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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zu intraoperativen Zellbesiedlung von Konstrukten wie Leitschienen (z. B. synthetische Knochenersatzmaterialien) bei der Therapie großer Knochendefekte bei denen das verlorene Knochengewebe nicht mehr durch die körpereigene Regeneration neu gebildet werden kann. Damit die Leitschiene gut einheilt, muss sie im Vorfeld ausreichend mit körpereigenen Zellen besiedelt werden.
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Derartige Vorrichtungen werden in der Biologie und der Medizin zur Kultivierung von Zellen, bzw. Besiedlung von Konstrukten mit Körperzellen eingesetzt. In der Regel wird die Konzentration des Kulturmediums durch einen Medienzulauf und eine Medienablauf oder rezirkulierend in einem stationären Verhältnis gehalten. Dazu wird das Kulturmedium meist mittels Schlauchpumpe über Schläuche der Kammer zu- und abgeführt. So werden neben dem Gehäuse für die Kultivierungskammer und der Pumpe zusätzlich noch ein Vorratsbehälter und ein Auffangbehälter für das Kulturmedium benötigt.
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Die bekannten Systeme werden beispielsweise im Bereich des Tissue Engineering, also dem Züchten von Gewebe im Labor, eingesetzt. Das Tissue Engineering spielt in der Medizin generell, beispielsweise zur Erzeugung von Gefäß-, Haut- oder Organersatz, und insbesondere in der Unfall- und der wiederherstellenden Chirurgie für die Therapie von Knochendefekten eine große Rolle. So dient in letzterem Bespiel heute die „autogene Spongiosatransplantation” als Mittel der Wahl, während Knochenersatzmaterialien nur bei speziellen Indikationen eingesetzt werden. Großer Nachteil bei der Spongiosatransplantation ist der zusätzlich notwendige operative Eingriff für die Spongiosaentnahme aus dem Beckenknochen.
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Bekannte Systeme weisen einen aufwändigen technischen Aufbau auf, der eine Vielzahl einzelner Komponenten umfasst. Zentrales Stück ist dabei die Besiedelungskammer, die über einen Zulauf und einen Ablauf von dem Kultur- oder Nährmedium mit Körperzellen durchströmt wird. Durch derart komplexe Systeme ist die „in vitro” Besiedelung erheblich eingeschränkt. Insbesondere besteht eine relativ große Kontaminationsgefahr, die durch Leckagen in den Verbindungen begünstigt wird. Die bekannten Systeme sind innerhalb des OP nur bedingt zu gebrauchen, da sie unhandlich sind und von einem unter Stress stehenden OP-Team nur mit großem technischen Verständnis und einer gewissen Fingerfertigkeit bedient werden können. Ein weiterer Nachteil der Systeme ist, dass ein Gasaustausch in den für den Medientransport vorgesehenen Schläuchen zu Veränderung des pH-Wertes des Nährmediums führen kann. Zudem ist die Gefahr verhältnismäßig hoch, dass wegen der Adhäsion Zellen an den Schlauchwänden verbleiben und damit verloren sind. Ein weiterer Nachteil der bekannten Systeme ist das hohe Totraumvolumen.
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Weitere Zellbesiedelungssysteme sind in verschiedenen Patentschriften beschrieben. So offenenbart die Patentanmeldung
DE 102004054125 A1 eine Gradientenkammer zum Kultivieren und/oder Differenzieren von Zellen und Gewebe. Der Kammerinnenraum wird durch wenigstens zwei Kammerelemente gebildet. Die Gradientenkammer ist aus ihrer Normallage, in der der Träger in einer horizontalen oder nahezu horizontalen Ebene angeordnet ist, in eine Schwenklage zum Zwecke der Entlüftung auslenkbar. Diese Gradientenkammer muss wie oben beschrieben mit Hilfe von Schläuchen und einer externen Pumpe mit Kulturmedium versorgt werden und weist dementsprechend die bereits dargestellten Nachteile auf. Die Patentanmeldung
DE 102005007512 A1 offenbart eine Zellkultivierungseinrichtung. Diese weist eine Kammer auf, in der ein Zellwachstumssubstrat angeordnet ist. Die Kammer ist auf einer Plattform, welche durch ein Antriebssystem eine Schaukelbewegung ausführt. An den zwei Seiten der Kammer sind jeweils Zellwachstumssubstratmittel angeordnet. Die Flüssigkeit wird durch die Schaukelbewegung von einer Seite zur anderen Seite der Kammer bewegt. Dieses System ermöglicht aufgrund seiner Schwenkbewegung eine periodische statt einer kontinuierlichen Durchstömung der zu besiedelnden Leitschiene. Das Gebrauchsmuster
DE 8813314 U1 offenbart eine Vorrichtung zur Durchführung biologischer Experimente. Diese Vorrichtung ist ein zylindrischer Behälter, in dessen Inneren eine Reihe von einzelnen Räumen übereinander angeordnet ist. Dieser Aufbau ist zur Durchführung von Zellexperimenten geeignet. Die Besiedelung von Leitschienen ist nicht möglich, da keine Vorrichtung zur gerichtet Durchströmung der Leitschiene vorhanden ist. Die Patentanmeldung
DE 102004035107 A1 offenbart eine Vorrichtung zur Kultivierung von organischem Zellmaterial in einem Fluid. Die Strömung des Fluids innerhalb der Kultivierungskammer wird durch integrierte Fördereinrichtung erzeugt. Die integrierte Fördereinrichtung ist technisch allerdings sehr aufwändig, schwer zu realisieren und störanfällig.
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Die Patentanmeldung
US 2003/0203478 A1 offenbart eine Vorrichtung zur gravitationsabhängigen Durchströmung von Zellträgern durch Kulturmedium mit wechselnder Strömungsrichtung. Zellträger sind hier Hohlfasern, in denen die Zellen immobilisiert und vom Mediumfluss separiert sind. Eine Zellbesiedlung im Sinne der vorliegenden Anmeldung ist nicht vorgesehen.
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Die Patentanmeldung
DE 690 06 695 T2 offenbart ein Kultivierungssystem für Haftzellen beim dem ebenfalls eine Strömungsumkehr des das in einem Gitter gehaltenen Zellträgermaterial umfließenden Mediums beschrieben wird, hier allerdings mit Hilfe von Rührern und Pumpen.
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Die Patentanmeldung
DE 31 05 861 A1 offenbart ein Verfahren zur Massenkultivation von Zellen mit Lageumkehr, wobei die Drehung um 180° der Besiedelung verschiedener Behälterbereiche dient.
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Die Patentanmeldung
DE 100 58 240 A1 offenbart Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung biologischer Prothesen. Die Vorrichtung bietet die Möglichkeit einer Strömungs- bzw. Lageumkehr, wobei Gravitations- und Zentrifugalkraft kombiniert angewendet werden können. Der durch das Implantat fließende Medienstrom wird hier mit Hilfe einer Pumpe generiert.
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Die Patentanmeldung
EP 1 857 543 A1 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von dicht besiedeltem Gewebe. Es handelt sich um eine mehrteilige Apparatur in der ein Zellträger in ein Gitter eingefasst ist. Hier wird der den Zellträger durchströmende Fluidstrom durch eine externe Pumpe erzeugt, die das Fluid aus einen externen Vorratsbehälter bezieht. Der komplette Aufbau ist in einer temperierbaren Kammer untergebracht. Der Aufbau ist für längere Besiedelungszeiten ausgelegt und nicht für einen intraoperativen Einsatz.
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Die Patentanmeldung
EP 1 359 214 A1 offenbart einen Bioreaktor zur Besiedelung von dreidimensionalen Strukturen mit Zellen. Der Bioreaktor besteht im Wesentlichen aus einen starren äußerem Gehäuse welches eine innere sterile Kammer umgibt. Die innere Kammer ist entnehmbar, zu diesem Zweck besitzt das äußere Gehäuse einen Deckel. Die innere, sterile Kammer ist ebenfalls mit einem Deckel, der der Entnahme der besiedelten Strukturen dient, versehen. Der Fluidaustausch im Inneren der Kammer wird durch einen entsprechenden Zu- und Ablauf gewährleistet. Der Fluidstrom wird hier durch eine Pumpe erzeugt welche das Fluid aus einem Vorratsbehälter bezieht.
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Die Patentanmeldung
US 2003/0104610 A1 offenbart Verfahren und Vorrichtung eines Analysesystems welches in-vivo Bedingungen nachbilden soll und für hohe Durchsätze ausgelegt ist. Das äußere Gehäuse kann hierbei zweiteilig ausgeführt sein.
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Vorrichtungen mit sämtlichen Merkmalen der anmeldungsgemäßen Vorrichtung sind aus dem Stand der Technik nicht bekannt. Insbesondere zur intraoperativen Anwendung, d. h. zur Entnahme von patienteneigene Zellen und zur Besiedelung der Zellen auf einem Zellträger während eines chirurgischen Eingriffs im operativen Umfeld, sind die bislang eingesetzten Besiedelungsverfahren wegen ihres aufwändigen Aufbaus bzw. fehlender Funktionalität kaum geeignet.
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Aufgabe der Erfindung ist es eine Kammer zu schaffen, die einfach aufgebaut und somit kostengünstig zu fertigen ist und die bei Minimierung der Kontaminationsgefahr eine bequeme Handhabung sowohl im Labor als auch innerhalb des OP gewährleistet.
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Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und ein Verfahren gemäß Anspruch 22 gelöst. Besonders vorteilhafte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen genannt.
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Der erfindungswesentliche Grundgedanke liegt darin, eine miniaturisierte und autonome Besiedelungskammer zu schaffen. Die gewünschte Miniaturisierung wird dadurch ermöglicht, dass die Komponenten des Systems zu einem Bauteil vereint, insbesondere innerhalb eines einzigen kleinen Gehäuses zusammengefasst werden.
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Dabei wird die Förderung des Kulturmediums mit den Körperzellen nicht mehr durch ein externes Gerät realisiert. Die Förderung des Mediums erfolgt über die Schwerkraft ohne zusätzliche Pumpen etc. Wesentliches Merkmal ist die Integration von zwei Vorratsbehältern für das Kultivierungsmedium in die Zellbesiedelungskammer. Jeder dieser Vorratsbehälter besitzt eine Öffnung, durch die das Medium über eine definiere Kapillare auf die zwischen den Vorratsbehältern angeordnete, zu besiedelnde Leitschiene fließen bzw. tropfen kann. Die Kapillare bestimmt maßgeblich die Strömung des Kulturmediums mit Zellen. Entscheidend ist eine geeignete Dimensionierung der Länge der Kapillare, des Durchmessers der Kapillare und des Vorratsbehälter, um einen definierten Medienfluss zu erhalten. Damit das Medium die Leitschiene gleichmäßig durchfließen kann, wird diese in einer bevorzugten Ausführung mit einem feinen Gitternetz eingefasst, das die ankommende Flüssigkeitsmenge durch Kapillareffekte gleichmäßig an die Leitschiene weitergibt. Nach dem Durchfließen der Leitschiene wird das Medium vom unteren Vorratsbehälter aufgefangen. Der zweite Vorratsbehälter ist symmetrisch zum ersten angeordnet. Ist das Kulturmedium mit Zellen fast vollständig aus dem ersten Vorratsbehälter über die zu besiedelnde Leitschiene in den zweite Vorratsbehälter gelaufen, so wird die Zellbesiedelungskammer ähnlich einer Sanduhr um 180° gedreht und der Besiedelungsprozess startet mit gegengesetzter Flussrichtung von neuem. Durch die dadruch erreichte beidseitige Anströmung der Leitschiene wird eine gleichmäßigere Besiedelung mit Zellen erreicht. Die Einfüllung des Mediums mit den Zellen kann über einen Zugang erfolgen, welcher dann steril verschlossen wird. Die Lösung der Aufgabe liegt somit in der Entwicklung eines integrierten Systems zur Besiedelung von Leitschienen, insbesondere synthetischen Knochenersatzmaterialien mit Körperzellen.
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Ein wesentlicher Vorteil ist, dass bei dem erfindungsgemäßen System keine Schläuche mehr außerhalb der Kammer nötig sind. Damit ist die Leckage-Gefahr reduziert und das Risiko der Kontamination minimiert. Das System funktioniert ohne zusätzliche Pumpmechanismen und ist Energieautark da der Medienfluss schwerkraftbedingt induziert wird. Durch den kompakten, abgeschlossenen Aufbau ist es möglich, das System sterilisierbar auszuführen, eventuell mit bereits enthaltener Leitschiene und/oder Nährlösung. Diese Eigenschaften wirken sich vorteilhaft hinsichtlich einer Zulassung als Medizinprodukt aus. Des Weiteren ist der einfache Aufbau vorteilhaft hinsichtlich einer einfachen Bedienung und dem Ausschluss von Fehlbedienungen und Fehlfunktionen. Durch die integrierten Vorratskammern mit Kulturmedium, in die das Zellmaterial wie z. B. Blut mit körpereigenen Zellen oder Knochenmark des Patienten durch einen verschließbaren Zugang in das System eingebracht wird, wird eine intraoperative Zellbesiedelung von Leitschienen möglich. Durch die kontinuierliche Strömung wird eine dynamische Besiedlung der Leitschiene erreicht, was die Zelladhäsion auf dem Implantat verbessert und so eine bessere Einheilung des Implantats zu Folge hat.
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Besonders einfach und kostengünstig lässt sich die Erfindung umsetzen, wenn das Gehäuse aus zwei aus insbesondere transparentem Kunststoff gefertigten Hälften besteht. In jede Hälfte ist ein Vorratsbehälter integriert. Eine Gehäusehälfte ist für die Aufnahme des Trägers für die Leitschiene ausgeführt. Die Gehäusehälften sind miteinander, beispielsweise durch ein Gewinde, verbindbar und durch Deckel verschließbar. Der zweiteilige Träger für die Leitschiene wird von einer Gehäusehälfte getragen und beim Verbinden der beiden Hälften durch die andere fixiert. Solche Basisteile können im Spritzgussverfahren massenhaft hergestellt werden.
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In einer bevorzugten Ausführung werden die beiden zylinderförmigen Gehäusehälften aus transparentem Kunststoff durch Deckel verschlossen, diese können ebenfalls aus Kunststoff bestehen, wobei in einen der Deckel die steril verschließbare Öffnung zum Einbringen der Körperzellen integriert ist. In einer bevorzugten Ausführung ist die Öffnung zum Einbringen der Körperzellen als eine mit Spritzennadeln durchstechbare, wieder selbst schließende Membran ausgeführt. Die Dichtwirkung zwischen Gehäuse und Deckel wird durch geeignete Materialpaarungen oder eine zusätzliche Ringdichtung erreicht. Die Kapillaren sind als Kanülen aus Edelstahl oder Kunststoff realisiert, welche mittels biokompatibler Klebung an die integrierten Vorratsbehälter angebracht sind. In einer bevorzugten Ausführung ist der Durchmesser der Vorratsbehälter groß im Verhältnis zu deren Höhe, damit die Flüssigkeitssäule über der Kapillare und damit der statische Druck möglichst wenig variiert. Die Vorratsbehälter weisen in einer bevorzugten Ausführung schlitzartige Rücklauföffnungen auf, die den Rückfluss des Kulturmediums ermöglichen. Durch die gezielte Wahl des Durchmessers der Kanüle wird die Strömungsgeschwindigkeit des Kulturmediums mit Zellen eingestellt. Dabei sollte die Länge der Kanülen möglichst groß gegenüber dem Flüssigkeitsstand im Vorratsbehälter sein, so dass eine möglichst konstante Durchflussgeschwindigkeit des Kulturmediums mit Zellen durch die zu besiedelnde Leitschiene erreicht wird. Die Leitschiene ist in der bevorzugten Ausführung ein synthetisches Knochenersatzmaterial. Die Leitschiene wird im Träger zwischen zwei Gittern aus Edelstahl oder Kunststoff fixiert, welche eine gleichmäßige Verteilung der Flüssigkeit auf dem Knochenersatzmaterial gewährleisten. Die Maschenweite innerhalb des Gitters kann variieren, um eine gezielte Verteilung des Kulturmediums mit Zellen zu erreichen. Der Abstand zwischen Kanülenende und Gitter wird in einer bevorzugten Ausführung so eingestellt, dass sich der Tropfen nur teilweise ausbildet bevor er das Gitter berührt und von diesem durch Kapillareffekte an die Leitschiene weitergeleitet wird. Es kann in einer Ausführungsform besonders vorteilhaft sein eine hydrophobe Beschichtung der Innenwände vorzusehen. Diese kann ein Anhaften der Zellen und des Kulturmediums verhindern.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand 1 näher beschrieben, welche einen Schnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zeigt. Die Erfindung bezieht sich auf eine neuartige Kammer (1) zur Besiedelung von Leitschienen (6) mit Zellen. Wesentliches Merkmal dieser Kammer ist die Integration von zwei Vorratsbehältern (2) für das Kultivierungsmedium in der Zellbesiedelungskammer. Der Durchmesser der Vorratsbehälter sollte im Verhältnis zu Höhe möglichst groß ausfallen, damit sich der Flüssigkeitspegel und somit der statische Druck möglichst wenig verändern. Jeder dieser Vorratsbehälter besitzt eine Öffnung (3), durch die das Medium über eine Kapillare auf die zu besiedelnde Leitschiene fließen bzw. tropfen kann. Diese Strecke sollte im Verhältnis zum Füllstand in dem Vorratsbehälter möglichst groß sein. So kann der Einfluss, des veränderlichen Flüssigkeitsstands in dem Vorratsbehälter, auf die Fließgeschwindigkeit reduziert werden. Damit das Medium die Leitschiene gleichmäßig durchfließen kann, wird diese bevorzugt mit einem feinen Gitternetz (5) eingefasst, dass die ankommende Flüssigkeitsmenge durch Kapillareffekte gleichmäßig an die Leitschiene weitergibt. Bei Vorversuchen hat sich herausgestellt, dass es von Vorteil ist den Abstand zwischen dem Ende der Kanüle und dem Gitternetz so einzustellen, dass sich der Tropfen nur teilweise ausbilden kann. Bevor sich der Tropfen vollständig ausgebildet hat, berührt er das Gitternetz und die Flüssigkeit wird durch Kapillareffekte weitergeleitet. Nach dem Durchfließen der Leitschiene wird das Medium von dem zweiten Vorratsbehälter aufgefangen. Der zweite Vorratsbehälter ist symmetrisch zum ersten angeordnet, wobei sich die zu besiedelnde Leitschiene mittig zwischen beiden Vorratsbehältern befindet. Damit ergibt sich ein Aufbau ähnlich einer Sanduhr. Damit der zweite Vorratsbehälter das Medium aufnehmen kann, sind geeignete Rücklauföffnungen (4) vorzusehen. Ist das Kulturmedium fast vollständig von dem ersten Vorratsbehälter über die zu besiedelnde Leitschiene in die zweite Kammer gelaufen, so wird die Zellbesiedelungskammer ähnlich einer Sanduhr um 180° gedreht und der Besiedelungsprozess startet mit gegengesetzter Flussrichtung von neuem. Die Einfüllung des Mediums mit den Zellen erfolgt über einen Zugang (7), welcher dann steril verschlossen wird. Um eine definierte Flussgeschwindigkeit des Mediums durch die zu besiedelnde Leitschiene zu erreichen, müssen geeignete Entlüftungskanäle im System vorhanden sein. Das System kann als Kompaktsystem steril verpackt und direkt einsetzbar verkauft werden.
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In einem Ausführungsbeispiel kann die Einweg-Zellbesiedelungskammer aus zwei Gehäusehälften (1) aus Plexiglas bestehen, welche durch ein M45 Gewinde miteinander verschraubbar sind. in jede Gehäusehälfte ist ein Vorratsbehälter (2) mit dem Innendurchmesser 30 mm integriert, gekennzeichnet durch schlitzartige Rücklauföffnungen (4). Der Medienfluss durch das Konstrukt wird über Edelstahlkanülen (3) mit einem Innendurchmesser von 0,86 mm und einer Länge von 30 mm gesteuert. Das zu besiedelnde Konstrukt (6) wird in einem zweiteiligen Träger (5) welcher ebenfalls aus Plexiglas besteht zwischen zwei Edelstahlgittern mit der Maschenweite 20 μm fixiert. Der Träger für die Leitschiene wird von einer Gehäusehälfte getragen und durch das Zusammenschrauben beider Gehäusehälften durch einen entsprechenden Absatz an der nicht tragenden Gehäusehälfte fixiert. Eine der zylinderförmigen Gehäusehälften ist mit einer durchstechbaren Membran (7) für die Einbringung der dem Patienten entnommenen Körperzellen ausgestattet.
