JPS63243876A

JPS63243876A - 免疫学的測定法

Info

Publication number: JPS63243876A
Application number: JP8036187A
Authority: JP
Inventors: Yukio Fujisawa; 藤沢　幸夫; Yasuaki Ito; 康明伊藤; Tsuneo Asano; 浅野　常夫
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-03-31
Filing date: 1987-03-31
Publication date: 1988-10-11

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は宿主由来物質の免疫学的測定法に関する。

（従来技術およびその問題点）近年の組換えＤＮＡ技術の急速な進歩によって、生体内
の種々の遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子を大
腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、カビ、動
物細胞などの真核細胞において発現させることができろ
ようになった。また、動物細胞の培養技術も著しく進歩
し、有用物質を産生ずる各種の株化細胞の大量培養も可
能になっている。そして、各種の組換えＤＮＡ技術によ
る生産物や株化細胞の産物に、近年若しい進歩を見せて
いる蛋白質やペプチドの精製技術を適用することによっ
て、今まで得られなかった有用蛋白質やペプチドを量産
ずろことができろようになってきている。

このようにして得られた精製標品を医薬品としてヒトに
投与する前に、最終標品中に微量混在する宿主由来物質
について正確に把握し、それらに起因する副作用を最小
限に抑える方法を確立し、安全性を完全に確立しておく
ことが必須である。

通常、混入物の検査方法として、検体を５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル′心気泳動（Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ）に付し
、銀染色またはクマジーブルー染色によって混入物を検
出する方法が多用されている。この方法はきわめて高感
度なものであるが、産物と夾雑物の移動度が同一の場合
には両者を区別することが出来ないという欠点がある。

この方法をｈｌｉう乙のとして、免疫学的な手法１例え
ばＩＥ　Ｉ　Ａ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）　［ＩεＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋ
ｅｄ　ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎＬ　Ａｓ５ａｙ）］、
　Ｒｒ　Ａ（Ｒａｄｉ。

Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　、免疫蛍光法（Ｉｍｍｕｎ
ｏｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｃ）などが考慮されるべき
である。

事実、この免疫学的手法を用いて宿主由来夾准蛋白を検
出する試みがなされている。たとえば、Ａｎｉｃｃｔｔ
ｉ、　Ｖ、Ｒ１ら［Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　、〜１ｅ
ｔｈｏｄｓ（ツヤ−ナル・オブ・イムノロジカル・メソ
ッズ）、９１．２１３　（１９８６）］は、大腸菌組換
え体によって生産されたヒト生長ホルモン（ｈＧｔ（）
の精製標品中における大腸閉山来夾雉蛋白（Ｅ　ＣＰ　
Ｓ）測定用のＥＩ。

ＩＳＡを作製している。この方法に従えば、ＥｃＰｓは
ｈＧｔｌの精製法を最終段階の一つ前まで踏襲して部分
精製（ｍｏｃｋ　　ｐｕｒｉｒｉｃａｔｉｏｎ）され、
この標品をウサギに接種して、ＥＣＰｓ抗血ｌ＃か作製
されている。該抗血清は、上記の“ｍｏｃ　ｋ”精製に
ょうて得られたＥＣＰｓのアフィニイティー・クロマト
グラフィーにかけられ、特異的な抗Ｅ　ＣＰ　ｓ抗体が
調製されている。そして、“ｍｏｃｋ”精製ＥＣＰｓ標
品と抗■εＣＰｓ特異抗体を用いるＥ　ＣＰ　ｓのＩＥ
ＬＸｓＡを作製している。この方法は高感度にＥ　ＣＰ
　ｓを検出することが出来るが、目的産物の精製方法が
変更された場合には、濃縮されてくる宿主由来蛋白が大
きく異なるため、その都１，１ＥｃＩ’ｓを”ｍｏｃｋ
”精製して新しくＥＬｒＳＡを設定する必要があり、Ｅ
　ＣＰ　ｓの一般的な測定法としては用いることが出来
ないという欠点がある。

また、背片らは［基礎と臨床、２０巻、８８８３（１９
８６）ｊ酵母組換え体によって生産されたＢ型肝炎つィ
ルス表面抗原精製標品中における酵母由来夾雑蛋白（Ｙ
Ｐｓ）測定用のＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａを作製している。彼
らの方法に従えば、ＹＰｓは宿主菌を超音波処理するこ
とによって調製され、これがウサギに接種されてＹＰｓ
抗血清が作製された。次に、該抗血清から硫安塩析とＤ
ＥＡＥ−セルロース・クロマトグラフィーにより抗ＹＰ
ｓ抗体が得られ、該抗ＹＰｓ抗体と上記酵母破砕物とを
用いるＹＰｓのＥＬ［ＳＡが作製された。しかしながら
、このＥＬＩＳＡは低分子ポリペプチド（約１万ダルト
ン以下）などの免疫原となり得ない物質を多量に含む酵
母破砕物を標ｑ品（ｓｔａｎｄａｒｄ）としているため
、ＹＰｓの検出感度が悪く、しかも検量線と精製標品中
のＹＰｓ夾雑物との間に平行性も認められず、このＥＬ
ｒＳＡではＹＰｓの定１は原理的に困・誰であると報告
されている。

（間頂点を解決するための手段）本発明は、宿主の粗抽出液をヒト以外の動物に１を種し
粗抽出液中に含まれる宿主由来物質に対するポリクロー
ナル抗体を産生させ、得られたボリン【１−ナル抗体に
より宿主の粗抽出液から該動物において免疫原となり得
る宿主由来物質を精製し、精製された宿主由来物質を標
学品として、被検体中の宿主由来物質と」二足宿主由来
物質に対するポリクローナル抗体との反応性を比較する
ことを特徴とする、被検体中の宿主由来物質の免疫学的
測定法を搗供するらのである。

宿主としては、遺伝子組換え技術で用いられる宿主、た
とえば大腸菌、枯草菌、放線菌などの原核細胞や酵母、
カビ類、動物細胞などの真核細胞が含まれる。

宿主の粗抽出液は、宿主を適当な溶液中で、磨細、超音
波破砕、フレンチプレスなどの機械的手法またはりゾチ
ーム処理（大腸菌など）やザイモリエース処理（酵母な
ど）などの酵素的手法あるいはそれらの手法を組み合わ
せて宿主細胞を破壊した後、ろ過あるいは遠心分離に付
し、不溶画分（細胞壁、細胞膜など）を除去することに
より得ることができる。粗抽出液の採取に用いられる溶
液は緩衝液（例、リン酸ナトリウム緩衝液）が好ましい
。

溶液中にはプロテアーゼ阻害剤（例、フェニルメチルス
ルホニルフルオライド、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム塩）、界面活性剤（例、トリト：／　Ｘ　−１０
０，Ｔｗｃｅｎ　−８０）などのタンパクの抽出の際、
通常用いられる物質や遺伝子組換え技術の遺伝子産物の
抽出に用いられるタンパク変性剤（例、尿素、塩酸グア
ニジン）を加えてもよい。被検体の調製の際、タンパク
変性剤が使用されていることが明らかな場合には、宿主
の粗抽出液を調製する際、タンパク変性剤を用いること
が望ましく、被検体の調製にタンパク変性剤が使用され
ているか否が不明の場合には、タンパク変性剤を添加せ
ずに調製した宿主の粗抽出液とタンパク変性剤を添加し
て７Ａ製した宿主の粗抽出液との混合液を抗体産生およ
び抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望まし
い。

宿主細胞の破壊は上記のとおり通常、磨細法。

超音波法、フレンチプレス法および／または酵素法が用
いられる。磨細にはミキサーや粉砕機が用いられ、通常
、ガラス粉末、ガラスピーズなどの磨細剤が添加される
。超音波処理には通常の超音波破砕機が用いられる。酵
素処理にはリゾチーム。

β−１，３−グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼな
どの溶菌酵素が使用される。被検体の調製の際酵素処理
が行われていることが明らかな場合には、酵素を用いて
宿主の粗抽出液を調製することが望ましく、また被検体
の調製に酵素処理が行われていることが不明の場合には
酵素を用いて調製した宿主の粗抽出液と酵素を用いずに
調製した宿主の＄１１抽出液との混合液として抗体産生
および抗体による宿主由来物質の精製に用いることか望
ましい。

宿主細胞の破壊には上記の方法の他、凍結融解法、自己
融解法、何機溶媒法などの方法を用いてもよいが、これ
らの方法はタンパクを変性させる恐れがあるために被検
体の１調製にこれらの方法が（ｊＵ用されていることが
明らかな場合に使用されることか望ましい。

宿主細胞の破壊により得られた破砕物は通常の方法（例
、ろ過、遠心分離）により不溶画分（細胞膜。

細胞壁）が除去されるが、必ずしし完全に不溶画分が除
去されなくてもよい。

上記の方法で得られた宿主の粗抽出液は動物に接種され
、宿主由来物質に対する抗体が産生される。用いられる
動物としてはウサギ、ヒツジ、モルモット、マウスなど
の抗体産生能を有する動物が用いられる。宿主の粗抽出
液の動物への接種は通常の方法により行われる。抗体産
生を増強させるため、アジュバント［例、フロインｔ−
（Ｆｒｅｕｎｄ）のアジュバント、水酸化アルミニラム
コと宿主の粗抽出液を混合し動物に接種することが望ま
しい。接種の回数は特に限定されないが、■ないし２週
毎に１回ずつ計２〜４回が好ましい。

宿主由来物質に対する抗体は、通常の方法にて動物より
採血し、血清を得た後、得られた血ｉｆｆを、宿主の粗
抽出液中に含まれる宿主由来物質を結合させた担体を用
いるアフィニティー・クロマトグラフィーに付すことに
より得ることができる。アフィニティー・クロマトグラ
フィー用カラムは、宿主の粗抽出液を濃縮、乾燥し、あ
るいはａ縮、乾燥せずに、臭化シアンで活性化したセフ
ァロース４Ｂなどの担体に常法に従いカップリングさせ
、これを適当なカラムに充填することにより作製するこ
とができる。血清をアフィニティー・クロマトグラフィ
ーに付す前に、硫安分画などの通常の方法で抗体をある
程度精製するのが好ましい。抗体のカラムへの吸着は、
適当な緩衝液（例、ホウ酸緩衝液、ｐｏ約８．０）で平
衡化したカラムに血清を付加することにより行われる。

抗体の溶出は通常ＩＭ程度の塩化ナトリウトを含む０．
２Ｍグリンンー塩酸緩衝液（ｐｏ２．０）を用いて行わ
れる。

溶出された抗体を含む両分は減圧下あるいは透析膜を用
いて濃縮され、宿主由来物質に対するポリクローナル抗
体が調製される。

ポリクローナル抗体による宿主の粗抽出液からの免疫片
となり得る宿主由来物質の精製は、通常ボリン【Ｉ−ナ
ル抗体を結合させた担体を用いるアフィニティー・り〔
ｌマドグラフィーにより行イつれる。アフィニティー・
クロマトグラフィー用カラ１、は、上記の方法で得られ
たポリクローナル抗体をフォルミルセル【１フアイン、
アフィゲル−１０などの担体に常法に従いカップリング
させ、これを適当なカラムに充填することにより作製す
ることができる。カップリングに際しては通常還元剤（
例、Ｎ　ａＣＮ　Ｂ　Ｈ３）が用いられる。宿主由来物
質のカラムへの吸着は、適当な緩衝液（例、リン酸緩衝
液、ｐＨ約７８）で平衡化したカラムに宿主の粗抽出液
を付加することにより行われろ。免疫原となり得た宿主
由来物質の溶出は通常００２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ｐｔ−ｉ　２　、　Ｏ）を用いて行われる。

溶出溶媒には界面活性剤（例、Ｔｗｅｃｎ　８０　）あ
るいは蛋白変性剤（例、尿素）か適量添加されていてら
よい。溶出された宿主由来物質は通常の方法［例、パン
・スリク（Ｖａｎ　５ｌｙｋｅ）法、ケルダール法、ビ
ウレット法、ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法、紫外線吸収法
、濁度法］によりその蛋白ｈ１を測定することができる
。

精製された宿主由来物質は透析膜を用いて濃縮あるし）
は蒸留水などを用いて適当な濃度に希釈され、免疫学的
測定法の標準品として使用される。

被検体中の宿主由来物質は上記で得られたポリクローナ
ル抗体との反応性により免疫学的に定量することができ
る。反応性の測定には通常、ＥＩＡ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）
、ＲＩ　Ａ、免疫蛍光法などの自体公知の手段が用いら
れる。各手段に用いられる標識抗体は自体公知の方法に
よりポリクローナル抗体を標識することにより調製でき
る。反応性の測定方法は用いられる手段によって異なる
が、たとえばＥＩＡによる８１＋１定の例としては、（
１）宿主由来物質に対するポリクローナル抗体を同相上
に固定し、（２）標準品または被検体を加えて反応させ
、（３）よく洗浄して固相上のポリクローナル抗体に結
合しなかった物質を除去し、（４）酵素で標識された宿
主由来物質に対するポリクローナル抗体と反応させ、固
相上に結合した酵素標識抗体の酵素活性を測定する方法
などがあげられる。ここで用いられる固相としてはセフ
ァロース粒子、ボリスヂレン、ポリカーボネートビーズ
あるいはこれらの材質のマイクロプレートなどがあげら
れる。宿主由来物質に対するポリクローナル抗体（Ｆａ
ｂ’でもよい）の標識は上記のとおり自体公知の方法で
行われ、標識に用いられる物質としてはたとえば、ホー
スラデッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリン・ホスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレセイン・イソチオシアネ
ートなどの蛍光色素　１！Ｊなどの放射性物質、アビジ
ン、ビオチンなどがあげられる。

（実施例）以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１　宿主由来物質に対する特異抗体の作製（１）
宿主酵母由来物質（ＹＰｓ）の抽出遺伝子組換えの宿主
として用いられている酵母サツカロミセス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ　１ａｅ
）ＡＨ２２Ｒ″″ＩＭｉｙａｎｏｈａｒａ、Ａ、ら、Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（プロシージンゲス・オブ・ザ
・ナンヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンセス）ＵＳ
Ａ。

８０．１　（１９８３）］を、ロロインとヒスデシンを
添加したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒ培地［Ｂｏｓｔｉａｎ、
　Ｋ、＾、ら、　ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　７７．４５０４　（１９８０）］中
で３０℃、２日間培養して得られた菌体、３０ｇを２０
０−の抽出用緩衝液［７，５Ｍ尿素、２５ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７，５）、１ｍＭフェニルメチル
スルホニルフルオライド（ＰＭＳ　Ｆ）、　ｌ　ＯｍＭ
エヂレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、
０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００３に懸濁し、直径０
゜５〜０．７５ｍｍのガラスピーズ、２００ｇを加えて
激しく振盪することにより酵母を機械的に破砕した。該
破砕液を遠心分離（１Ｂ、ＯＯＯｘｇ、　３０分間）に
かけて上清液を得た。以下、上清液を宿主酵母の粗抽出
物（祖ＹＰｓ；２００蔵、６６ｍｇ／１２）として用い
た。

（２）酵母由来物質に対する特異抗体（抗ＹＰｓ抗体）
の作製上記粗抽出液（１０ｍｇ蛋白／ｄ）、３ｄとＦｒｅｕｎ
ｄ（フロイント）の完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製
）。

３ｍ１２とをよく混合したものを、体重２，５〜３．０
ｋｇのウサギ（日本白色柱）の背部皮下に接種し、初回
免疫後２週目と４週目に同量を用いて追加免疫を行った
。３回目の免疫から１週間後に採血し、宿主酵母蛋白に
対する抗血清（ＹＰｓ抗１１１清）を得ノこ。

次に、前記の酵母宿主の粗抽出物、１５０ｍｇ（蛋白量
として）を臭化シアン−活性化セファロース４　Ｂ　（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
、　５　ｇ（乾燥ｆｆ１）に、供給元の指示書に従って
カップリングさせ、粗ＹＰｓが結合したセファロース４
Ｂ（ＹＰｓ−セファロース４．８）を作製した。

前記ＹＰｓ抗血清、２５ｄに１００％飽和硫安溶液、１
６．７−を加え、室温で３０分攪拌した後、遠心分離（
１６，０００ｙ４．１０分間）にかけて沈澱を集めた。

この沈澱物を２０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解し同緩衝液で平衡化したＹＰｓ−セファロース４Ｂカ
ラム（１，６ｘ８ｃｍ）にかけ、０゜５ＭＮａＣρを含
む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ１１４　、５　）て該カラム
を洗浄した後、ＩＭＮａＣ（２を含む０２Ｍグリシン−
塩酸緩衝液（ｐｉ−１２、０）でＹＰｓに対する特異抗
体を溶出した。該特異抗体の溶出画分（７０）ｎＱ）の
ｐＨを３ＮＮａＯＩ４を用いて中性に調製した後、コロ
ジオンバック（ザルトリウス社製）で１．５ｄになるま
で濃縮し、２５ｍｇのＹＰｓ特異抗体（ＩｇＧ）を調製
した。

実施例２２次抗体の作製実施例１の（２）で得られたＹＰ特異抗体１２ｍｇを、
Ｏ，１Ｍ酢酸緩衝液（ｐ＋−ｉ　４　、　Ｏ）に対して
２時間透析した後、４８０μｇのベプンンを加え、３７
℃で一晩消化した。次にｌＮＮａＯＨを数滴加え、ｐｌ
＋を中性にした後、０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０
）で平衡化した５ｅｐｈａｄｅｘ（セファデックス）Ｇ
−１５０カラム（２，６ｃｍＸ　８０ｃｍ）を用いてＦ
（ａｂ’）、を分離精製した（流ｍ　Ｉ　５　ｒｎｆｌ
　／　ｈｒ）。

Ｆ（ａｂ’）−画分をコロジオンバックを用いて１　、
５　Ｍｌまで濃縮し、さらに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
５，０）に対して２時間透析した。次に、２−メルカプ
トエヂルアミンを終濃度２０ｍＭになるように加え、Ｎ
ｔ置換を行った後、３７℃で９０分反応させた。

続いて該サンプルをＯ，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐ［１６，０）、５ｍＭＥＤＴＡで平衡化したセファデ
ックスＧ−２５カラム（１，６ｃｍｘ　８０ｃｍ）に流
速１５　ｔＪ　／　ｈｒでかけ、ボイド・ボリュームに
溶出されるＦａｂ’画分を回収した。

上記操作とは別にホースラディシュ・ペルオキシダーゼ
ｌｏｎｇを１　、４　ｍｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６，８）に溶かしたものに、ｌＯＯμＱの
マレイミド液（■７０μＱのＮ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミドに８ｍｇのＮ−（４−カルボキシシクロヘキシルメ
チル）マレイミドＮ−ヒドロキシザクシンイミドエステ
ルを溶かしたもの）を加え、Ｎ、置換をした後、マグネ
チックスターラーで攪拌しながら室温で６０分反応させ
た。次に４００Ｏｒｐｍ、　ｌ　Ｑ分間遠心分離を行っ
て上清を回収し、該上清を、０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１，６ｃｍｘ　８０ｃｍ）に流速１５１ｎ
ｆｌ／ｈｒでかけ、ボイド・ボリュームに溶出されるホ
ースラディシュ・ペルオキシダーゼ画分を回収した。

上記のＦａｂ’画分とホースラディシュ・ペルオキシダ
ーゼ画分を混合し、コロジオンバックで濃縮しながら、
４°Ｃで一晩反応させた。該サンプルを０．１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（［）［−１６、５）で平衡化したウ
ルトロゲルＡＣＡ４４カラム（１，６ｃｍｘ　８５　ｃ
ｍ）に流速１５歳／ｂｒでかけ、Ｆａｂ’とホースラデ
ィシュ・ペルオキシダーゼが共有結合した分子の両分（
６，５ｄ）を回収した。最後に安定化剤として１３０μ
Ｑの５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、２．５％メル
チオレートを加えた。

該サンプルは、１００倍から５００倍の希釈をしても、
２次抗体として使用可能であった。

実施例３　宿土由来物質標章品の作製酵母由来物質（ＹＰｓ）を免疫学的測定法で定量するに
はＹＰｓ標亭品を用いて検量線を作製する必要がある。

この際に用いるＹＰｓ標桑品は抗Ｙ　　　　　゛Ｐｓ抗
体を用いるアフィニイティー・クロマトグラフィーによ
って以下のように作製した。

Ｆｏｒｍｙｌ−ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ（ホルミルーセ
ルロファイン）［チッソ（株）製］　２　、０　ｒａｌ
ｌを２歳の蒸留水で４回、２−のリン酸緩衝食塩水で４
回洗浄した後、実施例１の（２）で作製したＹＰｓ特異
抗体（６、８ｍｇ／Ｍｌ）。

１．５ｙｆｆｌを加え、４°０．３０分間振盪した。次
に、この懸澗液に８　、８　ｍｇのＮａＣＮＢＨ３を加
え、４℃、−夜振盪した。この担体をガラスフィルター
上、Ｐ　Ｂ　Ｓでよく洗浄した後、Ｏ、ｌ　Ｍ　Ｔ　ｒ
ｉｓ　−１（ＣＣ緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁した。こ
れに６．３２ｍｇのＮ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ：＋を加え、
４°ＣＡ時間振盪した。

この担体をガラスフィルター上、ＰＢＳ（１＆当たり、
Ｋ　ＣＱ　　０　、２　ｇ　、　Ｋ　Ｈｔ　Ｐ　Ｏ４０
、２ｇ　、　Ｎ　ａ　ＣＱ８ｇ、ＮａＪｌｒ’ｏ４ｓ　
１２Ｈ２０３，５８ｇ含有）。

４ＭＮＩｆ４ＳＣＮ、６Ｍ塩酸グアニノン、ＰＢＳの順
に各６＋Ｊで洗ｉ’Ｔトした後、カラムに充てん（抗Ｙ
Ｐｓ抗体カラム）した。

実施例Ｉの（１）で得られた宿主酵母の粗抽出液５滅を
、ｌ　５ｍＭ　Ｅｌ）ＴＡ、０．１％Ｔｗｃｃｎ　８０
　。

０．１ｍＭ（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニル
フルオライド塩酸塩（Ｐ−ＡＰＭＳＰ）を含む０．１Ｍ
リン酸すトリウム緩衝液（ｐＨ７、８）で７倍に希釈し
た後、遠心分離（２７，０ＯＯＸ　３０分間）にかけよ
清液を得た。該上清液を上記抗ＹＰｓ抗体カラムにかけ
、１Ｍ尿素、０．１ｍＭＰ−八ＰＭＳＦ、Ｉ　５ｍＭ　
ＥＤＴＡ、Ｏ，Ｉ％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む０．１Ｍリ
ン酸すトリウム緩衝液（ｐｔ−＋　７　、８　）テカラ
ムを洗浄した後、１Ｍ尿素、０．■％Ｔｗｅｅｎ　８０
を含む０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２、０）で
Ｙ　Ｐｓ（３５０μｇ）を溶出した。

実施例４ ■　菌体からのＨＢｓＡｇ抽出特願昭６ｌ−ＩＬ３８３３号（昭和６１年８月１８日提
出）の明細書に記載の酵Ｉｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
ＡＩ−１２２Ｒ７ｐＧＬＤ　　Ｐ３　１−ＲｃＴ（ＩＦ
Ｏ−１０２０６；ＰＥＲＭ　　ＢＰ−１０５９）の凍結
保存菌に５００ｇを０．１％ポリオキシエヂレン（２０
）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ　８０　）　
−７。

５Ｍ尿素−１５ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム塩（ＥＤＴＡ）−２ｍＭフェニルメヂルスルホニルフ
ルオライド（ＰＭＳＦ）−０，１ｍＭ（ｐ−アミツノフ
ェニル）メタンスルホニルフルオライド塩酸塩（Ｐ−Ａ
ＰＭＳＦ）−１００ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液
（ｐＨ７，８）２５０　ＣＪｒｒｔｌに均一に懸殉じた
。この懸濁液をグイノーミルＫＤＬ型ボールミル（ＷＡ
Ｂ社、バーゼル、スイス）により流速４０００　ｄ／ｈ
ｒおよびガラスピース０．５０〜０．７５ｍｍで処理し
、細胞を連続的に破壊した。

抽出効率を高める為にこの操作を２回繰り返した。

この抽出液を１３，９ＯＯＸｇで３０分間遠心して上清
３３００＋Ｊを得た。

■　ポリエチレングリコールによる分画上記で得た上清
に０．６５倍量の３３％濃度（Ｗ／Ｗ）ポリエチレング
リコール６０００（ＰＥＧ−６０００）をゆっくり添加
し、りＨを６．０に調整したのち３０分間攪拌してから
、１３．９００ｘｇで３０分間遠心してＨＢｓＡｇ画分
を沈澱として回収した。

得られた沈澱物を７．５Ｍ尿素−１５ｍＭＥＤＴＡ−２
ｍＭ　ＰＭＳＦ−０，ＩｍＭ　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−＋００
ｍＭリン酸ナトリウムを含む緩衝液（ｐｌ（７，２）１
０００鑓に溶解し、ｐ　１（を７，０に調整し）２のち
最終濃度が０．３０Ｍになるように食塩を添加した。こ
の溶液に０．２５倍１の３３％濃度（Ｗ／Ｗ）のＰＥＧ
−６０００を添加し、３０分後に１３゜９００　Ｘ　ｇ
で３０分間遠心し、上ｌｔｆを得た。得られた」ｍｍに
０．２９倍量の３３％濃度（Ｗ／Ｗ）のＰ　Ｅ　Ｇ　−
６０００をさらに添加し、ｌ）　Ｈを６．０に調整して
、３０分間攪拌を続けたのち、１３，９００ｘｇで３０
分間遠心して沈澱物を集めた。この沈澱物を５．０Ｍ尿
２−０．１４５Ｍ食塩−５ｍＭ　ＥＤＴＡ−ＳｍＭ　ｒ
’ＭｓＦ−０，０５ｍＭ　Ｐ−ＡＰＭＳＦ−１０ｍＭリ
ン酸すトリウム緩衝液（ｐｔ１７．８）Ｉ　２０＋ｎＩ
ｌに溶解した。

■　セファクリルＳ−３００によるゲルろ過上記で得た
溶解液を５，０Ｍ尿素−０，１４５〜１食塩−５ｍＭ　
ＥＤＴＡ−１ｍＭ　ＰＭＳＦ−０，０５ｍＭ　Ｐ−ＡＰ
ＭＳＦ−１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ−１６
、０）で平衡化したセファクリルＳ−３００（ファルマ
シア社、スエーデン）カラム（５ｘ　ｌ　０２ｃｍ、２
０００ｄ）に負荷し、同一緩衝液で溶出して、カラムの
排除容積で溶出されて（る画分２４０戒を集めた。

■　抗体カラム次に上記で得た溶出液２４０雁を０　、１４．５　Ｍ食
塩−５ｍＭ　ｒ′：ＪＤＴＡ−０，１ｍＭ　Ｐ−ＡＰＭ
ＳＦ−２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐｉ（７，０
）で５倍に希釈し、同一緩衝液で平衡化したマウス由来
の抗１−Ｔ　Ｂ　ｓ　Ａ　ｇ抗体（国際出願Ｐ　ＣＴ／
Ｊ　Ｐ　８５　／　００１６１の参考例１〜３に記載）
［特開昭６１−２３１９９７号公報コを結合させたホル
ミルーセルロファイン力ラム２００滅を通過させた。

次いでｔｌＢｓＡｇを吸着させたカラムを１Ｍチオシア
ン酸アンモニウム−２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ６、０）で洗浄したのち、４Ｍチオシアン酸アンモ
ニウムー２５ｍＭリン酸ナトリウム緩・衝液（ｐ）（６
，０）で溶出した。（約３００１＋β）。これを実施例
５で被検体として用いた。

実施例５　宿生由来夾雑物のＥＬＩＳＡＮｕｎｃ　Ｉｍ
ｍｕｎｏｐｌａｔｅ　（ヌンク・イミノプレート）Ｉに
実施例１の（２）に記載のＹＰｓ特シ■抗体［コーティ
ング溶液（ＮａｌＩＣＯ３，２、９３ｇとＮａｚＣＯｓ
ｌ、５９ｇを１１２に溶解させた液）中、２０ｇｇ／滅
になるように調整したもの］、　１５０ｇｇを分注し、
４℃、−夜装置した。該プレートをに留水で３回洗浄し
た後、ブロッキング溶液［ウソ血清アルブミン（シグマ
社製）、０．５ｇ：ｔｏ倍濃度のリン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）、１０滅：　１％メルチオレート。

０　、１　＋Ｊ　；蒸留水、９０Ｔｎｆｌ］、２００　
ｕ（ｌを分注し、４℃で一夜静置した。該プレートを蒸
留水で５回洗浄した後、被検体または実施例３の酵母由
来物質標準品（０〜Ｌｏｎｇ蛋白／旋）、１００μρを
分注し、３７℃、２時間インキュベーションした。該プ
レートを蒸留水で５回洗浄した。次に、希釈緩衝液［子
牛血清、＋５旋；１０倍濃度のＰＢＳ、５０滅；１％メ
ルチオレート、　０　、５　ｚＪ　；蒸留水、４３５＋
Ｊ］で１１００倍に希釈した、実施例２に記載の２次抗
体、■００μＱを各穴に分注し、３７°Ｃ，２時間イン
キュベーションした。蒸留水で５回、該プレートを洗Ｈ
）したのら基質液［２４，３ｍＭクエン酸塩。

５１．４ｍＭ　Ｎａ、ｔｌＰＯ，、ｐＨ５，０，０，０
４％０−−フェニレ：／シフ　ミニ／、０．００１３％
Ｈ、０２コ。

１００μＱを分注し、室温で１０〜３０分間反応した後
、２　Ｎｔｌ、Ｓ　Ｏ，、１００μＱを加えて反応を停
止し、分光光度計によってＡ４８．の吸光度を測定した
。

実施例３に記載のＹＰｓ標準品を用いて作製した検量線
を第１図に示す。また、この検１線を用いて、実施例４
で得られたＢ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の
部分精製標品中における酵母由来夾雑物を定量した。そ
の結果を第１表に示す。

第　　１　　表２０００　０．８６２　４．７３４０００　０．４７０　４．６８８０００　０．２７５　４．６２ＹＰｓ平均値：４．６８（μｇ／戒）上記の結果は、本測定法において、酵母由来物質標準品
の反応性（ｄｏｓｅ　　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）と被検体中
のＹＰｓのドーズレスポンスは平行関係にあり、酵母由
来物質標準品で得られた検量線をもとにして被検体中の
Ｙ　Ｐ　ｓを定量することができることを示している。

（発明の効果）本発明によれば、被検体、特に遺伝子組換え技術によっ
て得られたタンパクの精製品中における宿主由来夾雑物
質の免疫学的定量を高感度で行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵母由来物質に対するポリクローナル抗体で精
製した酵母由来物質を標め品として用いて作製した検量
線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

宿主の粗抽出液をヒト以外の動物に接種し粗抽出液中に
含まれる宿主由来物質に対するポリクローナル抗体を産
生させ、得られたポリクローナル抗体により宿主の粗抽
出液から該動物において免疫原となり得る宿主由来物質
を精製し、精製された宿主由来物質を標準品として、被
検体中の宿主由来物質と上記宿主由来物質に対するポリ
クローナル抗体との反応性を比較することを特徴とする
被検体中の宿主由来物質の免疫学的測定法。