JPH01132370A

JPH01132370A - 細胞融合装置

Info

Publication number: JPH01132370A
Application number: JP29031687A
Authority: JP
Inventors: Tomoko Shinomura; 知子篠村
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-11-17
Filing date: 1987-11-17
Publication date: 1989-05-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は細胞融合装置に関し、特に融合用チャンバ内に
音響学的ラム波を発生させるための、超音波振動発生手
段を設けて、融合剤、細胞等を保持する溶液および細胞
自体に振動を与えることにより、細胞融合の促進を図っ
た細胞融合装置に関する。

〔従来の技術〕

従来の細胞融合装置では、細胞同志が接着するか、ある
いは、細胞膜の一部が融合した後の細胞質の融合の過程
を促進する特別の手段を設けていなかったため、融合が
途中で止まったり、融合完了までに要する時間の長さが
数時間以上に及ぶ場合もあった。

また、従来の、融合剤を用いる細胞融合装置では、細胞
を保持するチャンバに特別な溶液攪拌手段を設けておら
ず、自然の拡散のみによって形成される細胞同志の接着
の頻度が低く、１０４個／ｍＱより低密度の細胞試料で
融合細胞を効率良く得られなかった。

なお、細胞融合の標準的プロセスに関しては、例えば、
竹内等編の「植物組織培養の技術Ｊ７４−７７頁（朝食
書店、　１９８３年）の記載が参考になる。また、細胞
融合装置として関連するものには、例えば、特開昭６０
−１２９６９号、同６１−２０９５９２号公報に開示さ
れた装置が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記従来技術は、細胞密度が１０４個／ｍＱ以上の高密
度の試料を対象としており、１０４個／ｍＱより低密度
の試料を扱う場合、あるいは、本出願人が先に特願昭６
０−１７２１４３号「細胞融合装置」に捉案じた（特開
昭６２−３２８７４号公報参照）、融合用チャンバ中に
細胞を２個ずつしか保持しないような場合には、細胞が
チャンバに付着する、あるいは、細胞同志が接着し合う
頻度が低い、更には、接着状態のまま融合が完了しない
ものもある等の理由で、融合効率が低いという問題があ
った。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、その目的と
するところは、従来の細胞融合装置における上述の如き
問題を解消し、上述の如き低密度の細胞試料でも、融合
細胞を効率良く得られるような細胞融合装置を提供する
ことにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の上記目的は、細胞融合を行わせるための、溶液
および細胞を保持する融合用チャンバを有する細胞融合
装置において、前記融合用チャンバに、超音波振動発生
手段を設けたことを特徴とする細胞融合装置によって達
成される。

〔作用〕

本発明に係わる細胞融合装置おいては、融合用チャンバ
内に音響学的ラム波を発生させるための超音波発生手段
を設けることにより、溶液および細胞に振動を与えるこ
とができる。これにより、融合剤を用いる細胞融合用チ
ャンバでは、溶液および細胞の攪拌が行われ、細胞同志
がぶつかり合って接着する確率が高くなる。また、接着
した細胞および電気融合等によって細胞膜の一部が融合
した細胞は、振動を受けることによって、細胞膜の脂質
層および細胞質の流動性が高くなり、融合が促進される
。

第３図は、２個の細胞間の細胞融合の過程を模式的に示
すものである。（ａ）に示す如く接触している細胞同志
は、融合剤あるいは電気パルスの影響で、（ｂ）に示す
如く膜の一部が融合する。はとんどの場合、この過程は
比較的短時間（数秒以内）に完了するが、その後、細胞
膜および細胞質の融合が進んで、（ｅ）に示す如く、形
態的に見ても融合細胞が一個の細胞としての様相を示す
ようになるまでに要する時間は、−様ではない。

短い場合は数秒以内に完了することもあるが、通常、何
も処理をしない場合は、（ｂ）の状態から（ｅ）の状態
に達するまでに、３０分から数時間を要し、中には、（
ｃ）または（ｄ）様のままで進行が停止しているように
見えることもあった。このような場合に、チャンバに設
けた超音波振動子に、後述する如く、１５〜２０ｖ　、
　５０に−Ｉ　ＭＨｚの電圧を３〜４秒間のパルスとし
て１回〜数回印加すると、溶液を通じて振動が細胞に伝
搬し、その結果、３０分以上形態的に何も変化の見られ
なかった融合途中の細胞に変化が生じ、数分以内に（ｅ
）の状態まで進行して融合の完了した例が見られた。

（ｂ）の状態（融合の初期）と（ｄ）の状態（同後期）
のまま、３０分以上融合の進行が停止しているものに上
述の如き刺激を与えた場合、１０分以内に融合の完了し
た割合は、前者で約３０％、後者では約４５％であった
。従来の装置では、上記（ｂ）以降の過程は細胞自身の
流動性のみによって進行させているが、本発明において
は、長時間融合過程が停止しているもの、あるいは、非
常にゆっくり進行しているものについても、下記の如く
、融合過程を促進させることができる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図面に基づいて詳細に説明する
。

第１図は、本発明の一実施例を示す細胞融合装置の要部
を示すものであり、図（ａ）は縦断面図、（ｂ）は斜視
図である。図において、】０は円環状のチャンバ、６０
は圧電セラミック、圧電フィルム等の超音波振動子、７
０は試料支持板、８０および９０は電極を示している。

上記チャンバ１０および超音波振動子６０は、試料支持
板７０上に接着されており、細胞３０および融合剤を含
む溶液２０を上記チャンバ１０に保持する。電極８０お
よび９０に電圧を印加することにより、振動子６０は上
下方向に、厚み振動をする。

この振動は、試料支持板７０において、ラム波に変換さ
れて伝搬する。円環状の振動子６０の内側に伝搬した波
は、円環の中心、すなわち、チャンバ１０付近に集中し
、溶液２０にキャビテーションを惹き起こす。これによ
って、細胞３０を含む溶液は攪拌され、細胞同志が接触
する機会が多くなり、細胞の接着の効率が向上する。

上記試料支持板７０を、光学的に透明な材質で構成する
ことにより、光学顕微鏡下で細胞融合処理を行うことが
できる。細胞の接着や、融合の進行状況、および、細胞
の破壊等のダメージを常時監視し、印加する電圧の大き
さおよび印加時間を調節することによって溶液の攪拌の
程度や時間を調節することができるよう、振動子を駆動
するパワーアンプは出力および周波数の可変つまみを有
するものを用いた。

上述の如く構成された本実施例の細胞融合装置を用いて
行った実験の結果を以下に述べる。

本実験では、直径１ｍｍのチャンバを構成し、１μＱの
溶液中に細胞を２〜数個保持して、融合剤（ポリエチレ
ングリコール、デキストラン等）を添加後、パワーアン
プから２０−４０　ｖ　、　５０　Ｋ　−Ｉ　Ｍ　Ｈｚ
の正弦波あるいは方形波を連続的に３０秒から数分間出
力し、細胞同志の接着を誘起して融合細胞を得ることが
できた。また、上記３０秒から数分間出力する超音波を
、間欠的ないしはパルス状に与えた場合にも、同様な効
果を得た。

第２図は、本発明の他の実施例を示す細胞融合装置の要
部を示す断面図である。本実施例においては、チャンバ
１０の底を「すり鉢」状に構成し、超音波振動子６０を
チャンバ１０に密着させている。

本実験では、チャンバ１０に細胞３０を保持し、融合剤
を含む溶液２０を添加する。電圧を印加して溶液２０を
攪拌し、すみやかに融合剤の濃度を均一にした後、電圧
の印加を中止する。溶液２０の比重を細胞３０の比重よ
り小さい値に設定しておくと、細胞３０は重力に従って
チャンバ底部に沈降する。

チャンバ底部はすり鉢状になっており、すり鉢の底に集
合した細胞は、隣り合う細胞同志で接着し、融合する。

添加する融合剤の濃度を予め低めにしておき、後から少
量ずつ融合剤を加え、上記電圧の印加・中止を行うと効
果的である。

この操作を繰り返すことにより、細胞にとっては毒性の
ある融合剤の濃度をできるだけ低く押えた条件下で、少
数個の細胞を試料としてすみやかに融合処理を行い、効
率良く融合細胞を得ることができた。なお、チャンバを
遠心分離機に装着して、短時間で細胞を沈降・接着させ
ることも可能である。

第４図、第５図および第７図は、本発明の更に別の実施
例を示すもので、電気融合用チャンバに超音波振動子を
設けた例であり、第５図は、前述の、本出願人が先に特
願昭６０−１７２１４３号「細胞融合装置」に提案した
、融合用チャンバ中に細胞を２個ずつしか保持しないよ
うな細胞融合装置に本発明を適用した例を示している。

また、第７図は、特開昭６１−２１９３８６号公報に開
示されている細胞融合装置に適用した例を示している。

これらの実施例では、チャンバ１０に、融合用の細胞を
含む溶液２０を注入すると、細胞が融合用電極４０およ
びチャンバ内壁面に多数付着し、中には強く付着して、
交流電流を融合用電極４０間に印加しても離れず、その
ままでは、細胞を融合に好適な位置まで泳動できないも
のが多く生じた。

このときに、チャンバ外壁に設けた超音波振動子に、２
０−４０　ｖ　、　５０　Ｋ−Ｉ　Ｍ　Ｉ（ｚの電圧を
適当な時間印加すると、溶液２０に穏やかなキャビテー
ションが生じ、溶液および細胞が攪拌される。このとき
、融合用電極およびチャンバ内壁に付着していた細胞は
遊離するので、再び付着する前に、交流電流を印加して
、細胞を所定の位置に泳動させ、電気融合を行うことが
できた。

第６図に、微小チャンバに細胞を２個保持して電気融合
を行う場合の模式図を示す。（ａ）の場合細胞３０が、
融合用電極およびチャンバ内壁に付着してしまい、その
ままでは、電気融合を行えないが、超音波振動子の振動
によって細胞は遊離するので、（ｂ）に示す如く、細胞
を融合に最適の位置まで移動させることができた。

上記電気融合のいずれかの実施例においても、融合のた
めの直流電流パルスを印加すると、接触している細胞間
の細胞膜が一部融合する。このときの電圧を高くするか
、あるいは、印加時間を長くすると、融合は早く進行す
るが、細胞へのダメージが大きい。そこで、印加電圧は
できるだけ低く、時間も短く抑えたいが、この場合、第
３図の（ｂ）から先へ融合が進行するのに長時間を要し
たり、あるいは、進行が停止するものが多くなる。

ここで、チャンバに設けた超音波振動子に電圧を印加し
、振動を溶液および細胞に伝播させることにより、融合
過程を促進することができる。

この場合、細胞に与えるダメージは、最小に抑えられて
いるので、その後の培養における細胞の活性は良好に保
てる。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明によれば、細胞融合を行わせる
ための溶液および細胞を保持する融合用チャンバを有す
る細胞融合装置において、前記融合用チャンバ内に音響
学的ラム波を発生させるための超音波振動発生手段を設
けたので、上述の如き低密度の細胞試料でも、融合細胞
を効率良く得られるような細胞融合装置を実現できると
いう顕著な効果を奏するものである。

特に、本発明によれば、細胞のチャンバ内壁や電極への
付着を防止でき、細胞の接着頻度を高めることができる
ので、少数個の細胞を試料とじて融合を行わせる場合の
融合効率の向上に効果が大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ）は本発明の一実施例を示す細胞融合装置の
要部を示す断面図、同（ｂ）はその斜視図、第２図は他
の実施例を示す細胞融合装置の要部を示す断面図、第３
図（ａ）〜（ｅ）は２個の細胞間の細胞融合の過程を模
式的に示す図、第４図、第５図および第７図は本発明の
更に別の実施例を示す断面図、第６図は微小チャンバに
細胞を２個保持して電気融合を行う場合の模式図である
。１０：チャンバ、２０：細胞と融合剤を含む溶液、３０
：細胞、４０：融合用電極、６０：超音波振動子、７０
：試料支持板、８０，９０：電極。特許出願人　株式会社　日立製作所

Claims

【特許請求の範囲】１、細胞融合を行わせるための、溶液および細胞を保持
する融合用チャンバを有する細胞融合装置において、前
記融合用チャンバに、超音波振動発生手段を設けたこと
を特徴とする細胞融合装置。２、前記超音波振動発生手段が、比較的小面積の前記融
合用チャンバの周囲に、円環状に配置されることを特徴
とする、特許請求の範囲第１項記載の細胞融合装置。３、前記比較的小面積の融合用チャンバの底部がすり鉢
状に構成されていることを特徴とする、特許請求の範囲
第２項記載の細胞融合装置。４、前記融合用チャンバが、細胞保持プレート上に配置
されている複数の凹部であることを特徴とする、特許請
求の範囲第１項記載の細胞融合装置。５、前記融合用チャンバが融合用電極を有する電気融合
用チャンバであり、前記超音波振動発生手段が、前記電
気融合用チャンバの融合用電極に近接して設けられてい
ることを特徴とする、特許請求の範囲第１項記載の細胞
融合装置。