WO2008156206A1 - フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法 - Google Patents

フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法 Download PDF

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WO2008156206A1
WO2008156206A1 PCT/JP2008/061593 JP2008061593W WO2008156206A1 WO 2008156206 A1 WO2008156206 A1 WO 2008156206A1 JP 2008061593 W JP2008061593 W JP 2008061593W WO 2008156206 A1 WO2008156206 A1 WO 2008156206A1
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seq
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Yoshikazu Tanaka
Yukihisa Katsumoto
Yuko Fukui
Masako Mizutani
Noriko Nakamura
Junichi Togami
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    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a rose artificially containing flavone and malvidin.
  • the present invention also relates to a method for altering the rose flower color by a co-pigmentation effect caused by the inclusion of flavone and malvidin by genetic manipulation, particularly a method for changing the flower color in the blue direction.
  • Flavonoids are typical secondary metabolites of plants and have the basic skeleton of C6C3C6 as shown below, and are synthesized from phenylalanine and malonyl CoA. Depending on the oxidation state of the C ring, it is classified into flavones and flavonols.
  • Flavonoids absorb ultraviolet rays and remove radicals, so it was thought that they originally had a function to protect plants from various stresses. In recent years, it has also attracted attention as a healthy ingredient (see Harborne and Williams 2000 Phytochemistry 55, 481-504).
  • anthocyanidin has (1) Pelargoni, which is often found in orange to red flowers. Gin (pe 1 a rgonidin)> (2) Cyanidin and peonidin, which are common in red to red flowers, and (3) Delphinidine, which is common in purple to blue flowers in), petunidin (pe tun id in) and malvidin (ma 1 vidin) are common.
  • anthocyanin has a great influence on its color. Blue tint increases as the number of hydroxyl groups on the B ring of anthocyanin increases. Therefore, delphindine-type anthocyanins are blue compared to pelargonidin-type anthocyanins and cyanidin-type anthocyanins.
  • the biosynthesis of flavonoids, including anthocyanins, is well preserved across plant species. Flavonoids are biosynthesized in the cytoplasm, added to sugars and acyl groups, and then transported and accumulated in the vacuole (Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, ⁇ 24, and Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th, Flowering and its manipulat ion, pp. 201-239, Blackwell Publishing Ltd.).
  • This method of artificially modifying plant metabolism is sometimes called metabolic engineering.
  • the enzyme gene that produces the target substance may be expressed in a recombinant plant.
  • the target gene often competes with the endogenous enzyme of the plant itself. In many cases, the accumulation of material does not occur at all or hardly, and it does not result in industrially useful traits.
  • Petunia hybrida cannot accumulate perargondin due to the specificity of its dihydroflavonol reductase (hereinafter referred to as “DFR”), so orange flower-colored varieties naturally exist. do not do.
  • DFR dihydroflavonol reductase
  • anthocyanins turn blue due to intramolecular pigment action as the number of attached aromatic acyl groups increases.
  • Antocyanes with two or more aromatic acyl groups are called polyacylated anthocyanins and have a stable blue color (see Harborne and Williams 2000 phytochemi stry 55, 48 504 504).
  • anthocyanin dye which is an essential dye
  • the color of the flower changes depending on the flavonoids (also called covigment), metal ions, and the pH of the vacuole.
  • flavonols and flavonols are typical pigments that have the effect of making anthocyanins blue and darker by stacking them together with anthocyanins and sandwiches (Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl.
  • flavone is a colorless auxiliary pigment component.
  • isovitexin isov 1 texin
  • isovitexin exerts a pigment effect on anthocyanins in Japanese garden iris (Iris ensata Thunb-) and makes the color blue.
  • Isovitexin has also been shown to stabilize the color of honeysuckle flowers by stabilizing anthocyanins.
  • flavones often have stronger pigmentation effects than flavonols.
  • analysis of gene recombination indicates that flavones have stronger pigmentation effects than flavonols (Fukui et a 1. See Phy tochemi st ry, 63, 15-23, 2003). Therefore, flavone accumulation is important to make the flower color blue
  • flavones are also involved in ultraviolet absorption, various stresses, and interactions with other microorganisms. By synthesizing flavones, plants with new traits can be obtained. (See Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-279182 for patent literature relating to a gene encoding flavone synthase). However, an example of flavone expression in rose is not yet known. Flavon is synthesized from flavonone by a reaction catalyzed by flavone synthase.
  • apigenin is synthesized from naringenin (nar ingenin)
  • luteolin is synthesized from eriodictyol
  • tricetin icet in is synthesized from pendant hydroxyflavanone.
  • flavone synthases There are two types of flavone synthases: flavone synthase I and flavone synthase II. Both catalyze the same reaction, but are different types of enzymes.
  • Flavone synthase I is a 2-oxoglycolate-dependent dioxygenase (Britsch et al. (1981) Z. Naturforsch 36c pp. 742-750, and Britsch (1990) Arch.
  • Flavone synthase II is a cytochrome P450 type monooxygenase.
  • the structural genes of flavone synthase II are trenian, goldfish, Perilla frutescens, gerbera (Gerbera hybr ida), Lind, (See Tanaka and Brugl iera 2006 Ainsworth, F lowering and its manipulat ion, pp. 201-239, B 1 ackwe 11 Publish ing Ltd.).
  • flavone synthase gene When the flavone synthase gene is expressed in a transgenic plant that does not produce flavones, flavones are expected to be synthesized. However, there was a report that when the flavone synthase gene of Trenia was expressed in petunia, the color of the dark blue-purple flower became lighter (Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004). In addition, when flavone synthase gene derived from Linda was expressed in tobacco, flavone was synthesized, but there was also a report that the color of the flower was still light (Nakatsuka et al.
  • Roses are the most popular flowering plant and have been cultivated since BC.
  • artificial breeding has been done for hundreds of years.
  • roses containing pelargonidin, cyanidin, flavonol and some flavonoids were obtained.
  • roses that produce delphinidin which is not found in natural roses, have also been made using genetic engineering techniques.
  • roses that accumulate flavones have not yet been obtained by mating or genetic recombination.
  • roses that accumulate both flavones and malvidin have not yet been obtained. Disclosure of the invention
  • the greatest advantage of using genetic recombination techniques for plant breeding is that, unlike breeding by crossing, plants can be improved using genes that cannot be crossed or genes from other organisms.
  • any gene of another species can be introduced into an arbitrary plant, such as a rose, and given a new ability to that plant.
  • Nora is different from model plants such as Arabidopsis (Arab idops is tha 1 i ana), Yuno, 'ko (tobacco (Nicot iana tabacum L-)), and whether the introduced gene functions or not. It is known to depend greatly on the origin of the gene and the promoter used.
  • flavone synthase gene It is easy to analogize the expression of flavone synthase, but which flavone synthase of dioxygenase type or cytochrome P450 type should be expressed, which flavone synthase gene of plant origin should be expressed, etc. Because it is not easy to analogize
  • the pigment effect is a phenomenon that occurs when anthocyanin and flavonol flavonol coexist in a vacuole at a certain concentration.
  • the pigment effect is modified by glycosylation of antocyanin, which is a color source. It has also been clarified that flavone flavonol, which is a bigumen cocoon, needs to be modified with a more suitable glycosylation, etc. (Na tu re. 2005 Aug 1 1; 436 (7052 ): 79 K and Na tu re,
  • Flavonols need to have an optimal structural combination, and trial and error on how modified anthocyanins and flavonols should coexist It will take. Moreover, even if the flavone synthase functions in roses, flavanones such as naringenin are not found in natural roses.
  • Flavone is not always synthesized from flavanone because it is rapidly hydroxylated by 3-hydroxylase (hereinafter abbreviated as “F3H”).
  • the present invention intends to provide a rose containing a pigment suitable for the desired color development in the rose.
  • the present inventor has found that the target color tone expression can be achieved by artificially containing flavones and malvin in roses as a result of various studies, and has completed the present invention.
  • the present invention is as follows:
  • the rose according to 6 above which is a gene encoding any of the above.
  • Flavonoid 3 ′, 5 ′ monohydroxylase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8;
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 has an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and substitution by amino or other amino acids. Flavonoid 3 ', 5' — hydroxylase,
  • Flavonoid 3 ′, 5′-hydroxylase having an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, or
  • Flavonoids 3 ′ and 5 ′ monohydroxylase encoded by a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 under high stringency conditions, The rose according to any one of 2 to 8, which is a gene encoding any one of the above.
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10 has an amino acid sequence modified by addition or deletion of one to several amino acids and / or substitution by other amino acids Methyltransferase,
  • the change in flower color is the hue angle in the L * a * b color system chromaticity diagram.
  • a rose J is a generic term for ornamental plants that are deciduous shrubs of the order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa. It is not intended to be limited to a particular variety, and it means the whole plant or the part that usually contains flowers.
  • high stringent conditions refers to, for example, 6 XSSC (composition of 1 XSSC: 0.15 MN a C 1, 0.0 1 5 M sodium kennate. Rhodium, pH 7.0), 0.5% SDS, 5X Denhardt, lOOig Zml, denatured fragmented salmon sperm DNA, 50% formamide, in the antisense strand and the target Incubate with nucleic acid overnight at 55 and wash under conditions such as 0.1 XSSC and / or above 60, especially non-specific signals in the background. This is a condition that no longer exists.
  • hue angle (0) in the L * a * b color system chromaticity diagram is standardized by the International Certification Committee (CIE) in 1966 when used in this specification.
  • CIE International Certification Committee
  • the color of the flower can be expressed by using the hue angle in combination with the color of the RHS (Royal Horticultural Society).
  • flavone synthesis gene flavone synthesis gene, flavonoid 3 ', 5' monohydroxylase gene, and anthocyanin methyltransferase gene
  • perilla-derived flavone synthase II gene was introduced together with pansy-derived F3 ′ 5′H gene and the like.
  • flavones were not detected in roses introduced with perilla-derived flavone synthase II gene, indicating that this gene does not function in roses.
  • flavones were detected in roses introduced with the flavone synthase II gene derived from Trenia or goldfish, and it was found that the flavone synthesis gene functions in roses.
  • flavone synthase II In addition to the F3'5'H gene of pansy and pansy, by introducing a B-ring methyltransferase gene, methylated delphinidin-type antocyanin and flavone are accumulated in rose petals, and rose petals are more
  • the enzymes relevant to the present invention are typically enzymes having a specific amino acid sequence described in the sequence listing. However, in the case of an enzyme, a desired enzyme activity is maintained even if the amino acid sequence is modified not only in a specific, for example, native amino acid sequence, but also in a region other than the region involved in the conservative activity. It is well known. Therefore, the enzymes of the present invention are amino acids modified by addition or deletion of one to several amino acids and / or substitution with other amino acids to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: A protein having an acid sequence and maintaining the original enzyme activity, and an amino acid sequence having 90% or more sequence identity to the specific amino acid sequence shown in SEQ ID NO: Proteins that maintain enzyme activity are also included in the enzymes of the present invention.
  • an enzyme encoded by a nucleic acid having a base sequence indicated by a specific sequence number and a nucleic acid that hybridizes under high stringency conditions and having the desired enzyme activity is also included in the enzyme of the present invention. included.
  • examples of the enzyme gene involved in the present invention include the following.
  • Flavone (Luteol in 7-O-glucoside) was added to the various anthocyanins prepared in this way at a molar concentration ratio of 0, 1, 4 in a buffer solution of pH 5.0, and absorbed. The spectrum was measured. Cyan in (Cyan id in 3, 5-diglucoside ;, Delphin (Delphinidin 3, 5-diglucoside), Ma 1 v in (Malvidin 3, 5-diglucoside) is used as the anthocyanin. The concentration of anthocyanin was lmM for Cyanin, Delphin and Malvin.
  • Example 2 (Reference example): Introduction of pansy F3 '5' H # 40 gene and perilla flavone synthase gene into rose variety "Lavande"
  • PYFS3 a plasmid containing the perilla-derived flavone synthase gene described in JP-A-2000-279182, is digested with Xbal, blunt-ended, and further digested with BamHI to obtain about 1.8 kb perilla flavone synthase A gene fragment was obtained.
  • PSPB906 described in W02005 / 017147 was digested with Xhol, blunt-ended, and further digested with BamHI. Between this blunt end and the BamHI cleavage site, the above-mentioned perilla flavone synthase gene fragment was inserted to obtain 906-pY FS3.
  • 906-PYES3 is a perilla-derived flavone synthase between E 1 2 35S Promo Yui and D8 Yui Minine Ichiya (both described in W02005 / 017147) It has a prime gene.
  • PSPB1310 was defined as a vector in which the expression cassette of the F3 ′ 5 ′ H # 40 gene and the expression cassette of perilla flavone synthase were linked in the same direction.
  • This plasmid is constitutively expressed in plants in the pansy F3'5 ⁇ # 40 gene and perilla flavone synthase gene.
  • the PSPB1310 produced in this way was introduced into the mauve rose variety “Lavande” (maure rose variety Lavande), and 55 transformants were obtained. Accumulation of delphidinidine was confirmed, with a delphidinidine content of up to 70% (average 26%) However, no flavone was detected, and perilla-derived flavone synthase gene functions in rose cells It was inferred that this was not done.
  • the plasmodium inserted in the EcoRI and Xhol sites of the plasmid pB lues cript II SK (-) was transformed into pSP by the use of the Trenia-derived flavone synthase gene described in Akashi et al. B426. This was digested with Kpnl, blunt-ended, and further digested with BamH I to obtain an approximately 1.7 kb Trenia-derived flavone synthase gene fragment.
  • PSPB906 described in W02005 / 017147 was digested with Xhol, blunt-ended, and further digested with BamHI. Between this blunt end and the BamHI cleavage site, the above-mentioned Treya flavone synthase gene fragment was inserted to obtain 90 6 -426.
  • a plasmid into which a fragment of the F3 '5' H # 40 gene was inserted was designated PSPB575.
  • an about 3.3 kb Trelia flavone synthase gene expression cassette obtained by digesting the above-mentioned 906-426 with Ascl was inserted.
  • PSPB 1309 a vector in which the expression cassette of F3'5 'H # 40 gene and the flavone synthase expression cassette of Trelia were linked in the same direction was designated as PSPB 1309.
  • This plasmid is expressed in plants in a constitutive manner in the pansy F3'5'H # 40 gene and the flavone synthase gene of Treya.
  • the pSPBl 309 produced in this way was introduced into a mauve rose variety “Lavande”, and 50 transformants were obtained.
  • 36 were able to confirm the accumulation of delphinidin, with a delphidinidine content of up to 45% (average 12%).
  • the accumulation of flavones was confirmed in 35 individuals by the action of the trenia-derived flavone synthase gene. The total amount of flavones was the highest, with a high content of 1.68 mg per lg fresh petal weight.
  • De 1 Delphidinidine, Cya: .Cyanidine, Pe 1: Pelargonidin, M: Milysetin, Q: Quercetin, K: Kenferrol, Tri: Trisetine, Lut: Luteolin, Ap i: Apigenin
  • the pSPB 1309 described in Example 3 was introduced into the salmon-pink rose variety “WKS124” (salman-pink rose variety “WKS124”) to obtain 40 transformants.
  • Delphidinidine accumulation was confirmed in 26 out of 27 individuals subjected to dye analysis, and the delphidinidine content was up to 96% (average 81%).
  • flavone trisetin, luteolin, apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, with a high content of 4.41 mg per lg fresh petal weight.
  • De 1 Delphidinidine, Cya: Cyanidine, Pe 1: Pelargonidin, M: Milysetin, Q: Quercetin, K: Kenferrol, Tri: ⁇ U cetin, Lut: Luteolin, Ap i: Apigenin
  • PSPB 1309 described in Example 3 was treated with Pacl, and was present in the vicinity of the junction of the Trepane-derived flavone synthase expression cassette and the pansy-derived F3 '5'H # 40 gene expression cassette (more strictly Pansy F3 '5'H by cleaving the Pacl site and the Pacl site in the multicloning site of the vector in the flavone synthase expression cassette D8. A # 40 gene expression cassette was cut out.
  • the binary vector pSPB 1530 having the methyltransferase gene expression cassette described in W02003-062428 was cleaved with Pacl, and the above pansy F3'5'H # 40 expression cassette was added thereto.
  • TMT-BP40 This plasmid is called TMT-BP40.
  • PSPB 1309 was cleaved with Ascl to cut out the flavone synthase-expressing cassette of Trelia. This was inserted into the Ascl site of TMT-BP40 in the same direction as these expression cassettes, and the resulting plasmid was designated PSFL535.
  • This plasmid constitutively expresses the pansy F3 '5'H # 40 gene, the trelia methyltransferase gene, and the treflav flavone synthase gene in plants.
  • the PSFL535 thus obtained was introduced into a salmon pink rose “WKS 124” to obtain 173 transformants.
  • 98 transformants that were analyzed for anthocyanidins 88 were able to confirm the accumulation of malvidin (antocyanidins methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin) and derived from pansy in rose petals.
  • the product showed that the F3 '5'H # 40 gene and the torenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were functional.
  • the malvidin content was a maximum of 84% (average 50%).
  • flavones trisetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was highest, with a high content of 4.58 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin was detected in 51 individuals.
  • Example 6 Introduction of pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, trenia-derived flavone synthase gene and trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "Lavande"
  • PSFL535 described in Example 5 was introduced into a mauve rose variety “Lavande” to obtain 130 transformants.
  • 37 were able to confirm the accumulation of malvidin (antocyanidin methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin) and derived from pansy in rose petals.
  • the product showed that the F3 '5' H # 40 gene and the Trenia derived anthocyanin methyltransferase gene are functioning.
  • the maximum malvidin content was 55.6% (average 20.5%).
  • flavone trisetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was highest, with a high content of 5.11 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
  • Example 7 Introduction of pansy-derived F3 '5' H # 40 gene, trenia-derived flavone synthase gene and trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene into rose variety "WKS82"
  • PSFL535 described in Example 5 was introduced into a mauve rose variety "WKS82" to obtain 250 transformants.
  • 232 transformants that were analyzed for antocyanidin 110 were able to confirm the accumulation of malvidin (antocyanidin methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin).
  • the product showed that the pansy F3 '5 ⁇ # 40 gene and the torenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were functional.
  • the maximum content of malvidin was 65.2% (average 19.7%).
  • flavones trisetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, with a high content of 4.71 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin or luteolin was detected in 80 individuals.
  • Example 8 Introduction of Pansy-derived F3 '5'H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene and Trenia-derived an ⁇ cyanine methyltransferase gene to rose variety "WKS140"
  • PSFL535 described in Example 5 was introduced into a mauve rose variety “WKS140” to obtain 74 transformants.
  • 74 transformants analyzed by antocyanidin 20 were able to confirm the accumulation of malvidin (antocyanidin methylated at the 3 'and 5' positions of delphinidin) and rose petals.
  • the product showed that the pansy F3 '5'H # 40 gene and the torenia-derived anthocyanin methyltransferase gene were functioning.
  • the maximum malvidin content was 51.3% (average 33.5%).
  • flavone trisetin, luteolin, and apigenin
  • the total amount of flavones was the highest, with a high content of 3.04 mg per lg fresh petal weight.
  • methylated tricetin or luteolin was detected in 20 of the transformants producing flavones.
  • Example 9 Propagation of flavone and malvidin to progeny
  • One pan-derived F3 '5' H # 40 gene, Trenia-derived flavone synthase gene, and Trenia-derived anthocyanin methyltransferase gene Cross between roses and cultivated roses
  • Example 1 Propagation of flavone synthesis ability to progeny
  • Example 1 Evaluation of flower color of roses containing flavones
  • Hue angle (hue): In the L * a * b * color system, the axis of a * (red direction) is 0 °, and the position of the color can be determined from the angle moved relative to the counter-clockwise hue. What I did. If it is 90 °, it is yellow, 180 ° is green, 270 ° is blue, and 0 ° ( 360 °) is red. That is, the closer the value is to 270 °, the bluer the hue.
  • roses which are popular flowering plants as ornamental plants, can be changed to a blue color by the pigmentation effect by adding flavones and malvidin by genetic recombination techniques. Can do. Roses with blue flowers are expected to be in demand as ornamental plants.

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Abstract

本発明は、遺伝子組換え手法によりフラボン及びマルビジンを含むことを特徴とするバラを提供する。当該フラボン、及びマルビジンは、典型的には、それぞれ、導入されたフラボン合成酵素遺伝子、並びにパンジー由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子及びアントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子の発現によって生成される。前記フラボン合成酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子であり、具体例として、ゴマノハグサ科キンギョソウ由来のフラボン合成酵素遺伝子、及びゴマノハグサ科トレニア由来のフラボン合成酵素遺伝子である。また、フラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子は、例えば、パンジー由来のフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子である。また、アントシアニンのメチル基転移酵素遺伝子は、例えば、ゴマノハグサ科トレニア由来のメチル基転移酵素遺伝子である。

Description

明 細 書 フラボン及びマルビジンを含むバラ及びその生産方法 技術分野
本発明は、 フラボン（flavone)及びマルビジン（ma lv id in)を人為 的に含有させたバラ （a rose)に関する。 本発明は、 遺伝子操作によ り フラボン及びマルビジンを含めることにより生ずるコピグメンテ ーショ ン効果（co- pigment at ion effect)によりバラの花色を改変す る方法、 特に花色を青色方向に変化させる方法にも関する。 - 背景技術
花は植物の生殖器官であり次の世代となる種子を生産するために 必要である。 種子を形成するためには花粉がめしべに付着し、 受精 することが必要である。 通常花粉の運搬は、 蜂や蝶などの昆虫や、 ハチド リ、 まれにはコゥモリ により行われる。 花弁の役割は花粉を 運ぶこれらの生物を魅了することにあり、 植物はそのために、 花の 色や形、 模様に工夫を凝らしている。
花の色は鑑賞の際にも花卉の最も重要な形質であることから、 古 くから様々な色の花が交配によって育種されてきた。 しかしながら 、 ひとつの植物種の花があらゆる色をもつ場合は少なく、 たとえば 、 交配により作製されたバラ （rose (Rosa hybrida) ) , 力一ネーショ (carnat ion (Dianthus caryophyl lus) ) , キク （chrysan themum (Chr yanthemum mor i fol ium) ) , ユリ （1 i ly (Li 1 ium spp. ) )などには紫力、 ら青の品種力 sなく、 ノヽナショ ウブ（Japanese garden iris (Iris ens ata thumb. ))やリ ン ドウ （gent ian (Gent iana t r i flora) )には鮮やか な赤い品種はない。 花色のうち、 淡い黄色から赤色、 青色はフラボノイ ド （f lavonoid )及びアン トシァニン（anthocyan in) (フラボノィ ドに属する有色配 糖体） に由来することが多い。 フラボノイ ドは植物の代表的な二次 代謝物で、 以下に示すように、 C6C3C6の基本骨格をもち、 フエニル ァラニンとマロニル CoAから合成される。 C環の酸化状態により、 フラボン、 フラボノール（Havonol)などに分類される。
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卜リセチン フラポ /一 ft フラボン
フラボノイ ドは、 紫外線を吸収したり、 ラジカルを除去したりす るので、 もともとは植物体を様々なス トレスから保護する機能を担 つていたと考えられる。 また健康によい成分としても近年注目され ている （Harborne and Williams 2000 Phy tochemi s t ry 55, 481-504 参照）。
有色のアン トシァニンには、 数百分子種が知られているが、 以下 に示すように、 その発色団であるアン トシァニジン（anthocyanidin )には、 （ 1 ) オレンジ色から赤色の花に多いペラルゴ二ジン（pe 1 a rgonidin) > (2 ) 赤色から紅色の花に多いシァニジン（cyani din) 及びぺォニジン（peonidin)、 並びに （ 3) 紫から青色の花に多いデ ルフィ二ジン（del ph in id in)、 ペチュニジン（pe tun id in)及びマルビ ジン（ma 1 v i d i n)の 6種が一般的である。
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アン トシァニンの構造はその色に大きな影響を与える。 アン トシ ァニンの B環の水酸基数が増えると青みが増す。 従って、 デルフィ 二ジン型アン トシァニンは、 ペラルゴ二ジン型アン トシァニン、 シ ァニジン型アン トシァニンに比べ青い。 アン トシァニンを含むフラ ボノイ ドの生合成は、 植物種を超えてよく保存されている。 フラボ ノイ ドは細胞質で生合成され、 糖やァシル基が付加した後に、 液胞 へと輸送され蓄積される （Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80, 卜 24、 及び Tanaka and Brugl iera 2006 A inswor th 編、 Flowering and its manipulat ion, pp.201-239, Bla ckwell Publ ishing Ltd.参照）。
生合成に関わる酵素の構造遺伝子はすべてクローニングされてい る。 組換え植物を作製できれば、 これらの遺伝子の発現を人為的に 調整することにより花で蓄積するフラボノィ ドの構造と量を改変し 、 花色を変えることができる （Tanaka et al. 2005 Plant Cell, Ti ssue and Organ Culture 80, 1-24, 及び Tanaka and Brugl iera 20 06 Ainswor th 編、 Flowering and its manipulat ion、 pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。 たとえば、 花弁でデルフィ二 ジンを生産できない力一ネーショ ンゃバラにおいて、 デルフィニジ ンを合成するために必要なフラボノイ ド 3', 5'—水酸化酵素 （以下 、 「F3' 5'H」 と略す。 ） 遺伝子を発現させることにより、 デルフィ 二ジンを生産させ、 自然にはない青い花を作製した例がある （Tanak a 2006 Phytochemistry Reviews 5， 283- 291参照）。
このように植物の代謝を人為的に改変する方法は代謝工学と呼ば れることがある。 代謝を改変し、 目的の物質を蓄積させるためには 、 目的の物質を生産する酵素遺伝子を組換え植物において発現させ ればよいが、 しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、 目的の物質の蓄積がまったく、 あるいはほとんど起こ らず、 産業上 有用な形質を持つに至らないことも多い。
たとえば、 ペチュニア （Petunia hybrida)はそのジヒ ドロフラボ ノール還元酵素 （以下、 「DFR」 と略す。 ） の特異性のためにペラ ルゴンジンを蓄積できず、 したがってオレンジ色の花色の品種は天 然には存在しない。
バラなどの DFR遺伝子を導入することによりペラルゴ二ジンを蓄 積させたオレンジ色のペチュニアが報告されているが、 ペラルゴ二 ジンを蓄積させるためには、 DFRと競合するフラポノィ ド 3'-水酸化 酵素 （以下、 「F3'H」 と略す。 ） 、 F3' 5'H、 フラボノール合成酵素
(以下、 「FLS」 と略す。 ） の遺伝子が欠損しているペチュニア品 種を用いる必要があり、 これらが欠損していないペチュニアにバラ の DFR遺伝子を導入しても表現型の変化は認められない （Tanaka an d Brugl iera 2006 Ainsworth 編、 Flowering and its manipulat io n、 pp.201-239, Blackwell Publ ishing Ltd.参照）。 したがって目 的の遺伝子を単に導入するだけで目的の化合物が蓄積し表現型があ らわれるかどうかは予想できない。
さ らに、 代謝工学においては予想外の結果が出ることも多い。 た とえば、 トレニァ （Torenia hybr i da)においてフラボン合成酵素遺 伝子の発現を抑制したところ、 フラボン量が減少し、 フラバノ ン （f lavanone)の蓄積が見られた。 フラバノ ンが蓄積すればアン トシァ ニン量は増加するはずであるが、 実際にはアン トシァニン量も減少 した （Ueyama et al. Plant Science, 163， 253-263, 2002) 。 こ のように代謝物の増減を予想することは困難で目的の表現型を得る ためには鋭意工夫が必要である。
また、 アン トシァニンは結合する芳香族ァシル基の数が増えると 分子内コピグメン ト作用により青くなる。 2つ以上の芳香族ァシル 基をもつアン トシアンはポリアシル化アン トシァニンと呼ばれ、 安 定な青い色を呈する （Harborne and Williams 2000 phytochemi s t r y 55, 48卜 504参照） 。
必須色素であるアン トシァニン色素自体の構造によるほか、 共存 するフラボノイ ド （コビグメン トともいう） や金属イオン、 液胞の p Hなどによっても花の色は変化する。 たとえば、 フラボンゃフラ ボノールは、 代表的なコピグメン トで、 アン トシァニンとサン ドィ ツチ状に積み重なることにより、 アン トシァニンを青く し、 濃く見 えるようにする効果がある （Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl.
Prod. 52参照） 。 この点で、 フラボンは無色の補助色素成分であ るといえる。 たとえばフラボンの一種であるイソビテキシン （isov 1 texin) はノヽナショ ウブ (Japanese garden i r i s (Iris ensata Thunb - ))においてアン トシァニンに対しコピグメン ト効果を発揮し、 色 を青くする。 また、 イソビテキシンはアン トシァニンを安定化する ことによりハナショ ウブの花の色を安定化することも示されている
(Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 卜 5参照） 。 また、 フラボンはフラボノールより も強いコピグメン ト効采 示 すことが多い たとえば遺伝子組換え力一ネーショ ンの解析ではフ ラボンがフラポノールより もコピグメン ト効果が強いことが示され ている （Fuku i et a 1. Phy tochemi s t ry, 63, 15-23, 2003参照) 。 したがって、 フラボンの蓄積は花の色を青くするために重要である
。 しかしながら 、 すべての植物がフラボンを生産できるわけではな く、 バラゃぺチュニァなどはフラボンを蓄積しないことが知られて いる。 また、 フラボンは、 花色以外に、 紫外線の吸収 、 さまざまな ス ト レス、 他の微生物との相互作用などにも関与しており、 フラボ ンを合成させることにより新しい形質を持った植物を得ることがで きることも知られている （フラボン合成酵素をコー ドする遺伝子に 関する特許文献として、 特開 2000- 279182を参照のこと）。 しかしな がら、 バラにおいてフラボンを発現させた例は未だ知られていない フラボンはフラボン合成酵素が触媒する反応により フラバノ ンか ら合成される。 すなわち、 ァピゲニン（apigenin)はナリ ンゲニン （n ar ingenin)から、 ルテオリ ン（lu teo 1 in)はエリオジクチオール（er i odictyol)から、 ト リセチン （ icet in)はペン夕ヒ ドロキシフラバ ノ ンから合成される。 フラボン合成酵素には、 フラボン合成酵素 I とフラボン合成酵素 IIの 2種類がある。 両者は同じ反応を触媒する が、 異なるタイプの酵素である。 フラボン合成酵素 Iは 2-ォキソグ ル夕ル酸依存的なジォキシゲナーゼ （Britsch et al. (1981) Z. N aturforsch 36c pp. 742-750、 及び Britsch (1990) Arch. Biochem . Biophys.282 pp.152- 160参照） の 1種であり、 フラボン合成酵素 I Iはチ トクローム P450型のモノォキシゲナ一ゼである。 フラボン合 成酵素 IIの構造遺伝子は、 トレニァ、 キンギヨ ソゥ、 シソ （Perilla f rutescens)、 刀一ベラ （gerbera (Gerbera hybr ida) )、 リ ン ド、ゥな どから得られている （Tanaka and Brugl iera 2006 Ainsworth 編、 F lowering and its manipulat ion, pp.201-239, B 1 ackwe 11 Publish ing Ltd.参照）。
フラボン合成酵素遺伝子を、 フラボンを生産しない遺伝子組換え 植物において発現させると、 フラボンが合成されることが予想され る。 しかしながら、 ペチュニアにおいて トレ二ァのフラボン合成酵 素遺伝子を発現させたところ、 濃い青紫色の花の色が薄くなつたと の報告もある （Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004) また、 リ ン ドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで 発現させたところ、 フラボンが合成されたが、 やはり花の色は薄く なったとの報告もある （Nakatsuka et al. 2006, Molecular Breed ing 17 このように 、 フラボンが合成されても必ずしも花 色は冃 くならない 。 言い換えれば 、 コピグメン 卜効果を示さない原 因として、 アン 卜シァニンとフラボンの量や比が適切でないことや
、 ァン トシァニンとフラボンの糖やァシル基による修飾が適切では ない となどが挙げられる。 これらの結果から、 単にフラボン合成 酵素退伝子を発現させフラボンを蓄積させるだけでは花の色をより 青くすることはできないという ことが示唆される。
バラは最も人気のある花卉植物であり、 紀元前から栽培されてい た記録がある。 また、 数百年にわたり人為的な品種改良がされてき た。 その結果、 ペラルゴ二ジン、 シァニジン、 フラボノールといつ たフラボノイ ドを含むバラが得られている。 また、 近年では遺伝子 組換えの手法を用いて、 自然のバラにはないデルフィ二ジンを生産 するバラも作られている。 しかしながら、 フラボンを蓄積するバラ は、 交配によっても遺伝子組換えによっても未だ得られていない。 また、 フラボンとマルビジンの両者を蓄積するバラも未だ得られて いない。 発明の開示
植物の品種改良に遺伝子組換えの手法を用いることの最大の利点 は、 交配による品種改良と異なり、 交配することができない植物や 他の生物の遺伝子を利用して植物を改良できることである。 すなわ ち、 遺伝子組換えの手法を用いると他種の生物の任意の遺伝子を任 意の植物、 たとえばバラに導入し、 その植物に新しい能力を付与す ることができるとされている。 しかしながら、 ノ ラはァラビ ドプシ ス (Arab idops i s tha 1 i ana)や夕ノ、'コ (tobacco (Nicot iana tabacum L - ))などのモデル植物とは異なり、 導入した遺伝子が機能するかど うかはその遺伝子の起源や使用するプロモーターなどに大きく依存 することが知られている。
W02005/017147によれば、 フラボノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子 (F3' 5'H)をバラに導入した場合、 遺伝子組換えバラにおいて、 ペチ ュニァやリ ン ドウに由来する同遺伝子は発現せず、 デルフィ二ジン も検出されなかったが、 興味深いことにパンジー由来の同遺伝子は 発現し、 デルフィ二ジンを生産するという新しい能力をバラに付与 することができた。 この結果はバラにおいては、 どの植物種由来の 遺伝子を導入すれば機能するかは容易に類推できないことを示して いる。
また、 キクにおいてはある遺伝子を導入することができてもその 遺伝子がキクで機能するかどうかは予想することは困難であり、 ま た組換えキクの加齢にしたがって導入した遺伝子が機能しなくなる ことが知られている。 組換え植物において異種の遺伝子の転写によ く使用される力 リ フラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモーター は、 リ ン ドウにおいては機能しないことも報告されている （Mi shiba et al. Plant Journal 2005, 44: 54卜 556参照）。
フラボンをバラで合成させるためには、 フラボン合成酵素遺伝子 を発現させればよいことは容易に類推できるが、 ジォキシゲナーゼ 型又はチトクローム P450型のいずれのフラボン合成酵素を発現させ ればよいのか 、 どの植物起源のフラボン合成酵素遺伝子を発現させ ればよいのかなどについては、 容易に類推することはできないので
、 試行錯誤が要求される。 また 、 ピグメン ト効果は液胞中にアン 卜シァ一ンとフラボンゃフラボノ一ルが一定の濃度で共存すれば生 じる現象であるが、 発色源であるァン トシァニンの配糖化等の修飾 状態に対し、 ビグメン 卜となるフラボンゃフラポノールがより適 合した配糖化等の修飾を受けていることが必要であることも明らか にされている （Na t u re. 2005 Aug 1 1 ; 436 (7052) : 79 K 及び Na t u re,
358 • 5 15- 5 18 ( 1992)参照）
つまり、 必要な色調発現のためには、 アン 卜シァ一ンとフラボン
• フラボノールが、 最適な構造上の組み合わせをとることが必要で あり 、 また 、 どのように修飾されたアン トシァニンとフラボン · フ ラ ノ —ルを共存させればよいのかという点についても試行錯誤を 要するであろう。 さ らに、 フラボン合成酵素がバラで機能したとし ても、 天然のバラではナリ ンゲニンなどのフラバノ ンはフラバノ ン
3-水酸化酵素（以下、 「F3H」 と略す。 ）により速やかに水酸化され るため、 フラバノ ンからフラボンが合成されるとは限らない。
従って、 本発明は、 バラにおける目的とする色調発現のために適 切な色素を含むバラを提供しよつとするものである。
上記の課題を解決するため、 本発明者は、 種々検討の結果、 バラ に人為的にフラボン及びマルビンンを含有せしめることにより 目的 とする色調発現が達成されることを見出し、 本発明を完成した 具体的には、 本発明は以下の通りのものである ：
1 . 遺伝子組換え手法により フラボン及びマルビジンを含むこと を特徴とするバラ （a rose) 0 2. フラボンを含み、 且つパンジー （Viola X wittrockiana)由来 のフラボノィ ド 3'， 5'—水酸化酵素及びアン トシァニンのメチル基 転移酵素の発現によりマルビジンを含む、 前記 1 に記載のバラ。
3. アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子、 フラボン合成酵 素遺伝子及びパンジー由来の 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によ り、 マルビジン、 フラボン及びデルフィ二ジンを有する、 前記 1又 は 2に記載のバラ。
4. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 前記 1〜 3のいずれかに記載のバラ。
5. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノヽグサ科キン千ョ ソゥ (Scrophulariaceae, Antirrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 前記 4に記載のバラ。
6. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノ \クサ科卜レニァ （Scrophulariaceae, Toren ia hybrida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 前記 4に記載のバラ。
7. 前記ゴマノハグサ科キンギヨ ソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、 のいずれかをコー ドする遺伝子である、 前記 5 に記載のバラ。
8. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミ ノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である'、 前記 6 に記載のバラ。
9. 前記パンジー由来のフラボノイ ド 3' , 5'—水酸化酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 8 に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボノイ ド 3' ， 5'一水酸化酵素、
( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及びノ又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボノィ ド 3'， 5' —水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8 に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボノィ ド 3', 5 '—水酸化 酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダイズする核酸によりコー ドされたフラボノ ィ ド 3' , 5'一水酸化酵素、 のいずれかをコー ドする遺伝子である、 前記 2〜 8のいずれかに記 載のバラ。
1 0. 前記アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子が、
( 1 ) 配列番号 1 0 に記載のアミ ノ酸配列を有するメチル基転移 酵素、
( 2 ) 配列番号 1 0 に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個 のアミ ノ酸の付加、 欠失及び/又は他のアミ ノ酸による置換により 修飾されたアミ ノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
( 3 ) 配列番号 1 0 に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するメチル基転移酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 9 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたメチル基 転移酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である、 前記 2〜 9のいずれかに 記載のバラ。
1 1 . アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子、 フラボン合成 酵素遺伝子、 及びパンジー由来の 3'， 5 '—水酸化酵素遺伝子の導入 前の宿主と比べて花色が変化している、 前記 2〜 1 0のいずれかに 記載のバラ。
1 2. 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 前記 1 1 に 記載のバラ。
1 3. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度
( Θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 前記 1 1 又 は 1 2 に記載のバラ。
1 4. 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 前記 1 1 に記載のバラ。
1 5. 前記 1〜 1 4のいずれか 1項に記載のバラと同じ性質を有 する、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 6. 遺伝子組換え手法により フラボン及びマルビジンを含める ことにより生ずるコピグメンテーシヨ ン効果によりバラの花色を改 変する方法。
1 7. 前記コピグメンテーシヨ ン効果が、 花色を青色方向に変化 させる効果である、 前記 1 6に記載の方法。 発明を実施するための最良の形態
用語の定義
用語 「バラ （a rose) J とは、 本明細書中で使用するとき、 バラ目 ノ ラ科ノ ラ属 (Order, Rosales, Family, Rosaceae, Genus Rosa)の 落葉低木である鑑賞用植物の総称をいい、 特定の品種に限定される ことを意図されず、 また、 植物の全体又は通常花を含む部分を意味 する。
用語 「バラ」 の 「部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞」 とは 、 本明細書中に使用するとき、 本願発明に係る 「バラ」 の所望の遺 伝的形質が保持されている限り、 当該 「バラ」 に由来するすべての 物を意味し、 特定のものに限定されることを意図されない。
用語 「高ス ト リ ンジェン ト条件」 とは、 本明細書中で使用すると き、 例えば、 6 X S S C ( 1 X S S Cの組成 ： 0. 1 5 M N a C 1 、 0. 0 1 5 M クェン酸ナト リ ウム、 p H 7. 0 ) と 0. 5 % S D Sと 5 Xデンハルトと l O O i g Zm l 変性断片化サケ精子 D NAと 5 0 % ホルムアミ ドを含む溶液中、 アンチセンス鎖と、 対象の核酸とを 5 5 で一晩保温し、 0. 1 X S S C等の条件及び 又は 6 0で以上等の条件下での洗浄を行なう条件をいい、 特に、 バックグラウン ドの非特異的なシグナルが実質的に存在しなくなる 条件をいう。 用語 「L*a*b表色系色度図における色相角度 （ 0 ) 」 とは、 本明 細書中で使用するとき、 1 9 7 6年国際証明委員会 （ C I E ) で規 格化され、 日本国においても J I S 8 7 2 9 として採用された色相 角度 （ Θ ) をいい、 0 ° は赤方向、 9 0 ° は黄方向、 1 8 0 ° は緑 方向、 そして 2 7 0 ° は青方向である 。 尚、 花の色は、 かかる色相 角度と 、 R H S (英国王立園芸協会 ) のカラ一チヤ一卜のデ一夕を 併用して、 表すことができる。
フラボン合成遺伝子、 フラポノイ ド 3' , 5'一水酸化酵素遺伝子、 及 びアン 卜シァ一ンのメチル基転移酵素遺伝子の導入
バラに公知の方法で、 シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を 、 パンジー由来の F3' 5'H遺伝子などとともに導入した。 その結果、 シソ由来のフラボン合成酵素 IIの遺伝子を導入したバラではフラボ ンは検出されず、 この遺伝子はバラの中では機能しないことが示さ れた。 一方、 トレニァ又はキンギヨ ソゥ由来のフラボン合成酵素 II の遺伝子を導入したバラではフラボンが検出され、 フラボン合成遺 伝子はバラの中で機能することがわかつた
このようにして、 従来は存在しなかつたフラボンを蓄積するバラ を作出することができた。 フラボンの総フラ ノィ ド中の含量 （％
) は、 1%以上、 好ましくは 5%以上、 よ Ό好まし <は 10%以上、 そ して最も好ましく は 30%以上であればよい 。 ァン 卜シァニンとフラ ボンの両方を蓄積するバラは、 同じアン 卜シァ一ンのみを含むバラ より も、 相対的に青い色をしており、 フラボンの蓄積が青色化とい う新しい形質の付与に貢献していることがわか た
さらには、 B環がメチル化されたアン トシァニン （マルビジンを 含むアン トシァニン） とフラボンが共存するときに、 デルフィ ニジ ンを含むアン トシァニンとフラボンが共存する場合より高いコ ピグ メン ト効果が発揮されることを見出し、 上述のフラボン合成酵素 II の遺伝子とパンジーの F3 ' 5 ' H遺伝子に加え、 B環のメチル基転移 酵 遺伝子を導入する事により、 メチル化されたデルフィニジン型 ァン トシァニンとフラボンをバラ花弁で蓄積させ 、 バラ花弁をより
<することが可能となった。
また、 交雑試験により、 デルフィ二ジン型アン トシァニンとフラ ボンの両方を蓄積する形質は子孫にも伝達されることがわかつた。
れらのことから、 本来花弁でフラボンを蓄積していない、 又は ルビジンなどメチル化されたアン トシァニンを蓄積していなぃ植 物において、 これらの化合物を同時に蓄積させることにより、 花弁 の色彩をより青くすることが可能となる。 この際 、 パ'ラなどのよう に 元々フラボンとマルビジンのいずれも蓄積していない植物を宿 主として用いることが望ましい。
本発明に関連する酵素類は、 典型的には 、 配列表に記載されてい る特定のァミ ノ酸配列を有する酵素である 。 しかしながら 酵素に おいては 、 特定の、 例えば生来の、 ァ ノ酸配列のみならず 醉奉 活性に関与する領域以外の領域においてァミ ノ酸配列が修飾されて いても 所望の酵素活性が維持される とはよく知られてい 。 従 つて、 本発明の酵素類は、 配列番号に示す特定のアミノ酸配列に対 して、 1個〜数個のアミ ノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミノ酸 による置換により修飾されたアミ ノ酸配列を有し、 本来の酵素活性 を維持しているタンパク質、 及び配列番号に示す特定のアミノ酸配 列に対して 90 %以上の配列同一性を有するアミ ノ酸配列を有し、 本 来の酵素活性を維持しているタンパク質も、 本発明の酵素に含まれ る。
また、 ある酵素をコー ドする遺伝子を手にすれば、 当該遺伝子に 対して高ス ト リ ンジェン 卜条件下でハイブリダィズする核酸は、 当 該酵素と同様の活性を有する酵素をコー ドしている蓋然性が高いこ とが知られている。 従って、 特定の配列番号で示す塩基配列を有す る核酸と高ス ト リ ンジェン ト条件下でハイブリダィズする核酸によ り コー ドされ、 且つ目的の酵素活性を有する酵素も、 本発明の酵素 に含まれる。
従って、 本発明に関与する酵素遺伝子として下記のものが挙げら れる。
( A) キンギヨ ソゥ （Antirrhinum ma j us)由来のフラボン合成酵 素遺伝子
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミソ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子。
( B ) ト レニァ （Torenia hybrida)由来のフラボン合成酵素遺伝
±_
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子。
( C ) シソ （Peri 11a f ru t escens)由来のフラボン合成酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 6 に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 6 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 6 に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 5に示す塩基配列を有する核酸と高ス 卜 リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子。
( D ) パンジー （pansy (Viola x w i U rocki ana) )由来の 3'， 5'—水 酸化酵素遺伝子
( 1 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列を有する 3'， 5'—水酸化 酵素、
( 2 ) 配列番号 8 に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有する 3', 5'—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8 に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミ ノ酸配列を有する 3', 5'—水酸化酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされた 3' , 5'— 水酸化酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子。
( Ε ) ト レニァ （Torenia hybr ida)由来のメチル基転移酵素遺伝
±_
( 1 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列を有するメチル基転移 酵素、
( 2 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個 のアミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸による置換により 修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
( 3 ) 配列番号 1 0に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配 列同一性を有するアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 9.示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたメチル基転 移酵素、
のいずれかをコ一 ドする遺伝子。 実施例
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明する。 本実施例は 、 本発明を例示することのみを目的とし、 本発明の範囲を限定する ものと解されることを意図されない。
実施例 1 ： アン トシァニンに対するフラボンのコピグメン ト効果の シミ ュ レーショ ン
アン トシァニンに対するフラボンのコピグメン ト効果のシミュレ ーシヨ ンを行うため、 まずアン トシァニン類を調製した。 Cyan inは バラ品種 "Rote Rose" (rose cv. "Rote Rose" )の花弁より抽出、 精製した。 Delphinはバーべナ品種 "夕ビアンバイオレッ ト" （vber bena cv. "Tapien Violet" or vberbena variety Sunmare f TP-V ( "Tapien Violet" ) ( "Tapien is a Trade Mark registered in J a pan" ))の花弁より抽出した色素を、 アルカ リ加水分解した後精製 した。 Malvin、 及び Luteolin 7- 0- glucosideはフナコシ株式会社 より購入した。
このようにして調製した種々のアン トシァニンに対してフラボン (Luteol in 7- O-glucoside) を、 pH5.0の緩衝液中、 0、 1、 、 4当 量のモル濃度比で添加し、 吸収スペク トルを測定した。 アン トシァ ニンとしては、 Cyan in ( Cyan id in 3, 5-d iglucos ide; 、 Delphin (D elphinidin 3， 5 - d iglucos ide) 、 Ma 1 v in (Malvidin 3, 5-d iglucos ide) を用いた。 アン トシァニンの濃度は Cyanin、 Delphinおよび Ma lvinは lmMとした。
以下の表 1 と 2 に示すように、 フラボンの添加により、 アン トシ ァニン水溶液の吸光度は増大し、 その変化の割合 （吸光度比） は、 Malvinで最大であった。 また、 吸収極大 （ λ max) もフラボンの添 加とともに長波長側へシフ 卜した。 その変化の割合は Ma lvinで最大 、 次いで Delphinであった。 さらに、 L*a*b*表色系により色彩値の 評価を行ったところ、 フラボンの添加により、 色彩の青色化が観察 され、 彩度も上昇した。 その効果は、 Malvinで最も顕著であった。 すなわち、 Luteol in 7- 0- glucos ideのコ ピグメン ト効果を最も受 けるのは Malvinであることが判明した。 表 1 フラボン添加時のアン トシァニン水溶液の吸収極大
( λ max； 単位 nm)
Figure imgf000022_0001
表 2 λ maxにおけるフラボン無添加に対する吸光度比
Figure imgf000022_0002
実施例 2 (参考例） ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子とシソ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
特開 2000-279182に記載のシソ由来フラボン合成酵素遺伝子を含 むプラスミ ド、 PYFS3を Xbalで消化した後、 平滑末端化し、 さ らに B amHIで消化して、 約 1.8kbのシソ フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さ らに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述のシソのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 906-pY FS3を得た。 906-PYES3は E 1235Sプロモー夕一と D8夕一ミネ一夕一 （ いずれも W02005/017147に記載） の間にシソ由来のフラボン合成酵 素遺伝子を有するものである。
Ueya a らの報告 （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 , 2002)に記載された PSPB176の BamHIと Sail部位に、 W02005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ -F3' 5Ή #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とした 。 この Ascl部位に、 上述の 906- PYFS3を Asclで消化して得られる約 3 .4kbのシソのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを挿入した。 得 られたプラスミ ドのうち、 F3' 5' H #40遺伝子の発現カセッ トとシ ソのフラボン合成酵素の発現カセッ 卜が同じ方向に連結されたべク 夕一を PSPB1310 とした。 本プラスミ ドは植物においてはパンジー の F3' 5Ή #40遺伝子とシソのフラボン合成酵素遺伝子構成的に発現 する。
このようにして作製した PSPB1310を藤色系バラ品種 "Lavande" ( maure rose variety Lavande" )へ導入し、 55個体の开 質転換体 を得た。 色素分析を行った 50個体のうち 49個体でデルフィ二ジンの 蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 70% (平均 26%) で あった。 しかしながら、 フラボンは全く検出されず、 シソ由来のフ ラボン合成酵素遺伝子がバラの細胞では機能していないことが推察 された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 3 に示す。
表 3
Figure imgf000024_0001
対照 ： Lavande対照
Del ： デルフィ ジニジン、 Cya ： シァニジン、 Pel ： ペラルゴ二ジン 、 M ·· ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri : ト リ セチン、 Lu t ： ルテオリ ン、 Ap i ： ァピゲニン
Del ( ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 3 ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40 遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
Akashiらの報告 （Plant Cell Physiol 40, 1182-1186, 1999) に 記載の トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子が、 プラスミ ド pB lues cript II SK (-) の EcoRIと Xhol部位に挿入されたプラスミ ドを pSP B426とした。 これを Kpnlで消化した後、 平滑末端化し、 さ らに BamH Iで消化し、 約 1.7kbの ト レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子断片を 得た。 一方、 W02005/017147に記載の PSPB906を Xholで消化後、 平滑 末端化し、 さ らに BamHIで消化した。 この平滑末端と BamHI切断部位 の間に、 前述の ト レ二ァのフラボン合成酵素遺伝子断片を挿入し 90 6 - 426を得た。
Ueyama らの報告 （Ueyama et al. Plant Science, 163, 253-263 ， 2002)に記載された pSPB176の BamHIと Sail部位に、 WO2005/017147 に記載の PCGP1961から BamHIと Xholの部分消化で切り出したパンジ 一 F3' 5' H #40遺伝子 の断片を挿入したプラスミ ドを PSPB575とし た。 この Ascl部位に、 上述の 906-426を Asclで消化して得られる約 3 .3 kbの トレ二ァのフラボン合成酵素遺伝子発現カセッ トを挿入し た。 得られたプラスミ ドのうち、 F3'5' H#40遺伝子の発現カセッ ト と トレ二ァのフラボン合成酵素の発現カセッ トが同じ方向に連結さ れたベクターを PSPB 1309 とした。 本プラスミ ドは植物においては パンジー F3'5'H #40遺伝子と ト レ二ァのフラボン合成酵素遺伝子構 成的に発現する。
このようにして作製した pSPBl 309を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し、 50個体の形質転換体を得た。 色素分析を行った 38個体の うち 36個体でデルフィ二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含 有率は最高 45% (平均 12%) であった。 一方、 トレニァ由来フラボ ン合成酵素遺伝子の働きにより、 35個体で新たにフラボン （ルテオ リ ン、 ァピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新 鮮花弁重量 lgあたり 1.68mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 4に示す。
表 4
Figure imgf000026_0001
対照 ： Lavande対照
De 1 ： デルフィ ジニジン、 Cya： .シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン 、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri : ト リ セチン、 Lu t ： ルテオリ ン、 Ap i ： ァピゲニン
Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 4 ： バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝 子と ト レニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の導入
サーモンピンク系バラ品種 "WKS124" (salman-pink rose variet y "WKS124" )へ実施例 3に記載の pSPB 1309を導入し、 40個体の形 質転換体を得た。 色素分析を行った 27個体のうち 26個体でデルフィ 二ジンの蓄積を確認でき、 デルフィ二ジン含有率は最高 96% (平均 81%) であった。 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働 きにより、 26個体で新たにフラボン （ ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァ ピゲニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重 量 lgあたり 4.41mgという高い含有量であった。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 5に示す。 表 5
Figure imgf000027_0001
対照 ： WKS124対照
De 1： デルフィ ジニジン、 Cya： シァニジン、 Pe 1 ： ペラルゴ二ジン 、 M： ミ リセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri： 卜 U セチン、 Lu t： ルテオリ ン、 Ap i： ァピゲニン
Del ( % ) ： 総アン トシァニジン中のデルフィ二ジンの割合 実施例 5 ： バラ品種 "WKS124" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びト レニァ由来アン 卜 シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 3に記載の PSPB 1309を Pacl処理し、 ト レニァ由来のフラポ ン合成酵素発現カセッ 卜とパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子発現カセ ッ トの連結部位付近に存在する （より厳密には、 フラボン合成酵素 発現カセッ 卜の D8夕一ミネ一夕一 3'末端付近に存在する） Pacl部位 とベクターのマルチクローニングサイ ト内の Pacl部位を切断するこ とにより、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子発現カセッ トを切り出した。 一方、 W02003-062428に記載された ト レニァのメチル基転移酵素 遺伝子発現カセッ トを有するバイナリ一べク夕一 pSPB 1530を Paclで 切断し、 そこに上記のパンジー F3'5'H #40発現カセッ トを、 メチル 基転移酵素遺伝子発現カセッ 卜と同じ方向に挿入した。 本プラスミ ドを TMT- BP40とする。 一方、 PSPB 1309を Asclで切断し、 トレ二ァのフラボン合成酵素発 現カセッ トを切り出した。 これを TMT-BP40の Ascl部位に、 これらの 発現カセッ トと同じ方向に挿入し、 得られたプラスミ ドを PSFL535 とした。 本プラスミ ドは植物において、 パンジー F3' 5'H #40遺伝子 と トレ二ァのメチル基転移酵素遺伝子、 及びト レ二ァのフラボン合 成酵素遺伝子を構成的に発現する。
このようにして得られた PSFL535をサーモンピンク系のバラ 「WKS 124」 へ導入し、 173個体の形質転換体を得た。 アン トシァニジン分 析を行った 98個体の形質転換体のうち 88個体でマルビジン （デルフ ィニジンの 3'位と 5 '位がメチル化されたアン トシァニジン） の蓄積 を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝子 と トレニァ由来アン トシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能して いることが生成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最高 84% (平均 50%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 77個 体で新たにフラボン （ ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4.58 mgという高い含有量であった。 また、 51個体でメチル化された ト リ セチンが検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 6に示す。
表 6
Figure imgf000029_0001
対照：觀 24対照
Del：デルフィジニジン、 Cya： シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン、 Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M： ミリセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri： トリセチン 、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン
Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合、
Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 6 ： バラ品種 "Lavande" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン ト シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 5に記載の pSFL535を藤色系バラ品種 "Lavande" へ導入し 、 130個体の形質転換体を得た。 アン トシァニジン分析を行った 118 個体の形質転換体のうち 37個体でマルビジン （デルフィ二ジンの 3' 位と 5'位がメチル化されたアン トシァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と ト レニァ由 来アン トシァニンメチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生 成物により示された。 なお、 マルビジン含有率は最高 55.6% (平均 20.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 78個 体で新たにフラボン （ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 5. 11 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化された ト リセチン又はルテオリ ンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 7 に示す。
表 7
Figure imgf000031_0001
M :ラバンテ対照
Del：デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai：マルビジン、 M： ミリセチン、 Q： ケルセチン： K： ケンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api：ァピゲニン
Del (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 7 ： バラ品種 "WKS82" へのパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子 と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン トシ ァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 5に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "WKS82" (mauve ros e variety "WKS82" )へ導入し、 250個体の形質転換体を得た。 ァ ン トシァニジン分析を行つた 232個体の形質転換体のうち 110個体で マルビジン （デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアン ト シァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3' 5Ή #40遺伝子と トレニァ由来アン トシァニンメチル基転移酵 素遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マル ビジン含有率は最高 65.2% (平均 19.7%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 125 個体で新たにフラボン （ ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の 蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 71mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形 質転換体のうち 80個体でメチル化された ト リセチン又はルテオリ ン が検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 8 に示す。
表 8
Figure imgf000033_0001
対照： WKS82対照
De l ：デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pe t ：ペチュニジン、 Pel ：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai ：マルビジン、 M： ミリセチン、 Q： ケルセチン： K： ケンフエロール、 Tr i ： トリセチン、 Lut ：ルテオリン、 Api ： ァピゲニン
De l (%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai ( ) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 8 ： バラ品種 "WKS140 へのパンジー由来 F3' 5'H #40遺伝 子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子及びトレニァ由来アン 卜 シァニンメチル基転移酵素遺伝子の導入
実施例 5に記載の PSFL535を藤色系バラ品種 "WKS140" (mauve ro se variety "WKS140" )へ導入し、 74個体の形質転換体を得た。 ァ ン トシァニジン分析を行った 74個体の形質転換体のうち 20個体でマ ルビジン （デルフィ二ジンの 3'位と 5'位がメチル化されたアン トシ ァニジン） の蓄積を確認でき、 バラの花弁においてパンジー由来 F3 ' 5'H #40遺伝子と トレニァ由来アン トシァニンメチル基転移酵素 遺伝子が機能していることが生成物により示された。 なお、 マルビ ジン含有率は最高 51.3% (平均 33.5%) であった。
一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 29個 体で新たにフラボン （ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の蓄 積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 3.04 mgという高い含有量であった。 また、 フラボンを生産していた形質 転換体のうち 20個体でメチル化された ト リセチン又はルテオリ ンが 検出された。
代表的な形質転換体の分析値を以下の表 9 に示す。
表 9
Figure imgf000035_0001
対照： WKS140対照
Del ：デルフィ二ジン、 Cya： シァニジン、 Pet ：ペチュニジン、 Pel ：ペラルゴ二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai ：マルビジン、 M： ミリセチン、 Q： ケルセチン： K： ケンフエロール、 Tri ： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api ： ァピゲニン
Del ( ) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合
Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 9 ： フラボン及びマルビジン合成能の後代への伝播一パン 一由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝 子と トレニァ由来アン トシァニンメチル基転移酵素遺伝子を導入し た遺伝子組換えバラと栽培バラとの交雑
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 5で作出したマルビジン及びフラボンを生産するバラ （ 表 6中、 植物 No.6) を花粉親として用いた交配を行った。 種子親に は、 中輪系栽培バラ "Medeo (メデォ） " （floribunda rose variet y "Medeo" )を用レ た。
取得した形質転換体 F1雑種後代のうち 10個体の色素分析を行った ところ、 7個体でマルビジンの蓄積が確認され、 バラの花弁におい てパンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子と トレニァ由来アン トシァニン メチル基転移酵素遺伝子が機能していることが生成物により示され た。 なお、 マルビジン含有率は最高 68.2% (平均 46.6%) であった 一方、 トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子の働きにより、 8個 体の形質転換体後代でフラボン （ト リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲ ニン） の蓄積も確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lg あたり 7.35mgという極めて高い含有量であった。 また、 フラボンを 生産していた形質転換体後代のうち 6個体でメチル化された ト リセ チンが検出された。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 0に示す。 表 1 o
Figure imgf000037_0001
Del :デルフィ二ジン、 Cya : シァニジン、 Pet ：ペチュニジン、 Pel ：ペラル 二ジン： Peo：ぺォニジン、 Mai ：マルビジン、 ： ミリセチン、 Q： ケルセチン： K： ケンフエロール、 Tri ： トリセチン、 Lut ：ルテオリン、 Api ：ァピゲニン
Del {%) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン) の割合
Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 0 ： フラボン合成能の後代への伝播
パンジー由来 F3' 5' H #40遺伝子及びトレニァ由来アン トシァニン メチル基転移酵素遺伝子を導入したバラ品種 "WKS124" と、 パンジ —由来 F3' 5'H #40遺伝子と トレニァ由来フラボン合成酵素遺伝子 を導入したバラ品種 "Lavande" の交配
バラに付与したフラボン合成能の後代への遺伝様式を調査するた め、 実施例 3で作出したフラボン生産株 （表 4中、 植物 No.4) を花 粉親として用いた交配を行った。 種子親には、 バラ品種 WKS124へ pS PB 1532を導入し、 パンジー由来 F3' 5'H # 40遺伝子およびト レニァ 由来アン トシァニンメチル基転移酵素遺伝子の働きにより花弁でマ ルビジンを高蓄積した形質転換体 WKS 124/1532- 12- 1 ( W02003/06242 8に記載） を用いた。
取得した形質転換体後代のうち 149個体の色素分析を行つたとこ ろ、 88個体でフラボン （ 卜 リセチン、 ルテオリ ン、 ァピゲニン） の 蓄積が確認できた。 フラボン総量は最高で新鮮花弁重量 lgあたり 4. 09mgという高い含有量であった。 また、 42個体でメチル化された ト リセチンが検出され、 11個体でメチル化されたルテオリ ン （Chryso eriol (3'Met-Lut) ) が検出された。 なお、 色素分析を行った 149 個体のうち、 129個体でマルビジンの蓄積が確認できた。 マルビジ ン含有率は最高 79% (平均 36%) であった。
代表的な形質転換体後代の分析値を以下の表 1 1 に示す。
表 1 1
Figure imgf000039_0001
Del：デルフィジニジン、 Cya： シァニジン、 Pet：ペチュニジン、 Pel：ペラルゴ二ジン、 Peo：ぺォニジン、 Mai：マル M： ミリセチン、 Q： ケルセチン、 K： ケンフエロール、 Tri： トリセチン、 Lut：ルテオリン、 Api： ァピゲニン
Del ( ) ：総アントシァニジン中のデルフィ二ジン系色素 （デルフィ二二ジン、 ペチュニジン、 マルビジン） の割合、 Mai (%) ：総アントシァニジン中のマルビジンの割合
実施例 1 1 ： フラボンを含むバラの花色の評価
実胞例 4及び 5 において作出された形質転換体 （バラ品種 " WKS 1
24" を宿主とする ) について、 ( 1 ) 主な色素としてデルフィニジ ンを蓄積し、 フラポンを含まないもの、 （ 2 ) 主な色素としてデル フィニジンを蓄積し 、 フラボンを含むもの、 （ 3 ) 主な色素として マルビジンを高蓄禾貝し 、 フラポンを含まないもの、 及び （ 4 ) 主な 色素としてマルビンンを高蓄積し 、 フラボンを含むもの、 及び （ 5
) 宿主 (主な色素としてペラゴ ―ジンを蓄積） というグル一プに分 類し、 それぞれの花弁の色彩について分光測色計を用いて評価を行 つ た （ n = 10 ) 。
主色素がデルフィ二ジンタイプのバラ、 マルビジンタイプのバラ いずれにおいても、 フラボンが共存する場合に花弁の色相角度は青 色方向へシフ トしていた。 また、 主色素がマルビジンタイプのバラ においては、 その傾向がより顕著であり、 反射スペク トルの極小 （ λ M i n) も長波長側へ大きく シフ トしていた。 以上の結果から、 フ ラボンの共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。 結果を以下の表 1 2 に示す。
表 1 2
Figure imgf000041_0001
色相角度 （hue) ： L* a*b*表色系において、 a* (赤方向） の軸を 0 ° として、 ここから反時計方向の色相に対して移動した角度で、 色 の位置がわかるようにしたもの。 90 ° であれば黄方向、 180 ° であ れば、 緑方向、 270 ° であれば青方向、 0 ° (= 360 ° )であれば赤方 向ということになる。 すなわち、 数値が 270 ° に近いほど色相は青 い。
産業上の利用の可能性
本発明により、 鑑賞用植物として人気のある花卉植物であるバラ において、 遺伝子組換え手法によりフラボン及びマルビジンを含ま せることで、 コピグメンテーシヨ ン効果によりバラの花色を青色方 向に変化させることができる。 青色の花色をもつバラは観賞用植物 としての商品需要が見込まれる。
こ こで、 本明細書中に引用した特許文献、 非特許技術文献の全て を、 個別に又はそれらを全体として、 本明細書中に援用する。
これまで、 本発明を説明してきたが、 本発明は、 その本質から逸 脱せずに、 修正又は変更されうると解されるべきであり、 本発明の 範囲は、 実施例の記載に基づくのではなく、 添付の請求の範囲によ り画されるべきことはいうまでもない。

Claims

1. 遺伝子組換え手法により フラボン及びマルビジンを含むこと を特徴とするバラ （a rose)。
2. フラボンを含み、 且つパンジー （Viola X wi t trockiana)由来 のフラボノイ ド 3', 5'—水酸化酵素及びアン トシァニンのメチル基 請
転移酵素の発現によりマルビジンを含む、 請求項 1 に記載のバラ。
3. アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子、 フラボン合成酵 の
素遺伝子及びパンジー由来の 3', 5'—水酸化酵素遺伝子の発現によ り、 マルビジン、 フラボン及びデルフィ二ジンを有する、 請求項 1 又は 2に記載のバラ。 囲
4. 前記フラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマノハグサ科由来のフラ ボン合成酵素遺伝子である、 請求項 1〜 3のずれか 1項に記載のバ ラ。
5. 前記ゴマノ八ダサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノノヽグサ科キンギヨ ソゥ (Scrophular iaceae, Antirrhinum ma jus) 由来のフラボン合成酵素遺伝子である、 請求項 4に記載のバラ。
6. 前記ゴマノハグサ科由来のフラボン合成酵素遺伝子が、 ゴマ ノハグサ科ト レニァ （Scrophulariaceae, Torenia hybrida)由来の フラボン合成酵素遺伝子である、 請求項 4に記載のバラ。
7 . 前記ゴマノハグサ科キンギヨ ソゥ由来のフラボン合成酵素遺 伝子が、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 ( 3 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 1 に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である、 請求項 5 に記載のバラ。
8. 前記ゴマノハグサ科トレニァ由来のフラボン合成酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 4に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵 素、
( 2 ) 配列番号 4に記載のアミ ノ酸配列において、 1個〜数個の アミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するフラボン合成酵素、
( 3 ) 配列番号 4に記載のアミノ酸配列に対して 9 0 %以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するフラボン合成酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 3に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボン 合成酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である、 請求項 6 に記載のバラ。
9. 前記パンジー由来のフラポノイ ド 3', 5 ' —水酸化酵素遺伝子 が、
( 1 ) 配列番号 8に記載のアミ ノ酸配列を有するフラボノイ ド 3' , 5'—水酸化酵素、
( 2 ) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個の アミ ノ酸の付加、 欠失及び 又は他のアミ ノ酸による置換により修 飾されたアミ ノ酸配列を有するフラボノィ ド 3', 5 '—水酸化酵素、
( 3 ) 配列番号 8 に記載のアミ ノ酸配列に対して 90%以上の配列 同一性を有するアミノ酸配列を有するフラボノィ ド 3'， 5 '—水酸化 酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 7 に示す塩基配列を有する核酸と高ス トリ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたフラボノ ィ ド 3', 5'一水酸化酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である、 請求項 2〜 8のいずれか 1 項に記載のバラ。
1 0. 前記アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子が、
( 1 ) 配列番号 1 0に記載のアミ ノ酸配列を有するメチル基転移 酵素、
( 2 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列において、 1個〜数個 のアミノ酸の付加、 欠失及び Z又は他のアミ ノ酸による置換により 修飾されたアミノ酸配列を有するメチル基転移酵素、
( 3 ) 配列番号 1 0に記載のアミノ酸配列に対して 90%以上の配 列同一性を有するアミ ノ酸配列を有するメチル基転移酵素、 又は
( 4 ) 配列番号 9に示す塩基配列を有する核酸と高ス ト リ ンジェ ン ト条件下でハイブリダィズする核酸によりコー ドされたメチル基 転移酵素、
のいずれかをコー ドする遺伝子である、 請求項 2〜 9のいずれか 1項に記載のバラ。
1 1. アン トシァニンのメチル基転移酵素遺伝子、 フラボン合成 酵素遺伝子、 及びパンジー由来の 3'， 5'—水酸化酵素遺伝子の導入 前の宿主と比べて花色が変化している、 請求項 2〜 1 0のいずれか 1項に記載のバラ。
1 2. 前記花色の変化が、 青に向けての変化である、 請求項 1 1 に記載のバラ。
1 3. 前記花色の変化が、 L*a*b表色系色度図における色相角度 ( θ ) が青方向軸である 2 7 0 ° に近づく変化である、 請求項 1 1 又は 1 2 に記載のバラ。
1 4 . 前記花色の変化が、 花弁の反射スペク トルの極小値が長波 長側にシフ トする変化である、 請求項 1 1 に記載のバラ。
1 5 . 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載のバラと同じ性質を 有する、 その部分、 子孫、 組織、 栄養増殖体又は細胞。
1 6 . 遺伝子組換え手法により フラボン及びマルビジンを含める ことにより生ずるコ ピグメンテ一シヨ ン効果によりバラの花色を改 変する方法。
1 7 . 前記コピグメンテーシヨ ン効果が、 花色を青色方向に変化 させる効果である、 請求項 1 6 に記載の方法。
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EP08777606A EP2163619B1 (en) 2007-06-20 2008-06-19 Rose containing flavone and malvidin, and method for production thereof
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010110382A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 青いバラに含まれる新規化合物
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
WO2020203940A1 (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 サントリーホールディングス株式会社 フラボン７－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用
WO2021065749A1 (ja) 2019-10-01 2021-04-08 サントリーホールディングス株式会社 ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用
WO2022107857A1 (ja) 2020-11-18 2022-05-27 サントリーホールディングス株式会社 フラボン４'－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2008156214A1 (ja) * 2007-06-20 2010-08-26 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法
AU2008264439A1 (en) * 2007-06-20 2008-12-24 Suntory Holdings Limited Rose containing flavone, and method for production thereof
CN105349553B (zh) * 2015-12-17 2018-09-07 海南大学 一种花色调节基因VwMYB29及其应用
CN106754989B (zh) * 2016-12-21 2020-04-21 广东药科大学 布渣叶黄烷酮-2-羟基化酶及其编码基因与应用
US20200283782A1 (en) * 2017-10-03 2020-09-10 Suntory Holdings Limited Transformed plant having blue flower color, and method for creating same
KR102010833B1 (ko) * 2017-11-08 2019-08-16 대한민국 화훼식물의 꽃잎, 암술기관 및 화심 색 변형 기능 매발톱꽃 유래 신규 유전자 및 이의 용도
CN115094066B (zh) * 2022-05-06 2023-11-14 上海师范大学 一种调控月季花瓣颜色的基因RcTTG1及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000279182A (ja) * 1999-01-29 2000-10-10 Suntory Ltd フラボン合成酵素をコードする遺伝子
WO2005017147A1 (ja) * 2003-08-13 2005-02-24 International Flower Developments Proprietary Limited 花色が変更されたバラの製造方法
JP2005514950A (ja) * 2002-01-25 2005-05-26 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド メチルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子配列及びそのための使用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5480789A (en) * 1991-04-01 1996-01-02 Florigene Europe B.V. Genetically transformed rose plants and methods for their production
US5948955A (en) * 1991-07-13 1999-09-07 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants having altered anthocyann levels
CA2130800C (en) * 1992-03-02 2002-05-14 Yasuhiro Kikuchi Plant genes encoding flavonoid-3',5'-hydroxylase
US20010007157A1 (en) * 1993-11-18 2001-07-05 Ebrahim Firoozabady Genetically transformed rose plants and methods for their production
US5568832A (en) * 1994-10-18 1996-10-29 Eddy; Zonell Skylight shade
JPH0970290A (ja) * 1995-02-17 1997-03-18 Suntory Ltd アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
AUPN298895A0 (en) * 1995-05-16 1995-06-08 International Flower Developments Pty Ltd Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing same
PL194895B1 (pl) * 1998-01-22 2007-07-31 Nat Research Council Sposób poprawiania żywieniowego profilu rośliny i genetycznie zmienione komórki rośliny, nasion lub komórki potomne
KR100440332B1 (ko) * 2002-06-28 2004-07-15 현대자동차주식회사 유압 회로용 투웨이 오리피스 첵밸브 장치
WO2004020637A1 (en) * 2002-08-30 2004-03-11 International Flower Developments Pty. Ltd. Flavonoid 3',5'hydroxylase gene sequences and uses therefor
JP4378676B2 (ja) * 2003-06-03 2009-12-09 日本電気株式会社 電力制御方法および電力制御回路
JPWO2008156214A1 (ja) * 2007-06-20 2010-08-26 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド フラボン及びデルフィニジンを含むバラ及びその生産方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000279182A (ja) * 1999-01-29 2000-10-10 Suntory Ltd フラボン合成酵素をコードする遺伝子
JP2005514950A (ja) * 2002-01-25 2005-05-26 インターナショナル フラワー ディベロップメンツ プロプライアタリー リミテッド メチルトランスフェラーゼ活性を有する遺伝子配列及びそのための使用
WO2005017147A1 (ja) * 2003-08-13 2005-02-24 International Flower Developments Proprietary Limited 花色が変更されたバラの製造方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FUKUI Y. ET AL.: "A rationale for the shift in colour towards blue in transgenic carnation flowers expressing the flavonoid 3',5'-hydroxylase gene", PHYTOCHEMISTRY, vol. 63, no. 1, 2003, pages 15 - 23, XP004415736 *
See also references of EP2163619A4 *
TANAKA Y. ET AL.: "Flower colour modification of roses by expression of a torenian anthocyanin methyltransferase gene", PLANT AND CELL PHYSIOLOGY, vol. 48, no. SUPPL., August 2007 (2007-08-01), pages S221, ABSTR.NR. 820(P220), XP009134731 *
TANAKA Y. ET AL.: "Shokubutsu Shikiso no Seikagaku to Idengaku Hana no Iro no Biotechnology", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 47, no. 3, 2002, pages 225 - 230, XP008124957 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9057076B2 (en) 2009-03-27 2015-06-16 Suntory Holdings Limited Compounds purified from blue roses
CN102365287A (zh) * 2009-03-27 2012-02-29 三得利控股株式会社 蓝月季中含有的新型化合物
AU2010228224B2 (en) * 2009-03-27 2015-09-17 Suntory Holdings Limited Novel compound contained in blue rose
EP2947083A1 (en) * 2009-03-27 2015-11-25 Suntory Holdings Limited Novel compound contained in blue rose
JP2013014589A (ja) * 2009-03-27 2013-01-24 Internatl Flower Dev Pty Ltd 青いバラに含まれる新規化合物
WO2010110382A1 (ja) * 2009-03-27 2010-09-30 インターナショナル フラワー ディベロプメンツ プロプライアタリー リミティド 青いバラに含まれる新規化合物
RU2507206C2 (ru) * 2009-03-27 2014-02-20 Сантори Холдингз Лимитед Новое соединение, содержащееся в голубой розе
JP2014210786A (ja) * 2009-03-27 2014-11-13 サントリーホールディングス株式会社 青いバラに含まれる新規化合物
JP5099653B2 (ja) * 2009-03-27 2012-12-19 サントリーホールディングス株式会社 青いバラに含まれる新規化合物
EP2602324A1 (en) 2009-04-24 2013-06-12 Suntory Holdings Limited Method for production of chrysanthemum plant having petals containing modified anthocyanin
WO2010122850A1 (ja) 2009-04-24 2010-10-28 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 修飾されたアントシアニンを花弁に含有するキク植物を生産する方法
CN108777947B (zh) * 2016-03-31 2022-11-11 三得利控股株式会社 具有蓝色系花色的植物及其制作方法
WO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
JPWO2017169699A1 (ja) * 2016-03-31 2018-10-25 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 青系花色を有する植物及びその作出方法
CN108777947A (zh) * 2016-03-31 2018-11-09 三得利控股株式会社 具有蓝色系花色的植物及其制作方法
WO2020203940A1 (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 サントリーホールディングス株式会社 フラボン７－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用
WO2021065749A1 (ja) 2019-10-01 2021-04-08 サントリーホールディングス株式会社 ソバ由来ｃ－配糖化酵素遺伝子及びその使用
WO2022107857A1 (ja) 2020-11-18 2022-05-27 サントリーホールディングス株式会社 フラボン４'－ｏ－メチル基転移酵素遺伝子及びその使用

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