JP6868872B2 - 難溶性蛋白質の可溶化剤、難溶性蛋白質の可溶化方法及び難溶性蛋白質のサンプル製造方法 - Google Patents
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難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含むことを特徴としている。
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む可溶化剤によって難溶性蛋白質を可溶化することを特徴としている。
消化工程の終了後に直ちに液体クロマトグラフィー質量分析の対象とすることができる難溶性蛋白質のサンプル製造方法であって、
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む可溶化剤で可溶化した蛋白質をイオン液体とアルカリ水溶液を吸着しない合成ポリマー系の疎水性マイクロビーズ又は疎水性官能基を結合したアルカリ耐性のビーズ担体に吸着させて抽出する抽出工程と、抽出された蛋白質から前記可溶化剤を選択的に除去する洗浄工程と、前記疎水性マイクロビーズ又は前記ビーズ担体に吸着した蛋白質を消化する消化工程を有し、液体が吸入又は排出される吸排出口に前記疎水性マイクロビーズ又は前記ビーズ担体が予め設けられた容器の内部において、前記全工程を、試料を他の容器に移し替えることなく同一の前記容器内で遠心操作又は液体の排出を行うためのピペティング操作の繰り返しのみの連続操作によって行うことを特徴としている。
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含んでおり、従来、例えば難溶性の蛋白質凝集体の可溶化剤として使用されているギ酸や尿素などの変性剤・ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤に比べ、難溶性蛋白質を迅速かつ高濃度に可溶化することができる。
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む可溶化剤によって、従来、例えば難溶性の蛋白質凝集体の可溶化剤として使用されているギ酸や尿素などの変性剤・ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤に比べ、難溶性蛋白質を迅速かつ高濃度に可溶化することができる。
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含むことにより、加熱卵白蛋白質を可溶化できる可溶化剤で可溶化した蛋白質をイオン液体とアルカリ水溶液を吸着しない合成ポリマー系の疎水性マイクロビーズ又は疎水性官能基を結合したアルカリ耐性のビーズ担体に吸着させて抽出する抽出工程と、抽出された蛋白質から可溶化剤を選択的に除去する洗浄工程と、前記疎水性マイクロビーズ又は前記ビーズ担体に吸着した蛋白質を消化する消化工程を連続的に行って難溶性蛋白質のサンプルを効率的かつ少ないサンプルロスで製造することができ、直ちに液体クロマトグラフィー質量分析の対象とすることができる。
異なる容器に試料を移し変える手間が不要となるため操作が簡単になり、作業者に熟練した技術や経験が要求されることがなくなるとともに、サンプルロスが低減化される効果も得られる。
液体が吸入又は排出される吸排出口に前記吸着材料が予め設けられた容器の内部において、前記全工程を、試料を他の容器に移し替えることなく同一の前記容器内で遠心操作又は液体の排出を行うためのピペティング操作の繰り返しのみの連続操作によって行うことができる。このため、作業者や環境に対する試料の感染リスクを最小化でき、従って実験操作の自動化を見据えた基盤技術としても極めて有用である。また、イオン液体とアルカリ水溶液を吸着しない合成ポリマー系の疎水性マイクロビーズ又は疎水性官能基を結合したアルカリ耐性のビーズ担体が吸排出口に予め設けられた容器として、市販されている所謂マイクロチップを利用することができるため、吸着材料の前記ビーズを別材料として取り扱う煩雑さがない。
難溶性生体試料としての難溶性蛋白質の凝集体を可溶化し、分析用のサンプルを効率的かつ高精度で製造する方法について、項目1で説明する。具体的には、まず本願発明者が提案する新規な可溶化剤について(1)で説明し、次に、この可溶化剤で可溶化した難溶性蛋白質を固相で抽出する方法について(2)で説明した後、(3)において図1〜図3を参照して全体の製造工程を説明する。さらに、項目2で本実施形態の効果を説明し、項目3で具体的な実験例について詳細に説明する。
(1)可溶化剤
本実施形態の可溶化剤は、イオン液体とアルカリ水溶液を混合した抽出溶媒であり、既存の可溶化剤であるSDSやギ酸などでは溶解できない多くの難溶性生体試料、例えばゆで卵の加熱卵白凝集体のような難溶性蛋白質の凝集体であっても、迅速かつ高濃度に可溶化することができる。
1-Butyl-3-methylimidazolium Thiocyanate ([bmin][SCN])
1-Butyl-3-methylimidazolium nitrate ([bmim][NO3])
1-Butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate ([bmim][BF4])
1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate ([emin][OAc])
ethylammonium nitrate (EAN)
propylammonium nitrate (PAN)
水酸化リチウム(LiOH)
水酸化ルビジウム(RbOH)
水酸化カルシウム(Ca(OH)2)
水酸化バリウム (Ba(OH)2)
マイクロチューブなどの任意の小型容器内に難溶性蛋白質を入れ、これに前記可溶化剤を加えて難溶性蛋白質を可溶化する。小型容器内の可溶化した難溶性蛋白質に、吸着材料としての疎水性マイクロビーズを加え、可溶化した難溶性蛋白質を当該ビーズ表面に吸着させる。イオン液体とアルカリ水溶液は、マイクロビーズに吸着しないため、水や水系緩衝液などの洗浄溶媒でマイクロビーズを洗浄することで除去することができる。また、可溶化剤に不純物が混入していた場合には、有機溶媒と水系緩衝液を用いて洗浄することで、有機溶媒を残存させることなく当該不純物を除去することができる。疎水性マイクロビーズとしては、幅広いpH領域での使用に安定な合成ポリマー系の逆相ポリマービーズが好ましいが、C8やC18 等のアルキル官能基や別の疎水性官能基を結合したアルカリ耐性のシリカやガラス等のビーズ担体も使用できる。
図1を参照して難溶性蛋白質のサンプルの製造工程を説明する。
以下に詳述するように、本実施形態の製造工程によれば、上述したイオン液体とアルカリ水溶液からなる実施形態の可溶化剤を使用することにより、難溶性蛋白質を可溶化可する可溶化工程1)と、可溶化した難溶性生体試料を吸着材料に吸着させて抽出する抽出工程2)と、抽出された難溶性生体試料から前記可溶化剤を選択的に除去する洗浄工程3)と、難溶性蛋白質をサンプルとして適切な形態とするために消化する消化工程4)のすべての工程を、同一容器内の連続操作によって実現することができる。これによって、超高感度タンパク質分析を行うためのサンプル調製を極めて簡便に行うことが可能となる。
図1において可溶化工程1)で示すように、マイクロチュープなどの小型容器1内に回収した難溶性蛋白質の凝集体2に、前記可溶化剤3を添加する。これに超音波破砕やボルテックス撹拌などの物理的操作を加えて難溶性蛋白質の凝集体2を可溶化する。この際、難溶性蛋白質の非特異的な加水分解を最小化するために、撹拌時間は30分以内とすることが好ましい。また、イオン液体の添加量は、サンプルの蛋白量や使用するイオン液体の種類などに依存するが、例えば、[bmin][SCN] と 0.5MのNaOH水溶液からなる可溶化剤3[40%(v/v) [bmin][SCN] ]の場合、6−7mg加熱卵白蛋白質/mL の可溶化キャパシティーを持つことが見込まれるため、通常は20μL−200μLで十分である。
図1において抽出工程2)で示すように、同図の可溶化工程1)で説明した可溶化溶液に、吸着材料(担体)である疎水性のマイクロビーズ4(図中では1個のビーズを拡大して示している。)を直接添加し、ボルテックス撹拌でマイクロビーズ4の表面に難溶性蛋白質を吸着させる。通常、ボルテックス撹拌と静止の操作を複数回(3〜4回)繰り返すことで十分な吸着が達成できる。一方、使用するイオン液体によっては、マイクロビーズ4の表面と難溶性蛋白質の吸着を抑制する場合があるので、そのような場合には、マイクロビーズ4を添加した後に可溶化溶液を水で希釈(3〜4倍)してから、撹拌操作を行う。また、可溶化溶液に加えるマイクロビーズ4の量は、可溶化溶液中の蛋白質含有量に依存するが、例えば、ポリスチレン系の逆相ポリマーからなる合成ポリマービーズであるPOROS (パースペクティブ社の商標)R2を使用する場合、当該ビーズ1μl あたり、最大で15μg の蛋白質の結合容量が見込まれるため、通常は1μl で十分である。
図1において洗浄工程3)で示すように、小型容器1を遠心することで蛋白質を吸着したマイクロビーズ4を沈殿させ、上清(イオン液体とアルカリ水溶液を含む)を任意の手段で吸引除去する。沈殿したマイクロビーズ4に、水または水系緩衝液などの洗浄溶媒(100〜500μL)を加え、ボルテックス撹拌し、再度遠心してマイクロビーズ4を沈殿させ、同様に上清を除去する。この操作を複数回(2〜3回)繰り返すことで、可溶化剤3として用いたイオン液体とアルカリ水溶液を難溶性蛋白質のサンプルから除去できる。
一般に蛋白質は分子量が大きいため、MS分析等の対象となる試料とするために、蛋白質の特定の結合を加水分解できるプロテアーゼを用いて消化する必要がある。ここでは、トリプシン消化を行う例を示す。その場合の溶媒としては、少量の有機溶媒―水系緩衝液からなる混合溶媒を用いることが好ましく、様々な有機溶媒と緩衝液の組み合わせが採用可能であるが、具体的には、例えばアセトニトリルと5mM(最終濃度)Tris-HCl緩衝液 (pH 8)からなる混合溶媒の場合であれば、概ね60:40`80:20 (v/v) 間の組み合わせが好ましい。
細胞や組織に沈着する蛋白質等の凝集体は一般に難溶性であるため、従来のプロテオミクスの技術・戦略では高感度なMS分析は困難であった。これに対して、本実施形態が提供するイオン液体とアルカリ水溶液の混合溶媒である可溶化剤は、既存の可溶化剤(尿素やSDS等)に不溶である種々の難溶性生体試料の凝集体、例えば、ゆで卵(加熱卵白凝集体2)であっても極短時間で高濃度に可溶化でき、また、疎水性マイクロビーズを担体として用いた洗浄操作によって前記小型容器から簡単に除去できるため、高感度なMS分析用のサンプルが容易に調製できるという効果をもつ。
[実験例1]
第1実施形態の可溶化剤の性能を、既存の可溶化剤の性能と比較した。難溶性蛋白質の凝集体のモデルとしては、今日最も難溶と考えられている鶏卵白蛋白質の熱凝集物を使用した。本実施形態の可溶化剤は、40%(v/v) の[bmin][SCN] と、60%(v/v) の0.5M NaOH からなる。また、既存の可溶化剤としては、8M尿素と10%のSDSを使用した。鶏卵白を10μL(蛋白質の含有量で約1mg)ずつ3本のマイクロチューブ(1.5 mL) にとり、湯浴上で100℃、3分間加熱して蛋白質を凝固させた。次いでそれぞれのマイクロチューブに上記可溶化剤を200μLずつ加えて、2分間超音波撹拌(23kHz)し、1分間ボルテックス撹拌した。さらにこの撹拌操作を2回行った(合計で3回)。その後、同チューブを100,000 gで60分間、遠心操作を加え、上清と沈殿に分けて上清の蛋白量(蛋白質の可溶化量)を蛋白質定量キット Bradford ULTRA (商標)で測定した。
第1実施形態の手順に従って製造した熱凝集卵白蛋白質のサンプルと、第1実施形態と同様の手順であるが可溶化剤として8M尿素を使用して製造した熱凝集卵白蛋白質のサンプルと、第1実施形態と同様の手順であるが可溶化剤として10%SDSを使用して製造した熱凝集卵白蛋白質のサンプルを、それぞれ実際にMS分析し、その結果を比較した。
第2実施形態に係る難溶性蛋白質の凝集体のサンプル製造方法を、図4を参照して説明する。第2実施形態で使用される可溶化剤、洗浄溶媒、蛋白質分解酵素、さらに吸着剤であるマイクロビーズ等の使用材料は、第1実施形態で使用したものと実質的に同一である。従って、可溶化、抽出、洗浄及び消化の各工程における作用も第1実施形態と実質的に同一である。しかし、第1実施形態の各工程がマイクロチューブのような一つの小型容器の内部で行われたのに対し、第2実施形態では、マイクロチューブのような小型容器と、マイクロビーズが予め仕込まれた操作容器である後述するマイクロチップと、液体の出し入れ操作を行う分注器を使用する点が相違している。従って、以下の説明では、可溶化、抽出、洗浄及び消化の各工程における作用については第1実施形態の説明を援用し、各工程を実行する作業上の特徴を中心に説明するものとする。
第3実施形態に係る難溶性蛋白質の凝集体2のサンプル製造方法を、図5を参照して説明する。第3実施形態で使用される可溶化剤、洗浄溶媒、蛋白質分解酵素、さらに吸着剤であるマイクロビーズ等の使用材料は、第1実施形態で使用したものと実質的に同一である。従って、可溶化、抽出、洗浄及び消化の各工程における作用も第1実施形態と実質的に同一である。しかし、第1実施形態の各工程がマイクロチューブのような単なる一つの小型容器の内部で行われ、マイクロビーズは別体として小型容器に投入されたのに対し、第3実施形態では、マイクロチューブのような小型容器と、マイクロビーズが予め仕込まれた操作容器であるマイクロチップを使用する点が相違している。従って、以下の説明では、可溶化、抽出、洗浄及び消化の各工程における作用については第1実施形態の説明を援用し、各工程を実行する作業上の特徴を中心に説明するものとする。
第1〜第3実施形態で使用した可溶化剤3は、難溶性蛋白質以外の難溶性生体試料、具体的には難溶性糖含有物質及び難溶性脂質含有物質にも適用できる。すなわち、実施形態の可溶化剤3は、難溶性糖含有物質及び難溶性脂質含有物質を目的物質とすることができ、従来よりも小さなサンプルロスでこれら目的物質を効率的に可溶化することができるので、これら目的物質をMS分析等に適した状態のサンプルとして効率的に製造するために有用である。
2…難溶性生体試料の一例である難溶性蛋白質の凝集体
3…可溶化剤
4…吸着材料としてのマイクロビーズ
5…操作容器としてのマイクロチップ
6…分注器(ピペット)
7…洗浄溶媒
8…消化液としてのトリプシン溶液
Claims (3)
- 難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む難溶性蛋白質の可溶化剤。
- 難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む可溶化剤によって難溶性蛋白質を可溶化する難溶性蛋白質の可溶化方法。
- 消化工程の終了後に直ちに液体クロマトグラフィー質量分析の対象とすることができる難溶性蛋白質のサンプル製造方法であって、
難溶性蛋白質の溶解性に対して塩溶効果が高い陽イオンである1-Butyl-3-methylimidazolium と陰イオンの組み合わせをもつイオン液体と、難溶性蛋白質を可溶化するために十分な濃度を有する水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムの強アルカリ水溶液を20:80 〜60:40 (v/v) の混合比で含む可溶化剤で可溶化した蛋白質をイオン液体とアルカリ水溶液を吸着しない合成ポリマー系の疎水性マイクロビーズ又は疎水性官能基を結合したアルカリ耐性のビーズ担体に吸着させて抽出する抽出工程と、抽出された蛋白質から前記可溶化剤を選択的に除去する洗浄工程と、前記疎水性マイクロビーズ又は前記ビーズ担体に吸着した蛋白質を消化する消化工程を有し、液体が吸入又は排出される吸排出口に前記疎水性マイクロビーズ又は前記ビーズ担体が予め設けられた容器の内部において、前記全工程を、試料を他の容器に移し替えることなく同一の前記容器内で遠心操作又は液体の排出を行うためのピペティング操作の繰り返しのみの連続操作によって行う難溶性蛋白質のサンプル製造方法。
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