WO2006088029A1 - 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 - Google Patents

高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 Download PDF

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WO2006088029A1
WO2006088029A1 PCT/JP2006/302561 JP2006302561W WO2006088029A1 WO 2006088029 A1 WO2006088029 A1 WO 2006088029A1 JP 2006302561 W JP2006302561 W JP 2006302561W WO 2006088029 A1 WO2006088029 A1 WO 2006088029A1
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density
culture
liquid flow
producing
mesh member
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PCT/JP2006/302561
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Eijiro Adachi
Shihoka Ohashi
Kazuya Hirai
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School Juridical Person Kitasato Gakuen
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a high-density culture tissue, a high-density culture tissue, and a high-density culture apparatus. More specifically, the present invention relates to a method for producing a high-density cultured tissue for regenerative medicine or various experiments such as artificial organs, artificial bones, and artificial skin, a high-density cultured tissue obtained by this method, and an apparatus used for this production method.
  • a technique proposed as a three-dimensional culture method is a technique in which an adhesion substrate (scaffold material) is prepared in advance, cells are seeded on this, and cultured in a culture solution (for example, JP 06-277050 A).
  • Patent Document 1 JP-A-10-52261 (Patent Document 2), JP-A 2001-120255 5 (Patent Document 3), JP-A 2003-265169 (Patent Document 4), WO2004Z07 8954 pamphlet (Patent Document 5), Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-65087 (Patent Document 6), etc.)
  • Patent Document 2 JP-A-10-52261
  • Patent Document 3 JP-A 2001-120255 5
  • Patent Document 4 JP-A 2003-265169
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-65087
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-65087
  • the three-dimensionally densified cultured tissue is expected to be useful in transplantation medicine, life science experiments, and new drug clinical trials.
  • the reasoning power is still widespread, and it is the current situation.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 06-277050
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 10-52261
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-120255
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-265169
  • Patent Document 5 WO2004Z078954 Pamphlet
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-65087
  • an object of the present invention is to provide a method for rapidly creating a living tissue-like artificial tissue in which cells are densely accumulated by a simple operation.
  • a mesh member is provided in a path for circulating and culturing a cell culture solution containing an extracellular matrix component and one or more animal cells. If the liquid flow control member is disposed in contact with or close to the liquid flow control member so that the liquid flow control member faces the liquid flow and is located on the back surface of the mesh member, formation of a substrate to which cells adhere and cell seeding are performed. It was possible to carry out at the same time, and by applying the above configuration, it was found that the target organization can be created much faster than the conventional method, and the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following method for producing a high-density culture tissue, the high-density culture tissue obtained thereby, and an apparatus used for this production method.
  • a mesh member and a fluid flow control member are disposed, and the fluid flow control member responds to the fluid flow with the mesh member.
  • a method for producing a high-density cultured tissue characterized in that the extracellular matrix molecules and animal cells are densely accumulated on the surface of the mesh member so as to be located in contact with or in close proximity to the back surface of the mesh member.
  • the extracellular matrix component is collagen, elastin, proteodalycan, fibrillin
  • somatic cells are selected from fibroblasts, hepatocytes, vascular endothelial cells, epidermal cells, chondrocytes, glial cells, and smooth muscle cells.
  • the physiologically active substance comprises a cell growth factor, a hormone and Z, a natural or synthetic chemical substance having a pharmacological action, or a mixture of two or more thereof.
  • liquid-permeable porous material is filter paper, non-woven fabric, or silk-fibre-in membrane.
  • the mesh member and the liquid flow control member are cylindrical, and are arranged coaxially so that the culture medium flows from the central axis toward the outer periphery, and the culture medium collected at the outer periphery is circulated to the central axis. This allows high density of extracellular matrix molecules and animal cells on the surface of the mesh. 14.
  • the mesh member and the liquid flow control member are flat, and are arranged in contact with each other or in close proximity so that the liquid flow control member is positioned on the back surface of the mesh member with respect to the liquid flow.
  • the obtained high-density cultured tissue is taken out, and the same or containing an extracellular matrix component and one or more animal cells A method for producing a high-density culture tissue in which culture is continued in a non-circulating culture solution of a different formulation.
  • the obtained high-density cultured tissue is removed, or subsequently, an extracellular matrix component and one or more animal cells.
  • a method for producing a high-density culture tissue, wherein a layered high-density culture tissue is formed by performing at least one operation of forming different high-density culture tissues on the tissue using the same or different culture solutions containing.
  • a high-density cultured tissue produced by the method according to any one of 1 to 20 above.
  • the reactor has a pipe line constituting a closed circulation path, and the reactor has a cylindrical mesh member and a cylindrical liquid flow control member brought into contact with or in close proximity to each other so that the mesh member is a liquid flow control member.
  • An extracellular matrix molecule and animal cells are provided on the surface of the mesh member having a liquid inlet / outlet through which the cell culture solution is circulated from the inside toward the outside on the mesh member while being coaxially held so as to be located on the inner side.
  • an artificial tissue similar to a biological tissue in which an extracellular matrix and animal cells are collected at high density can be quickly created by a simple operation.
  • the present invention makes it possible to easily and quickly create various transplanted tissues as materials for regenerative medicine, and tissues that can complement animal experiments conducted during the development of cosmetics and new drugs at medical or research sites.
  • the mesh member and the fluid flow control member are brought into contact with or close to each other in a path for circulating and culturing a cell culture solution containing an extracellular matrix component and one or more animal cells.
  • the mesh member is arranged on the upstream side in view of the flow force of the culture solution, and extracellular matrix molecules and animal cells are accumulated at a high density on the surface of the mesh member.
  • the flow rate of the culture medium is locally reduced, and the extracellular matrix suspended in the cell culture medium.
  • the concentration of the tassel component and the animal cell can be locally increased. As a result, the extracellular matrix molecules and the animal cell are densely accumulated on the mesh member.
  • the culture fluid flow is made to flow substantially uniformly through the mesh member and the fluid flow control member.
  • the mesh member and the liquid flow control member are formed as cylindrical members, which are arranged coaxially so that the mesh member is on the inside, and cultured from the inside to the outside of the mesh member. Liquid This can be realized by flowing.
  • the second aspect can be realized by using a mesh member and a liquid flow control member as planar members, arranging them in parallel, and flowing the culture solution at a substantially right angle to the surface of the mesh member.
  • the first mode is particularly preferably a mode in which the culture fluid flow is caused to flow radially with respect to the central axial force of the cylinder with respect to the mesh member and the liquid flow control member provided in a cylindrical shape.
  • a cylindrical reactor 10 as shown in FIG.
  • This reactor is basically composed of a cylindrical container body 11 and a lid 12.
  • a central cylinder 14 having a plurality of holes 13 on the surface is provided at the center of the container body, and an opening is provided at the center of the lid 12.
  • the center tube 14 may be fixed to the lid 12 integrally with the opening 15.
  • another pipe line 16 that connects the inside and the outside of the container is provided on the outer periphery of the container body 11.
  • One or a plurality of pipes 16 are provided, and the pipes 16 have holes 17 that open toward the inside of the container.
  • the upper ends of the pipes 16 are connected to corresponding openings 18 formed at corresponding positions of the lid 12. , Forming a liquid flow path. Thereby, the liquid can be introduced into the reactor 10 from the opening 15 and the liquid can be taken out from the opening 18.
  • the configuration for extracting the liquid from the outer periphery is arbitrary, and is not limited to the configuration described here.
  • the cylindrical mesh member 19 and the liquid flow control member 20 are disposed between the outer surface of the cylindrical mesh member and the inner surface of the container so as to be substantially coaxial with the central cylinder 14. Arrange.
  • the cylindrical mesh member and the liquid flow control member are mounted in the container so that the former is inside.
  • the cylindrical mesh member 19 has a mesh fixed inside and attached to the inside of the frame as shown in the figure, and the liquid flow control member, which is a flexible sheet or film, is placed outside the frame of the mesh member 19. Can be wrapped around.
  • the culture solution When the culture solution is fed into the reactor 10 from the opening 15, the cell culture solution containing extracellular matrix components and animal cells swells in the radial direction from the surface hole 13 toward the inside of the container. (Arrow in the figure).
  • the culture solution passes through the mesh member 19 and the liquid flow control member 20, is collected on the inner surface of the container, and is circulated into the central cylinder through pump means as will be described later.
  • a device for sensing the pressure in the circulation path is provided in the circulation path.
  • the second aspect is particularly preferably a mode in which the mesh member and the liquid flow control member provided in parallel flow the culture medium flow to the planar member against the planar member. For example, as shown in FIG. 2, such a configuration is realized by installing a cylindrical member 22 having a plurality of holes 21 in the lower portion in the flow path.
  • a planar member 23 having a mesh force is disposed in the cylindrical member 22, and a liquid flow control member 24 is disposed below the planar member 23.
  • the cylindrical member 22 is provided with ribs 25 on the inner periphery thereof, and if necessary, leakage preventing members (for example, silicon rings) 26 and 27 and a supporting mesh 28 are loaded thereon.
  • leakage preventing members for example, silicon rings
  • the liquid flow control member 26 and the planar mesh member 24 are overlapped.
  • a liquid leakage preventing member for example, the inner cylinder 29
  • these members are taken out and shown, but when used, these members are mounted so as to be fixed by the ribs 25 in the cylindrical member 22 as described above and installed in the flow path.
  • the cylindrical member 22 is installed in a container from which the central cylinder 14 is removed in the reactor 10 of the first embodiment. Note that when the liquid that has entered the reactor flows outside the cylindrical member 22, the formation efficiency of the high-density tissue decreases, so the height of the cylindrical member 22 or the inner cylinder 29 is adjusted, and the reactor It is preferable that the lid and the cylindrical member 22 or the inner cylinder 29 are designed to be in close contact with each other.
  • the liquid that has entered the cylindrical member 22 flows out into the reactor vessel from the lower plurality of holes 21 and is collected on the inner surface of the vessel in the same manner as in the first embodiment. After the high-density structure is formed, the mesh member 24 can be easily taken out by taking out the cylindrical member 22 from the reactor vessel and pushing it up from below with a protruding member.
  • a closed circulation culture apparatus in which a reactor 10, a medium reservoir 30, a circulation pump 40, and a flow cell 50 are connected by a pipe and installed in an incubator 60 is provided.
  • a sensor such as a DO (dissolved oxygen) sensor 70 and a display device 80 for the measured value, and a stirrer 90 for stirring the medium in the medium reservoir 30 are installed.
  • the stirrer 90 is, for example, a magnetic rotating device that rotates a magnetic stirring bar placed in a medium reservoir.
  • the mesh member only needs to support a high-density cell culture that is a mixture of extracellular matrix components and animal cells, and usually has a mesh that does not greatly disturb the liquid flow. It is. Specifically, it has a hole of about 100 / ⁇ ⁇ to 1 ⁇ , more preferably about 100 m to 0.5 mm. For example, a mesh of about 100 ⁇ m to 300 ⁇ m formed by weaving a wire having a diameter of about 0.08 to 0.1 mm can be used.
  • the material of the mesh member may be any of metal (for example, stainless steel), synthetic resin (for example, polyester), ceramic, and artificial material.
  • a metal mesh that is easy to sterilize and clean is preferred.
  • a biocompatible material such as an artificial blood vessel material
  • a high-density cellular tissue can be formed on the mesh and applied to the living body. is there.
  • the liquid flow control member is not particularly limited as long as it is a member that allows the liquid flow to permeate while decelerating the flow, but is usually a liquid flow permeable porous material, particularly a liquid flow permeable porous membrane. It is. Examples of such membranes include filter paper, woven fabric, non-woven fabric, or silk-five mouth-in membrane.
  • the mesh member and the liquid flow control member are disposed in contact with or in proximity to each other.
  • the term “proximity” refers to a stagnation force of the solution caused by the liquid flow control member S. If it occurs in the vicinity of the mesh member, it is usually about several millimeters or less, preferably about 1 mm or less.
  • the mesh member and the liquid flow control member may be arranged on the upstream side (with a view to the liquid flow force), but when the mesh member (especially a metal mesh) is arranged on the upstream side, It is possible to easily obtain a high-density cell culture tissue that only has matrix components and animal cells.
  • the fluid flow control member may be arranged upstream.
  • the mesh member and the liquid flow control member may be integrated.
  • a conventional artificial blood vessel material has a structure in which a stainless steel cylinder is lined with polyester knit, and can be used as an alternative member of the mesh member-liquid flow control member of the present invention.
  • It may be about 4 to 10 ⁇ l Zcm 2 / sec, preferably about 6 to 8 ⁇ l / cm 2 / sec.
  • Te Contact ⁇ the present invention extracellular matrix components contained in the cell culture 37 ° C as the base material of cell adhesion, neutral P H region Nio, a Te polymerization! /, Mutually adherable
  • the molecule is typically a substance found in connective tissue. Examples of such substances include collagen, elastin, proteoglycan, fibrin, fibronectin, laminin, chitin, chitosan and the like.
  • These extracellular matrix components may be used alone or in combination of two or more.
  • the modification may be a modification usually found in vivo or an artificial modification for imparting various activities and properties.
  • the above components can also be included.
  • the above components for example, for proteodarican, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, heparin, keratan sulfate, etc.
  • it is collagen or elastin or a combination of these and one or more of the above components, and particularly preferably collagen or collagen and one or more of the above components. Which component is preferred is determined by the type of target tissue.
  • any conventionally known collagen can be used.
  • collagens such as type I, type II, type III, type IV, and type V can be used.
  • Such collagen can be used after being dissolved in an acid, an enzyme, an alkali, or the like using a living tissue containing the collagen to be obtained as a raw material.
  • a living tissue containing the collagen In order to eliminate or suppress allergic reactions and rejection reactions, it is preferable to remove all or part of the telopeptide at the molecular end by enzymatic treatment.
  • examples of such collagen materials include pork skin-derived type I collagen, porcine tendon-derived type I collagen, bovine nasal cartilage derived type I collagen, type I collagen extracted from fish, genetically modified collagen, or a mixture thereof. Etc.
  • type IV is used when forming a tissue corresponding to the basement membrane.
  • the animal cells contained in the cell culture medium are appropriately selected according to the purpose and are not particularly limited, and examples include somatic cells, tumor cells, embryonic stem cells and the like.
  • somatic cells include fibroblasts, hepatocytes, vascular endothelial cells, epidermal cells, epithelial cells, chondrocytes, glial cells and smooth muscle cells. These may be used alone or as a mixture of two or more.
  • the basic composition of the cell culture medium depends on the type of animal cells to be cultured, a conventional natural medium or synthetic medium can be used. Synthetic media are more preferable in consideration of infections of animal-derived substances such as bacteria and viruses, and variations in composition depending on the timing and place of supply.
  • the synthetic medium is not particularly limited.For example, a-MEM (Minimum Essential Medium), Eagle MEM, Dulbecco MEM (DMEM), RPM I 1640 medium, CMRC medium, HAM medium, DMEZF12 medium, 199 medium, MCDB medium And so on. A conventionally used serum or the like may be added as appropriate.
  • the natural medium include generally known natural media, and are not particularly limited. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the content of the extracellular matrix component in the cell culture medium is 0.1-0.
  • It is about 5 mgZml, preferably about 0.2 to 0.3 mgZml.
  • the cell culture medium contains other substances that promote cell adhesion together with the extracellular matrix component, for example, peptides and proteins such as polylysine, histone, gluten, gelatin, fibrin, and fib mouth in; RGD, RGDS , GRGDS, YIGSR, IKVAV, and other cell-binding oligopeptides or synthetic proteins incorporating these sequences by genetic engineering; polysaccharides such as alginic acid, starch, dextran and their derivatives; lactic acid, glycolic acid, strength Biodegradable polymers such as polymers of prolataton and hydroxybutyrate or copolymers thereof and block copolymers of these polymers or copolymers with polyethylene glycol or polypropylene glycol may also be included.
  • peptides and proteins such as polylysine, histone, gluten, gelatin, fibrin, and fib mouth in
  • the culture solution may contain physiologically active substances other than those described above.
  • physiologically active substances include cell growth factors, hormones and Z, or natural or synthetic chemical substances having a pharmacological action. By adding such a substance, the function was given. Can be changed. In addition, by changing the reflux conditions, a cell-embedded tissue containing a synthetic compound that does not exist in nature can be created.
  • the cell growth factor is not particularly limited, and examples thereof include epidermal growth factor, epidermal growth factor, fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, hepatocyte growth factor, and insulin. Other cell growth factors can be used depending on the type of cells to be cultured.
  • the hormone is not particularly limited, and examples thereof include insulin, transferrin, dexamethasone, hydrocortisone, thyroxine, 3, 3 ', 5 toledothyronine, 1-methyl 3-butylxanthine, progesterone and the like. it can. These may be used alone or in combination of two or more.
  • physiologically active substances include, for example, ascorbic acid (particularly L-ascorbic acid), vitamins such as biotin, calcium pantothenate, ascorbic acid diphosphate, vitamin D, proteins such as serum albumin and transferrin, Examples include lipids, lipid acid sources, linoleic acid, cholesterol, pyruvic acid, nucleosides for DNA and RNA synthesis, darcocorticoids, retinoic acid, ⁇ -glycose oral phosphate, monothioglycerol, and various antibiotics. These are merely examples, and other components may be used depending on the purpose. The above components may be used alone or in combination of two or more.
  • the culture may be performed under normal conditions until a high-density cultured yarn and weave having a desired size (thickness) is produced.
  • the culture temperature is 35-40 ° C and the culture time is 6 hours-9 days.
  • the conventional method for producing a high-density cultured tissue requires a period of two weeks or more. According to the present invention, the required culture time is significantly reduced.
  • the obtained high-density cultured tissue is taken out, and the extracellular matrix component and one type or Provided is a method for producing a high-density cultured tissue in which culture is continued in a non-circulating culture solution of the same or different formulation containing a plurality of animal cells.
  • the non-circulating culture condition is, for example, culture on a dish.
  • a high-density cultured tissue is produced by the method described in any one of the above. After the preparation, the obtained high-density culture tissue is taken out or subsequently different high-density culture tissue on the tissue using the same or different culture medium containing extracellular matrix components and one or more animal cells.
  • the laminated high-density cultured tissue can be formed by performing the operation of forming at least once.
  • the type and concentration of the extracellular matrix component, the type and concentration of the nutrient component, or the type and concentration of the component to be added, or the culture conditions such as temperature and pH are continuously or intermittently. It is possible to cultivate by changing, and it is possible to create an extracellular matrix environment closer to the living body in the culture apparatus.
  • multiple cell types for example, smooth muscle cells and vascular endothelial cells, etc.
  • the stacked high-density cultured tissue produced by this method may be removed, and the culture may be continued in a non-circulating culture solution of the same or different formulation containing an extracellular matrix component and one or more animal cells. it can.
  • Such high-density cultured tissues include tissues of various parts of the human body, and examples include skin, cartilage, blood vessels, nerves, ureters, heart, skeletal muscle, various organs, and tumor tissues.
  • the high-density culture apparatus 1 is of the type shown in FIG. 1 and configured as follows.
  • a filter paper (Toyo Roshi Co., Ltd. 3 ⁇ 4iIS P-3801—type) is wrapped around the outer circumference of a cylinder containing a stainless steel mesh (mesh size: 133 X 266 ⁇ m) with a diameter of 22 mm and a height of 17 mm. Formed. Note that the mesh is stretched on the inner surface of the support frame, and the mesh and the liquid flow control member are spaced apart at the maximum by the thickness of the support member. Yes.
  • This mesh liquid flow control member is inserted into a radial flow type bioreactor (BRK-05 manufactured by Able Co., Ltd.), and the culture medium reservoir, flow cell, DO sensor (dissolved oxygen meter), and pressure in the circulation path are detected.
  • a closed circulatory system was constructed along with a device and a circulation pump.
  • the radial flow bioreactor has a capacity of about 5 ml of a polycarbonate container, and has a hollow central shaft having a plurality of holes on the surface and an outer peripheral surface having a plurality of holes.
  • the container has a lid with a hole connected to the inside of the central shaft, and liquid is fed through this hole.
  • this is a device in which a carrier such as a bead or sponge is placed in a container and the medium is fed from the outer peripheral surface toward the central axis and circulated.
  • the container was not charged with anything other than the mesh liquid flow control member, and the liquid flow from the central axis to the outer peripheral surface was configured.
  • these are the CO incubators.
  • the medium was circulated while the medium in the medium reservoir was stirred with a magnetic stir bar to supply oxygen and prevent gelation.
  • DMEM + 10% FBS (Ushi fetal serum) + 100unitZml penicillin G, 100 ⁇ gZml streptomycin) and mouse normal fibroblasts (5.0 X 10 7 cells) in 25 Oml type I collagen ((strain ) Made by Koken; extracted from cowhide using the protein digestion enzyme pepsin) was added at a rate of 0.5 mgZml.
  • the culture solution was refluxed at a flow rate of 7 mlZ in the above closed circulation system. Five milliliters of the reflux solution was collected every 24 hours, and the concentration of type I collagen and matrix-metaprotease (MMP) activity were analyzed by SDS-PAGE and zymography, respectively.
  • MMP matrix-metaprotease
  • the collected aggregate was observed with an optical microscope (400x), it was composed of substrate and cells. It was. When this was observed with a scanning electron microscope, the substrate appeared to have a network structure in which fine fibers with a diameter of about 140 nm repeatedly branched and anastomosed (Fig. 6). These fibers have periodic striation that is characteristic of collagen fibrils, and type I collagen in the culture medium shows a decrease over time in SDS-PAGE analysis. It was confirmed that it was formed by coalescence.
  • the DO sensor readings tended to decrease over time, confirming cell survival and growth.
  • fibroblasts were partially spindle-shaped from day 3 and were morphologically similar to fibroblasts present in the dermis layer.
  • the cell concentration in the accumulation was about 55-70 in the field of view of 400 times regardless of the number of culture days between 3 and 9 days.
  • Gelatin 'zymography In one analysis, transient MMP-2 and MMP-9 rises were observed. During the 9-day culture period, V and miscellaneous gels were not observed even if they were dissected even on the gel, and scattered. Existed in sex.
  • high-density fibroblasts can be cultured in a form closer to the dermis.
  • Example 1 Prepare 250 ml of culture solution adjusted to 0.5 mgZml type I collagen as in Example 1, and human gastric cancer cells (KATO III) 1.0 X 10 7 cells Z250 ml and the same number of human fibroblasts (TIG101) as above
  • KATO III human gastric cancer cells
  • TOG101 human fibroblasts
  • a collagen-coated plain weave Dacron artificial blood vessel (Intergard-W (trademark)) having almost the same shape and dimensions as this was placed in a reactor and cultured for 5 days.
  • the Dacron vascular prosthesis used is a product that has already been used for transplantation, and has the ability to knit knitted polyester fibers.
  • the collagen gel of the collected artificial tissue has a thickness of about 3 mm and a uniform force, which is thicker than in Examples 1 and 2 (Fig. 8).
  • Fig. 9 When searched with an optical microscope, refluxed cells were observed in the tissue formed on the Dacron artificial blood vessel (Fig. 9).
  • an artificial tissue can be easily formed on an artificial blood vessel, and an artificial tissue can be created in combination with an artificial biopolymer material.
  • the vascular media smooth muscle layer
  • the vascular media can be artificially created by replacing the combination with, for example, smooth muscle and type IV collagen.
  • the high-density culture apparatus 2 is of the type shown in FIG. 2 and configured as follows.
  • a metal cylinder having three openings with a length of 4.2 mm and a length of 11.2 mm at the bottom of an outer diameter of 21.3 mm, an inner diameter of 19.3 mm, and a height of 20.5 mm was prepared.
  • This metal cylinder was provided with ribs with a width of 1.1 mm on its inner circumference.
  • a silicon rubber ring (outer diameter 19.3 mm, inner diameter 17. Om, height 0.5 mm), disk-shaped stainless steel wire mesh (diameter 18.7 mm (same below), 35-50 mesh) ), Filter paper (Toyo Filter Paper Co., Ltd.
  • the metal cylinder (inner cylinder) placed on the inside is in close contact with the lower surface of the reactor with the lid closed, and when the culture medium is introduced into the center of the lid, all the reflux medium is made of metal. It passed through the inside of the cylinder.
  • the high-density culture apparatus was changed to the apparatus, the cells of human-derived cancer cell cultures (1. OX 10 7 cells
  • the collagen concentration was 0.5 mgZml, the total amount of the culture solution was 200 ml, and the solution was also refluxed for 20 hours with the central force of the lid of the reactor introduced as described above.
  • the culture medium and collagen were the same as in Example 1. As a result, a white agglomerate was obtained on the upper mesh that was slid over almost the entire surface (Fig. 10).
  • the metal cylinder is removed from the reactor, and the cylinder is slowly placed on a member with a cylindrical metal rod (diameter 16.5 mm, height approximately 25 mm) in the center of the disc-shaped base (diameter 50 mm). The mesh inside the cylinder was taken out.
  • the accumulation on the mesh was uniformly about 0.5 mm in thickness, and as a result of microscopic observation, proliferation of cancer cells was observed in the collagen fibers.
  • a gel having a thickness of 2.4 mm and a diameter of 17.5 mm could be recovered.
  • fetal bovine serum was added to the reflux solution.
  • the extracellular matrix and the layer of cells that are hierarchically different can be stacked by repeating three-dimensional three-dimensional culture and high-density culture.
  • Collagen gel is not easy to produce because the limit is about 2mgZml in neutral culture medium, and at this concentration, fibril formation occurs rapidly.
  • the closed circulation type high-density culture apparatus uses a type I collagen solution with a low concentration of 0.5 mg / ml, even an unskilled person can prepare a cell-incorporated collagen gel.
  • FIG. 1 A schematic diagram showing a configuration example of a reactor portion of a culture apparatus used in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing another configuration example of the reactor part of the culture apparatus used in the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing another configuration example of the reactor portion of the culture apparatus used in the method of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of the configuration of a culture apparatus used in the method of the present invention.
  • FIG. 5 is a macroscopic photograph of a high-density cultured tissue (Example 1) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 6 is an electron micrograph of a high-density cultured tissue (Example 1) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 7 is an optical micrograph of a high-density cultured tissue (Example 2) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph of the inside of a high-density cultured tissue reactor obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 9 is an optical micrograph of a high-density cultured tissue (Example 3) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 10 is a macroscopic photograph of a high-density cultured tissue (Example 4) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 11 Optical microscope image of hierarchical high-density cultured tissue (Example 5) obtained by the method of the present invention.
  • FIG. 12 Optical microscope image of hierarchical high-density cultured tissue (Example 5) obtained by the method of the present invention. Reactor Container body Lid

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Abstract

　細胞外マトリックス成分と１種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、メッシュ部材と液流制御部材とを、液流制御部材が液流に対して前記メッシュ部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記メッシュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させる方法を提供する。 　本発明によれば、簡単な操作によって細胞が高密度に集積した生体組織類似の人工組織を迅速に作成することができる。

Description

明 細 書
高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織
技術分野
[0001] 本発明は、高密度培養組織の製造方法、高密度培養組織及び高密度培養装置に 関する。さらに詳しくは、人工臓器、人工骨、人工皮膚等の再生医療用または各種実 験用の高密度培養組織の製造方法及びこの方法により得られる高密度培養組織並 びにこの製造方法に用いる装置に関する。
背景技術
[0002] 近年、様々な細胞を生体外で培養できるようになってきて!/、るが、これらの細胞を有 機的に立体配置する技術は肝臓などの比較的均一な構成の組織に限られている。 従来、三次元培養法として提唱されている技術は、接着基質 (足場材料)を予め作成 し、これに細胞を播種して培養液中で培養するカゝ（例えば、特開平 06— 277050号 公報 (特許文献 1)、特開平 10— 52261号公報 (特許文献 2)、特開 2001— 12025 5号公報（特許文献 3)、特開 2003— 265169号公報（特許文献 4)、 WO2004Z07 8954号パンフレット（特許文献 5)、特開 2004— 65087号公報 (特許文献 6)等)）、 ディッシュ (ペトリ皿)上で接着基質と細胞とを混合して培養する方法しかなかった。
[0003] しかし、前者の場合は細胞を接着基質内に遊走させる必要があり長期間培養を続 けなければならない。後者の場合には接着基質は非常に希薄な組織であり、播種し た細胞が基質を収縮させて高密度になるまで長期間培養を続けなければならない。 V、ずれの方法を採用するにしても 2週間程度の培養期間が必要であり、その間に細 胞から接着基質を分解する酵素が分泌されるため、一度形成された高密度組織が分 解されてしまう場合があった。
このように、三次元的に高密度化された培養組織は、移植医療、生命科学の実験 や新薬の治験等での有用性が期待されているが、作成期間が長く利用期間が短い t 、う理由力も未だ充分に普及して 、な 、のが現状である。
[0004] 特許文献 1：特開平 06— 277050号公報
特許文献 2：特開平 10— 52261号公報 特許文献 3：特開 2001— 120255号公報
特許文献 4:特開 2003— 265169号公報
特許文献 5： WO2004Z078954号パンフレツ卜
特許文献 6：特開 2004— 65087号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 従って、本発明の目的は、簡単な操作によって細胞が高密度に集積した生体組織 類似の人工組織を迅速に作成する方法を提供することにある。特に、本発明は、再 生医療の材料として有用な様々な移植用組織並びに化粧品や新薬開発時に行わ れる動物実験を補完しうる組織を医療現場で簡単にかつ迅速に作成可能とすること を目的とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行なった結果、細胞外マトリック ス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培養する経路内に、 メッシュ部材と液流制御部材とを、液流制御部材が液流に対向して前記メッシュ部材 の裏面に位置するように接触または近接させて配設すれば、細胞が接着する基質の 形成と細胞の播種を同時に行なうことが可能であり、上記構成を適用することにより、 従来法に比べ格段に早く目的とする組織が作成できることを見出し本発明を完成す るに至った。
[0007] すなわち、本発明は、以下の高密度培養組織の製造方法及びこれにより得られる 高密度培養組織並びにこの製造方法に用いる装置を提供する。
1.細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環 培養する経路内に、メッシュ部材と液流制御部材とを、液流制御部材が液流に対し て前記メッシュ部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記メッ シュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させることを特 徴とする高密度培養組織の製造方法。
2.細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、エラスチン、プロテオダリカン、フイブリリン
、フイブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサンもしくはこれらに化学的修飾が加えられ た化合物またはこれらの 2種類以上の混合物を含む前記 1記載の高密度培養組織 の製造方法。
3.動物細胞が、体細胞、腫瘍細胞および胚性幹細胞またはこれらの 2種類以上の 混合物を含む前記 1記載の高密度培養組織の製造方法。
4.体細胞が、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、神経膠 細胞、平滑筋細胞から選択される前記 3記載の高密度培養組織の製造方法。
5.培養液がさらに生理活性物質を含む前記 1記載の高密度培養組織の製造方法。
6.生理活性物質が、細胞成長因子、ホルモン及び Zまたは薬理作用を有する天然 もしくは合成化学物質またはこれらの 2種類以上の混合物を含む前記 5記載の高密 度培養組織の製造方法。
7.培養温度が 35〜40°Cで培養時間が 6時間〜 9日である前記 1記載の高密度培 養組織の製造方法。
8.液流制御部材が液流透過性多孔性材料である前記 1記載の高密度培養組織の 製造方法。
9.液流透過性多孔性材料が、濾紙、不織布または絹フイブ口イン膜である前記 7記 載の高密度培養組織の製造方法。
10.メッシュ部材が、金属、セラミック、合成樹脂または天然材料である前記 1記載の 高密度培養組織の製造方法。
11.液流制御部材とメッシュ部材がー体的に形成されて 、る前記 1記載の高密度培 養組織の製造方法。
12.一体的に形成された液流制御部材とメッシュ部材が人工血管である前記 11記 載の高密度培養組織の製造方法。
13.メッシュ部材と液流制御部材が筒状であり、筒の中心力 外周に向けての液流 中にメッシュ部材を液流制御部材の内側に配設する前記 1記載の高密度培養組織 の製造方法。
14.メッシュ部材と液流制御部材が円筒状であり、これらを同軸に配設してその中心 軸から外周に向けて前記培養液を流し、外周で回収した培養液を前記中心軸に循 環し、これによつて前記メッシュの表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度 に集積させる前記 13記載の高密度培養組織の製造方法。
15.メッシュ部材と液流制御部材が平面状であり、両者を平行に、かつ液流制御部 材が液流に対して前記メッシュ部材の裏面に位置するように接触または近接させて 配設する前記 1記載の高密度培養組織の製造方法。
16.メッシュ部材と液流制御部材を水平に、上方から下方に向けた液流中に上下に 配設する前記 15記載の高密度培養組織の製造方法。
17.前記 1〜16のいずれかに記載の方法により高密度培養組織を製造した後、得ら れた高密度培養組織を取り出し、細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物 細胞を含む同一または異なる処方の非循環培養液中で培養を継続する高密度培養 組織の製造方法。
18.前記 1〜16のいずれかに記載の方法により高密度培養組織を製造した後、得ら れた高密度培養組織を取り出し、または引き続いて、細胞外マトリックス成分と 1種類 または複数の動物細胞を含む同一または異なる培養液を用いて前記組織上に異な る高密度培養組織を形成する操作を少なくとも 1回行って積層型高密度培養組織を 形成する高密度培養組織の製造方法。
19.前記 18に記載の方法で製造した積層型高密度培養組織を取り出し、細胞外マ トリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む同一または異なる処方の非循環 培養液中で培養を継続する積層型高密度培養組織の製造方法。
20.高密度培養組織が、皮膚、軟骨、血管、神経、筋肉または各種臓器である前記 1〜19のいずれかに記載の高密度培養組織の製造方法。
21.前記 1〜20のいずれかに記載の方法により製造される高密度培養組織。
22.細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を収 容するための液溜め、前記細胞培養液を循環するためのポンプ手段、筒状容器本 体を有するリアクター及びこれらをつな ヽで閉鎖循環路を構成する管路を有し、前記 リアクターは、その内部に筒状メッシュ部材と筒状液流制御部材とを接触または近接 させてメッシュ部材が液流制御部材の内側に位置するように同軸に保持して、前記 細胞培養液をメッシュ部材上に内側から外側に向けて流通させる液の出入口を有す る、前記メッシュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を集積させる高密 度細胞培養装置。
23.細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を収 容するための液溜め、前記細胞培養液を循環するためのポンプ手段、筒状容器本 体を有するリアクター及びこれらをつな ヽで閉鎖循環路を構成する管路を有し、前記 リアクターは、その内部に平面状メッシュ部材と平面状液流制御部材を接触または近 接させて水平に上下に保持して、前記細胞培養液をメッシュ部材上に上方から下方 に向けて流通させる液の出入口を有する、前記メッシュ部材の表面に細胞外マトリツ タス分子と動物細胞を集積させる高密度細胞培養装置。
発明の効果
[0008] 本発明によれば、簡単な操作によって細胞外マトリックスと動物細胞が高密度に集 積した生体組織に類似した人工組織が迅速に作成できる。本発明により再生医療の 材料としてさまざまな移植用組織、並びに化粧品や新薬開発時に行われる動物実験 を補完しうる組織を医療または研究の現場で簡単にかつ迅速に作成することが可能 となる。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明では、上記の通り、細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を 含む細胞培養液を循環培養する経路内に、メッシュ部材と液流制御部材を接触また は近接させて配設する。この際、培養液の流れ力 見て上流側にメッシュ部材を配置 させ、前記メッシュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積 させる。
[0010] 上記培養液をメッシュ部材と液流制御部材を接触または近接させて配設すること〖こ より、培養液の流速を局所的に低減させ、細胞培養液に懸濁している細胞外マトリツ タス成分と動物細胞の濃度を局所的に高めることができ、この結果、メッシュ部材上 に細胞外マトリックス分子と動物細胞が高密度に集積される。
[0011] 細胞外マトリックス分子と動物細胞の高密度な集積を均一に行なうためには、メッシ ュ部材と液流制御部材に対し培養液流を概ね均一に流すものとする。これは、第 1の 態様としては、メッシュ部材と液流制御部材を筒状の部材とし、これらをメッシュ部材 が内側になるように同軸状に配置してメッシュ部材の内部から外側に向けて培養液を 流すことにより実現できる。第 2の態様としては、メッシュ部材と液流制御部材を平面 状の部材とし、これらを平行に配置してメッシュ部材表面に対して概ね直角に培養液 を流すことにより実現できる。
[0012] 第 1の態様は、特に円筒状に設けたメッシュ部材と液流制御部材に対し培養液流 を円筒の中心軸力も放射状に流す形態が好ましい。このような形態は、典型的には、 図 1に示すような円筒状のリアクター 10によって実現できる。このリアクターは、基本 的には円筒状の容器本体 11、蓋 12からなり、容器本体の中央には表面に複数の孔 13を有する中心筒 14が設けられ、また、蓋 12の中央には開口部 15があって、蓋 12 でリアクターを密閉したときに開口部 15が中心筒 14内の中空部と繋がって液の流路 を形成するようになっている。あるいは、中心筒 14は開口部 15と一体に蓋 12に固定 されていてもよい。また、容器本体 11の外周には容器内と外部とを繋ぐ別の管路 16 が設けられている。この管路 16は 1または複数設けられ、容器内に向けて開いた孔 1 7を有し、また、管路 16の上端は蓋 12の対応位置に空けられた対応する開口部 18と 繋がって、液の流路を形成する。これにより、開口部 15からリアクター 10内に液を導 入し、開口部 18から液を取り出すことが可能になっている。もっとも、外周から液を取 り出すための構成は任意であり、ここに挙げた構成に限られるものではない。
[0013] 本発明においては、前記中心筒 14の周りにこれとほぼ同軸となるように、円筒状メ ッシュ部材 19、前記円筒メッシュ部材の外面と容器内面との間に液流制御部材 20を 配設する。図 1ではメッシュ部材 19と液流制御部材 20を取り出して示してある力 使 用時にはこれら円筒メッシュ部材と液流制御部材は前者が内側になるように容器内 に装着する。例えば、円筒メッシュ部材 19は、図示するように枠の内側にメッシュを固 定な 、し装着したものであり、可撓性シートまたはフィルムである液流制御部材をメッ シュ部材 19の枠の外側に巻き付けることができる。
培養液を前記開口部 15からリアクター 10内に送入することにより、その表面の孔 1 3から容器内部に向けて、細胞外マトリックス成分と動物細胞を含む細胞培養液が半 径方向に湧出する（図中の矢印）。培養液はメッシュ部材 19と液流制御部材 20を通 り、容器内面で回収され、後述のようにポンプ手段を通して前記中心筒内に循環され る。好ましくは循環経路内に、循環路内の圧力を感知する装置を設ける。 [0014] 第 2の態様は、特に平行に設けたメッシュ部材と液流制御部材が平面状の部材に 対し培養液流をメッシュ部材の側力 流す形態が好ましい。このような形態は、例え ば、図 2に示すように、下部に複数の孔 21を有する筒状部材 22を流路内に設置する こと〖こより実現される。
本発明では、筒状部材 22内にメッシュ力 なる平面状部材 23、その下側に液流制 御部材 24を配設する。好ましくは、筒状部材 22は、その内周にリブ 25を備えており、 必要に応じて漏出防止用部材 (例えば、シリコンリング） 26、 27、支持用メッシュ 28を 装入し、その上に液流制御部材 26と平面状メッシュ部材 24を重ねる。さらに、液の漏 出防止用部材 (例えば、内筒 29)を重ねる。図 2ではこれらの部材を取り出して示して あるが、使用時にはこれらの部材を、上記のように筒状部材 22内のリブ 25で固定さ れるように装着し、流路内に設置する。
例えば、第 1の実施形態のリアクター 10において中心筒 14を取り除いた容器に上 記筒状部材 22を設置する。なお、リアクター内に入った液が筒状部材 22の外部を流 れた場合、高密度組織の形成効率が低下するので、筒状部材 22または内筒 29の高 さを調整して、リアクターの蓋と筒状部材 22または内筒 29が密着するように設計する ことが好ましい。筒状部材 22内に入った液は下部の複数の孔 21からリアクター容器 内に流出し、第 1の態様と同様にして容器内面で回収される。なお、高密度組織が形 成された後、筒状部材 22をリアクター容器から取り出し、これを下から突起状部材で 押し上げることにより、メッシュ部材 24を容易に取り出すことができる。
[0015] 装置全体の構成例としては、図 4に示すように、リアクター 10、培地溜め 30、循環ポ ンプ 40、フローセル 50を管路で接続しインキュベーター 60内に設置した閉鎖循環 式培養装置が挙げられる。好ましくは、 DO (溶存酸素）センサー 70等のセンサーとそ の計測値の表示装置 80、さらに培地溜め 30内の培地を撹拌するためのスターラー 9 0を設置する。スターラー 90は、例えば、培地溜め内に入れた磁気撹拌子を回転さ せる磁気回転装置である。
[0016] なお、上記で例として挙げたリアクター容器は、特公平 2— 109966号公報）に記載 されており、市販品も存在するが、容器内に生体担体触媒等を充填し、外周から内 部に向力つて培地を流すものであり、本発明で規定する構成により高密度な細胞培 養装置として用いるものではない。特に、本発明者らの検討によれば、内部から外周 に向力つて培地を流す構成により、従来に比べ短時間で高密度な細胞培養が実現 できると 、う予想外の知見が得られて 、る。
[0017] メッシュ部材は、細胞外マトリックス成分と動物細胞の混合体である高密度細胞培 養物を支持するに足るものであればよぐ通常、液流を大きく妨げない程度の網目を 有する部材である。具体的には、 100 /ζ πι〜1πιπι程度、より好ましくは 100 m〜0 . 5mm程度の孔を有する。例えば、直径 0. 08〜0. 1mm程度の針金を織って形成 した 100 μ m〜300 μ m程度のメッシュが利用できる。メッシュ部材の材料は金属（例 えば、ステンレス）、合成樹脂（例えば、ポリエステル）、セラミック、人工材料等のいず れでもよい。通常は滅菌や洗浄操作の容易な金属製メッシュが好ましいが、例えば、 人工血管材料等の生体適合性材料を用いれば、その上に高密度細胞組織を形成し て生体に適用することも可能である。
[0018] 液流制御部材は、液流を透過させつつもその流れを減速させる部材であれば特に 限定されないが、通常は、液流透過性多孔性材料、特に液流透過性の多孔性膜で ある。このような膜の例としては、濾紙、織布、不織布または絹フイブ口イン膜が挙げら れる。
[0019] 本発明では、メッシュ部材と液流制御部材を接触または近接させて配設する。ここ で、近接と言う場合、液流制御部材による溶液の停滞力 Sメッシュ部材近傍で生じるも のであればよぐ通常は数 mm程度以下、好ましくは約 lmm以下である。メッシュ部 材と液流制御部材は 、ずれを (液流力も見て）上流側に配置してもよ 、が、メッシュ部 材 (特に金属製メッシュ）を上流側に配置した場合には細胞外マトリックス成分と動物 細胞のみ力もなる高密度細胞培養組織を容易に得ることができる。なお、細胞外マト リックス成分と動物細胞力 なる高密度細胞培養組織と液流制御部材との複合部材 を得る目的の場合は、液流制御部材を上流側に配置してもよい。また、メッシュ部材 と液流制御部材は一体ィ匕されていてもよい。例えば、慣用の人工血管材料は、ポリエ ステルニットでステンレス製円筒を裏打ちした構造を採っており、本発明のメッシュ部 材ー液流制御部材の代替部材として用いることができる。
[0020] メッシュ部材と液流制御部材の上記以外の寸法条件（面積、ラジアルフロー型リアク ターにおいては直径）は成長させようとする細胞の種類や組織の大きさにもよるが、 細胞培養液の循環速度カ^ッシュ部材または液流制御部材近傍にぉ 、て、例えば、
4〜10 μ lZcm2/秒程度、好ましくは 6〜8 μ 1/cm2/秒程度となる程度のものであ ればよい。
[0021] 本発明にお ヽて、細胞培養液中に含まれる細胞外マトリックス成分は細胞接着の 基材として 37°C、中性 PH領域にぉ 、て重合な!/、し相互接着可能な分子であればよ いが、典型的には結合組織中に見られる物質である。このような物質の例としては、 例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フイブリリン、フイブロネクチン、ラ ミニン、キチン、キトサン等が挙げられる。これらの細胞外マトリックス成分は単独で用 いてもよいし、 2種以上の組み合わせとして用いてもよい。また、上記各成分は種々 の化学的修飾を受けたものでものでもよ ヽ。修飾は生体内で通常見られる修飾でも よいし、種々の活性や特性を賦与する為の人工的な修飾でもよい。さらに、上記各成 分の構成成分 (例えば、プロテオダリカンについて、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸 、デルマタン硫酸、へパラン硫酸、へパリン、ケラタン硫酸などのグリコサミノダリカン 等)も含まれ得る。
[0022] 好ましくは、コラーゲンもしくはエラスチンまたはこれらと上記成分の 1種以上の組み 合わせであり、特に好ましくはコラーゲンまたはコラーゲンと上記成分の 1種以上の組 み合わせである。どの成分が好ましいかは目的とする培養組織のタイプにより決定さ れる。
[0023] コラーゲンとしては、従来公知のいずれのコラーゲンも用い得る。例えば、 I型、 II型 、 III型、 IV型、 V型等のコラーゲンを用いることができる。
こうしたコラーゲンは、得ようとするコラーゲンを含む生体組織を原料として、酸、酵 素、アルカリ等により可溶ィ匕して用いることができる。また、アレルギー反応や拒否反 応を解消ないし抑制するため、酵素処理によって分子末端のテロペプチドを全部ま たは一部を除去することが好ましい。このようなコラーゲン材料としては、例えば、豚 皮由来 I型コラーゲン、豚腱由来 I型コラーゲン、牛鼻軟骨由来 Π型コラーゲン、魚か ら抽出した I型コラーゲン、遺伝子組換え型のコラーゲンあるいはこれらの混合物等 が挙げられる。但し、これらは例示であり、 目的に応じ他の種類も利用可能である。例 えば、基底膜に相当する組織を形成する場合には IV型を用いる。
[0024] 細胞培養液中に含まれる動物細胞は、 目的に応じて適宜選択され特に限定されな いが、体細胞、腫瘍細胞、胚性幹細胞等が挙げられる。体細胞としては、例えば、線 維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、神経膠細胞 および平滑筋細胞等が挙げられる。これらは単独でもよいし、 2種類以上の混合物で ちょい。
[0025] 細胞培養液の基本組成は、培養対象とする動物細胞の種類にもよるが、慣用の天 然培地または合成培地を用い得る。動物由来物質力 の細菌やウィルスなどの感染 、供給の時期や場所による組成のばらつき等の点を考慮すれば、合成培地がより好 ましい。合成培地としては、特に限定はされないが、例えば、 a -MEM (Minimum Essential Medium)、 Eagle MEM、 Dulbecco MEM (DMEM)、 RPM I 1640 培地、 CMRC培地、 HAM培地、 DMEZF12培地、 199培地、 MCDB培地等を挙 げることができる。適宜、慣用される血清等を添加してもよい。天然培地としては、通 常公知の天然培地を挙げることができ、特に限定はされない。これらは単独で用いて も、 2種以上を併用してもよい。
[0026] 細胞培養液中細胞外マトリックス成分の含有量は、培養開始時において 0. 1〜0.
5mgZml、好ましくは 0. 2〜0. 3mgZml程度である。
[0027] なお、細胞培養液は、上記細胞外マトリックス成分とともに、細胞付着を促進する他 の物質、例えば、ポリリジン、ヒストン、グルテン、ゼラチン、フイブリン、フイブ口イン等 のペプチドやタンパク質; RGD、 RGDS, GRGDS, YIGSR, IKVAV等の細胞接 着性オリゴペプチドまたは遺伝子工学的にこれらの配列を組み込んだ合成タンパク 質;アルギン酸、デンプン、デキストラン等の多糖およびこれらの誘導体;乳酸、グリコ ール酸、力プロラタトンおよびヒドロキシブチレートの重合体またはこれらの共重合体 並びにこれらの重合体または共重合体とポリエチレングリコールもしくはポリプロピレ ングリコールとのブロックコポリマー等の生体分解性高分子を含んでもよい。
[0028] また、培養液は、上記以外の生理活性物質を含んでもよ!ヽ。このような生理活性物 質の例としては、細胞成長因子、ホルモン及び Zまたは薬理作用を有する天然もしく は合成化学物質が挙げられる。このような物質を添加することにより、機能を付与した り変化させることができる。また、還流条件を変えることによって自然界には存在しな い合成化合物を含有させた細胞組み込み型の組織を作成できる。
[0029] 細胞成長因子は、特に限定はされないが、例えば、表皮成長因子、上皮成長因子 、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子及びインシュリン等 を挙げることができる。培養しょうとする細胞の種類に応じて他の細胞成長因子を用 いることも可能である。
[0030] ホルモンは、特に限定はされないが、例えば、インシュリン、トランスフェリン、デキサ メタゾン、ヒドロコルチゾン、チロキシン、 3, 3', 5 トリョードチロニン、 1—メチル 3 ーブチルキサンチン、プロゲステロンなどを挙げることができる。これらは単独で用い ても、 2種以上を併用してもよい。
[0031] その他の生理活性物質は、例えば、ァスコルビン酸（特に、 Lーァスコルビン酸）、ビ ォチン、パントテン酸カルシウム、ァスコルビン酸二リン酸、ビタミン D等のビタミン類、 血清アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質、脂質、脂質酸源、リノール酸、コレス テロール、ピルビン酸、 DNAおよび RNA合成用ヌクレオシド、ダルココルチコイド、レ チノイン酸、 βーグリセ口ホスフェート、モノチォグリセロール、各種の抗生物質等を 挙げることができる。なお、これらは例示であって、目的に応じてこれ以外の成分を用 いることもできる。上記成分は単独で用いても、 2種以上を併用してもよい。
[0032] 培養は通常の条件により、所望の大きさ (厚さ）の高密度培養糸且織が生成するまで 行なえばよい。典型的には、培養温度は 35〜40°Cであり、培養時間は 6時間〜 9日 である。上述のように、従来の高密度培養組織の製造方法では 2週間以上の期間を 要している。本発明によれば、必要な培養時間が大幅に短縮される。
[0033] また、本発明によれば、上記の 、ずれかに記載の方法により高密度培養組織を製 造した後、得られた高密度培養組織を取り出し、細胞外マトリックス成分と 1種類また は複数の動物細胞を含む同一または異なる処方の非循環培養液中で培養を継続す る高密度培養組織の製造方法が提供される。ここで、非循環培養条件とは、例えば、 ディッシュ上での培養である。このような方法を採ることにより、新たに積層した細胞が 生体に近!、状態で増殖分化することが期待される。
[0034] また、本発明によれば、上記の 、ずれかに記載の方法により高密度培養組織を製 造した後、得られた高密度培養組織を取り出し、または引き続いて、細胞外マトリック ス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む同一または異なる培養液を用いて前記 組織上に異なる高密度培養組織を形成する操作を少なくとも 1回行って積層型の高 密度培養組織を形成することができる。
[0035] 例えば、細胞外マトリックス成分の種類や濃度、栄養成分の種類や濃度、または添 加する成分の種類や濃度、ある!ヽは温度や pH等の培養条件を連続してまたは断続 的に変化させて培養することも可能であり、より生体に近い細胞外マトリックス環境を 培養装置内で作成可能である。また、細胞接着基材だけでなく複数の細胞種 (例え ば、平滑筋細胞と血管内皮細胞など）を同時にあるいは時間差を持って閉鎖循環式 培養装置内に投入することにより腸や尿管など一定の傾斜構造を持つ組織を再生 することも可會である。
[0036] さらに、この方法で製造した積層型高密度培養組織を取り出し、細胞外マトリックス 成分と 1種類または複数の動物細胞を含む同一または異なる処方の非循環培養液 中で培養を継続することもできる。
[0037] このように、本発明によれば、均一な高密度培養組織の迅速かつ確実な形成が可 能であるとともに、複数の構造を一体ィ匕ないし複合ィ匕した高密度培養組織の迅速か つ確実な形成が可能である。このような高密度培養組織としては、人体各部の組織 が含まれ、例えば、皮膚、軟骨、血管、神経、尿管、心臓、骨格筋または各種臓器及 び腫瘍組織が挙げられる。
実施例
[0038] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
実施例 1
[高密度培養装置 1]
高密度培養装置 1は、図 1に示すタイプのものであり以下のように構成した。
直径 22mm、高さ 17mmのステンレス製メッシュ（メッシュサイズ： 133 X 266 μ m) を含む円筒の外周に濾紙 (東洋濾紙 (株) ¾iIS P— 3801—種)を巻き付けて、メッ シ 液流制御部材を形成した。なお、メッシュは支持枠の内面に張られており、メッ シュと液流制御部材間には、最大で上記支持部材の厚み程度の間隔が隔てられて いる。
[0039] このメッシュ 液流制御部材をラジアルフロー型バイオリアクター（エイブル (株)製 BRK-05)内に挿入し、培地溜め、フローセル、 DOセンサー（溶存酸素計）、循環 路内の圧力を感知する装置、循環ポンプとともに閉鎖循環系を構成した。なお、上記 ラジアルフロー型バイオリアクターは、容量約 5mlのポリカーボネート製容器力 なり 、複数の孔を表面に有する中空の中心軸と複数の孔を有する外周面を有する。容器 には、中心軸内と繋がる孔を有する蓋が附属しており、この孔を通して液を送入する
[0040] なお、メーカーの説明書によれば、これは、容器内にビーズやスポンジ等の担体を 入れ、外周面から中心軸に向けて培地を送り込み循環する装置であるが、以下の実 験では、容器内にはメッシュ 液流制御部材以外のものは装入せず、中心軸から外 周面への液流となるように構成した。図 4に示すようにこれらを COインキュベーター
2
内に設置し、また、磁気撹拌子によって培地溜め内の培地を撹拌して酸素供給及び ゲル化防止を行!、つつ培地を循環させた。
[0041] [培養実験]
培養液（DMEM+ 10%FBS (ゥシ胎児血清） + 100unitZmlペニシリン G、 100 μ gZmlストレプトマイシン）とマウス正常線維芽細胞（5. 0 X 107細胞）の混合液 25 Omlに I型コラーゲン（ (株)高研製；蛋白消化酵素ペプシンを用いて牛皮より抽出し たもの）を 0. 5mgZmlの割合で添加した。コラーゲン添加後、培養液を上記閉鎖循 環系内において流速 7mlZ分で還流した。還流液を 24時間毎に 5mlずつ採取し、 I 型コラーゲン濃度とマトリックス ·メタ口プロテアーゼ（MMP)活性をそれぞれ SDS— P AGEとザィモグラフィ一により解析した。
[0042] 還流開始後、前記メッシュ 液流制御部材のメッシュ側には、白色の滑らかな物質 が集積し始めた。還流開始後 3日目、 6日目、 9日目にリアクター力も前記メッシュ— 液流制御部材を回収したところ、 3日目の時点でメッシュ上に厚さ 2mm、幅 17mm、 長さ 59mm、湿重量約 1. Ogの集積物が形成されていた（図 5)。それ以後も若干の 重量の増加が見られたが形態上の変化は認められな力つた。
回収した集積物を光学顕微鏡 (400倍)で観察したところ、基質と細胞から構成され ていた。これを走査型電子顕微鏡で観察したところ、基質は直径約 140nmの細線維 が分岐'吻合を繰り返す網状構造を呈して ヽた（図 6)。この線維はコラーゲン細線維 の特徴である周期性横紋を有しており、培養液中の I型コラーゲンは SDS— PAGE 分析で経時的減少を示していることから基質が I型コラーゲンの自己重合体で形成さ れて 、ることが確認された。
[0043] 還流開始後、 DOセンサーの測定値は経時的に減少傾向を示し、細胞の生存'成 長を裏付けていた。光学顕微鏡観察では、 3日目の時点から線維芽細胞が一部紡 錘形を示し、真皮層に存在する線維芽細胞と形態的に類似していた。なお、 HE染 色、電子顕微鏡観察の結果によれば、集積物中の細胞濃度は 3〜9日の間では培 養日数に関係なく 400倍の視野中 55〜70個程度であった。ゼラチン'ザィモグラフィ 一による解析では、一過性の MMP— 2及び MMP— 9上昇が観察された力 9日間 の培養期間中、 V、ずれのゲルにお 1ヽても細胞塊は観察されず散在性に存在した。 以上の通り、本発明の方法によれば、ディッシュ上での培養と異なり、真皮内により 近い形態で高密度の線維芽細胞の培養が実現できる。
[0044] 実飾 12
実施例 1と同じく I型コラーゲン 0. 5mgZmlに調整した培養液 250mlを用意し、ヒト 胃癌細胞 (KATO III) 1. 0 X 107細胞 Z250ml及びこれと同数のヒト線維芽細胞（ TIG101)を上記閉鎖循環式培養装置にて 4日間還流したところ、実施例 1と同じよう に厚さ l〜2mm、幅 17mm、長さ 59mmの人工組織を得た。実施例 1と同様に培養 液中の溶存 I型コラーゲンは還流培養によって減少しており、電子顕微鏡観察の結 果からも人工組織の基質は I型コラーゲンの自己重合体で形成されていることが確認 できた。
[0045] 光学顕微鏡的に観察したところ多数の硬癌細胞と線維芽細胞がコラーゲン細線維 の網状構造の中にヒト癌組織によく似た状態で形成されて 、る様子が観察された（図 7)。
なお、この例では硬癌細胞だけを I型コラーゲンとともに還流培養しても多くの癌細 胞は萎縮してしまい癌組織を得ることはできず、正常線維芽細胞とともにコラーゲン ゲル内に培養することでのみヒトの癌組織モデルを作成できた。 [0046] 実施例 3
実施例 1の前記メッシュ 液流制御部材に代えて、これとほぼ同形状同寸法のコラ 一ゲン被覆平織りダクロン人工血管 (Intergard— W (商標））をリアクター内に置 、て 5日間培養した。なお、用いたダクロン人工血管は既に移植手術に供されている製品 であり、ポリエステル繊維のニット編み構造力もなる。
[0047] 回収した人工組織のコラーゲンゲルは厚さ約 3mmで、し力も均一で実施例 1、 2に 比べて厚い（図 8)。光学顕微鏡にて検索したところダクロン人工血管上にできた組織 内には還流した細胞が観察された（図 9)。
以上のように、本発明によれば、人工血管上に容易に人工組織を形成することが可 能であり、人工生体高分子材料と組み合わせて人工組織を作成できることが確認さ れた。また、組み合わせを例えば平滑筋と IV型コラーゲンに代えることにより血管の 中膜 (平滑筋の層）を人工的に作成することができる。
[0048] 実施例 4
[高密度培養装置 2]
高密度培養装置 2は、図 2に示すタイプのものであり以下のように構成した。
外径 21. 3mm、内径 19. 3mm、高さ 20. 5mmの下部に縦 4. 2mm、長さ 11. 2m mの開口部を 3箇所有する金属製円筒を用意した。なお、この金属製円筒には、そ の内周に幅 1. 1mmのリブを設けた。この円筒内に、シリコン製ゴムリング (外径 19. 3mm、内径 17. Om、高さ 0. 5mm)、濾紙支持用の円盤状ステンレス金網（直径 18 . 7mm (以下同じ）、 35〜50メッシュ）、濾紙 (東洋濾紙 (株)衡 IS P— 3801—種） 、高密度培養組織製造用の円盤状ステンレス金網（100メッシュ）、シリコン製ゴムリン グ（外径 19. 3mm,内径 17. Om、厚さ 0. 7mm)を置き、さらに金属製円筒の内側 にこれと接するような金属製内筒（外径 19. 2mm,内径 17. Om、高さ 0. 5mm)を配 置した。内側に配置した金属製円筒（内筒）はリアクターに蓋を閉めた状態でその下 面に密着するようにし、蓋中央の孔力 培養液を導入した際に、還流培養液がすべ て金属製円筒の内側を通るようにした。
[0049] [培養実験]
高密度培養装置を上記装置に変更し、培養細胞をヒト由来癌細胞（1. O X 107細胞 )としコラーゲン濃度を 0. 5mgZml、培養液の総量を 200mlとし、上記の通りリアクタ 一蓋中央力も液を導入して 20時間還流した。なお、培養液及びコラーゲンは実施例 1と同じものを使用した。この結果、上部メッシュ上に、ほぼその全面にわたって滑ら 力な白色の集積物が得られた（図 10)。
還流停止後、金属製円筒をリアクターから取り外し、円盤状の基部（直径 50mm)の 中央に円柱金属棒 (直径 16. 5mm,高さ約 25mm)を取り付けた部材の上に円筒を ゆっくりと載せて円筒内部のメッシュを取り出した。
メッシュ上の集積物は厚さが均一に約 0. 5mmであり、顕微鏡観察の結果、コラー ゲン線維中に癌細胞の増殖が観察された。
[0050] 実飾 15
図 3に示すように、実施例 4で用いた平板状ゲル作製装置（図 2)のろ紙 (24)を除き 、 目の細かい金属メッシュ（23)上にポリ乳酸線維のニット網構造力もなる直径 18. 7 mmのシート (31)を配置した。
このリアクター内に、 I型コラーゲン 0. 5mgZmlに調整した培養液 250mlを用意し 、ヒト線維芽細胞（HFO小 2) 2 X 107個/ 250mlを 4時間、 5ml/minの流速にて環 流した。
[0051] 0. 5mg/ml I型コラーゲンと線維芽細胞の混合液に替えて、引き続き 0. lmg/ ml Matrigel (基底膜の代替標品） 50mlに差し替えて 2時間還流を続けた。この還 流終了直前に大動脈平滑筋（Clontech ネ: fcAoSMC) 4 X 106個をリアクター内に注 入し、還流を終えた。
リアクター内からは厚さ 2. 4mm直径 17. 5mmのゲルを回収できた。なお、今回の 実施例では還流液に牛胎児血清を添加して ヽな ヽ。
この回収物を光学顕微鏡で観察したところ、線維芽細胞を含む I型コラーゲン細線 維層と重合したマトリゲル内に平滑筋細胞を持った層が階層的に作製されていた（図 11)。
また、走査電子顕微鏡による観察では最下層からポリ乳酸ゲル層、 I型コラーゲン 細線維と線維芽細胞よりなる層、マトリゲルと平滑筋力ゝら構成された層が区別された ( 図 12)。 産業上の利用可能性
[0052] 本発明によれば、三次元立体培養と高密度培養を繰り返すことにより階層的に異な つた細胞外マトリックスと細胞の層を重ねることができる。コラーゲンは中性培養液で は 2mgZml程度が限界で、この濃度では細線維形成が急速に起こるためコラーゲ ンゲル作成は容易でない。し力しながら閉鎖循環式高密度培養装置では 0. 5mg/ mlと低濃度 I型コラーゲン溶液を用いるため未熟練者でも用意に細胞組み込み型コ ラーゲンゲルを作成することができる。
本発明を利用することにより（l) BSE病原体であるプリオン混入の危険性を回避で きる、（2)血管，腸管，尿管などの階層構造を持った組織を再生することができる可 能性が示される。
図面の簡単な説明
[0053] [図 1]本発明の方法で用いる培養装置のリアクター部分の構成例を示した模式図。
[図 2]本発明の方法で用いる培養装置のリアクター部分の別の構成例を示した模式 図。
[図 3]本発明の方法で用いる培養装置のリアクター部分の別の構成例を示した模式 図。
[図 4]本発明の方法で用いる培養装置の構成の一例を示した模式図。
[図 5]本発明の方法で得られた高密度培養組織 (実施例 1)の肉眼写真。
[図 6]本発明の方法で得られた高密度培養組織 (実施例 1)の電子顕微鏡写真。
[図 7]本発明の方法で得られた高密度培養組織 (実施例 2)の光学顕微鏡写真。
[図 8]本発明の方法で得られた高密度培養組織のリアクター内部の写真。
[図 9]本発明の方法で得られた高密度培養組織 (実施例 3)の光学顕微鏡写真。
[図 10]本発明の方法で得られた高密度培養組織 (実施例 4)の肉眼写真。
[図 11]本発明の方法で得られた階層性高密度培養組織 (実施例 5)の光学顕微鏡像
(矢印：線維芽細胞， *：平滑筋細胞，へマトキシリン'ェォジン染色。；)。
[図 12]本発明の方法で得られた階層性高密度培養組織 (実施例 5)の光学顕微鏡像 符号の説明 リアクター 容器本体 蓋
孔
中心筒
開口部
管路
孔
開口部
メッシュ部材 液流制御部材 孔
筒状部材 平面状メッシュ部材 液流制御部材 リブ
、 27 シリコンリング 支持用メッシュ 内筒
培地溜め シート
循環ポンプ フローセル インキュベーター センサー 表示装置 スターラー

Claims

請求の範囲
[I] 細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を循環培 養する経路内に、メッシュ部材と液流制御部材とを、液流制御部材が液流に対して 前記メッシュ部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設し、前記メッシ ュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に集積させることを特徴 とする高密度培養組織の製造方法。
[2] 細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、エラスチン、プロテオダリカン、フイブリリン、 フイブロネクチン、ラミニン、キチン、キトサンもしくはこれらに化学的修飾が加えられ た化合物またはこれらの 2種類以上の混合物を含む請求項 1記載の高密度培養組 織の製造方法。
[3] 動物細胞が、体細胞、腫瘍細胞および胚性幹細胞またはこれらの 2種類以上の混 合物を含む請求項 1記載の高密度培養組織の製造方法。
[4] 体細胞が、線維芽細胞、肝細胞、血管内皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、神経膠細 胞、平滑筋細胞から選択される請求項 3記載の高密度培養組織の製造方法。
[5] 培養液がさらに生理活性物質を含む請求項 1記載の高密度培養組織の製造方法
[6] 生理活性物質が、細胞成長因子、ホルモン及び Zまたは薬理作用を有する天然も しくは合成化学物質またはこれらの 2種類以上の混合物を含む請求項 5記載の高密 度培養組織の製造方法。
[7] 培養温度が 35〜40°Cで培養時間が 6時間〜 9日である請求項 1記載の高密度培 養組織の製造方法。
[8] 液流制御部材が液流透過性多孔性材料である請求項 1記載の高密度培養組織の 製造方法。
[9] 液流透過性多孔性材料が、濾紙、不織布または絹フイブ口イン膜である請求項 7記 載の高密度培養組織の製造方法。
[10] メッシュ部材が、金属、セラミック、合成樹脂または天然材料である請求項 1記載の 高密度培養組織の製造方法。
[II] 液流制御部材とメッシュ部材がー体的に形成されている請求項 1記載の高密度培 養組織の製造方法。
[12] 一体的に形成された液流制御部材とメッシュ部材が人工血管である請求項 11記載 の高密度培養組織の製造方法。
[13] メッシュ部材と液流制御部材が筒状であり、筒の中心から外周に向けての液流中に メッシュ部材を液流制御部材の内側に配設する請求項 1記載の高密度培養組織の 製造方法。
[14] メッシュ部材と液流制御部材が円筒状であり、これらを同軸に配設してその中心軸 から外周に向けて前記培養液を流し、外周で回収した培養液を前記中心軸に循環 し、これによつて前記メッシュの表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を高密度に 集積させる請求項 13記載の高密度培養組織の製造方法。
[15] メッシュ部材と液流制御部材が平面状であり、両者を平行に、かつ液流制御部材が 液流に対して前記メッシュ部材の裏面に位置するように接触または近接させて配設 する請求項 1記載の高密度培養組織の製造方法。
[16] メッシュ部材と液流制御部材を水平に、上方から下方に向けた液流中に上下に配 設する請求項 15記載の高密度培養組織の製造方法。
[17] 請求項 1〜16のいずれかに記載の方法により高密度培養組織を製造した後、得ら れた高密度培養組織を取り出し、細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物 細胞を含む同一または異なる処方の非循環培養液中で培養を継続する高密度培養 組織の製造方法。
[18] 請求項 1〜16のいずれかに記載の方法により高密度培養組織を製造した後、得ら れた高密度培養組織を取り出し、または引き続いて、細胞外マトリックス成分と 1種類 または複数の動物細胞を含む同一または異なる培養液を用いて前記組織上に異な る高密度培養組織を形成する操作を少なくとも 1回行って積層型高密度培養組織を 形成する高密度培養組織の製造方法。
[19] 請求項 18に記載の方法で製造した積層型高密度培養組織を取り出し、細胞外マト リックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む同一または異なる処方の非循環 培養液中で培養を継続する積層型高密度培養組織の製造方法。
[20] 高密度培養組織が、皮膚、軟骨、血管、神経、筋肉または各種臓器である請求項 1 〜 19のいずれか〖こ記載の高密度培養組織の製造方法。
[21] 請求項 1〜20のいずれかに記載の方法により製造される高密度培養組織。
[22] 細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を収容す るための液溜め、前記細胞培養液を循環するためのポンプ手段、筒状容器本体を有 するリアクター及びこれらをつな ヽで閉鎖循環路を構成する管路を有し、前記リアクタ 一は、その内部に筒状メッシュ部材と筒状液流制御部材とを接触または近接させてメ ッシュ部材が液流制御部材の内側に位置するように同軸に保持して、前記細胞培養 液をメッシュ部材上に内側力も外側に向けて流通させる液の出入口を有する、前記メ ッシュ部材の表面に細胞外マトリックス分子と動物細胞を集積させる高密度細胞培養 装置。
[23] 細胞外マトリックス成分と 1種類または複数の動物細胞を含む細胞培養液を収容す るための液溜め、前記細胞培養液を循環するためのポンプ手段、筒状容器本体を有 するリアクター及びこれらをつな ヽで閉鎖循環路を構成する管路を有し、前記リアクタ 一は、その内部に平面状メッシュ部材と平面状液流制御部材を接触または近接させ て水平に上下に保持して、前記細胞培養液をメッシュ部材上に上方から下方に向け て流通させる液の出入口を有する、前記メッシュ部材の表面に細胞外マトリックス分 子と動物細胞を集積させる高密度細胞培養装置。
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