WO2006068148A1 - 組換え微生物 - Google Patents

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microorganism
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strain
base sequence
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Takeko Kodama
Keiji Endo
Katsuya Ozaki
Junichi Sekiguchi
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Kao Corp
Shinshu University NUC
Original Assignee
Kao Corp
Shinshu University NUC
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism used for producing a useful protein or polypeptide, and a method for producing a protein or polypeptide.
  • Industrial production of useful substances by microorganisms includes not only foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, but also amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. Has a wide range of uses, and its use has spread to a wide range of fields from foods, medicines, daily necessaries such as detergents, cosmetics, and various ingredients.
  • microorganisms originally have a wide variety of genes to cope with environmental changes in nature, and in industrial production of proteins and the like in which a limited production medium is used. Was not necessarily efficient.
  • microorganisms have a variety of protein-degrading enzymes to decompose proteins and use them as nitrogen and carbon sources, which degrade the target proteins and the like, which is a major obstacle in the production of foreign proteins. It was.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 288909
  • Patent Document 2 Japanese Patent No. 3210315
  • Patent Document 3 Special Table 2001-527401
  • Non-Patent Document 1 J. BacterioL, 158, 411, (1984)
  • Non-Patent Document 2 J. BacterioL, 160, 15, (1984)
  • Non-Patent Document 3 J. BacterioL, 160, 442, (1984)
  • Non-Patent Document 4 Appl. Environ. Microbiol, 68, 3261, (2002)
  • Non-Patent Document 5 Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)
  • the present invention relates to a gene that encodes a heterologous protein or polypeptide as a host using a microorganism in which the Bacillus subtilis acceptance IX gene or a gene corresponding to the gene is deleted or inactivated.
  • a recombinant microorganism into which is introduced is provided.
  • the present invention also provides a method for producing a protein or polypeptide using the recombinant microorganism.
  • FIG. 1 A schematic diagram showing the preparation of a DNA fragment for gene deletion introduction by SOE-PCR and a method for deleting a target gene (substitution with a drug resistance gene) using the DNA fragment. is there.
  • FIG. 2 Schematic illustration of preparation of DNA fragment for gene deletion by SOE-PCR, construction of plasmid for gene deletion introduction using the DNA fragment, and target gene deletion method using the plasmid It is shown.
  • FIG. 3 Welcome 1 ⁇ : Culture supernatant of the lost strain and 9-deficient protease gene deletion strain (Kao9 strain), and the wild-type 168 strain of Bacillus subtilis and 8-fold deletion of protease gene (Kao8 strain) as controls The results of examining the protease activity of the fractions by protease zymogram are shown.
  • FIG.4 Production of amylase-PreS2 fusion protein in the 9-fold protease gene deletion strain (Kao9 strain) and, as a control, the 8-fold protease gene deletion strain (Kao8 strain), were examined by Western blot using an anti-PreS2 antibody. Show the results.
  • FIG.5 Production results of amylase-PreS2 fusion protein of 168 wild-type strains of Bacillus subtilis strain as a control, triple deletion strain (Kao3 strain), as a control, by Western blot using anti-PreS2 antibody Is shown.
  • the present invention creates a host microorganism capable of improving the productivity of a protein or polypeptide, particularly by reducing the amount of proteolytic enzyme produced, and encodes the protein or polypeptide in the host microorganism.
  • the present invention relates to providing a recombinant microorganism obtained by introducing a gene and providing a method for producing a protein or polypeptide using the recombinant microorganism.
  • the present inventors searched for a proteolytic enzyme that acts unnecessary or harmful in the production of useful proteins or polypeptides using microorganisms. It was found in the medium that the enzymes and proteins were degraded during the secretory production of useful enzymes and proteins to reduce their yield.
  • a host microorganism a microorganism strain that lacks or inactivates the Bacillus subtilis acceptance IX gene, the degradation of useful foreign enzymes and proteins can be greatly prevented, and an efficient enzyme protein Found that production of [0012] If the recombinant microorganism of the present invention is used, the target protein or polypeptide can be prevented from being decomposed, and these can be efficiently produced in large quantities.
  • the identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985). More specifically, genetic information. It is calculated by analyzing the unit size to compare (ktup) as 2 using the search homology program of the processing software Genetyx-Win (software development).
  • Host microorganisms for constructing the microorganism of the present invention include the Bacillus subtilis ⁇ IX gene (Nature, 390, 249-256, (1997), and JAFAN: Japan. Functi onal Analysis Network for Bacillus subtilis (BS ⁇ RF DB, http://bacillus.genome.ad.jp 8 update on June 17, 2003) or a gene corresponding to the gene They are desirable and they can be wild type or mutated. Specific examples include Bacillus bacteria such as Bacillus, Clostridium bacteria, and yeasts, with Bacillus bacteria being particularly preferred. Furthermore, Bacillus subtilis is particularly preferred because it has been clarified in whole genome information, has established genetic engineering and genome engineering technology, and has the ability to secrete and produce proteins and extracellularly.
  • the gene to be deleted or inactivated is reported to encode the putative serine protease AprX in Bacillus subtilis, aElX gene (Microbiology, 14 5, 3121, ( 1999), gene number BG12567 (Nature, 390, 249-256, (1997)) and JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB, http: //bacillus.genome.ad.jp8 June 17, 2003 Update)), or a gene corresponding to the gene.
  • the gene corresponding to the gene has the same function as that of the Bacillus subtilis gene, or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% in the reception gene and nucleotide sequence.
  • genes derived from other microorganisms preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus, having an identity of 98% or more, and specific examples include the BH1930 gene (aprX gene) of Bacillus halodurans. ) And Oceanobadllus ihe ygn2k OB2375 gene.
  • another DNA fragment is inserted into the above gene, or the residue
  • This can also be achieved by inactivating the target gene by methods such as transcription of the gene and mutation in the translation initiation control region, but preferably a method of physically deleting the target gene is used. More desirable.
  • the gene to be deleted or inactivated may be other proteases known to be secreted extracellularly or bound to the cell surface layer.
  • One or more gene deletions that encode a class may be combined.
  • the construction of the microorganism of the present invention can be combined with deletion or inactivation of a gene group other than the protease in the cell, which is expected to have a greater effect on productivity improvement. Bacillus subtilis reception IX gene or a.
  • Table 1 shows the genes that are expected to be effective. In this case, one or more genes selected from the nine genes corresponding to the valleys of ipr or aprE. NprB, nprE, bpr. It is preferably lost or inactivated.
  • the am £ and nm £ genes that encode the major extracellular alkaline protease AprE and the neutral protease NprE, respectively, or the three genes corresponding to the gene are deleted or inactive.
  • the target gene group can also be deleted or inactivated by conducting random gene deletions or inactive mutations followed by protein productivity assessment and gene analysis using appropriate methods. can do.
  • the genome is constructed by incorporating it into the parent microorganism cell and causing homologous recombination twice in the two regions outside the target gene mutation site of the parent microorganism genome or two regions outside the target gene. It is possible to replace the above target gene with a deleted or inactivated gene fragment.
  • a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid is introduced into the parent microbial cell, and homologous recombination in a part of the target gene. It is also possible to inactivate by disrupting the target gene on the parental microbial genome.
  • a method of causing homologous recombination similar to the above-described method using a randomly cloned DNA fragment, or a method such as a method of causing parental microorganisms to be stranded It can also be carried out by irradiation.
  • the deletion-introducing DNA fragment used in this method is about 0.
  • a drug resistance marker gene fragment is inserted between a 2-3 kb fragment and an approximately 0.2-3 kb fragment adjacent to the downstream side.
  • the upstream fragment and downstream fragment of the deletion target gene and three fragments of the drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR.
  • the drug resistance marker gene is inserted at the downstream end of the upstream fragment.
  • the three types of PCR fragments prepared in the first round were used as a saddle shape, and the second round PCR was performed using the upstream primer of the upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment, whereby the upstream fragment In the drug resistance marker gene sequence added to the downstream end and the upstream end of the downstream fragment, annealing with the drug resistance marker gene fragment occurs, and as a result of PCR amplification, the drug resistance marker is inserted between the upstream fragment and the downstream fragment. DNA fragments with the marker gene inserted can be obtained (Fig. 1).
  • a spectinomycin resistance gene is used as a drug resistance marker gene, for example, using the primer set shown in Table 2 and an appropriate vertical DNA, Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) etc. Using enzyme kits, etc., under normal conditions shown in the book (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWnite, Humana Press, pp251 (1993), Gene, 77,61, (1989), etc.) By performing SOE-PCR, DNA fragments for deletion introduction of each gene can be obtained.
  • the DNA fragment for introduction of deletion obtained by force was transformed into a competent cell transformation method (J. Bacterio 1.93, 1925 (1967)) etc., the gene recombination occurs in the cell in the upstream and downstream homologous regions of the identical deletion target gene, and the target gene becomes a drug resistance gene.
  • Replaced cells can be isolated by selection with drug resistance markers ( Figure 1). That is, when the deletion-introduced DNA fragment prepared using the primer set shown in Table 2 is introduced, the mouthpiece that grows on the agar medium containing spectinomycin is isolated and the target gene is deleted. Then, it can be confirmed by a PCR method using the genome as a cage, that it has been replaced with a spectinomycin resistance gene.
  • a deletion-introducing DNA fragment prepared by SOE-PCR method was inserted.
  • a two-step single crossover method using a deletion-introducing plasmid can also be used. The method will be described below.
  • the deletion-introducing DNA fragment used in the present method is about 0.
  • DNA fragment in which 2 to 3 kb fragments, and about 0.2 to 3 kb fragments adjacent downstream are bound is a DNA fragment in which 2 to 3 kb fragments, and about 0.2 to 3 kb fragments adjacent downstream are bound.
  • a DNA fragment in which a drug resistance marker gene fragment such as a chloramfecole resistance gene is bound downstream or upstream of the DNA fragment can also be used.
  • the first PCR prepares the upstream and downstream fragments of the deletion target gene, and if necessary, three fragments of the drug resistance marker gene fragment. At this time, the ends of the DNA fragments to be bound are prepared. Primers with a 10 to 30 base pair sequence added are used.
  • each PCR fragment prepared in the first round is mixed to form a saddle, and the second round of PCR is performed using a pair of primers that are the most upstream and the most downstream in the target binding fragment, respectively.
  • the desired DNA fragment for introducing a deletion can be prepared.
  • a second PCR is performed using an upstream primer of the upstream fragment and a downstream primer of the drug resistance marker gene fragment.
  • the deletion-introducing DNA fragment obtained by the above-described method or the like is not amplified in a host bacterium using a normal restriction enzyme and DNA ligase, and can be easily used as a plasmid DNA or a temperature-sensitive plasmid.
  • a deletion-introducing plasmid is constructed by inserting the plasmid DNA into a removable plasmid DNA.
  • Examples of plasmid DNA that is not amplified in the host fungus include, but are not limited to, for example, pUC18, pUC118, and pBR322 when Bacillus subtilis is used as the host.
  • an upstream fragment or a downstream fragment inserted into the plasmid after transformation of the host bacterium with the plasmid for introducing the deletion is performed by a combinatorial cell transformation method (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)) or the like.
  • a homologous recombination between the homologous region on the genome and the homologous region of the genome yields a transformant in which the deletion plasmid is fused into the host bacterial genomic DNA (Fig. 2).
  • drug resistance by a single gene such as the chloramphee-chol resistance gene of the plasmid for introduction of deletion may be used as an index.
  • the sequence of the upstream region and downstream region of the gene to be deleted such as the receptor IX gene or the gene corresponding to the receptor IX gene, Duplicates exist from the bacterial genome and the deletion-introducing plasmid!
  • the upstream region or downstream region by introducing homologous recombination in the genome in a region different from the region homologous recombination at the time of obtaining the transformant, deletion introduction including a drug resistance marker gene is performed.
  • deletion of the target gene such as the acceptor gene or the gene corresponding to the acceptor gene occurs (Fig. 2).
  • Examples of the method for causing homologous recombination in the genome include the method of inducing competence (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)). Spontaneously induced even during cultivation in a normal medium. Homologous recombination occurs. Strains that have undergone homologous recombination within the genome as intended can be selected from bacterial strains that have become drug-sensitive because the drug resistance marker gene is lost at the same time and the drug resistance is lost. These strains are also extracted using genomic DNA and PCR. To confirm the deletion of the target gene.
  • a resistance gene for a drug that acts bacteriostatically on the host cell such as chloramfecole
  • a resistant strain carrying the drug resistance gene can grow, and a susceptible strain lacking the drug resistance gene cannot grow or die.
  • penicillin antibiotics such as ampicillin
  • the resistant strains to be killed are killed, while the susceptible strains are affected by ampicillin and the like.
  • the proportion of susceptible strains increases.
  • a sensitive strain can be selected efficiently by smearing and culturing the culture solution after concentration in this manner on an appropriate agar medium, and confirming the presence or absence of resistance to the marker drug of the colonies that appear by replica method etc. Is possible.
  • the target protein or polypeptide produced using the microorganism of the present invention includes, for example, various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, diagnostics, and proteins such as physiologically active factors. And polypeptides.
  • industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, diagnostics, and proteins such as physiologically active factors.
  • polypeptides include, for example, various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, diagnostics, and proteins such as physiologically active factors. And polypeptides.
  • the functions of industrial enzymes are categorized into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomeric enzyme (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase). / Synthetase) etc.
  • Preferred examples include genes of hydrolases such as cellula
  • cellulases belonging to family 5 are listed in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309 (1991)), among which cellulases derived from microorganisms, particularly from Bacillus bacteria. .
  • Examples include alkaline cellulase having an acid sequence, and further, 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of the amino acid sequence.
  • An example is cellulase consisting of an amino acid sequence.
  • a amylase derived from a microorganism can be mentioned, and a liquid amylase derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus is particularly preferable.
  • an alkaline amylase derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus having the amino acid sequence ability represented by SEQ ID NO: 61, or 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% from the amino acid sequence.
  • proteases include serine proteases derived from microorganisms, particularly serine proteases derived from batinoles bacteria.
  • the protein produced by the present invention include physiologically active proteins and enzymes derived from higher organisms such as humans, etc.
  • Preferred examples include interferon Q ;, interferon / 3, Examples include growth hormone, salivary gland amylase, etc.
  • a part of the domain constituting a physiologically active protein can also be expressed, such as the antigen recognition domain pre S2 of human hepatitis C virus antibody. Can be mentioned.
  • the target protein or polypeptide gene has upstream a control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a ribosome binding site, and an initiation codon. It is desirable that one or more selected regions including a translation initiation control region and a secretory signal peptide region are combined in a proper form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretory signal region are combined, and that the secretory signal peptide region is a batch.
  • KSM-S237 strain (April 14, 2003, Tsukuba, Ibaraki, Japan, 305-8566) East 1-chome 1 1 Chuo 6th, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center, deposited as FERM BP-7875), KSM-64 (April 14, 2003, 305-8566 Japan) 1st, 1st, Tsukuba, Higashi, Ibaraki Pref. 6th Central, Deposited as FERM BP-2886 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) It is desirable that the secretory signal peptide region is properly bound to the structural gene of the target protein or polypeptide.
  • a DNA fragment comprising a nucleotide sequence having an identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more, or the above DNA fragment strength consisting of a base sequence in which a part of the base sequence is deleted. It is desirable that the DNA is properly bound to the structural gene of the target protein or polypeptide.
  • a DNA fragment consisting of a base sequence from which a part of the above base sequence has been deleted is a part of the above base sequence that has been deleted, but functions related to gene transcription, translation, and differentiation. It means a DNA fragment that holds and holds.
  • the recombinant plasmid of the present invention can be obtained by incorporating a recombinant plasmid obtained by binding a DNA fragment containing the above target protein or polypeptide gene and an appropriate plasmid vector into a host microorganism cell by a general transformation method. Microorganisms can be obtained. In addition, the recombinant microorganism of the present invention can also be obtained by using a DNA fragment in which an appropriate homologous region with the host microorganism genome is bound to the DNA fragment and directly integrating it into the host microorganism genome.
  • Production of the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention involves inoculating the strain with a medium containing an anabolic carbon source, nitrogen source and other essential components, Culture may be performed by microbial culture, and after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified.
  • the composition of the medium is not particularly limited. Preferably, better results can be obtained by using a medium containing maltose or maltooligosaccharide as a carbon source.
  • a host microbial mutant strain in which one or more genes selected from one of the Bacillus subtilis genes shown in Table 1 or a gene corresponding to the gene have been deleted or inactivated , And the mutant strain can be used to construct a recombinant microorganism, and by using this, a useful protein or polypeptide can be efficiently produced.
  • 168 strains of Bacillus subtilis Use the extracted genomic DNA as a saddle type, and use the eprRvl and eprUpr, and eprDNf and eprrv-r-marked primer sets shown in Table 2 to flank the SE £ gene upstream of the genome.
  • a 0.6 kb fragment (A) and a 0.5 kb fragment (B) adjacent downstream were prepared.
  • the mril gene derived from plasmid pUB110 (Plasmid 15, 93 (1986)) is upstream of the chloramphenicol resistance gene derived from plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)).
  • a 1.2 kb fragment (C) ligated with the promoter region (Nucleic Acids Res. 17, 4410 (1989)) was prepared.
  • the obtained (A) (B) (C) 3 fragments were mixed to form a cage, and SOE-PCR using the primers epri 2 and Cmrv2 in Table 2 was performed to obtain 3 fragments (A) (B)
  • the DNA fragments were combined in the order of (C) to obtain a 2.2 kb DNA fragment (see Fig. 2).
  • the ends of this DNA fragment were blunted and 5--phosphorylated and inserted into the restriction enzyme site of plasmid pUC118 (Methods Enzymol.
  • the 1.2 kb fragment (C) is an o.4 kb fragment (D) containing the repUl and repUr-Cm primer sets (Table 2) and the en gene promoter region prepared using plasmid pUBiio as a cage.
  • D o.4 kb fragment
  • E 0.8 kb fragment
  • the plasmid pUC118-Cmr A epr for gEE gene deletion constructed in Example 1 was introduced into Bacillus subtilis 168 strain by the combinatorial cell transformation method (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967)), and the upstream region of the gene, Alternatively, a transformant fused with genomic DNA by homologous recombination between the corresponding regions in the downstream region was obtained using chloramfecol resistance as an index. The obtained transformant is inoculated into LB medium, cultured at 37 ° C for 2 hours, and then subjected to the competence induction operation, so that the upstream region of the SEE gene that exists redundantly on the genome, or Intragenomic homologous recombination was induced between the downstream regions.
  • ampicillin enrichment was performed as follows. The culture solution after induction of the competent cell was inoculated to 1 mL of LB medium containing 5 ppm final concentration of chloramphecoal and final lOOppm ampicillin sodium so that the turbidity (OD600) at 600 nm was 0.003.
  • deletion of ⁇ gene was performed in the same manner as ⁇ EI gene deletion as the next deletion. That is, the gene deletion plasmid PUC118-C mr AwprA was constructed in the same manner as in Example 1, and the gEE gene was obtained by introducing the constructed plasmid into the genomic DNA and subsequent deletion of the ⁇ ⁇ gene by homologous recombination in the genome. And a double deletion strain of 5 ⁇ gene. By repeating the same procedure thereafter, the mm :, nprB. EE, I £, heavy, and SElE genes were deleted in sequence, and finally the protease 8-fold deletion strain in which 8 types of protease genes were deleted. And was named Kao8 strain.
  • the primer sequences used for each deletion are shown in Table 2, and the correspondence between each primer and the primer used for gene deletion shown in Example 1 is shown in Table 3.
  • Example 4 Construction of a IX gene deletion strain (replacement with a betatinomycin resistance gene)
  • the spectinomycin-resistant gene region was excised from the BamHI and Xhol restriction enzyme cleavage points of plasmid pDG1727 (Gene, 167, 335, (1995)), and ⁇ lHI and 20 ⁇ 1 restriction were made in pBluescript II SK (+) (Stratagene).
  • PBlueSPR was constructed by inserting at the enzyme cleavage point.
  • the Spectinomycin resistance gene region was amplified using the PBlueSPR DNA as a saddle and the primer sets PB-M13-20 and PB-M13Rev (Table 1) (H).
  • DNA fragments of (F), (G), and (H) were converted into DNA fragments and bound in the order of (E) (H) (G) by SOE-PCR using aprX + 5F and aprX + 1320R primer sets.
  • the prepared DNA fragment was prepared.
  • 168 strains of Bacillus subtilis were transformed by the competent cell transformation method, and colonies grown on LB agar medium containing spectinomycin (100 ⁇ g / mL) were isolated as transformants.
  • the genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed by PCR that the ⁇ IX gene was deleted and replaced with a spectinomycin resistance gene.
  • a strain lacking the Bacillus subtilis reception IX gene was constructed and named ⁇ aprX (Sp) strain.
  • Example 5 Construction of a 9-fold deletion strain of protease gene containing a deletion gene
  • Example 6 Protease zymogram analysis of 9-deficient protease gene containing IX gene deletion
  • Example 15 After culturing each gene deletion strain obtained in Example 15 and Bacillus subtilis 168 strain as a control for 100 hours, the culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was diluted with 1 X sample buffer (62 Sample of protease zymogram solubilized to 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 5% sucrose, 0.002% BPB (Bromophenol blue)) It was.
  • 1 X sample buffer 62 Sample of protease zymogram solubilized to 5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 5% sucrose, 0.002% BPB (Bromophenol blue)
  • the bacterial strain obtained in this way was cultured with shaking in 5 mL of LB medium at 30 ° C overnight, and 0.03 mL of this culture was added to 30 mL of 2xL-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-pentahydrate, 15 ppm tetracycline), followed by shaking culture at 30 ° C. for 4 days. After culturing, the cells were removed by centrifugation, and the alkaline cellulase activity of the culture supernatant was measured, and the amount of alkaline cellulase secreted and produced outside the cells by culturing was determined.
  • 2xL-maltose medium 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-pentahydrate, 15 ppm tetracycline
  • Recombinant plasmid pTUBE52-preS2 (165 bp) inserted with a DNA fragment (165 bp) ligated to the human hepatitis B virus antigen recognition PreS2 domain downstream of the N-terminal 522 amino acid coding region of the amylase gene derived from Bacillus subtilis Appl. Microbiol. BiotechnoL, 40, 341 (1993)) was introduced into the Kao8 and Kao9 strains obtained in Examples 3 and 5 by a conventional competent cell transformation method.
  • the obtained transformed strain was cultured overnight at 30 ° C with shaking, and 0.03 mL of this culture was added to 30 mL of 2xL-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) and shaking culture at 30 ° C for 100 hours.
  • 2xL-maltose medium 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline
  • the amount of amylase-PreS2 protein in the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was determined by Western plot analysis using an anti-PreS2 antibody (Special Immunology Laboratories).
  • the culture supernatant can be made into IX sample buffer (62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 5% sucrose, 0.002% BPB (Bromophenol blue)). 7% after solubilization and 10% SDS-PAGE, blotting was performed on PVDF (polyvinyl difluonaine membrane: Immobilon; 0.45 ⁇ m pore size; Millipor e). An anti-preS2 antibody (Hyb-5520: Special Immunology Laboratory Inc.) was used as the primary antibody. Use a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (Amersham Pharmacia biotech) as a secondary antibody.
  • IX sample buffer 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 5% 2-mercaptoethanol, 2% SDS, 5% sucrose, 0.002% BPB (Bromophenol blue)
  • PVDF polyvinyl difluonaine membrane: Immobilon; 0.45 ⁇ m
  • a microorganism was constructed in which a total of three protease genes including the acceptor IX gene were deleted. Construction of plasmid pUC118-Cmr A aprE for deletion of sm £ gene in the same manner as in Examples 1 and 2, and introduction of the constructed plasmid into Bacillus subtilis 168 strain genomic DNA followed by homologous recombination in the genome. A single deletion strain of the accepting IE gene was obtained.
  • a protease gene triple deletion strain in which the three genes aprE, nprE, and aprX were deleted was constructed in the same manner as in Example 3, and named Kao3 strain.
  • Table 3 shows the correspondence between the primers used when deleting the IX gene in the construction of the Kao3 strain and the primers used when deleting other protease genes.
  • the plasmid pRUBE52-preS2 for amylase-PreS2 production was introduced into the Kao3 strain obtained in Example 9 and 168 strains of Bacillus subtilis as a control by a conventional combinatorial cell transformation method.
  • the obtained transformed strain is shaken overnight at 30 ° C, and further Inoculate 30 mL of 2xL-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) Then, shaking culture was performed at 30 ° C for 25 hours.
  • 2xL-maltose medium 2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline
  • amylase-PreS2 protein in the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was determined by Western plot analysis using an anti-PreS2 antibody (Special Immunology Research Institute, Inc.). As shown in Fig. 5, a strong amylase-PreS2 band detected in the control gene 168 (wild type) was detected in the protease gene triple deletion strain, and amylase-PreS2 productivity was detected. Improvement was confirmed.

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Abstract

　タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物、これにタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法の提供。 　枯草菌のaprX遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、及び当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。

Description

明 細 書
組換え微生物
技術分野
[0001] 本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる微生物、及びタンパ ク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
背景技術
[0002] 微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品 類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク 質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、 化粧品等の日用品、或いは各種ィ匕成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている
[0003] こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要 な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の 育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展によ り、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになって おり、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（ Bacillus subtilis) Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と 認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。
[0004] し力しながら、微生物は元来、自然界における環境変化に対応するための多種多 様な遺伝子群を有しており、限定された生産培地が使用されるタンパク質等の工業 的生産においては、必ずしも効率的であるとは言えない状況であった。特に、微生物 はタンパク質を分解して窒素及び炭素源として利用するために多種のタンパク質分 解酵素を持っており、これらが目的のタンパク質等を分解し、外来タンパク質等の生 産において大きな障害になっていた。
[0005] こうしたタンパク質分解酵素（プロテアーゼ、ぺプチダーゼなど）の遺伝子を欠損さ せることによって、生産される目的タンパク質の分解を防ぐ試みは古くから行われて おり、特に枯草菌においては、主要な細胞外アルカリプロテアーゼである AprE、或い は中性プロテアーゼである NprEをコードする遺伝子、或いはそれら両遺伝子の欠損 (非特許文献 1、 2及び 3参照)を初めとして、計 8種類 (後記表 1参照)の細胞外や細 胞壁結合型のプロテアーゼ、ぺプチダーゼの遺伝子につ!、て遺伝子欠損微生物、 更にはこれら 8種類のプロテアーゼ、ぺプチダーゼの遺伝子が全て欠損した枯草菌 株の報告例も知られていた (非特許文献 4参照)。しカゝしながら、これら 8種類のタンパ ク質分解酵素遺伝子を欠損させた微生物菌株にぉ ヽても培養液中にタンパク質分 解酵素の活性が認められ、 目的タンパク質の分解が引き起こされていることが本発明 者らの解析等によって明らかにされた。このため、原因となるタンパク質分解酵素及 びその遺伝子の特定が望まれて ヽた。
[0006] 枯草菌の aElX遺伝子は、推定菌体内のセリンプロテアーゼ AprXをコードするものと して報告されている (非特許文献 5参照)が、この AprXが培地中に存在して、有用酵 素やタンパク質の分泌生産時に、当該酵素、タンパク質を分解してそれらの収量を 低下させることにつ ヽては全く報告されて 、な 、。
特許文献 1：特許第 288909号公報
特許文献 2 :特許第 3210315号公報
特許文献 3：特表 2001— 527401号公報
非特許文献 1 :J. BacterioL, 158, 411, (1984)
非特許文献 2 : J. BacterioL, 160, 15, (1984)
非特許文献 3 : J. BacterioL, 160, 442, (1984)
非特許文献 4 :Appl. Environ. Microbiol, 68, 3261, (2002)
非特許文献 5 : Microbiology, 145, 3121-3127, (1999)
発明の開示
[0007] 本発明は、枯草菌の迎 IX遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又 は不活性ィ匕させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコ ードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。
[0008] また本発明は、当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方 法を提供するものである。
図面の簡単な説明 [0009] [図 l]SOE-PCRによる遺伝子欠失導入用 DNA断片の調製、及び当該 DNA断片を用 いて標的遺伝子を欠失 (薬剤耐性遺伝子と置換)させる方法を模式的に示したもの である。
[図 2]SOE-PCRによる遺伝子欠失用 DNA断片の調製、当該 DNA断片を用いた遺伝 子欠失導入用プラスミドの構築、及び当該プラスミドを用いた標的遺伝子の欠失方 法を模式的に示したものである。
[図 3]迎 1 ^：失株及びプロテアーゼ遺伝子 9重欠失株 (Kao9株）、対照として、枯草菌 の野生型の 168株及びプロテアーゼ遺伝子 8重欠失株 (Kao8株）の培養上清画分の プロテアーゼ活性をプロテアーゼザィモグラムにより調べた結果を示している。
[図 4]プロテアーゼ遺伝子 9重欠失株 (Kao9株）、対照として、プロテアーゼ遺伝子 8重 欠失株（Kao8株）のアミラーゼ- PreS2融合タンパク質の生産量を抗 PreS2抗体を用い たウェスタンブロットにより調べた結果を示して 、る。
[図 5]プロテアーゼ遺伝子 3重欠失株 (Kao3株）、対照として、枯草菌の野生型の 168 株のアミラーゼ- PreS2融合タンパク質の生産量を抗 PreS2抗体を用いたウェスタンブ ロットにより調べた結果を示している。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明は、特にタンパク質分解酵素の生産量を低減化することにより、タンパク質 又はポリペプチドの生産性向上を可能とする宿主微生物を作成し、当該宿主微生物 にタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入して得られる組換え微生物 を提供すること、並びに当該組換え微生物を用いたタンパク質又はポリペプチドの製 造法を提供することに関する。
[0011] 本発明者らは、微生物を用いて有用なタンパク質又はポリペプチドの生産する場合 に不要或いは有害な働きをするタンパク質分解酵素を探索したところ、枯草菌の推 定菌体内セリンプロテアーゼ AprX力 培地中に存在して、有用酵素やタンパク質の 分泌生産時に、当該酵素、タンパク質を分解してそれらの収量を低下させることを見 出した。そして、枯草菌の迎 IX遺伝子を欠失又は不活性ィ匕した微生物菌株を宿主微 生物として用いることにより、外来の有用酵素やタンパク質の分解を大幅に防ぐことが でき、効率的な酵素'タンパク質の生産が可能になることを見出した。 [0012] 本発明の組換え微生物を用いれば、目的タンパク質又はポリペプチドの分解を防 ぐことができ、これらを効率よく大量に生産することができる。
[0013] 本発明にお!/、て、アミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、 Lipman- Pearson法（Scie nce,227, 1435, (1985》によって計算される。より具体的には、遺伝情報処理ソフトゥェ ァ Genetyx- Win (ソフトウェア開発）のホモロジ一解析 (Search homology)プログラムを 用いて、 Unit size to compare (ktup)を 2として解析を行うことにより算出される。
[0014] 本発明の微生物を構築するための宿主微生物（以下、「親微生物」ともいう）として は、枯草菌の^ IX遺伝子（Nature, 390, 249-256, (1997)、及び JAFAN: Japan Functi onal Analysis Network for Bacillus subtilis(BS〇RF DB、 http://bacillus.genome.ad.jp 八 2003年 6月 17日更新)に於ける遺伝子番号 BG12567)、又は当該遺伝子に相当 する遺伝子を有するものが望ましぐまたこれらは、野生型のものでも変異を施したも のでものよい。具体的には、枯苣菌などのバチルス (Bacillus)属細菌や、クロストリジゥ ム (Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス属細菌が好まし い。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されて いる点、またタンパク質と菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌 が好ましい。
[0015] 本発明にお ヽて欠失又は不活性化の対象となる遺伝子は、枯草菌の推定菌体内 セリンプロテアーゼ AprXをコードすることが報告された aElX遺伝子（Microbiology, 14 5, 3121, (1999)、遺伝子番号 BG12567 (Nature, 390, 249-256, (1997)及び JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB、 http://bacillus. genome.ad.jp八 2003年 6月 17日更新)）、又は当該遺伝子に相当する遺伝子である。
[0016] 遺伝子に相当する遺伝子としては、枯草菌の 遺伝子と同じ機能を有する 、又は迎 遺伝子と塩基配列において 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましく は 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有する 、他の微生物由来、好ましくはバチルス属細菌由来の遺伝子が挙げられ、具体的な 例としては、 Bacillus haloduransの BH1930遣伝子 (aprX遣伝子)や Oceanobadllus ihe ygn2kの OB2375遺伝子などが挙げられる。
[0017] 本発明においては、上記の遺伝子内に他の DNA断片を挿入する、或いは当該遺 伝子の転写，翻訳開始制御領域に変異を与える等の方法によって目的遺伝子を不 活性ィ匕することによつても達成できるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させ る方法がより望ましい。
[0018] また、欠失又は不活性化させる遺伝子は迎 ι 遺伝子又は迎 IX遺伝子に相当する 遺伝子に加え、細胞外に分泌又は細胞表層に結合していることが知られる他のプロ テア一ゼ類をコードする 1以上の遺伝子欠失を組み合わせても良い。更に本発明の 微生物の構築には、細胞内のプロテアーゼゃプロテアーゼ以外の遺伝子群の欠失 又は不活性ィヒを組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果 が期待される。枯草菌の迎 IX遺伝子又は当該 a。rX遣伝子に相当する遺伝子以外の 細胞外に分泌又は細胞表層に結合して 、るプロテアーゼをコードする遺伝子であつ て、 遺伝子又は 遺伝子に相当する遺伝子と組み合わせて欠失又は不活性 化させることにより効果が期待される遺伝子を表 1に記載した。この場合、 遺伝 子にカ卩 て、 aprE. nprB、 nprE、 bpr.道、 mpr、 epr及び wprAの谷 iwfe子又は当き 伝子に相当する 9種類の遺伝子より選ばれる 1以上の遺伝子を欠失又は不活性化さ せるのが好ましい。また aElX遺伝子に加えて、主要な細胞外アルカリプロテアーゼで ある AprE及び中性プロテアーゼである NprEをそれぞれコードする am£及び nm£遺伝 子又は当該遺伝子に相当する 3種類の遺伝子を欠失又は不活性化させることがより 好まし \、更に fesElX遺 fe十にカロ て、 prE. nprB、 nprE、 bpr. vpr、 mpr、 epr ^ wp の各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する 9種類の遺伝子の全てを欠失又 は不活性化させるのが特に好まし ヽ。
[0019] [表 1]
遺伝子名 遺伝子番号 遺伝子機能等
aprE BG10190 セリンアルカリプロテア一ゼ （subt i l is in E) nprB BG10691 細胞外中性プロテアーゼ B
nprE BG10448 細胞外中性金属プロテアーゼ
醒 BG10690 細胞外金属プロテアーゼ
bpr BG10233 バシロぺプチダーゼ F
epr BG10561 マイナー細胞外セリンプロテアーゼ
vpr BG10591 マイナー細胞外セリンプロテアーゼ
wprA BG11846 細胞壁結合型プロテアーゼ前駆体 (CWBP23, CWBP52)
[0020] 遺伝子群の欠失又は不活性ィ匕の手順としては、 遺伝子又は 遺伝子に相 当する遺伝子、更には表 1に示したプロテアーゼ遺伝子を計画的に欠失又は不活性 化させる方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性ィ匕変異を与えた後、適当 な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行うことによつても、目的遺 伝子群を欠失又は不活性化することができる。
[0021] 標的遺伝子の欠失又は不活性ィ匕には、例えば相同組換えによる方法を用いれば よい。すなわち、塩基置換や塩基挿入等によって不活性化変異を導入した標的遺伝 子、又は標的遺伝子の外側領域を含むが標的遺伝子を含まな!/ヽ直鎖状の DNA断片 等を PCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物 ゲノムの標的遺伝子変異部位の外側 2ケ所領域、又は標的遺伝子外側 2ケ所の領域 で 2回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或い は不活性化させた遺伝子断片と置換することが可能である。或いは、標的遺伝子の 一部を含む DNA断片を適当なプラスミドにクローユングして得られる環状の組換えプ ラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換 えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断することによって不活性ィ匕すること も可能である。
[0022] 特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同 組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性ィ匕させる方法については、既にいくつか の報告例があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990)等）、こうした方法を繰り返すこと によって、本発明の宿主微生物を得ることができる。
[0023] また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性ィ匕についてもランダムにクローユングし た DNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物 に Ί線等を照射すること等によっても実施可能である。
[0024] 以下、より具体的に SOE (splicing by overlap extension)- PCR法（Gene, 77, 61, (19 89))によって調製される欠失導入用 DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法 について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものでは ない。
[0025] 本方法で用いる欠失導入用 DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約 0.
2〜3kb断片と、同じく下流に隣接する約 0.2〜3kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺 伝子断片を挿入した断片である。まず、 1回目の PCRによって、欠失対象遺伝子の上 流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の 3断片を調製するが 、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側 10〜3 0塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側 10 〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図 1)。
[0026] 次 、で、 1回目に調製した 3種類の PCR断片を铸型とし、上流断片の上流側プライ マーと下流断片の下流側プライマーを用いて 2回目の PCRを行うことによって、上流 断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配 列において、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニーリングが生じ、 PCR増幅の結 果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子が挿入した DNA断 片を得ることができる（図 1)。
[0027] 薬剤耐性マーカー遺伝子として、スぺクチノマイシン耐性遺伝子を用いる場合、例 えば表 2に示したプライマーセットと適当な铸型 DNAを用い、 Pyrobest DNAポリメーラ ーゼ（宝酒造）などの一般の PCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Cur rent Methods and Applications, Edited by B.A.Wnite, Humana Press, pp251 (1993) 、 Gene, 77,61, (1989)等）に示される通常の条件により SOE-PCRを行うことによって、 各遺伝子の欠失導入用 DNA断片が得られる。
[0028] 力べして得られた欠失導入用 DNA断片を、コンビテントセル形質転換法 (J. Bacterio 1.93, 1925 (1967))等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の 上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が 薬剤耐性遺伝子と置換した細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離するこ とができる（図 1)。即ち、表 2に示したプライマーセットを用いて調製した欠失導入用 DNA断片を導入した場合、スぺクチノマイシンを含む寒天培地上に生育するコ口- 一を分離し、目的の遺伝子が欠失してスぺクチノマイシン耐性遺伝子と置換している ことを、ゲノムを铸型とした PCR法などによって確認すれば良 、。
[0029] また、本発明に於ける迎 遺伝子又は迎 Ι 遺伝子に相当する遺伝子を含むプロテ ァーゼ遺伝子の欠失方法としては、 SOE-PCR法によって調製される欠失導入用 DN A断片を挿入した欠失導入用プラスミドを用いた 2段階の 1重交差法を用いることもで きる。以下、その方法について説明する。
[0030] 本方法で用いる欠失導入用 DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約 0.
2〜3kb断片、同じく下流に隣接する約 0.2〜3kb断片が結合した DNA断片である。ま た当該 DNA断片の下流或いは上流にクロラムフエ-コール耐性遺伝子などの薬剤耐 性マーカー遺伝子断片を結合させた DNA断片を用いることもできる。まず、 1回目の PCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに必要に応じて薬 剤耐性マーカー遺伝子断片の 3断片を調製するが、この際、結合対象となる DNA断 片の末端 10〜30塩基対の配列を付加したプライマーを用いる。例えば、上流断片、 下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させる場合、上流断片の下流末 端に下流断片の上流側 10〜30塩基対配列、また下流断片の下流末端に薬剤耐性 マーカー遺伝子断片の上流側 10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプ ライマーを用いれば良い（図 2)。
[0031] 次に 1回目に調製した各 PCR断片を混合して铸型とし、目的とする結合断片におい てそれぞれ最上流側及び最下流側となる 1対のプライマーを用いて 2回目の PCRを 行うことにより、目的の欠失導入用 DNA断片を調製することができる。具体的には例 えば、上流断片、下流断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片を結合させる場合、 上流断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマー を用いて 2回目の PCRを行うことによって、上流断片の下流末端に付加した下流断片 との相同配列において、また下流断片の下流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺 伝子断片との相同配列においてアニーリングが生じ、 PCR増幅の結果、上流側断片 、下流側断片と薬剤耐性マーカー遺伝子断片が結合した欠失導入用 DNA断片が得 られる（図 2)。
[0032] 更に、上述の方法などによって得られる欠失導入用 DNA断片を、通常の制限酵素 と DNAリガーゼを用いて宿主菌内で増幅されな 、プラスミド DNA、又は温度感受性プ ラスミド等、容易に除去できるプラスミド DNAに挿入することによって、欠失導入用プ ラスミドを構築する。宿主菌内で増幅されないプラスミド DNAの例としては、例えば枯 草菌を宿主とする場合、 pUC18、 pUC118、 pBR322などが挙げられる力 これらに限 定されるものではない。
[0033] 次いで、欠失導入用プラスミドによる宿主菌の形質転換をコンビテントセル形質転 換法 (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))などによって行い、プラスミドに挿入された上流 断片或いは下流断片とゲノム上の相同領域間での 1重交差の相同組換えによって欠 失導入用プラスミドが宿主菌ゲノム DNA内に融合した形質転換体を得る（図 2)。形質 転換体の選択には欠失導入用プラスミドのクロラムフエ-コール耐性遺伝子などのマ 一力一遺伝子による薬剤耐性を指標に行えば良い。
[0034] カゝくして得られる形質転換体のゲノム上には迎 IX遺伝子又は迎 IX遺伝子に相当す る遺伝子などの欠失すべき遺伝子の上流領域及び下流領域の配列にっ 、て、宿主 菌ゲノム由来と欠失導入用プラスミドに由来するものが重複して存在して!/、る。この上 流領域又は下流領域のうち、形質転換体を獲得する際に相同組換えした領域と異な る領域でゲノム内相同組換えを起こさせることにより、薬剤耐性マーカー遺伝子を含 む欠失導入用プラスミド由来の領域と共に迎 遺伝子又は迎 遺伝子に相当する 遺伝子など欠失すべき標的遺伝子の欠失が生じる（図 2)。ゲノム内の相同糸且換えを 起こさせる方法としては、例えばコンビテンスを誘導する方法 (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))が挙げられる力 単に通常の培地での培養中においても自然誘発的に相同 組換えが生じる。 目的通りにゲノム内相同組換えを起こした菌株は同時に薬剤耐性 マーカー遺伝子を欠失して薬剤に対する耐性能を失うため、薬剤感受性となった菌 株より選択することができる。こうした菌株カもゲノム DNAを抽出し、 PCR法などによつ て目的遺伝子の欠失を確認すれば良い。
[0035] 目的の欠失株を選択する際、ゲノム内での相同組換えは 10— 4程度のやや低い頻度 で生じるものと考えられる為、薬剤耐性から感受性に変化した菌株を直接選択するこ とは難しい。そこで、目的欠失株を効率的に取得するためには薬剤感受性株の存在 比率を高めるなどの工夫を施すことが望ま U、。薬剤感受性株の濃縮方法としては、 例えばアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質が、増殖細胞に対して殺菌的に作 用し、一方、非増殖細胞には作用しないことを利用した濃縮法 (Methods in Molecula r Genetics, Cold Spring Harbor Labs, (1970))などが挙げられる。アンピシリンなどに よる濃縮を行う場合、例えばクロラムフエ-コールなどの様に宿主細胞に対して静菌 的に作用する薬剤に対する耐性遺伝子を欠失導入用プラスミドの薬剤耐性マーカー 遺伝子として用いる必要がある。こうした静菌的作用の薬剤を適量含む適当な培地 において、当該薬剤耐性遺伝子を保持する耐性株は増殖可能であり、当該薬剤耐 性遺伝子を欠失した感受性株は増殖も死滅もしな ヽ。この様な条件下にお ヽて適当 な濃度のアンピシリンなどのペニシリン系抗生物質を添加して培養を行うと、増殖しよ うとする耐性株が死滅する一方、感受性株はアンピシリンなどの作用を受けず、結果 として感受性株の存在比率が高まることになる。この様な濃縮操作を行った培養液を 適当な寒天培地に塗抹、培養し、出現したコロニーのマーカー薬剤に対する耐性の 有無をレプリカ法などによって確認することにより、効率的に感受性株を選択すること が可能となる。
[0036] 以上の様な方法により構築される枯草菌の迎 遺伝子、又は当該遺伝子に相当す る遺伝子を含む 1以上のプロテアーゼ遺伝子が欠失又は不活性ィヒされた宿主微生 物変異株に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入する こと〖こよって、本発明の組換え微生物を得ることができる。
[0037] 本発明の微生物を用いて生産する目的タンパク質又はポリペプチドとしては、例え ば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断等の各種産業用酵素や生理活性因 子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられる。また、産業用酵素の機能別には、酸 化還元酵素（Oxidoreductase)、転移酵素（Transferase),加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性ィ匕酵素 (Isomerase)、合成酵素 (Ligase/Synthetase)等が含ま れるが、好適にはセルラーゼ、 α -アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺 伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類 (Biochem. J., 280, 309 ( 1991))中でファミリー 5に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバ チルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号 2又 は 4で示されるアミノ酸配列力 なるバチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼゃ、 当該アミノ酸配列の 1個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ 酸配列を有するアルカリセルラーゼが挙げられ、さらには、当該アミノ酸配列と 70%、 好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98% 以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
[0038] また、 a アミラーゼの具体例としては、微生物由来の a アミラーゼが挙げられ、 特にバチルス属細菌由来の液ィ匕型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配 列番号 61で示されるアミノ酸配列力 なるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼ や、当該アミノ酸配列と 70%、好ましくは 80%、より好ましくは 90%以上、さらに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有するアミノ酸配列力 なるアミラーゼ が挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性は Lipman- Pearson法（Science, 227, 1435, (1985》によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特 にバチノレス属細菌由来のセリンプロテアーゼゃ金属プロテアーゼ等が挙げられる。 更に、本発明により生産されるタンパク質としてはヒトなどの高等生物由来の生理活 性タンパク質や酵素などが挙げられる。好適な例としては、インターフェロン Q；、イン ターフェロン /3、成長ホルモン、唾液腺アミラーゼ等が挙げられる。また、生理活性タ ンパク質などを構成する一部のドメイン等も発現可能であり、例えば、ヒト C型肝炎ウイ ルス抗体の抗原認識ドメイン preS2などが挙げられる。
[0039] また、目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、 翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始 制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始制御領域及び分泌シ グナルペプチド領域力 選ばれる 1以上の領域が適正な形で結合されて 、ることが 望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から なる 3領域が結合されて 、ることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチ ルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開 始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流 0.6〜1 kb領域であるもの力 目的タン ノ ク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されて 、ることが望ま 、。例えば、 特開 2000-210081号公報ゃ特開平 4-190793号公報等に記載されているバチルス属 細菌、すなわち KSM- S237株（2003年 4月 14日、〒 305-8566 日本国茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一に FERM BP- 7875として寄託）、 KSM- 64株（2003年 4月 14日、〒 305- 8566 日本国 茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6、独立行政法人 産業技術総合研究所特 許生物寄託センターに FERM BP-2886として寄託）由来のセルラーゼ遺伝子の転写 開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的タンパク 質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体 的には配列番号 1で示される塩基配列の塩基番号 1〜659の塩基配列、配列番号 3 で示される塩基配列力 なるセルラーゼ遺伝子の塩基番号 1〜696の塩基配列、また 当該塩基配列に対して 70%以上、好ましくは 80%以上、より好ましくは 90%以上、さ らに好ましくは 95%以上、特に好ましくは 98%以上の同一性を有する塩基配列から なる DNA断片、あるいは上記 、ずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列から なる DNA断片力 目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合され ていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からな る DNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分 泌に関わる機能を保持して ヽる DNA断片を意味する。
[0040] 上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含む DNA断片と適当なプラスミド ベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって宿主微生物 細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、 当該 DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合した DNA断片を用 ヽ 、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによつても本発明の組換え微生物を得ること ができる。
[0041] 本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該 菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の 微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取.精製す ることにより行えばよい。培地の成分 '組成などは特に限定されないが、好ましくは、 炭素源としてマルトース又はマルトオリゴ糖を含む培地を用いれば、より良い結果が 得られる。
[0042] 以上より、表 1に示される枯草菌の遺伝子のいずれか、又は当該遺伝子に相当す る遺伝子カゝら選ばれた 1以上の遺伝子が欠失又は不活性化された宿主微生物変異 株、及び当該変異株を用いて組換え微生物を構築することができ、これを用いれば 有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。
実施例
[0043] 以下実施例にて、枯草菌の迎 IX遺伝子 (BG12567)を含む計 9種類のプロテアーゼ 遺伝子を欠失させた微生物の構築、並びに当該微生物を宿主として用いたセルラー ゼ生産又はヒト B型肝炎ウィルス抗体の抗原認識ドメイン PreS2生産にっ 、て、また主 要な 2つの細胞外プロテアーゼをコードする迎 ιΕ遺伝子（BG10190)と nprE遣伝子 (B G 10448)に加え、 ^lX遺伝子（BG 12567)を含む計 3種類のプロテアーゼ遺伝子を欠 失させた微生物の構築、並びに当該微生物を宿主として用いたヒト B型肝炎ウィルス 抗体の抗原認識ドメイン PreS2生産にっ 、て、具体的に説明する。
[0044] [表 2-1]
06/7CCSS00ifc1>d/ O 8S890900ZAV
Figure imgf000015_0001
usso nprEfw2 TCTCTTTGTTGAAAAACGATA 39 vprfwl AAAAACATCCCTCCGCTTC 40 vprUPr TCTTCGGTCAATACAAGCAGAAAGCGAATGAT 41 vpr丽 TCTGCTTGTATTGACCGAAGAACCTTTCACTG 42 vprrv-repll CTGATCTCGACTTCGTTCTGCTCGGCTCATCTGGAGAAA 43 vprfw2 TTTTTGGCAGGCAGCCTT 44 aprEfwl CTGTTTATTATGGGCCACGAA 45 aprEUPr GATCAGCTTGGGGTTAATCAACGTACAAGCAG 46 aprEDNf TGATTAACCCCAAGCTGATCCACAATTTTTTGC 47 aprErv-repu CTGATCTCGACTTCGTTCTGATTTTCCAAACGAGCTTTC 48 aprEfw2 ATGGGCCATTATGTCATGAAG 49 aprX+5F TTGGGTACTCTATGGTAC 50 aprX+563 CACTGGCCGTCGTTTTACCCATGACCATTATCATCG 51 aprX+775F CATGGTCATAGCTGTTTCCTTATGAGCATGTCGCTCG 52 aprX+1320R GGGAACGGAATTTTCTGC 53
PB-M13-20 GTAAAACGACGGCCAGTG 54
PB-M13 ev GGAAACAGCTATGACCATG 55 aprXfwl TTCTTTATCATCCTCATGG 56 aprXUPr TACAAATGGTGAACGCAGAAAATTCCGTTC 57 aprXDNf TTTTCTGCGTTCACCATTTGTACCATAGAG 58 aprXrv-repu CTGATCTCGACTTCGTTCTAACAACCTCACTTGGCAA 59 aprXfw2 ATAGATCGGCGCCTGAAA 60
[0046] [表 3]
Figure imgf000016_0001
[0047] 実施例 1 SEE遺伝子欠失用プラスミドの構築
枯草菌 168株力 抽出したゲノム DNAを铸型とし、表 2に示した eprRvlと eprUpr、及 び eprDNfと eprrv-r印の各プライマーセットを用いて、ゲノム上の SE£遺伝子の上流に 隣接する 0.6kb断片 (A)、及び下流に隣接する 0.5kb断片 (B)をそれぞれ調製した。ま た別途プラスミド pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982))由来のクロラムフエニコー ル耐性遺伝子の上流にプラスミド pUB110 (Plasmid 15, 93 (1986))由来の mril遺伝子 のプロモーター領域（Nucleic Acids Res. 17, 4410 (1989))を連結した 1.2kb断片（C) を調製した。次に、得られた (A) (B) (C) 3断片を混合して铸型とし、表 2のプライマー epri 2と Cmrv2を用いた SOE-PCRを行うことによって、 3断片を (A) (B) (C)の順にな る様に結合させ、 2.2kbの DNA断片を得た（図 2参照)。この DNA断片の末端を平滑 化及び 5，—リン酸化し、プラスミド pUC 118 (Methods Enzymol. 153, 3 (1987))の Ι 制限酵素部位に挿入して^:遺伝子欠失用プラスミド pUC118-Cmr A印 rを構築した 。尚、上記 1.2kb断片（C)は、 repUl と repUr- Cmのプライマーセット（表 2)及び铸型と してプラスミド pUBiioを用いて調製した en遺伝子プロモーター領域を含む o.4kb断 片（D)と、 CmUf- repと Cmrvlのプライマーセット（表 2)及び铸型としてプラスミド pC194 を用いて調製したクロラムフエ-コール耐性遺伝子を含む 0.8kb断片 (E)とを混合して 铸型とし、表 2に示したプライマー repUl と Cmrvlを用いた SOE-PCRを行なうことによ つて調製した。
実施例 2 欠失用プラスミドを用いた 遺伝子欠失株の構築
実施例 1にて構築した gEE遺伝子欠失用プラスミド pUC118-Cmr A eprをコンビテント セル形質転換法 (J. Bacteriol. 93, 1925 (1967))によって枯草菌 168株に導入し、 遺伝子上流領域、或いは下流領域の相当する領域間での 1重交差の相同組換えに よりゲノム DNAと融合した形質転 ·をクロラムフエ-コール耐性を指標に取得した。 得られた形質転換株を LB培地に接種し、 37°Cにて 2時間培養後、再度、コンビテン ス誘導操作を行うことにより、ゲノム上で重複して存在する SEE遺伝子上流領域、或い は下流領域の間に於けるゲノム内相同組換えを誘導した。図 2に示す様に、プラスミ ド導入の際と異なる領域で相同組換えが起こった場合、プラスミドに由来するクロラム フエ-コール耐性遺伝子及び PUC118ベクター領域の脱落に伴って 遺伝子が欠 失することになる。次に、クロラムフエ-コール感受性となった株の存在比率を高める 為、以下の要領でアンピシリン濃縮操作を行なった。コンビテントセル誘導後の培養 液を終濃度 5ppmのクロラムフエ-コール及び終濃度 lOOppmのアンピシリンナトリウム を含む LB培地 1 mLに 600nmにおける濁度（OD600)が 0.003になるように接種した。 3 7°Cにて 5時間培養後、 10,000ppmのアンピシリンナトリウム水溶液を 10 L添カ卩して更 に 3時間培養した。培養終了後、 2%塩ィ匕ナトリウム水溶液にて菌体を遠心洗浄した後 、 lmLの 2%塩化ナトリウム水溶液に懸濁し、懸濁液 100 Lを LB寒天培地に塗沫した 。 37°Cにて約 15時間インキュベーションし、生育した菌株のうち、プラスミド領域の脱 落に伴ってクロラムフエ-コール感受性となったものを選抜した。選抜した菌株のゲノ ム DNAを铸型とし、表 2に示すプライマー epri 2と eprrv-repを用いた PCRを行なうこと により 遺伝子欠失の確認を行な ヽ、 §EI遺伝子欠失株を取得した。
[0049] 実施例 3 プロテアーゼ遺伝子 8重欠失株の構築
遺伝子欠失株に対し、次の欠失として] ϊΕΐΔ遺伝子の欠失を §EI遺伝子欠失と同 様に行なった。即ち、実施例 1と同様にして 遺伝子欠失用プラスミド PUC118-C mr AwprAを構築し、構築したプラスミドのゲノム DNAへの導入とそれに続くゲノム内 相同組換えによる^ ΕΕΔ遺伝子の欠失により gEE遺伝子と 5^遺伝子の 2重欠失株を 取得した。以降同様の操作を繰り返すことにより、 mm：、 nprB. EE、 I £、重、 SElEの 各遺伝子を順次欠失させ、最終的に 8種類のプロテアーゼ遺伝子が欠失したプロテ ァーゼ 8重欠失株を構築し、 Kao8株と命名した。各欠失を行う際に用いたプライマー の配列は表 2に示し、また各プライマーと実施例 1で示した 遺伝子欠失に用いた プライマーとの対応については表 3に示した。
[0050] 実施例 4 迎 IX遺伝子欠失株の構築 (スベタチノマイシン耐性遺伝子による置換）
SOE (splicing by overlap extension)— PCR法（Gene, 77, 61, (1989))によって調製さ れる欠失導入用 DNA断片を用いた二重交差法により迎 遺伝子欠失株を構築した 。まず、表 2に示した aprX+5Fと aprX+563R、及び aprX+775Fと aprX+1320Rの各プライ マーセットを用いて、枯草菌 168株カゝら抽出したゲノム DNAを铸型とし、 aorX遣伝子の 上流を含む 5，末端側の 558 bp断片 (F)、及び 3，末端側の 545 bp断片（G)をそれぞ れ調製した。一方、プラスミド pDG1727 (Gene, 167, 335, (1995))の BamHI及び Xhol 制限酵素切断点よりスぺクチノマイシン耐性遺伝子領域を切り出し、 pBluescript II S K (+) (Stratagene)に ^ lHI及び 20^1制限酵素切断点に挿入し、 pBlueSPRを構築した 。 PBlueSPRの DNAを铸型とし、 PB- M13- 20、 PB- M13Rev (表 1)のプライマーセットを 用いてスぺクチノマイシン耐性遺伝子領域を増幅した (H)。次に (F)、 (G)及び (H) の DNA断片铸型とし、 aprX+5F、 aprX+1320Rプライマーセットを用いて SOE- PCR法 により、（E) (H) (G)の順に結合した DNA断片を調製した。調製した DNA断片を用い、 コンビテントセル形質転換法による枯草菌 168株の形質転換を行 ヽ、スぺクチノマイ シン（100 μ g/mL)を含む LB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離 した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、 PCRによって^ IX遺伝子が欠失してス ぺクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上の様にして、枯草 菌の迎 IX遺伝子が欠失した菌株を構築し、 Δ aprX(Sp)株と命名した。
[0051] 実施例 5 迎 遺伝子欠失を含むプロテアーゼ遺伝子 9重欠失株の構築
実施例 4に示した (E) (H) (G)の順に結合した DNA断片を用いて、コンビテントセル 形質転換法によりプロテアーゼ遺伝子 8重欠失株（実施例 3、 Kao8株）の形質転換を 行い、スぺクチノマイシン（100 μ g/mL)を含む LB寒天培地上に生育したコロニーを 形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、 PCRによって 遺伝子が欠失してスぺクチノマイシン耐性遺伝子に置換していることを確認した。 以上の棣にして、枯草菌の aprE、 nD_rB、 nD_rE、 b¾E、 vpr、 mEE、 epr及び wDrAの 8遣 子の多重欠失に加えて、 遺伝子が欠失した菌株を構築し、 Kao9株と命名した。
[0052] 実施例 6 迎 IX遺伝子欠失を含むプロテアーゼ遺伝子 9重欠失株のプロテアーゼザ ィモグラム解析
実施例 1 5にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌 168株を 100時 間培養後、培養液を 10,000rpm、 5分遠心し、その上清を 1 Xサンプルバッファー（62. 5mM Tris- HCl(pH6.8), 5% 2-メルカプトエタノール， 2% SDS, 5%スクロース， 0.002% BPB (Bromophenol blue) )になるように可溶化し、プロテアーゼザィモグラムのサンプ ルとした。サンプルを煮沸せず、 0.1%ゼラチンを含む 12%SDS-PAGEを行った後、 Re naturation buffer (2.5% Triton X- 100)にて室温で 30分間振とうし、さらに Zymogram D eveloping buffer (50mM Tris— HCl(pH8.5)、 200mM NaCl、 5mM CaC12、 0.02% Brij35) にて室温で 30分間振とうした。再度 Zymogram Developing bufferに置換した後 37°Cで 12時間インキュベートした後、 CBB (クマシ染色液)でゲルを染色した。以上の方法に よってプロテアーゼのザィモグラム解析を行った（図 3)。この結果、 8重欠失株（Kao8 株）においてもプロテアーゼ活性バンドが検出された力 遺伝子欠失株では本 バンドが消失し、 Kao8株で残存するプロテアーゼ活性が AprXであることが明らかに なった。また、迎 遺伝子を含むプロテアーゼ遺伝子 9重欠失株 (Kao9株)ではプロ テアーゼ活性バンドが検出されな力つた。
[0053] 実施例 7 アルカリセルラーゼの生産
実施例 1—5にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌 168株に、バチ ルス エスピー (Bacillus sp.) KSM- S237株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開 20 00- 210081号公報、配列番号 1)断片（3.1 kb)がシャトルベクター pHY300PLKの ^ I H淛限酵素切断点に挿入された組換えプラスミド pHY-S237を、プロトプラスト形質転 換法によって導入した。これによつて得られた菌株を 5mLの LB培地で一夜 30°Cで振 盪培養を行い、更にこの培養液 0.03 mLを 30 mLの 2xL—マルトース培地（2%トリプト ン、 1%酵母エキス、 1% NaCl、 7.5%マルトース、 7.5 ppm硫酸マンガン 4- 5水和物、 15 ppmテトラサイクリン）に接種し、 30°Cで 4日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分 離によって菌体を除 、た培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によ つて菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表 4に示 した様に、 aElX遺伝子欠失株である A aprX(Sp)株及びプロテアーゼ遺伝子多重欠失 株 (Kao9株）を用いた場合は ヽずれも、対照の 168株（野生型）の場合と比較してアル カリセルラーゼの高 、分泌生産が認められた。
[0054] [表 4]
Figure imgf000020_0001
[0055] 実施例 8 Kao8株及び Kao9株によるヒト B型肝炎ウィルス抗原認識 PreS2ドメインの生 産
枯草菌由来のアミラーゼ遺伝子の N末側 522アミノ酸をコードする領域の下流にヒト B型肝炎ウィルス抗原認識 PreS2ドメイン断片を結合した DNA断片 (165 bp)が挿入さ れた組換えプラスミド pTUBE52-preS2 (Appl. Microbiol. BiotechnoL, 40, 341 (1993)) を、実施例 3及び 5にて得られた Kao8株と Kao9株に通常のコンビテントセル形質転換 法によって導入した。得られた形質転換菌株を一夜 30°Cで振盪培養を行い、更にこ の培養液 0.03 mLを 30 mLの 2xL—マルトース培地（2%トリプトン、 1%酵母エキス、 1% NaCl、 7.5%マルトース、 7.5 ppm硫酸マンガン 4-5水和物、 15 ppmテトラサイクリン） に接種し、 30°Cで 100時間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除 Vヽた培養液上清中のアミラーゼ- PreS2タンパク質量を抗 PreS2抗体（ (株)特殊免疫 研究所)を用いたウェスタンプロット解析により求めた。まず、培養上清を I Xサンプル バッファー（62.5mM Tris-HCl(pH6.8),5% 2-メルカプトエタノール， 2% SDS, 5%スクロ ース， 0.002% BPB (Bromophenol blue) )になるよう可溶化し、 10%SDS- PAGEを行つ 7こ後、 PVDF (polyvinyl difluonaine membrane： Immobilon； 0.45 μ m pore size; Millipor e)にブロッテイングした。一次抗体として抗 preS2抗体 (Hyb-5520 : (株)特殊免疫研 究所）を用いた。二次抗体としてペルォキシダーゼ標識抗マウス IgG抗体 (Amersham Pharmacia biotech)を使用し 7こ。ま 7こ ECL Plus Western blotting reagent pack (RPN2 124; Amersham Pharmacia biotech)により検出した。この結果、図 4に示した様に、プ 口テアーゼ遺伝子 9重欠失株 (Kao9株)では 8重欠失株 (Kao8株）に比べて明らかに 強いアミラーゼ- PreS2バンドが検出され、迎 の欠失によりアミラーゼ- PreS2の大幅 な生産向上が認められた。
[0056] 実施例 9 迎 EE、厘： E、及び迎 IXの 3遺伝子を欠失した株の構築
主要な 2つの細胞外プロテアーゼをコードする迎 EE遺伝子と nm£遺伝子に加え、迎 IX遺伝子を含む計 3種類のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた微生物の構築を行なつ た。実施例 1及び 2と同様にして sm£遺伝子欠失用プラスミド pUC118-Cmr A aprEを 構築し、構築したプラスミドの枯草菌 168株ゲノム DNAへの導入とそれに続くゲノム内 相同組換えによる迎 IE遺伝子の欠失により迎 IE遺伝子の単独欠失株を取得した。次 いで実施例 3と同様にして aprE、 nprE、及び aprXの 3遺伝子が欠失したプロテアーゼ 遺伝子 3重欠失株を構築し、 Kao3株と命名した。尚、 Kao3株構築において^ IX遺伝 子を欠失させる際に用いたプライマーと他のプロテアーゼ遺伝子を欠失させた際に 用いたプライマーとの対応については表 3に示した。
[0057] 実施例 10 Kao3株によるヒト B型肝炎ウィルス抗原認識 PreS2ドメインの生産
実施例 8と同様に、アミラーゼ- PreS2生産用プラスミド pRUBE52-preS2を実施例 9に て得られた Kao3株、及び対照として枯草菌 168株に通常のコンビテントセル形質転換 法によって導入した。得られた形質転換菌株を一夜 30°Cで振盪培養を行い、更にこ の培養液 0.03mLを 30 mLの 2xL—マルトース培地（2%トリプトン、 1%酵母エキス、 1% N aCl、 7.5%マルトース、 7.5 ppm硫酸マンガン 4-5水和物、 15 ppmテトラサイクリン）に 接種し、 30°Cで 25時間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除い た培養液上清中のアミラーゼ- PreS2タンパク質量を抗 PreS2抗体（ (株)特殊免疫研 究所)を用いたウェスタンプロット解析により求めた。図 5に示した様に、対照の 168株 (野生株）の場合には認められな力つたアミラーゼ- PreS2のバンドがプロテアーゼ遺 伝子 3重欠失株において検出され、アミラーゼ- PreS2の生産性向上が確認された。

Claims

請求の範囲
[1] 枯草菌の迎 遺伝子若しくは当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性ィ匕 させた微生物を宿主とし、これに異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝 子を導入した組換え微生物。
[2] 更に枯草菌の 遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子とは異なるプロテア ーゼをコードする 1種以上の遺伝子を欠失又は不活性ィヒさせた微生物を宿主とする 請求項 1記載の組換え微生物。
[3] 枯草菌の SElX遺伝子又は当該 SElX遺伝子に相当する遺伝子とは異なるプロテア ~~セ コ ~~ドする遺 izs子力、枯草菌の aElE、 nprB、 nprE、 bpr. vpr、 mpr、 epr及ひ wpr Aの各遺伝子並びに当該遺伝子に相当する遺伝子力 選ばれるものである請求項 2 記載の組換え微生物。
[4] 枯草菌の迎 iX、 am£及び nm£の各遺伝子の全て、又は当該遺伝子に相当する 3種 類の遺伝子の全てを欠失又は不活性化させた微生物を宿主とする請求項 3記載の 組換え微生物。
[。」 枯草 の aprX、 aprE、 nprB、 nprE, bpr、 vpr、 mpr、 epr及び wprAの各食 fe子の全て
、又は当該遺伝子に相当する 9種類の遺伝子の全てを欠失又は不活性ィ匕させた微 生物を宿主とする請求項 3記載の組換え微生物。
[6] 微生物が枯草菌又はその他のバチルス属細菌である請求項 1〜5のいずれか 1項 記載の微生物。
[7] 異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領 域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域から選ばれる 1以上の領域を結合し た請求項 1〜6のいずれか 1項記載の組換え微生物。
[8] 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる 3領域を結 合したものである請求項 7記載の組換え微生物。
[9] 分泌シグナル領域がバチルス属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写 開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流 0.6〜lkb領 域由来のものである請求項 7又は 8記載の組換え微生物。
[10] 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる 3領域が、 配列番号 1で示される塩基配列力 なるセルラーゼ遺伝子の塩基番号 1〜659の塩 基配列、配列番号 3で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号 1〜6 96の塩基配列又は当該塩基配列のいずれ力と 70%以上の同一性を有する塩基配 列からなる DNA断片、又は当該塩基配列の一部が欠失した塩基配列力 なる DNA 断片である請求項 8記載の組換え微生物。
請求項 1〜10のいずれか 1項記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリべ プチドの製造方法。
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