JP2023152529A - 空中浮遊微生物量の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】空中浮遊微生物の量を迅速に評価することができる空中浮遊微生物量の評価方法を提供する。【解決手段】空中浮遊微生物量の評価方法は、空気Ａを界面活性剤及び微生物の栄養となる有機物を含む捕集液３０中に取り込む捕集工程と、捕集液３０中に取り込まれた微生物Ｍの量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定する測定工程と、を有する。【選択図】図１

Description

本発明は、空中浮遊微生物量の評価方法に関する。

下記特許文献１には、生物細胞の捕集時にはゲル状で、加熱した際に４０℃以下でゾル状に相対変位する捕集担体を備えた捕集ユニットと、捕集担体にエアを吹き付ける吹き付け手段と、を備えた捕集装置が開示されている。この捕集装置では、空中浮遊微生物をゲル状の捕集担体（すなわち、固相の捕集担体）で捕集する。その後、ゲル状の捕集担体を加熱することで液体化して回収し、ＡＴＰを測定する。捕集担体は、捕集した生物細胞をＡＴＰにより検出するための検査用試薬を含有している。

特開２００９－１３１１８６号公報

特許文献１に記載の捕集装置では、空中浮遊微生物をゲル状の捕集担体（すなわち、固相の捕集担体）で捕集する。そして、空中浮遊微生物の捕集後に、ゲル状の捕集担体を加熱することで液体化して回収し、ゾル状の捕集担体（すなわち、液体の捕集担体）のＡＴＰを測定するため、検査工程が煩雑であり、検査に時間がかかる。

本発明は上記事実を考慮し、空中浮遊微生物の量を迅速に評価することができる空中浮遊微生物量の評価方法を提供することが目的である。

第１態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法は、空気を界面活性剤及び微生物の栄養となる有機物を含む捕集液中に取り込む捕集工程と、前記捕集液中に取り込まれた微生物の量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定する測定工程と、を有する。ここで、ＡＴＰは、アデノシン三リン酸である。

第１態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法によれば、捕集工程では、空気を、界面活性剤及び微生物の栄養となる有機物を含む捕集液中に取り込む。さらに、測定工程では、捕集液中のＡＴＰの存在量を測定する。
ＡＴＰの存在量は、捕集液中に取り込まれた微生物の量と相関関係があるので、ＡＴＰの存在量を測定することで、空中に浮遊する微生物の量を迅速に評価できる。また、捕集液中には、界面活性剤が添加されているので、微生物が液体と接触しやすく、捕集されやすくなっている。
このように第１態様では、捕集液を寒天培地に接種して培養し、生じたコロニー（集落）を計数する場合と比較して、捕集液に含まれるＡＴＰの存在量を測定する時間が短くて済む。また、第１態様では、空中浮遊微生物をゲル状の捕集担体で捕集した後、ゲル状の捕集担体を加熱することで液体化して回収してＡＴＰを測定する場合と比較して、捕集液に含まれるＡＴＰの存在量を測定する時間が短くて済む。
また、捕集液中に微生物の栄養素となる有機物を含ませているので、培養する際に、有機物を別途添加する必要がない。

第２態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法は、第１態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法において、前記測定工程で前記ＡＴＰの存在量が少ない場合は、前記捕集液を前記微生物の生育に適した温度で保温して前記微生物を培養し、所定時間が経過した後に、前記ＡＴＰの存在量を再度測定する。

第２態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法によれば、ＡＴＰの存在量が少ない場合は、捕集液を微生物の生育に適した温度で保温して微生物を培養し、微生物を増殖させることで、ＡＴＰの存在量を測定することができる。このため、捕集液に微生物の栄養となる有機物を新たに添加して寒天培地で培養する必要がなく、空中に浮遊した微生物が存在するかどうかを容易に確認することができる。

第３態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法は、第１態様又は第２態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法において、前記有機物は、ペプトンである。ここで、ペプトンは、たんぱく質が酵素、熱又は酸などによって分解されたときにできる、たんぱく質とアミノ酸との中間的な物質である。

第３態様に記載の空中浮遊微生物量の評価方法によれば、有機物はペプトンであるため、捕集液を微生物の生育に適した温度で保温して微生物を培養することで、微生物をより確実に増殖させることができる。

本開示によれば、空中浮遊微生物の量を迅速に評価することができる。

第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法に用いられるエアーサンプラーを示す構成図であり、（Ａ）～（Ｄ）は、エアーサンプラーを用いて空中浮遊微生物を捕集する工程を示す構成図である。 ＡＴＰを希釈した標準液の蛍光値とＡＴＰ量との関係を示すグラフである。 捕集液及び第１比較液とＡＴＰ量との関係を示すグラフである。 捕集直後の捕集液の蛍光値と総菌数との関係を示すグラフである。 補正後の捕集液の蛍光値と経過時間との関係を示すグラフである。 補正後の捕集液の蛍光値と捕集液の培養時間との関係を示すグラフである。

本発明の実施の形態について、図面を基に詳細に説明する。

＜第１実施形態＞
第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法について説明する。

［空中浮遊微生物量の評価方法の各工程］
第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、空気Ａを捕集液３０中に取り込む捕集工程（図１参照）と、捕集液３０中に取り込まれた微生物の量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定する測定工程と、を有している。

［捕集工程］
捕集工程では、捕集装置を用いて、大量の空気を捕集液中に取り込む。一例として、図１に示すエアーサンプラー１０を用いて空気Ａを大量に吸引することで、エアーサンプラー１０内の捕集液３０中に空気Ａを取り込む。これにより、空気Ａ中に微生物（細菌やカビなどの真菌）が浮遊している場合は、空気Ａ中に浮遊する微生物が捕集液３０に捕集される。エアーサンプラー１０の構成及び空気Ａに浮遊する微生物の捕集方法については、後に説明する。

（捕集液）
捕集液３０は、界面活性剤、及び微生物の栄養となる有機物を少量含む液体である。エアーサンプラー１０で空中浮遊微生物を捕集する場合、捕集液３０には少量の界面活性剤を添加した方が捕集効率は良好となる。界面活性剤を含まない液体の場合は、多くの微生物の表面は疎水性であり、液体に空気を吹き込んでも液体になじまずに、液体に捕集されることなく排気されるためである。そのため、微生物が液体を接触しやすく、捕集されやすくするために、界面活性剤を添加した捕集液３０を用いている。

界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０（オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、別名：ポリソルベート８０）、Ｔｗｅｅｎ２０（モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、別名：ポリソルベート２０）などが用いられる。Ｔｗｅｅｎ８０及びＴｗｅｅｎ２０は、非イオン性の界面活性剤である。捕集液３０として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０又はＴｗｅｅｎ２０を０．０２ｇ／Ｌ以上０．０８ｇ／Ｌ以下添加したものを用いることができる。第１実施形態では、捕集液３０として、Ｔｗｅｅｎ８０を０．０５ｇ／Ｌ添加したものを用いている。

微生物Ｍの栄養となる有機物は、捕集液３０に捕集した微生物Ｍを培養して増やすために使用される。微生物Ｍの栄養となる有機物として、例えば、ペプトンなどが用いられる。上記のように、ペプトンは、たんぱく質が酵素（ペプシンなど）、熱又は酸などによって分解されたときにできる、たんぱく質とアミノ酸との中間的な物質である。ペプトンは、さまざまな長さのポリペプチド、オリゴペプチドの混合物である。ペプトンは、水溶性で加熱によって凝固しない。捕集液３０として、例えば、ペプトンを５ｇ／Ｌ以上２０ｇ／Ｌ以下添加したものを用いることができる。第１実施形態では、捕集液３０として、ペプトンを１０ｇ／Ｌ添加したものを用いている。

ただし、添加するペプトンにＡＴＰが含まれていると、捕集液３０のＡＴＰ量のバックグランド値が上がってしまい、微量の微生物Ｍの検出が難しくなる。発明者はいくつかのペプトンを試したところ、品質管理が確実になされているメーカーであるディフコ社のペプトンであれば、微生物の生育に適した１０ｇ／Ｌ程度の量で捕集液３０に添加しても、ＡＴＰ量の測定に影響を与えることなく、微生物Ｍの生育に寄与すること見出した。

（エアーサンプラーの構成）
ここで、捕集工程で使用されるエアーサンプラー１０について説明する。図１（Ａ）～（Ｄ）には、エアーサンプラー１０の構成及びエアーサンプラー１０で空気Ａを取り込む工程が示されている。図１において示される矢印ＵＰで示す方向を鉛直方向の上方側とする。エアーサンプラー１０は、空気Ａ中に浮遊する微生物を捕集する捕集装置の一例であり、サイクロン方式のエアーサンプラーである。エアーサンプラー１０として、例えば、ベルタン社製のコリオリスμエアーサンプラーが用いられている。

図１（Ａ）等に示すように、エアーサンプラー１０は、容器１２と、容器１２の上部に装着された装着部１４と、を備えている。エアーサンプラー１０は、装着部１４の側部１６に設けられて空気Ａが導入されるサンプリング口１８と、装着部１４の上部に設けられて空気Ａが排出される排出部２０と、を備えている。

容器１２は、略円錐状の凹部を備えたカップであり、上部１２Ａ側に対して下部１２Ｂ側の内径が徐々に小さくなるように形成されている。容器１２には、捕集液３０が収容されている。捕集液３０は、容器１２の内径が変化する部位の上下方向の中間部付近まで収容されている（図１（Ａ）参照）。

装着部１４は、容器１２の上部に着脱可能に装着されている。装着部１４は、軸方向が上下方向となるように配置される筒状の部材であり、筒状の部材の上端が上壁部１４Ａで閉塞されている。一例として、装着部１４は、平面視にて円形状であり、内面に雌ねじ部（図示省略）を備えている。一例として、容器１２は、上部１２Ａ側の縁部の外面に雄ねじ部（図示省略）を備えている。そして、装着部１４の雌ねじ部を容器１２の雄ねじ部に締め付けることで、装着部１４は、容器１２の上部１２Ａに着脱可能に装着されている。

装着部１４の側部１６は、半径方向外側に突出する枠部１６Ａを備えており、枠部１６Ａの内部に矩形状のサンプリング口１８が形成されている。枠部１６Ａには、空気Ａを供給する図示しない供給部が取り付けられ、供給部からサンプリング口１８に空気Ａが導入される。

装着部１４の上壁部１４Ａには、内部の空気Ａが排出される排出部２０が設けられている。排出部２０は、円筒状の管体であり、上壁部１４Ａの中心部から上方側に延びている。

（エアーサンプラーによる捕集工程）
次に、エアーサンプラー１０により空気Ａ中に浮遊する微生物Ｍを捕集液３０で捕集する工程について説明する。図１（Ａ）に示すように、容器１２には、捕集液３０が収容され、容器１２の上部１２Ａに装着部１４が装着される。一例として、容器１２には、１５ｍｌの捕集液３０が収容される。図１（Ａ）～（Ｄ）では、構成を分かりやすくするため、微生物Ｍを円形で大きく図示しているが、微生物Ｍの実際の形状は異なり、微生物Ｍの実際の大きさはかなり小さい。

図１（Ｂ）に示すように、エアーサンプラー１０では、サンプリング口１８に空気Ａが導入される。これにより、サンプリング口１８から空気Ａが高速で旋回して、容器１２内に吸引渦巻きを形成する。

図１（Ｃ）に示すように、容器１２内で吸引渦巻を形成した空気Ａは、上方の装着部１４側に導かれ、装着部１４の排出部２０から排出される。その際、空気Ａ中の微生物Ｍは、捕集液３０中で高速回転し、遠心力で容器１２の内壁に押し付けられて空気Ａから分離され、捕集液３０中に濃縮分離される（図１（Ｄ）参照）。これにより、エアーサンプラー１０による捕集液３０での微生物Ｍの捕集が完了する。エアーサンプラー１０では、例えば、５分間で１５００Ｌ（すなわち、１分間で３００Ｌ）の空気Ａを吸引することが可能である。

［測定工程］
測定工程では、捕集工程の後に、ＡＴＰ測定器を用いて、捕集液３０のＡＴＰの存在量を測定する。ＡＴＰの存在量は、捕集工程で捕集液３０中に取り込まれた微生物Ｍの量と相関関係がある。このため、捕集液３０のＡＴＰの存在量を測定することで、空気Ａ中に浮遊する微生物Ｍの量を評価することができる。これにより、食品工場、医薬品工場、医療施設などでの衛生管理、及び環境微生物の制御に生かすことが可能である。

上記のように、ＡＴＰは、アデノシン三リン酸である。アデノシン三リン酸は、プリン塩基であるアデニンに糖のリボースがＮ－グリコシド結合により結合したアデノシンに、リボースの５’－ヒドロキシ基にリン酸エステル結合によりリン酸基が結合し、さらにリン酸がもう２分子連続してリン酸無水結合により結合した構造を有する化合物である。リボースの５位の炭素に、リン酸が結合しているため、アデノシン５’－三リン酸とも記載される。ＡＴＰの存在量の測定では、アデノシン三リン酸及びその誘導体からなる群より選択される化合物が測定される場合がある。アデノシン５’－三リン酸及びその誘導体からなる群より選択される化合物には、アデノシン５’－三リン酸（ＡＴＰ）、ＡＴＰの塩、ＡＴＰ水和物、及び、ＡＴＰの塩の水和物などが包含され、アデノシン５’－三リン酸の基本構造を有する。

ＡＴＰ測定器では、ＡＴＰの存在量の測定として、捕集液３０の蛍光値を測定する。一例として、ＡＴＰ測定器では、図示しない測定容器に反応試薬を混合した捕集液３０が収容され、蛍光値が測定される。ＡＴＰ測定器では、測定容器に捕集液３０を収容する前に、フィルタカートリッジで捕集液３０をろ過してもよい。第１実施形態では、捕集工程の後の捕集液３０に反応試薬を混合することで、ルシフェラーゼとマグネシウムイオンとの存在下、捕集液３０中のＡＴＰとルシフェリンとが反応した結果、発光する。ここで生じる光の発光強度をＡＴＰ測定器にて測定することで、反応試薬を含む捕集液３０中に含まれるＡＴＰ類の定量分析が行われる。例えば、蛍光値とＡＴＰの存在量の関係は、予めＡＴＰを希釈した標準液を用いて検量線が作成されており、測定された蛍光値を検量線に当てはめることで、捕集液３０のＡＴＰの存在量が測定される。ＡＴＰ測定器として、例えば、ルミノメーターＰｉ－１０２（Ｈｙｇｉｅｎａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）が使用される。なお、ＡＴＰ測定器は、ルミノメーターＰｉ－１０２に限定するものではなく、他のＡＴＰ測定器（例えば、キッコーマン株式会社製のルミテスターＣ１１０など）を使用してもよい。

例えば、エアーサンプラー１０を用いて捕集液３０に空気Ａを取り込み、その捕集液３０のＡＴＰの存在量を測定する方法で、屋外の空気や一般的な室内の空気を捕集液３０に捕集したところ、捕集前に比べて捕集液３０のＡＴＰの量は増加し、測定されたＡＴＰ量は空中浮遊微生物量に相関することが確認できた。

また、測定工程でＡＴＰの存在量が少ない場合は、捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度で保温して微生物を培養し、所定時間が経過した後に、ＡＴＰの存在量を再度測定する。

一般的な室内よりも空気が清浄な環境では、空気を捕集液３０に捕集しても、捕集液３０のＡＴＰの量は、捕集前と変わらない場合がある。このため、測定工程でＡＴＰの存在量が少ない場合は、捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度で保温して微生物Ｍを培養し、所定時間が経過した後に、捕集液３０のＡＴＰの存在量を再度測定する。

微生物の生育に適した温度は、測定対象となる微生物の種類に合わせて適切な温度に設定する。微生物の生育に適した温度として、例えば、２５℃から３５℃の範囲の温度を使用することができる。第１実施形態では、例えば、捕集液３０を３０℃で保温する。一例として、捕集液３０は、容器１２に収容したまま容器１２を密閉し、３０℃の温度に設定された恒温槽に入れることで、捕集液３０を保温することができる。

また、微生物Ｍを培養する所定時間は、測定対象となる微生物の種類に合わせて適切な時間を設定する。微生物Ｍを培養する所定時間は、例えば、１日程度である。

[比較例]
ここで、比較例の空中浮遊微生物量を評価する方法について説明する。

空中浮遊微生物量を評価する方法としては、例えば、第１比較例では、微生物の栄養を含む寒天培地にサンプル空気を高速で吹き付けて寒天培地上に捕集し、その寒天培地の微生物の生育に適した温度で保温して培養することで、生じたコロニー（集落）を計数する衝突法がある。また、第２比較例では、微生物の栄養を含む寒天培地にサンプル空気を遠心力で吹き付けて寒天培地上に捕集し、その寒天培地の微生物の生育に適した温度で保温して培養することで、生じたコロニー（集落）を計数する遠心法がある。また、第３比較例では、サンプル空気を微生物の捕捉ができるフィルターでろ過してフィルターに空中浮遊微生物を捕集し、フィルターを寒天培地に貼り付けて培養して生じたコロニーを計数するろ過法がある。さらに、第４比較例では、サンプル空気を液体で捕集して、その液体を寒天培地に接種して培養して生じたコロニーを計数するインピンジャー法などがある。

これらの第１～第４比較例では、いずれも微生物の栄養を含む寒天培地上で培養するため、微生物の菌体の塊であるコロニーが生じるのに１日から数日かかり、迅速に評価ができない欠点がある。

[作用及び効果]
次に、第１実施形態の作用及び効果について説明する。ここでは、第１実施形態の作用及び効果を説明する前に、本開示の技術の背景について説明する。

一般的に空気中に含まれる微生物は、環境中の液体に含まれる微生物よりも圧倒的に少ない。例えば、河川水や海水に含まれる微生物量は１ｍｌ当たり１００個程度存在することが多く、１Ｌ当たりに換算すると１０万個程度となる。しかし、空気中では１立米あたりで多くても１０００個から１万個、１Ｌ当たりに換算すると１個や１０個となり、環境水と環境の空気とでは数桁、含まれる微生物量が異なる。そのため、空中浮遊微生物量の評価では大量の空気を捕集することが必要となる。

例えば、第４比較例として、液体に空中浮遊微生物を捕集するインピンジャー法では、空気を導入する管体をガス捕集管の液体の中に配置し、管体の下部から液体内に空気を導入することで、空気中の微生物を捕集する。しかし、インピンジャー法では、１分間で数Ｌしか空気を捕集できず、それ以上の空気を液体に吹き込んでも、液体に捕集されずに素通りしてしまい、捕集効率が悪くなる。このため、１立米あたりで数千個の空中浮遊微生物（換算すると、１Ｌ当たりに数個）に対して、インピンジャー法で微生物を捕集することは難しい。

これに対して、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法は、空気Ａを界面活性剤及び微生物Ｍの栄養となる有機物を含む捕集液３０中に取り込む捕集工程と、捕集液３０中に取り込まれた微生物Ｍの量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定する測定工程と、を有する。

捕集工程では、空気Ａを、界面活性剤及び微生物の栄養となる有機物を含む捕集液３０中に取り込む。第１実施形態では、エアーサンプラー１０を用いて空気Ａを捕集液３０中に取り込む（図１参照）。エアーサンプラー１０では、サイクロン方式により空気Ａを高速で旋回させ、空気Ａを大量に吸引することで、空気Ａを捕集液３０中に取り込む。これにより、空気Ａ中に微生物Ｍが浮遊している場合は、微生物Ｍが遠心力によりエアーサンプラー１０の容器１２の内壁に押し付けられ、空気Ａ中の微生物Ｍが捕集液３０に捕集される。

さらに、測定工程では、捕集液３０中のＡＴＰの存在量を測定する。第１実施形態では、ＡＴＰ測定器を用いて捕集液３０の蛍光値を測定することで、捕集液３０中のＡＴＰの存在量を測定する。ＡＴＰの存在量は、捕集液３０中に取り込まれた微生物Ｍの量と相関関係があるので、ＡＴＰの存在量を測定することで、空中に浮遊する微生物Ｍの量を迅速に評価できる。また、捕集液３０中には、界面活性剤が添加されているので、微生物Ｍが液体と接触しやすく、捕集されやすくなっている。

上記のように、第１実施形態では、サイクロン方式のエアーサンプラー１０を用いて空気Ａを捕集液３０に取り込んで空気Ａを捕集液３０に捕集し、捕集後にただちに捕集液３０のＡＴＰの存在量をＡＴＰ測定器で測定する。捕集液３０には、微生物Ｍの捕集効率をよくする界面活性剤と、微生物Ｍの生育を促進するペプトンが含まれている。これにより、捕集液３０中の微生物Ｍの量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定することで、空気Ａ中に含まれる空中浮遊微生物量を迅速に評価することができる。このため、捕集した場所の空気が清浄であるか、清浄ではないかの評価を迅速に行うことができる。

このように第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、捕集液３０を寒天培地に接種して培養し、生じたコロニー（集落）を計数する場合と比較して、捕集液３０に含まれるＡＴＰの存在量を測定する時間が短くて済む。また、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、空中浮遊微生物をゲル状の捕集担体で捕集した後、ゲル状の捕集担体を加熱することで液体化して回収してＡＴＰを測定する場合と比較して、捕集液３０に含まれるＡＴＰの存在量を測定する時間が短くて済む。このため、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、空中浮遊微生物の量を迅速に評価することができる。
また、捕集液中に微生物の栄養素となる有機物を含ませているので、培養する際に、有機物を別途添加する必要がない。

また、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、測定工程でＡＴＰの存在量が少ない場合は、捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度で保温して微生物Ｍを培養し、所定時間が経過した後に、捕集液３０のＡＴＰの存在量を再度測定する。

一般的な室内よりも空気が清浄な環境では、空気を捕集液３０に捕集しても、捕集液３０のＡＴＰの量は、捕集前と変わらない場合がある。このため、測定工程でＡＴＰの存在量が少ない場合は、捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度（例えば、３０℃）で保温して微生物Ｍを培養し、所定時間（例えば、１日程度）が経過した後に、捕集液３０のＡＴＰの存在量を再度測定する。捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度（例えば、３０℃）で保温することで、捕集液３０中に微量の微生物Ｍが存在する場合は、微生物Ｍを増殖させることが可能である。微生物Ｍを増殖させることで、ＡＴＰの存在量を測定することができる。

このため、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、捕集液３０に微生物の栄養となる有機物を新たに添加して寒天培地で培養する必要がなく、空気Ａ中に浮遊した微生物が存在するかどうかを容易に確認することができる。すなわち、捕集液３０のＡＴＰ量が増加していないか確認することで、ごく微量で存在する空中浮遊微生物量を短時間で評価することができる。したがって、捕集した場所の空気が本当に清浄かどうか、空中浮遊微生物がほとんど存在しないかどうかを確認することができる。

また、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、微生物Ｍの栄養となる有機物は、ペプトンである。

このため、第１実施形態の空中浮遊微生物量の評価方法では、ペプトンを含んだ捕集液３０を微生物Ｍの生育に適した温度で保温して微生物Ｍを培養することで、微生物Ｍをより確実に増殖させることができる。

＜空中浮遊微生物量の評価方法の検証＞
次に、空中浮遊微生物量の評価方法を検証するために行った実験について説明する。

[実験１]
実験１では、ＡＴＰ量を測定するＡＴＰ測定器の精度を確認する実験を行った。ＡＴＰは、アデノシン５’－三リン酸二ナトリウム三水和物（関東化学株式会社製）を使用し、１０ｍＭ（１０ｍｍｏｌ／ｌ）の水溶液を作成して、その１０倍希釈を繰り返し行い、０．１ｆｍｏｌ（ｆｍｏｌは１０のマイナス１５乗ｍｏｌ）までの希釈系列の水溶液を準備した。その水溶液０．１ｍｌをＡＴＰ測定器のルミノメーターＰｉ－１０２（Ｈｙｇｉｅｎａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）で測定するため、専用の綿棒であるＵｌｔｒａｓｎａｐ（Ｈｙｇｉｅｎａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製の検査キッド）に添加し、反応試薬を混合してＡＴＰ測定器にかけて、蛍光値を読み取った。

複数回のＡＴＰ量の測定を、各希釈液ごとに行い、プロットしたものが図２に示すグラフである。すなわち、各希釈液は、ＡＴＰ量を測定する標準液である。図２は、標準液の蛍光値とＡＴＰ量との関係を示すグラフである。図２に示すように、ＡＴＰ測定器による標準液の蛍光値とＡＴＰ量に高い比例関係があることが確認できた。図２に示すグラフは、検量線として使用することもできる。

[実験２]
実験２では、空中浮遊微生物の捕集液の組成による違いを確認する実験を行った。実験２では、Ｔｗｅｅｎ８０（関東化学株式会社製）を０．０５ｇ／Ｌ添加した第１比較液で捕集した時と、０．０５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０（関東化学株式会社製）と１０ｇ／Ｌのペプトン（ディフコ社製）を添加した捕集液（ＴＰ液）で捕集した時で、捕集後に第１比較液及び捕集液を３０℃の恒温槽に入れて保温し、ＡＴＰ量（測定器の蛍光値とＡＴＰ量は比例関係にあるので、今後蛍光値で評価した）が増加するか調べた。

空中浮遊微生物の捕集は、サイクロン方式のエアーサンプラー１０として、コリオリスμエアーサンプラー（ベルタン社製）を使用し、専用の容器１２に捕集液又は第１比較液を１５ｍｌ入れ、１分間３００Ｌのスピードで５分間、１５００Ｌの空気を取り込んだ。捕集場所は、屋外と実験室内、それぞれの捕集液又は第１比較液で２回ずつ捕集した。捕集直後から２時間後、４時間後、１７時間後に各捕集液又は各第１比較液の０．１ｍｌをＵｌｔｒａｓｎａｐに添加し、ＡＴＰ測定器としてルミノメーターＰｉ－１０２で蛍光値を測定した。

図３は、捕集液（ＴＰ液）及び第１比較液とＡＴＰ量との関係を示すグラフである。図３に示すように、Ｔｗｅｅｎ８０のみを添加した第１比較液ではほとんど蛍光値は変化せず、Ｔｗｅｅｎ８０とペプトンを添加した捕集液（ＴＰ液）では１７時間後に蛍光値が急上昇している物が認められた。そのため、ペプトンを添加した捕集液（ＴＰ液）により、捕集した微生物が増殖して蛍光値が増加、すなわち、ＡＴＰ量が増加していることが確認できた。

[実験３]
実験３では、ＡＴＰ測定器による捕集液の蛍光値と捕集液の総菌数との関係を確認する実験を行った。

捕集液に０．０５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０（関東化学株式会社製）と１０ｇ／Ｌのペプトン（ディフコ社製）を添加した液（ＴＰ液）を用いて、屋外、３か所の実験室、及びクリーンルーム内で合計３１回の空中浮遊微生物の捕集を行った。空中浮遊微生物の捕集は、サイクロン方式のエアーサンプラー１０として、コリオリスμエアーサンプラーを使用し、専用の容器１２に捕集液を１５ｍｌ入れ、１分間３００Ｌのスピードで５分間、１５００Ｌの空気を取り込んだ。捕集直後に各捕集液の０．１ｍｌをＵｌｔｒａｓｎａｐに添加し、ＡＴＰ測定器としてルミノメーターＰｉ－１０２で蛍光値を測定した。

コリオリスμエアーサンプラーでの捕集と同時に、寒天培地を用いた空中浮遊微生物の捕集を行った。バイオサンプＭＢＳー１０００Ｎ（ミドリ安全社製）を用い、空気を吸気して寒天培地に当てることで、空中浮遊微生物の捕集を行った。寒天培地にはＳＣＤ寒天培地（ソイビーンカゼインダイジェスト寒天培地、多くの細菌や真菌の生育に適した培地）を使用し、１分間１００Ｌのスピードで１分間、１００Ｌの空気の吸気を行い、１か所で５枚から１０枚の寒天培地で捕集した。寒天培地は３０℃で５日間保温し、生じたコロニー（細菌と真菌）をそれぞれ計数し、合計して総菌数を求めた（培養法）。

図４は、捕集直後の捕集液の蛍光値の１立米あたりの数値の対数と、培養法で求めた総菌数（1立米あたりの菌数）をプロットして作成したグラフ（散布図）である。図４に示すように、捕集液の蛍光値と培養法で求めた総菌数には相関関係が認められ、蛍光値が高いほど、総菌数が多いことが確認できた。

[実験４]
実験４では、ＡＴＰ測定器による捕集液の補正後の蛍光値と経過時間との関係を確認する実験を行った。

捕集液に０．０５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０（関東化学株式会社製）と１０ｇ／Ｌのペプトン（ディフコ社製）を添加した液（ＴＰ液）を用いて、屋外、２か所の実験室（実験室１と実験室２）、及びクリーンルーム内で合計１６回の空中浮遊微生物の捕集を行った。空中浮遊微生物の捕集は、サイクロン方式のエアーサンプラー１０として、コリオリスμエアーサンプラーを使用し、専用の容器１２に捕集液を１５ｍｌ入れ、１分間３００Ｌのスピードで５分間、１５００Ｌの空気を取り込んだ。捕集する前にあらかじめ、各容器１２中の捕集液０．１ｍｌ採取してＵｌｔｒａｓｎａｐに添加し、ＡＴＰ測定器としてルミノメーターＰｉ－１０２で蛍光値を測定した。捕集後に捕集液を３０℃の恒温槽に入れて保温し、捕集直後（０時間、すなわち保温しない状態）、１２時間後、２４時間後、３６時間後、１０８時間後に捕集液の蛍光値を測定し、どのように変化するかを調べた。

図５は、時間ごとの蛍光値から捕集前の蛍光値を差し引いて補正し、その補正した蛍光値の時間変化をプロットしたグラフである。図５に示すように、空中浮遊微生物の多い屋外、実験室１、実験室２では、捕集直後ですでに蛍光値が高く、保温後１２時間から４８時間で急激に蛍光値が上昇しており、多くの空中浮遊微生物が存在していたことが確認できた。

クリーンルームでは、捕集直後では蛍光値は低い値で、空中浮遊微生物が僅かながら存在する時には２４時間以降で蛍光値は上昇した。しかし、クリーンルームでは、２４時間から１０８時間後に測定してもほとんど蛍光値が変化しないサンプルもあり、これは空中浮遊微生物がほとんど存在しないことを示している。このため、空中浮遊微生物が少ない環境でも２４時間後にＡＴＰ量を測定し、少しでも上昇していることが認められた場合、空中浮遊微生物が存在することが確認できることがわかった。

[実験５]
実験５では、ＡＴＰ測定器による捕集液の補正後の蛍光値と培養時間との関係を確認する実験を行った。

捕集液に０．０５ｇ／ＬのＴｗｅｅｎ８０（関東化学株式会社製）と１０ｇ／Ｌのペプトン（ディフコ社製）を添加した液（ＴＰ液）を用いて、クリーンルーム内で合計１５回の空中浮遊微生物の捕集を行った。空中浮遊微生物の捕集は、サイクロン方式のエアーサンプラー１０として、コリオリスμエアーサンプラーを使用し、専用の容器１２に捕集液を１５ｍｌ入れ、１分間３００Ｌのスピードで５分間、１５００Ｌの空気を取り込んだ。捕集する前にあらかじめ、各容器１２中の捕集液０．１ｍｌ採取してＵｌｔｒａｓｎａｐに添加し、ＡＴＰ測定器としてルミノメーターＰｉ－１０２で蛍光値を測定した。捕集後に捕集液を３０℃の恒温槽に入れて保温し、捕集直後（０時間、すなわち保温しない状態）、２４時間後、４８時間後、１０８時間後に蛍光値を測定し、どのように変化するかを調べた。

図６は、時間ごとの蛍光値から捕集前の蛍光値を差し引いて補正し、その補正した蛍光値の時間変化をプロットしたグラフである。図６に示すように、空中浮遊微生物の少ないクリーンルームであっても、２４時間後の補正後の蛍光値が３０から５０程度の数値（ＡＴＰ量としては０．１ｆｍｏｌ程度）より低いと、その後の蛍光値の増加はないことから空中浮遊微生物は全く存在しないことが分かる。また、２４時間後の補正後の蛍光値が３０から５０程度の数値より高いと、その後に蛍光値が上昇していることから空中浮遊微生物が微量ながら存在していたことがわかる。このように捕集直後の蛍光値では微量の空中浮遊微生物量の存在量を評価できないが、２４時間程度培養してから蛍光値を測定することで、微量の空中浮遊菌量の存在を評価することができる。

＜その他＞
尚、本発明は上記実施形態に限定されない。

例えば、第１実施形態では、サイクロン方式のエアーサンプラー１０を用いて空気Ａを捕集液３０に取り込んだが、本開示はこの構成に限定されるものではない。例えば、サイクロン方式以外の方式で大量の空気Ａを吸引又は吹き込むことが可能な捕集装置であれば、他の吸引又は吹き込み方式の捕集装置を用いて、空気Ａを捕集液３０に取り込んでもよい。

また、第１実施形態では、捕集液３０に含まれる微生物の栄養となる有機物として、ペプトンを用いたが、本開示はこの構成に限定されるものではなく、微生物の栄養となる有機物であれば、他の有機物を用いてもよい。

また、第１実施形態において、捕集液３０を保温するときの微生物Ｍの生育に適した温度、捕集液３０を保温する時間は、変更可能である。

更に、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々なる態様で実施し得る。複数の実施形態及び変形例等は、適宜、組み合わされて実施可能である。

１０ エアーサンプラー
１２ 容器
３０ 捕集液
Ｍ 微生物

Claims (3)

1. 空気を界面活性剤及び微生物の栄養となる有機物を含む捕集液中に取り込む捕集工程と、
   前記捕集液中に取り込まれた微生物の量と相関関係があるＡＴＰの存在量を測定する測定工程と、
   を有する空中浮遊微生物量の評価方法。
2. 前記測定工程で前記ＡＴＰの存在量が少ない場合は、前記捕集液を前記微生物の生育に適した温度で保温して前記微生物を培養し、所定時間が経過した後に、前記ＡＴＰの存在量を再度測定する請求項１に記載の空中浮遊微生物量の評価方法。
3. 前記有機物は、ペプトンである請求項１又は請求項２に記載の空中浮遊微生物量の評価方法。