WO2006016558A1 - 新規な Paenibacillus 属菌およびそれらの菌もしくはそれらの菌の培養物質を利用した植物病害防除 - Google Patents

新規な Paenibacillus 属菌およびそれらの菌もしくはそれらの菌の培養物質を利用した植物病害防除 Download PDF

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WO2006016558A1
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plant disease
plant
paenibacillus
genus
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French (fr)
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Shinichiro Kochi
Tsukasa Fujimaki
Yoshinori Kanai
Katsuyuki Futamata
Yuzo Kioka
Katsunori Noguchi
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Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
Katakura Chikkarin Co., Ltd.
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel Paenibacillus genus and control of plant diseases using these fungi or cultures of those fungi. More specifically, Paen3 ⁇ 4acillus spp. That can exhibit a plant disease control action by producing a plant disease resistance inducer and exhibiting a plant disease resistance induction activity, more specifically, for example, Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS—0074, Paenibacillus polymyxa BS—0105, Paenibacillus sp.
  • the present invention relates to plant disease control using a novel plant disease resistance-inducing activity of a compound obtained from
  • Patent Document 1 proposes to use microbial cells such as Bacillus subtilis FR-2 and Bacillus polymyxa KT-8 as plant fungal infection control agents.
  • microbial cells such as Bacillus subtilis FR-2 and Bacillus polymyxa KT-8 as plant fungal infection control agents.
  • biocontrol agents that are still not sufficient in performance and type.
  • Non-patent Document 3 S-methyl ester (generic name: benzobenzoal S-methyl) (Non-patent document 1, Non-patent document 2), 3- (2-propyleneoxy) -1,2-benzisothiazole-1,1-dioxide (generic name Pro Benazol) (Non-patent Document 3) is limited to several types and cannot be said to be sufficient.
  • Patent Document 2 describes the use of a bacterium that induces resistance to plant diseases and an organic soil conditioner to impart resistance to plant diseases. This method is also sufficient. Absent.
  • Patent Document 3 reports that the antibacterial active substance KT-6291A (Fusaricidin A) produced by Bacillus sp. KB-291 controls each plant disease.
  • the antibacterial active substance KT-6291A described in Patent Document 3 does not show activity against the gram-negative bacterium Cucillus spotted bacterial disease, and also shows activity against other gram-negative bacteria.
  • it has been clarified that there is no description of a method for controlling plant diseases caused by gram-negative bacteria, and that it has no antibacterial activity against Fusarium spp. It has been.
  • there are descriptions of other substances exhibiting antibacterial activity against some microorganisms there is no knowledge about plant disease resistance-inducing activity.
  • Non-patent document 4 similarly shows that the antibacterial active substance Fusaricidi A is produced from Bacillus polymyxa KT-8, but it is clear that this substance does not show activity against gram-negative bacteria. Has been.
  • Non-Patent Document 5 includes Bacillus polymyxa KT-8 as an antibacterial active substance Fusaricidin. Although Fusariddin B and the like are produced together with A, it has been clarified that these substances also show no activity against gram-negative bacteria.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 6-253827
  • Patent Document 2 Special Table 2003-529539
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 2-275898
  • Non-patent literature l Plant Physiol. 117, p.1333- 1339 (1998)
  • Non-Special Reference 2 Brighton crop protection conference-pests & di sea ses-1996, 8A— 4, CGA2455704
  • Non-Patent Document 3 Annu. Rev. Phytopathol. 32, p.439-59, (1994)
  • Non-Patent Document 4 The Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129-135
  • Non-Patent Document 5 The Journal of Antibiotics VOL.50, No.3, p.220-228
  • an object of the present invention is to provide a Paenibadllus genus capable of exhibiting plant disease resistance inducing activity, and further to provide a plant disease resistance inducer.
  • Another object of the present invention is to provide a plant disease control agent and a plant disease control method using them.
  • the present invention relates to a novel genus Paenibacillus having a plant disease control action.
  • the present invention relates to a Paenibadllus genus that can exhibit a plant disease control action by producing a plant disease resistance inducer and exhibiting a plant disease resistance inducing activity.
  • this invention relates to the composition containing said Paenibadllus genus microbe.
  • the present invention relates to a composition containing a single plant disease resistance inducer or some combination thereof obtained from the culture of the aforementioned genus Paenibadllus. Furthermore, this invention relates to the plant disease control agent which consists of said composition.
  • the present invention provides a plant disease resistance inducer, at least selected from compound Fusa ricidin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4 having the following structure:
  • One relates to a plant disease control agent containing a compound.
  • Compound 4 further relates to a method for controlling plant diseases, which comprises applying the above-mentioned Paenibacillus genus, composition or plant disease control agent to plants to protect the plant from infection by plant pathogens.
  • the invention further relates to novel compounds 3 and 4 having the above structural formula.
  • the genus Paenibacillus belongs to the genus Bacillus when identified by a morphological 'physiological test of the strain, and belongs to the genus Paenibacillus when identified by 16S rDNA nucleotide sequence analysis. Means.
  • the genus Paenibacillus of the present invention can control plant disease caused by Gram-negative bacteria such as Pseudomonas and Fusarium by exhibiting plant disease resistance-inducing activity.
  • novel microorganisms Paen3 ⁇ 4acillus sp. BS_0048, Paenib acnlus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277 found by the present invention are caused by these gram-negative bacteria and Fusarium spp. Plant diseases caused by a wide range of plant pathogens such as Colletotrichum spp. And Glomerella spp. Can be controlled.
  • Paenibacillus sp. BS-0048 can be named Bacillus sp. BS-0048 when identified by a morphological 'physical characterization test of the strain.
  • Paen3 ⁇ 4acillus sp. BS-0048 It means the same strain that can be named.
  • Paen3 ⁇ 4acillus polymyxa BS-0105 can be named Bacillus sp. BS-0105 belonging to the genus Bacillus when identified by morphological and physiological characterization of the strain.
  • Compound l (Fusaricidin A), Compound 2 (Fus aricidin B), Compound 3 and Compound 4 produced by Paen3 ⁇ 4acillus spp.
  • Plant disease resistance-inducing activity and are therefore infected by plant pathogens. It is effective in controlling plant diseases because it has an action of protecting plant bodies from
  • FIG. 1 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (DMSO-d6) of novel compound 3 of the present invention.
  • FIG. 2 shows a proton nuclear magnetic resonance spectrum (DMSO-d6) of novel compound 4 of the present invention.
  • a novel Paenibacillus genus having a plant disease control action is provided, and a plant disease resistance-inducing activity is produced by producing a plant disease resistance inducer and exhibiting a plant disease resistance-inducing activity.
  • Paenibacillus spp. Can be provided.
  • the plant disease resistance inducer of the present invention include the above-mentioned compound Fusaricidin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4.
  • the plant disease resistance-inducing activity mentioned here means an activity that imparts so-called induced resistance to plant diseases. It is possible to produce a substance having such activity. Paen3 ⁇ 4acillus spp. And plant disease resistance inducers such as compound Fusaricidin A), compound 2 (Fusaric idin B), compound 3, and compound 4 can protect plants from infection by plant pathogens. Plant disease resistance-inducing activity that exhibits no direct antibacterial activity can be used to protect plants from infection by plant pathogens, and as a result, plant diseases can be controlled.
  • Paenibacillus examples include, for example, the novel Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277 or a variant thereof.
  • the body is, for example, a naturally occurring mutation, a mutant caused by a physical cause such as ultraviolet rays, or a chemical mutagen such as a salt or compound, and the function intended by the present invention, that is, By producing at least one compound selected from plant disease resistance inducers such as compound Fusariddin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4 and exhibiting plant disease resistance inducing activity As long as it is a mutant capable of exhibiting a plant disease control action, it may be a mutant of the wrong! /.
  • plant disease resistance inducers such as compound Fusariddin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4
  • the Paenibacillus genus used in the present invention is a strain that can be said to belong to the genus Bacillus when identified by a morphological 'physiological test of the strain. Any strain belonging to the genus Paenibacillus may be used.
  • the Paenibacillus genus of the present invention controls plant diseases caused by Gram-negative bacteria and Fusarium species by producing plant disease resistance inducers and exhibiting plant disease resistance-inducing activity. be able to.
  • plant disease resistance inducers such as the above-mentioned compound Fusariddin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3, and compound 4 themselves also exert plant disease resistance-inducing activity, resulting in Gram-negative. It can control plant diseases caused by bacteria and Fus ari.
  • Plant diseases caused by Gram-negative bacteria include, for example, plant diseases caused by Pseudomonas spp.Specific examples include plant diseases such as Pseudomonas synngae pv. Lachrymans. Examples include varieties of lysopods, Itoda fungus disease, rice leaf sheath browning disease (Pseudomonas foscovaginae), etc. Examples of plant diseases caused by Fusarium genus fungi include Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Lily vine ⁇ ! Disease (Fusan oxysporum f. Sp. Cucumerium), melon vine harm (Fusarium oxysporum f. Sp. Melonis), tomato dwarf disease (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici) etc .;
  • the Paenibacillus genus of the present invention for example, the novel Paenibacillus sp. BS-0048, Paeniba cillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277 are the above-mentioned Gram-negative bacteria and Fusarium It is possible to control plant diseases caused by genus fungi and control plant diseases caused by a wide range of plant pathogenic fungi such as Colletotrichum spp. Can do. Examples of plant diseases caused by Colletotrichum spp.
  • cucurbit anthracnose such as cucumber anthracnose (Colletotrichum orbiculare), strawberry anthracnose (Coll etotrichum acutatum), and Glomerella spp.
  • plant diseases caused by the above include grape rot (Glomerella dngulata) and strawberry anthracnose (Glo merella cingulata).
  • gray rot Botrytis cinerea
  • sclerotia Scleroti ma sclerotiorum
  • rice blast Pyricularia oryzae
  • blight Tehanatephorus c ucumeris
  • sesame of each crop for example, gray rot (Botrytis cinerea), sclerotia (Scleroti ma sclerotiorum), rice blast (Pyricularia oryzae), blight (Thanatephorus c ucumeris) and sesame of each crop.
  • Leaf blight (Cochliobolus miyabeanus), apple black scab (Venturia inaequalis, spot, leaf fall; I ⁇ (Alternaria mali) and rot (Valsa ceratosperma), pear black spot (Alternaria kikuchiana) and scab (Venturia) nashicola), citrus sunspot (Diaporthe citri), blue mold (Penicillium italicum) and mosquito, mildew (Xanthom onas campestris pv. citri), peach homopense rot;) ⁇ (Phomopsis sp.
  • Vitians and soft rot 3 Erwinia carotovora subsp. Carotovora), Black rot (Xanthomonas campestris pv. Campestris), Brassicaceae vegetable root-knot disease (Plasmodiophora brassicae), seedling blight of each crop (Pythium sp.), Fruit tree purple herb disease (Helicobasidium mompa), rhinoceros radish (Rhizoctonia solani) and curb flai leaves
  • the Paen3 ⁇ 4acillus genus of the present invention is also effective against blight (Curvularia sp.).
  • the Paenibacillus genus of the present invention or a plant disease resistance inducer
  • the above-mentioned compound Fusaricidin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4 themselves exert plant disease resistance-inducing activity, thus protecting the plant from infection by plant pathogens.
  • Plant diseases can be controlled.
  • plant pathogens include the various bacteria described above, fungi, and viruses.
  • fungi examples include gray mold disease (Botrytis cinerea), mycorrhizal disease (Sclerotini a sclerotiorum), ⁇ ⁇ ⁇ chi ;! ⁇ (Pyncularia oryzae, crest moth i nanatephorus cue umeris) and sesame leaves Blight (Cochliobolus miyabeanus), apple scab (Venturia i naequalis), spots, leaves;) ⁇ (Alternaria mali) and rot; i ⁇ (Valsa ceratosperma), pears black spot (Alternaria kikuchiana) and scab (Venturia nashicola), citrus black spot (Diaporthe citri) and blue mold (Penicillium italicum), peach homoposis spoilage (Phomopsis sp.) And ash scab (Monilinia fructicola), power rickets (Gloeospor
  • bacteria include citrus or Xanthomonas cam pestns pv. Vitians, Xanthomonas campestris pv. Ci tri, eggplant blight (Ralstonia solanacearum), lettuce plaques, Itoda fungi;) ⁇ (Xanthomonas cam pestns pv. Vitians) And soft rot (Erwinia carotovora subsp. Carotovora) and black rot (Xanthomonas campestris pv. Campestris).
  • cucumber mosaic cucumovirus wa melonmelon mosaic2 potyvirus ⁇ zucchini yellow mosaic potyvirus
  • tomato acetic necrovirus 3 ⁇ 4 (tob acco necrosis necro virus), strawberry quinores
  • awberry latent C virus soybean dwarf luteovirus, strawberry mottle virus, strawberr y pseudo mild yellow edge carlavirus, strawberry vein banding caulimovirus, tabocco mosaic tobamovirus, tobacco necrosis necrovirus), cabbage mozic
  • Potyvirus no. Gui Zuinores ;! ⁇ (southern bean mosaic sobemovirus, peanut stunt cucumovirus, bean common mosaic potyvirus ⁇ broad bean wilt fabavirus), potato leafr oil luteovirus, and the like.
  • Paen3 ⁇ 4acillus genus of the present invention for controlling plant diseases, spores, vegetative cells, whole cultures, and the like of the genus Paen3 ⁇ 4acillus can be usually used.
  • These can be prepared by culturing Paenibacillus spp.
  • the culture strength thereof can also be prepared.
  • the whole culture can be prepared as a whole culture powder by lyophilizing the whole culture obtained as it is. For example, after cultivation, the whole culture is centrifuged to remove impurities, the resulting supernatant is further centrifuged, the precipitated cells are washed, and vegetative cells are prepared as cell precipitates. I'm going.
  • the spore can be prepared as a freeze-dried cell powder by suspending the cell precipitate obtained here in distilled water and freeze-drying.
  • the Paenibacillus genus used in the present invention is usually a living bacterium, but may be a bacterium killed by heat treatment or the like.
  • the live bacteria are those obtained from the culture and the dried bacteria, the bacteria separated from the culture by a normal method such as filtration or centrifugation, and the separation and drying after collection. It is intended to include both of the bacteria that have been released.
  • Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. B3 ⁇ 4-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277 and other Paenibacillus species are cultured according to the usual culture method for general bacteria. It is possible to use any conceivable method such as solid culture or liquid culture (test tube shaking culture, reciprocating shaking culture, rotary shaking culture, jar armor mentor culture, tank culture, etc.).
  • the culture medium includes various carbon sources and nitrogen Sources, organic salts, and inorganic salts can be used in appropriate combinations.
  • examples of the carbon source include glucose, starch, glycerin, dextrin, sucrose, animal and vegetable oils, and the like.
  • examples of the organic nitrogen source include yeast extract, soybean flour, corn steep liquor, wheat germ, meat extract, peptone and the like.
  • examples of the organic nitrogen source include sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium sulfate, and ammonium acetate.
  • organic salts and inorganic salts include acetates such as sodium acetate; carbonates such as calcium carbonate and sodium carbonate; salt salts such as sodium chloride and sodium carbonate; potassium potassium dihydrogen phosphate; Examples include phosphates such as disodium hydrogen phosphate; sulfates such as ferrous sulfate, zinc sulfate, and copper sulfate.
  • the culture temperature is a force that can be appropriately changed within a range in which microorganisms can grow, and is preferably in the range of 20 ° C to 40 ° C.
  • the culture is carried out under aerobic conditions. In particular, when cultivating in a jar mentor or a culture tank, it is carried out by supplying sterile air. No.
  • Compound Fusaricidin A) and Compound 2 (Fusaricidin B) used as plant disease resistance inducers in the present invention include, for example, the novel Paen3 ⁇ 4acillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. B3 ⁇ 4— discovered in the present invention. It is known to produce Paenibacillus species such as Paenibacillus polymyxa B3 ⁇ 4-0105, Paenibacillus sp. B3 ⁇ 4-0277, or these compounds, Bacillus sp. KB-291 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • Bacillus polymyxa KT—8 ( ⁇ he Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129—135 (1996); The Journal of Antibiotic s VOL.50, No.3, p.220-228 (1997) It can be obtained from a culture of Bacillus genus such as >> Compound 3 and Compound 4 can also obtain the culture strength of the above-mentioned novel Paenibacillus genus found in the present invention. In these methods, these bacteria are cultivated by a usual method, and the methods described in these documents and For example, it can be obtained by extracting the culture solution with butanol, ethyl acetate, etc., and subjecting the extract to high performance liquid chromatography. .
  • Paenibacillus genus used in controlling plant diseases of the present invention, or plant disease resistance such as Compound 1 (Fusaricidin A), Compound 2 (Fusaricidin B), Compound 3, and Compound 4
  • the sex inducer can be used as it is without adding any other components. If necessary, prepared by mixing with various carriers such as solid carrier, liquid carrier, etc., or adding adjuvants for pharmaceuticals such as additives, wettable powder, solution, suspension, granule, powder In addition, those formulated into microcapsules and pastes can also be used.
  • the genus Paenibadllus of the present invention is usually contained in a weight ratio (wet amount of bacteria) of about 0.1% to 99%. Further, it is desirable to contain about 10 3 to about 10 11 colony forming units (hereinafter referred to as CFU) of the genus Paenibadllus of the present invention per lg preparation. In addition, when using Paenibadllus sporulates, vegetative cells or whole cultures, add about 10 3 to 10 u CFU per lg of formulation or about 0.1% to 99% in a normal weight ratio (wet amount). It is desirable to contain. In the case of a plant disease resistance inducer, compound 1 (Fusaricidin A), compound 2 (Fusaricidin B), compound 3 and compound 4 contain at least one selected compound in an amount of 0.01% to 99%. Is desirable.
  • Solid carriers used in the formulation include, for example, mineral powder (kaolin clay, bentonite, diatomaceous earth, synthetic hydrous silicon oxide, talc, quartz, vermiculite, pearlite, etc.), inorganic salts (ammonium sulfate, Phosphorus, ammonium nitrate, urea, ammonium chloride, etc.), organic powders (wheat flour, soy flour, bran, chitin, rice bran, skim milk powder, whole milk powder, etc.), activated carbon, calcium carbonate, etc.
  • Examples include water, glycerol, vegetable oil (soybean oil, rapeseed oil, etc.), liquid animal oil (fish oil, etc.), ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol and the like.
  • Pharmaceutical adjuvants include, for example, casein, gelatin, polysaccharides (starch powder, arabia gum, cellulose derivatives, alginic acid, etc.), lignin derivatives, bentonite, sugars, plant oils, mineral oils, synthetic water-soluble high Molecules (polyvinyl alcohol, polyacrylic acids, etc.), polypropylene alcohol, antifreezing agents such as ethylene glycol, antifoaming agents such as silicon compounds, natural polysaccharides (xanthan gum, etc.), inorganic substances (aluminum, bentonite, etc.), synthesis Examples thereof include thickeners such as water-soluble polymers (polyacrylic acid and the like).
  • the application amount (wet amount) of the active ingredient of the genus Paenibacillus used is usually about O.lg to about 10000 g per 10 ares, preferably about 10 g to about 10,000 g. 1000g.
  • the bacterial concentration at the time of application is usually from about 10 3 CFUZmL to about 10 u CFUZmL, preferably about 10 5 CFU / mL to about 10 9 CFU / mL.
  • Granules, powders, pastes, etc. can be applied as they are without dilution.
  • the application amount is about O.lg to about 10000g (wet amount) per 10 ares.
  • the concentration of spore or vegetative cell is preferably 10 3 to 10 1Q CFU / mL.
  • the application amount of the plant disease resistance inducer is about 0.001 to 10000 g per 10 ares, and when diluted with the desired water, compound 1 (Fusaricidin A), compound 2 (Fu saricidin B), Compound 3 and compound 4 force
  • the concentration of at least one compound selected is 0.1 to 1000 Is desirable.
  • the Paenibacillus genus bacteria or plant disease resistance inducer of the present invention it is preferable to apply the Paenibacillus genus bacteria or plant disease resistance inducer of the present invention to plant foliage, rhizosphere and / or seeds.
  • a spraying method similar to the method for controlling aboveground diseases the Paenibacillus genus or plant disease resistance inducer of the present invention is mixed with a solid carrier and a binder called a binder, or separately from plants.
  • a method of coating or immersing seeds, or a method of applying to the fertilizer, soil improvement material, soil, etc. with or without mixing, a Paenibacillus genus or plant disease resistance inducer of the present invention as a solid carrier For example, a method using microbial materials obtained by adding or not adding organic nutrients (rice bran, malt extract, amino acid, etc.), fertilizer components, etc. can be used.
  • albumin agar medium egg albumin 0.25 g, D-glucose lg, phosphate 2 potassium 0.5 g, magnesium sulfate 0.2 g, iron sulfate III tr ace, distilled water 1 L, pH 6.8 to The colonies grown after culturing at 30 ° C for 5-10 days were isolated.
  • the strains exemplified in the present invention are microorganisms isolated from tomato cultivated soil, Nagaimo cultivated soil, and organic continuous soil, and strain codes BS-0048, BS-0074, BS-0105, BS-0277 and Each was named.
  • Table 1 below shows the morphological and physiological test results of the BS-0048 strain, BS-0074 strain, BS-0105 strain and BS-0277 strain.
  • Table 1 BS-0048, BS-0074, BS-0105, BS-0277
  • each strain was judged to be equivalent to a new species.
  • the BS-010 5 strain was close to B. polymyxa or B. macerans, but differed from these species in V-P reactivity and casein utilization.
  • B. macerans and B. polymyxa force S hits were identified by the BiOLOG identification device, but the similarity was low and the species was different.
  • the BS-0074 strain was judged to be equivalent to a new species because it was somewhat similar to B. halodurans and was different in several strengths.
  • BS-0105 (trust date: June 18, 2004; trust number: FERM P-20087)
  • BS-0277 strain is Bacillus sp.
  • BS-0277 (date of trust) : Deposit date: June 18, 2004; Deposit number: FERM P-20088), deposited with the Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • the base sequence of about 1500 bp of 16S rDNA (16S rRNA gene) of Bacillus sp. BS-0105 strain was determined, and its sequence was used to search for homology to the bacterial reference strain database and GenBank / DDBJ / EMBL.
  • the 16S rDNA base sequence of Bacillus sp. BS-0105 strain showed the highest homology to PaSibacillus polymyxa 16S rDNA with a homology rate of 98.7%.
  • P. polymyxa was considered to be closely related.
  • As a result of comparing the DNA-DNA homology value using hybridization with the reference strain of Sarakuko P. polymyxa it showed a homology rate of 70% or more with respect to the reference strain.
  • Bacillus sp.BS-0105 could be teated with Paenibacillus polymyxa, although the similarity was low in the identification results with the BioLOG identification device. Therefore, the Bacillus sp. B3 ⁇ 4-0105 strain was named Paenibacillus polymyxa BS-0105.
  • a partial base sequence of about 500 bp of 16S rDNA (16S rRNA gene) of Bacillus sp. BS-0048 strain, BS-0074 strain, BS-0277 strain was determined, and the sequence was used as a reference for bacterial reference strain data. And homology to GenBank / DDBJ / EMBL.
  • the 16S rDNA nucleotide sequences of Bacillus sp. BS-0048 strain and BS-0277 strain showed the highest homology to Paenibacillus polymyxa 16S rDNA at homology rates of 98.5% and 97.5%, respectively.
  • BS-0074 strain showed the highest homology to PaSibacillus eligii 16S rDNA with a homology rate of 98.4%.
  • the Bacillus sp. BS-0048 strain contained the same phylogenetic branch as P. elgii.
  • Bacillus sp. BS-0048 strain Bacillus sp. BS-0074 strain and Bacillus sp. BS-0277 strain were identified as Paenibacillus spp. Therefore, they were named Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, and Paenibacillus sp. BS-0277, respectively.
  • BS-0074 (Transfer date: July 22, 2005 (22.07.2005); Contract number: IPOD FERM BP-10378), BS-0105 strain is Paenibacillus polymyxa BS-0105 (Transfer date: July 22, 2005) (22.07.2005); accession number: IPOD FERM BP—10379), BS-0 277 strain is Peanibacillus sp. BS-0277 (transfer date: July 22, 2005 (22.07.2005); accession number: IPOD FERM BP No. -10380), 1-chome, Tsukuba 1-chome, Ibaraki, Japan 305-8566, Japan 6 IPOD Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (IPOD).
  • IPOD FERM BP-10378 BS-0105 strain is Paenibacillus polymyxa BS-0105 (Transfer date: July 22, 2005) (22.07.2005); accession number: IPOD FERM BP—10379), BS-0 277 strain is Peanibacillus
  • Paenibacillus sp. BS 0048
  • Paenibacillus sp. B3 ⁇ 4 0074
  • Paenibacillus polymyxa BS 0105
  • YPMG medium D-glucose 10 g, meat extract lg, yeast extract 3 g, peptone 5 g, distilled
  • YPMG medium D-glucose 10 g, meat extract lg, yeast extract 3 g, peptone 5 g, distilled
  • Bacterial strains BS-0048, BS-0105, BS-0277 obtained by the above pre-culture are 10 mL of medium (D-glucose 20 g, soluble starch 10 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, malt extract 10 g, (Soy flour 15g, distilled water 1L) After inoculation in an lOOmL Erlenmeyer flask containing 1 ml, and strain BS-0074 culture O.lmL is inoculated in an lOOmL Erlenmeyer flask containing 10 ml of YPMG medium, both rotating at 200 rpm, 25 ° C The cells were cultured for 4 days under the conditions described above.
  • medium D-glucose 20 g, soluble starch 10 g, peptone 10 g, yeast extract 10 g, malt extract 10 g, (Soy flour 15g, distilled water 1L
  • O.lmL is inoculated in an
  • the whole culture lOOmL obtained in Production Example 2 was freeze-dried to obtain 3.56 g of total culture powder of 4.1 ⁇ 10 9 CFU / g.
  • a part represents a weight part.
  • the bacterium of the present invention having a dry weight of about 80 parts obtained in Production Examples 4 and 5 was mixed with 20 parts of soybean powder to obtain a wettable powder containing cells.
  • One platinum loop of the strain BS-0105-preserving bacterium of the present invention was inoculated into a 250 mL Erlenmeyer flask containing 50 mL of YPMG medium, and then cultured at 30 ° C. for 6 days at an amplitude of 100 amplitude Z minutes.
  • Zeolite 9 and soybean powder 1 were mixed at a ratio of 200 g, and 200 g of the mixture was placed in a mayonnaise bottle, and 50 mL of water was added and sterilized at 121 ° C for 30 minutes.
  • 1 mL of the culture obtained by the above pre-culture was added and cultured at 30 ° C. for 10 days to obtain a culture material of BS-0105 10 9 CFU / g.
  • the plant disease control method of the present invention has a control effect on plant diseases.
  • Plastic pots were filled with horticultural soil, cucumber (variety: Yotsuba) was sown and grown in a greenhouse for 20 days. Prepared by the method of Production Example 1 on the cotyledons of cucumber seedlings with the first leaf O.lmL of the whole cultures of the strains BS-0048, BS-0074, BS-0105, BS-0277 were applied. After placing in a glass house at 25 ° C for 3 days, plants were spray-inoculated with cucumber anthracnose fungus conidia (Colletotrichum orbiculare, 1 X 10 6 spores / mL) suspended in distilled water.
  • cucumber anthracnose fungus conidia Cold-inoculated with cucumber anthracnose fungus conidia (Colletotrichum orbiculare, 1 X 10 6 spores / mL) suspended in distilled water.
  • Control value ⁇ 1 (number of lesions in treated area, number of lesions in untreated area)) X 100
  • Plastic pots were filled with horticultural soil, cucumber (variety: Yotsuba) was sown, and grown in a greenhouse for 20 months.
  • the spore preparation of the strain BS-0105 produced by the methods of Production Examples 4, 5, 6, and 7 and formulated by the method of Formulation Example 1 was prepared on the cucumber seedlings in which the second leaf of the main leaf was developed.
  • the foliage was sprayed at a rate of 2 ⁇ 10 7 CFU / mL.
  • Colletotrichum orbiculare 1 day after holding in a dark moist chamber at 25 ° C for 24 hours, then placed in a glass house at 25 ° C for 4 days and then suspended in distilled water X 10 6 spores / mL) did.
  • Control value ⁇ 1 (number of treated lesions Z number of untreated lesions) ⁇ X 100
  • Table 3 Effect of BS-0105 strain on cucumber anthracnose control
  • Plastic pots were filled with horticultural soil, cucumber (variety: Yotsuba) was sown and grown in a greenhouse for 20 days.
  • a spore preparation of the strain BS-0105 prepared by the method of Preparation Example 1 and prepared by the method of Preparation Example 1 was prepared at the rate of 2 X 10 7 CFU / mL. Scattered. After holding in a dark humidity chamber at 25 ° C for 24 hours, placing it in a glass house at 25 ° C for 4 days, suspended cucumber spotted bacteria (Pseudomona s syringae pv. Lachrymans) suspended in distilled water. A suspension (1 ⁇ 10 8 CFU / mL) was spray-inoculated on the plant body.
  • Control value ⁇ 1 (number of treated lesions Z number of untreated lesions) ⁇ X 100
  • the preparation mainly composed of the bacterium of the present invention has the same or higher control effect compared to the impression wettable powder Nashi Benzoral S-methyl, which is a known control agent. showed that.
  • Two spore preparation samples of strain BS-0105 were produced by the method of Production Example 5 and cultivated in a plastic pot and developed by the method of Production Example 2 on strawberry seedlings (variety: Akihime) with about 10 leaflets developed.
  • the foliage was sprayed at a rate of X 10 7 CFU / mL.
  • Strawberry anthracnose conidia spores suspended in distilled water after being placed in a glass house at 25 ° C for 3 days (Amister 20 floor benole for 1 day) after being kept in a dark wet room at 25 ° C for 24 hours
  • the plant (Colletotrichum orbiculare, 2 X 10 6 spores / mL) was spray-inoculated on the plants.
  • Disease index 0 No disease
  • Disease index 1 Small spots on small leaflets
  • Disease index 2 Many small spots on stems and leaves
  • Disease index 3 Conspicuous on stems and leaves
  • Aina No. 1 Kerakura Chikkarin Co., Ltd.
  • melon variety: Earls
  • a seed treatment section was prepared by immersing melon seeds in a petri dish containing 10 mL (10 8 spores / mL) of the strain BS-0105 culture solution prepared in Production Example 2 and battling at 30 ° C for 2 hours. It was. After the cotyledon has developed, the pot is placed in a 12 cm polypot filled with Aina No. 1, and when 3 true leaves are fully developed, the strain BS-0105 culture solution prepared in Production Example 2 is used.
  • a group was prepared by irrigation with lmL (10 8 spores / mL) and foliar spray treatment, and a group in which 2 mL of 2 ppm solution of wasbenzolar S-methyl was foliar sprayed. Inoculation with the pathogenic fungus (Pseudomonas syringae pv.) Achrymans was carried out 5 days after the treatment in advance.
  • Aina No. 1 was filled in the seedling tray and melon (variety: Prince) was raised. At this time, melon seeds were immersed in a petri dish containing 10 mL (10 8 spores / mL) of the strain BS-0105 culture solution prepared in Production Example 2 and subjected to pactization at 30 ° C. for 2 hours. Bacillus sp. BS- prepared in Production Example 2 after the cotyledon was developed, filled with soil of Fusarium oxysporum f. Sp. 0105 culture broth divided into lmL / pot (10 8 spores / mL) Irrigated together.
  • Benrate wettable powder was irrigated with 2 mL of a 1000-fold diluted solution (concentration: 500 ppm).
  • the disease severity was calculated from the following equation, and the control value was calculated from the value according to the following equation to compare the control effect. The results are shown in Table 7.
  • Disease severity (Sickness index X number of shares Z4 X number of shares) X 100
  • the cells were cultured with shaking at 200 rpm, 25 ° C for 4 days.
  • the resulting butanol extract was concentrated on a rotary evaporator. After extracting the extract with ethyl acetate z distilled water, the aqueous layer was extracted with butanol Z distilled water, and the butanol layer was recovered and concentrated to dryness.
  • the crude extract was dissolved in 4 mL of dimethyl sulfoxide and purified using HPLC.
  • the HPLC conditions are as follows. That is, the mobile phase was acetonitrile-0.1% (v / v) TFA (35:65), the column was Senshu Pak PEGASIL ODS2 20 X 250 mm, the injection volume was 0.1 mL, the column temperature was 40 ° C, HPLC fractionation was performed under each condition of flow rate: 9 mL / min. The components having a retention time of 23 minutes were collected and concentrated to dryness. As a result, 60.7 mg of a mixture containing Compound 1 and Compound 2 at a ratio of 3: 2 was obtained.
  • HPLC analysis conditions were as follows: mobile phase 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) -containing 27% acetonitrile solution, CAPCELL PAK C UG120 2.0 X 100 mm (Shiseido) used as column, single injection volume 3 / z L, column Temperature 40
  • a mixture containing Compound 1 and Compound 2 in a ratio of 3: 2 was dissolved in dimethyl sulfoxide, and then diluted to a predetermined concentration with distilled water.
  • Table 11 Effect of Compound 1 and Compound 2 for controlling cucumber spotted bacterial disease
  • Plastic bats were stuffed with horticultural soil, seeded with cucumber (variety: Sagamihanjiro), and grown in a greenhouse for 12 days.
  • the cucumber seedlings in which the cotyledons were developed were sprayed with the preparation obtained in the above preparation example at a rate of ImL per strain.
  • Plant stocks were irrigated with 2 mL each. The disease was placed in a glass house at 25 ° C for 14 days to cause disease.
  • Disease index 0 No disease
  • Disease index 1 Slight yellowing on the ground
  • Disease index 2 Browning conspicuous on the ground
  • Disease index 3 Steady browning and poor growth on the ground
  • HPLC fractionation was carried out under the conditions of a single injection volume of 0.25 mL, a column temperature of 40 ° C, and a flow rate of 1 mL / min using a 5. u rn 4.6 X 250 mm. The eluate having a retention time of 20 to 35 minutes was collected every 30 seconds, and each fraction was analyzed by LC / MS.
  • the HPLC analysis conditions are as follows. In other words, 0.1% TFA-containing acetonitrile-0.1% (v / v) TFA (27:73) was used as the mobile phase, and Shiseido CAPCELL PAK C UG120 3 ⁇ 2.0 X 100 mm as the column.
  • 200 mL of the culture obtained by the above-mentioned preculture is added to 20 L of production medium (D-glucose 200 g, starch 600 g, ammonium sulfate 50 g, soybean powder 50 g, potassium hydrogen phosphate 10 g, sodium chloride 5 g, magnesium sulfate 5 g, calcium carbonate 120 g), transplanted to a jar mentor, rotation speed 400 rpm, 25 ° C, air flow rate
  • the cells were cultured at 10 L / min for 3 days.
  • Solubility Easily soluble in methanol, butanol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, insoluble in ethyl acetate, chloroform, and hexane
  • Solubility Easily soluble in methanol, butanol, isopropyl alcohol, dimethyl sulfoxide, insoluble in ethyl acetate, chloroform, and hexane
  • Acid hydrolysis When hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110 ° C for 24 hours, give glutamic acid, valine, threonine, halothrone, and alanine in a molar ratio of 1: 2: 1: 1: 2. .
  • the genus Paenibacillus of the present invention for example, novel Paenib acillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277 has an excellent effect on the control of plant diseases and is useful as a control agent.
  • these Paenibacillus spp. And known substances Compound l (Fusaricidin A) and Compound 2 (Fusaricidin B), or novel compounds 3 and 4 have plant disease resistance-inducing activity.
  • Compound l (Fusaricidin A) and Compound 2 (Fusaricidin B) novel compounds 3 and 4

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Abstract

　新規な Paenibacillus sp. BS-0048、Paenibacillus sp. BS-0074、Paenibacillus polymyxa BS-0105、Paenibacillus sp. BS-0277 並びにそれから産生される Fusaricidin A および Fusaricidin B や新規化合物３および４は、植物病害抵抗性誘導活性を有し、菌類、細菌類、ウイルスなどの感染から植物を防御することができ、その結果、植物の病害を効果的に防除することができる。

Description

明 細 書
新規な Paenibacillus属菌およびそれらの菌もしくはそれらの菌の培養物 質を利用した植物病害防除
技術分野
[0001] 本発明は、新規な Paenibacillus属菌およびそれらの菌もしくはそれらの菌の培養 物質を利用した植物病害防除に関する。更に詳細には、植物病害抵抗性誘導物質 を産生して植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより植物病害防除作用を示す ことができる Paen¾acillus属菌、より具体的には、例えば、 Paenibacillus sp. BS-0048 、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus polymyxa BS— 0105、 Paenibacillus sp. BS— 0277などの新規な Paenibacillus属菌、これらの Paenibacillus属菌による植物病害 防除、並びにこれらの Paen¾acillus属菌の培養物から得られる化合物の新規な植物 病害抵抗性誘導活性を利用した植物病害防除に関する。
背景技術
[0002] 農業分野において、あらゆる植物病害の発生は作物収量の大幅な減少を引き起こ し、その防除は農業技術上必須の手段である。これら病害を防ぐ手段としては栽培 環境の制御、病害抵抗性品種の育成、農園芸用殺菌剤の散布による防除、農業用 資材等による生物的防除等あるが、その中で農園芸用殺菌剤による防除が直接的 で最も効果が高い。しかし環境汚染や環境生物に与える影響の問題から、これら殺 菌剤を大量に散布して直接的に防除する手段に大きく依存するのは明らかに問題で あると言;^る。
[0003] そのような状況の中、病原菌に対して特異的に効果を示し、選択毒性という点で非 常に優れた殺菌作用を有する農園芸用殺菌剤も開発されているが、そのような薬剤 は病原菌の薬剤耐性を引き起こしやすいという欠点も有し、その対策に作用性の異 なった複数の薬剤を混合して、あるいはローテーションで散布して ヽるのが現状であ る。
これらの化学農薬の過度な依存の問題を解決するために、近年、自然界に普遍的 に存在している微生物や天敵を利用して各種作物病害や害虫を防除する方法が実 用化されてきており、防除体系も改善されつつある。例えば、特許文献 1には、 Bacill us subtilis FR- 2、 Bacillus polymyxa KT- 8などの微生物の菌体を植物真菌感染防 除剤として用いることが提案されている。しかしながら、その性能や種類はまだ十分と 言えるものではなぐさらに優れた生物防除剤が必要とされている。
[0004] 薬剤耐性菌発生の問題を解決するためには、本来植物が持っている病害抵抗性 を付与する物質や微生物の利用が最も有効であると考えられる。
現在まで、植物病害に対する抵抗性を誘導する物質はサリチル酸などいくつか知 られているものの、実際に植物病害防除薬剤として用いられているものは、 1,2,3-ベ ンゾチアゾール -7-カルボン酸 S-メチル エステル（一般名ァシベンゾラル Sメチル）（ 非特許文献 1、非特許文献 2)、 3-(2-プロピレンォキシ )-1,2 -ベンズイソチアゾール- 1, 1-ジォキサイド (一般名プロべナゾール）（非特許文献 3)等の数種に限られ、十分 であるとは言えない。
特許文献 2には、植物病害に対する抵抗性を誘導する細菌と有機土壌改良剤とを 用いて、植物の病気に対する耐性を付与することが記載されてはいる力 この方法も 十分であるとは言えない。
[0005] 一方、特許文献 3には、 Bacillus sp. KB-291によって産生される抗菌活性物質 KT -6291A (Fusaricidin A)が各植物病害を防除することが報告されている。しかしなが ら、特許文献 3に記載の抗菌活性物質 KT-6291Aは、グラム陰性細菌であるキユウリ 斑点細菌病菌に対して活性を示さな 、こと、その他のグラム陰性細菌に対しても活性 を示さな 、ことが明らかにされており、グラム陰性細菌によって引き起こされる植物病 害を防除する方法の記載がなぐさらに Fusarium属菌であるキユウリつる割病菌に 対しても抗菌活性を示さな 、ことが示されて 、る。また 、くつかの微生物に対して抗 菌活性を示す他の物質についての記述はあるが、植物病害抵抗性誘導活性に関す る知見は全くない。
[0006] 非特許文献 4にも、同様に、 Bacillus polymyxa KT- 8から抗菌活性物質 Fusaricidi n Aが産生されるが、この物質はグラム陰性細菌に対して活性を示さないことが明ら かにされている。
さらに、非特許文献 5には、 Bacillus polymyxa KT-8から抗菌活性物質 Fusaricidin Aとともに Fusariddin Bなどもが産生されるが、これらの物質もグラム陰性細菌に対 して活性を示さな 、ことが明らかにされて 、る。
特許文献 1：特開平 6 - 253827号公報
特許文献 2：特表 2003 - 529539号公報
特許文献 3：特開平 2— 275898号公報
非特許文献 l : Plant Physiol. 117, p.1333- 1339 (1998)
非特干文献 2： Brighton crop protection conference - pests & di sea ses - 1996, 8A— 4, CGA2455704
非特許文献 3 :Annu. Rev. Phytopathol. 32, p.439-59, (1994)
非特許文献 4 : The Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129- 135
(1996)
非特許文献 5 : The Journal of Antibiotics VOL.50, No.3, p.220-228
(1997)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 従って、本発明の課題は、植物病害抵抗性誘導活性を示すことができる Paenibadl lus属菌を提供すること、更には、植物病害抵抗性誘導物質を提供することにある。 また、本発明の課題は、これらを利用した、植物病害防除剤、植物病害防除方法を 提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記の状況を鑑み、より優れた植物病害防除方法を見出すべく鋭 意検討を重ねた結果、菌株の形態学的 ·生理性状学的試験により同定した場合には Bacillus属に属し、 16S rDNA塩基配列解析により同定した場合には Paenibacillus 属に属するある種の細菌が、優れた植物病害防除効果を有することを見出した。また 、これらの Bacillusもしくは Paenibacillus属に属するある種の細菌の培養物中に植 物病害抵抗性誘導活性を有する化合物が存在することが明らかになった。本発明は これらの知見に基いて完成されたものである。
しかして、本発明は、植物病害防除作用を有する新規な Paenibacillus属菌に関す る。
更に本発明は、植物病害抵抗性誘導物質を産生して植物病害抵抗性誘導活性を 発揮することにより植物病害防除作用を示すことができる Paenibadllus属菌に関す る。
更に本発明は、上記の Paenibadllus属菌を含有する組成物に関する。
更に本発明は、上記の Paenibadllus属菌の培養物から得られる単一の植物病害 抵抗性誘導物質あるいはそのいくつかの組み合わせを含有する組成物に関する。 更に本発明は、上記の組成物から成る植物病害防除剤に関する。
更に本発明は、植物病害抵抗性誘導物質として、下記構造を有する化合物 Fusa ricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4から選ばれる少なくとも
1つに化合物を含有する植物病害防除剤に関する。
[化 1]
Figure imgf000006_0001
化合物 1 (Fusaricidin A)
[化 2]
Figure imgf000007_0001
化合物 2 (Fusaricidin B)
[化 3]
Figure imgf000007_0002
化合物 3
[化 4]
Figure imgf000008_0001
化合物 4 更に本発明は、上記の Paenibacillus属菌、組成物または植物病害防除剤を、植物 に適用して植物病原体の感染から植物体を防御することを特徴とする植物病害防除 方法に関する。
更に本発明は、上記の構造式を有する新規な化合物 3および 4に関する。
本発明において、 Paenibacillus属菌とは、菌株の形態学的'生理性状学的試験に より同定した場合には Bacillus属に属し、 16S rDNA塩基配列解析により同定した場 合には Paenibacillus属に属する菌を意味する。
発明の効果
本発明の Paenibacillus属菌は、植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、 P seudomonas属菌などのグラム陰性細菌や Fusarium属菌によって引き起こされる植 物病害を防除することができる。
また、本発明によって見出された新規な微生物 Paen¾acillus sp. BS_0048、 Paenib acnlus sp. BS - 0074、 Paenibacillus polymyxa BS - 0105、 Paenibacillus sp. BS - 0277は 、これらのグラム陰性細菌や Fusarium属菌によって引き起こされる植物病害を防除 することができるとともに、通常の植物病原菌、例えば、 Colletotrichum属菌ゃ Glom erella属菌などの広範囲の植物病原菌によって引き起こされる植物病害を防除する ことができる。ここで、例えば、 Paenibacillus sp. BS-0048とは、菌株の形態学的'生 理性状学的試験により同定した場合には、 Bacillus sp. BS-0048と命名することがで き、 16S rDNA塩基配列解析により同定した場合には Paen¾acillus sp. BS-0048と 命名することができる同一の菌株を意味する。また、 Paen¾acillus polymyxa BS-0105 とは、菌株の形態学的，生理性状学的試験により同定した場合には、 Bacillus属に 属する Bacillus sp. BS-0105と命名することができ、 16S rDNA塩基配列解析により 1 疋'した場合には Paenibacillus属の polymyxa種に為する Paenibacillus polymyxa BS-0105と命名することができる同一の菌株を意味する
また、 Paen¾acillus属菌によって産生される化合物 l(Fusaricidin A)、化合物 2(Fus aricidin B)、化合物 3およびィ匕合物 4は、植物病害抵抗性誘導活性を有し、従って、 植物病原体の感染から植物体を防御する作用を有するため、植物病害防除に有効 である。
図面の簡単な説明
[0010] [図 1]本発明の新規な化合物 3のプロトン核磁気共鳴スペクトル（DMSO-d6)を示す。
[図 2]本発明の新規な化合物 4のプロトン核磁気共鳴スペクトル (DMSO-d6)を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明により、植物病害防除作用を有する新規な Paenibacillus属菌が提供され、 また、植物病害抵抗性誘導物質を産生して植物病害抵抗性誘導活性を発揮するこ とにより植物病害防除作用を示すことができる Paenibacillus属菌が提供される。本発 明の植物病害抵抗性誘導物質としては、例えば、上記の化合物 Fusaricidin A)、 化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3、化合物 4が挙げられる。
ここで言う植物病害抵抗性誘導活性とは、植物病害に対して、所謂、〃誘導抵抗性 (induced resistance)"を付与する活性を意味する。このような活性を有する物質を産 生することができる Paen¾acillus属菌や、化合物 Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaric idin B)、化合物 3、化合物 4などの植物病害抵抗性誘導物質は、植物病原体の感染 から植物体を防御することができる。従って、直接抗菌活性を示すことなぐ植物病害 抵抗性誘導活性を発揮して植物病原体の感染から植物体を防御し、その結果、植 物病害を防除することができる。
[0012] このような Paenibacillus属菌としては、具体的には、例えば、本発明により見出され ァこ新規な Paenibacillus sp. BS - 0048、 Paenibacillus sp. BS - 0074、 Paenibacillus polym yxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277またはそれらの変異体が挙げられる。変異 体としては、例えば、自然に起こる自然突然変異や、紫外線などの物理的原因、塩 基ィ匕合物などの化学的変異原等によって生じる変異体であって、本発明が意図する 機能、すなわち、植物病害抵抗性誘導物質、例えば、化合物 Fusariddin A)、化合 物 2(Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4力 選ばれる少なくとも 1つの化合物を 産生して植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより植物病害防除作用を示すこ とができる変異体であれば、 、ずれの変異体であってもよ!/、。
また、本発明に用いられる Paenibacillus属菌は、菌株の形態学的'生理性状学的 試験により同定した場合には Bacillus属に属するといえる菌株であっても、 16s DNA 塩基配列解析により同定した場合には Paenibacillus属に属する菌株であればよい。
[0013] 本発明の Paenibacillus属菌は、植物病害抵抗性誘導物質を産生して植物病害抵 抗性誘導活性を発揮することにより、グラム陰性細菌や Fusarium属菌によって引き 起こされる植物病害を防除することができる。また、植物病害抵抗性誘導物質である 、例えば、上記の化合物 Fusariddin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3、化合 物 4自体も、植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、グラム陰性細菌や Fus ari醒属菌によって引き起こされる植物病害を防除することができる。
グラム陰性細菌によって引き起こされる植物病害としては、例えば、 Pseudomonas 属菌によって引き起こされる植物病害が挙げられ、具体的には、例えば、キユウリゃメ ロンの斑点細菌炳 (Pseudomonas synngae pv. lachrymansノなどのゥリ類の斑 、糸田菌 病、イネの葉鞘褐変病 (Pseudomonas foscovaginae)などが挙げられる。 Fusarium属 菌によって引き起こされる植物病害としては、例えば、ムギ類の赤かび病（Fusarium g raminearum、 Fusarium avenaceum、 Fusarium culmorum)、やユウリのつる^!病 (Fusan um oxysporum f. sp. cucumerium)、メロンのつる害 (！れ病 (Fusarium oxysporum f. sp. melonis)、トマトの萎调病 (Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)など; 0 げられる。
[0014] 本発明の Paenibacillus属菌、例えば、新規な Paenibacillus sp. BS- 0048、 Paeniba cillus sp. BS - 0074、 Paenibacillus polymyxa BS - 0105、 Paenibacillus sp. BS - 0277は、 上記したグラム陰性細菌や Fusarium属菌によって引き起こされる植物病害を防除す ることができるとともに、通常の植物病原菌、例えば、 Colletotrichum属菌ゃ Glomere 11a属菌などの広範囲の植物病原菌によって引き起こされる植物病害を防除すること ができる。 Colletotrichum属菌によって引き起こされる植物病害としては、例えば、キ ユウリの炭そ病（Colletotrichum orbiculare)などのゥリ類炭そ病、イチゴの炭そ病（Coll etotrichum acutatum)などが挙げられ、 Glomerella属菌によって引き起こされる植物 病害としては、例えば、ブドウの晚腐病（Glomerella dngulata)、イチゴの炭そ病（Glo merella cingulata)などが挙げられる。
[0015] これら以外にも、例えば、各作物の灰色かび病 (Botrytis cinerea)、菌核病（Scleroti ma sclerotiorum)、ィネの ヽもち (Pyricularia oryzae)、紋枯れ病 (Thanatephorus c ucumeris)およびごま葉枯れ病 (Cochliobolus miyabeanus)、リンゴの黒星病 (Venturia inaequalisノ、斑 、落葉; I丙 (Alternaria mali)および腐らん病 (Valsa ceratosperma)、ナ シの黒斑病 (Alternaria kikuchiana)および黒星病（Venturia nashicola)、カンキッの 黒点病 (Diaporthe citri)、青かび病 (Penicillium italicum)およびカ^、よう病 (Xanthom onas campestris pv. citri)、モモのホモプンス腐敗;)丙 (Phomopsis sp.リおよび灰星病 ( Monilinia fructicola)、カキの炭そ病、Gloeosporium kaki)および角斑落葉;！丙 (Cercos pora kaki)、ム 類のっとんこ;！丙 (Erysiphe graminis)、さび病 (Puccinia graminis, P. st niformis, P. recondita)、 黒 病 (Ustilago nudaノおよひ赤； び 3 (Gioberella zeae 、 Monographella nivalis)、 =ユウリのっとんこ病 (Sphaerotheca cucurbitae)、つる枯^丙 (Didymella bryoniae)およびべと;)丙 (Pseudoperonospora cuoensis)、トマトの 力び ί丙 (Fulvia fiilva)、ナスの半身萎凋病 (Verticillium dahliae)、褐色腐敗病 (Phytophthora capsici)および青枯 (Ralstonia solanacearum)、タノコの赤星 (Alternaria alterna ta)、テンサイの褐斑病（Cercospora beticola)、ジャガイモ疫病（Phytophthora infesta ns)、タ ス'の紫斑; I丙 し ercospora kikuchiリ、タイコンのベと病 (Pernospora brassicae )、ホウレンソゥのべと病 (Peronospora spinaciae)、レタスの斑点細菌病 (Xanthomona s campestris pv. vitiansノおよび軟腐 3 (Erwinia carotovora subsp. carotovora)、ゃャ べッの黒腐病 (Xanthomonas campestris pv. campestris)、アブラナ科野菜の根こふ 病（Plasmodiophora brassicae)、各作物の苗立枯病 (Pythium sp.)、果樹の紫紋羽病 (Helicobasidium mompa)、シノ のラージノヽッテ (Rhizoctonia solani)およびカーブフリ ァ葉枯病（Curvularia sp.)などにも、本発明の Paen¾acillus属菌は有効である。
[0016] 更には、本発明の Paenibacillus属菌、あるいは植物病害抵抗性誘導物質である、 例えば、上記の化合物 Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3、化合物 4自体は、植物病害抵抗性誘導活性を発揮するため、植物病原体の感染から植物 体を防御して、その結果、植物病害を防除することができる。植物病原体としては、 上記した各種の細菌や、菌類、その他、ウィルス類を挙げることができる。
菌類としては、例えば、各作物の灰色かび病（Botrytis cinerea)、菌核病（Sclerotini a sclerotiorum)、ィ不の ヽ ¾ち;!丙 (Pyncularia oryzae 、紋枯れ丙 i nanatephorus cue umeris)およびごま葉枯れ病 (Cochliobolus miyabeanus)、リンゴの黒星病（Venturia i naequalis)、斑 、 葉;)丙 (Alternaria mali)および腐らん; i丙（Valsa ceratosperma)、ナ シの黒斑病 (Alternaria kikuchiana)および黒星病（Venturia nashicola)、カンキッの 黒点病（Diaporthe citri)および青かび病 (Penicillium italicum)、モモのホモプシス腐 敗病 (Phomopsis sp.)および灰星病 (Monilinia fructicola)、力キの炭そ病 (Gloeospori um kaki)および角斑落葉病（Cercospora kaki)、ブドウの晚腐病 (Glomerella cingulat a)、ム3 のつどんこ; I丙 (Erysipne graminis)、さび病 (Puccinia graminis, P. stniformis , P. recondita)、裸黒稳病 (Ustilago nuda)および赤力び;!丙（Monographella nivalis;、 ユウリのつどんこ; ¾ (bpnaerotheca cucurbitae)、っ 枯丙 (Didymella bryoniae)、炭 そ; ¾、し olletotncnum oroiculare およ！ ベと病 (Pseudoperonospora cubensisノ、トマト の葉かび病 (Fulvia fiilva)、ナスの半身萎凋病（Verticillium dahliae)および褐色腐敗 ¾ (Phytophthora capsicリ、イチゴの そ; ¾ (し ollectorichum acutatum, ulomerella ci ngulata)、タノくコの赤星病 (Alternaria alternata)、テンサイの褐斑病 (Cercospora beti cola)、ンャガイモ疫病 (Phytophthora infestansリ、タイズの紫斑病 (Cercospora kikuc hii)、タイコンのベと病 (Pernospora brassicae)、ホウレンソゥのべと ί丙 (Peronospora sp inaciae)、アブラナ科野菜の根こぶ病（Plasmodiophora brassicae)、各作物の苗立枯 病（Pythium sp.)、果樹の紫紋羽病（Helicobasidium mompa)、シバのラージパッチ（R hizoctonia solani)およびカーブラリア葉枯病（Curvularia sp.)などが挙げられる。 上記以外の細菌類としては、カンキッのか!/、よう病（Xanthomonas campestris pv. ci tri)、ナスの靑枯病 (Ralstonia solanacearum)レタスの斑 、糸田菌;)丙 (Xanthomonas cam pestns pv. vitians)および軟腐病 (Erwinia carotovora subsp. carotovora)、 = ャへッ の黒腐病 (Xanthomonas campestris pv. campestris)など力罕げられる。 ウイノレス類としては、 f列えば、キユウリモザイク丙、 cucumber mosaic cucumovirus、 wa termelon mosaic2 potyvirus ^ zucchini yellow mosaic potyvirus)、トマトゥ ノレス；) ¾ (tob acco necrosis necro virus)、イチゴゥイノレス; ¾ (strawberry crincle cytorhabdovirus、 str awberry latent C virus、 soybean dwarf luteovirus、 strawberry mottle virus、 strawberr y pseudo mild yellow edge carlavirus、 strawberry vein banding caulimovirus、 tabocco mosaic tobamovirus、 tobacco necrosis necrovirus)、キャベツモザィク;!丙 (cauliflower mosaic caulimovirus、 cucumber mosaic cucumovirus、 turnip mosaic potyvirusノ、グイ ズゥイノレス;!丙 (southern bean mosaic sobemovirus、 peanut stunt cucumovirus、 bean c ommon mosaic potyvirus ^ broad bean wilt fabavirus)、ンャガイモ葉卷病 (potato leafr oil luteovirus)などが挙げられる。
[0018] 本発明の Paen¾acillus属菌を植物病害防除に用いるには、通常、 Paen¾acillus属 菌の芽胞、栄養菌体、全培養物などを用いることができる。これらは、通常の方法に より、 Paenibacillus属菌を培養して、その培養物力も調製することができる。例えば、 得られる全培養物をそのまま凍結乾燥することにより、全培養物粉末として全培養物 を調製することができる。例えば、培養後、全培養物を遠心分離して夾雑物を除去し 、得られる上清を更に遠心分離し、沈殿した菌体を洗浄して、菌体沈殿物として栄養 菌体を調製することがきる。また、例えば、ここで得られる菌体沈殿物を蒸留水に懸 濁して凍結乾燥することにより、凍結乾燥菌体粉末として、芽胞を調製することができ る。
本発明で用いられる Paenibacillus属菌は、通常生菌であるが、熱処理等によって 死滅させた菌でもよい。なお、ここで生菌とは、上記したように、培養物から得られたも のおよびその乾燥菌、培養物から濾過や遠心分離等の通常の方法により分離された 菌および分離'採取後に乾燥された菌の両者を包含するものである。
[0019] Paenibacillus sp. BS- 0048、 Paenibacillus sp. B¾- 0074、 Paenibacillus polymyxa BS- 0105、 Paenibacillus sp. BS-0277などの Paenibacillus属菌の培養は、一般細菌にお ける通常の培養方法に準じて行なわれ、固体培養または液体培養 (試験管振とう培 養、往復式振とう培養、回転振とう培養、ジャーフアーメンター培養、タンク培養等)な ど、考えられるいずれの方法でも可能である。培養培地としては各種の炭素源、窒素 源、有機塩、無機塩を適宜に組み合わせて用いることが出来る。一般に炭素源として は、例えば、グルコース、デンプン、グリセリン、デキストリン、シユークロース、動植物 油等が挙げらる。有機窒素源としては、例えば、酵母エキス、大豆粉、コーン'スティ ープ 'リカー（corn steep liquor)、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン等が挙げられる。無 機窒素源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、酢 酸アンモ-ゥム等が挙げられる。有機塩、無機塩としては、例えば、酢酸ナトリウム等 の酢酸塩;炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム等の炭酸塩;塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム 等の塩ィ匕物；リン酸 2水素 1カリウム、リン酸水素 2ナトリウム等のリン酸塩;硫酸第一鉄 、硫酸亜鉛、硫酸銅等の硫酸塩などが挙げられる。培養温度は微生物が生育可能 な範囲で適宜変更できる力 好ましくは 20°C〜40°Cの範囲である。通常、培養は好 気的条件下で行なわれ、特にジャーフアーメンターや培養タンクで培養する場合に は、無菌空気を送入して行うが、生育可能な条件であれば方法、条件は特に限定さ れない。
[0020] 本発明で植物病害抵抗性誘導物質として用いる化合物 Fusaricidin A)や化合物 2(Fusaricidin B)は、例えば、本発明で見出された新規な Paen¾acillus sp. BS-0048、 Paenibacillus sp. B¾— 0074、 Paenibacillus polymyxa B¾— 0105、 Paenibacillus sp. B¾— 0 277などの Paenibacillus属菌、あるいは、これらの化合物を産生することが知られて いる、 Bacillus sp. KB— 291 (特開平 2— 275898号公報)、 Bacillus polymyxa KT— 8 (Τ he Journal of Antibiotics VOL.49, No.2, p.129— 135 (1996); The Journal of Antibiotic s VOL.50, No.3, p.220-228 (1997》などの Bacillus属菌の培養物から得ることが出 来る。また、化合物 3や化合物 4は、本発明で見出された上記の新規な Paenibacillus 属菌の培養物力も得ることが出来る。具体的には、これらの菌を、通常の方法で培 養し、得られる培養液から、これらの文献に記載された方法や、通常の精製方法を組 み合わせること〖こより得ることができる。例えば、培養液を、ブタノール、酢酸ェチルな どで抽出し、抽出液を高速液体クロマトグラフィーなどに付することにより得ることがで きる。
[0021] 本発明の植物病害防除において用いられる Paenibacillus属菌、あるいは化合物 1 (Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3、化合物 4などの植物病害抵抗 性誘導物質は、他の成分を何ら加えず、そのまま使用することもできる。必要に応じ て固体担体、液体担体等の各種担体と混合して調製したもの、または添加剤等の製 剤用補助剤を加えて、水和剤、溶液剤、懸濁剤、粒剤、粉剤、マイクロカプセル剤、 ペースト剤等に製剤化したものを用いることもできる。
これらの製剤には、本発明の Paenibadllus属菌を、通常重量比（細菌は湿潤量） で約 0.1 %〜99%含有する。また、製剤 lg当たり約 103〜約 1011のコロニー形成単 位（以下、 CFUと記す。）の本発明の Paenibadllus属菌を含有することが望ましい。ま た、 Paenibadllus属菌の芽胞、栄養菌体あるいは全培養物を用いる場合には、製剤 lgあたり約 103〜10u CFUあるいは通常重量比（湿潤量）で約 0.1%〜99%の量 を含有するのが望ましい。植物病害抵抗性誘導物質の場合には、化合物 1 (Fusarici din A)、化合物 2 (Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4力 選ばれる少なくとも 1 つの化合物を 0.01%〜99%の量を含有するのが望ましい。
[0022] 製剤化で用いられる固体担体としては、例えば、鉱物質粉末 (カオリンクレー、ベン トナイト、珪藻土、合成含水酸化珪素、タルク類、石英、バーミキユライト、パーライト等 )、無機塩 (硫安、燐安、硝安、尿素、塩安等)、有機物粉末 (小麦粉、大豆粉、フスマ 、キチン、米糠、脱脂粉乳、全脂粉乳等)、活性炭、炭酸カルシウム等があげられ、液 体担体としては、例えば、水、グリセロール、植物油（大豆油、なたね油等）、液体動 物油（魚油等）、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 ポリプロピレングリコール等が挙げられる。
[0023] 製剤用補助剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、多糖類 (でんぷん粉、ァラビ ァゴム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、糖類、植 物油、鉱物油、合成水溶性高分子 (ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸類等）、プ ロピレンダリコール、エチレングリコール等の凍結防止剤、シリコン系化合物等の消泡 剤、天然多糖類 (ザンサンガム等)、無機物 (アルミニウム、ベントナイト等)、合成水溶 性高分子 (ポリアクリル酸等)等の増粘剤などを挙げることができる。
殺虫剤、殺線虫剤、殺ダニ剤、殺菌剤、除草剤、植物生長調節剤、展着剤、肥料、 微生物資材、土壌改良資材等と混合して用いることもでき、また混合せずに同時に 用いることちでさる。 [0024] 本発明の植物病害防除においては、用いられる Paenibacillus属菌の有効成分の 施用量 (湿潤量）は、通常、 10アールあたり約 O.lg〜約 10000gであり、好ましくは約 10g〜約 1000gである。水和剤、懸濁剤、マイクロカプセル剤等を水で希釈して用い る場合、施用時の細菌濃度は通常、約 103CFUZmL〜約 10uCFUZmLであり、好 ましくは約 105 CFU/mL〜約 109 CFU/mLである。粒剤、粉剤、ペースト剤等は何 ら希釈することなく製剤のままで施用することができる。
また、 Paenibacillus属菌の芽胞、栄養菌体あるいは全培養物を用いる場合の施用 量は、 10アールあたり約 O.lg〜約 10000g (湿潤量）が望ましぐ水で希釈して用いる 場合、施用時の芽胞あるいは栄養菌体の濃度は 103〜101Q CFU/mLが望ましい。 また植物病害抵抗性誘導物質の施用量は、 10アールあたり約 0.001g〜10000gが 望ましぐ水で希釈して用いる場合、施用時の化合物 1 (Fusaricidin A)、化合物 2 (Fu saricidin B)、化合物 3およびィ匕合物 4力 選ばれる少なくとも 1つの化合物の濃度は 0.1〜1000
Figure imgf000016_0001
が望ましい。
[0025] 本発明の植物病害防除においては、本発明の Paenibacillus属菌あるいは植物病 害抵抗性誘導物質を、植物の茎葉、根圏および/または種子に施用するのが好まし い。実際に植物に適用するには、例えば、通常行われる粒剤を株元あるいは土壌に 施用する方法、希釈液もしくは希釈しない液を株元あるいは土壌に施用する方法な どがある。その他に、例えば、地上部病害を防除する方法と同様の散布法、本発明 の Paenibacillus属菌あるいは植物病害抵抗性誘導物質を固体担体およびバインダ 一と呼ばれる固着剤等と混合、もしくは別々に植物の種子にコーティングあるいは浸 漬処理する方法、または肥料、土壌改良資材、培土等と混合、もしくは混合せずに同 時に施用する方法、本発明の Paenibacillus属菌あるいは植物病害抵抗性誘導物質 を固体担体に吸着させ、さらに有機系栄養素 (米糠、麦芽エキス、アミノ酸等)、肥料 成分等を添加、または添加せずに得られる微生物資材を使用する方法などを用いる ことができる。
これらの施用量、施用濃度は、いずれも製剤の種類、施用時期、施用場所、施用 方法、栽培方法、作物の種類、植物病害の種類、被害程度等の状況によって異なり 、上記の範囲にかかわることなく増カロさせたり、減少させたりすることができる。 [0026] 以下、本発明の植物病害防除について、細菌の分離例、製造例、製剤例、試験例 、培養例、抽出例、精製例、調製例および評価例により、さらに詳しく説明するが、本 発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
細菌の分離例 1
新規な Paenibacillus sp. BS- 0048、 Paenibacillus sp. BS- 0074、 Paenibacillus polvm vxa BS- 0105、 Paenibacillus sp. BS-Q277の分離および同定 全国各地の栽培圃場より、トマト、ナス、ピーマン、キユウリ、メロン、ホウレンソゥ、ィ チゴ、ダイコン、ナガィモなどの根圏土壌および根を採取した。この根圏土壌あるい は根 10gを滅菌水 90 mLを入れたふた付きガラス瓶に入れ超音波あるいは振盪処 理を行った。この懸濁液を適宜希釈した液 lmLをアルブミン寒天培地 (エッグアルブ ミン 0.25g、 D—グルコース lg、リン酸 2カリ 0.5g、硫酸マグネシウム 0.2g、硫酸鉄 III tr ace、蒸留水 1L、 pH 6.8〜7.0)と混釈して 30°Cで 5〜10日間培養して生育したコロ ニーを分離した。
[0027] (2) 的 験による^^の 定
本発明で例示する菌株は、トマト栽培土壌、ナガィモ栽培土壌、有機連用土壌より 分離された微生物であり、菌株コード BS-0048株、 BS-0074株、 BS-0105株、 BS-0 277株とそれぞれ命名した。下記の表 1に BS-0048株、 BS-0074株、 BS-0105株、 B S-0277株の形態学的'生理性状学的試験結果を示す。
[0028] [表 1]
表 1 ： BS-0048 株、 BS-0074 株、 BS-0105 株、 BS-0277 株の
形態学的 ·生理性状学的試験結果
Figure imgf000018_0001
[0029] BS-0048株および BS - 0277株は、 B. polymyxaとの類似性が最も高くなつているが
V-P反応性が異なっていることからそれぞれの菌株を新種相当と判定した。 BS-010 5株は、 B. polymyxaあるいは B. maceransに近いが、 V-P反応性とカゼイン資化性 においてこれらの種と異なっていた。また、 BiOLOG同定装置での同定結果では B. maceransおよび B. polymyxa力 Sヒットしたが類似性は低く異なる種であったことから 本菌株を新種相当と判定した。 BS-0074株は、 B. haloduransとの類似性がやや高い 力 資化性でいくつ力の相違があったことから本菌株を新種相当と判定した。
[0030] 上記の形態学的'生理性状学的試験により、トマト、ナガィモあるいは有機連用栽 培土壌より分離した BS- 0048株、 BS- 0074株、 BS- 0105株、 BS- 0277株は、いずれ も Bacillus sp.と同定され、それぞれ BS- 0048株は Bacillus sp. BS- 0048 (受託日：平 成 16年 6月 18 日；受託番号： FERM P- 20085)、 BS- 0074株は Bacillus sp. BS- 00 74 (受託日：平成 16年 6月 18 日；受託番号： FERM P- 20086)、 BS- 0105株は Bad llus sp. BS- 0105 (受託日：平成 16年 6月 18日；受託番号： FERM P- 20087)、 BS-0 277株は Bacillus sp. BS- 0277 (受託日：平成 16年 6月 18日；受託番号： FERM P -20088)として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD)に 寄託されている。
[0031] (3) 16S rDNA塩某配列解析による同定
Bacillus sp. BS- 0105株の 16S rDNA (16S rRNA遺伝子）の塩基配列約 1500bpを 決定し、その配列を用いて細菌基準株データベースおよび GenBank/DDBJ/EMBL に対する相同性を検索した。その結果、 Bacillus sp. BS-0105株の 16S rDNA塩基 配列は、相同率 98.7%で Paenibacillus polymyxaの 16S rDNAに対して最も高い相 同性を示し、分子系統榭を作成して分子系統解析を行なった結果、 P. polymyxaと 近縁である可能性が高いと考えられた。さら〖こ P. polymyxaの基準株との間で、ハイ ブリダィゼーシヨンを用いた DNA-DNA相同値を比較した結果、基準株に対して 70 %以上の相同率を示した。
以上から、 BioLOG同定装置での同定結果では類似性が低かったものの、 Bacillus sp.BS— 0105 を Paenibacillus polymyxaで teると | 疋した。従って、 Bacillus sp.B¾— 0105株を Paenibacillus polymyxa BS- 0105と命名した。
[0032] Bacillus sp. BS- 0048株、 BS- 0074株、 BS- 0277株の 16S rDNA(16S rRNA遺伝 子）の部分塩基配列約 500bpを決定し、その配列を用いて細菌基準株データべ一 スおよび GenBank/DDBJ/EMBLに対する相同性を検索した。その結果、 Bacillus sp . BS-0048株および BS-0277株の 16S rDNA塩基配列は、それぞれ相同率 98.5% および 97.5%で Paenibacillus polymyxaの 16S rDNAに対して最も高い相同性を 示した。また、 Bacillus sp. BS-0074株の 16S rDNA塩基配列は、相同率 98.4%で Paenibacillus eligiiの 16S rDNAに対して最も高い相同性を示した。いずれのデータ ベースに対する相同性検索においても、 Bacillus sp. BS-0048株、 BS- 0074株、 BS- 0277株と相同性の高い上位 30菌株は、 Paenibacillus由来の 16S rDNAが占め、 分子系統榭を作成して分子系統解析を行なったところ、 Bacillus sp. BS-0048株、 BS -0277株は P.polymyxaを中心とするクラスター内に含まれ、 Bacillus sp. BS-0048株 は、 P.elgiiと同一の系統枝を示した。
以上から、 Bacillus sp. BS-0048株、 Bacillus sp. BS- 0074株、 Bacillus sp. BS- 0277 株は、 Paenibacillus属菌であると同定した。従って、それぞれ、 Paenibacillus sp. BS- 0048、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus sp. BS— 0277と命名した。
[0033] 上記の新たな命名に従って、日本国〒 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 IPOD (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD)に寄託さ れている、菌株を新たな命名に変更するとともに、国内寄託をブダペスト条約に基づ く国際寄託に移管した。その結果、 BS-0048株は、 Paen¾acillus sp. BS-0048 (移管 日 : 2005年 07月 22 日 (22.07.2005)；受託番号： IPOD FERM BP- 10377)、 BS- 007 4株は Paenibacillus sp. BS- 0074 (移管日 : 2005年 07月 22 日 (22.07.2005)；受託 番号： IPOD FERM BP- 10378)、 BS- 0105株は Paenibacillus polymyxa BS- 0105 (移 管日 : 2005年 07月 22 日 (22.07.2005)；受託番号： IPOD FERM BP— 10379)、 BS—0 277株は Peanibacillus sp. BS- 0277 (移管日 : 2005年 7月 22 日 (22.07.2005)；受託 番号： IPOD FERM BP-10380)として、 日本国〒 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1 番地 1中央第 6 IPOD (独)産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IPOD)に 寄託されている。
[0034] 製造例 1
Paenibacillus sp. BS— 0048、 Paenibacillus sp. B¾— 0074、 Paenibacillus polymyxa BS— 0105、 Paenibacillus sp. BS- 0277の培着
本発明の菌株 BS-0048、 BS-0074, BS-0105、 BS-0277の保存菌の一白金耳を 10 mLの YPMG培地（D—グルコース 10g、肉エキス lg、酵母エキス 3g、ペプトン 5g、 蒸留水 1L、 pH 7.0とする）を含む 50mL試験管内に植菌後、振幅数 100振幅 Z分 、 25°C、暗黒条件下で 3 日間培養した。上記前培養により得られた菌株 BS-0048、 BS- 0105、 BS-0277培養物 O.lmLは 10mLの培地（D—グルコース 20g、可溶性デン プン 10g、ペプトン 10g、酵母エキス 10g、麦芽エキス 10g、大豆粉 15g、蒸留水 1L) を含む lOOmL容三角フラスコ内に植菌後、また菌株 BS-0074培養物 O.lmLは 10 mlの YPMG培地を含む lOOmL容三角フラスコ内に植菌後、いずれも回転数 200rp m、 25°Cの条件で 4日間培養した。
[0035] 製造例 2
Paenibacillus polvmvxa BS— 0105の培着
本発明の菌株 BS-0105保存菌の一白金耳を lOOmLの YPMG培地を含む 250mL 容三角フラスコ内に植菌後、振幅数 100振幅 Z分、 30°C、暗黒条件下で 7日間培 し 7こ。
[0036] 製造例 3
Paenibacillus polvmvxa BS- 0105の全焙着物の調製
製造例 1によって得られた菌株 BS-0105の全培養物の約 1Lを 1500rpm、 5分間 遠心分離して培地由来の夾雑物を除去した後、上清を 8000rpm、 20分間遠心分離 し菌体を沈殿させた。 0.8%生理食塩水で沈殿物を洗浄し再度 8000rpm、 20分間遠 心分離した。この操作を 2回繰返して菌体沈殿物を得た。
[0037] 製造例 4
Paenibacillus polvmvxa BS-Q105の凍結乾燥菌体（芽胞）粉末の調製
上記製造例 3の培養物 300mL力 得られた洗浄菌体沈澱物を蒸留水 50mLに懸 濁して凍結乾燥機にかけ、 8.8 X 109CFU/gの凍結乾燥菌体 (芽胞)粉末 2.13gを 得た。
[0038] 製造例 5
Paenibacillus polvmvxa BS-Q105 の凍結乾燥菌体（芽胞）粉末の調製
上記製造例 3の培養物 300mL力 得られた洗浄菌体沈澱物を 20%スキムミルク 5
OmLに懸濁して凍結乾燥機にかけ、 3.5 X 109CFU/gの凍結乾燥菌体 (芽胞)粉末
11.08gを得た。
[0039] 製造例 6
Paenibacillus polvmvxa BS-Q105の凍結乾燥菌体（芽胞）粉末の調製
上記製造例 3の培養物 300mL力 得られた洗浄菌体沈澱物を 5%硫酸アンモ- ゥム溶液 50mLに懸濁し凍結乾燥機にかけ、 4.3 X 109 CFU/gの凍結乾燥菌体 (芽 胞)粉末 4.67gを得た。
[0040] 製造例 7
Paenibacillus polvmvxa BS-Q105の全培着物粉末調製
製造例 2によって得られた全培養物 lOOmLを凍結乾燥して、 4.1 X 109CFU/gの全 培養物粉末 3.56gを得た。
[0041] 次に製剤例を示す。なお、部は重量部を表す。
[0042] 製剤例 1
水禾ロ剤の調製
製造例 4、 5、 6、 7によって得られる乾燥重量約 60部の本発明細菌を 20部の大豆 粉、 10部のペプトン、 10部の D-グルコースに混和して、菌体含有の水和剤を得た。
[0043] 製剤例 2
7k禾ロ の
製造例 4、 5によって得られる乾燥重量約 80部の本発明細菌を 20部の大豆粉に 混和して、菌体含有の水和剤を得た。
[0044] 製剤例 3
焙着 ¾材の調製
本発明の菌株 BS-0105保存菌の一白金耳を 50mLの YPMG培地を含む 250mL 容三角フラスコに植菌後、振幅数 100振幅 Z分、 30°Cで 6日間培養した。次に、 ゼォライト 9と大豆粉末 1の割合で混合し、その 200gをマヨネーズビンに入れ、水 50 mLを加えて 121°Cで 30分滅菌した。この資材へ上記前培養により得られた培養 物 lmLを添加して 30°Cで 10日間培養して BS-0105菌 109CFU/gの培養資材を 得た。
[0045] 次に本発明の植物病害防除方法が、植物病害に対して防除効果があることを試験 例により示す。
[0046] 試験例 1
各菌株焙着物のキユウリ炭そ病防除効果試験
プラスチックポットに園芸用培土を詰め、キユウリ（品種：四葉)を播種し、温室内で 2 0日間育成した。本葉第 1葉が展開したキユウリ幼苗の子葉に製造例 1の方法で調製 した菌株 BS- 0048、 BS- 0074、 BS- 0105、 BS-0277の全培養物の O.lmLをそれぞれ 塗布した。 3 日間、 25°Cのガラスハウス内に置いた後、蒸留水に懸濁したキユウリ炭 そ病菌分生胞子液（Colletotrichum orbiculare, 1 X 106spores/mL)を植物体に噴霧 接種した。 25°C、暗黒の湿室に 24時間保持後、 7 日間、 25°Cのガラスハウス内に 置いて発病させた。本葉第 1葉の病斑数をそれぞれ計測し、その値から防除価を、 下記式により算出して防除効果を比較した。結果を表 2に示した。 防除価 ={1 （処理区病斑数 無処理区病斑数)） X 100
[0047] [表 2] 表 2 ：各菌株培養物のキユウリ炭そ病防除効果試験
Figure imgf000023_0001
[0048] 表 2の結果力も明らかなように、本発明の細菌培養物を子葉に処理した場合、公知 の防除剤であるァシベンゾラル Sメチルと同様に、本葉第 1葉の発病を顕著に抑制し た。
[0049] 試験例 2
^H qのキユウリ ^^方 ,験
プラスチックポットに園芸用培土を詰め、キユウリ（品種：四葉）を播種し、温室内で 2 0 曰間育成した。本葉第 2葉が展開したキユウリの幼苗に、製造例 4、 5、 6、 7のそれ ぞれの方法で製造し、製剤例 1の方法で製剤した菌株 BS-0105の芽胞調製サンプ ノレを 2 X 107CFU/mLの割合で茎葉散布処理した。 25°C、暗黒の湿室に 24時間保 持後、 4 日間、 25°Cのガラスハウス内に置いた後、蒸留水に懸濁したキユウリ炭そ病 菌分生胞子液（Colletotrichum orbiculare, 1 X 106spores/mL)を植物体に噴霧接種 した。 25°C、暗黒の湿室に 24時間保持後、 7日間、 25°Cのガラスハウス内に置いて 発病させた。葉の病斑数をそれぞれ計測し、その値カゝら下記式により防除価を算出 して防除効果を比較した。結果を表 3に示した。 防除価 ={1 （処理区病斑数 Z無処理区病斑数) } X 100
[表 3] 表 3 ： BS-0105 株のキュクリ炭そ病防除効果
Figure imgf000024_0001
表 3において、 同じアルファべットは有意差なし （有意水準 0. 05)
[0051] 表 3の結果から明らかなように、本発明の細菌を主成分とする製剤は、公知の防除 剤であるインプレッション水和剤ゃァシベンゾラル Sメチルに比べて、 、ずれも同等か ら高い防除効果を示した。
[0052] 試験例 3
精製芽朐のキユウリ斑点細菌病防除効菜試験
プラスチックポットに園芸用培土を詰め、キユウリ（品種：四葉)を播種し、温室内で 2 0 日間育成した。本葉第 2葉が展開したキユウリの幼苗に、製造例 5の方法で製造し、 製剤例 1の方法で製剤した菌株 BS-0105の芽胞調製サンプルを 2 X 107CFU/mL の割合で茎葉散布処理した。 25°C、暗黒の湿室に 24時間保持後、 4 日間、 25°Cの ガラスハウス内に置いた後、蒸留水に懸濁したキユウリ斑点細菌病細菌（Pseudomona s syringae pv. lachrymans)の懸濁液（1 X 108CFU/mL)を植物体に噴霧接種した。 2 5°C、暗黒の湿室に 24時間保持後、 7日間、 25°Cのガラスハウス内に置いて発病させ た。本葉第 2葉の病斑数をそれぞれ計測し、その値力 下記式により防除価を算出 して防除効果を比較した。結果を表 4に示した。 防除価 ={1 （処理区病斑数 Z無処理区病斑数) } X 100
[0053] [表 4] 表 4 ： BS-0105 株のキユウリ斑点細菌病防除効果
Figure imgf000025_0001
表 4において同じアルファべットは有意差なし （有意水準 0. 05)
[0054] 表 4の結果から明らかなように、本発明の細菌を主成分とする製剤は、公知の防除 剤であるインプレッション水和剤ゃァシベンゾラル Sメチルに比べて、同等から高 、防 除効果を示した。
[0055] 試験例 4
j^fl qのイチゴ ^ ^方 ,験
プラスチックポットで栽培し、小葉が 10枚程度展開したイチゴ苗（品種:あきひめ） に、製造例 5の方法で製造し、製剤例 2の方法で製剤した菌株 BS- 0105の芽胞調製 サンプルを 2 X 107CFU/mLの割合で茎葉散布処理した。 25°C、暗黒の湿室に 24 時間保持後、 3 日間（アミスター 20フロアブノレは 1 日間）、 25°Cのガラスハウス内に 置いた後、蒸留水に懸濁したイチゴ炭そ病分生胞子液 (Colletotrichum orbiculare, 2 X 106 spores/mL)を植物体に噴霧接種した。 25°C、暗黒の湿室に 24時間保持後、 14 日間、 25°Cのガラスハウス内に置いて発病させた。下記式から発病度を求め、そ の値から下記式により防除価を算出して防除効果を比較した。結果は表 5に示した。 発病度 = (∑発病指数 X該当数 Z4 X調査数） X 100
発病指数 0 :発病なし、発病指数 1：小葉に少し小斑点が見られる、 発病指数 2 :茎葉部に小斑点が多数見られる、発病指数 3 :茎葉部に目立った 大
型病斑あり、発病指数 4：萎凋と枯死 防除価 ={1 （処理区発病度 Z無処理区発病度) } X 100
[0056] [表 5] 表 5 ： BS-0105 株のイチゴ炭そ病防除効果
Figure imgf000026_0001
表 5において同じアルファべットは有意差なし
(有意水準 0. 05)
[0057] 表 5の結果から明らかなように、本発明の細菌を主成分とする製剤は、公知の防除 剤であるアミスター 20フロアブルゃァシベンゾラル Sメチルに比べて、低 、発病度を 示し、また高い防除効果を示した。
[0058] 試験例 5
焙着液によるメロン斑点、細菌病防除効 試,験
愛菜 1号 (片倉チッカリン (株)製)を育苗トレーに充填し、メロン (品種：アールス)を 育苗した。この時、製造例 2で調製した菌株 BS-0105培養液 10mL(108spores/mL)を 入れたシャーレにメロン種子を浸漬して 30°Cで 2時間バタテリゼーシヨンした種子 処理区を設けた。子葉が展開後、愛菜 1号を充填した 12cmポリポットに鉢上げを行 い、本葉 3枚が完全に展開した時に、製造例 2で調製した菌株 BS-0105培養液を lmL(108spores/mL)灌注および葉面散布処理した区、およびァシベンゾラル Sメチル の 2ppm溶液 2mLを葉面散布した区を設けた。病原菌（Pseudomonas syringae pv. ] achrymans)の接種は、処理 5日後にあらかじめジャガイモ半合成培地（ジャガイモ 30 0gと蒸留水 1Lの煎汁液、硝酸カルシウム 4水和物 0.5g、リン酸水素 2ナトリウム 12 水和物 2g、ペプトン 5g、スクロース 20g、粉末寒天 15g)で培養した斑点細菌病菌液 を葉の裏面を中心に全葉に噴霧接種した。発病調査は病原菌接種 8 日後に第 2葉 から第 4葉の病斑数を計数した。その値から下記式により防除価を算出して防除効 果を比較した。結果は表 6に示した。 防除価 ={1 （処理区病斑数 Z無処理区病斑数) }X 100
[0059] [表 6] 表 6 ： BS-0105 株のメロン斑点細菌病防除効果
Figure imgf000027_0001
[0060] 表 6の結果から明らかなように、本発明の細菌培養物を種子、葉および灌注処理し た場合、公知の防除剤であるァシベンゾラル Sメチルに比べていずれも同等力も高い 防除効果を示した。
[0061] 試験例 6
培着液によるメロンつる割病防除効果試験
愛菜 1号を育苗トレーに充填し、メロン (品種:プリンス)を育苗した。この時、製造例 2で調製した菌株 BS-0105培養液 10mL(108spores/mL)を入れたシャーレにメロン種 子を浸漬して 30°Cで 2時間パクテリゼーシヨンした。子葉が展開後、つる割病 (Fusa rium oxysporum f. sp. 111610 3ノの 土を充 し7こ10.5(3]11ホリ ットに鉢上げ 行い、 製造例 2で調製した Bacillus sp. BS-0105培養液を lmL/ポット (108spores/mL)の割 合で灌注した。ベンレート水和剤は 1000倍希釈液 (濃度 500ppm) 2mLを灌注処理 した。下記式から発病度を求め、その値から下記式により防除価を算出して防除効 果を比較した。結果は表 7に示した。 発病度 = (∑発病指数 X株数 Z4 X株数） X 100
発病指数: 0(健全)、 1(軽症)、 2(中症)、 3(重症)、 4(枯死)の 5段階評価 防除価 = { 1 (各処理区の発病度 Z無処理区の発病度) } X 100
[0062] [表 7] 表 7 ： BS-0105 株のメロンつる割病抑制効果
Figure imgf000028_0001
[0063] 表 7の結果から明らかなように、本発明の細菌培養物を種子および灌注処理した場 合、公知の防除剤であるベンレート水和剤に比べて、同等の防除効果を示した。
[0064] また、 Paenibacillus sp. BS— 0048、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus polymyx a BS- 0105、 Paenibacillus sp. BS- 0277の培養物から、化合物 1 (Fusaricidin A)と化合 物 2 (Fusaricidin B)を得る方法として、以下の例があげられる。
[0065] 培養例 1
Paenibacillus polvmvxa BS- 0105の培着
本発明の菌株 BS-0105保存菌の一白金耳を 10mLの YPMG培地（D ダルコ一 ス 10g、肉エキス lg、酵母エキス 3g、ペプトン 5g、蒸留水 1L、 pH 7.0とする）を含 む lOOmL容三角フラスコに植菌後、回転数 200rpm、 25°C、暗黒条件下で 3 日間 培養した。前述の前培養により得られた培養物 0.5mLを 10mLの生産培地 (D グ ルコース 20g、大豆粉 10g、コーンスティープリカ一 5g、グリセロール 2.5g、コーンス ターチ 2.5g、酵母エキス lg、 NaCl lg、 CaCO lg、蒸留水 1L、 pH 7.0)を含む 100m
3
L容三角フラスコ内に植菌後、回転数 200rpm、 25°C、 4 日間振とう培養した。
[0066] 抽出例 1
Paenibacillus polvmvxa BS- 0105の培着液からの柚出
300mLの培養液を同容量のブタノールでー晚振とう抽出した後、得られたブタノー ル抽出液をロータリーエバポレーターにて濃縮した。抽出物を酢酸ェチル z蒸留水 で抽出した後、今度は水層をブタノール Z蒸留水で抽出し、ブタノール層を回収し、 濃縮乾固した。
[0067] 精製例 1
化合物 1 (Fusaricidin A) 化合物 2(Fusaricidin B)の混合物の精製
粗抽出物を 4 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、 HPLCを用いてこれを精製し た。 HPLC条件は次ぎの通りである。すなわち、移動相はァセトニトリル- 0.1 % (v/v) T FA (35 : 65)、カラムは Senshu Pak PEGASIL ODS2 20 X 250 mmを用い、 1回の注 入量 0.1 mL、カラム温度 40°C、流速： 9 mL/min.の各条件下で HPLC分取を行なつ た。保持時間 23分の成分を回収し、濃縮乾固した結果、化合物 1と化合物 2を 3 : 2 の比率で含有する混合物を 60.7mg得た。
[0068] 化合物 1 (Fusaricidin A) 化合物 2 (Fusaricidin B)の同定
化合物 1と化合物 2を 3:2の比率で含有する混合物を DMSO-dに溶解し13 C-NMR
6
測定を行なった結果、非特許文献 4、 5に記載の Fusaricidin Aと Fusaricidin Bの13 C- NMR測定値と一致した。表 8に、化合物 1 (Fusaricidin A)と化合物 2 (Fusaricidin B) のケミカルシフトデータを示した。
[0069] [表 8] 表 8：化合物 1 (Fusaricidin A) と化合物 2
(Fusaricidin B) のケミカルシフ トデータ
Fusaricidin A Fusaricidin B
Moiety Position Moiety Position S c
L-Thr(l) 1 56.7 L-Thr(l) 1 56.7
2 70.3 2 70.1
3 16.2 3 16.5
4 168.4 4 168.1
D-Val(l) 5 57.0 D-Val(l) 5 56.9
6 31.5 6 31.5
7 18.2 7 17.9
8 19.0 8 19.0
9 170.8 9 171.0
L-Val(2) 10 57.8 L-Val(2) 10 58.5
11 30.1 11 29.6
12 18.0 12 18.2
13 19.2 13 19.2
14 172.9 14 172.3
O-alJo- 15 60.2 O-aJIo- 15 59.5
Thr(2) Thr(2)
16 65.6 16 65.6
17 19.5 17 19.7
18 170.3 18 170.3
D-Asn 19 50.4 D-Gln 19 ' l 52.7
20 36.5 20 26 o.1
21 172.4 21 31.8
22 169.6 22
23
D-Ala 23 47.7 D-Ala 24 47.8
24 17.2 25 17.2
25 170.5 26 170.5
GHPD 26 171.9 GHPD 27 172.0
27 43.0 28 43.3
28 67.5 29 67.5
29 36.7 30 36.7
30 25.2 31 25.2
31~ 37 28.6 32~38 28.6
29.0 29.0 29.1 29.0
38 26.0 39 26.0
39 28.4 40 28,4
40 40.7 41 40.7
41 156.7 42 156.7
GHPD: 15-グァ -ジノ -3-ヒ ドロキシペンタデカン酸 [0070] 精製例 2
Paenibacillus sp. BS— 0048、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus sp. BS-Q277 からの化合物 1 (Fusaricidin A)と化合物 2 (Fusaricidin B)の産牛.
菌株 BS- 0048、 BS- 0074、 BS- 0105、 BS- 0277を前記培養例 1に準じて培養した。 1 OmLの培養液を同容量のブタノールでー晚振とう抽出した後、得られたブタノール抽 出液をロータリーエバポレーターにて濃縮した。抽出物を lmLのジメチルスルホキシ ドに溶解後、 LC/MS分析を行なった（LC及び MS分析装置は NANOSPACE SI-2 ( 資生堂）及び FINNIGAN LCQDU° (Thermo Quest) )。 HPLC分析条件は、移動相を 0 .1% TFA (トリフルォロ酢酸)含有 27%ァセトニトリル水溶液、カラムに CAPCELL PAK C UG120 2.0 X 100 mm (資生堂）を用い、 1回の注入量 3 /z L、カラム温度 40
18
°C、流速: 0.2 mL/min.で分離後、以下の条件で分子量測定を行なった。すなわちキ ャピラリー温度 245°C、キヤビラリ一電圧 10V、 Sheath Gas Flow Rate (シースガス流量 ) 95arb、 Aux Gas Flow Rate (ォギジラリーガス流量） 10arb、 Spray Voltage (スプレー 電圧） 5kV、 Electron Multiple Voltage (エレクトロン 'マルチプライアー電圧）- 700Vの 条件で測定を行なった。その結果、菌株 BS-0048、 BS-0074, BS-0105、 BS-0277の いずれの培養抽出物からも、保持時間 18.5分に分子量 883(M+H)+の分子イオンピ ーク、保持時間 17.8分に分子量 897(M+H)+の分子イオンピークが検出された。また 、精製例 1の化合物 1と化合物 2の混合物からも、前記保持時間にそれぞれ同様の 分子イオンピークが検出された。これらの結果と前記 13C_NMR測定の結果から、保 持時間 18.5分で検出された物質は Fusaricidin A、保持時間 17.8分で検出された 物質は Fusaricidin Bであることが確認された。
[0071] 調製例 1
溶液剤の調製
化合物 1と化合物 2を 3： 2の比率で含有する混合物をジメチルスルホキシドで溶解 後、蒸留水で所定濃度に希釈した。
[0072] 評価例 1
植物病害抵抗件誘導活件の評価
Siegrist, J.ら（Physiological and Molecular Plant Pathology 53, 223—238:1998)は、 植物病害抵抗性誘導活性を見るモデル実験系として、パセリ培養細胞のェリシター 応答性をファイトァレキシン蛍光検出によって測定する方法を用い、植物病害抵抗性 誘導物質であるァシベンゾラル Sメチルのェリシター応答性向上を明らかにしている。 本発明の化合物 1と化合物 2に関しても、 Siegrist, J.らの方法に準じて、植物病害抵 抗性誘導活性の評価を行なった。結果を表 9に示した。
[0073] [表 9] 表 9 ： フアイ トァレキシン検出結果
Figure imgf000032_0001
NT：未試験
[0074] 表 9の結果から、化合物 1と化合物 2は、既存の植物病害抵抗性誘導活性物質と同 様にパセリ培養細胞のェリシター応答性を向上させ、従って、植物病害抵抗性誘導 活性を有することが明らかになった。
[0075] 評価例 2
キュクリ 点、 ] ¾f ^l¾fに する^: 活袢試験
化合物 1と化合物 2のキユウリ斑点細菌病細菌（Pseudomonas syringae pv. lachryma ns)に対して直接抗菌活性を示すかを検討した。すなわち、 45°Cに保温したジャガイ モ半合成培地（ジャガイモ 300gと蒸留水 1Lの煎汁液、硝酸カルシウム 4水和物 0. 5g、リン酸水素 2ナトリウム 12水和物 2g、ペプトン 5g、スクロース 20g、粉末寒天 15g) にキユウリ斑点細菌病細菌を 1 X 108CFUZmLの割合で混合し、 20mLずつ滅菌シ ヤーレに分注した。培地固化後、ジメチルスルホキシドに溶解して 100 /z g/mLに調 整した化合物 1と化合物 2混合物（3 : 2)の 50 μ Lを径 8mmペーパーディスクに染 み込ませた後、培地上に静置した。 25°C、暗黒条件下で 48時間培養した後にぺ パーディスク周縁の阻止円の有無で活性を評価した。結果を表 10に示した。
[表 10] 表 1 0 ：キユウリ斑点細菌病細菌に対する直接抗菌活性結果
Figure imgf000033_0001
[0077] 表 10の結果から、化合物 1と化合物 2は、キユウリ斑点細菌病細菌に直接抗菌活性 を示さないことが明らかとなった。
[0078] 評価例 3
キユウ'這点 J田 ¾i 方 ¾ 試,験
プラスチックポットに園芸用培土を詰め、キユウリ（品種：四葉)を播種し、温室内で 2 0 日間育成した。本葉第 2葉が展開したキユウリの幼苗に、上記調製例によって得ら れた製剤を 1株あたり 5 mLの割合で株元灌注処理した。 25°Cのガラスハウス内に 3 日間置いた後、蒸留水に懸濁したキユウリ斑点細菌病細菌（Pseudomonas syringae pv. lachrymans)の懸濁液（l X 108CFUZmL)を植物体に噴霧接種した。 25°C、暗黒 の湿室に 24時間保持後、 7 日間、 25°Cのガラスハウス内に置いて発病させた。葉 の病斑数をそれぞれ計測し、その値から下記式により防除価を算出して防除効果を 比較した。結果を表 11に示した。 防除価 ={1 （処理区病斑数 Z無処理区病斑数) }X 100
[0079] [表 11] 表 1 1 ：化合物 1と化合物 2のキユウリ斑点細菌病防除効果
Figure imgf000034_0001
表 1 1において同じアルファべットは有意差なし
(有意水準 0. 05)
[0080] 表 11の結果から明らかなように、本発明の化合物 1と化合物 2を主成分とする製剤 は、直接抗菌活性を示さないキユウリ斑点細菌病に対して、優れた防除効果を示した
[0081] 評価例 4
キユウリつる割病 に する ¾fffi ,験
ィ匕合物 1とィ匕合物 2のキユウリつる害 ij病菌 (Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)に 対して直接抗菌活性を示すかを検討した。すなわち、 45°Cに保温したポテト'デキス トロース寒天培地（日水製薬）にキユウリつる割病菌の分生胞子を 1 X 107 spores/mL の割合で混合し、 20mLずつ滅菌シャーレに分注した。培地固化後、ジメチルスル ホキシドに溶解して所定濃度に調整したィ匕合物 1と化合物 2混合物（3 : 2)を 50 L ずつ径 8mmペーパーディスクに染み込ませた後、培地上に静置した。 25°C、暗黒 条件下で 48時間培養した後にペーパーディスク周縁の阻止円の有無で活性を評 価した。結果を表 12に示した。
[0082] [表 12] 表 1 2 ：キユウリつる割病菌に対する直接抗菌活性結果
Figure imgf000034_0002
+ ：明瞭な阻止円あり、 一 ：阻止円なし [0083] 表 12の結果から明らかなように、化合物 1と化合物 2の混合物（3 : 2)は、濃度 30pp mと 20ppmの ί&合でも3 rユウリつる害 (！れ病菌 (Fusarium oxysporum f.sp. cucumerium )に対して抗菌活性を示さなかった。
[0084] 評価例 5
キユウリつる害 II IS方 ¾ 試,験
プラスチックバットに園芸用培土を詰め、キユウリ（品種:相模半白）を播種し、温室 内で 12 日間育成した。子葉が展開したキユウリの幼苗に、上記調製例によって得ら れた製剤を 1株あたり ImLの割合で葉面散布処理を行なった。 25°Cのガラスハウ ス内に 3 日間置いた後、蒸留水に懸濁したキユウリつる割病菌（Fusarium oxysporum f.sp. cucumerium)の分生胞子懸濁液（3 X 107spores/mL)を植物体の株元に 2mL ずつ灌注接種した。 14日間、 25°Cのガラスハウス内に置いて発病させ、発病の程度 力 下記式により発病度を算出後、その値から下記式により防除価を算出して防除 効果を比較した。結果を表 13に示した。 発病度 = (∑発病指数 X該当数 Z4 X調査数） X 100
発病指数 0 :発病なし、発病指数 1 :地際部に僅かな黄化、発病指数 2 : 地際部に目立つ褐変、発病指数 3：茎に力なり目立った褐変と地上部生育 不良、発病指数 4 :植物体の回復不可能な萎凋と枯死 防除価 ={1 （処理区発病度 Z無処理区発病度) } X 100
[0085] [表 13] 表 1 3 ：キユウリつる割病防除効果
Figure imgf000036_0001
3において同じアルファべットは有意差な
(有意水準 0. 05)
[0086] 表 13の結果力も明らかなように、本発明の化合物 1と化合物 2を主成分とする製剤 は、地上部散布処理によって土壌病害であるキユウリつる割病を防除した。直接抗菌 活性を示さない濃度である、化合物 1の 12pPmと化合物 2の 8ppmの混合処理にお V、て優れた防除効果を示した。
[0087] 精製例 3
化合物 1 (Fusaricidin A)ならびに化合物 2 (Fusaricidin B)の分離精製
化合物 1と化合物 2の混合物 133.7 mgを 3 mLのジメチルスルホキシドに溶解し、 HP LCを用いてこれを精製した。 HPLC条件は次のとおりである。すなわち、移動相はァ セトニトリル— 0.1 % (v/v) TFA (29 : 71)、カラムは Shiseido CAPCELL PAK C SG120
18
5 .u rn 4.6 X 250 mmを用い、 1回の注入量 0.25 mL、カラム温度 40°C、流速： 1 mL/m in.の各条件下で HPLC分取を行なった。保持時間 20分から 35分までの溶出液を 30秒ごとに回収し、各画分を LC/MSにて分析した。 HPLC分析条件は以下である 。すなわち、移動相は 0.1 % TFA含有ァセトニトリル- 0.1 % (v/v) TFA (27 : 73)、カラ ムは Shiseido CAPCELL PAK C UG120 3 μ τη 2.0 X 100 mmを用い、 1回の注入
18
量 0.01 mL、カラム温度 40°C、流速: 0.2 mL/min.で分離後、以下の条件で分子量 測定を行なった。すなわちキヤピラリー温度 245°C、キヤピラリー電流 10V、 Sheath G as Flow Rate (シースガス流量） 95arb、 Aux Gas Flow Rate (ォギジラリーガス流量） 10r abゝ Spray Voltage (スプレー電圧） 5kV、 Electron Multiple Voltage (エレクトロン 'マル チプライア-電圧) -700の条件で測定を行なった。 化合物 1が含まれる画分をまとめ濃縮乾固した結果、化合物 1を 44.7 mg得た。ま た化合物 2が含まれる画分をまとめ濃縮乾固した結果、化合物 2を 24.8 mg得た。
[0088] 評価例 6
化合物 1ならびに化合物 2のそれぞれの槭物病害抵抗件謙導活件の評価 上記の精製例 3で分離精製されたィヒ合物 1ならびに化合物 2のそれぞれについて、 評価例 1にて実施したパセリ培養細胞のェリシター応答性をファイトァレキシン蛍光 検出によって測定する方法により、同様にして化合物 1と化合物 2のそれぞれについ て植物病害抵抗性誘導活性の評価を行なった。結果を表 14に示した。
[0089] [表 14] 表 1 4 ： フアイ トァレキシン検出結果
Figure imgf000037_0001
[0090] 表 14の結果から、化合物 1ならびに化合物 2のそれぞれは、既存の植物病害抵抗 性誘導活性物質と同様にパセリ培養細胞のェリシター応答性を向上させ、従って、 植物病害抵抗性誘導活性を有することが明らかになった。
[0091] 培養例 2
Paenibacillus polvmvxa BS-Q105の培着
本発明の菌株 BS-0105の凍結保存菌液の lOOuLを lOOmLの YPMG培地（D— グルコース iog、肉エキス lg、酵母エキス 3g、ペプトン 5g、蒸留水 1L、 pH 7.0とす る）を含む 400mL容フラスコに植菌後、回転数 210rpm、 25°Cで 1 曰間培養した。 前述の前培養により得られた培養物 200mLを 20Lの生産培地（D—グルコース 200 g、スターチ 600g、硫安 50g、大豆粉 50g、リン酸-水素カリウム 10g、塩化ナトリウム 5g、硫酸マグネシウム 5g、炭酸カルシウム 120g)を含むジャーフアーメンターに移植 後、回転数 400rpm、 25°C、通気量 10L/minで 3 日間培養した。
[0092] 抽出例 2
化合物 3および化合物 4の抽出
上記培養例 2で得られた培養液 5Lに、イソプロピルアルコール 5L、 lmol/L塩化 カルシウム 1Lを加え、これをろ過して約 10Lの抽出液を得た。本抽出液の 5Lを口 一タリーエバポレーターで 500mLまで濃縮し、これをブタノ一ノレ 500mLで抽出後、 ブタノール層を 200mLの蒸留水で 3回抽出して 600mLの水層を得た。この水層を ロータリーエバポレーターで濃縮し、得られた水層をォクタデシルシリカゲルカラムに 供した。カラムを水洗し、 10〜25%ァセトニトリル水で溶出した。これを濃縮して粗抽 出物を得た。
[0093] 精製例 4
·3あ び化 ·4の >¾Ι
上記抽出例 2で得られた粗抽出物を 4 mLの 50%メタノールに溶解し、 HPLCを 用いてこれを精製した。 HPLC条件は次ぎの通りである。すなわち、移動相はァセト 二トリル： 0.1 % (v/v) TFA(32 : 68)、カラムは Inertsil ODS 20 X 250 mmを用い、 1回 の注入量 1.5 mL、カラム温度 30°C、流速： 10 mL/min.の各条件下で HPLC分取を 行なった。各画分を LC/MS (移動相： 0.1%TFA含有ァセトニトリル- 0.1%(v/v)TFA( 27:73)、カラム： Shiseido CAPCELL PAK C UG120 3 m 2.0 X 100mm)にて分析し
18
、 954m/z[M+H]+および 968m/z[M+H]+のピークを含む画分をまとめ、これを濃縮乾固 して化合物 3を 14mg、およびィ匕合物 4を 3. lmg得た。
[0094] 化合物 3の理化学的性質
分子量： 954.16
分子式： C H N 0
44 79 11 12
溶解性:メタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドに易 溶、酢酸ェチル、クロ口ホルム、へキサンに不溶
酸加水分解: 6規定塩酸で、 110°C、 24時間加水分解させたとき、ァスパラギン酸、 パリン、スレオニン、ァロスレオニン、ァラニンを 1 :2:1:1: 2のモノレ比であた る。 プロトン核磁気共鳴スペクトル：図 1に示す。
C- 13核磁気共鳴スペクトル:表 15に示す。
[0095] 上記の理化学的性状及びスペクトル解析の結果から、新規化合物 3の化学構造を 下記のように同定した。
[化 5]
Figure imgf000039_0001
[0096] 化合物 4の理化学的性質
分子量： 968.19
分子式： C H N 0
45 81 11 12
溶解性:メタノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシドに易 溶、酢酸ェチル、クロ口ホルム、へキサンに不溶
酸加水分解: 6規定塩酸で、 110°C、 24時間加水分解させたとき、グルタミン酸、バリ ン、スレオ-ン、ァロスレオ-ン、ァラニンを 1:2:1:1:2のモル比であたえる。
プロトン核磁気共鳴スペクトル（DMSO-d6)：図 2に示す。
C- 13核磁気共鳴スペクトル（DMSO-d6)：表 15に示す。
[0097] 上記の理化学的性状及びスペクトル解析の結果から、新規化合物 4の化学構造を 下記のように同定した。
[化 6]
[8600]
Figure imgf000040_0001
I^S O/SOOZdf/ェ:) d 8ε 8SS9T0/900Z OAV 表 15：化合物 3および化合物 4の C-13核磁気共鳴スペクトルの Chemical Shiftデータ
Figure imgf000041_0001
GHPD: 15-guanidino-3-hydroxypentadecanoic acid [0099] 評価例 7
化合物 3ならびに化合物 4のそれぞれの植物病害抵抗件謙導活件の評価 上記の精製例 4で分離精製されたィ匕合物 3ならびに化合物 4のそれぞれについて、 評価例 1にて実施したパセリ培養細胞のェリシター応答性をファイトァレキシン蛍光 検出によって測定する方法により、同様にして化合物 3と化合物 4のそれぞれについ て植物病害抵抗性誘導活性の評価を行なった。結果を表 16に示した。
[0100] [表 16]
Figure imgf000042_0001
[0101] 表 16の結果から、化合物 3と化合物 4は、既存の植物病害抵抗性誘導活性物質と 同様にパセリ培養細胞のェリシター活性を向上させ、従って、植物病害抵抗性誘導 活性を有することが明らかとなった。
産業上の利用可能性
[0102] 以上に詳細に記載した通り、本発明の Paenibacillus属菌、例えば、新規な Paenib acillus sp. BS— 0048、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus polymyxa BS— 0105、 P aenibacillus sp. BS-0277は、各植物病害防除に優れた効果を有し、防除剤として有 用である。また、こられの Paenibacillus属菌および公知の物質である化合物 l(Fusari cidin A)と化合物 2(Fusaricidin B)、あるいは新規な化合物 3および化合物 4は、植物 害病抵抗性誘導活性を有することが明らかとなり、従来防除できないとされていた植 物病害に対しても防除効果を示すことが明ら力となった。更には、これらの Paneibadl lus属菌および化合物は、植物害病抵抗性誘導活性を有することから、植物病原体 の感染から植物体を防御できることが明らかとなった。

Claims

請求の範囲 [1] 植物病害防除作用を有する新規な Paenibadllus属菌。 [2] 植物病害抵抗性誘導物質を産生して植物病害抵抗性誘導活性を発揮すること〖こ より植物病害防除作用を示すことができる Paenibadllus属菌。 [3] 植物病害抵抗性誘導物質として、下記構造を有する化合物 KFusariddin A)、化合 物 2(Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4力 選ばれる少なくとも 1つの化合物を 産生する請求項 2に記載の Paen¾acillus属菌。
[化 1]
Figure imgf000044_0001
化合物 1 (Fusariciain A)
[化 2]
Figure imgf000044_0002
化合物 2 (Fusaricidin B)
[化 3]
Figure imgf000045_0001
化合物
[化 4]
Figure imgf000045_0002
化合物 4
[4] 植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、グラム陰性細菌によって引き起こ される植物病害を防除することができる請求項 1から 3の 、ずれかに記載の Paenibac illus鳥 。
[5] 植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、 Fusarium属菌によって引き起こさ れる植物病害を防除することができる請求項 1から 4の!、ずれかに記載の Paenibacill us属菌。
[6] 新規な Paenibacillus sp. BS— 0048、 Paenibacillus sp. BS— 0074、 Paenibacillus polym yxa BS-0105もしくは Paenibacillus sp. BS-0277、またはそれらの変異体である請求 項 1から 5のいずれかに記載の Paenibacillus属菌。
[7] 請求項 1から 6のいずれかに記載の Paenibacillus属菌を含有する組成物。
[8] Paenibacillus属菌の芽胞、栄養菌体ある!/ヽは全培養物を含有する請求項 7に記載 の組成物。
[9] 請求項 1から 6のいずれかに記載の Paenibacillus属菌の培養物から得られる単一 の植物病害抵抗性誘導物質あるいはその植物病害抵抗性誘導物質のいくつかの組 み合わせを含有する組成物。
[10] 請求項 7から 9の 、ずれかに記載の組成物力も成る植物病害防除剤。
[11] Colletotrichum属菌または Glomerella属菌によって引き起こされる植物病害を防除 する、請求項 7、 8または 9に記載の組成物あるいは請求項 10に記載の植物病害防 除剤。
[12] ゥリ類炭そ病またはイチゴ炭そ病を防除する、請求項 7、 8または 9に記載の組成物 あるいは請求項 10に記載の植物病害防除剤。
[13] 植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、グラム陰性細菌によって引き起こ される植物病害を防除する請求項 7、 8または 9に記載の組成物あるいは請求項 10 に記載の植物病害防除剤。
[14] グラム陰性細菌が Pseudomonas属菌である請求項 13に記載の組成物または植物 病害防除剤。
[15] Pseudomonas属菌によって引き起こされるゥリ類の斑点細菌病を防除する請求項 1
4に記載の組成物または植物病害防除剤。
[16] 植物病害抵抗性誘導活性を発揮することにより、 Fusarium属菌によって引き起こさ れる植物病害を防除する、請求項 7、 8または 9に記載の組成物あるいは請求項 10 に記載の植物病害防除剤。
[17] 茎葉、根圏および/または種子処理によって植物病害を防除する、請求項 7、 8また は 9に記載の組成物あるいは請求項 10に記載の植物病害防除剤。
[18] 植物病害抵抗性誘導物質として、化合物 l(Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B
)、化合物 3およびィ匕合物 4から選ばれる少なくとも 1つの化合物を含有する植物病害 防除剤。
[19] 化合物 l(Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4から選 ばれる少なくとも 1つの化合物が、植物病害抵抗性誘導活性を発揮して、その結果、 植物病害を防除する請求項 18に記載の植物病害防除剤。
[20] 化合物 l(Fusaricidin A)、化合物 2(Fusaricidin B)、化合物 3および化合物 4から選 ばれる少なくとも 1つの化合物が、直接抗菌活性を示すことなぐ植物病害抵抗性誘 導活性を発揮して、その結果、植物病害を防除する請求項 18または 19に記載の植 物病害防除剤。
[21] グラム陰性細菌によって引き起こされる植物病害を防除する請求項 18から 20のい ずれかに記載の植物病害防除剤。
[22] グラム陰性細菌が Pseudomonas属菌である請求項 21に記載の植物病害防除剤。
[23] Pseudomonas属菌によって引き起こされるゥリ類の斑点細菌病を防除する請求項 2
2に記載の植物病害防除剤。
[24] Fusarium属菌によって引き起こされる植物病害を防除する請求項 18から 20のい ずれかに記載の植物病害防除剤。
[25] 茎葉、根圏および/または種子処理によって植物病害を防除する請求項 18から 24 に記載の植物病害防除剤。
[26] 請求項 1から 6の!、ずれかに記載の Paenibacillus属菌、ある!/、は請求項 7から 25 の！ヽずれかに記載の組成物または植物病害防除剤を、植物に適用して植物病原体 の感染から植物体を防御することを特徴とする植物病害防除方法。
[27] 請求項 1から 6の!、ずれかに記載の Paenibacillus属菌、ある!/、は請求項 7から 25 の!、ずれかに記載の組成物または植物病害防除剤が、植物病害抵抗性誘導活性を 発揮して、植物病原体の感染から植物体を防御する請求項 26に記載の植物病害防 除方法。
[28] 請求項 1から 6の!、ずれかに記載の Paenibacillus属菌、ある!/、は請求項 7から 25 の!、ずれかに記載の組成物または植物病害防除剤が、直接抗菌活性を示すことなく 、植物病害抵抗性誘導活性を発揮して、その結果、植物病害を防除する請求項 27 に記載の植物病害防除方法。
[29] 下記構造式を有する新規な化合物 3。
[化 5] 27
Figure imgf000048_0001
化合物 3 下記構造式を有する新規な化合物 4.
Figure imgf000048_0002
化合物 4
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