JPS63243876A - 免疫学的測定法 - Google Patents
免疫学的測定法Info
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- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
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- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は宿主由来物質の免疫学的測定法に関する。
(従来技術およびその問題点)
近年の組換えDNA技術の急速な進歩によって、生体内
の種々の遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子を大
腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、カビ、動
物細胞などの真核細胞において発現させることができろ
ようになった。また、動物細胞の培養技術も著しく進歩
し、有用物質を産生ずる各種の株化細胞の大量培養も可
能になっている。そして、各種の組換えDNA技術によ
る生産物や株化細胞の産物に、近年若しい進歩を見せて
いる蛋白質やペプチドの精製技術を適用することによっ
て、今まで得られなかった有用蛋白質やペプチドを量産
ずろことができろようになってきている。
の種々の遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子を大
腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、カビ、動
物細胞などの真核細胞において発現させることができろ
ようになった。また、動物細胞の培養技術も著しく進歩
し、有用物質を産生ずる各種の株化細胞の大量培養も可
能になっている。そして、各種の組換えDNA技術によ
る生産物や株化細胞の産物に、近年若しい進歩を見せて
いる蛋白質やペプチドの精製技術を適用することによっ
て、今まで得られなかった有用蛋白質やペプチドを量産
ずろことができろようになってきている。
このようにして得られた精製標品を医薬品としてヒトに
投与する前に、最終標品中に微量混在する宿主由来物質
について正確に把握し、それらに起因する副作用を最小
限に抑える方法を確立し、安全性を完全に確立しておく
ことが必須である。
投与する前に、最終標品中に微量混在する宿主由来物質
について正確に把握し、それらに起因する副作用を最小
限に抑える方法を確立し、安全性を完全に確立しておく
ことが必須である。
通常、混入物の検査方法として、検体を5DS−ポリア
クリルアミドゲル′心気泳動(P A G E)に付し
、銀染色またはクマジーブルー染色によって混入物を検
出する方法が多用されている。この方法はきわめて高感
度なものであるが、産物と夾雑物の移動度が同一の場合
には両者を区別することが出来ないという欠点がある。
クリルアミドゲル′心気泳動(P A G E)に付し
、銀染色またはクマジーブルー染色によって混入物を検
出する方法が多用されている。この方法はきわめて高感
度なものであるが、産物と夾雑物の移動度が同一の場合
には両者を区別することが出来ないという欠点がある。
この方法をhliう乙のとして、免疫学的な手法1例え
ばIE I A(Enzyme Immunoassa
y) [IεL I S A (EnzymeLink
ed ImmunosorbenL As5ay)]、
Rr A(Radi。
ばIE I A(Enzyme Immunoassa
y) [IεL I S A (EnzymeLink
ed ImmunosorbenL As5ay)]、
Rr A(Radi。
Immunoassay) 、免疫蛍光法(Immun
of 1uorescencc)などが考慮されるべき
である。
of 1uorescencc)などが考慮されるべき
である。
事実、この免疫学的手法を用いて宿主由来夾准蛋白を検
出する試みがなされている。たとえば、Anicctt
i、 V、R1ら[J 、 Immunol 、〜1e
thods(ツヤ−ナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッズ)、91.213 (1986)]は、大腸菌組換
え体によって生産されたヒト生長ホルモン(hGt()
の精製標品中における大腸閉山来夾雉蛋白(E CP
S)測定用のEI。
出する試みがなされている。たとえば、Anicctt
i、 V、R1ら[J 、 Immunol 、〜1e
thods(ツヤ−ナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッズ)、91.213 (1986)]は、大腸菌組換
え体によって生産されたヒト生長ホルモン(hGt()
の精製標品中における大腸閉山来夾雉蛋白(E CP
S)測定用のEI。
ISAを作製している。この方法に従えば、EcPsは
hGtlの精製法を最終段階の一つ前まで踏襲して部分
精製(mock purirication)され、
この標品をウサギに接種して、ECPs抗血l#か作製
されている。該抗血清は、上記の“moc k”精製に
ょうて得られたECPsのアフィニイティー・クロマト
グラフィーにかけられ、特異的な抗E CP s抗体が
調製されている。そして、“mock”精製ECPs標
品と抗■εCPs特異抗体を用いるE CP sのIE
LXsAを作製している。この方法は高感度にE CP
sを検出することが出来るが、目的産物の精製方法が
変更された場合には、濃縮されてくる宿主由来蛋白が大
きく異なるため、その都1,1EcI’sを”mock
”精製して新しくELrSAを設定する必要があり、E
CP sの一般的な測定法としては用いることが出来
ないという欠点がある。
hGtlの精製法を最終段階の一つ前まで踏襲して部分
精製(mock purirication)され、
この標品をウサギに接種して、ECPs抗血l#か作製
されている。該抗血清は、上記の“moc k”精製に
ょうて得られたECPsのアフィニイティー・クロマト
グラフィーにかけられ、特異的な抗E CP s抗体が
調製されている。そして、“mock”精製ECPs標
品と抗■εCPs特異抗体を用いるE CP sのIE
LXsAを作製している。この方法は高感度にE CP
sを検出することが出来るが、目的産物の精製方法が
変更された場合には、濃縮されてくる宿主由来蛋白が大
きく異なるため、その都1,1EcI’sを”mock
”精製して新しくELrSAを設定する必要があり、E
CP sの一般的な測定法としては用いることが出来
ないという欠点がある。
また、背片らは[基礎と臨床、20巻、8883(19
86)j酵母組換え体によって生産されたB型肝炎つィ
ルス表面抗原精製標品中における酵母由来夾雑蛋白(Y
Ps)測定用のE L I S Aを作製している。彼
らの方法に従えば、YPsは宿主菌を超音波処理するこ
とによって調製され、これがウサギに接種されてYPs
抗血清が作製された。次に、該抗血清から硫安塩析とD
EAE−セルロース・クロマトグラフィーにより抗YP
s抗体が得られ、該抗YPs抗体と上記酵母破砕物とを
用いるYPsのEL[SAが作製された。しかしながら
、このELISAは低分子ポリペプチド(約1万ダルト
ン以下)などの免疫原となり得ない物質を多量に含む酵
母破砕物を標q品(standard)としているため
、YPsの検出感度が悪く、しかも検量線と精製標品中
のYPs夾雑物との間に平行性も認められず、このEL
rSAではYPsの定1は原理的に困・誰であると報告
されている。
86)j酵母組換え体によって生産されたB型肝炎つィ
ルス表面抗原精製標品中における酵母由来夾雑蛋白(Y
Ps)測定用のE L I S Aを作製している。彼
らの方法に従えば、YPsは宿主菌を超音波処理するこ
とによって調製され、これがウサギに接種されてYPs
抗血清が作製された。次に、該抗血清から硫安塩析とD
EAE−セルロース・クロマトグラフィーにより抗YP
s抗体が得られ、該抗YPs抗体と上記酵母破砕物とを
用いるYPsのEL[SAが作製された。しかしながら
、このELISAは低分子ポリペプチド(約1万ダルト
ン以下)などの免疫原となり得ない物質を多量に含む酵
母破砕物を標q品(standard)としているため
、YPsの検出感度が悪く、しかも検量線と精製標品中
のYPs夾雑物との間に平行性も認められず、このEL
rSAではYPsの定1は原理的に困・誰であると報告
されている。
(間頂点を解決するための手段)
本発明は、宿主の粗抽出液をヒト以外の動物に1を種し
粗抽出液中に含まれる宿主由来物質に対するポリクロー
ナル抗体を産生させ、得られたボリン【1−ナル抗体に
より宿主の粗抽出液から該動物において免疫原となり得
る宿主由来物質を精製し、精製された宿主由来物質を標
学品として、被検体中の宿主由来物質と」二足宿主由来
物質に対するポリクローナル抗体との反応性を比較する
ことを特徴とする、被検体中の宿主由来物質の免疫学的
測定法を搗供するらのである。
粗抽出液中に含まれる宿主由来物質に対するポリクロー
ナル抗体を産生させ、得られたボリン【1−ナル抗体に
より宿主の粗抽出液から該動物において免疫原となり得
る宿主由来物質を精製し、精製された宿主由来物質を標
学品として、被検体中の宿主由来物質と」二足宿主由来
物質に対するポリクローナル抗体との反応性を比較する
ことを特徴とする、被検体中の宿主由来物質の免疫学的
測定法を搗供するらのである。
宿主としては、遺伝子組換え技術で用いられる宿主、た
とえば大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、
カビ類、動物細胞などの真核細胞が含まれる。
とえば大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、
カビ類、動物細胞などの真核細胞が含まれる。
宿主の粗抽出液は、宿主を適当な溶液中で、磨細、超音
波破砕、フレンチプレスなどの機械的手法またはりゾチ
ーム処理(大腸菌など)やザイモリエース処理(酵母な
ど)などの酵素的手法あるいはそれらの手法を組み合わ
せて宿主細胞を破壊した後、ろ過あるいは遠心分離に付
し、不溶画分(細胞壁、細胞膜など)を除去することに
より得ることができる。粗抽出液の採取に用いられる溶
液は緩衝液(例、リン酸ナトリウム緩衝液)が好ましい
。
波破砕、フレンチプレスなどの機械的手法またはりゾチ
ーム処理(大腸菌など)やザイモリエース処理(酵母な
ど)などの酵素的手法あるいはそれらの手法を組み合わ
せて宿主細胞を破壊した後、ろ過あるいは遠心分離に付
し、不溶画分(細胞壁、細胞膜など)を除去することに
より得ることができる。粗抽出液の採取に用いられる溶
液は緩衝液(例、リン酸ナトリウム緩衝液)が好ましい
。
溶液中にはプロテアーゼ阻害剤(例、フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム塩)、界面活性剤(例、トリト:/ X −10
0,Twcen −80)などのタンパクの抽出の際、
通常用いられる物質や遺伝子組換え技術の遺伝子産物の
抽出に用いられるタンパク変性剤(例、尿素、塩酸グア
ニジン)を加えてもよい。被検体の調製の際、タンパク
変性剤が使用されていることが明らかな場合には、宿主
の粗抽出液を調製する際、タンパク変性剤を用いること
が望ましく、被検体の調製にタンパク変性剤が使用され
ているか否が不明の場合には、タンパク変性剤を添加せ
ずに調製した宿主の粗抽出液とタンパク変性剤を添加し
て7A製した宿主の粗抽出液との混合液を抗体産生およ
び抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望まし
い。
ルホニルフルオライド、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム塩)、界面活性剤(例、トリト:/ X −10
0,Twcen −80)などのタンパクの抽出の際、
通常用いられる物質や遺伝子組換え技術の遺伝子産物の
抽出に用いられるタンパク変性剤(例、尿素、塩酸グア
ニジン)を加えてもよい。被検体の調製の際、タンパク
変性剤が使用されていることが明らかな場合には、宿主
の粗抽出液を調製する際、タンパク変性剤を用いること
が望ましく、被検体の調製にタンパク変性剤が使用され
ているか否が不明の場合には、タンパク変性剤を添加せ
ずに調製した宿主の粗抽出液とタンパク変性剤を添加し
て7A製した宿主の粗抽出液との混合液を抗体産生およ
び抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望まし
い。
宿主細胞の破壊は上記のとおり通常、磨細法。
超音波法、フレンチプレス法および/または酵素法が用
いられる。磨細にはミキサーや粉砕機が用いられ、通常
、ガラス粉末、ガラスピーズなどの磨細剤が添加される
。超音波処理には通常の超音波破砕機が用いられる。酵
素処理にはリゾチーム。
いられる。磨細にはミキサーや粉砕機が用いられ、通常
、ガラス粉末、ガラスピーズなどの磨細剤が添加される
。超音波処理には通常の超音波破砕機が用いられる。酵
素処理にはリゾチーム。
β−1,3−グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼな
どの溶菌酵素が使用される。被検体の調製の際酵素処理
が行われていることが明らかな場合には、酵素を用いて
宿主の粗抽出液を調製することが望ましく、また被検体
の調製に酵素処理が行われていることが不明の場合には
酵素を用いて調製した宿主の粗抽出液と酵素を用いずに
調製した宿主の$11抽出液との混合液として抗体産生
および抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望
ましい。
どの溶菌酵素が使用される。被検体の調製の際酵素処理
が行われていることが明らかな場合には、酵素を用いて
宿主の粗抽出液を調製することが望ましく、また被検体
の調製に酵素処理が行われていることが不明の場合には
酵素を用いて調製した宿主の粗抽出液と酵素を用いずに
調製した宿主の$11抽出液との混合液として抗体産生
および抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望
ましい。
宿主細胞の破壊には上記の方法の他、凍結融解法、自己
融解法、何機溶媒法などの方法を用いてもよいが、これ
らの方法はタンパクを変性させる恐れがあるために被検
体の1調製にこれらの方法が(jU用されていることが
明らかな場合に使用されることか望ましい。
融解法、何機溶媒法などの方法を用いてもよいが、これ
らの方法はタンパクを変性させる恐れがあるために被検
体の1調製にこれらの方法が(jU用されていることが
明らかな場合に使用されることか望ましい。
宿主細胞の破壊により得られた破砕物は通常の方法(例
、ろ過、遠心分離)により不溶画分(細胞膜。
、ろ過、遠心分離)により不溶画分(細胞膜。
細胞壁)が除去されるが、必ずしし完全に不溶画分が除
去されなくてもよい。
去されなくてもよい。
上記の方法で得られた宿主の粗抽出液は動物に接種され
、宿主由来物質に対する抗体が産生される。用いられる
動物としてはウサギ、ヒツジ、モルモット、マウスなど
の抗体産生能を有する動物が用いられる。宿主の粗抽出
液の動物への接種は通常の方法により行われる。抗体産
生を増強させるため、アジュバント[例、フロインt−
(Freund)のアジュバント、水酸化アルミニラム
コと宿主の粗抽出液を混合し動物に接種することが望ま
しい。接種の回数は特に限定されないが、■ないし2週
毎に1回ずつ計2〜4回が好ましい。
、宿主由来物質に対する抗体が産生される。用いられる
動物としてはウサギ、ヒツジ、モルモット、マウスなど
の抗体産生能を有する動物が用いられる。宿主の粗抽出
液の動物への接種は通常の方法により行われる。抗体産
生を増強させるため、アジュバント[例、フロインt−
(Freund)のアジュバント、水酸化アルミニラム
コと宿主の粗抽出液を混合し動物に接種することが望ま
しい。接種の回数は特に限定されないが、■ないし2週
毎に1回ずつ計2〜4回が好ましい。
宿主由来物質に対する抗体は、通常の方法にて動物より
採血し、血清を得た後、得られた血iffを、宿主の粗
抽出液中に含まれる宿主由来物質を結合させた担体を用
いるアフィニティー・クロマトグラフィーに付すことに
より得ることができる。アフィニティー・クロマトグラ
フィー用カラムは、宿主の粗抽出液を濃縮、乾燥し、あ
るいはa縮、乾燥せずに、臭化シアンで活性化したセフ
ァロース4Bなどの担体に常法に従いカップリングさせ
、これを適当なカラムに充填することにより作製するこ
とができる。血清をアフィニティー・クロマトグラフィ
ーに付す前に、硫安分画などの通常の方法で抗体をある
程度精製するのが好ましい。抗体のカラムへの吸着は、
適当な緩衝液(例、ホウ酸緩衝液、po約8.0)で平
衡化したカラムに血清を付加することにより行われる。
採血し、血清を得た後、得られた血iffを、宿主の粗
抽出液中に含まれる宿主由来物質を結合させた担体を用
いるアフィニティー・クロマトグラフィーに付すことに
より得ることができる。アフィニティー・クロマトグラ
フィー用カラムは、宿主の粗抽出液を濃縮、乾燥し、あ
るいはa縮、乾燥せずに、臭化シアンで活性化したセフ
ァロース4Bなどの担体に常法に従いカップリングさせ
、これを適当なカラムに充填することにより作製するこ
とができる。血清をアフィニティー・クロマトグラフィ
ーに付す前に、硫安分画などの通常の方法で抗体をある
程度精製するのが好ましい。抗体のカラムへの吸着は、
適当な緩衝液(例、ホウ酸緩衝液、po約8.0)で平
衡化したカラムに血清を付加することにより行われる。
抗体の溶出は通常IM程度の塩化ナトリウトを含む0.
2Mグリンンー塩酸緩衝液(po2.0)を用いて行わ
れる。
2Mグリンンー塩酸緩衝液(po2.0)を用いて行わ
れる。
溶出された抗体を含む両分は減圧下あるいは透析膜を用
いて濃縮され、宿主由来物質に対するポリクローナル抗
体が調製される。
いて濃縮され、宿主由来物質に対するポリクローナル抗
体が調製される。
ポリクローナル抗体による宿主の粗抽出液からの免疫片
となり得る宿主由来物質の精製は、通常ボリン【I−ナ
ル抗体を結合させた担体を用いるアフィニティー・り〔
lマドグラフィーにより行イつれる。アフィニティー・
クロマトグラフィー用カラ1、は、上記の方法で得られ
たポリクローナル抗体をフォルミルセル【1フアイン、
アフィゲル−10などの担体に常法に従いカップリング
させ、これを適当なカラムに充填することにより作製す
ることができる。カップリングに際しては通常還元剤(
例、N aCN B H3)が用いられる。宿主由来物
質のカラムへの吸着は、適当な緩衝液(例、リン酸緩衝
液、pH約78)で平衡化したカラムに宿主の粗抽出液
を付加することにより行われろ。免疫原となり得た宿主
由来物質の溶出は通常002Mグリシン−塩酸緩衝液(
pt−i 2 、 O)を用いて行われる。
となり得る宿主由来物質の精製は、通常ボリン【I−ナ
ル抗体を結合させた担体を用いるアフィニティー・り〔
lマドグラフィーにより行イつれる。アフィニティー・
クロマトグラフィー用カラ1、は、上記の方法で得られ
たポリクローナル抗体をフォルミルセル【1フアイン、
アフィゲル−10などの担体に常法に従いカップリング
させ、これを適当なカラムに充填することにより作製す
ることができる。カップリングに際しては通常還元剤(
例、N aCN B H3)が用いられる。宿主由来物
質のカラムへの吸着は、適当な緩衝液(例、リン酸緩衝
液、pH約78)で平衡化したカラムに宿主の粗抽出液
を付加することにより行われろ。免疫原となり得た宿主
由来物質の溶出は通常002Mグリシン−塩酸緩衝液(
pt−i 2 、 O)を用いて行われる。
溶出溶媒には界面活性剤(例、Twecn 80 )あ
るいは蛋白変性剤(例、尿素)か適量添加されていてら
よい。溶出された宿主由来物質は通常の方法[例、パン
・スリク(Van 5lyke)法、ケルダール法、ビ
ウレット法、ローリ−(Lowry)法、紫外線吸収法
、濁度法]によりその蛋白h1を測定することができる
。
るいは蛋白変性剤(例、尿素)か適量添加されていてら
よい。溶出された宿主由来物質は通常の方法[例、パン
・スリク(Van 5lyke)法、ケルダール法、ビ
ウレット法、ローリ−(Lowry)法、紫外線吸収法
、濁度法]によりその蛋白h1を測定することができる
。
精製された宿主由来物質は透析膜を用いて濃縮あるし)
は蒸留水などを用いて適当な濃度に希釈され、免疫学的
測定法の標準品として使用される。
は蒸留水などを用いて適当な濃度に希釈され、免疫学的
測定法の標準品として使用される。
被検体中の宿主由来物質は上記で得られたポリクローナ
ル抗体との反応性により免疫学的に定量することができ
る。反応性の測定には通常、EIA(EL I SA)
、RI A、免疫蛍光法などの自体公知の手段が用いら
れる。各手段に用いられる標識抗体は自体公知の方法に
よりポリクローナル抗体を標識することにより調製でき
る。反応性の測定方法は用いられる手段によって異なる
が、たとえばEIAによる81+1定の例としては、(
1)宿主由来物質に対するポリクローナル抗体を同相上
に固定し、(2)標準品または被検体を加えて反応させ
、(3)よく洗浄して固相上のポリクローナル抗体に結
合しなかった物質を除去し、(4)酵素で標識された宿
主由来物質に対するポリクローナル抗体と反応させ、固
相上に結合した酵素標識抗体の酵素活性を測定する方法
などがあげられる。ここで用いられる固相としてはセフ
ァロース粒子、ボリスヂレン、ポリカーボネートビーズ
あるいはこれらの材質のマイクロプレートなどがあげら
れる。宿主由来物質に対するポリクローナル抗体(Fa
b’でもよい)の標識は上記のとおり自体公知の方法で
行われ、標識に用いられる物質としてはたとえば、ホー
スラデッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリン・ホスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレセイン・イソチオシアネ
ートなどの蛍光色素 1!Jなどの放射性物質、アビジ
ン、ビオチンなどがあげられる。
ル抗体との反応性により免疫学的に定量することができ
る。反応性の測定には通常、EIA(EL I SA)
、RI A、免疫蛍光法などの自体公知の手段が用いら
れる。各手段に用いられる標識抗体は自体公知の方法に
よりポリクローナル抗体を標識することにより調製でき
る。反応性の測定方法は用いられる手段によって異なる
が、たとえばEIAによる81+1定の例としては、(
1)宿主由来物質に対するポリクローナル抗体を同相上
に固定し、(2)標準品または被検体を加えて反応させ
、(3)よく洗浄して固相上のポリクローナル抗体に結
合しなかった物質を除去し、(4)酵素で標識された宿
主由来物質に対するポリクローナル抗体と反応させ、固
相上に結合した酵素標識抗体の酵素活性を測定する方法
などがあげられる。ここで用いられる固相としてはセフ
ァロース粒子、ボリスヂレン、ポリカーボネートビーズ
あるいはこれらの材質のマイクロプレートなどがあげら
れる。宿主由来物質に対するポリクローナル抗体(Fa
b’でもよい)の標識は上記のとおり自体公知の方法で
行われ、標識に用いられる物質としてはたとえば、ホー
スラデッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリン・ホスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレセイン・イソチオシアネ
ートなどの蛍光色素 1!Jなどの放射性物質、アビジ
ン、ビオチンなどがあげられる。
(実施例)
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1 宿主由来物質に対する特異抗体の作製(1)
宿主酵母由来物質(YPs)の抽出遺伝子組換えの宿主
として用いられている酵母サツカロミセス・セレビシェ
(Saccharomycescerevis 1ae
)AH22R″″IMiyanohara、A、ら、P
roc、 Na1l。
宿主酵母由来物質(YPs)の抽出遺伝子組換えの宿主
として用いられている酵母サツカロミセス・セレビシェ
(Saccharomycescerevis 1ae
)AH22R″″IMiyanohara、A、ら、P
roc、 Na1l。
Acad、 Sci、 (プロシージンゲス・オブ・ザ
・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンセス)US
A。
・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンセス)US
A。
80.1 (1983)]を、ロロインとヒスデシンを
添加したBurkholder培地[Bostian、
K、^、ら、 ProcNatl、 Acad、 S
ci、 USA、 77.4504 (1980)]中
で30℃、2日間培養して得られた菌体、30gを20
0−の抽出用緩衝液[7,5M尿素、25mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7,5)、1mMフェニルメチル
スルホニルフルオライド(PMS F)、 l OmM
エヂレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)、
0.1%Triton X−1003に懸濁し、直径0
゜5〜0.75mmのガラスピーズ、200gを加えて
激しく振盪することにより酵母を機械的に破砕した。該
破砕液を遠心分離(1B、OOOxg、 30分間)に
かけて上清液を得た。以下、上清液を宿主酵母の粗抽出
物(祖YPs;200蔵、66mg/12)として用い
た。
添加したBurkholder培地[Bostian、
K、^、ら、 ProcNatl、 Acad、 S
ci、 USA、 77.4504 (1980)]中
で30℃、2日間培養して得られた菌体、30gを20
0−の抽出用緩衝液[7,5M尿素、25mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH7,5)、1mMフェニルメチル
スルホニルフルオライド(PMS F)、 l OmM
エヂレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)、
0.1%Triton X−1003に懸濁し、直径0
゜5〜0.75mmのガラスピーズ、200gを加えて
激しく振盪することにより酵母を機械的に破砕した。該
破砕液を遠心分離(1B、OOOxg、 30分間)に
かけて上清液を得た。以下、上清液を宿主酵母の粗抽出
物(祖YPs;200蔵、66mg/12)として用い
た。
(2)酵母由来物質に対する特異抗体(抗YPs抗体)
の作製 上記粗抽出液(10mg蛋白/d)、3dとFreun
d(フロイント)の完全アジュバント(DIFCO社製
)。
の作製 上記粗抽出液(10mg蛋白/d)、3dとFreun
d(フロイント)の完全アジュバント(DIFCO社製
)。
3m12とをよく混合したものを、体重2,5〜3.0
kgのウサギ(日本白色柱)の背部皮下に接種し、初回
免疫後2週目と4週目に同量を用いて追加免疫を行った
。3回目の免疫から1週間後に採血し、宿主酵母蛋白に
対する抗血清(YPs抗111清)を得ノこ。
kgのウサギ(日本白色柱)の背部皮下に接種し、初回
免疫後2週目と4週目に同量を用いて追加免疫を行った
。3回目の免疫から1週間後に採血し、宿主酵母蛋白に
対する抗血清(YPs抗111清)を得ノこ。
次に、前記の酵母宿主の粗抽出物、150mg(蛋白量
として)を臭化シアン−活性化セファロース4 B (
Pharmacia Fine Chemicals)
、 5 g(乾燥ff1)に、供給元の指示書に従って
カップリングさせ、粗YPsが結合したセファロース4
B(YPs−セファロース4.8)を作製した。
として)を臭化シアン−活性化セファロース4 B (
Pharmacia Fine Chemicals)
、 5 g(乾燥ff1)に、供給元の指示書に従って
カップリングさせ、粗YPsが結合したセファロース4
B(YPs−セファロース4.8)を作製した。
前記YPs抗血清、25dに100%飽和硫安溶液、1
6.7−を加え、室温で30分攪拌した後、遠心分離(
16,000y4.10分間)にかけて沈澱を集めた。
6.7−を加え、室温で30分攪拌した後、遠心分離(
16,000y4.10分間)にかけて沈澱を集めた。
この沈澱物を20mMホウ酸緩衝液(pH8,0)に溶
解し同緩衝液で平衡化したYPs−セファロース4Bカ
ラム(1,6x8cm)にかけ、0゜5MNaCρを含
む0.1M酢酸緩衝液(p114 、5 )て該カラム
を洗浄した後、IMNaC(2を含む02Mグリシン−
塩酸緩衝液(pi−12、0)でYPsに対する特異抗
体を溶出した。該特異抗体の溶出画分(70)nQ)の
pHを3NNaOI4を用いて中性に調製した後、コロ
ジオンバック(ザルトリウス社製)で1.5dになるま
で濃縮し、25mgのYPs特異抗体(IgG)を調製
した。
解し同緩衝液で平衡化したYPs−セファロース4Bカ
ラム(1,6x8cm)にかけ、0゜5MNaCρを含
む0.1M酢酸緩衝液(p114 、5 )て該カラム
を洗浄した後、IMNaC(2を含む02Mグリシン−
塩酸緩衝液(pi−12、0)でYPsに対する特異抗
体を溶出した。該特異抗体の溶出画分(70)nQ)の
pHを3NNaOI4を用いて中性に調製した後、コロ
ジオンバック(ザルトリウス社製)で1.5dになるま
で濃縮し、25mgのYPs特異抗体(IgG)を調製
した。
実施例22次抗体の作製
実施例1の(2)で得られたYP特異抗体12mgを、
O,1M酢酸緩衝液(p+−i 4 、 O)に対して
2時間透析した後、480μgのベプンンを加え、37
℃で一晩消化した。次にlNNaOHを数滴加え、pl
+を中性にした後、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8,0
)で平衡化した5ephadex(セファデックス)G
−150カラム(2,6cmX 80cm)を用いてF
(ab’)、を分離精製した(流m I 5 rnfl
/ hr)。
O,1M酢酸緩衝液(p+−i 4 、 O)に対して
2時間透析した後、480μgのベプンンを加え、37
℃で一晩消化した。次にlNNaOHを数滴加え、pl
+を中性にした後、0.1Mホウ酸緩衝液(pH8,0
)で平衡化した5ephadex(セファデックス)G
−150カラム(2,6cmX 80cm)を用いてF
(ab’)、を分離精製した(流m I 5 rnfl
/ hr)。
F(ab’)−画分をコロジオンバックを用いて1 、
5 Mlまで濃縮し、さらに0.1M酢酸緩衝液(pH
5,0)に対して2時間透析した。次に、2−メルカプ
トエヂルアミンを終濃度20mMになるように加え、N
t置換を行った後、37℃で90分反応させた。
5 Mlまで濃縮し、さらに0.1M酢酸緩衝液(pH
5,0)に対して2時間透析した。次に、2−メルカプ
トエヂルアミンを終濃度20mMになるように加え、N
t置換を行った後、37℃で90分反応させた。
続いて該サンプルをO,1Mリン酸ナトリウム緩衝液(
p[16,0)、5mMEDTAで平衡化したセファデ
ックスG−25カラム(1,6cmx 80cm)に流
速15 tJ / hrでかけ、ボイド・ボリュームに
溶出されるFab’画分を回収した。
p[16,0)、5mMEDTAで平衡化したセファデ
ックスG−25カラム(1,6cmx 80cm)に流
速15 tJ / hrでかけ、ボイド・ボリュームに
溶出されるFab’画分を回収した。
上記操作とは別にホースラディシュ・ペルオキシダーゼ
longを1 、4 mlの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6,8)に溶かしたものに、lOOμQの
マレイミド液(■70μQのN、N−ジメチルホルムア
ミドに8mgのN−(4−カルボキシシクロヘキシルメ
チル)マレイミドN−ヒドロキシザクシンイミドエステ
ルを溶かしたもの)を加え、N、置換をした後、マグネ
チックスターラーで攪拌しながら室温で60分反応させ
た。次に400Orpm、 l Q分間遠心分離を行っ
て上清を回収し、該上清を、0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6,8)で平衡化したセファデックスG−
25カラム(1,6cmx 80cm)に流速151n
fl/hrでかけ、ボイド・ボリュームに溶出されるホ
ースラディシュ・ペルオキシダーゼ画分を回収した。
longを1 、4 mlの0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6,8)に溶かしたものに、lOOμQの
マレイミド液(■70μQのN、N−ジメチルホルムア
ミドに8mgのN−(4−カルボキシシクロヘキシルメ
チル)マレイミドN−ヒドロキシザクシンイミドエステ
ルを溶かしたもの)を加え、N、置換をした後、マグネ
チックスターラーで攪拌しながら室温で60分反応させ
た。次に400Orpm、 l Q分間遠心分離を行っ
て上清を回収し、該上清を、0.1Mリン酸ナトリウム
緩衝液(pH6,8)で平衡化したセファデックスG−
25カラム(1,6cmx 80cm)に流速151n
fl/hrでかけ、ボイド・ボリュームに溶出されるホ
ースラディシュ・ペルオキシダーゼ画分を回収した。
上記のFab’画分とホースラディシュ・ペルオキシダ
ーゼ画分を混合し、コロジオンバックで濃縮しながら、
4°Cで一晩反応させた。該サンプルを0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液([)[−16、5)で平衡化したウ
ルトロゲルACA44カラム(1,6cmx 85 c
m)に流速15歳/brでかけ、Fab’とホースラデ
ィシュ・ペルオキシダーゼが共有結合した分子の両分(
6,5d)を回収した。最後に安定化剤として130μ
Qの5%BSA(ウシ血清アルブミン)、2.5%メル
チオレートを加えた。
ーゼ画分を混合し、コロジオンバックで濃縮しながら、
4°Cで一晩反応させた。該サンプルを0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液([)[−16、5)で平衡化したウ
ルトロゲルACA44カラム(1,6cmx 85 c
m)に流速15歳/brでかけ、Fab’とホースラデ
ィシュ・ペルオキシダーゼが共有結合した分子の両分(
6,5d)を回収した。最後に安定化剤として130μ
Qの5%BSA(ウシ血清アルブミン)、2.5%メル
チオレートを加えた。
該サンプルは、100倍から500倍の希釈をしても、
2次抗体として使用可能であった。
2次抗体として使用可能であった。
実施例3 宿土由来物質標章品の作製
酵母由来物質(YPs)を免疫学的測定法で定量するに
はYPs標亭品を用いて検量線を作製する必要がある。
はYPs標亭品を用いて検量線を作製する必要がある。
この際に用いるYPs標桑品は抗Y ゛Ps抗
体を用いるアフィニイティー・クロマトグラフィーによ
って以下のように作製した。
体を用いるアフィニイティー・クロマトグラフィーによ
って以下のように作製した。
Formyl−cellulofine(ホルミルーセ
ルロファイン)[チッソ(株)製] 2 、0 ral
lを2歳の蒸留水で4回、2−のリン酸緩衝食塩水で4
回洗浄した後、実施例1の(2)で作製したYPs特異
抗体(6、8mg/Ml)。
ルロファイン)[チッソ(株)製] 2 、0 ral
lを2歳の蒸留水で4回、2−のリン酸緩衝食塩水で4
回洗浄した後、実施例1の(2)で作製したYPs特異
抗体(6、8mg/Ml)。
1.5yfflを加え、4°0.30分間振盪した。次
に、この懸澗液に8 、8 mgのNaCNBH3を加
え、4℃、−夜振盪した。この担体をガラスフィルター
上、P B Sでよく洗浄した後、O、l M T r
is −1(CC緩衝液(pH8,0)に懸濁した。こ
れに6.32mgのN a CN B H:+を加え、
4°CA時間振盪した。
に、この懸澗液に8 、8 mgのNaCNBH3を加
え、4℃、−夜振盪した。この担体をガラスフィルター
上、P B Sでよく洗浄した後、O、l M T r
is −1(CC緩衝液(pH8,0)に懸濁した。こ
れに6.32mgのN a CN B H:+を加え、
4°CA時間振盪した。
この担体をガラスフィルター上、PBS(1&当たり、
K CQ 0 、2 g 、 K Ht P O40
、2g 、 N a CQ8g、NaJlr’o4s
12H203,58g含有)。
K CQ 0 、2 g 、 K Ht P O40
、2g 、 N a CQ8g、NaJlr’o4s
12H203,58g含有)。
4MNIf4SCN、6M塩酸グアニノン、PBSの順
に各6+Jで洗i’Tトした後、カラムに充てん(抗Y
Ps抗体カラム)した。
に各6+Jで洗i’Tトした後、カラムに充てん(抗Y
Ps抗体カラム)した。
実施例Iの(1)で得られた宿主酵母の粗抽出液5滅を
、l 5mM El)TA、0.1%Twccn 80
。
、l 5mM El)TA、0.1%Twccn 80
。
0.1mM(p−アミジノフェニル)メタンスルホニル
フルオライド塩酸塩(P−APMSP)を含む0.1M
リン酸すトリウム緩衝液(pH7、8)で7倍に希釈し
た後、遠心分離(27,0OOX 30分間)にかけよ
清液を得た。該上清液を上記抗YPs抗体カラムにかけ
、1M尿素、0.1mMP−八PMSF、I 5mM
EDTA、O,I%Tween 80を含む0.1Mリ
ン酸すトリウム緩衝液(pt−+ 7 、8 )テカラ
ムを洗浄した後、1M尿素、0.■%Tween 80
を含む0.2Mグリシン−塩酸緩衝液(pH2、0)で
Y Ps(350μg)を溶出した。
フルオライド塩酸塩(P−APMSP)を含む0.1M
リン酸すトリウム緩衝液(pH7、8)で7倍に希釈し
た後、遠心分離(27,0OOX 30分間)にかけよ
清液を得た。該上清液を上記抗YPs抗体カラムにかけ
、1M尿素、0.1mMP−八PMSF、I 5mM
EDTA、O,I%Tween 80を含む0.1Mリ
ン酸すトリウム緩衝液(pt−+ 7 、8 )テカラ
ムを洗浄した後、1M尿素、0.■%Tween 80
を含む0.2Mグリシン−塩酸緩衝液(pH2、0)で
Y Ps(350μg)を溶出した。
実施例4
■ 菌体からのHBsAg抽出
特願昭6l−IL3833号(昭和61年8月18日提
出)の明細書に記載の酵Is、 cerevisiae
AI−122R7pGLD P3 1−RcT(IF
O−10206;PERM BP−1059)の凍結
保存菌に500gを0.1%ポリオキシエヂレン(20
)ソルビタンモノオレエート(Tween 80 )
−7。
出)の明細書に記載の酵Is、 cerevisiae
AI−122R7pGLD P3 1−RcT(IF
O−10206;PERM BP−1059)の凍結
保存菌に500gを0.1%ポリオキシエヂレン(20
)ソルビタンモノオレエート(Tween 80 )
−7。
5M尿素−15mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩(EDTA)−2mMフェニルメヂルスルホニルフ
ルオライド(PMSF)−0,1mM(p−アミツノフ
ェニル)メタンスルホニルフルオライド塩酸塩(P−A
PMSF)−100mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液
(pH7,8)250 CJrrtlに均一に懸殉じた
。この懸濁液をグイノーミルKDL型ボールミル(WA
B社、バーゼル、スイス)により流速4000 d/h
rおよびガラスピース0.50〜0.75mmで処理し
、細胞を連続的に破壊した。
ム塩(EDTA)−2mMフェニルメヂルスルホニルフ
ルオライド(PMSF)−0,1mM(p−アミツノフ
ェニル)メタンスルホニルフルオライド塩酸塩(P−A
PMSF)−100mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液
(pH7,8)250 CJrrtlに均一に懸殉じた
。この懸濁液をグイノーミルKDL型ボールミル(WA
B社、バーゼル、スイス)により流速4000 d/h
rおよびガラスピース0.50〜0.75mmで処理し
、細胞を連続的に破壊した。
抽出効率を高める為にこの操作を2回繰り返した。
この抽出液を13,9OOXgで30分間遠心して上清
3300+Jを得た。
3300+Jを得た。
■ ポリエチレングリコールによる分画上記で得た上清
に0.65倍量の33%濃度(W/W)ポリエチレング
リコール6000(PEG−6000)をゆっくり添加
し、りHを6.0に調整したのち30分間攪拌してから
、13.900xgで30分間遠心してHBsAg画分
を沈澱として回収した。
に0.65倍量の33%濃度(W/W)ポリエチレング
リコール6000(PEG−6000)をゆっくり添加
し、りHを6.0に調整したのち30分間攪拌してから
、13.900xgで30分間遠心してHBsAg画分
を沈澱として回収した。
得られた沈澱物を7.5M尿素−15mMEDTA−2
mM PMSF−0,ImM P−APMSF−+00
mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液(pl(7,2)1
000鑓に溶解し、p 1(を7,0に調整し)2のち
最終濃度が0.30Mになるように食塩を添加した。こ
の溶液に0.25倍1の33%濃度(W/W)のPEG
−6000を添加し、30分後に13゜900 X g
で30分間遠心し、上ltfを得た。得られた」mmに
0.29倍量の33%濃度(W/W)のP E G −
6000をさらに添加し、l) Hを6.0に調整して
、30分間攪拌を続けたのち、13,900xgで30
分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を5.0M尿
2−0.145M食塩−5mM EDTA−SmM r
’MsF−0,05mM P−APMSF−10mMリ
ン酸すトリウム緩衝液(pt17.8)I 20+nI
lに溶解した。
mM PMSF−0,ImM P−APMSF−+00
mMリン酸ナトリウムを含む緩衝液(pl(7,2)1
000鑓に溶解し、p 1(を7,0に調整し)2のち
最終濃度が0.30Mになるように食塩を添加した。こ
の溶液に0.25倍1の33%濃度(W/W)のPEG
−6000を添加し、30分後に13゜900 X g
で30分間遠心し、上ltfを得た。得られた」mmに
0.29倍量の33%濃度(W/W)のP E G −
6000をさらに添加し、l) Hを6.0に調整して
、30分間攪拌を続けたのち、13,900xgで30
分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を5.0M尿
2−0.145M食塩−5mM EDTA−SmM r
’MsF−0,05mM P−APMSF−10mMリ
ン酸すトリウム緩衝液(pt17.8)I 20+nI
lに溶解した。
■ セファクリルS−300によるゲルろ過上記で得た
溶解液を5,0M尿素−0,145〜1食塩−5mM
EDTA−1mM PMSF−0,05mM P−AP
MSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pi−16
、0)で平衡化したセファクリルS−300(ファルマ
シア社、スエーデン)カラム(5x l 02cm、2
000d)に負荷し、同一緩衝液で溶出して、カラムの
排除容積で溶出されて(る画分240戒を集めた。
溶解液を5,0M尿素−0,145〜1食塩−5mM
EDTA−1mM PMSF−0,05mM P−AP
MSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pi−16
、0)で平衡化したセファクリルS−300(ファルマ
シア社、スエーデン)カラム(5x l 02cm、2
000d)に負荷し、同一緩衝液で溶出して、カラムの
排除容積で溶出されて(る画分240戒を集めた。
■ 抗体カラム
次に上記で得た溶出液240雁を0 、14.5 M食
塩−5mM r′:JDTA−0,1mM P−APM
SF−25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pi(7,0
)で5倍に希釈し、同一緩衝液で平衡化したマウス由来
の抗1−T B s A g抗体(国際出願P CT/
J P 85 / 00161の参考例1〜3に記載)
[特開昭61−231997号公報コを結合させたホル
ミルーセルロファイン力ラム200滅を通過させた。
塩−5mM r′:JDTA−0,1mM P−APM
SF−25mMリン酸ナトリウム緩衝液(pi(7,0
)で5倍に希釈し、同一緩衝液で平衡化したマウス由来
の抗1−T B s A g抗体(国際出願P CT/
J P 85 / 00161の参考例1〜3に記載)
[特開昭61−231997号公報コを結合させたホル
ミルーセルロファイン力ラム200滅を通過させた。
次いでtlBsAgを吸着させたカラムを1Mチオシア
ン酸アンモニウム−25mMリン酸ナトリウム緩衝液(
pH6、0)で洗浄したのち、4Mチオシアン酸アンモ
ニウムー25mMリン酸ナトリウム緩・衝液(p)(6
,0)で溶出した。(約3001+β)。これを実施例
5で被検体として用いた。
ン酸アンモニウム−25mMリン酸ナトリウム緩衝液(
pH6、0)で洗浄したのち、4Mチオシアン酸アンモ
ニウムー25mMリン酸ナトリウム緩・衝液(p)(6
,0)で溶出した。(約3001+β)。これを実施例
5で被検体として用いた。
実施例5 宿生由来夾雑物のELISANunc Im
munoplate (ヌンク・イミノプレート)Iに
実施例1の(2)に記載のYPs特シ■抗体[コーティ
ング溶液(NalICO3,2、93gとNazCOs
l、59gを112に溶解させた液)中、20gg/滅
になるように調整したもの]、 150ggを分注し、
4℃、−夜装置した。該プレートをに留水で3回洗浄し
た後、ブロッキング溶液[ウソ血清アルブミン(シグマ
社製)、0.5g:to倍濃度のリン酸緩衝食塩水(P
BS)、10滅: 1%メルチオレート。
munoplate (ヌンク・イミノプレート)Iに
実施例1の(2)に記載のYPs特シ■抗体[コーティ
ング溶液(NalICO3,2、93gとNazCOs
l、59gを112に溶解させた液)中、20gg/滅
になるように調整したもの]、 150ggを分注し、
4℃、−夜装置した。該プレートをに留水で3回洗浄し
た後、ブロッキング溶液[ウソ血清アルブミン(シグマ
社製)、0.5g:to倍濃度のリン酸緩衝食塩水(P
BS)、10滅: 1%メルチオレート。
0 、1 +J ;蒸留水、90Tnfl]、200
u(lを分注し、4℃で一夜静置した。該プレートを蒸
留水で5回洗浄した後、被検体または実施例3の酵母由
来物質標準品(0〜Long蛋白/旋)、100μρを
分注し、37℃、2時間インキュベーションした。該プ
レートを蒸留水で5回洗浄した。次に、希釈緩衝液[子
牛血清、+5旋;10倍濃度のPBS、50滅;1%メ
ルチオレート、 0 、5 zJ ;蒸留水、435+
J]で1100倍に希釈した、実施例2に記載の2次抗
体、■00μQを各穴に分注し、37°C,2時間イン
キュベーションした。蒸留水で5回、該プレートを洗H
)したのら基質液[24,3mMクエン酸塩。
u(lを分注し、4℃で一夜静置した。該プレートを蒸
留水で5回洗浄した後、被検体または実施例3の酵母由
来物質標準品(0〜Long蛋白/旋)、100μρを
分注し、37℃、2時間インキュベーションした。該プ
レートを蒸留水で5回洗浄した。次に、希釈緩衝液[子
牛血清、+5旋;10倍濃度のPBS、50滅;1%メ
ルチオレート、 0 、5 zJ ;蒸留水、435+
J]で1100倍に希釈した、実施例2に記載の2次抗
体、■00μQを各穴に分注し、37°C,2時間イン
キュベーションした。蒸留水で5回、該プレートを洗H
)したのら基質液[24,3mMクエン酸塩。
51.4mM Na、tlPO,、pH5,0,0,0
4%0−−フェニレ:/シフ ミニ/、0.0013%
H、02コ。
4%0−−フェニレ:/シフ ミニ/、0.0013%
H、02コ。
100μQを分注し、室温で10〜30分間反応した後
、2 Ntl、S O,、100μQを加えて反応を停
止し、分光光度計によってA48.の吸光度を測定した
。
、2 Ntl、S O,、100μQを加えて反応を停
止し、分光光度計によってA48.の吸光度を測定した
。
実施例3に記載のYPs標準品を用いて作製した検量線
を第1図に示す。また、この検1線を用いて、実施例4
で得られたB型肝炎ウィルス表面抗原(HBsAg)の
部分精製標品中における酵母由来夾雑物を定量した。そ
の結果を第1表に示す。
を第1図に示す。また、この検1線を用いて、実施例4
で得られたB型肝炎ウィルス表面抗原(HBsAg)の
部分精製標品中における酵母由来夾雑物を定量した。そ
の結果を第1表に示す。
第 1 表
2000 0.862 4.73
4000 0.470 4.68
8000 0.275 4.62
YPs平均値:4.68(μg/戒)
上記の結果は、本測定法において、酵母由来物質標準品
の反応性(dose response)と被検体中
のYPsのドーズレスポンスは平行関係にあり、酵母由
来物質標準品で得られた検量線をもとにして被検体中の
Y P sを定量することができることを示している。
の反応性(dose response)と被検体中
のYPsのドーズレスポンスは平行関係にあり、酵母由
来物質標準品で得られた検量線をもとにして被検体中の
Y P sを定量することができることを示している。
(発明の効果)
本発明によれば、被検体、特に遺伝子組換え技術によっ
て得られたタンパクの精製品中における宿主由来夾雑物
質の免疫学的定量を高感度で行うことができる。
て得られたタンパクの精製品中における宿主由来夾雑物
質の免疫学的定量を高感度で行うことができる。
第1図は酵母由来物質に対するポリクローナル抗体で精
製した酵母由来物質を標め品として用いて作製した検量
線を示す。
製した酵母由来物質を標め品として用いて作製した検量
線を示す。
Claims (1)
- 宿主の粗抽出液をヒト以外の動物に接種し粗抽出液中に
含まれる宿主由来物質に対するポリクローナル抗体を産
生させ、得られたポリクローナル抗体により宿主の粗抽
出液から該動物において免疫原となり得る宿主由来物質
を精製し、精製された宿主由来物質を標準品として、被
検体中の宿主由来物質と上記宿主由来物質に対するポリ
クローナル抗体との反応性を比較することを特徴とする
被検体中の宿主由来物質の免疫学的測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8036187A JPS63243876A (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 免疫学的測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8036187A JPS63243876A (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 免疫学的測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63243876A true JPS63243876A (ja) | 1988-10-11 |
Family
ID=13716115
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8036187A Pending JPS63243876A (ja) | 1987-03-31 | 1987-03-31 | 免疫学的測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63243876A (ja) |
-
1987
- 1987-03-31 JP JP8036187A patent/JPS63243876A/ja active Pending
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