WO2017051650A1 - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents

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WO2017051650A1
WO2017051650A1 PCT/JP2016/074701 JP2016074701W WO2017051650A1 WO 2017051650 A1 WO2017051650 A1 WO 2017051650A1 JP 2016074701 W JP2016074701 W JP 2016074701W WO 2017051650 A1 WO2017051650 A1 WO 2017051650A1
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metal porous
porous membrane
cell culture
cell
cells
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PCT/JP2016/074701
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近藤　孝志
萬壽　優
順子 渡邉
長谷川　慎
恵実 北西
Original Assignee
株式会社村田製作所
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Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method and a cell culture apparatus for culturing cells using a medium.
  • a cell culturing method using a porous resin membrane is disclosed (for example, see Patent Document 1).
  • both the upper layer portion and the lower layer portion are filled with the medium with the porous membrane as a boundary, and the medium is always supplied from the lower layer to the cells through the porous film while the cells are cultured.
  • the medium is always supplied from the lower layer to the cells through the porous film while the cells are cultured.
  • An object of the present invention is to provide a cell culture method and a cell culture apparatus that can reduce the loss of a medium.
  • the cell culture method of one embodiment of the present invention includes: Disposing a metal porous membrane having a plurality of through-holes inside a bottomed culture vessel, Supplying a medium to the inside of the culture vessel; Supplying cells into the culture vessel, and culturing the cells using the medium, including.
  • the cell culture device of one embodiment of the present invention includes: A cell culture device for culturing cells using a medium, A bottomed culture vessel containing the medium and the cells; A metal porous membrane having a plurality of through-holes disposed inside the culture vessel; Is provided.
  • the present invention it is possible to provide a cell culturing method and a cell culturing apparatus capable of reducing a medium loss.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a cell culture device according to a first embodiment of the present invention.
  • the enlarged view of a part of metal porous film in Embodiment 1 which concerns on this invention Schematic view of a part of the metal porous membrane shown in FIG. 2 as viewed from the first main surface side Sectional drawing which cut
  • the flowchart which shows the cell culture method of Embodiment 1 which concerns on this invention.
  • the figure which shows the modification of the metal porous membrane in Embodiment 1 which concerns on this invention The figure which shows the cell growth rate when a cell is cultured using the cell culture apparatus of Embodiment 1 which concerns on this invention.
  • FIG. 1 Schematic configuration diagram of a cell culture device according to Embodiment 2 of the present invention Schematic of a part of a metal porous membrane in embodiment 2 according to the present invention The figure which shows the experimental result regarding the cell survival days in Example 3 and Comparative Example 1 using the cell culture apparatus of Embodiment 2 which concerns on this invention.
  • Schematic configuration diagram of a cell culture device of Embodiment 3 according to the present invention Schematic configuration diagram of a cell culture device according to Embodiment 4 of the present invention.
  • Schematic configuration diagram showing a modification of the cell culture device of Embodiment 4 according to the present invention Schematic configuration diagram of a cell culture device according to a fifth embodiment of the present invention
  • Schematic configuration diagram of a cell culture device according to a seventh embodiment of the present invention Schematic configuration diagram of a cell culture device according to an eighth embodiment of the present invention.
  • the cell culture method of one embodiment of the present invention includes: Disposing a metal porous membrane having a plurality of through-holes inside a bottomed culture vessel, Supplying a medium to the inside of the culture vessel; Supplying cells into the culture vessel, and culturing the cells using the medium, May be included.
  • Such a configuration can reduce the loss of the medium due to water absorption of the porous membrane itself.
  • the step of culturing the cells includes the step of culturing the medium through the through-hole that communicates through a wall surface in which the opening on the first main surface side and the opening on the second main surface side of the metal porous membrane are continuous. You may include the process of supplying to the said cell.
  • Such a configuration facilitates the supply of the medium through the through-hole, and allows the medium to be circulated efficiently in the culture vessel. In addition, since the cells easily pass through the through holes, the movement of the cells can be easily determined.
  • a gap may be provided between the metal porous membrane and the bottom of the culture vessel to arrange the metal porous membrane.
  • the medium in the culture vessel can be efficiently circulated through the through hole.
  • the movement of the cell can be easily determined.
  • the gap in the step of arranging the metal porous membrane, the gap may be provided by providing a spacer between the metal porous membrane and the bottom of the culture vessel.
  • the metal porous film can be firmly fixed by the spacer, and a void can be reliably provided.
  • the medium in the culture vessel can be efficiently circulated through the through hole.
  • it is possible to easily determine the movement of the cell by determining that the cell has moved to the void through the through hole.
  • the metal porous membrane includes a magnetic substance
  • the metal porous membrane may be arranged inside the culture vessel by a magnetic force.
  • the metal porous film can be firmly fixed by magnetic force. Moreover, since it is not necessary to provide a fixing mechanism in the culture vessel, cells can be cultured efficiently.
  • the surface of the metal porous membrane may be coated with gold.
  • Such a configuration improves the wettability of the surface of the metal porous membrane, thereby improving the affinity of the cells. For this reason, the survival days of the cell in culture can be lengthened.
  • the cell culture device of one embodiment of the present invention includes: A cell culture device for culturing cells using a medium, A bottomed culture vessel containing the medium and the cells; A metal porous membrane having a plurality of through-holes disposed inside the culture vessel; May be provided.
  • Such a configuration can reduce the loss of the medium due to water absorption of the porous membrane itself.
  • the through-hole of the metal porous membrane may be communicated through a wall surface in which the opening on the first main surface side and the opening on the second main surface side of the metal porous membrane are continuous.
  • Such a configuration facilitates the supply of the medium through the through-hole, and allows the medium to be circulated efficiently in the culture vessel. Since the cells easily pass through the through holes, the movement of the cells can be easily discriminated. Moreover, the culture medium hold
  • the metal porous membrane may have a thickness of 50 nm to 100 ⁇ m.
  • Such a configuration can further reduce the medium retained in the metal porous membrane. It becomes easier to supply the medium through the through hole, and the medium can be circulated more efficiently in the culture vessel. Cell migration can be more easily determined.
  • the porosity of the metal porous membrane per unit volume may be 10% or more and 90% or less.
  • Such a configuration can further reduce the medium retained in the metal porous membrane.
  • a spacer may be provided between the culture vessel and the metal porous membrane.
  • a gap can be provided between the metal porous membrane and the culture vessel.
  • the culture medium in a culture container can be efficiently circulated through a through-hole.
  • it is possible to easily determine the movement of the cell by determining that the cell has moved to the void through the through hole.
  • the metal porous membrane may have the spacer on the second main surface facing the bottom of the culture vessel.
  • the number of parts can be reduced and the metal porous membrane and the spacer can be firmly fixed.
  • the culture vessel may have a spacer at the bottom facing the second main surface of the metal porous membrane.
  • Such a configuration can reduce the number of parts and firmly fix the culture vessel and the spacer.
  • the metal porous film may contain a magnetic material.
  • the metal porous membrane can be firmly fixed by magnetic force. Moreover, since it is not necessary to provide a fixing mechanism in the culture vessel, cells can be cultured efficiently.
  • the surface of the metal porous membrane may be coated with gold.
  • Such a configuration improves the wettability of the surface of the metal porous membrane, thereby improving the affinity of the cells. For this reason, the survival days of the cell in culture can be lengthened.
  • the aperture ratio of the through hole in at least one of the first main surface and the second main surface of the metal porous membrane may be 10% or more.
  • FIG. 1 shows a schematic configuration diagram of a cell culture device 100A according to Embodiment 1 of the present invention.
  • the cell culture device 100A includes a bottomed culture vessel 10, a metal porous membrane 20 having a plurality of through holes 21 arranged in the culture vessel 10, and a bottom portion of the culture vessel 10. And a spacer 30 provided between the metal porous film 20.
  • the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 in the culture vessel 10 are filled with the medium 40, and are accommodated on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20.
  • Cells 50 are cultured.
  • “cultivate” means an operation in which cells are immersed in a medium and allowed to proliferate while the cells are alive by cell division, and / or cells are immersed in a medium, and then the cells are cultured in the medium. It means the operation of recovering the secreted product extracted.
  • the culture medium 40 is a fluid that provides a growth environment to the cells 50 to be cultured.
  • the medium 40 may be a liquid medium.
  • the medium 40 include DMEM (Dulbecco modified Eagle medium), EMEM (Eagle minimum essential medium), RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Laboratory medium), Ham's F -12 medium, IMDM (Iskov modified Dulbecco medium), Grace insect medium, YPD medium (yeast extract dextrose medium), broth medium, LB medium (Luria medium) and the like.
  • the cells 50 are, for example, eggs, sperm, induced pluripotent stem cells (iPS cells), ES cells, feeder cells, stem cells, mesenchymal stem cells, mononuclear cells, single cells, cell clusters, Suspension cells, adhesive cells, neurons, leukocytes, lymphocytes, cells for regenerative medicine, autologous cells, cancer cells, circulating cancer cells (CTC), HL-60, HeLa, CHO, HEK293, MDCK, NIH3T3, PC12, Sf9, Vero, fungi, yeast, bacteria and the like.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • ES cells feeder cells
  • stem cells mesenchymal stem cells
  • mononuclear cells single cells
  • cell clusters single cells
  • Suspension cells adhesive cells
  • neurons neurotrophic factor
  • leukocytes lymphocytes
  • cells for regenerative medicine autologous cells
  • cancer cells circulating cancer cells (CTC)
  • CTC circulating cancer cells
  • the culture container 10 is a bottomed container to which the culture medium 40 and the cells 50 are supplied.
  • the culture container 10 is a cylindrical container having an open top surface.
  • the culture container 10 has an inner diameter of 33 mm and is made of polystyrene, for example.
  • the metal porous membrane 20 is a metal thin film disposed in the culture vessel 10.
  • the metal porous film 20 is a circular metal mesh, and has a first main surface PS1 and a second main surface PS2 facing each other, and a plurality of through-holes 21 penetrating both main surfaces. It is a structure which has.
  • the first main surface PS1 is the main surface of the metal porous membrane 20 located on the opening side of the culture vessel 10.
  • the second main surface PS2 is a main surface of the metal porous membrane 20 located on the bottom side of the culture vessel 10.
  • the metal porous film 20 is made of nickel, for example.
  • the metal porous film 20 has dimensions of, for example, a diameter of 33 mm and a thickness of 0.85 ⁇ m. Moreover, the aperture ratio in the 1st main surface PS1 and 2nd main surface PS2 of the metal porous membrane 20 is 53%, for example.
  • the metal porous membrane 20 is divided into a space on the first main surface PS1 side and a space on the second main surface PS2 side so that the culture medium 40 can move only through the through hole 21. It has become. By sorting in this way, the cell can be moved only through the through hole 21, and the size of the movable cell can be defined by the size of the through hole 21.
  • the size of the through-hole 21 is smaller than the size of the cell, unnecessary organic substances (including dead cells and part of dead cells) that are incidentally generated by the culture are removed from the second main surface PS2. It is possible to keep the medium around the cells constantly in high quality by eliminating the space in the side.
  • FIG. 2 is an enlarged schematic view of a part of the metal porous membrane 20.
  • the X, Y, and Z directions in FIG. 2 indicate the vertical direction, the horizontal direction, and the thickness direction of the metal porous film 20, respectively.
  • FIG. 3 is a schematic view of a part of the metal porous membrane 20 of FIG. 2 as viewed from the first main surface PS1 side.
  • the metal porous film 20 is a plate-like structure (lattice-like structure) in which a plurality of through holes 21 are arranged in a matrix at regular intervals.
  • the plurality of through holes 21 have a square shape when viewed from the first main surface PS1 side of the metal porous film 20, that is, when viewed in the Z direction.
  • the plurality of through holes 21 are periodically arranged on the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous film 20.
  • the plurality of through holes 21 are provided at equal intervals in two arrangement directions parallel to each side of the square, that is, in the X direction and the Y direction in FIG. As shown in FIG. 3, in the first embodiment, for example, one side d of the through hole 21 is 1.9 ⁇ m, and the lattice interval b is 2.6 ⁇ m.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of a part of the metal porous membrane 20 shown in FIG. 3 cut along line AA.
  • the through-hole 21 of the metal porous film 20 communicates through a wall surface in which the opening on the first main surface PS1 side and the opening on the second main surface PS2 side are continuous.
  • the through hole 21 is provided so that the opening on the first main surface PS1 side can be projected onto the opening on the second main surface PS2 side. That is, when the metal porous film 20 is viewed from the first main surface PS1 side, the through hole 21 is provided so that the opening on the first main surface PS1 side overlaps the opening on the second main surface PS2 side.
  • the through hole 21 is provided so that the inner wall thereof is perpendicular to the first main surface PS1 and the second main surface PS2.
  • the shape and size of the through-hole 21 are appropriately designed according to the size and shape of the cell 50 to be cultured.
  • a plurality of through holes 21 having a predetermined size can be provided at predetermined intervals.
  • the through-hole 21 has, for example, a square shape with a length of 0.05 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less and a width of 0.05 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less as viewed from the first main surface PS1 side of the metal porous film 20, that is, viewed from the Z direction. May be designed.
  • the interval between the through holes 21 is, for example, greater than 1 time and less than or equal to 10 times that of the through holes 21, and more preferably less than or equal to 3 times that of the through holes 21.
  • the aperture ratio is preferably 10% or more.
  • the minimum value of the through hole is preferably 0.5 times or more and the maximum value of the through hole is preferably 1.5 times or less with respect to the average value of the size of the through holes.
  • the opening ratio of the through holes 21 in at least one of the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous film 20 is preferably 10% or more.
  • An opening ratio means the ratio for which the opening of a through-hole accounts with respect to the surface area of the 1st main surface of a metal porous film.
  • the through hole 21 is not limited to a square, and may be, for example, a rectangle, a circle, or an ellipse.
  • the arrangement of the holes is not limited to the square lattice arrangement, and for example, as long as it is a square arrangement, a rectangular arrangement in which the intervals in the two arrangement directions are not equal may be used, or a triangular lattice arrangement or a quasi-periodic arrangement may be used.
  • the thickness of the metal porous film 20 is preferably 50 nm or more and 100 ⁇ m or less.
  • the porosity of the metal porous membrane 20 per unit volume is preferably 10% or more and 90% or less.
  • the porosity per unit volume means the ratio occupied by the internal space of the through hole 21 per unit volume.
  • the spacer 30 is a support provided between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20.
  • the spacer 30 lifts and supports the metal porous membrane 20 from the bottom of the culture vessel 10 to the opening side, thereby providing a gap between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20.
  • the spacer 30 is a support body having a regular quadrangular prism shape.
  • the height of the spacer 30 is 1 mm
  • one side of the bottom surface of the spacer 30 is 1 mm.
  • a plurality of spacers 30 are provided between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20.
  • the plurality of spacers 30 are provided at intervals of 5 mm.
  • the culture medium 40 can move between the plurality of spacers 30.
  • FIG. 5 shows a flowchart of the cell culture method according to Embodiment 1.
  • step ST ⁇ b> 11 the culture vessel 10 for supplying the culture medium 40 and the cells 50 and the metal porous membrane 20 are prepared (preparation process).
  • step ST12 the metal porous membrane 20 is placed inside the culture vessel 10 (metal porous membrane placement step). Specifically, the metal porous membrane 20 is introduced along the inner wall of the culture vessel 10, and the metal porous membrane 20 is fixed on the spacer 30 provided at the bottom of the culture vessel 10. Thereby, a space is provided between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20.
  • gap should just be a magnitude
  • Circulation means that the culture medium 40 moves from the second main surface PS2 side to the first main surface PS1 side through a certain through hole 21, while the second main surface PS1 side from the first main surface PS1 side through another through hole 21. It means natural convection in which the culture medium 40 moves to the surface PS2 side. Or the space
  • the culture medium 40 is supplied into the culture vessel 10 (medium supply process). Specifically, the culture medium 40 is supplied into the culture vessel 10 to form a state in which both main surfaces of the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 are filled with the medium 40. . In such a state, the culture medium 40 in the culture vessel 10 circulates so that the culture medium 40 is supplied from the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 to the first main surface PS1 through the through hole 21. Become.
  • step ST14 the cells 50 are supplied into the culture vessel 10 (cell supply step). Specifically, the cells 50 are supplied onto the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20 disposed inside the culture vessel 10. The cells 50 supplied on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20 are accommodated on the first main surface PS1. The medium 40 is supplied to the cells 50 on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20 through the through holes 21.
  • step ST15 the cells 50 accommodated in the culture vessel 10 are cultured (cell culture process). Specifically, the culture medium 40 is supplied to the cells 50 accommodated on the first main surface PS1 through the through holes 21 of the metal porous membrane 20. At the same time, the medium 40 on the first main surface PS1 is supplied to the cells 50. Since the culture medium 40 circulates in the culture vessel 10, the state where the culture medium 40 is continuously supplied to the cells 50 is maintained.
  • the cells 50 can be recovered by pulling up the metal porous membrane 20 using tweezers (cell recovery step).
  • the cell culture device 100A includes a metal porous membrane 20 having a plurality of through holes 21. Since the metal porous membrane 20 has a lower water absorption than the resin porous membrane, the amount of the medium 40 absorbed by the membrane itself can be reduced. Thus, in the cell culture device 100A, the loss of the culture medium 40 due to water absorption of the membrane itself can be reduced by using the metal porous membrane 20.
  • the metal porous membrane 20 has a higher rigidity than the resin porous membrane, and therefore, the bending can be reduced. That is, the metal porous film 20 can reduce the deformation of the through hole 21 as compared with the resin porous film. For example, when the metallic porous film 20 is pulled up from the culture medium 40, the deformation of the through hole 21 due to the bending of the metallic porous film 20 is small, so that the culture medium 40 hardly remains in the through hole 21. Thus, in the cell culture device 100A, after the metal porous membrane 20 is pulled up from the medium 40, the remaining medium 40 (residual liquid) in the metal porous membrane 20 can be reduced.
  • the metal porous membrane 20 has a small deflection, the stress applied to the cells 50 due to the deflection can be reduced.
  • the metal porous film 20 can be made thinner than the resin porous film. Thereby, in the cell culture device 100A, when the cell 50 is cultured, the amount of the medium 40 used for filling the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 with the medium 40 is reduced. This can be reduced as compared with a cell culture device using a resin porous membrane.
  • the cost for cell culture can be reduced by reducing the amount of the medium 40 used for culturing the cells 50.
  • the metal porous film 20 can increase the aperture ratio of the through hole 21 in at least one of the first main surface PS1 and the second main surface PS2 as compared with the resin porous film. Thereby, the supply of the culture medium 40 through the through-hole 21 of the metal porous membrane 20 can be made highly efficient.
  • the through hole 21 of the metal porous membrane 20 communicates with the first main surface PS1 side through the wall surface where the second main surface PS2 side opening is continuous.
  • the size of the through hole 21 of the metal porous membrane 20 is designed to be larger than the size of the cell 50, when the cell 50 moves on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20. Then, it moves through the through hole 21 to the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 or to the bottom of the culture vessel 10. Thereby, in cell culture device 100A, movement of cell 50 can be discriminated easily.
  • the metal porous membrane 20 has a higher thermal conductivity than the resin porous membrane. For this reason, the temperature of the culture medium 40 and the metal porous film 20 can be balanced in a short time.
  • a space 30 is provided between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20 by providing the spacer 30 between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20.
  • This void facilitates circulation of the culture medium 40 through the culture vessel 10.
  • the supply of the culture medium 40 through the through hole 21 of the metal porous membrane 20 can be made highly efficient by the gap.
  • the cell culture device 100A a state in which both main surfaces of the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 are filled with the culture medium 40 in the culture vessel 10 is formed. Thereby, the culture medium 40 is supplied to the cell 50 on the 1st main surface PS1 through the through-hole 21 toward the 1st main surface PS1 from 2nd main surface PS2. With such a configuration, the cell culture apparatus 100A can efficiently supply the medium 40 to the cells 50 and culture the cells 50 with high efficiency.
  • the metal porous membrane 20 is made of metal, gamma ray sterilization by gamma irradiation, autoclave sterilization with high-temperature and high-pressure saturated steam, ethylene oxide gas sterilization using ethylene oxide gas, or ozone. Even if oxidative sterilization is applied, it is not damaged. Therefore, the used metal porous membrane 20 can be reused by washing and sterilizing.
  • the culture vessel 10 may have any shape as long as the metal porous membrane 20 is disposed inside and the medium 40 and the cells 50 can be supplied.
  • the culture container 10 may be, for example, a bottomed polygonal container having an upper surface opened.
  • the through-hole 21 of the metal porous film 20 is provided in the direction perpendicular to the first main surface PS1 and the second main surface PS2
  • the present invention is not limited to this.
  • the through-hole 21 is provided so that at least a part of the opening on the first main surface PS1 side can be projected onto the opening of the second main surface PS2 when viewed from the thickness direction of the metal porous film 20.
  • FIG. 6 shows a modified metal porous membrane 20a.
  • the through-hole 21a may be provided with the inner wall inclined.
  • the through hole 21a may be provided with an angle ⁇ 1 inclined in the Y direction with respect to the Z direction.
  • the angle ⁇ 1 may be an angle that allows at least a part of the opening on the first main surface PS1 side to be projected onto the opening of the second main surface PS2.
  • Embodiment 1 the example in which the outer peripheral portion of the metal porous membrane 20 is disposed along the inner wall of the culture vessel 10 has been described, but the present invention is not limited to this.
  • a gap may be provided between the outer peripheral portion of the metal porous membrane 20 and the inner wall of the culture vessel 10. By providing this void, the culture medium 40 can be circulated more easily.
  • the spacer 30 has been described as a support having a regular quadrangular prism shape, but is not limited thereto.
  • the spacer 30 may have any shape that can support the metal porous film 20.
  • the spacer 30 may be, for example, a cylindrical shape or a polygonal column shape.
  • the spacer 30 should just be provided in the position which can support the metal porous membrane 20, and an installation position and number are not limited.
  • Embodiment 1 although the structure provided with the spacer 30 was demonstrated, it is not limited to this.
  • the spacer 30 is not an essential configuration, and the cell culture device 100A may be configured without the spacer 30.
  • the step of supplying the culture medium 40 into the culture vessel 10 (medium supply step) ST13 and the step of supplying the cells 50 into the culture vessel 10 (cell supply step) ST14 are performed separately.
  • the present invention is not limited to this.
  • the medium supply step ST13 and the cell supply step ST14 may be performed simultaneously.
  • step ST12 which arrange
  • step ST12 of disposing the metal porous membrane 20 in the culture vessel 10 may be performed. In this case, it may be determined that the cell 50 has moved from the second main surface PS2 of the metal porous film 20 to the first main surface PS1 through the through hole 21.
  • the cell culture device 100A describes the cell 50 as an object to be cultured, but the object to be cultured is not limited to cells.
  • the object to be cultured in the cell culture device 100A may include bacteria (eubacteria) or viruses.
  • bacteria (eubacteria) include gram positive bacteria, gram negative bacteria, Escherichia coli, and tuberculosis bacteria.
  • the virus include DNA virus, RNA virus, rotavirus, (bird) influenza virus, yellow fever virus, dengue fever virus, encephalitis virus, hemorrhagic fever virus, and immunodeficiency virus.
  • Example 1 in which cells 50 are cultured using cell culture device 100A of the first embodiment will be described.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS Fetel Bovine Serum
  • Example 1 first, the culture medium 40 was put into the culture vessel 10 of the cell culture device 100A, and both the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 were filled with the culture medium 40. A state was formed. Next, cells 50 (HeLa cells) were seeded on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20. After culturing for 3 days in an environment with a temperature of 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%, the metal porous membrane 20 was taken out of the culture medium 40 using magnetic tweezers.
  • HeLa cells HeLa cells
  • the metal porous membrane 20 was taken out from the culture medium 40, the metal porous membrane 20 was not bent.
  • the culture medium 40 existing on the first main surface PS1 flowed down from the peripheral edge of the metal porous membrane 20 into the culture vessel 10.
  • Example 2 Example 2 in which cells 50 are cultured using cell culture device 100A of the first embodiment will be described.
  • the medium 40 RPMI1640 (Roswell Park Memorial Laboratory Medium) mixed with 10% FB (fetal bovine serum), 100 units / ml penicillin and 10 ⁇ g / ml streptomycin was used.
  • FB fetal bovine serum
  • the cell 50 HL60 cell was used.
  • Example 2 first, the culture medium 40 was put into the culture vessel 10 of the cell culture device 100A, and both the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20 were filled with the culture medium 40. A state was formed. Next, cells 50 (HL60 cells) were seeded on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20. The cells were cultured for 3 days in an environment with a temperature of 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%.
  • FIG. 7 shows the cell growth rate during culture. As shown in FIG. 7, the doubling time (time until the cell growth rate is doubled) is 50 hours when the culturing time is less than 50 hours in Example 2, and the culturing time is 50 hours when the culturing time is 50 hours or more.
  • the doubling time was 20 hours.
  • the metal porous membrane 20 is taken out from the culture medium 40 using magnetic tweezers, and the cells trapped in the metal porous membrane 20 are treated with a CFDA (5 (6) -Carboxyfluorescein diacetate) solution so that only living cells are present.
  • CFDA (6) -Carboxyfluorescein diacetate
  • the amount of the culture medium 40 attached to the metal porous membrane 20 and taken out depends on the surface area including the inner wall of the through-hole 21 and the thickness of the attached culture medium. Can be modeled with products.
  • the amount of the culture medium 40 can be reduced as compared with the case where resin porous membranes having the same opening ratio per unit area and porosity per unit volume are used. This is because the resin porous membrane has a very large hole inner wall area.
  • FIG. 8 shows a schematic configuration diagram of the cell culture device 100B of the second embodiment.
  • FIG. 9 shows an enlarged cross-sectional view of a part of the metal porous membrane 20b.
  • the metal porous film 20 b is made of a material containing a magnetic material, and the metal porous film 20 b is fixed by the magnet 60. Is different.
  • the second embodiment is different from the first embodiment in that the surface of the metal porous film 20b is covered with gold.
  • the cell culture device 100B is disposed at the bottom of the culture vessel 10, the metal porous membrane 20b containing a magnetic material, the spacer 30 that supports the metal porous membrane 20b, and the culture vessel 10. And a magnet 60.
  • the metal porous membrane 20 b is fixed to the spacer 30 by the magnetic force of the magnet 60.
  • the metal porous membrane 20b has an outer diameter of 29 mm.
  • the dimensions other than the outer diameter of the metal porous membrane 20b are the same as those of the metal porous membrane 20 of the first embodiment.
  • the metal porous film 20b includes a magnetic material. Examples of the magnetic material include nickel, cobalt, iron, and alloys containing these.
  • the metal porous film 20b covers the surface with 50 nm thick gold in order to improve the wettability of the film surface.
  • the wettability of the film surface means hydrophilicity on the surface of the film, and does not mean the ease of liquid penetration into the film.
  • Examples of the gold coating method include a plating method and a vapor deposition method.
  • the magnet 60 is disposed outside the bottom of the culture vessel 10.
  • the magnet 60 is, for example, a neodymium magnet.
  • the magnet 60 draws the metal porous membrane 20b inside the culture vessel 10 toward the bottom of the culture vessel 10 by magnetic force.
  • the metal porous membrane 20b including the magnetic material is fixed to the upper surface of the spacer 30 by the magnetic force of the magnet 60, and the space between the bottom of the culture vessel 10 and the metal porous membrane 20b is fixed. A gap is provided.
  • the metal porous film 20b is formed of a material containing a magnetic material, and the metal porous film 20b is fixed inside the culture vessel 10 by the magnetic force of the magnet 60.
  • the metal porous film 20 b disposed in the culture medium 40 from floating due to buoyancy and firmly fix the metal porous film 20 b to the upper surface of the spacer 30.
  • the metal porous membrane 20b can be easily taken out from the culture medium 40, so that the handleability is improved.
  • it is not necessary to provide a fixing mechanism in the culture vessel cells can be cultured efficiently.
  • the metal porous membrane 20b can be firmly fixed to the spacer 30 by the magnetic force of the magnet 60, a gap can be provided between the metal porous membrane 20b and the culture vessel 10. Thereby, the culture medium 40 in the culture vessel 10 can be efficiently circulated through the through hole 21. Further, by determining that the cell 50 has moved to the gap through the through hole 21, it is possible to easily determine the movement of the cell.
  • the surface of the metal porous membrane 20b is covered with gold.
  • the wettability of the surface of the metal porous membrane 20b is improved, so that the affinity of the cells 50 is improved. For this reason, the survival days of the cell 50 in culture can be lengthened.
  • the metal porous film 20b demonstrated the example which covers the whole surface with gold
  • the metal porous film 20b only needs to be covered with gold at least a part of its surface.
  • the surface material is not limited to gold, and even platinum, silver, copper, etc. are preferable because the wettability of the surface of the metal porous film is improved.
  • the spacer 30 may be formed of a magnet, and the metal porous film 20b may be fixed by the magnetic force of the spacer 30.
  • the present invention is not limited to this.
  • the cell culture device 100B may not include the spacer 30.
  • Example 3 in which the cells 50 are cultured using the cell culture device 100B of the second embodiment will be described.
  • the culture medium 40 was introduced into the culture vessel 10 to form a state in which both the first main surface PS1 and the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20b were filled with the culture medium 40.
  • cells 50 (HL60 cells) were added on the first main surface PS1 of the metal porous membrane 20b, and the cells were cultured in an environment with a temperature of 37 degrees and a carbon dioxide concentration of 5%.
  • the cells 50 grew in a suspended state while repeatedly contacting and dissociating with the first main surface PS1 in the medium 40.
  • cells 50 were cultured under the same conditions as in Example 3. went.
  • FIG. 10 shows the results of comparison of the number of days of cell survival when cells were cultured in Example 3 and Comparative Example 1.
  • the survival time of the cells 50 was 3 days.
  • the survival time of the cells was 7 days.
  • the number of days of cell survival could be extended by the gold covering the surface of the metal porous membrane 20b. This is considered to be because the hydrophilicity of the membrane surface was improved by covering the membrane surface with gold, and the affinity with cells was improved.
  • FIG. 11 shows a schematic configuration diagram of a cell culture device 100C according to the third embodiment.
  • the third embodiment is different from the first embodiment in that it has a protrusion 11 that protrudes inward from the side wall of the culture vessel 10a.
  • the third embodiment is different from the first embodiment in that the spacer 30 is not provided.
  • the culture vessel 10a has an annular protrusion 11 protruding from the inner wall of the culture vessel 10a toward the center at a position above the bottom surface.
  • the protrusion 11 is formed to have such a dimension that the metal porous film 20 can be disposed on the upper surface.
  • the protrusion 11 is located 2 mm above the bottom surface and protrudes 5 mm from the inner wall of the culture vessel 10a toward the center.
  • the metal porous film 20 is disposed on the upper surface of the protrusion 11.
  • the cell culture device 100C according to Embodiment 3 can provide the following effects.
  • the cell culture device 100C has an annular protrusion 11 protruding from the inner wall of the culture vessel 10a toward the center at a position above the bottom surface of the culture vessel 10a. With such a configuration, a gap can be provided between the bottom of the culture vessel 10 a and the metal porous membrane 20 without using the spacer 30. For this reason, the number of parts can be reduced.
  • the protrusion 11 has an annular shape, but the present invention is not limited to this.
  • the protrusion 11 may have a polygonal shape, a quadrangular shape, an elliptical shape, or the like.
  • FIG. 12 shows a schematic configuration diagram of a cell culture device 100D of the fourth embodiment.
  • the fourth embodiment differs from the first embodiment in that the metal porous film 20c has a spacer 30a.
  • the cell culture device 100D is provided with a plurality of spacers 30a on the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20c.
  • the plurality of spacers 30a are provided at equal intervals on the second main surface PS2.
  • the spacer 30a is formed integrally with the metal porous film 20c.
  • the spacer 30a is provided on the second main surface PS2 of the metal porous membrane 20c. With such a configuration, the number of parts can be reduced, and the metal porous film 20c can be firmly fixed to the spacer 30a. In addition, the metal porous film 20c and the spacer 30a can be integrally formed to be more firmly fixed.
  • a space can be provided between the metal porous membrane 20c and the culture vessel 10 by the spacer 30a provided in the metal porous membrane 20c.
  • the culture medium 40 in the culture vessel 10 can be efficiently circulated through the through hole 21. Further, by determining that the cell 50 has moved to the gap through the through hole 21, the movement of the cell can be easily determined.
  • the metal porous film 20c demonstrated the example formed integrally with the spacer 30a, it is not limited to this.
  • the metal porous film 20c may be configured such that the spacer 30a is detachably attached to the second main surface PS2.
  • FIG. 13 shows a schematic configuration diagram of a cell culture device 100E of a modified example.
  • a first metal porous film 20ca having a spacer 30aa and a second metal porous film 20cb having a spacer 30ab are arranged in the culture vessel 10.
  • the first metal porous film 20ca is disposed inside the culture vessel 10
  • the second metal porous film 20cb is disposed on the first main surface PS1 of the first metal porous film 20ca. ing.
  • many cells 50 can be cultured at a time.
  • FIG. 14 shows a schematic configuration diagram of the cell culture device 100F of the fifth embodiment.
  • the fifth embodiment is different from the first embodiment in that the culture vessel 10b has a spacer 30b.
  • the cell culture device 100F is provided with a plurality of spacers 30b at the bottom of the culture vessel 10b.
  • the plurality of spacers 30b protrude from the bottom of the culture vessel 10b toward the opening.
  • the spacer 30b is formed integrally with the culture vessel 10b.
  • a spacer 30b is provided at the bottom of the culture vessel 10b. With such a configuration, the number of parts can be reduced, and the culture vessel 10b and the spacer 30b can be firmly fixed. In addition, the culture vessel 10b and the spacer 30b can be formed more firmly by being integrally formed.
  • a space can be provided between the metal porous membrane 20 and the culture vessel 10b by the spacer 30b provided in the culture vessel 10b.
  • the culture medium 40 in the culture vessel 10b can be efficiently circulated through the through hole 21. Further, by determining that the cell 50 has moved to the gap through the through hole 21, the movement of the cell can be easily determined.
  • the culture container 10b demonstrated the example formed integrally with the spacer 30b, it is not limited to this.
  • the culture vessel 10b may be configured such that the spacer 30b is detachably attached to the bottom surface.
  • FIG. 15 is a schematic configuration diagram of the cell culture device 100G according to the sixth embodiment as viewed from the first main surface PS1 side of the metal porous membrane 20.
  • the sixth embodiment is different from the first embodiment in that the spacers 30ca and 30cb are formed in a ring shape.
  • ring-shaped spacers 30ca and 30cb are arranged at the bottom of the culture vessel 10.
  • the spacer 30ca is provided inside the spacer 30cb.
  • the spacer 30ca is a silicon annular ring having a thickness of 100 ⁇ m, an inner diameter of 5 mm, and an outer diameter of 8 mm.
  • the spacer 30cb is a silicon ring having a thickness of 100 ⁇ m, an inner diameter of 20 mm, and an outer diameter of 23 mm.
  • the cell culture device 100G has ring-shaped spacers 30ca and 30cb.
  • the metal porous film 20 can be firmly supported by the spacers 30ca and 30cb.
  • the inner space and the outer space of the spacer can be partitioned by the spacers 30ca and 30cb.
  • the culture medium 40 and the cells 50 can be moved only through the through holes 21 of the metal porous membrane 20.
  • the cells 50 that have moved from the first main surface PS1 through the through hole 21 to the inside of the spacers 30ca and 30cb can be collected.
  • the cell culture device 100G may be configured to include one or more ring-shaped spacers.
  • FIG. 16 is a schematic configuration diagram of a cell culture device 100H according to the seventh embodiment.
  • Embodiment 7 will mainly describe differences from Embodiment 1.
  • the same or equivalent components as those in the first embodiment will be described with the same reference numerals.
  • descriptions overlapping with those in the first embodiment are omitted.
  • the seventh embodiment is different from the first embodiment in that the height of the spacer 30d is adjusted and the metal porous film 20 is inclined.
  • the cell culture device 100H increases the height of the spacer 30d from one end side to the other end side in a side view.
  • the metal porous membrane 20 is inclined with respect to the culture vessel 10 by an angle ⁇ 2, and a part of the metal porous membrane 20 is exposed outside the medium 40.
  • the height of the spacer 30d is adjusted and the metal porous film 20 is tilted to expose a part of the metal porous film 20 to the outside of the culture medium 40.
  • the portion of the metal porous membrane 20 exposed to the outside of the culture medium 40 is in contact with the outside air, so that the temperature of the outside air can be efficiently transmitted to the culture medium 40 through the metal porous membrane 20.
  • the metal porous membrane 20 can be handled without contaminating the culture medium 40.
  • the present invention is not limited to this.
  • the metal porous film 20 only needs to be at least partially exposed to the outside of the culture medium 40.
  • FIG. 17 shows a schematic configuration diagram of a cell culture device 100I according to the eighth embodiment.
  • the eighth embodiment differs from the first embodiment in that a part of the metal porous membrane 20 d is bent toward the opening side of the culture vessel 10.
  • the end of the metal porous membrane 20d is bent toward the opening side of the culture vessel 10.
  • the end portion of the bent metal porous membrane 20d is exposed outside the culture medium 40.
  • the end portion of the metallic porous film 20d is bent in an L shape.
  • the cell culture apparatus 100I exposes a part of the metal porous film 20d outside the culture medium 40 by bending a part of the metal porous film 20d.
  • the portion of the metallic porous film 20 d exposed to the outside of the culture medium 40 comes into contact with the outside air, so that the temperature of the outside air can be efficiently transmitted to the culture medium 40 through the metallic porous film 20.
  • the metal porous membrane 20 can be handled without contaminating the culture medium 40.
  • the metal porous film 20d demonstrated the example formed by bending in L shape, it is not limited to this.
  • the metallic porous film 20d only needs to be at least partially exposed to the outside of the culture medium 40, and may be bent at an arbitrary angle.
  • the present invention is useful in the fields of regenerative medicine, cell therapy, drug discovery, and other useful substance production, for example. More specifically, co-culture of iPS cells, ES cells and feeder cells, induction of differentiation of cells into specific forms, selective removal of cancerous cells, drug screening using cultured cells, biotechnology using cultured cells It can be used for production of useful substances such as pharmaceutical preparations, preparation of spheroid cell clusters that can be used as materials for cancer tissue model systems and artificial tissue construction, bioreactors using cultured cells, and continuous production of useful substances by fermentation.

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Abstract

培地のロスを低減することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供する。本発明の細胞培養方法は、有底の培養容器の内部に複数の貫通孔を有する金属製多孔膜を配置する工程、培養容器の内部に培地を供給する工程、培養容器の内部に細胞を供給する工程、および培地を用いて細胞を培養する工程、を含む。本発明の細胞培養装置は、培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、培地と細胞とを収容する、有底の培養容器と、培養容器の内部に配置した、複数の貫通孔を有する金属製多孔膜と、を備える。このような構成により、多孔膜自体の吸水による培地のロスを低減することができる。

Description

細胞培養方法及び細胞培養装置
　本発明は、培地を用いて細胞を培養する細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
　培地を用いて細胞を培養する方法として、樹脂製の多孔膜を用いた細胞培養方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。特許文献１に開示された細胞培養方法では、多孔膜を境に上層部及び下層部の双方を培地で満たし、細胞が培養されている間、常に多孔膜を介して培地が下層から細胞に供給されている。
特開２０１１－２５０８０４号公報
　しかしながら、特許文献１の細胞培養方法においては、樹脂製多孔膜を用いているため、多孔膜自体の吸水による培地のロスが大きいという課題がある。
　本発明は、培地のロスを低減することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
　本発明の一態様の細胞培養方法は、
　有底の培養容器の内部に複数の貫通孔を有する金属製多孔膜を配置する工程、
　前記培養容器の内部に培地を供給する工程、
　前記培養容器の内部に細胞を供給する工程、および
　前記培地を用いて前記細胞を培養する工程、
を含む。
　本発明の一態様の細胞培養装置は、
　培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
　前記培地と前記細胞とを収容する、有底の培養容器と、
　前記培養容器の内部に配置した、複数の貫通孔を有する金属製多孔膜と、
を備える。
　本発明によれば、培地のロスを低減することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することができる。
本発明に係る実施の形態１の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態１における金属製多孔膜の一部の拡大図 図２の金属製多孔膜の一部を第１主面側から見た概略図 図３の金属製多孔膜の一部をＡ－Ａ線で切断した断面図 本発明に係る実施の形態１の細胞培養方法を示すフローチャート 本発明に係る実施の形態１における金属製多孔膜の変形例を示す図 本発明に係る実施の形態１の細胞培養装置を用いて細胞を培養した時の細胞増殖率を示す図 本発明に係る実施の形態２の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態２における金属製多孔膜の一部の概略図 本発明に係る実施の形態２の細胞培養装置を用いた実施例３と比較例１とにおける細胞生存日数に関する実験結果を示す図 本発明に係る実施の形態３の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態４の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態４の細胞培養装置の変形例を示す概略構成図 本発明に係る実施の形態５の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態６の細胞培養装置を金属製多孔膜の第１主面側から見た概略構成図 本発明に係る実施の形態７の細胞培養装置の概略構成図 本発明に係る実施の形態８の細胞培養装置の概略構成図
　本発明の一態様の細胞培養方法は、
　有底の培養容器の内部に複数の貫通孔を有する金属製多孔膜を配置する工程、
　前記培養容器の内部に培地を供給する工程、
　前記培養容器の内部に細胞を供給する工程、および
　前記培地を用いて前記細胞を培養する工程、
を含んでもよい。
　このような構成により、多孔膜自体の吸水による培地のロスを低減することができる。
　前記細胞培養方法において、前記細胞を培養する工程は、前記金属製多孔膜における第１主面側の開口と第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通する前記貫通孔を通じて前記培地を前記細胞に供給する工程を含んでもよい。
　このような構成により、貫通孔を介しての培地の供給が行いやすくなり、培養容器内において培地を効率よく循環させることができる。また、細胞が貫通孔を通りやすくなるため、細胞の移動を容易に判別することができる。
　前記細胞培養方法において、前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜と前記培養容器の底部との間に空隙を設けて前記金属製多孔膜を配置してもよい。
　このような構成により、培養容器内の培地を、貫通孔を介して効率良く循環させることができる。細胞が貫通孔を通って空隙に移動したことを判別することによって、細胞の移動を容易に判別することができる。
　前記細胞培養方法において、前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜と前記培養容器の底部との間にスペーサを設けることによって前記空隙を設けてもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜をスペーサにより強固に固定して、確実に空隙を設けることができる。培養容器内の培地を、貫通孔を介して効率良く循環させることができる。また、細胞が貫通孔を通って空隙に移動したことを判別することによって、細胞の移動を容易に判別することができる。
　前記細胞培養方法において、前記金属製多孔膜は、磁性体を含み、
　前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜を磁力により前記培養容器の内部に配置してもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜を磁力により強固に固定することができる。また、前記培養容器内に固定機構を設けなくて済むために、細胞を効率良く培養できる。
　前記細胞培養方法において、前記金属製多孔膜の表面は金で被覆されていてもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜の表面の濡れ性が向上するため、細胞の親和性が向上する。このため、培養中の細胞の生存日数を長くすることができる。
　本発明の一態様の細胞培養装置は、
　培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
　前記培地と前記細胞とを収容する、有底の培養容器と、
　前記培養容器の内部に配置した、複数の貫通孔を有する金属製多孔膜と、
を備えてもよい。
　このような構成により、多孔膜自体の吸水による培地のロスを低減することができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜の前記貫通孔は、前記金属製多孔膜における第１主面側の開口と第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通していてもよい。
　このような構成により、貫通孔を介しての培地の供給が行いやすくなり、培養容器内において培地を効率よく循環させることができる。細胞が貫通孔を通りやすくなるため、細胞の移動を容易に判別することができる。また、金属製多孔膜の貫通孔内に保持される培地を減らすことができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜の厚みは、５０ｎｍ以上１００μｍ以下であってもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜に保持される培地を更に低減することができる。貫通孔を介しての培地の供給が更に行いやすくなり、培養容器内において培地を更に効率よく循環させることができる。細胞の移動を更に容易に判別することができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜の単位体積当たりにおける空隙率は、１０％以上９０％以下であってもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜に保持される培地を更に低減することができる。
　前記細胞培養装置において、前記培養容器と前記金属製多孔膜との間にスペーサを備えてもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜と培養容器との間に空隙を設けることができる。これにより、培養容器内の培地を、貫通孔を介して効率良く循環させることができる。また、細胞が貫通孔を通って空隙に移動したことを判別することによって、細胞の移動を容易に判別することができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜は、前記培養容器の底部に面する第２主面に前記スペーサを有していてもよい。
　このような構成により、部品点数を減らすと共に、金属製多孔膜とスペーサを強固に固定することができる。
　前記細胞培養装置において、前記培養容器は、前記金属製多孔膜の第２主面に面する底部にスペーサを有してもよい。
　このような構成により、部品点数を減らすと共に、培養容器とスペーサを強固に固定することができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜は、磁性体を含んでいてもよい。
　このような構成により、磁力により金属製多孔膜を強固に固定することができる。また、前記培養容器内に固定機構を設けなくて済むために、細胞を効率良く培養できる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜の表面は金で被覆されていてもよい。
　このような構成により、金属製多孔膜の表面の濡れ性が向上するため、細胞の親和性が向上する。このため、培養中の細胞の生存日数を長くすることができる。
　前記細胞培養装置において、前記金属製多孔膜の第１主面と第２主面の少なくとも一方における前記貫通孔の開口率は、１０％以上であってもよい。
　このような構成により、貫通孔を介して細胞に供給する培地を増やすことができると共に、培養容器内の培地を効率良く循環させることができる。また、細胞が貫通孔を通って移動しやすくなるため、細胞の移動を更に容易に判別することができる。
　以下、本発明に係る実施の形態について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。
（実施の形態１）
［全体構成］
　図１は、本発明に係る実施の形態１の細胞培養装置１００Ａの概略構成図を示す。図１に示すように、細胞培養装置１００Ａは、有底の培養容器１０と、培養容器１０内に配置された、複数の貫通孔２１を有する金属製多孔膜２０と、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に設けられたスペーサ３０と、を備える。
　細胞培養装置１００Ａは、培養容器１０内の金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２を培地４０で満たし、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上に収容された細胞５０を培養する。なお、本明細書において、「培養する」とは、細胞を、培地に浸漬させて、細胞分裂により細胞を生存させつつ増殖させる操作、及び／又は細胞を、培地に浸漬させて、細胞から培地へ抽出される分泌物を回収する操作を意味する。
　実施の形態１において、培地４０とは、培養対象である細胞５０に生育環境を提供する流動体である。例えば、培地４０は、液体培地であればよく、培地４０の例としては、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＥＭＥＭ（イーグル最小必須培地）、ＲＰＭＩ１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地）、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、グレース昆虫培地、ＹＰＤ培地（イースト・エキストラクト・デキストロース培地）、麹汁培地、ＬＢ培地（ルリア培地）等がある。
　実施の形態１において、細胞５０とは、例えば、卵、精子、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ＥＳ細胞、フィーダー細胞、幹細胞、間葉系幹細胞、単核球細胞、単細胞、細胞塊、浮遊性細胞、接着性細胞、神経細胞、白血球、リンパ球、再生医療用細胞、自己細胞、がん細胞、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）、ＨＬ－６０、ＨｅＬａ、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓｆ９、Ｖｅｒｏ、菌類、酵母、細菌類等を含む。
＜培養容器＞
　培養容器１０は、培地４０と細胞５０が供給される有底の容器である。培養容器１０は、上面が開口している円筒状の容器である。培養容器１０は、例えば、内径が３３ｍｍであって、ポリスチレンで作られている。
＜金属製多孔膜＞
　金属製多孔膜２０は、培養容器１０内に配置される金属製薄膜である。実施の形態１において、金属製多孔膜２０は、円形の金属メッシュであり、互いに対向する第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを有し、両主面を貫通する複数の貫通孔２１を有する構造体である。第１主面ＰＳ１とは、培養容器１０の開口側に位置する金属製多孔膜２０の主面である。第２主面ＰＳ２とは、培養容器１０の底部側に位置する金属製多孔膜２０の主面である。金属製多孔膜２０は、例えば、ニッケルで形成されている。金属製多孔膜２０の寸法は、例えば、直径３３ｍｍ、厚さ０．８５μｍである。また、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２における開口率は、例えば、５３％である。実施の形態１において、金属製多孔膜２０は、第１主面ＰＳ１側の空間と第２主面ＰＳ２側の空間とに仕分けており、貫通孔２１を介してのみ培地４０が移動できるようになっている。このように仕分けることで、細胞の移動は貫通孔２１を介してのみ可能となり、移動可能な細胞の大きさを貫通孔２１の大きさで規定することが可能となる。あるいは、貫通孔２１の大きさを細胞の大きさよりも小さく設計しておくことで、培養によって付随的に発生する不要な有機物（死細胞や死細胞の一部を含む）を第２主面ＰＳ２側の空間に排除して、細胞周辺の培地を常に高品質に維持することが可能となる。
　図２は、金属製多孔膜２０の一部を拡大した概略図である。図２中のＸ、Ｙ、Ｚ方向は、それぞれ金属製多孔膜２０の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図３は、図２の金属製多孔膜２０の一部を第１主面ＰＳ１側から見た概略図である。図２及び図３に示すように、金属製多孔膜２０は、マトリックス状に一定の間隔で複数の貫通孔２１が配置された板状構造体（格子状構造体）である。複数の貫通孔２１は、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１側から見て、即ちＺ方向に見て正方形の形状を有する。複数の貫通孔２１は、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２上に周期的に配置されている。複数の貫通孔２１は、正方形の各辺と平行な２つの配列方向、即ち図２中のＸ方向とＹ方向に等しい間隔で設けられている。図３に示すように、実施の形態１において、例えば、貫通孔２１の一辺ｄは１．９μｍであり、格子間隔ｂは２．６μｍである。
　図４は、図３の金属製多孔膜２０の一部をＡ－Ａ線で切断した断面図である。図４に示すように、金属製多孔膜２０の貫通孔２１は、第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔２１は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。即ち、金属製多孔膜２０を第１主面ＰＳ１側から見た場合に、貫通孔２１は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口と重なるように設けられている。実施の形態１において、貫通孔２１は、その内壁が第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直となるように設けられている。
　貫通孔２１の形状や寸法は、培養する細胞５０の大きさ、形状に応じて適宜設計されるものである。例えば、所定の寸法の複数の貫通孔２１を所定の間隔で設けることができる。貫通孔２１は、例えば、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１側から見て、即ちＺ方向から見て、縦０．０５μｍ以上５０μｍ以下、横０．０５μｍ以上５０μｍ以下の正方形の形状に設計されてもよい。貫通孔２１間の間隔は、例えば、貫通孔２１の１倍より大きく１０倍以下であり、より好ましくは貫通孔２１の３倍以下である。あるいは、開口率にして１０％以上が好ましい。また、貫通孔の大きさの平均値に対して、貫通孔の最小値は０．５倍以上、貫通孔の最大値は１．５倍以下が好ましい。
　金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２の少なくとも一方における貫通孔２１の開口率は、１０％以上が好ましい。開口率とは、金属製多孔膜の第１主面の表面積に対する貫通孔の開口が占める割合を意味する。
　なお、貫通孔２１は、正方形に限定されず、例えば長方形や円や楕円などでもよい。また、孔の配列も正方格子配列に限定されず、例えば方形配列であれば、２つの配列方向の間隔は等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列や準周期配列などでもよい。
　金属製多孔膜２０の厚さは、５０ｎｍ以上１００μｍ以下が好ましい。
　金属製多孔膜２０の単位体積当たりにおける空隙率は、１０％以上９０％以下が好ましい。単位体積当たりにおける空隙率とは、単位体積当たりにおける貫通孔２１の内部空間が占める割合を意味する。
＜スペーサ＞
　スペーサ３０は、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に設けられた支持体である。スペーサ３０は、培養容器１０の底部から開口側へ金属製多孔膜２０を持ち上げて支持することによって、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に空隙を設けている。実施の形態１において、スペーサ３０は、正四角柱の形状を有する支持体である。例えば、スペーサ３０の高さは１ｍｍ、スペーサ３０の底面の一辺は１ｍｍである。実施の形態１において、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に複数のスペーサ３０が設けられている。複数のスペーサ３０は、５ｍｍの間隔で設けられている。実施の形態１において、培地４０は、複数のスペーサ３０間を移動することができる。
［細胞培養方法］
　本発明の実施の形態１に係る細胞培養方法について、図５を用いて説明する。図５は、実施の形態１に係る細胞培養方法のフローチャートを示す。
　図５に示すように、ステップＳＴ１１において、培地４０と細胞５０を供給する培養容器１０と、金属製多孔膜２０を準備する（準備工程）。
　ステップＳＴ１２において、培養容器１０の内部に金属製多孔膜２０を配置する（金属製多孔膜配置工程）。具体的には、培養容器１０の内壁に沿って、金属製多孔膜２０を投入し、培養容器１０の底部に設けられたスペーサ３０の上に金属製多孔膜２０を固定する。これにより、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に空隙を設ける。空隙は、例えば、培地４０が金属製多孔膜２０の貫通孔２１を通過して培養容器１０内を循環できる程度の大きさであればよい。循環とは、ある貫通孔２１を介して第２主面ＰＳ２側から第１主面ＰＳ１側へ培地４０が移動する一方、別の貫通孔２１を介して第１主面ＰＳ１側から第２主面ＰＳ２側へ培地４０が移動するような自然対流を意味する。あるいは、空隙は、細胞５０を金属製多孔膜２０の第２主面ＰＳ２上で培養できる程度の大きさであればよい。
　ステップＳＴ１３において、培養容器１０の内部に培地４０を供給する（培地供給工程）。具体的には、培地４０を培養容器１０の内部に供給し、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２との両主面が培地４０で満たされた状態を形成する。このような状態になると、培養容器１０内の培地４０が循環し、金属製多孔膜２０の第２主面ＰＳ２から第１主面ＰＳ１へ貫通孔２１を介して培地４０が供給されるようになる。
　ステップＳＴ１４において、培養容器１０の内部に細胞５０を供給する（細胞供給工程）。具体的には、培養容器１０の内部に配置された金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上に細胞５０を供給する。金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上に供給された細胞５０は、第１主面ＰＳ１上に収容される。金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上の細胞５０には、貫通孔２１を介して培地４０が供給される。
　ステップＳＴ１５において、培養容器１０の内部に収容された細胞５０を培養する（細胞培養工程）。具体的には、金属製多孔膜２０の貫通孔２１を通じて培地４０を、第１主面ＰＳ１上に収容された細胞５０に供給する。また同時に第１主面ＰＳ１上の培地４０を細胞５０に供給する。培養容器１０内では培地４０が循環しているため、細胞５０には培地４０が供給され続ける状態が維持されている。
　細胞５０の培養が終了した後、ピンセット等を用いて金属製多孔膜２０を引き上げて、細胞５０を回収することができる（細胞回収工程）。
［効果］
　実施の形態１に係る細胞培養装置１００Ａによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいては、複数の貫通孔２１を有する金属製多孔膜２０を備えている。金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて吸水性が低いため、膜自体によって吸水される培地４０の量を低減することができる。このように、細胞培養装置１００Ａにおいては、金属製多孔膜２０を用いることによって、膜自体の吸水による培地４０のロスを低減することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて剛性が高いため、撓みを小さくすることができる。即ち、金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて、貫通孔２１の変形を小さくすることができる。例えば、金属製多孔膜２０を培地４０から引き上げるとき、金属製多孔膜２０の撓みによる貫通孔２１の変形が小さいため、貫通孔２１に培地４０が残りにくい。このように、細胞培養装置１００Ａにおいては、金属製多孔膜２０を培地４０の中から引き上げた後に、金属製多孔膜２０内の残る培地４０（残液）を低減することができる。
　また、金属製多孔膜２０の撓みが小さいことによって、撓みによる細胞５０にかかるストレスを低減することができる。
　金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて、膜の厚さを薄くすることができる。これにより、細胞培養装置１００Ａにおいては、細胞５０を培養する際に、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを培地４０で満たすために使用する培地４０の量を、樹脂製多孔膜を用いた細胞培養装置と比べて低減することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいては、細胞５０を培養するために使用する培地４０の量を低減することによって、細胞培養にかかるコストを低減することができる。
　金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて、第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２の少なくとも一方における貫通孔２１の開口率を大きくすることができる。これにより、金属製多孔膜２０の貫通孔２１を介した培地４０の供給を高効率化することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、金属製多孔膜２０の貫通孔２１は、第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。このような構成により、培養容器１０内を循環する培地４０を、貫通孔２１を介して金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上の細胞５０に効率良く供給することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいては、金属製多孔膜２０の貫通孔２１のサイズが細胞５０のサイズよりも大きく設計されているため、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上で細胞５０が動くと、貫通孔２１を通って金属製多孔膜２０の第２主面ＰＳ２に、又は培養容器１０の底部に移動する。これにより、細胞培養装置１００Ａにおいては、細胞５０の移動を容易に判別することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、金属製多孔膜２０は、樹脂製多孔膜と比べて熱伝導率が高い。このため、培地４０と金属製多孔膜２０との温度を短時間で均衡化することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間にスペーサ３０を設けることによって、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０との間に空隙を設けている。この空隙によって、培地４０が培養容器１０内を循環しやすくなる。また、空隙によって、金属製多孔膜２０の貫通孔２１を介した培地４０の供給を高効率化することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、培養容器１０内で金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２との両主面が培地４０で満たされた状態を形成している。これにより、第２主面ＰＳ２から第１主面ＰＳ１へ向かって貫通孔２１を介して培地４０が、第１主面ＰＳ１上の細胞５０に供給される。このような構成により、細胞培養装置１００Ａは、効率良く培地４０を細胞５０に供給して、細胞５０を高効率で培養することができる。
　細胞培養装置１００Ａにおいて、金属製多孔膜２０は、金属で作られているため、ガンマ線照射によるガンマ線滅菌、高温高圧の飽和水蒸気によるオートクレーブ滅菌、酸化エチレンガスを用いた酸化エチレンガス滅菌、又はオゾンによる酸化滅菌を施したとしても損傷を受けることがない。したがって、使用済みの金属製多孔膜２０は、洗浄及び滅菌することで再利用することができる。
　なお、実施の形態１において、培養容器１０は、円筒状の容器である例を説明したが、これに限定されない。培養容器１０は、その内部に金属製多孔膜２０を配置し、培地４０と細胞５０を供給することができる形状であればよい。培養容器１０は、例えば、上面が開口されている有底の多角形状の容器であってもよい。
　実施の形態１において、金属製多孔膜２０の貫通孔２１は、第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直方向に設けられている例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔２１は、金属製多孔膜２０の厚み方向から見て、第１主面ＰＳ１側の開口の少なくとも一部が、第２主面ＰＳ２の開口に投影できるように設けられていればよい。図６は、変形例の金属製多孔膜２０ａを示す。図６に示すように、貫通孔２１ａは、内壁を傾斜して設けられてもよい。例えば、貫通孔２１ａは、Ｚ方向に対してＹ方向へ角度θ１傾斜して設けられてもよい。θ１は、第１主面ＰＳ１側の開口の少なくとも一部が、第２主面ＰＳ２の開口に投影できる程度の角度であればよい。
　実施の形態１において、金属製多孔膜２０の外周部は、培養容器１０の内壁に沿って配置されている例を説明したが、これに限定されない。例えば、金属製多孔膜２０の外周部と培養容器１０の内壁との間に空隙を設けてもよい。この空隙を設けることによって、培地４０を更に循環しやすくすることができる。
　実施の形態１において、スペーサ３０は、正四角柱の形状を有する支持体を説明したが、これに限定されない。スペーサ３０は、金属製多孔膜２０を支持できる形状であればよい。スペーサ３０は、例えば、円柱形状、多角柱形状等であってもよい。また、スペーサ３０は、金属製多孔膜２０を支持できる位置に設けられていればよく、設置位置や数は限定されない。
　実施の形態１において、スペーサ３０を備える構成について説明したが、これに限定されない。スペーサ３０は、必須の構成ではなく、細胞培養装置１００Ａは、スペーサ３０を備えない構成であってもよい。
　実施の形態１において、培養容器１０の内部に培地４０を供給するステップ（培地供給工程）ＳＴ１３と、培養容器１０の内部に細胞５０を供給するステップ（細胞供給工程）ＳＴ１４と、を分けて行う例について説明したが、これに限定されない。例えば、培地供給工程ＳＴ１３と細胞供給工程ＳＴ１４とは、同時に行ってもよい。
　実施の形態１において、培養容器１０に金属製多孔膜２０を配置するステップＳＴ１２を、培養容器１０と金属製多孔膜２０を準備するステップＳＴ１１の後に行う例について説明したが、これに限定されない。例えば、培養容器１０に細胞５０を供給するステップＳＴ１４の後に、培養容器１０に金属製多孔膜２０を配置するステップＳＴ１２を行ってもよい。この場合、貫通孔２１を通じて金属製多孔膜２０の第２主面ＰＳ２から第１主面ＰＳ１へ細胞５０が移動したことを判別してもよい。
　実施の形態１において、細胞培養装置１００Ａは、培養する対象物として細胞５０を説明しているが、培養する対象物は細胞に限定されない。細胞培養装置１００Ａで培養する対象物としては、例えば、細菌（真正細菌）又はウィルス等を含んでもよい。細菌（真正細菌）としては、例えば、グラム陽性菌、グラム陰性菌、大腸菌、結核菌を含む。ウィルスとしては、例えば、ＤＮＡウィルス、ＲＮＡウィルス、ロタウィルス、（鳥）インフルエンザウィルス、黄熱病ウィルス、デング熱病ウィルス、脳炎ウィルス、出血熱ウィルス、免疫不全ウィルスを含む。
（実施例１）
　実施の形態１の細胞培養装置１００Ａを用いて細胞５０の培養を行う実施例１について説明する。
　実施例１は、培地４０として、１０%のＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）と２％のＦＢＳ（Ｆｅｔｅｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）を混合したものを用いた。細胞５０として、ＨｅＬａ細胞を用いた。
　実施例１では、まず、細胞培養装置１００Ａの培養容器１０の内部に培地４０を投入し、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２との両面を培地４０で満たした状態を形成した。次に、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上に細胞５０（ＨｅＬａ細胞）を播種した。温度３７度、二酸化炭素濃度５％の環境下で３日間培養した後、磁石製ピンセットを使用して培地４０から金属製多孔膜２０を取り出した。
　金属製多孔膜２０を培地４０から取り出す際、金属製多孔膜２０に撓みは見られなかった。また、第１主面ＰＳ１上に存在していた培地４０は、金属製多孔膜２０の周縁部から培養容器１０の内部へ流れ落ちた。
　取り出した金属製多孔膜２０の第２主面ＰＳ２を顕微鏡で観察した結果、第２主面ＰＳ２上にも細胞５０の存在を確認することができた。金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１から第２主面ＰＳ２への経路は、貫通孔２１のみであるため、貫通孔２１を通じて金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１から第２主面ＰＳ２へ細胞５０の培養が進んだと考えられる。
（実施例２）
　実施の形態１の細胞培養装置１００Ａを用いて細胞５０の培養を行う実施例２について説明する。
　実施例２は、培地４０として、ＲＰＭＩ１６４０（ロズウェルパーク記念研究所培地）に１０％のＦＢ（ウシ胎児血清）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンと１０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを混合したものを用いた。細胞５０として、ＨＬ６０細胞を用いた。
　実施例２では、まず、細胞培養装置１００Ａの培養容器１０の内部に培地４０を投入し、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２との両面を培地４０で満たした状態を形成した。次に、金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１上に細胞５０（ＨＬ６０細胞）を播種した。温度３７度、二酸化炭素濃度５％の環境下で３日間培養した。図７は、培養時の細胞増殖率を示す。図７に示すように、実施例２における培養時間５０時間未満では倍加時間(細胞増殖率が２倍になるまでの時間)が５０時間、培養時間５０時間以上では、培養時間５０時間時点を起点としたときの倍加時間が２０時間であった。培養後、磁石製ピンセットを使用して培地４０から金属製多孔膜２０を取り出し、金属製多孔膜２０に捕捉された細胞をＣＦＤＡ（５（６）－Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｄｉａｃｅｔａｔｅ）溶液で処理して生細胞のみを蛍光染色した。その結果、金属製多孔膜２０に捕捉された細胞の９８％以上が生細胞であることが確認され、活性のある細胞を培養できていることが分かった。
　金属製多孔膜２０を培地４０に一定時間浸した後で取り出した際、金属製多孔膜２０に付着して取り出される培地４０の量は、貫通孔２１の内壁を含む表面積と付着培地の厚みの積でモデル化できる。この培地４０の量は、単位面積当たりの開口率や単位体積当たりの空隙率が同じ樹脂製多孔膜を使用した場合に比べて低減させることができる。樹脂製多孔膜は孔内壁の面積が非常に大きいからである。
（実施の形態２）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態２の細胞培養装置について図８及び図９を用いて説明する。
　図８は、実施の形態２の細胞培養装置１００Ｂの概略構成図を示す。図９は、金属製多孔膜２０ｂの一部を拡大した断面図を示す。
　実施の形態２では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態２においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態２では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図８及び図９に示すように、実施の形態２は、実施の形態１と比べて、金属製多孔膜２０ｂを、磁性体を含む材料で作り、磁石６０によって金属製多孔膜２０ｂを固定している点が異なる。また、実施の形態２は、実施の形態１と比べて、金属製多孔膜２０ｂの表面を金で覆っている点が異なる。
　図８に示すように、細胞培養装置１００Ｂは、培養容器１０と、磁性体を含む金属製多孔膜２０ｂと、金属製多孔膜２０ｂを支持するスペーサ３０と、培養容器１０の底部に配置された磁石６０と、を備える。細胞培養装置１００Ｂは、磁石６０の磁力によって、金属製多孔膜２０ｂをスペーサ３０に固定している。
　金属製多孔膜２０ｂは、外径２９ｍｍである。金属製多孔膜２０ｂの外径以外の寸法は、実施の形態１の金属製多孔膜２０と同じ寸法である。金属製多孔膜２０ｂは、磁性体を含んでいる。磁性体としては、例えば、ニッケル、コバルト、鉄、およびこれらを含む合金等がある。
　図９に示すように、金属製多孔膜２０ｂは、膜表面の濡れ性を向上させるため、表面を厚さ５０ｎｍの金で覆っている。膜表面の濡れ性とは、膜の表面における親水性を意味し、膜内部への液体の染み込みやすさを意味するものではない。金の被覆方法としては、例えば、めっき法、蒸着法がある。
　磁石６０は、培養容器１０の底部外側に配置されている。実施の形態２において、磁石６０は、例えば、ネオジウム磁石を用いている。磁石６０は、培養容器１０の内部の金属製多孔膜２０ｂを磁力によって、培養容器１０の底部に向かって引き寄せる。
　このように、実施の形態２においては、磁石６０の磁力により、磁性体を含む金属製多孔膜２０ｂをスペーサ３０の上面に固定し、培養容器１０の底部と金属製多孔膜２０ｂとの間に空隙を設けている。
［効果］
　実施の形態２に係る細胞培養装置１００Ｂによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｂにおいては、金属製多孔膜２０ｂを、磁性体を含む材料で形成し、磁石６０による磁力によって金属製多孔膜２０ｂを培養容器１０の内部に固定している。このような構成により、培地４０の中に配置されている金属製多孔膜２０ｂが浮力により浮上するのを抑制して、金属製多孔膜２０ｂをスペーサ３０の上面に強固に固定することができる。また、細胞回収工程においては、磁石６０を取り除けば、容易に金属製多孔膜２０ｂを培地４０から取り出すことができるため、取り扱い性が向上する。また、前記培養容器内に固定機構を設けなくて済むために、細胞を効率良く培養できる。
　細胞培養装置１００Ｂにおいては、金属製多孔膜２０ｂを磁石６０の磁力によってスペーサ３０に強固に固定できるため、金属製多孔膜２０ｂと培養容器１０との間に空隙を設けることができる。これにより、培養容器１０内の培地４０を、貫通孔２１を介して効率良く循環させることができる。また、細胞５０が貫通孔２１を通って空隙に移動したことを判別することによって、容易に細胞の移動を判別することができる。
　細胞培養装置１００Ｂにおいては、金属製多孔膜２０ｂの表面を金で覆っている。このような構成により、金属製多孔膜２０ｂの表面の濡れ性が向上するため、細胞５０の親和性が向上する。このため、培養中の細胞５０の生存日数を長くすることができる。
　なお、実施の形態２において、金属製多孔膜２０ｂは、表面全体を金で覆う例について説明したが、これに限定されない。金属製多孔膜２０ｂは、少なくとも一部の表面が金で覆われていればよい。また、表面の材料は金に限定されず、白金、銀、銅などであっても金属製多孔膜の表面の濡れ性が向上するため好ましい。
　実施の形態２において、磁石６０を培養容器１０の底部外側に配置する例について説明したが、これに限定されない。例えば、スペーサ３０を磁石で形成し、スペーサ３０の磁力によって金属製多孔膜２０ｂを固定してもよい。
　実施の形態２において、細胞培養装置１００Ｂがスペーサ３０を備える例について説明したが、これに限定されない。例えば、細胞培養装置１００Ｂは、スペーサ３０を備えていなくてもよい。
（実施例３）
　実施の形態２の細胞培養装置１００Ｂを用いて細胞５０の培養を行う実施例３について説明する。
　実施例３は、培養容器１０の内部に培地４０を投入し、金属製多孔膜２０ｂの第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２との両面を培地４０で満たした状態を形成した。次に、金属製多孔膜２０ｂの第１主面ＰＳ１上に細胞５０（ＨＬ６０細胞）を添加し、温度３７度、二酸化炭素濃度５％の環境下で培養した。細胞５０は浮遊状態で、培地４０の中で第１主面ＰＳ１と接触、解離を繰り返しながら増殖した。また、金属製多孔膜２０ｂの表面を覆う金の効果を検証するため、比較例１として、金で覆われていない金属製多孔膜を用いて、実施例３と同じ条件で細胞５０の培養を行った。
　図１０は、実施例３と比較例１とで細胞の培養を行った場合における細胞生存日数の比較結果を示す。図１０に示すように、比較例１では、細胞５０の生存日数は３日であった。一方、実施例３では、細胞の生存日数は７日であった。このように、金属製多孔膜２０ｂの表面を覆う金によって、細胞の生存日数を延ばすことができた。これは、膜の表面を金で覆うことによって、膜表面の親水性が向上し、細胞との親和性が向上したからであると考えられる。
（実施の形態３）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態３の細胞培養装置について図１１を用いて説明する。
　図１１は、実施の形態３の細胞培養装置１００Ｃの概略構成図を示す。
　実施の形態３では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態３においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態３では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１１に示すように、実施の形態３は、実施の形態１と比べて、培養容器１０ａの側壁を内側に突出する突起部１１を有する点で異なる。また、実施の形態３は、スペーサ３０を備えない点で実施の形態１と異なる。
　培養容器１０ａは、底面から上方の位置に、培養容器１０ａの内壁から中央に向かって突出する円環状の突起部１１を有している。突起部１１は、上面に金属製多孔膜２０を配置することができる程度の寸法に形成されている。実施の形態３において、突起部１１は、底面から２ｍｍ上方に位置し、培養容器１０ａの内壁から中央に向かって５ｍｍ突出している。
　実施の形態３において、金属製多孔膜２０は、突起部１１の上面に配置される。
［効果］
　実施の形態３に係る細胞培養装置１００Ｃによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｃにおいては、培養容器１０ａの底面から上方の位置に、培養容器１０ａの内壁から中央に向かって突出する円環状の突起部１１を有している。このような構成により、スペーサ３０を用いずとも、培養容器１０ａの底部と金属製多孔膜２０との間に空隙を設けることができる。このため、部品数を低減することができる。
　なお、実施の形態３において、突起部１１は、円環状の形状を有する例を説明したが、これに限定されない。突起部１１は、多角形状、四角形状、楕円形状などであってもよい。
（実施の形態４）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態４の細胞培養装置について図１２を用いて説明する。
　図１２は、実施の形態４の細胞培養装置１００Ｄの概略構成図を示す。
　実施の形態４では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態４においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態４では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１２に示すように、実施の形態４は、実施の形態１と比べて、金属製多孔膜２０ｃがスペーサ３０ａを有している点で異なる。
　細胞培養装置１００Ｄは、金属製多孔膜２０ｃの第２主面ＰＳ２に複数のスペーサ３０ａを設けている。複数のスペーサ３０ａは、第２主面ＰＳ２上に等間隔に設けられている。実施の形態４において、スペーサ３０ａは、金属製多孔膜２０ｃと一体で形成されている。
［効果］
　実施の形態４に係る細胞培養装置１００Ｄによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｄにおいては、金属製多孔膜２０ｃの第２主面ＰＳ２にスペーサ３０ａを設けている。このような構成によって、部品点数を減らすことができると共に、金属製多孔膜２０ｃをスペーサ３０ａに強固に固定することができる。また、金属製多孔膜２０ｃとスペーサ３０ａを一体で形成することによって、更に強固に固定することができる。
　細胞培養装置１００Ｄにおいては、金属製多孔膜２０ｃに設けられたスペーサ３０ａによって、金属製多孔膜２０ｃと培養容器１０との間に空隙を設けることができる。これにより、培養容器１０内の培地４０を、貫通孔２１を介して効率良く循環させることができる。また、細胞５０が貫通孔２１を通って空隙に移動したことを判別することによって、細胞の移動を容易に判別することができる。
　なお、実施の形態４において、金属製多孔膜２０ｃは、スペーサ３０ａと一体で形成される例について説明したが、これに限定されない。例えば、金属製多孔膜２０ｃは、スペーサ３０ａを第２主面ＰＳ２に着脱可能に取り付けられる構成であってもよい。
　また、実施の形態４において、複数の金属製多孔膜２０ｃを用いて、細胞５０の培養を行ってもよい。図１３は、変形例の細胞培養装置１００Ｅの概略構成図を示す。図１３に示すように、細胞培養装置１００Ｅは、培養容器１０の中にスペーサ３０ａａを有する第１金属製多孔膜２０ｃａとスペーサ３０ａｂを有する第２金属製多孔膜２０ｃｂとを配置している。細胞培養装置１００Ｅにおいては、培養容器１０の内部に、第１金属製多孔膜２０ｃａを配置し、第１金属製多孔膜２０ｃａの第１主面ＰＳ１上に第２金属製多孔膜２０ｃｂを配置している。このような構成により、一度に多くの細胞５０を培養することができる。
（実施の形態５）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態５の細胞培養装置について図１４を用いて説明する。
　図１４は、実施の形態５の細胞培養装置１００Ｆの概略構成図を示す。
　実施の形態５では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態５においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態５では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１４に示すように、実施の形態５は、実施の形態１と比べて、培養容器１０ｂがスペーサ３０ｂを有している点で異なる。
　細胞培養装置１００Ｆは、培養容器１０ｂの底部に複数のスペーサ３０ｂを設けている。複数のスペーサ３０ｂは、培養容器１０ｂの底部から開口に向かって突設されている。実施の形態１において、スペーサ３０ｂは、培養容器１０ｂと一体で形成されている。
［効果］
　実施の形態５に係る細胞培養装置１００Ｆによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｆにおいては、培養容器１０ｂの底部にスペーサ３０ｂを設けている。このような構成によって、部品点数を減らすことができると共に、培養容器１０ｂとスペーサ３０ｂを強固に固定することができる。また、培養容器１０ｂとスペーサ３０ｂを一体で形成することによって、更に強固に固定することができる。
　細胞培養装置１００Ｆにおいては、培養容器１０ｂに設けられたスペーサ３０ｂによって、金属製多孔膜２０と培養容器１０ｂとの間に空隙を設けることができる。これにより、培養容器１０ｂ内の培地４０を、貫通孔２１を介して効率良く循環させることができる。また、細胞５０が貫通孔２１を通って空隙に移動したことを判別することによって、細胞の移動を容易に判別することができる。
　なお、実施の形態５において、培養容器１０ｂは、スペーサ３０ｂと一体で形成される例について説明したが、これに限定されない。例えば、培養容器１０ｂは、スペーサ３０ｂを底面に着脱可能に取り付けられる構成であってもよい。
（実施の形態６）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態６の細胞培養装置について図１５を用いて説明する。
　図１５は、実施の形態６の細胞培養装置１００Ｇを金属製多孔膜２０の第１主面ＰＳ１側から見た概略構成図を示す。
　実施の形態６では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態６においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態６では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１５に示すように、実施の形態６は、実施の形態１と比べて、スペーサ３０ｃａ、３０ｃｂがリング状に形成されている点で異なる。
　細胞培養装置１００Ｇは、リング状のスペーサ３０ｃａ、３０ｃｂを培養容器１０の底部に配置している。スペーサ３０ｃａは、スペーサ３０ｃｂの内側に設けられている。実施の形態６において、スペーサ３０ｃａは、厚み１００μｍ、内径５ｍｍ、外径８ｍｍのシリコン製環状リングである。スペーサ３０ｃｂは、厚み１００μｍ、内径２０ｍｍ、外径２３ｍｍのシリコン製環状リングである。
［効果］
　実施の形態６に係る細胞培養装置１００Ｇによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｇにおいては、リング状のスペーサ３０ｃａ、３０ｃｂを有している。このような構成により、スペーサ３０ｃａ、３０ｃｂによって金属製多孔膜２０を強固に支持することができる。また、スペーサ３０ｃａ、３０ｃｂでスペーサの内側の空間と外側の空間とを仕切ることができる。このため、これらの仕切られた空間においては、金属製多孔膜２０の貫通孔２１を介してのみ培地４０の移動及び細胞５０の移動が可能となる。このような構成により、例えば、第１主面ＰＳ１から貫通孔２１を通って、スペーサ３０ｃａ、３０ｃｂの内側に移動した細胞５０を集めておくこともできる。
　なお、実施の形態６において、リング状のスペーサ３０ｃａ、３０ｃｂの２つを備える例について説明したが、これに限定されない。細胞培養装置１００Ｇは、例えば、リング状のスペーサを１つ又は複数備える構成であってもよい。
（実施の形態７）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態７の細胞培養装置について図１６を用いて説明する。
　図１６は、実施の形態７の細胞培養装置１００Ｈの概略構成図を示す。
　実施の形態７では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態７においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態７では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１６に示すように、実施の形態７は、実施の形態１と比べて、スペーサ３０ｄの高さを調整し、金属製多孔膜２０を傾斜させている点で異なる。
　細胞培養装置１００Ｈは、側面視において、一端側から他端側へ向かってスペーサ３０ｄの高さを高くしている。細胞培養装置１００Ｈは、金属製多孔膜２０を培養容器１０に対して角度θ２だけ傾斜させて、金属製多孔膜２０の一部を培地４０の外に露出させている。
［効果］
　実施の形態７に係る細胞培養装置１００Ｈによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｈにおいては、スペーサ３０ｄの高さを調整して、金属製多孔膜２０を傾斜させることによって、金属製多孔膜２０の一部を培地４０の外に露出させている。このような構成により、培地４０の外に露出した金属製多孔膜２０の部分が外気に接触するため、金属製多孔膜２０を介して外気の温度を培地４０へ効率良く伝えることができる。また、培地４０を汚染させることなく金属製多孔膜２０を扱うことができる。
　なお、実施の形態７において、金属製多孔膜２０を角度θ２傾斜させて金属製多孔膜２０の他端を培地４０の外に露出させる例について説明したが、これに限定されない。金属製多孔膜２０は、少なくとも一部が培地４０の外に露出していればよい。
（実施の形態８）
［全体構成］
　本発明に係る実施の形態８の細胞培養装置について図１７を用いて説明する。
　図１７は、実施の形態８の細胞培養装置１００Ｉの概略構成図を示す。
　実施の形態８では、主に実施の形態１と異なる点について説明する。実施の形態８においては、実施の形態１と同一又は同等の構成については同じ符号を付して説明する。また、実施の形態８では、実施の形態１と重複する記載は省略する。
　図１７に示すように、実施の形態８は、実施の形態１と比べて、金属製多孔膜２０ｄの一部を、培養容器１０の開口側に向けて折り曲げている点で異なる。
　細胞培養装置１００Ｉは、金属製多孔膜２０ｄの端部を、培養容器１０の開口側に向けて折り曲げている。折り曲げられた金属製多孔膜２０ｄの端部は、培地４０の外に露出する。実施の形態８において、金属製多孔膜２０ｄの端部は、Ｌ字状に折り曲げられている。
［効果］
　実施の形態８に係る細胞培養装置１００Ｉによれば、以下の効果を奏することができる。
　細胞培養装置１００Ｉは、金属製多孔膜２０ｄの一部を折り曲げることによって、金属製多孔膜２０ｄの一部を培地４０の外に露出させている。このような構成により、培地４０の外に露出した金属製多孔膜２０ｄの部分が外気に接触するため、金属製多孔膜２０を介して外気の温度を培地４０へ効率良く伝えることができる。また、培地４０を汚染させることなく金属製多孔膜２０を扱うことができる。
　なお、実施の形態８において、金属製多孔膜２０ｄは、Ｌ字形状に折り曲げて形成されている例について説明したが、これに限定されない。金属製多孔膜２０ｄは、少なくとも一部が培地４０の外側に露出していればよく、任意の角度で折り曲げられていてもよい。
　本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。
　本発明は、例えば、再生医療、細胞治療、創薬、その他の有用物質生産の分野に有用である。より具体的には、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞とフィーダー細胞との共培養、細胞の特定の形態への分化誘導、がん化細胞の選択的除去、培養細胞を用いた薬剤スクリーニング、培養細胞によるバイオ製剤など有用物質生産、がん組織のモデル系および人工組織構築の材料に利用できるスフェロイド細胞塊の調製、培養細胞を用いたバイオリアクター、発酵による連続的な有用物質生産といった用途に利用できる。
　　１０　培養容器
　　１１　突起部
　　２０　金属製多孔膜
　　２１　貫通孔
　　２２　金
　　３０　スペーサ
　　４０　培地
　　５０　細胞
　　６０　磁石
　　ＰＳ１　第１主面
　　ＰＳ２　第２主面

Claims (16)

  1. 　有底の培養容器の内部に複数の貫通孔を有する金属製多孔膜を配置する工程、
    　前記培養容器の内部に培地を供給する工程、
    　前記培養容器の内部に細胞を供給する工程、および
    　前記培地を用いて前記細胞を培養する工程、
    を含む、細胞培養方法。
  2. 　前記細胞を培養する工程は、前記金属製多孔膜における第１主面側の開口と第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通する前記貫通孔を通じて前記培地を前記細胞に供給する工程を含む、請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜と前記培養容器の底部との間に空隙を設けて前記金属製多孔膜を配置する、請求項１または２に記載の細胞培養方法。
  4. 　前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜と前記培養容器の底部との間にスペーサを設けることによって前記空隙を設ける、請求項３に記載の細胞培養方法。
  5. 　前記金属製多孔膜は、磁性体を含み、
    　前記金属製多孔膜を配置する工程は、前記金属製多孔膜を磁力により前記培養容器の内部に配置する、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  6. 　前記金属製多孔膜の表面は金で被覆されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  7. 　培地を用いて細胞を培養する細胞培養装置であって、
    　前記培地と前記細胞とを収容する、有底の培養容器と、
    　前記培養容器の内部に配置した、複数の貫通孔を有する金属製多孔膜と、
    を備える、細胞培養装置。
  8. 　前記金属製多孔膜の前記貫通孔は、前記金属製多孔膜における第１主面側の開口と第２主面側の開口とが連続した壁面を通じて連通する、請求項７に記載の細胞培養装置。
  9. 　前記金属製多孔膜の厚みは、５０ｎｍ以上１００μｍ以下である、請求項７または８に記載の細胞培養装置。
  10. 　前記金属製多孔膜の単位体積当たりにおける空隙率は、１０％以上９０％以下である、請求項７～９のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  11. 　更に、前記培養容器と前記金属製多孔膜との間にスペーサを備える、請求項７～１０のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  12. 　前記金属製多孔膜は、前記培養容器の底部に面する第２主面に前記スペーサを有する、請求項１１に記載の細胞培養装置。
  13. 　前記培養容器は、前記金属製多孔膜の第２主面に面する底部に前記スペーサを有する、請求項１１に記載の細胞培養装置。
  14. 　前記金属製多孔膜は、磁性体を含む、請求項７～１３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  15. 　前記金属製多孔膜の表面は金で被覆されている、請求項７～１４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  16. 　前記金属製多孔膜の第１主面と第２主面の少なくとも一方における前記貫通孔の開口率は、１０％以上である、請求項７～１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
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