WO2005033704A1 - イムノアッセイ - Google Patents

Abstract

水に難溶性のタンパク質、或いは難抽出状態にあるタンパク質を、試料からの高い抽出効率を維持したままで、引き続く免疫反応により鋭敏かつ簡便に検出する方法を提供する。　試料中の水難溶性のタンパク質、或いは難抽出状態にあるタンパク質を、比較的高濃度のイオン性界面活性剤含有水性溶媒によって抽出／可溶化し、次いで、当該抽出液中のタンパク質を、該タンパク質をイオン性界面活性剤で変性したタンパク質に対して得られた抗体を用いて、直接、検出することを特徴とする、高感度かつ簡便なイムノアッセイ。

Description

明 細 書 ィ ム ノ ア ッ セィ 技術分野

本発明は、 水に難溶性のタ ンパク寳、 或いは難抽出状態にあ る タ ンパク 質を高感度で測定するィ ム ノ ア ッセィ に関する。

背景技術

分子生物学の急速な進歩に と もない、 ィ ム ノ ア ツ セィ の検出 感度向上に対する要求は依然と して高まっている。 生命科学分 野では、 膜結合型の各種細胞表面タ ンパク 質が、 細胞内、 或い は細胞間情報伝達において極めて重要な役割を担っ ている証 fc が、 日 々、 集積 している。 これらの細胞表面タ ンパク質は、 Si 物間、 或いは組織間で様々 なサブタイ プと して発現され、 また、 その時間的、 空間的発現パター ンは厳格に制御 されている。 つて、 今 日 の生命科学において、 当該細胞表面タ ンパク 質を髙 感度で検出する こ と は、 各種生命現象の理解の上で不可欠の 1¾ 題と なっている。 しかしなが ら、 殆どの膜結合型細胞表面タ パク 質は、 イ オン性界面活性剤を含まない水性溶媒に不溶 Z難 溶であるか、 難抽出性である。 加えて、 公衆衛生の分野でも高感度ィ ム ノ ア ッセィ に対する 要求は、 以前にもま して高ま り つつある。 遺伝子組換植物の使 用や、 B S E、 食物ア レルゲン等への消費者の関心の高ま り と と も に、 食品製造業者はこれらの高感度検出を求め られている。 特に、 加工食品中に存在する場合、 食物ア レルゲン等のタ ンパ ク質は、 それ自体は水に可溶性であっても、 当該加工食品中の 他の成分と複雑な複合体を形成し、 イ オン性界面活性剤を含ま ない水性溶媒を用いては容易に加工食品か ら抽出 されないこ と が経験 されている。 例えば、 小麦を使用 した加工食品中に含ま れる タ ンパク質は、 小麦由来のダルテ ン と極めて強固に結合 し ているため、 イ オン性界面活性剤を含む水性溶媒を用いなけれ ば、 当該タ ンパク質を十分に抽出できない。

しか して、 そのよ う な水に難溶性ノ難抽出性タ ンパク 質の存 在を高感度でィ ム ノ ア ツセィ によ り 検出する には、 極微量の当 該タ ンパク 質の存在をも確認でき る よ う に、 当該ア ツセィ に用 いる抗体の特異性と親和性を向上させる こ と が要求 される が、 その よ う な特異性および親和性の向上には一定の限界がある。

従って、 そのよ う な高感度のィ ム ノ ア ッセィ では、 抗体の特 異性および親和.性の向上以外にも、 ア ツセィ全体のプロ ト コ一 ルを変更する必要がある。 特に、 測定対象である水難溶性/難 抽出性タ ンパク質をよ り 効率的に抽出する こ と は、 ア ツセィ全 体の感度を飛躍的に向上させる もの と 考え られ、 当該目 的のた めに、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム ( S D S ) に代表されるイ オン 性界面活性剤を用いて、 水難溶性タ ンパク 質等を可.溶化 Z抽出 する こ と が極めて有力な手法と な り 得る。 と こ ろが、 一方で、 そのよ う なイオン性界面活性剤は、 引 き続く ィ ム ノ アツセィ に おける抗原—抗体反応も阻害する と信 じ られてお り 、 これまで、 高濃度のィ オン性界面活性剤の存在下で、 抗原—抗体反応を行 う こ と は避け られてきた。

つま り 、 S D S等のイ オン性界面活性剤の比較的高濃度で極 めて効率よ く 抽出 したタ ンパク 質を、 従来の免疫測定法によ り 測定する場合には、 予め該抽出液からイ オン性界面活性剤を除 去する か、 或いは抽出液を十分に希釈 して、 イ オン性界面活性 剤の濃度を、 免疫反応に悪影響を与えない と信 じ られていた程 度まで低下させる必要があった。 具体的には、 1 ) 当該抽出液 をセロ ハンチューブ等を用いて透析する、 2 ) 遠心濃縮器等を 用いて界面活性剤を含まない溶液に置換する、 3 ) ゲル濾過や イ オン交換ク ロマ ト グラ フ ィ ーによ って界面活性剤を含まない 溶液に置換する、 4 ) 化学物質を添加 して界面活性剤のみを沈 殿させる方法等によ り 、 抽出液中のイ オン性界面活性剤の濃度 を減少 させるための前処理が行われていた。 しか しなが ら、 ィ オン性界面活性剤は、 タ ンパク質と容易に ミ セルを形成するた め、 界面活性剤のみを除く こ と は非常に困難である場合が多く 、 上記の除去処理を行 う こ と によって、 目的 とする タ ンパ ク 質の 回収率が著 しく 低下する原因 と なる し、 そもそも、 当該前処理 自体が煩雑なものである。 また、 別法と して、 当該イ オ ン性界 面活性剤の濃度低下のために抽出液全体を大幅に希釈したので は、 測定すべき抽出タ ンパク 質の濃度も同時に低下 して しまい、 結局、 引き練く 免疫反応における検出感度が一向に向上 しない。 すなわち、 一般に、 水難溶性ノ難抽出性タ ンパク 質を効率よ く 試料か ら抽出するための、 高濃度のイ オン性界面活性剤の使用 は、 引 き続く 免疫反応を有効に行わせる こ と と は両立 しないも の と 考え られていたのである。

特許文献 1 は、 イ オン性界面活性剤であ る S D S の存在下で の抗原一抗体反応について記載 している。 該文献は、 不安定な 構造を有する血漿タ ンノ ク質 C E T P (コ レ ステ リ ルエステル 転送タ ンパ ク ） の安定的且つ交差反応のないィ ム ノ ア ツセィ に 関 してお り 、 当該ア ツセィ においては、 C E T P を 0 . 0 0 1 ~ 1 0 % ( W/ V ) の S D Sで前処理する。 更に、 該文献では、 C E T P と その抗体と の間の抗原一抗体反応が、 0 . 0 0 1 〜 0 . 3 % ( W / V ) の S D S存在下でも行い得る と されるが、 実際に、 その特に好ま しい範囲は 0 . 0 2 〜 0 . 0 3 % ( W Z V ) と も されてお り 、 実施例においては、 0 . 2 5 % S D S で前処 理 した C E T P を、 更に 1 1 倍希釈 （ 2 0 μ 1 の前処理溶液に 2 0 0 μ 1 の抗体溶液を添加） して、 S D S の濃度を約 0 . 0 2 3 % 程度に調整し、 前記抗原一抗体反応を行っている。

すなわち、 当該文献も、 S D S に代表されるイオン性界面活 性剤は、 少なく と も 0 . 0 3 %以上の濃度において、 ィ ム ノ ア ッセィ における抗原一抗体反応を阻害する と い う前提に立って お り 、 抗原一抗体反応の実行時には、 高濃度の S D S含有試料 を十分に希釈して、 S D S濃度を 0 . 0 3 %以下に減少 させる べき こ と を教示 しているのである。

[特許文献 1 ] 特開平 9 一 7 7 7 9 8 号公報 （第 5 頁、 右 欄、 第 0 0 3 0段落 ； 第 6 頁、 左欄、 第 0 0 3 3段落 ； 第 1 0 頁、 左欄、 第 0 0 5 1 段落） 発明の開示

発明が解決しよ う とする課題

従って、 本発明は、 極めて高感度で検出する こ と が要求され る よ う な、 水に難溶性のタ ンパク質、 或いは難抽出状態にある タ ンパク質を、 試料から の高い抽出効率を維持 したままで、 引 き続く 免疫反応によ り 鋭敏かつ簡便に検出する方法を提供する ものである。

課穎を解決するための手段

これまで一般的に考え られていたこ と と は異な り 、 多 く の場 合、 抗原抗体反応自 体は、 高濃度のイ オン性界面活性剤の存在 下でも検出不能なレベルにま で阻害されない と の驚嘆すべき知 見が得られた。 更に、 見掛け上、 抗原抗体反応が高濃度のィ ォ ン性界面活性剤で阻害される よ う な一部のタ ンパク 質において さ えも、 該タ ンパク 質をイ オ ン性界面活性剤で変性 し、 当該変 性タ ンパク 質に対 して得られた抗体を用いれば、 前記抗原抗体 反応が満足行く よ う に行われ得る こ と が見出 された。 本発明者 は、 かかる知見に基き、 水に難溶性のタ ンパク 質、 或いは難抽 出状態にあ る タ ンパ ク 質の高感度かつ簡便な免疫学的測定法を 完成させた。 すなわち、 本発明によれば、 試料中に含有される 水に難溶性のタ ンパク質、 或いは難抽出状態にある タンパク 質 を、 比較的高濃度のイ オ ン性界面活性剤含有水性溶媒に よって 抽出/可溶化 し、 次いで、 得られた抽出液の溶媒置換をする こ と な く 、 或いは、 検出不能な レベルに まで前記タ ンパク 質の濃 度を低下させる こ と のないよ う に、 該抽出液を実質的に希釈す る こ と なく 、 直接、 免疫学的測定法によって抽出液中のタ ンパ ク質を検出する こ と を特徴とする、 高感度かつ簡便なィ ム ノ ア ッセィ が提供される。

し力 して、 本発明は、

試料中の水難溶性/難抽出性タ ンパ ク 質の存在を検出するた めの免疫学的測定法であって、 以下の工程、

( I ) 試料中の水難溶性/難抽出性タ ンパク 質を、 イ オン 性界面活性剤を含む水性溶媒で抽出および Zまたは可溶化する、

( I I ) 工程 （ I ) で用いるイ オン性界面活性剤で予め変 性させた前記水難溶性/難抽出性タ ンパク 質を免疫原と して得 られた抗体を、

a ) 上記工程 （ I ) で得られたタ ンパク質溶液に対 し、 該溶液を実質的に希釈する こ と なく 添加するか ； 或いは

b ) 上記工程 （ I ) で得られたタ ンパク 質溶液を、 そ のイ オン性界面活性剤濃度が 0 . 0 3 % ( W / V ) 以下にな ら ない範囲で希釈 した希釈液に対して添加する ；

こ と によ り 、 前記水難溶性 Z難抽出性タ ンパク 質と 前記抗体と の間で抗原一抗体複合体を形成させる、.および

( I I I ) 形成された前記抗原一抗体複合体を検出する、 工程を含むこ と を特徴とする、 前記測定法を提供する。

前記工程 （ I ) における水性溶媒中のイ オン性界面活性剤の 濃度が、 例えば 0 . 3 % ( W / V ) を超える場合においても、 当該水性溶媒で抽出 した試料 （タ ンパク質） 溶液内での抗原一 抗体複合体形成が阻害されないこ と が知見 された。 すなわち、 前記工程 （ I I ) における抗原一抗体複合体は、 0 . 3 % ( W / V ) を超え、 好適には 1 % ( W / V ) 以上のイ オン性界面活性剤の 存在下においても形成され得る。 或いは、 定量性の確認等の 目 的で当該試料溶液を希釈する必要がある場合においても、 それ は、 良好な抗原一抗体反応において必要である従来から信 じ ら れてきた 0 . 0 3 % ( W / V ) 以下のイオン性界面活性剤濃度 ま での希釈を意図する必要はなく 、 こ のこ と は、 本発明の方法 が、 イ オン性界面活性剤の持つ高い抽出力を犠牲にする こ と な く 実施でき る こ と を意味する。 本発明のイ オン性界面活性剤は、 ドデシル硫酸ナ ト リ ゥム、 ドデシル硫酸リ チウム、 ラ ウ リ ノレサルコシ ンナ ト リ ゥム、 臭化 へキサデシル ト リ メ チルア ンモ ニ ゥム、 塩化へキサデシル ト リ メ チルアンモニ ゥム、 塩化へキサデシルピ リ ジ - ゥム等力 ら選 択でき 、 場合によっては、 これ ら を混合しても差し支えない。 特に、 当該イ オン性界面活性剤 と して、 生化学分野において多 用 される ドデシル硫酸ナ ト リ ウム （ S D S ) が、 その入手の容 易性な ど力 ら も好ま しいも のと して例示でき る。

工程 （ I ) の水性溶媒は、 タ ンパク 質を更に変性させ得る、 2 —メ ノレカ プ トエタ ノール、 ジチオス レィ トール等の還元剤を も含み得る こ とが明 ら力 と なった。 従って、 好ま しい工程 （ I ) の水性溶媒の非限定的な例と して、 1 % ( W / V ) の ドデシル 硫酸ナ ト リ ゥムおよび 1 Mの 2 _メ ルカプ トエタ ノ ールを含む 水性溶媒をあげる こ と ができ る。

また、 測定の安定性および再現性を確保するために、 前記ェ 程 （ I ) において、 タ ンパク質溶液を更に煮沸する こ と が好ま し く 、 当該煮沸が、 少な く と も 8 0 °C以上で、 5 分間以上継続 される こ と が好ま しい。

本発明の方法は、 難抽出状態下にあるオボアルブ ミ ン、 オボ ムコィ ド、 カゼイ ン、 β — ラ ク ト グロ プリ ン、 そばタ ンパク 質、 小麦タ ンパク質及び落花生タ ンパク質の高感度測定に特に有利 である。 オボアルブ ミ ン、 オボム コィ ドおよびカゼィ ン等は、 それ自 体、 水に易溶である が、 それら のタ ンパク質が加工食品 等の複雑なマ ト リ ッ ク ス 中に存在する際、 通常の水性溶媒では 抽出が困難な場合がある。 本発明の方法は、 そのよ う な難抽出 状態下にあ る タ ンパク質の高感度測定において極めて有効に用 いる こ と ができ る。

こ の よ う に、 イ オン性界面活性剤の有する優れたタ ンパク 質 可溶化効果と 、 高濃度のイ オン性界面活性剤の存在下における 抗原一抗体反応に対する新たな知見に基づ く 本発明の方法は、 水に難溶性のタ ンパク質、 或いは難抽出状態にある タ ンパ ク 質 を高感度で検出する こ と が要求される よ う な、 今 日 の生命科学 研究や食品の品質保証において、 極めて有効に利用でき る も の である。

図面の簡単な説明

第 1 図は、 標準オボム コイ ドを順次段階希釈 し、 本発明の実 施例の方法 （ E I Αの原理に基く 固相サン ドイ ッチ法） によ り 測定波長 4 5 0 n m、 副波長 6 3 0 n mでの吸光度を測定 した 結果を示す。

第 2 図は、 オボム コィ ドを含む未知濃度検体 （検体 a 乃至 c ) を測定系に用いて、 本発明 の実施例の方法 （ E I Aの原理に基 く 固相サ ン ドイ ッ チ法） に よ り 測定波長 4 5 0 n m、 副波長 6 3 0 n mでの吸光度を測定した結果を示す。

第 3 図は、 H D T M A B 、 H D T M A Cおよび H D P Cの存 在下におけるオボアルブ ミ ンの測定結果を示す （参考例） 。 横 軸は各界面活性剤の濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。

第 4 図 は、 L D S 、 ラ ウ リ ルサルコ シ ンナ ト リ ゥ ムお よび S D S の存在下におけるオボアルブミ ンの測定結果を示す （参 考例） 。 横軸は各界面活性剤の濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光 度を示す。

第 5 図は、 H D T M A B 、 H D T M A Cおよび H D P Cの存 在下におけるオボム コィ ドの測定結果を示す。 横軸は各界面活 性剤の濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。

第 6 図は、 L D S 、 ラ ウ リ ルサノレコ シ ンナ ト リ ゥ ムお よ び S D S の存在下におけるオボム コィ ドの測定結果を示す。 横軸 は各界面活性剤の濃度 （％ ) を示し、 縦軸は吸光度を示す。 第 7図は、 T w e e n 2 0 、 ルプロール P X、 T r i t o n X - 1 0 0 および D O C の存在下におけるオボアルプミ ンの測定結 果を示す (参考例） 。 横軸は各界面活性剤の濃度 （％ ) を示し、 縦軸は吸光度を示す。

第 8図は、 T w e e n 2 0 、 ルプロール P X、 T r i t o n X - 1 0 0 および D O C の存在下におけるオボム コ ィ ドの測定結果 を示す （参考例） 。 横軸は各界面活性剤の濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。

第 9 図は、 S D S の存在下におけるカゼイ ンの測定結果を示 す。 横軸は界面活性剤 （ S D S ) 濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸 光度を示す。 （園） は抗原有り 、 （♦ ) は抗原な し （対照） 。

第 1 0 図は、 S D S の存在下における —ラ ク ト グロ プリ ン の測定結果を示す。 横軸は界面活性剤 （ S D S ) 濃度 （％ ) を 示し、 縦軸は吸光度を示す。 （酾） は抗原有 り 、 （♦) は抗原 な し （対照） 。

第 1 1 図は、 S D S の存在下におけるそばタ ンパク質の測定 結果を示す。 横軸は界面活性剤 （ S D S ) 濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。 （圔） は抗原有 り 、 （♦ ) は抗原な し （対 照） 。

第 1 2 図は、 S D S の存在下における小麦タ ンパク質 （グ リ ァジン） の測定結果を示す。 横軸は界面活性剤 （ S D S ) 濃度 ( % ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。 （酾） は抗原有り 、 （♦ ) は抗原な し （対照） 。

第 1 3 図は、 S D S の存在下におけ る落花生タ ンパク 質の測 定結果を示す。 横軸は界面活性剤 （ S D S ) 濃度 （％ ) を示 し、 縦軸は吸光度を示す。 （躍） は抗原有り 、 （♦) は抗原な し （対 照） 。

第 1 4 図は、 本発明によ る抗—イ オン性界面活性剤変性タ ン パク質—抗体を使用 したオボアルブミ ンの測定結果を示す。

第 1 5 図は、 本発明の抗ーイ オン性界面活性剤変性タ ンパク 質—抗体を用いた方法において、 オボアルブミ ン試料溶液を煮 沸 した場合の、 経時的な検出感度安定性に対する効果を示す。 参考例は、 天然型タ ンパ ク 質に対する抗体を用い、 同様の試料 溶液を加熱 した場合と加熱しない場合の結果を示す。

第 1 6 図は、 本発明の抗—イ オン性界面活性剤変性タ ンパク 質一抗体を用いた方法において、 オボム コィ ド試料溶液を煮沸 した場合の、 経時的な検出感度安定性に対する効果を示す。 参 考例は、 天然型タ ンパク 質に対する抗体を用い、 同様の試料溶 液を加熱した場合と加熱 しない場合の結果を示す。 第 1 7 図は、 本発明の抗ーイ オン性界面活性剤変性タ ンパク 質一抗体を用いた方法において、 落花生タ ンパク 質試料溶液を 煮沸 した場合の、 経時的な検出感度安定性に対する効果を示す。 参考例は、 天然型タ ンパク質に対する抗体を用い、 同様の試科 溶液を加熱 した場合と加熱 しない場合の結果を示す。

第 1 8 図は、 本発明の抗—イ オン性界面活性剤変性タ ンパ ク 質一抗体を用いた方法において、 そばタ ンパク質試料溶液を煮 沸 した場合の、 経時的な検出感度安定性に対する効果を示す。 参考例は、 天然型タ ンパク質に対する抗体を用い、 同様の試料 溶液を加熱 した場合と加熱 しない場合の結果を示す。

第 1 9 図は、 本発明の好ま しい態様である、 抗ーイオン性界 面活性剤変性タ ンパク質—抗体の使用 と、 試料溶液の煮沸の組 み合わせにおける ア ツセィ の感度を示す。 実施例は、 各濃度の オボアルプ ミ ンを、 1 % S D S ヽ 1 Mの 2 — メ ルカ プ ト エタ ノ ールを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) に溶解 して試料溶液 と した後、 該試料溶液を 5 分間、 1 0 0 °C湯煎で加熱し、 冷却 後に測定した E L I S Aの結果であ り 、 参考例は、 天然型オボ アルプミ ンに対する抗体を用い、 試料溶液を加熱 したと き の結 果を示す。 第 2 0 図は、 本発明の好ま しい態様である、 抗ーイオン性界 面活性剤変性タ ンパク質—抗体の使用 と、 試料溶液の煮沸の組 み合わせにおけるア ツセィ の感度を示す。 実施例は、 各濃度の オボム コイ ドを、 1 % S D S 、 1 Mの 2 —メ ノレカ プ トェタ ノ 一 ルを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) に溶解 して試料溶液と した後、 該試料溶液を 5 分間、 1 0 0 °C湯煎で加熱 し、 冷却後 に測定した E L I S Aの結果であ り 、 参考例は、 天然型ォボム コィ ドに対する抗体を用い、 試料溶液を加熱 した と き の結果を 示す。

第 2 1 図は、 本発明の好ま しい態様であ る 、 抗ーイ オン性界 面活性剤変性タ ンパク質—抗体の使用 と、 試料溶液の煮沸の組 み合わせにおけるア ツセィ の感度を示す。 実施例は、 各濃度の 落花生タ ンパク 質を、 1 % S D S 、 1 Mの 2 _メルカプ トエタ ノールを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) に溶解 して試料溶 液と した後、 該試料溶液を 5 分間、 1 0 0 °C湯煎で加熱し、 冷 却後に測定 した E L I S Aの結果であ り 、 参考例は、 天然型落 花生タ ンパク 質に対する抗体を用い、 試料溶液を加熱したと き の結果を示す。

第 2 2 図は、 本発明の好ま しい態様である、 抗—イオン性界 面活性剤変性タ ンパク質—抗体の使用 と、 試料溶液の煮沸の糸且 み合わせにおけるア ツセ ィ の感度を示す。 実施例は、 各濃度の そばタ ンパク 質を、 1 % S D S、 1 Mの 2 —メルカ プ トエタ ノ ールを含む緩衝液 （ P B S、 p H 6 . 5 ) に溶解して試料溶液 と した後、 該試料溶液を 5 分間、 1 0 0 C湯煎で加熱し、 冷却 後に測定した E L I S Aの結果であ り 、 参考例は、 天然型そば タ ンパク質に対する抗体を用い、 試料溶液を加熱 したと き の結 果を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明が対象とする 「水難溶性/難抽出性タ ンパク質」 は、 ィ オン性界面活性剤を含まない純水または一般的に用い られる 生理学的緩衝液に対 しては、 実質的な溶解性を示さ ないか、 或 いは単にそれらの緩衝液類では実質的に試料から抽出 し得な V、 タ ンパク質であ り 、 それ らのタ ンパク 質は、 本発明のイ オン' ι·生 界面活性剤を含む緩衝液類によ り 、 続く ィ ム ノ ア ッ セィ によ る 検出が可能な濃度にまで可溶化 し、 または抽出 され得る。 言 、 換えれば、 本発明における 「水難溶性 Z難抽出性タ ンパク質」 は、 イオン性界面活性剤を含まない純水や緩衝液類に対する薛 解度 · 抽出効率に比較した場合、 イ オン性界面活性剤含有緩衝 液等に対して有意に高め られた溶解度および/または抽出効率 を示す。 通常、 本発明の対象と なる 「水難溶性/難抽出性タ ン パク 質」 は、 イ オン性界面活性剤を含まない純水や緩衝液類へ の溶解度 · 抽出効率と比較 して、 5 倍以上、 好ま し く は 1 0倍 以上、 よ り 好ま し く は 5 0倍以上の溶解度 · 抽出効率を、 本発 明のィ オン性界面活性剤含有緩衝液等に対 して示 し得る。 その よ う な水難溶性 Z難抽出性タ ンパク 質の非限定的な例と しては、 構造タ ンパク 質や膜結合性の細胞表面タ ンパク質があげられる _c 特に、 細胞表面レセ プターや細胞付着因子等の生化学的に重要 な機能を担 う 膜タ ンパク 質が興味深い。 その他の水難溶性 Z難 抽出性タ ンパク 質の例と して、 加工食品等の内部に存在する食 物ア レルゲンタ ンパ ク 質をあげる こ と ができ る。 例えば、 オボ アルブ ミ ン、 才ボム コ ィ ド、 カゼイ ン、 β — ラ ク ト グロ ブ リ ン、 そばタ ンパク質、 小麦タ ンパク質及び落花生タ ンパク質は、 食 物ア レルゲンタ ンパク質と して重要なもの と考え られている。 これらのタ ンパク質は、 それ自体、 水に可溶性のも のも含むが、 加工食品内において、 当該食品中の他の成分と強固に複合体化 しそのマ ト リ ッ タ ス に組み込まれる こ とで、 難抽出状態におか れる場合がある。 そのよ う な難抽出状態におかれた水可溶性タ ンパク 質も 、 本発明のイ オン性界面活性剤の効果に よ り 初め て 抽出可能になる のであれば、 こ こ に言 う水難溶性/難抽出 タ ンパク質に含み得る。

なお、 本発明にい う 「試料」 と は、 水難溶性/難抽出性の タ ンパク 質を含む と推定される液体、 半固体或いは固体のいずれ か、 またはその混合物であ り 得るが、 有利には水難溶性 /難抽 出性のタ ンパク質を組み込む固体マ ト リ ッ ク スを包含する も の であ り 得、 例えば、 細胞や細胞膜、 組織、 器官の他、 食品や材 質等を含むものであるがこれら に限定されない。

本発明の方法においては、 上記の水難溶性 /難抽出性タ ン パ ク質を、 イ オン性界面活性剤を含む 「水性溶媒」 で可溶化 Z抽 出する。 当該 「水性溶媒」 は、 純水 ； 塩化ナ ト リ ウ ム、 塩化力 リ ゥムおよび重炭酸ナ ト リ ゥム等の塩溶液 ； 生化学分野で通常 用い られる各種緩衝液、 例えば リ ン酸緩衝液、 T r i s — 酸 緩衝液およびク ェ ン酸緩衝液 ； 水酸化ナ ト リ ゥム或いは塩酸等 で p Hを調節 したアル力 リ 性溶液或いは酸性溶液等を基本と し た溶媒を意味する。 更に、 当該水性溶媒は、 タ ンパ ク 質の溶解 度や抽出効率を追加的に向上させる捕助成分と して、 エチ レ ン ジァ ミ ン四酢酸 （ E D T A ) の よ う な キ レー ト化合物、 ホス ホ リ パーゼの よ う な酵素類および H L B価調節のために非イ オン 性界面活性剤を含み得る。 また、 当該水性溶媒には、 抽出中或 いは保存中の溶液内でのタ ンパク 質の分解を制御するためのプ 口テアーゼ阻害剤や、 微生物の繁殖を防止するアジ化ナ ト リ ゥ ムな どの抗菌性物質、 ァ ス コルビ ン酸等の酸化防止剤を添加 し ても よい。 加えて、 当該水性溶媒には、 引 き続く ィ ムノ ア ッセ ィ を実行不能に しない範囲でグ リ セロ ールやエタ ノ ー/レ等の極 性有機溶媒を添加する こ と も でき る。

上記の水性溶媒に添加される本発明のイ オ ン性界面活性剤は 水難溶性/難抽出性タンパク質の可溶化や抽出を実質的に向上 させ得る も の であれば公知のいずれのものを用いても ゝまわな い。 好適には、 当該イオン性界面活性剤は、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸リ チウム、 ラ ウ リ ルサルコ シ ンナ ト リ ウ ム、 臭化へキサデシル ト リ メ チルア ンモ ニ ゥム、 塩化へキサデ シル ト リ メ チルア ンモニ ゥ ム、 塩化へキサデシルピ リ ジニ ゥ ムお よびそれ ら の混合物か ら成る群よ り 選択 される 。 特に、 入手 の容易性や取 り 扱いの観点か ら は ドデシル硫酸ナ ト リ ゥ ム （ S D S ) が好適なイ オ ン性界面活性剤の例と して fe げられ る。 特に、 S D S は、 S D S — P a g e な どの電気泳動法にお いて用いられる汎用のイ オン性界面活性剤であ り 、 当該電 気泳 動 とィ ムノ ア ッセィ と の相関を容易にする 目的等において も、 好ま しいイ オン性界面活性剤である。

添加 されるイ オン性界面活性剤の濃度は、 本発明の対象 と な る水難溶性/難抽出性タ ンパク質の実質的な可溶化や抽出 を達 成でき る濃度であれば、 いかなる濃度でも かまわないが、 通常 は、 0 . 1 % ( W / V ) 以上、 好ま し く は 0 . 3 % ( W V ) 超え、 0 . 5 ( W / V ) 以上であって も一向に差し支えな い。 よ り 好ま し く は、 1 % ( W/ V ) のイ オン性界面活性剤が 前記 水性溶媒に添加され、 1 0 % ( W / V ) 程度の高濃度のィ オン 性界面活性剤さ えも使用でき る。 本発明の方法では、 その よ う な高濃度のイ オン性界面活性剤を含有する水性溶媒によ り 可溶 化 Z抽出されたタ ンパク 質さ えも、 当該イ オン性界面活†fe剤の 濃度を実質的に維持 したままの状態で、 引 き続く ィ ムノ ア ッセ ィ によ り検出 されるのである。

また、 本発明の特に好ま しい水性溶媒には、 上記の高濃 度の ィ オン性界面活性剤に加えて、 2 —メ ルカ プ トエタ ノーノレゃジ チオス レィ トール （ D T T ) 、 シァノ水ホ ウ素化ナ ト リ ゥ ム ( S C B H ) 、 ジメ チルァ ミ ンボラ ン （ D M A B ) 、 水ホウ素 ィ匕ナ ト リ ウム （ S B H ) やシスティ ンに代表される還元剤を添加す る こ と が好ま しい。 その原理は明 らかではないが、 当該還元剤 の添加によ り 、 引き続く ィ ム ノ ア ツセィ の再現性力 S向上する こ と が しばしば経験される 力 らである。 好適には、 該還元剤力 1 m M乃至 2 M程度の濃度、 通常 1 M程度の濃度で、 水性溶媒に 添カ卩される。

以上によ り 、 特に好ま しい本発明のイ オ ン性界面活性剤含有 水性溶媒は、 1 % ( W / V ) の ドデシル硫酸ナ ト リ ゥムおよび 1 Mの 2 — メルカプ トエタ ノールを含む リ ン酸緩衝液等であ り 得る。

既に明 ら かなよ う に、 本発明の方法の利点は、 高いタ ンパク 質可溶化能力を有するイ オン性界面活性剤によ り 水難溶性 /難 抽出性タ ンパク質を可溶化/抽出 し、 得られた抽出溶液を実質 的に希釈する こ と な く 、 続く ィ ム ノ ア ツセィ に供し う る と い う こ と にある。 従来の技術常識では、 S D S に代表さ れるイ オン 性界面活性剤が、 比較的高濃度 （例えば 0 . 0 3 %以上） で反 応液内に存在する と 、 所望の抗原—抗体反応が達成 し得ない と 考え られて きた。 従って、 水難溶性 難抽出性タ ンパク 質に関 する典型的な従来のィ ム ノ ア ツセィ では、 高濃度のイ オン性界 面活性剤を含む試料溶液への抗体の添加に先立って、 試料溶 液に対する煩雑な前処理や大幅な希釈が必要と されて 、 たので あ り 、 つま り は、 当該前処理や希釈に よ って、 該試料 液中の イ オン性界面活性剤濃度を 0 . 0 3 %程度にまで減少さ せた後 に、 抗原一抗体反応を実施 していたのである。 従って、 例えば 1 0 % ( W / V ) の S D S を含む水性溶媒にて抽出 し 難溶性 タ ンパク質を含む試料溶液は、 抗原—抗体反応の実施に 先立つ て、 少な く と も 3 0 0倍希釈 （ 0 . 0 3 % — S D S ) さ れる必 要があつたのであ り 、 これは同時に、 当該タ ンパク質 検出感 度を 3 0 0 分の 1 に低下させる こ と を意味する。

これに対 し、 本発明の方法においては、 抗原一抗体反応 自 体 がかな り 高濃度のイ オン性界面活性剤の存在下でも十分 に行わ れ得、 そのよ う な抗原一抗体反応の特異性および親和†fe は、 目 的のタ ンパク質を同様のィ オン性界面活性剤で変性さ た変性 タ ンパク質に対する抗体の使用によ り 、 著 し く 改善さ ^ る と の 新規な知見に基づいて、 例えば 1 % S D S含有水性溶 で可溶 ィ匕 したタ ンパク質の溶液を、 実質的に希釈する こ と な く 、 続く 抗原一抗体反応のための試料溶液と して使用 して、 ァ ゾ セィ全 体の感度向上を図る の であ る。 或いは、 本発明の方法 では、 1 o % ( w z V ) 以上の S D s を含む溶媒で可溶ィ匕 した難溶性 のタ ンパク 質を、 当該 1 0 % S D S溶液のままで抗原一抗体反 応によ り 測定する こ と も可能なのである。 また、 当然ではある が、 試料溶液中の抗原タ ンパク質量を正確に定量する際には、 測定の直線性を確認する こ と等を 目的に、 前記溶?夜を適当に段 階希釈する必要も あ り 得る。 本発明においては、 そのよ う な段 階希釈においても、 試料溶液の S D S濃度を低下させる こ と を 目 的とする必要はな く 、 これは、 S D S濃度の低下によ る水難 溶性タ ンパ ク 質の析出の危険性さ えも回避し得る。 従っ て、 本 発明においては、 高濃度のイ オン性界面活性剤を含む試料溶液 を場合によ り 希釈する際においても、 そのイ オン ' I·生界面活性剤 濃度を、 少なく と も 0 . 0 3 % ( W / V ) 以下にする必要がな 前記の と お り 、 本発明の重要な構成の一つは、 '待定のイ オン 性界面活性剤によ り 予め変性された水難溶性ノ難油出性タ ンパ ク質を免疫原と して免疫動物等に投与 し、 当該免疫動物に由来 する該タ ンパク質への特異抗体を用いて、 抗原一抗体反応に基 づ く ィ ム ノ ア ツセィ を実施する こ と である 。

よ り 具体的に、 ある水難溶性/難抽出性タ ンパク質が、 S D S を含む水性溶媒にて試料から抽出可能である こ と が知 られてい れば、 本発明の抗体作製においては、 該タ ンノ ク 質を S D S で 変性させ、 当該変性タ ンパク質を免疫原と して免疫動物に投与 する。 こ こ で、 該タ ンパク 質の変性は、 簡便に は、 測定対象の 水難溶性ノ難抽出性タ ンパク 質を、 高濃度のィ オン性界面活性 剤含有溶液に溶解または懸濁 し、 ー晚以上、 室温で放置 してお く だけで達成でき る。 また、 タ ンパク 質の可溶化ノ抽出のため の水性溶媒が 2 —メ ルカプ トエタ ノ ールのよ う な追加の還元剤 を S D S と 共に含む本発明の好ま しい例では、 抗原タ ンパク 質 の変性を、 当該 2 —メルカプ トエタ ノ ールと S D S の存在下で 行 う こ と が好ま しい。 例えば、 測定対象の水難溶性 Z難抽出性 タ ンパク質を、 1 % S D S と 1 Mの 2 — メ ルカ プ ト エタ ノ ーノレ を含む水性溶媒に懸濁/溶解 し、 これを室温でー晚以上放置 し て、 本発明の抗体作製に用いる変性タ ンパク 質免疫原と する こ と ができ る。

上記のよ う に して得られた変性タ ンパク 質の免疫動物への投 与は、 当業者にと って周知のいずれのプロ ト コ ールをも使用す る こ と ができ、 そのよ う なプロ ト コ ール の最適ィ匕も 当業者に と つて容易であろ う。 免疫動物 と しては、 マ ウス 、 ラ ッ ト 、 ヒ ッ ジ、 ゥサギ等を用いても よい。

特に、 本発明の抗体をポ リ ク ローナル抗体の形態 で用いる場 合、 当該ポ リ ク ローナル抗体は、 免疫動物の抗血清 よ り 調製す る。 具体的に、 当該免疫動物からの抗血淸は、 例え ば、 アジュ バン ト を含む前記免疫原を免疫動物に皮下注射し、 当該皮下投 与を適当な間隔 （例えば 1 週間） で所定の回数 （例えば 5 回） 繰 り返し、 最終免疫後に全血を採集して、 これを分離する こ とで得 るこ とができ る。 そのよ う な方法は、 例えば、 「 C U R R E N T P R O T O C O L S I N I MM U N O L O G Y 、 第 2 . 4 章 発行元 ： J o h n W i l e y & S o n s , I n c . , N e w Y o r k ) 」 等に記載されている。 ついで 、 前記抗血 清からのポ リ ク ローナル抗体の精製は、 動物の免疫 に用いた変 性タンパク質をク ロマ ト グラフィー用の樹脂、 例え «ί、 C N B r 活性ィ匕セファロースゃ H i T r a p N H S - a c t i v a t e d ( A m e r s h a m P h a r m a c i a 社製） に 共有結合で 固相化 し、 該固相化樹脂に上記抗血清を供 して当該抗血清中の 抗体を特異的に樹脂上に吸着させ、 ついで、 該樹脂 上に吸着 し た抗体を適切な緩衝液やカオ ト 口 ピッ クイ オン等を 用いて溶出 させて回収する こ と でも達成でき るが、 これに限定 されない。 また、 本発明の抗体をモ ノ ク ロ ーナル抗体と して得る場合は、 当業者に既知の手法を用いて、 免疫 したマ ウ ス の脾細胞 と ミ エ ローマ細胞株な どの細胞融合用のペア レ ン トセノレを融合 させ、 得られたハイ プ リ ドーマの中力 ら好適なものを選択 して ク 口 ン化 し、 次いで、 その融合細胞を生体外または生体内で培養 し、 の培養混合物よ り 特異性の高いモ ノ ク ロ ーナル抗体を採取す る。

更に、 本発明の抗体と して、 上記の よ う なポ リ ク ローナル Z モ ノ ク ロ ーナル抗体の他、 それらの抗体を酵素消化処理 して得 られる よ う な当該抗体の反応性フ ラ グメ ン ト も用いる こ と もで き る。 当該抗体フ ラ グメ ン ト の例には、 F a b フ ラ グメ ン ト、 F a ' フ ラ グメ ン ト 、 F ( a b ' ) 2 フ ラ グメ ン ト 、 F ( v ) フラ グメ ン ト、 H鎖モノ マー又はダイマー、 L鎖モ ノ マー又は ダイ マー、 1 個の H鎖及び 1 個の L鎖からなる ダイ マー等が含 まれる。 該フ ラ グメ ン ト は、 例えばペプシ ンやパパイ ン等のプ 口テアーゼによ り 完全な抗体を消化するか、 消化後、 必要に応 じて還元剤で処理するこ と によ り 得る こ と ができ る。 H鎖及び

L鎖モ ノ マーは、 完全な抗体をジチオス レィ ト ール等の還元剤 で処理 した後、 精製 した鎖状体を分離する こ と によ り 得る こ と もでき る。

なお、 本発明においては、 前記イ オ ン性界面 活性剤変性タ ン パク質に対する抗体を用いて測定を実施する こ と が好ま しいが ある種のタ ンパク質においては、 その よ う な変 '性タ ンパク 質に 対する抗体が必ず しも必要ではな く 、 天然型 （ n a t i v e ) のタ ンパク 質に対する抗体を用いても許容可能 な検出が行い得 る こ と が明 らかになった。 し力 しなが ら、 一般 的に、 そのよ う な天然型タ ンパク質に対する抗体を用いた検出 では、 イ オン性 界面活性剤を含む試料溶液の放置時間に比例 し て検出感度が減 少する こ と が観察された。 すなわち、 特定の水 難溶性 Z難抽出 性タ ンパク質をイ オ ン性界面活性剤含有水性溶 媒で抽出 した後 これを比較的単時間の う ちに続く 抗原—抗体反 応に供する場合 には、 比較的安定な抗原一抗体複合体の形成が 認め られるが、 抽出後、 時間の経過 と共に当該複合体の形成率 が減少 した。 こ のこ と は、 天然型タ ンパク質に対する抗体を用 いたィ ム ノ ア ツ セィでは、 時間依存的にア ツ セィ の再現性が損 なわれ得る こ と を意味する。

これに対 し、 本発明の変性タ ンパク 質に対す る抗体を使用す る場合、 そのよ う な経時的変化は微小であ り 、 特に、 予め抽出 液を煮沸 した場合において、 再現 t生の高いア ツセィ が行い得る こ と も見出 された。 すなわち、 本発明の更に好ま しい態様と し ては、 水難溶性 Z難抽出性タ ンパク 質を高濃度のィ オン性界面 活性剤含有水性溶媒で抽出 し、 次レヽで、 得 られたタ ンパク 質溶 液を煮沸、 すなわち、 少な く と も 8 0 °C以上の温度で 5 分以上 加熱し、 冷却後、 当該溶液に対して、 イ オ ン性界面活性剤変性 タ ンパク質に対する抗体を添加 して、 抗原一抗体複合体を形成 させる こ と があげられる。

かく して、 水難溶性/難抽出性タ ンパク 質を効率的に可溶化 /抽出 し、 当該高い抽出率を希釈等 によ り 犠牲にする こ と な く 、 効果的に抗原一抗体反応を達成 し得る高感度ィ ム ノ ア ツセィ · プロ ト コールが提供される。

なお、 本発明の免疫学的測定には、 上記のよ う に して形成さ れた抗原一抗体複合体を検出する こ と も含まれる が、 当該検出 は、 当業者に周知のいずれの方法に よ って も よいこ と が理解さ れるであろ う。 例えば、 本発明の免疫学的測定の一例であるサ ン ド ウイ ッチ · ィ ム ノ ア ツセィ で ίま、 1 の本発明のイオン性界 面活性剤変性タ ンパク質に対する抗体が、 ゥエル底面な どの固 相のコーテ ィ ングに用レ、 られてキヤ プチヤー側抗体を提供 し得 該変性タ ンパク質に対する も う 一方の抗体 （キ ヤプチヤー側抗 体と 同一または異なっていて よい） が放射性物質や着色粒子又 は酵素で標識されて検出側抗体を提供 し得る。 キヤ プチヤー側 抗体を有する ゥ ル内に、 上記イ オ ン性界面活性剤含有試料溶 液が添加され、 所定時間イ ン キ ュベー ト された後、 該抽出液を ゥエルから取 り 除き 、 好適な緩衝液等によ り ゥ エル内を充分に 洗浄後、 検出側の抗体が ゥエ ルに添加 される。 所定のイ ンキュ ベーシ ヨ ンの後、 ゥ エル内を洗浄し、 キヤ プチヤ ー側抗体—測 定対象物—検出側抗体複合体の生成を検出する。 検出は、 検出 側抗体に標識された標識物質の性質に依存 し、 放射性標識であ れば放射線量が、 着色粒子標識であれば発色量や吸光度が、 ま た酵素標識 （ E L I S A法） であれば、 更に適当な基質を ゥ ェ ルに添加 し、 所定のイ ンキュベーシ ョ ン後の吸光度が検出 され る。 なお、 上記 E L I S A法で酵素標識に用いる酵素に特に制 限はな く 、 例えば西洋ヮサビペルォキシダーゼやアル力 リ 性フ ォ ス フ ァターゼ等の酵素が有利に使用 される。 西洋ヮサ ビペル ォキシダーゼで標識する場合は、 当該酵素の基質と して 3 , 3 ' 5 , 5 ' —テ ト ラ メ チルベンチジン等がその基質と して利用可 能である。 アルカ リ 性フ ォ ス フ ァ ターゼを使用する場合は、 基 質と して p —二 ト ロ フエニル燐酸 が基質と してあげ られる。 上 記の免疫学的測定結果に基づき、 本発明の対象であ る水難溶性 難抽出性タ ンパク質の検出が可 能と なるの である

更に説明せずと も れまでの 説明 を与え られた当業者は 本発明を充分に活用 し得る。 以下 、 説明のみの 目 的で実施例を 与える。 なお、 以下において、 特に こ と わ り のない限 り 濃度 （％ ) は、 重量 Z容量 （w/v) %を示 す

実施例

固相サン ドイ チ法によ る i S D S を含む検 のオボム コ ィ ドの測定 (天然型ォボ ·^ィ ド に対する抗体の使用）

( 1 ) 抗ォボム コイ ド抗体の固 相化

ゥサギ抗— （天然型） オボム コ イ ド一ポ リ ク ローナル抗体を 炭酸緩衝液 （ ρ Η 9 . 6 ) に 1 g / m 1 になる よ う に溶解 し た。 これをマイ ク ロ タイ タープレ ー ト （ N u n c 社、 マイ ク ロ モ ジユ ーノレプ レー ト 、 M a s p - F 8 ) に Ι Ο Ο μ Ι ず つ分注し、 常温で 2時間放置した

( 2 ) マイ ク ロ タイ タープレー ト のブ口 ッ キング

各ゥ エルから上記抗体溶液を除去後、 3 0 0 μ 1 のプロ ツ キ ング溶 ί夜 （ 1 5 0 m M N a C 1 、 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 0 . 1 %ゥシ血清アルブ ミ ン を含む 2 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 ( P H 7 . 4 ) ) を加え常温で 2 時間放置 した。

( 3 ) オボムコィ ドの測定

各ゥ エル中のプロ ッキング溶液を除去後、 各ゥ エ ルに検体希 釈溶液 （ 0 . 1 % ゥ シ血清ァノレブ ミ ン ： 1 5 0 m M N a C 1 ： 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 ： 0 %、 0 . 0 1 %、 0 . 0 5 %、 0 . 1 %、 0 . 5 %または 1 %の S D S含有 2 0 m M ト リ ス塩 酸緩衝液 （ P H 7 . 4 ) ) で段階希釈 したオボム コイ ド標準品 (商品名 ： 卵製 ト リ プシ ンィ ン ヒ ビター、 ナカライテ ス タ社製） を 1 0 0 μ 1 カ卩え、 常温で 2 時間放置 した。 （なお、 以下に示 す種々 の検体の測定において 、 当該検体に含まれるオボム コィ ド量が上記系での測定範囲以外と なる場合には、 当該検体を更 に検体希釈溶液で希釈 して上記系の測定範囲内 と なる よ う に し てから測定した。 ）

次いで、 各 ゥ エルを洗浄 ί夜 3 0 0 μ 1 で 6 回洗浄後、 西洋 ヮ サ ビペルォキ シダーゼ標 識抗ォ ボ ム コ ィ ドポ リ ク ロ ーナ ル抗体を 0 . 1 % 8 3 八、 1 5 0 m M N a C l 、 0 . 0 5 % T w e e n 2 0含有 2 0 m [ ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7 . 4 ) で希釈 した溶液を 1 0 0 μ 1 ずつ加え、 常温で 3 0 分間放置 し た。 次に、 各ゥエルを洗浄液 3 0 0 μ 1 で 5 回洗浄後、 Τ Μ Β 溶液 （ 3 、 3 ' 、 5 、 5 ' テ ト ラ メ チルベ ンジジン） を 1 0 0 μ 1 ずつ加え、 常温で遮光 し 1 0 分間反応 させた。 その後、 1 規定硫酸を 1 0 0 β 1 ずつ各ケ エルに加え反応を停止させた。 各ゥエルの吸光度をマイ ク ロ ： 7° レー ト リ ーダーを用いて主波長 4 5 0 n m、 副波長 6 3 0 n で測定 した。 得られた標準曲線 を第 1 図に示す。

第 1 図力 らゎ力 る よ う に、 0 . 0 1 〜 1 . 0 %の S D S溶液 中の検体によ る標準曲線は、 S D S を添加 していない溶液中の 検体による 曲線と ほぼ同等で る こ と から、 本測定系において S D S 存在下でもオボム コ ィ ド、 の定量が可能である こ と が確認 された。

なお、 実際に種々 の検体中 O オボム コィ ド量を測定する場合 には、 この よ う に して得られ 標準曲線を も と に検体中のオボ ム コィ ド量を換算 した。

( 4 ) 検体の免疫測定

上記の試験法に従って、 実際 に検体の免疫測定試験を行った。 市販品の三種類のマ ヨネーズを 、 1 % S D S を含む検体希釈液 でそれぞれ 3倍段階希釈 し、 同時に測定した標準オボム コィ ド から得られた標準曲線に基いて、 検体のオボム コィ ド濃度を算 出 した。 第 2 図の結果に示すと お り 、 原点を通る良好な直線性 が得られた。

( 5 ) 添加回収試験

上記の試験法に従って抗原の添加回収試験を行った。

市販品の 3種類の ビスケ ッ ト を検体 と して、 その 1 % S D S 含有抽出液を調製 した。 すなわち、 当該ビス ケ ッ ト を均一に粉 末化 し、 当該粉末の 2 g を秤取 した。 これに 3 8 m l の 1 % S D S含有検体希釈液を力 [1え、 ホ モジナイ ザーを用いて 3 0秒 X 2 回の攪拌を行レヽ、 得 られた混合液を 3 , O O O X g で 2 0 分間遠心分離 した。 得られた上清を 5 Aの濾紙で濾過 し、 当該 濾液を食品抽出液 （ 1 % S D S含有抽出液） と して測定に用い た。 次いで、 該抽出液に標準オボム コィ ドを添加 して免疫測定 を実施 し、 測定値力 ら添加 したオボム コィ ド量の回収率を求め た。 回収率は、 添力 [1抗原量を 1 0 0 % と し、 該添加抗原量に対 する測定値から固有の検体含有抗原量を引いた値の割合で示す _c 以下の表 1 に示すとお り 、添加回収率は 8 8 . 7 カゝら 9 6 . 1 % と 良好な結果が得られ、 本発明の方法によ り 食品中のオボム コ ィ ドが正確且つ鋭敏に測定し得る こ と が示された。 1 添加回収試験の糸 ' i士

実施例 2

固相サン ドィ ツ チ法に よ る 、 各種イ オン性界面活性剤ま たは 非イ オ ン性界面活性剤を含む検体中 のオボ ム コ ィ ドおよ びオボ アルブ ミ ンの測 定 （杭一天然型タ ンパ ク 質 —抗体の使用）

上記実施例 と 同様の条件で、 本発明 の陰イ オ ン性界面活性剤 の一種であ る S D S 、 ドデシル硫酸 リ チ ウ ム （ L D S ) お よ び ラ ウ リ ノレサル コ シ ンナ ト リ ゥ ム 、 陽イ オン性界面活性剤の一種 である臭化へキサデシル ト リ メ チルア ンモニ ゥム （ H D T MA B ) 塩化へキサデシノレ ト リ メ チルア ンモニ ゥ ム （ H D T M A C ) お よ び塩化へキナデキ シル ピ リ ジニ ゥ ム （ H D P C ) 、 並びに参 考 と して非イ オ ン性界面活性剤であ る T w e e n 2 0 、 ノレプ ロ ール P Xお よ び T r i o n X - 1 0 0 な ら びにス テ ロ イ ド骨格 を有する界面活性剤であ るデォキシコール酸 （ D O C ) の、 ォ ボム コィ ド、およびオボアルブミ ン (参考例） の免疫測定系に対 する影響を検討した。 ，

すなわち 、 1 m l あた り 6 4 n g のオボアルブ ミ ンお よび 6 4 n g の ボム コィ ドを含む検体について、 上記の各種界面活 性剤の種々 の濃度におけ る免疫測定を行っ て吸光度を測定 し、 その結果を以下の表 2 〜 5 および第 3 図〜 ⁸ に示す。 表 2 オボアルブミンの測定系におけるイオン性界面活性剤の影響

3 オボムコィ ドの測定系におけるイオン性界面活性剤の'影響

表 4 tボアルブミンの測定系における非イオン性界面活性剤の影響 界面活性剤 非イオン性界面活性剤 ステロイ ド界面活性剤 濃度 （％) T w e e n20 LubrolPX TritonX-100 DOC

0. 0 O 5 1. 769 1. 859 1. 667 1. 888

0. 01 4 1. 71 3 . 803 1. 837 1. 889

0. 0 1 1. 71 8 1. 727 1. 847 1. 895

0. 1 23 1. 786 1. 71 0 1. 828 1. 820

0, 3フ 0 1. 754 1. 609 1. 788 1. 830

1. 1 1 0 1. 743 1. 658 1. 81 2 1. 627

3. 330 1. 780 1. 61 2 1. 791 . 383

1 0. 0 O 0 . 668 1. 399 1. 735 1. 1 99 表 5 オボ厶コ ィ ドの測定系における非イオン性界面活性剤の影響

本試験の結果、 オボアルプミ ンの測定系においては比較的高 濃度 （例え f 0 . 1 %以上） のイ オ ン性界面活性剤が測定感度 を著し く 低 " させ、 免疫測定を阻害するのに対 し、 オボム コィ ドの測定系 ίこおいては 1 0 %程度の極めて高い濃度のイ オン性 界面活性剤存在下においてもその測定が十分可能な こ と が明 ら 力 と なった。 こ のこ と 力 ら、 抗ー （天然型） オボアルブ ミ ン一 抗体を用いる 場合を除いては、 抗ー天然型タ ンパク 質一抗体を 用いた場合でも、 本発明のイ オン性界面活性剤の有する 高いタ ンパク 質抽出能力 と あわせて、 優れた検出感度と正確性を達成 する免疫測定系が提供され得る こ と が実証された。 なお、 参考 と した非ィ 才ン性界面活性剤およびデォキシコール酸は、 ォボ アルブ ミ ンお よびオボム コ イ ドのいずれの測定系に も影響 しな かっ た。

実施例 3

カゼイ ン及び ] 3 — ラ ク ト グロ ブ リ ンの測定 （杭—天然型タ ン パク 質一抗体の使用）

抗— （天然型） オボム コ ィ ド—抗体の代わ り に抗— （天然型） カゼイ ン一 抗体又は抗ー （天然型） — ラ ク ト グロ ブ リ ンー抗 体を使用 し た他は、 実施例 1 と ほぼ同様な手順でカ ゼィ ン又は J3 — ラ ク ト グ ロ プ リ ンの測定を行っ た。 すなわち、 S D S 濃度 を 1 0 %カゝ ら 0 . 1 5 6 %ま で段階希釈 した検体希釈液に、 そ れぞれ l m 1 あた り 牛乳タ ンパク 質量 と して 6 4 n g の牛乳タ ンパク 質を 添加 して測定用 の試料溶液を作製 した。 当該試料中 のカゼイ ン又は |3 — ラ ク ト グロ プ リ ン を実施例 1 と 同様のプロ ト コ ールで実施 さ れ る 市販のカ ゼィ ン用牛乳免疫測定キ ッ ト 又 は — ラ ク ト グ ロ ブ リ ン用牛乳免疫測定キ ッ ト （ と も に、 天然 型タ ンパク 質に対す る抗体を使用。 株式会社森永生科学研究所 よ り 入手。 商品名 、 モ リ ナガ特定原材料測定キ ッ ト ： 牛乳測定 キ ッ ト （カ ゼイ ン） 及びモ リ ナガ特定原材料測定キ ッ ト ： 牛乳 測定キ ッ ト （ ]3 — ラ ク ト グロ ブ リ ン） ） で測定 した。 結果を第 9 図および第 1 0 図に示 した。

第 9 図およ び第 1 0 図力、 ら明 らかな よ う に、 天然型タ ンパク 質に対する抗体を用いた場合でさ えも、 カゼィ ンおよび 0 — ラ ク ト グロ プリ ンにおいて、 S D S に代表される よ う なイ オン性 界面活性剤の 高濃度存在下で免疫測定が良好に実施でき る こ と が示された。

実施例 4

そばタ ンパ ク 質、 小麦タ ンパク質及ぴ落花生タ ンパク 質の測 定 （抗—天然型タ ンパク 質一抗体の使用）

実施例 3 と 同様に して、 そばタ ンパク質、 小麦タ ンパク質 （グ リ ァジ ン） 及 び落花生タ ンパク質の測定に対するイ オン性界面 活性剤の影響 を検証 した。 なお、 添加実験に用いたそばタ ンパ ク質は、 そば の子実を磨砕 し、 当該磨砕物に塩化ナ ト リ ウム等 の塩類を含む緩衝液 （ ト リ ス 一塩酸緩衝液等） を加えて成分を 抽出する こ と で得られた抽出物を遠心分離 してその上清を回収 し、 次いで、 該上清をス ーパーデッ ク ス G — 2 0 0 やス ーパー ロ ー ス 6 、 と も に A m e r s h a m P h a r m a c i a 社 製） のゲル濾過カ ラ ムに供 し、 分子量 7 0 〜 5 0 0 k Dの範囲 に溶出される 画分を回収する こ と によ り 調製 した。 また、 小麦 タ ンパク質 (ダ リ ァジ ン） は、 アサマ化成 (株） よ り 入手した 市販品を用い、 落花生タ ンパク 質は、 落花生の子 実を磨砕し、 当該磨砕物に塩化ナ ト リ ゥム等の塩類を含む緩衝 液 （ ト リ ス 一 塩酸緩衝液等） を加えて成分を抽出する こ と で得 られた抽出物 を遠心分離 してその上清を回収 し、 次いで、 該上 清をス ーノ 一 デッ タ ス G — 2 0 0やス ーパー ロ ース 6 ( と も に A m e r s h a m P h a r m a c i a社製） の ゲル濾過カ ラ ムに供 し、 分子量 3 0 〜 1 0 0 k Dの範囲に溶出 される画分を 回収する こ と によ り 調製 した。 これ ら の試料を用いた免疫測定 法によ る試験 は、 各市販の測定キッ ト （株式会社森永生科学研 究所製、 モ リ ナガ特定原材料測定キ ッ ト ： そば測定キッ ト、 モ リ ナガ特定原材料測定キ ッ ト ： 小麦測定キ ッ ト （グ リ アジン） 及びモ リ ナガ特定原材料測定キ ッ ト ： 落花生測定キ ッ ト 、 いず れも天然型タ ンパク 質に対する抗体を使用） によ り 実施 した。 結果を第 1 1 図乃至 1 3 に示 した。

第 1 1 図乃 至第 1 3 図力 ら、 そばタ ンパク質、 小麦タ ンパク 質及び落花生 タ ンパク質においても、 高濃度のイオン性界面活 性剤の存在下 で、 天然型タ ンパク質に対する抗体の使用によ り 、 免疫測定が良好に実施でき る こ と が示された。 実施例 5

抗ーイ オ ン性界面活性剤変性タ ンパ ク 質一抗体の作製

実施例 1 乃至 4 か ら、 オボム コイ ド、 、 カ ゼイ ン 、 β — ラ ク ト グロ プ リ ン、 そ ばタ ンパク 質、 小麦タ ンパク 質及び落花生タ ンパク 質において は、 それ ら の天然型タ ンパク 質対 して産生 さ れた抗体を用 いて も 、 高濃度のイ オン性界面活性剤存在下で、 特異的抗原 一抗体反応が達成 し得る こ と が示 さ れたが、 ォボア ルプ ミ ンにおいては、 そ の よ う な抗原 —抗体反応が実施 し得な かっ た。 そ こ で、 以下の よ う に して、 イ オ ン性界面活性剤で予 め変性 させたタ ンパ ク 質に対す る抗体を作製 し、 こ れを利用す る 方法を検討 した。

( 1 ) タ ンパク 質の変性

以下のタ ンパ ク 質を 0 . 1 〜 1 O m g / m 1 の濃度で 1 % S D S お よび 1 Mの 2 — メ ルカ プ ト エタ ノ ールを含む溶液に溶解 し、 ー晚、 室温で放置 した ：

1 . オボ' アルブ ミ ン （生化学工業株式会社よ り 購入。 商品名 ； 「 E g g A l b u m i n , 5 x C r y s t . ( C h i c k e n ) J )

2 . オボ ム コィ ド （ナカ ライ テス ク 社よ り 購入。 商品名 ； 「 ト リ プシ ンイ ン ヒ ビター （ f r o m c h i c k e n E g g W h i t e ) 」 ）

3 . 落花生 タ ンパク質は、 以下の と お り 調製 した。

1 ) 落 花生の子実を磨砕 し、 当該磨碎物に塩化ナ ト リ ウ ム等の塩を含 む緩衝液 （ ト リ ス 一塩酸緩衝液） を加えて成分を 抽出する。

2 ) 抽 出物を遠心分離して上清を回収する。

3 ) 上 、凊をス ーノ ーデッ ク ス G — 2 0 0やス ーパー ロ ー ス 6 (と bに A m e r s h a m P h a r m a c i a 社製) のゲル濾過力 ラ ムに供し、 分子量 3 0 〜 1 0 0 k D の範囲に溶 出される画分 を回収する。

4 . そばタ ンパク質は、 以下の と お り調製 した。

1 ) そ ばの子実を磨砕し、 当該磨砕物に塩化ナ ト リ ゥム 等の塩を含む 緩衝液 （ ト リ ス 一塩酸緩衝液） を加えて成分を抽 出する。

2 ) 抽 出物を遠心分離 して上淸を回収する。

3 ) 上 淸をス ーパーデッ ク ス G — 2 0 0 やス ーパー ロ ー ス 6 (と ¾に A m e r s n a m P h a r m a c i a 社製) のゲル濾過力 ラ ム に供し、 分子量 7 0 〜 5 0 0 k D の範 Mに溶 出 される 画分を回収する。

( 2 ) ゥサギポ リ ク ローナル抗体の調製

上記の よ う に して変性 したタ ンパク 質について、 フロ イ ン ト のアジュ ノ ン ト を用いてェマルジ ョ ンを作製し、 当該ェマルジ ヨ ンを ゥ サギの皮下に注射 して免疫 した。 免疫は、 一回あた り 1 m g の上記変性タ ンパク質が投与される よ う に行い、 一週間 おきに 5 回投与を行った。 最終免疫終了の一週間後に、 免疫 し た ゥサギの全血を採集し、 抗血清を調製した。 当該抗血清から の本発明 の抗体の調製は、 以下の手順に従った。 すなわち、 上 記ゥサギの免疫に用いた変性タンパク質を H i T r a p N H S — a c t i v a t e d ( A m e r s a m P h a r m a c i a 社製） に共有結合で固相化 し、 該固相化樹脂に上記抗血清を供 した。 ついで、 当該固相化樹脂上のタ ンパク質画分に結合 した 抗体を、 p H 2 . 7 に調製 した 0 . 1 M G l y _ H C l で溶 出 して、 本発明の抗体を得た。

実施例 6

抗ーィ オン性界面活性剤変性タ ンパク質—抗体の使用 によ る 以下の プロ ト コールに基づいて、 本発明のイ オ ン性界面活 性剤変性 タ ンパク 質に対する抗体の使用 によ る、 免疫学的測 定 （ E L I S A ) 法を評価 した。

[抗体固相化]

1 . 上記のイ オン性界面活性剤変性タ ンパク質に対する ゥサ ギポ リ ク ロ ーナル抗体を炭酸緩衝液 （ p H 9 . 6 ) に 1 μ g Z m Lで調製。

2 . マ イ ク ロ タ イ タ一プ レー ト ( N u n c社、 マイ ク ロ モジ ユーノレプ レー ト 、 M a x s o r p — F 8 ) に 1 0 0 /i Lずつ分 注常温で 2 時間静置。

[プロ ッ キング]

1 . 抗体固相化後、 抗体溶液を除去、 3 0 0 μ L のブロ ッ キ ング溶液 （ 1 5 0 m M N a C l 、 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 、 0 . 1 % ゥシ血清ア ルプ ミ ンを含む 2 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 ( H 7 . 4 ) ) を加え 2 時間静置。

[試料溶液の調製]

1 . 標準タ ンパク 質を 1 % S D S 、 1 Mの 2 — メ ルカ プ ト ェ タ ノールを含む緩衝液 （ P B S、 p H 6 . 5 ) に溶解し ：！ 〜 1 0 分間、 1 0 0 °C湯煎で沸騰加熱する。

2 . 加熱後、 上記と 同 じ緩衝液に よ り 標準タ ンパク濃度が 1 〜 6 4 n g ノ： m L の濃度になる よ う に希釈する。

[測 定 ]

1 . プロ ッ キング終了後の抗体固相化プレー ト に各濃度の標 準タ ンノ ク 溶液を 1 0 0 μ Lずつ加え、 1 時間常温で静置反応 させた。

2 . 反応後各ゥ エ ルを洗浄液 3 0 0 μ L で 6 回洗浄を行い、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識抗体を 0 . 1 % B S A、 1 5 0 m M N a C l 、 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 を含む 2 0 m M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H 7 . 4 ) で溶解 した溶液を 1 0 0 μ Lず つ加え、 常温で 3 0 分間静置反応させた。

3 . 各ゥ ヱルを洗浄液 3 0 O Lで 6 回洗浄後、 T M B溶液 ( 3 、 3 '、 5 、 5 'テ ト ラメ チルベンジジン） を l O O z Lずつ 加え、 常温で遮光 し、 1 0 分間反応。

4 . 1 規定硫酸を 1 0 0 μ Lずつ各 ゥエルに加え反応を停止 させた。 各 ゥエルの吸光度をマイ ク ロ プレー ト リ ーダーを用い て主波長 4 5 0 n m、 副波長 6 3 0 n niで測定 した。 結果は 2 重測定の平均値を示 した。

( 1 ) オボアルブ ミ ン の測定

天然型タ ンパク 質に対する抗体では測定が不能であっ たォボ アルブミ ン （第 3 図おょぴ第 4 図参照） について、 本発明によ る抗ーイオン性界面活性剤変性タ ンパク質一抗体を使用 した測 定結果を第 1 4 図に示 した。 本実施例では、 各濃度のオボアル プ ミ ンを溶解 した、 1 % S D S 、 1 Mの 2 —メ ルカプ トエタ ノ ールを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) を 5 分間、 1 0 0 °C 湯煎で加熱 して、 冷却後、 上記の E L I S A測定を実施 した。

第 1 4 図か ら、 高濃度のイ オン性界面活性剤の存在下におい ては、 天然型タ ンパク質に対する抗体を使用 した場合に測定が 困難である タ ンパク 質も、 抗ーイ オン性界面活性剤変性タ ンパ ク 質ー抗体を用いれば、 極めて高感度で測定でき る こ と がわか る。

( 2 ) 試料溶液の煮沸効果

本発明の抗ーイ オン性界面活性剤変性タ ンパク質一抗体を用 いた方法では、 試料溶液を予め煮沸する こ と によ り 、 測定の安 定性や感度を著 し く 向上させ得る こ と が示 された。 結果を、 第 1 5 図乃至第 1 8 図に示す。

.実施例では、 6 4 n g Z m 1 の濃度で各タ ンパク 質を、 1 % S D S 、 1 Mの 2 — メ ルカ プ トエタ ノ ールを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) に溶解 して試料溶液を調製 した後、 該試料溶 液を 5 分間、 1 0 0 °C湯煎で加熱 して、 その後、 室温で 0 乃至 6 時間放置 した場合の、 本発明の抗ーイオン性界面活性剤変性 タ ンパク質一抗体によ る E L I S Aの結果を示す。 一方、 参考 例 と して、 天然型タ ンパク質に対する抗体を用い、 同様の試科 溶液を加熱 した場合と加熱 しない場合の結果を示 した。 結果は、 天然型タ ンパク 質に対する抗体を用いた場合、 試料溶液を加熱 しなければ、 比較的単時間の間は高い検出感度を維持でき るが、 当該感度は経時的に減少する こ と を示す。 更に、 天然型タ ンパ ク質に対する抗体を用いた場合、 試料溶液を加熱する と 、 当初 か ら検出感度が大幅に低下する こ と を示 している。

これに対 し、 本発明の抗ーイ オン性界面活性剤変性タ ンパク 質一抗体を用い、 予め試料溶液を煮沸 した場合には、 高い検出 感度が長時間維持され、 極めて再現性と感度が高いアツセィ を 実施 し得る こ と が示された。

( 3 ) ア ツセィ の感度

本発明の好ま しい態様である、 抗—イオン性界面活性剤変性 タ ンパ ク質一抗体の使用 と 、 試料溶液の煮沸の組み合わせにお けるア ツセィ の感度を第 1 9 図乃至 2 2 に示 した。 実施例は、 各濃度のタ ンパク 質を、 1 % S D S 、 1 Mの 2 —メ ルカプ トェ タ ノ ールを含む緩衝液 （ P B S 、 p H 6 . 5 ) に溶解して試料 溶液と した後、 該試料溶液を 5 分間、 1 0 0 °C湯煎で加熱 し、 冷却後に測定した E L I S Aの結果を示す。 また、 図中、 参考 例は、 天然型タ ンパク質に対する抗体を用い、 試料溶液を加熱 した と きの結果を示す。 図から、 本願発明の方法が極めて高い 再現性と感度を有 している こ と がわかる。

産業上の利用可能性

特に、 実施例 6 か ら明 らかなよ う に、 本発明の抗ーイ オン性 界面活性剤変性タ ンパク 質一抗体を使用する こ と で、 タ ンパク 質のィ ム ノ ア ツセィ が、 高濃度のイ オン性界面活性剤の存在下 でも十分に実施し得る こ と が示された。 これによ り 、 イ オン性 界面活性剤の優れたタ ンパク質可溶化効果を利用する こ と で可 溶化 Z抽出 された難溶性 Z難抽出性タ ンパク 質を、 直接、 ィ ム ノ ア ッセィ で検出する こ と が可能と な り 、 そのよ う な高感度の 検出が要求 される よ う な生命科学研究や食品の品質保証におい て、 本発明の方法は、 極めて有効に利用でき る。

Claims

1 . 試料中の水難溶性/難抽出性タ ンパ ク 質の存在を検出す るための免疫学的測定法であって、 以下の工程、

冑

( 1 ) 試料中の水難溶性ノ難抽出性タ ンパク質を、 イ オ ン性界 面活性剤を含む水性溶媒で抽出および または可溶化する、

( 2 ) 工程 （ 1 ) で用いるイ オン性界面活性剤で予め変性させ 囲

た前記水難溶性ノ難抽出性タ ンパク 質を免疫原と して使用 して 得られた抗体を、 a ) 上記工程 （ 1 ) で得られたタ ンパク質溶液に対 し、 該溶液を実質的に希釈する こ と なく 添加するか ； 或いは b ) 上記工程 （ 1 ) で得られたタ ンパク 質溶液を、 そ のイ オン性界面活性剤濃度が 0 . 0 3 % ( W / V ) 以下にな ら ない範囲で希釈 した希釈液に対 して添加する ； こ と によ り 、 前記水難溶性/難抽出性タ ンパク 質と 前記 抗体と の間で抗原一抗体複合体を形成させる、 および

( 3 ) 形成された前記抗原一抗体複合体を検出する、 工程を含むこ と を特徴とする、 前記測定法。

2 . 工程 （ 1 ) におけ る水性溶媒中のィ オン性界面活性剤の 濃度が、 少な く と も 0 . 3 % ( W / V ) を超える、 請求項 1 に 記載の方法。

3 . 工程 （ 2 ) における抗原一抗体複合体の形成が、 少な く と も 0 . 3 % ( W / V ) を超えるイ オン性界面活性剤の存在下 で行われる、 請求項 1 または 2 に記載の方法。

4 . 前記イ オン性界面活性剤が、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム、 ドデシル硫酸 リ チ ウ ム、 ラ ウ リ ルサルコ シ ンナ ト リ ウム 、 臭化 へキサデシル ト リ メ チルア ンモニ ゥ ム 、 塩化へキサデシル ト リ メ チルア ンモニ ゥ ム 、 塩化へキサデシルピ リ ジニ ゥ ムお よびそ れ らの混合物か ら成る群よ り 選択される請求項 1 乃至 3 のいず れか一項に記載の方法。

5 . 前記イ オン性界面活性剤が ドデシル硫酸ナ ト リ ゥ ムであ る、 請求項 4 に記載の方法。

6 . 工程 （ 1 ) の水性溶媒が、 更に還元剤を含む、 請求項 1 乃至 5 のいずれか一項に記載の方法。

7 . 前記還元剤が、 2 —メ ルカプ ト エタ ノ ール、 ジチオス レ ィ トールまたはそれらの混合物である、 請求項 6 に記載の方法。

8 . 工程 （ 1 ) の水性溶媒が、 1 % ( W / V ) の ドデシル硫 酸ナ ト リ ゥムおよび 1 Mの 2 —メ ルカ プ ト エタ ノ ールを含む、 請求項 7 に記載の方法。

9 . 工程 （ 1 ) において、 タ ンパク質溶液を更に煮沸する こ と を含む請求項 1 乃至 8 のいずれか一項に記載の方法。

1 0 . 前記煮沸が、 少な く と も 8 0 °Cで 5 分間継続される請 求項 9 に記載の方法。

1 1 . 前記タ ンパク 質が、 難抽出状態下にあるオボアルプミ ン、 オボム コイ ド、 カゼイ ン、 一 ラ ク ト グロ プ リ ン、 そばタ ンパク 質、 小麦タ ンパク 質及び落花生タ ンパク 質か らな る群か ら選択される、 請求項 1 乃至 1 0 のいずれか一項に記載の方法。