の指示に応答して、第１のアクチュエータ２６が駆動し、第１の分注ノズル２２が菌捕集担体カートリッジ１の分注ノズルガイド５を通って、液体貯蔵容器９内の菌捕集フィルタ１１に近づいた状態を示している。さらに、第１の溶液溜め２９から供給される加熱溶液３７が、第１の分注ノズル２２から分注されて間もない状況を示している。加熱溶液３７は、リン酸バッファや滅菌水を用いるのが好適で、ここでは、４０℃のリン酸バッファを使用した。ただし、この４０℃という温度は、液体貯蔵容器９内で予備的に測定した結果である。前段の配管加熱ヒータ２５の設定温度は８０℃とし、第１の分注ノズル２２からは４５～５０℃の範囲で変動しながら液体貯蔵容器９内に、流速1ｍＬ/ｍｉｎで供給した際の貯蔵容器９内で計測した平均的な温度である。また、ここでは、配管加熱ヒータ２５のみを溶液の加熱に使用しているが、配管加熱ヒータ２５と溶液溜めヒータ３０の併用、溶液溜めヒータ３０の単独での使用でもかまわない。
　図７Ｂは、分注を開始し、５分が経過した状況を示している。液体貯蔵容器９の菌捕集フィルタ１１と担体支持台７で挟まれる内部容量は５ｍＬであり、図７Ｂの状態は、熱可塑性担体１５が加熱溶液３７にまさに接し始めたところである。
　図７Ｃは、さらに分注を続け、液体貯蔵容器９内に約７ｍＬの加熱溶液３７が供給され、さらに供給を停止した状況を示している。さらに、図７Ｃでは熱可塑性担体のポリマーがゾル転移し、液体化初期の状況を示している。図７Ｄは、数分後、熱可塑性担体のポリマーが完全に液体化し、加熱液体とポリマーの混合液体３８が形成されたところである。菌１９は懸濁し、菌懸濁液が形成されている。
　図７Ａ～Ｄでは、分注ノズルからの加熱溶液により、熱可塑性担体がゾル転移させているが、担体支持体等を加熱することにより、ゾル転移させてもよい。また、加熱溶液の分注と担体支持体等の加熱とを併用させてもよい。
　図７Ｅは、菌液吸引ノズル３１が上昇し、ドーナツ状の止め板１２と菌液吸引ノズル３１上のＯリング３６が密着し、吸引を開始する直前を示している。このように密着させるのは、図７Ａ～Ｄのいずれの工程であってもよい。図７Ｆは、吸引ポンプ３４が稼動し、加熱液体とポリマーの混合液体３８を、菌捕集フィルタ１１を介して、排液し、排液が終了した状況を示している。
　図７Ａ～Ｅの工程により、熱可塑性担体１５上に捕捉した菌１９を菌捕集担体フィルタ１１上に集菌できる。
　本実施例では、加熱溶液３７の供給と、吸引による加熱液体とポリマーの混合液体３８の排液は各１回であるが、複数回繰り返して菌捕集フィルタ１１上に菌１９を集菌しても良い。複数回繰り返す方が、菌捕集フィルタ１１上の不純物や熱可塑性担体１５であるゼラチンの固形残留物をフィルタ上で暖めながら、さらに液化して取除くことができる。
　本発明の担体処理装置の特徴は、菌捕集フィルタ１１上に加熱液体３７を供給し、熱可塑性担体１５をフィルタに近い位置から液化してろ過できる点である。これにより、菌捕集フィルタ１１上の温度を高く保つことができ、さらに、菌捕集フィルタ１１上の熱可塑性ポリマーの濃度を加熱溶液３７による希釈で、低濃度制御が可能であることから、菌捕集フィルタ１１の目詰まりを防ぐ手段として好都合である。
　図１４に示す捕集機７４の吸引により発生した気流７５は、第２の貫通孔４を通って、ギャップ６を通過し、捕集機７４の排気口を通じて排気される。気流７５から外れた菌１９は、熱可塑性担体１５の表面に捕捉される。この際、上蓋２と熱可塑性担体１５との間隔は第２の貫通孔４の径に対して、１：１もしくは１：２とする。前記比率の間隔では、より捕集率が増加する。
　熱可塑性担体の下部から加熱溶液を添加する方法以外に、ゾル転移させる方法として、菌捕集担体カートリッジ１の熱可塑性担体１５の上から加熱液体３７を添加する方法を用いてもよい。その場合には、上蓋２を取り外す必要がある。
　（実施の形態３）
　図８は、実施の形態２による担体処理装置の機構部と化学発光計測機構部をシステム化した自動菌数計測装置６０の概略構成図である。図６の担体処理装置の全機構に、さらに、菌１９のＡＴＰ抽出から発光計測までを自動で処理できる機構部を追加し、菌捕集担体カートリッジ１に捕集された菌１９の数に比例したＡＴＰ量は発光計測し、さらに菌１９の数を算出する装置である。担体処理機構部については、第２の実施例で説明したとおりなので、ここでは説明を省く。
　化学発光計測機構部について説明する。
　ＡＴＰ計測容器７０は、第１の容器ホルダ３９にセットされる。第１の容器ホルダ３９は、第２の板状部材４０に設置される。光検出器４１は、第３のアクチュエータ４２によりｚ軸方向に移動可能である。ＡＴＰ計測容器７０、第１の容器ホルダ３９、光検出器４１の中心は、ｚ軸方向の同一軸上にあるようにアライメントされている。光検出器４１は、一般的には光電子増倍管（Photomultiplier Tube: PMT）を使用するのが感度の面で好適である。しかし、PMTほどの感度は必要ではなく、装置コストの低下を重視する場合には、ホトダイオード等の半導体素子でも良い。ただし、本明細書では、PMTを使用した系のみについて記載する。
　第３のアクチュエータ４２によるｚ軸位置の移動は、検出感度を制御するために使用する。光の強度は発光点からの距離の２乗で減衰するため、発光物質を含む試料容器を受光面に近づけるのが好適である。しかし、ＡＴＰ濃度が高い測定対象を計測する場合、検出器を遠ざけた形で、検出上限を広くすることもまた有効であり、本自動菌数計測装置はそれを可能とする。
　発光計測に使用する液体操作部は、ＡＴＰ計測容器７０内へＡＴＰを含む液体を分注する際の液体出口となる第２の分注ノズル４３、第２の送液ポンプ４４、第２の分注ノズル４３を結ぶ第５の配管４５、第２の分注ノズル４３を固定し、かつ第２の分注ノズル４３と第５の配管４５との第２のノズルホルダ４６で構成されている。第２の分注ノズル４３は、第４のアクチュエータ４７によりｚ軸方向で位置を制御できる。さらに、第４のアクチュエータ４７と担体処理を行なう手段としての第３のアクチュエータは第５のアクチュエータに取り付けられており、ｙ軸方向にも位置を制御できる。
　第２の板状部材４０上には、溶液溜めチューブを複数セット（ここでは３セット）設置できるチューブ設置ホルダ４９が設置されており、第１の試薬チューブ５０、第２の試薬チューブ５１、第３の試薬チューブ５２には、ＡＴＰ消去試薬、ＡＴＰ抽出試薬、ＡＴＰ発光試薬などが導入される。これらの試薬は、第２の分注ノズル４３を利用して分取され、菌捕集担体カートリッジ１やＡＴＰ計測容器７０内へ分注される。
　自動菌数計測装置６０の全工程は、第２の制御装置５３を用いて連続的に自動制御されるものである。
　図９を参照して、図８を用いた自動菌数計数法の手順を説明する。まず、ＡＴＰ計測容器７０、ＡＴＰ消去試薬を入れた第１の試薬チューブ５０、ＡＴＰ抽出試薬を入れた第２の試薬チューブ５１、ＡＴＰ発光試薬を入れた第３の試薬チューブ５２を、チューブ設置ホルダ４９に設置する（Ｓ９０１）。次に、浮遊菌捕集用の捕集機に菌捕集担体カートリッジ１を取り付け、菌１９を捕集した菌捕集担体カートリッジ１、または落下菌を集菌した菌捕集担体カートリッジ１、または付着菌を採取した菌捕集担体カートリッジ１を、第２の板状部材４０に設置する（Ｓ９０２）。自動菌数計測装置６０の内部は発光計測のため、遮光された筐体である。上記Ｓ９０１、Ｓ９０２の工程は装置に取付けられた窓７１を介して、その遮光扉７２を外して設置される。または、第２の板状部材４０を引出せる引き出し７３を利用して設置される（図１３）。
　装置内は密閉状態で遮光される。
　第２の制御装置３５から与えられた処理開始の指示に応答して、まず、第１の分注ノズル２２が菌捕集担体カートリッジ１の液体貯蔵容器９内の菌捕集フィルタ１１の直上まで移動し、第１の溶液溜め２９から供給される加熱溶液３７を分注する（Ｓ９０３）。分注量は任意に設定できる。分注終了後、熱可塑性担体１５の液体化反応のための待機時間を経て（Ｓ９０４）、菌液吸引ノズル３１により、加熱液体とポリマーの混合液体３８を菌捕集フィルタ１１を介して吸引ろ過する（Ｓ９０５）。Ｓ９０３～９０５の工程が終了すると、菌１９は菌捕集担体フィルタ１１上に集菌されている。
　次に、生菌中のＡＴＰ量を測定するステップに以降する。第１の試薬チューブ５０より、第２の分注ノズル４３でＡＴＰ消去試薬を分取し、分取したＡＴＰ消去試薬を菌捕集フィルタ１１上に分注する（Ｓ９０６）。ＡＴＰ消去反応の待機時間３０分後（Ｓ９０７）、第２の試薬チューブ５１より、第２の分注ノズル４３でＡＴＰ抽出試薬を分取し、分取したＡＴＰ抽出試薬を菌捕集フィルタ１１上に分注し（Ｓ９１０）、菌中からＡＴＰを抽出する。なお、Ｓ９０９の工程に入る前に、第３の試薬チューブ５２より、第２の分注ノズル４３でＡＴＰ発光試薬を分取し、分取したＡＴＰ発光試薬をＡＴＰ計測容器７０に分注し（Ｓ９０８）、発光試薬のバックグラウンド測定を開始する（Ｓ９０９）。ＡＴＰ抽出反応の待機時間である３０秒～１分後（Ｓ９１１）、第２の分注ノズル４３で菌捕集担体カートリッジ１の液体貯蔵容器９内に導入し、菌１９と反応させたＡＴＰ抽出試薬を分取し、その分取したＡＴＰ抽出試薬をＡＴＰ計測容器７０に分注し（Ｓ９１２）、ＡＴＰの生物化学発光を計測する（Ｓ９１３）。計測されたＡＴＰ発光強度から、菌数を算出する（Ｓ９１４）。
　図１０は、横軸が測定時間、縦軸が単位秒あたりのフォトン数（Ｃｏｕｎｔ　Ｐｅｒ　Ｓｅｃｏｎｄ：　ＣＰＳ）で表されるＡＴＰ発光経時曲線グラフ５４の典型例である。発光試薬を分注する以前のバックグラウンド信号５５を１００秒間取得した後、１００秒後に２５０秒間のATP発光信号５６を取得した例である。ここでは、発光試薬を分注した後、直ちに、数秒で信号強度にピーク値５７を示すフラッシュ型（高感度型）発光試薬を使用している。
　菌数を算出するためには、光検出器４１の発光強度とＡＴＰ分子数との関係を、事前に検量線を作成してデータ管理しておく必要がある。図１１は、図１０のピーク値５７からバックグラウンド信号５５の値の差分を数値化し、各濃度に対してプロットした検量線グラフ５８である。検量線は１ａｍｏｌの極低濃度から１０００００ａｍｏｌまで直線状、即ち定量的な強度変化が得られている。
　この検量線グラフ５８から、菌数を算出し、データを自動的に出力することができる（Ｓ９１１）。それは、菌によって含まれるATP量が決まっているので算出できる。例えば、枯草菌は１７ａｍｏｌ／菌、黄色ブドウ球菌は１．５２ａｍｏｌ／菌、大腸菌は１－２ａｍｏｌ／菌である。
　図１２は、モデル試料として、標準菌株（日水製薬社のＥａｓｙ　ＱＡ　Ｂａｌｌ大腸菌１０，０００ｃｆｕ）を純水で希釈した懸濁液を用いて、大腸菌における検出感度と検出精度を確認した結果である。菌捕集担体カートリッジ１の熱可塑性担体１５上に、懸濁液を点着して点着量を変えることで菌数をコントールし、横軸に菌数、縦軸に発光強度をプロットした発光強度の菌数依存性グラフ５９である。
　1～５ＣＦＵの１ＣＦＵ毎のＡＴＰ量は、０．６、２．７、２．９、５．７、８．３であった（ＡＴＰ：１２ＣＰＳ／ａｍｏｌ）。つまり、平均で１ＣＦＵあたり１．２ａｍｏｌであった。標準菌株のカタログ値は、１．５ａｍｏｌ／ＣＦＵであり、図１２の破線がカタログ値をもとに作成した場合の理想的な検量線である。実験結果は、理想的な検量線の値と一致しており、信頼度、精度の高い計測が可能であることを示している。また、１ＣＦＵから計測可能な高感度装置であることも示している。
１…菌捕集担体カートリッジ、２…上蓋、３…第１の貫通孔、４…第２の貫通孔、５…分注ノズルガイド、６…ギャップ、７…担体支持台、８…第３の貫通孔、９…液体貯蔵容器、１０…外筒、１１…菌捕集フィルタ、１２…ドーナツ状の止め板、１３…第４の貫通孔、１４…第５の貫通孔、１５…熱可塑性担体、１７…支持部、１８…メッシュ、１９…菌、２０…ダスト、２１…第１の板状部材、２２…第１の分注ノズル、２３…第１のノズルホルダ、２４…第１の配管、２５…配管加熱ヒータ、２６…第２の配管、２７…第１の送液ポンプ、２８…第３の配管、２９…第１の溶液溜め、３０…溶液溜めヒータ、３１…菌液吸引ノズル、３２・・・第２のアクチュエータ、３３・・・第４の配管、３４・・・吸引ポンプ、３５・・・第１の制御装置、３６・・・Ｏリング、３７・・・加熱溶液、３８・・・加熱液体とポリマーの混合液体、３９・・・第１の容器ホルダ、４０・・・第２の板状部材、４１・・・光検出器、４２・・・第３のアクチュエータ、４３・・・第２の分注ノズル、４４・・・第２の送液ポンプ、４５・・・第５の配管、４６・・・第２のノズルホルダ、４７・・・第４のアクチュエータ、４９・・・チューブ設置ホルダ、５０・・・第１の試薬チューブ、５１・・・第２の試薬チューブ、５２・・・第３の試薬チューブ、５３・・・第２の制御装置、５４・・・ＡＴＰ発光経時曲線グラフ、５５・・・バックグラウンド信号、５６・・・ＡＴＰ発光信号、５７・・・ピーク値、５８・・・検量線グラフ、５９・・・発光強度の菌数依存性グラフ、６０・・・自動菌数計測装置、７０・・・ＡＴＰ計測容器、７１・・・窓、７２・・・遮光扉、７３・・・引き出し、７４・・・捕集機、７５・・・気流

Claims (28)

  1. 　熱可塑性担体と、
    　前記熱可塑性担体を支持し、かつ貫通する開口部を有する支持台と、
    　前記開口部を覆って配置され、かつ一部にフィルタを有する容器とを備える担体カートリッジ。
  2. 　前記熱可塑性担体は、ゲル－ゾル転移高分子であることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  3. 　前記熱可塑性担体は、３０℃以上でゾル状態となるゲル－ゾル転移高分子であることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  4. 　前記熱可塑性担体は、ゼラチンであることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  5. 　前記熱可塑性担体は、アルコール分を含むゼラチンであることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  6. 　前記熱可塑性担体の前記アルコール分は、グリセロールであることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  7. 　前記熱可塑性担体は、ゲル状態では板状で少なくとも１つの貫通孔を有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  8. 　前記支持台は、複数の貫通孔を有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  9. 　前記支持台は、前記熱可塑性担体の貫通孔を通過する位置と同じ中心軸上に貫通孔を有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  10. 　前記支持台の貫通孔の少なくとも１つは、前記支持台の平板上に形成された突起の中心にあることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  11. 　前記支持台の前記突起の中心軸は、前記熱可塑性担体の貫通孔の中心軸を通る位置関係で、前記熱可塑性担体は前記突起物を包みこみ前記支持台に支持されることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  12. 　前記容器は、すり鉢形状であることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  13. 　前記容器は、少なくとも１枚の前記フィルタが取り付けられ、取り付けるためのドーナツ状の板状部を有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  14. 　前記容器は、外筒の内部にあり、前記容器の液体保持部との間にギャップを有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  15. 　前記フィルタは、０．４５ミクロン以上の物質を通過させないＨＥＰＡ(High Efficiency Particulate Air)またはポア状のメンブレンフィルタであることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  16. 　前記熱可塑性担体を覆い、かつ前記熱可塑性担体を介して前記容器と対向して配置され、かつ複数の貫通孔を有する蓋部材をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  17. 　前記蓋部材の少なくとも１つの貫通孔は、前記支持台の突起の中心軸と前記熱可塑性担体の貫通孔の中心軸を通る位置関係にあることを特徴とする請求項１に記載の担体カートリッジ。
  18. 　熱可塑性担体と、
    　前記熱可塑性担体を支持し、かつ貫通する開口部を有する支持台と、
    　前記開口部を覆って配置され、かつ一部にフィルタを有する容器と、
    　前記開口部を介して前記容器に液体を供給する液体供給部と、
    　前記液体の温度を制御する温度制御部と、
    　フィルタを介して前記液体とゾル化した熱可塑性ポリマーを吸引ろ過するろ過制御部とを有する担体処理装置。
  19. 　前記液体供給部は、少なくとも１本のノズルと、少なくとも１つの溶液溜めと、少なくとも1本の配管チューブと、前記配管チューブと繋げられた少なくとも１つの送液ポンプと、前記容器内にノズルを移動させるノズル位置制御部とを有することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  20. 　前記担体処理装置の液体供給部の前記ノズルの先端は、前記支持台と前記フィルタに挟まれた領域で、前記フィルタ上に液体を供給することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  21. 　前記担体処理装置の温度制御部は、前記液体供給部の前記配管の少なくとも１部を加熱することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  22. 　前記担体処理装置の温度制御部は、前記液体供給部の前記溶液溜めを加熱することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  23. 　前記担体処理装置のろ過制御部は、ノズルと、配管チューブと、前記配管チューブと繋げられた吸引ポンプと、前記容器の前記フィルタ部と接触するようにノズルを移動させるノズル位置制御部とを有することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  24. 　液体を回収する少なくとも１つの液体回収部と、
    　回収した前記液体を収める回収容器と、前記回収容器を保持するホルダと、
    　前記回収ホルダ下部に設置された光検出器と、前記光検出器の位置制御部とを有することを特徴とする請求項１８に記載の担体処理装置。
  25. 　さらに少なくとも２つの第２の溶液溜めを有し、前記容器内と前記溶液溜めにノズルを移動させる第２のノズル位置制御部とを有することを特徴とする請求項２４に記載の担体処理装置。
  26. 　前記第２の溶液溜めは、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）抽出試薬、ＡＴＰ発光試薬、さらにＡＴＰ消去試薬の少なくとも１つを保持していることを特徴とする請求項２５に記載の担体処理装置。
  27. 　前記担体カートリッジの前記熱可塑性担体上に菌を集菌するステップと、
    　集菌した前記担体カートリッジを前記細菌計測装置に設置するステップと、
    　前記液体供給部から３０℃以上に加熱した液体を前記容器内に供給し、前記熱可塑性担体を前記液体で溶解してゾル化するステップと、
    　前記ろ過制御部でゾル化した担体と前記液体を吸引ろ過し、前記フィルタ上に前記菌を集菌するステップと、
    　前記フィルタ上に、前記液体供給部からＡＴＰ抽出試薬を添加するステップと、
    　前記ＡＴＰ抽出試薬を前記液体回収部で回収するステップと、
    　回収した前記ＡＴＰ抽出試薬を液体回収容器に分注し、前記液体回収容器に分注したＡＴＰ発光試薬と混合するステップと、
    　前記ＡＴＰ抽出液の回収液に含まれるＡＴＰと化学発光させ、前記化学発光の光強度を前記発光検出器で計測するステップと、
    　ＡＴＰ発光量から前記菌の数を計数するステップと、
    を有する菌の計測方法。
  28. 　前記菌は、空中浮遊菌、前記熱可塑性担体が押し付けられて付着した付着菌、静置させた前記熱可塑性担体上に落下した落下菌のいずれかであることを特徴とする請求項２７に記載の菌の計測方法。
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