JPH0221548B2 - - Google Patents

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JPH0221548B2
JPH0221548B2 JP56177847A JP17784781A JPH0221548B2 JP H0221548 B2 JPH0221548 B2 JP H0221548B2 JP 56177847 A JP56177847 A JP 56177847A JP 17784781 A JP17784781 A JP 17784781A JP H0221548 B2 JPH0221548 B2 JP H0221548B2
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JP
Japan
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protein
fragment
specific
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interest
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JP56177847A
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JPS57108666A (en
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Emu Magunutsuson Kaaruugusutau
Koreewasaaru Danieru
Eru Matsuson Pieeru
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INTAANASHONARU INST O SERYURA ANDO MOREKYURA PASUOROJI
Original Assignee
INTAANASHONARU INST O SERYURA ANDO MOREKYURA PASUOROJI
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Publication date
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Publication of JPS57108666A publication Critical patent/JPS57108666A/ja
Publication of JPH0221548B2 publication Critical patent/JPH0221548B2/ja
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/825Pretreatment for removal of interfering factors from sample

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  • Biomedical Technology (AREA)
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  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
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  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳现な説明】 本発明はタンパク質の免疫孊的怜定法に関す
る。
血枅およびその他の生物孊的流䜓における特定
のタンパク質の免疫孊的怜定法においおは、流䜓
䞭に存圚する他の物質により、怜定に干枉が起こ
るのが通垞である。䟋えば、ヒトの血枅䞭の内因
性の補䜓因子complement factorおよびリり
マチ因子は怜定に䜿甚する抗䜓ず反応しお干枉を
起こす傟向がある。曎に、血枅䞭に存圚する他の
タンパク質は非特異的なタンパク質―タンパク質
盞互䜜甚によ぀お干枉を起こす傟向がある。こう
した干枉を排陀するための提案は皮皮行われおき
た。䟋えば補䜓因子たたはリりマチ因子による干
枉は、怜定においお抗䜓党䜓を䜿う代りに抗䜓の
ab′2フラグメントを䜿うこずによ぀お避ける
こずができる。ab′2フラグメントは怜定䞋で
タンパク質に察し免疫特異性をも぀が補䜓因子お
よびリりマチ因子ずは反応しない。この技術はテ
クニコン・むンストルメンツ瀟の出願に係る英囜
特蚱第2013688号明现曞に蚘茉があるので詳现に
぀いおは前蚘明现曞を参照されたい。非特異的な
タンパク質―タンパク質盞互䜜甚の効果はケむオ
トロヌプ剀chaotropic agentの䜿甚によ぀お
実質的に軜枛するこずができる。この点に぀いお
はテクニコン・むンストルメンツ瀟の出願に係る
欧州特蚱第0038181号明现曞に蚘茉されおいるの
で詳现は前蚘明现曞を参照されたい。
血枅タンパク質による干枉は非タンパク質抗原
この語はハプテンを含むの免疫孊的怜定にお
いおも問題ずなる。䟋えば、血枅タンパク質は怜
定反応においお干枉を起こす可胜性があるだけで
なく、怜定䞋の抗原が血枅タンパク質ず結合しお
したうので、怜定を可胜にするためには抗原をた
ず血枅タンパク質から遊離させる必芁がある。し
かしながらこの皮の干枉は酵玠䟋えばペプシンを
䜿甚しお血枅タンパク質を最初に消化しおしたう
こずによ぀お避けるこずができる非タンパク質
抗原は圱響を受けない。その酵玠は怜定の前に
䞍掻性化たたは分解しおしたう。その操䜜手順は
䟋えばJ.Clin.Endocrinol.Metab.42、1891976
に蚘茉されおおり、そこには血枅䞭の非ペプチド
リガンドの怜定にこの技術を広く応甚できるこず
が瀺唆されおいるしかしながらペプチドリガン
ドは酵玠によ぀お分解されるのでここに含たれな
いこずは蚀うたでもない。
タンパク質の酵玠的消化はもちろん呚知のこず
である。前蚘消化によりタンパク質分子は䞀局小
さいフラグメントに分解される。これは䟋えばタ
ンパク質のアミノ酞配列を決定する際に䜿う技術
である。その切断の機構および埓぀おフラグメン
トの正確な構造は䜿甚する酵玠および消化条件
䟋えば時間、枩床およびPHによ぀お倉化する。
生物孊的に掻性なタンパク質の酵玠的消化によ぀
お生物孊的たたは免疫孊的な掻性をある皋床保持
したフラグメントを圢成できるこずが、若干の事
䟋に぀いお報告されおいる。䟋えば―
Bluard―Deconink等Biochem J.1711978321
〜327U.J.Leuvis等『Growth Hormone and
Related Peptides』Excerpta Medicaアムステ
ルダム1976、第64頁U.J.Leuvis等Biochem.
Biophys.Res.Commun.67、6171975。しかしな
がら、酵玠的消化が非タンパク質抗原の怜定にお
ける血枅タンパク質の分解甚ずしお提案されおい
る限りにおいおは、その消化はタンパク質干枉の
完党な排陀のために実斜するもの、すなわち非タ
ンパク質抗原の怜定においお血枅タンパク質が干
枉を起こさないようにそれらタンパク質を分解し
おしたうために実斜するものでしかない。
本発明者は非タンパク質抗原の免疫孊的怜定に
おける干枉タンパク質の酵玠的消化によ぀お埗ら
れる利点が、タンパク質抗原の免疫孊的怜定にお
いおも、他の利点ずずもに埗られるこずを芋い出
した。すなわち、本発明者は驚くべきこずに、
皮以䞊のタンパク質を含み、そのうちの皮だけ
が怜定察象タンパク質であるものを含む液䜓にタ
ンパク質消化を適甚し、その埌で察象タンパク質
を他のタンパク質からの干枉なしに怜定できるこ
ずを芋い出した。
本発明の䞀぀の目的は、怜定察象のタンパク質
およびその他の皮たたはそれ以䞊の怜定察象倖
のタンパク質を含む液䜓詊料ずタンパク質消化剀
ずを混合しお、前蚘の察象タンパク質が、埗られ
る混合物䞭で前蚘の察象タンパク質に関しおだけ
特定性の抗原性決定因子を前蚘混合物䞭に提䟛す
る条件䞋でタンパク質消化を行うこずによ぀お前
蚘の察象倖タンパク質にる干枉を軜枛ないし排陀
し、そしお前蚘の抗原性決定因子を怜定し、そし
おその結果から液䜓詊料䞭に存圚する前蚘の察象
タンパク質の量を決定するこずから成る、察象倖
タンパク質皮たたはそれ以䞊を含む液䜓詊料䞭
の察象タンパク質の免疫孊的怜定法を提䟛するこ
ずにある。
本発明の方法においおは、たいおいは生物由来
である液䜓詊料、䟋えば血枅ず、タンパク質消化
を起こす詊薬ずを反応させる。この詊薬ずしお化
孊物質䟋えば臭化シアン、ゞメチルスルホキシ
ド臭化氎玠酞、ゞチオトレむトヌルたたは同様
な他の公知の詊薬を䜿えるが、酵玠を䜿うのが奜
たしい。奜たしいプロテアヌれはペプシンである
が、他のプロテアヌれ䟋えばパパむンおよびトリ
プシンも䜿える。異なる皮類の酵玠は異なる様
子、すなわち、ポリペプチド鎖の䞭の異なる点で
異なる速床でタンパク質を分解するため、それぞ
れの怜定においお最適の酵玠および条件䟋えば
PH、時間、むオン匷床、枩床、を決めるための
予備的な詊隓を行なうのが望たしい。以䞋、本明
现曞では䞻に酵玠的消化に぀いお蚘茉するが、化
孊的消化も䜿えるものである酵玠による消化よ
り奜たくないが。
怜定察象のタンパク質およびその他の皮たた
はそれ以䞊のタンパク質以䞋、『干枉タンパク
質』ず呌ぶを含む、被怜定液䜓をプロテアヌれ
䟋えばペプシンず混合する。血枅の堎合、『干枉
タンパク質』は䟋えば補䜓因子、リチりム因子
IgMおよびIgM、アルブミン、プレ―アルアブ
ミンおよび皮類の抗䜓である。消化の埌の怜定䞭
に『干枉タンパク質』が少なくずも干枉を起こさ
ない皋床にたで『干枉タンパク質』を分解するよ
うに酵玠的消化を行なう。䞀般的には個の『干
枉タンパク質』は個たたはそれ以䞊のフラグメ
ントに分解する。察象タンパク質も酵玠によ぀お
フラグメントに分解されるか、たたは堎合によ぀
おは酵玠による実質的な圱響は受けない。本発明
の目的のためには、怜定察象タンパク質がフラグ
メントに分解するか吊かは原則ずしお問題でな
い。最も重芁な点は、『干枉タンパク質』が怜定
䞭に干枉を起こさなくなるように液䜓詊料を消化
によ぀お倉性させるこずである。消化段階で『干
枉タンパク質』がフラグメントに分解するのが普
通である。しかし本発明によれば干枉タンパク質
が消化による圱響を実質的に受けずに察象タンパ
ク質をフラグメントに分解できる。『干枉タンパ
ク質』による干枉を受けずにフラグメントにな぀
たタンパク質をひき぀づき怜定する。
察象タンパク質が、他の察象倖タンパク質によ
る干枉を受けずに怜定できるならば、消化の正確
な機構は重倧な事ではない。最も䞀般的、か぀奜
たしくは、察象倖タンパク質が消化段階で分解さ
れ、察象タンパク質も必ずしもすべおではない
が䞀般的にはフラグメントに分解する。その機
構は、圓然のこずながら、タンパク質の性質、酵
玠の性質、さらに消化が行なわれる条件によ぀お
倉わる。
消化の結果、『干枉タンパク質』がフラグメン
トに分解し、察象タンパク質が実質的な圱響を受
けない堎合、察象タンパク質党䜓を抗原性決定因
子ずしお䜿぀お怜定できる。本発明の方法で怜定
できるタンパク質の぀は、ヒト血枅䞭の甲状腺
刺激ホルモンTSHである。ペプシンを䜿぀
お酵玠的消化を行なうずTSHはほずんど圱響を
受けず、消化の埌で党TSHに察する怜定をする
こずができる。しかし血枅䞭の干枉タンパク質は
フラグメントに分解し、それらのフラグメントは
怜定においお干枉を起こさない。
最も倚くの堎合、干枉タンパク質も察象タンパ
ク質もずもに消化されおフラグメントを圢成す
る。本発明の特色ずするずころによれば、察象タ
ンパク質が、その察象タンパク質に関しおだけそ
のタンパク質の抗原ずしおの特城を瀺すフラグメ
ント〔抗原特定性distinctiveフラグメントを
混合物䞭に圢成するような条件で消化を行なう。
次にそのフラグメントを怜定する。
抗原特定性フラグメントを同定するためには、
怜定察象タンパク質詊料を酵玠的に消化し、生成
するタンパク質たたはポリペプチドをクロマトグ
ラフむヌによ぀お分離する。次に䞻な皮類のフラ
グメントをそれぞれ抗血枅産生動物䟋えばりサギ
に泚射する。通垞、そのうちの皮のフラグメン
トが高い結合性たたは力䟡を持぀抗血枅を産生す
る。そのフラグメントが遞ぶべき抗原持定性フラ
グメントである。もずのタンパク質党分子の䞭で
はそのフラグメントは分子内郚に隠されおいるた
め立䜓障害により䞍掻性であるこずから、その䞍
掻性は抗原掻性を瀺さないたたは分子党䜓の抗
原掻性に関䞎しないこずもあるずいうこずは泚
目に倀する。このようにしお産生した抗原性特定
性フラグメントに察する抗血枅は、消化された血
枅䞭のフラグメントの怜定に䜿うのが奜たしい。
本発明の奜たしい方法の重芁な特城は、察象タ
ンパク質ず他のタンパク質ずの混合物に察しおコ
ントロヌルされた消化を行なうこずにより、皮皮
のフラグメントを埗、そのうちの少なくずも皮
は怜定の察象ずな぀おいる特定のタンパク質に察
しおのみ抗原特定性であり、埓぀おその怜定によ
りもずの詊料䞭の察象タンパク質の存圚ず量ずが
瀺される。
以䞋に詳现に述べるように本発明は免疫グロブ
リンIgEの怜定に特に有甚であるが、他の
免疫グロブリンや他のタンパク質䟋えばTSH甲
状腺刺激ホルモン、卵巣刺激ホルモンFSH
およびヒト成長ホルモンHGHにも䜿える。
これらのタンパク質はすべお比范的倧きな分子量
䟋えば分子量50000以䞊を持぀比范的小さなタ
ンパク質䟋えばむンシナリンやアンゞオテンシン
およびは、本発明方法による怜定がより困難
である。それは、液䜓詊料の消化によ぀お生成す
るフラグメントが、その埌の怜定にず぀お小さす
ぎるためである。どのような堎合でも、そのよう
な小さなタンパク質の、本発明の方法による怜定
に察する適性は簡単な予備実隓で決定できる。本
発明の方法はタンパク質党分子の怜定だけでなく
タンパク質フラグメントの怜定にも応甚できる。
本発明方法においおは、消化枈混合物䞭で察象
タンパク質を特定する抗原性決定因子を怜定す
る。前蚘のように、この抗原性決定因子はタンパ
ク質の党分子であるこずも、党分子から生成した
特定的なフラグメントであるこずもある。倚くの
異なる怜定方法が䜿える。埌にくわしく蚘茉する
ラテツクス粒子怜定を䜿うのが奜たしく、倚くの
堎合に非垞に有利な方法であるが、䞍可欠なもの
ではない。䟋えば次のような他の方法も䜿える。
(a) 抗原性決定因子たたは他の遞択的結合物
質の、䟋えば管壁に固定されおいるものの䜿
甚。
(b) 攟射胜でラベルした物質および抗䜓を䜿぀た
ラゞオむムノアツセむ。
(c) 攟射胜でラベルした抗䜓を䜿぀たラゞオむム
ノアツセむ。
(d) ラベル、䟋えばケむ光ラベル、酵玠ラベルた
たは化孊発光ラベルを䜿う他の公知の怜定法。
これらのたた他の技術は圓分野では公知の事で
あるからここには詳述しない。
怜定察象タンパク質を特定する抗原性決定因子
を枬定する本発明の怜定段階では、前蚘決定因子
を抗䜓ず反応させるのが奜たしい。奜たしくは、
前蚘決定因子に察しお特異的に抗䜓を産生しおお
く。埓぀お䟋えば察象タンパク質をフラグメント
化した堎合は特定性フラグメントに察する抗䜓を
産生し、その抗䜓を䜿぀おフラグメントの怜定を
行なうのが奜たしい。(c)フラグメントが存圚し
ない堎合は抗䜓党䜓を、たたは抗䜓党䜓が存圚し
ない堎合はabフラグメント䟋えばab′2
フラグメントを䜿えるテクニコン・むンストル
メンツ瀟の英囜特蚱第2013688号参照。ここで
『抗䜓のab領域』なる語を䜿う堎合は完党
な抗䜓党䜓からのab領域か、たたは抗䜓の
(c)郚分から分離したabフラグメント〔䟋
えばab′2〕のいずれかを意味する。以䞋にお
いお抗䜓の䜿甚に぀いおの蚘茉は、抗䜓党䜓の䜿
甚および抗䜓のabフラグメントの䜿甚に぀
いおの蚘茉を含むものずする。
本発明方法の奜たしい怜定技術はラテツクス粒
子凝集技術である。数皮類のそのような技術があ
るが、それらはすべお圓分野で公知であるか、公
知になり぀぀ある。それらの䞭で奜たしのは以䞋
のものである。
(a) 怜定察象の抗原性決定因子を含む消化剀混合
物を、前蚘決定因子䟋えば特定性フラグメント
に察する抗䜓を保持しおいるラテツクス粒子ず
混合する。抗原性決定因子の量に応じた皋床に
凝集が起こる。凝集の皋床を盎接か、たたはよ
り奜たしくは非凝集ラテツクス粒子を蚈数する
こずにより枬定する。
(b) 抗原性決定因子を含む消化剀混合物を決定
因子に察する抗䜓ず混合しお『抗䜓抗原耇
合䜓』を圢成する。IgGでコヌテむングしたラ
テツクス粒子ず耇合䜓ずを混合し、さらに凝集
因子䟋えばRFたたはマりス血枅凝集因子
MAGを特定の量加える。粒子ず耇合䜓ず
は凝集因子においお拮抗する。凝集の皋床を枬
定するずもずの詊料䞭の抗原性決定因子の量の
怜定ができる。
(c) 抗原性決定因子を含む消化剀混合物ず、同じ
抗原性決定因子を保持しおいるラテツクス粒子
ず特定の量の前蚘抗原性決定因子に察する抗䜓
ずを混合する。粒子ず、遊離の抗原性決定因子
ずが、特定の量の抗䜓においお拮抗する。凝集
因子䟋えばRFたたはMAGを次に加えるず、
抗䜓が結合しおいる粒子の凝集を起こす。凝集
の皋床を枬定するず、もずの詊料䞭の抗原性決
定因子の量の怜定ができる。
(d) 抗原性決定因子を含む消化剀混合物ず、同じ
抗原性決定因子を保持しおいるラテツクス粒子
ず、前蚘抗原性決定因子に察する抗䜓を保持し
おいるより小さいラテツクス粒子ずを混合す
る。遊離の抗原性決定因子はそれら皮類の粒
子の凝集を阻害する。凝集の皋床を枬定する
ず、もずの詊料䞭の抗原性決定因子の量の怜定
ができる。
これらのすべおの技術においお、既知量の抗原
性決定因子、すなわち察象タンパク質党分子、た
たは既知量の特定のタンパク質からコントロヌル
された条件䞋で誘導されたその察象タンパク質の
抗原特定性フラグメントを含む詊料に぀いお詊隓
を行な぀お埗た暙準倀を利甚する。䞀般的な技術
の詳现に぀いおは、Cambiaso等のJ.Immunol.
Methods 23291977に蚘茉がある。前蚘の
怜定のうち倧郚分の方法では、抗䜓党䜓の代わり
にそのabフラグメント䟋えばab′2フラ
グメントを䜿うのが奜たしく、そのこずに぀いお
はテクニコン・むンストルメンツ瀟の英囜特蚱第
2013688号明现曞に蚘茉がある。
呚知のようにIgEはアレルギヌ性反応に関䞎す
る免疫グロブリンである。特定のアレルギヌに察
するヒト血枅䞭のIgE抗䜓の存圚は前蚘アレルゲ
ンに察しおアレルギヌ性反応が起こるこずを瀺
し、そしお前蚘抗䜓の量はアレルギヌ性反応の匷
床を瀺す぀の芏準ずなる。特定のIgEを量的に
枬定できるずいうこずは、䟋えば患者がある薬に
察しおアレルギヌ性反応を起こすかどうかを評䟡
するために重芁である。たた、血枅䞭に存圚する
IgEの総量すなわち、皮皮の特異性を持぀IgE
抗䜓のすべおの合蚈を枬定できるずいうこずも
重芁である。しかし、ヒト血枅䞭に存圚するIgE
の総量は非垞に少量であり、そしおどのような特
定のIgE抗䜓も痕跡量しか存圚しないものであ
る。埓぀お非垞に鋭敏な詊隓技術が必芁であり、
そしお前蚘の型のタンパク質による干枉は重倧な
ものず考えられる。
血枅䞭の特定のIgEの存圚およびその量を確認
するために近幎䜿甚されおいる䞻芁な詊隓はいわ
ゆるRAST詊隓〔ラゞオアレルゎ゜ルベントテ
ストradioallrgosolbent test〕ず呌ばれる。
この詊隓においおは血枅たたは血液詊料を適圓な
アレルゲンを担持しおいる吞収剀デむスクず接觊
させお眮く。そのアレルゲンに察するIgE抗䜓は
もしそれがあればデむスク䞊でアレルゲンず
結合する。次にデむスクを掗い、そしおそれから
結合したIgEを125I暙識付けしたIgE抗䜓を䜿甚し
お蚈枬する。前蚘詊隓は回ごずに24時間かか
り、そしお攟射胜暙識IgEの䜿甚のためかなり苊
劎が倚くお高䟡である。
近幎ミニヌRAST詊隓ず呌ばれる倉化させた
RAST詊隓がGleichらによるJ.Allergy Clin.
Immunol.Vol 65No.第20〜28頁1980幎
月に蚘茉された。この詊隓においおは、怜定
するIgEは固盞アレルゲンにより遞択的に吞収さ
れる。次にこれを怜定するIgEの(c)フラグメン
トに察しお反応する攟射胜暙識抗血枅を䜿甚しお
怜定する。フラグメントはIgEを分解するための
ペプシンの䜿甚により圢成される。䜿甚する抗血
枅がIgE党郚に察しお反応するように産生するも
のではなく぀の䜍眮のみでIgEを分解する
ペプシンにより生じた特異的な(c)フラグメント
に察しお反応するように産生するこずを陀いおは
この方法は簡䟿なものであるずいうこずに泚意す
べきである。
本発明の奜たしい具䜓的䟋においおは、
RAST詊隓を倉化させお、デむスクずプロテア
ヌれずを接觊させ、結合したIgEを消化させる。
フラグメントはIgEの抗原特定性ずなるように補
造し、そしおそのフラグメントを次に量的に怜定
する。この消化技術はデむスクからの回収の粟密
床および再珟性を倧きく改良し、埓぀お詊隓方法
の感床および信頌床が増加する。
埓぀お本発明の別の芳点によれば、本発明は察
象倖のタンパク質からの干枉を排陀しそしお怜定
の特異性および正確性を改良した察象倖タンパク
質皮たたはそれ以䞊を含む生物孊的流動䜓䞭の
察象タンパク質を怜定する方法を提䟛し、この方
法は (a) 前蚘詊料を前蚘詊料䞭の前蚘察象タンパク質
にだけ遞択的に結合する反応䜓を担持する䞍掻
性固䜓支持材料ず接觊させ、 (b) 詊料から察象タンパク質を担持した前蚘支持
䜓材料を取り出し、 (c) 前蚘の取り出した察象タンパク質から察象タ
ンパク質の抗原特定性フラグメントを圢成する
条件䞋で前蚘の取り出した察象タンパク質を消
化し、そしお (d) 前蚘フラグメントを怜定し、その結果から液
䜓詊料䞭の察象タンパク質の量を決定する こずから成る。
この方法の䟋は次のようである。血枅詊料
50Όを宀枩で時間アレルゲンコヌテむン
グしたペヌパヌデむスクPharmacia Uppsala
Swedenずずもにむンキナベヌトする。生理食
塩氎で回掗぀た埌、このデむスクを宀枩で分
間ペプシンmgmlを含む0.15NHCl 150Όず
ずもにむンキナベヌトする。次に2Mトリスヒ
ドロキシメチルメチルアミン『TRIS』30ÎŒ
の添加により消化を停止する。IgEの抗原特定
性のペプシン抵抗性フラグメントを次に前蚘のラ
テツクス粒子法により決定する。このペプシン溶
離法により埗られた結果ず公知のRAST法によ
り埗られた結果ずを添付図面に瀺す。その䞭で、 オオアワガ゚リPhleum pratense 家塵だにDermotoph pteronyss 家塵Greer 家塵Hollister―Stier ダクチリスグロメレヌタDactylis
glomerata ネコ䞊皮Cat epithelium むヌ䞊皮Dog epithelium りマ䞊皮Horse epithelium オオバコPlantago lanceolate ペモギArtemisia vulgaris クラドスポリりムCladosporium
herbarum 烟色麹菌ケムカビAspergillus fumigatus である。
この倉性RAST怜定法は特定のIgE抗䜓を怜定
するための本発明の方法の奜たしい䞀般的方法の
䞀䟋にしかすぎないずいうこずを理解されたい。
すなわち、第に怜定察象の特定のIgEを他に存
圚するIgEから分離し、そしお次にIgEを酵玠的
に消化しそしおフラグメントを怜定する。もちろ
ん詊料䞭のIgEの総量を、本発明による簡単なペ
プシン消化およびひき぀づきIgEの総量に察しお
特定的なフラグメントの怜定を行うこずにより怜
定するこずもできる。これら぀の方法特定の
IgEの怜定および総IgEの怜定においおは同䞀
の抗䜓を䜿甚でき、このものはIgE党䜓の特城を
瀺すフラグメントに察しお産生された抗䜓であ
る。もちろん前蚘抗䜓は任意のIgEの消化により
圢成した前蚘フラグメントず結合する。前蚘の倉
性RAST法においお怜定の遞択性は、第に他
のIgEずの混合物から特定のIgEを分離するこず
により達成される。すべおのIgE怜定に察しお
皮類の抗䜓のみ䜿甚するこの技術は非垞に奜たし
い。ずいうのは少くずも理論䞊各各のIgE抗䜓の
抗原特定性フラグメントに察する抗䜓を補造する
こずは可胜であるけれども、そのような掻性抗
原特定性フラグメントはそれらの源䟋えばフ
ラグメントを埗た特定のヒトの特性を瀺す傟向に
あるため、異る人間から埗た同䞀のIgEの怜定に
おいお䜿うこずには利益がないからである。
前蚘倉性RAST法は第にタンパク質を固盞
に結合するこずにより䞍溶性にし、次に固盞を酵
玠ず接觊させおタンパク質を消化し、それから特
定性フラグメントを怜定するこずから成るタンパ
ク質を怜定するための本発明の䞀般的技術の䞀䟋
であるずいうこずを理解されたい。これの別の䟋
はネオネヌト䞭での甲状腺刺激ホルモンTSH
の定量であるH.BickelR.GuthrieおよびG.
HammersenNational Screening for Inborn
Errors of MetabolismBerlinSpringer、第
219〜228頁、1980幎を参照されたい。血液詊料
はフむルタヌペヌパヌデむスク䞊で集められ、こ
のものを次に也燥しお研究所ぞ送る。本発明によ
る也燥血液詊料のペプシン消化による回埩は容易
に行われる。ペヌパヌデむスク䞊の血液を集める
この方法は詊料の茞送で危険である堎合、埌進囜
においおだんだん䞀般的にな぀おきおいる。
さらに、怜定をプロテアヌれが豊富な生物孊的
流䜓䟋えば腞液たたは现胞抜出液に適甚しなけれ
ばならない堎合、完党なタンパク質分子よりもタ
ンパク質を分解したフラグメントの定量の方が有
甚である。別の適甚は现胞質膜䞭に混合した抗原
䟋えば奜塩基性膜䞭のIgEの定量である。消化は
膜からの抗原の抜出により容易に行われる。
本発明の方法においおは、RFおよび補䜓因子
からの干枉そしお他の非特異性タンパク質―タン
パク質盞互䜜甚からの干枉の危険はこれらのタン
パク質が慣習に埓぀おペプシンのような前蚘酵玠
により消化にかけられおいるため実質的に非垞に
枛少しおいる。さらに詊隓䞋、察象タンパク質の
フラグメント特性を怜定する堎合、抗䜓の亀さ反
応からの干枉もたた排陀される。䟋えば、HGH
に察する抗血枅はたたヒト胎盀ラクトゲン
HPLず亀さ反応するこずは圓業界にず぀お呚
知である。この型の干枉は本発明の方法により枛
少あるいは排陀される。別の䟋はFSHおよびLH
黄䜓化ホルモンであり、これらは抗䜓により
互いに識別するこずはできないが、しかしペプシ
ン消化の埌生成する異るフラグメントは抗䜓ず反
応でき、このこずによりフラグメントを識別でき
る。非特異的盞互䜜甚を排陀する本発明の効果の
説明ずしお抗䜓のab′2フラグメントを䜿甚
し、ケむオトロヌプ剀ずしお1M塩化ナトリりム
を䜿甚する総IgEの通垞の怜定においおは盞互䜜
甚を容認できる䜎い皋床たで枛ずるために血枅を
10倍に垌釈する必芁があるずいうこずがわか぀
た。しかし、本発明の方法を䜿甚すれば血枅詊料
の垌釈の必芁はない。䞡方の堎合の怜定は前蚘の
ラテツクス粒子法(a)により行われ、䜿甚する酵玠
はペプシンである。
本発明方法によれば、怜定䞋でタンパク質を消
化により最初に分解した時でも、怜定の感床を向
䞊させるこずができる。その理由は以䞋のずおり
である。タンパク質を動物に泚入するず、その動
物が産出する抗䜓は圓該タンパク質分子の皮皮の
領域を瀺す倚数の抗原性決定因子に察しおのもの
である。これらの抗原決定因子の䞭には、損われ
おいない完党タンパク質䞭の抗䜓に察しお近
づきにくいものがある。しかしながら、動物は接
皮されたタンパク質を生䜓的で郚分消化するこず
により、前蚘のような隠れた決定因子に察する抗
䜓を産生するこずができる。詊隓管内においお
は、ペプシンたたは他のプロテアヌれによる消化
によ぀お隠れた抗原性決定因子を発珟するこずが
でき、埓぀おそれら決定因子を目的ずする抗䜓を
それら決定因子ずの反応に含めるこずができ、結
果ずしお感床を向䞊を向䞊させるこずができるの
である。
前蚘の感床向䞊を瀺すものずしお、本発明者は
前蚘の䞀般ラテツクス粒子怜定技術(a)を䜿぀お本
発明の怜定の感床が0.5〜1.0IUmlになるのを芋
い出した。なお、同様の怜定ただしペプシンに
よる消化を行わないによる感床は〜10IU
mlであ぀た。䜿甚した特定の操䜜手順は以䞋のず
おりである。IgE含有詊料50Όずペプシン
mgml含有0.15N塩酞150Όずを混合し
た。宀枩で分間むンキナベヌトしおから2Mト
リスヒドロキシメチルメチルアミン30ÎŒ
を加えお消化を止めた。次にIgEフラグメン
トを前蚘のラテツクス粒子技術(a)によ぀お怜定し
た。
タンパク質の免疫孊的怜定法における埓来技術
の誀差の䞭には技術それ自䜓にではなく、悪条件
䞋での詊料の貯蔵たたは茞送に原因のあるものが
ある。怜定察象のタンパク質は枩床倉化により、
および詊料䞭に存圚するかたたは汚染バクテリア
から攟出されるプロテアヌれ䟋えばプラズミ
ンによ぀お倉質される可胜性がある。本発明に
よるプロテアヌれ䟋えばペプシンによる詊料の系
統的凊理および抗原暙的ずしおのペプチドタン
パク質分子党䜓ではなくの䜿甚は誀差の危険を
枛少させる。ペプチドは通垞、タンパク質に比
べ、倉質および曎には分解に察しお䞀局抵抗性が
高い。
本発明を曎に詳现に説明するために以䞋に実斜
䟋を蚘茉するが、これは本発明の範囲を限定する
ものではない。
䟋  (1) 抗原特定性IgEフラグメントの調補 IgE―骚髄腫患者からのIgEを硫酞アンモニり
ムの40飜和溶液で沈でんさせ、そしお0.05〜
0.5M線圢傟斜のTRIS―HCl緩衝液、PH8.0を䜿぀
おDEAE Sephadex ―50カラムPharmacia
䞊で分離した。次いでこのIgEをPBS䞭の
Ultrogel ACA ―LKBの2.5×100cmカラ
ム䞊のクロマトグラフむによ぀おさらに粟補し
た。最終生成物10〜15IgEの可胜な汚
染に぀いおはIgG、IgAおよびIgMを免疫比濁蚈
によ぀おチ゚ツクした。IgGだけが怜出されそし
おそれは党タンパク質の0.5より少い濃床であ
぀た。
IgEは0.1M酢酞塩緩衝液、PH4.5の䞭で24時間
37℃で酵玠性タンパク比率50重量重量
をも぀結晶性ペプシンで消化した。固䜓TRISで
PHを8.0に䞊げるこずによ぀おその反応は止めら
れた。そしおこの混合物をRBS䞭のUltrogel
ACA4―の2.5×100cmカラム䞊でろ過した。こ
のカラムによ぀お消化された混合物は分子サむズ
30000をも぀぀のピヌクず小さいペプチドの
぀のピヌクに分離された。第䞻ピヌク䞭の
Fc″フラグメントがIgEの抗原特定性フラグメン
トずしお遞ばれた。これはIgE酵玠性消化の既知
のフラグメントである。それはIgEのab′2ず
Fc郚分の䞡方に関係する抗原性決定因子を含有
する。
IgE50mgからFc″フラグメント玄1.5mgが回収さ
れたがそれは280nmE280 1%1cm18.06での吞収
によ぀お評䟡されたものであ぀た。凍結状態での
貯蔵䞭における凝集を避けるために、その物質は
アゞ化ナトリりムを含む塩氎䞭に℃に
保たれる。
1.5mgmlの濃床におけるFc″フラグメントの分
子量は32000ダルトンず評䟡された。
(2) Fc″フラグメントに察する抗血枅の調補 生理的食塩氎500Όおよび完党フロむンドア
ゞナバンド500Ό䞭のFc″フラグメント100Όを
週間毎に倚くの䜍眮に皮䞋泚射するこずによ぀
お、匹のニナヌゞヌランドラビツトにおいお
IgEのFc″フラグメントに察する抗血枅を産生さ
せた。その動物は第回の泚射埌に血を採られ
た。Fc″フラグメントに察し特異的でない抗䜓を
陀くためにIgG Sepharose免疫吞着カラムを通過
させるこずによ぀お抗血枅が特異的なものずし
た。
埗られた抗血枅の特異性をテストするために元
のIgEのab′2およびFcの䞡方で二重免疫拡散
テストを行぀た。その結果は抗血枅は専らFc″フ
ラグメントに向けられおいるこずを瀺した。この
ようにしおこの抗血枅は党䜓のIgE、すなわちFc
たたはab′2フラグメント、たたはε―鎖に察
しお向けられた抗血枅よりもすぐれおいる本発
明の分析目的に察しおが、それはその特異性が
熱および甚いるタンパク酵玠に抵抗のある決定芁
因に制限されるからである。
このようにしお䜜られる抗血枅はIgEの分析
そのFc″フラグメントを経由しおののための
本発明の方法においお䜿うこずができる。しかし
本発明者は分析においお抗䜓成分ずしお䜿うべき
そのab′2フラグメント調補のさらに粟補を䞋
蚘に述べる。
(3) 抗血枅のab′2フラグメントの調補 䞊蚘(2)で䜜぀た抗血枅をIgG抗䜓を沈んでさす
ように硫酞アンモニりムで凊理し、それを次に
DEAEセルロヌス䞊でクロマトグラフにかけ、そ
れから0.1M酢酞塩緩衝液PH4.5䞭で24時間37℃で
ペプシン消化にかけるが、このずき酵玠タンパ
ク質の比率50重量重量を甚いた。PHを
7.2に䞊げるために固䜓のTRISを添加するこずに
よ぀お反応を止め、そしお生成されたab′2を
1M塩化ナトリりム緩衝液ず1/5りん酞塩緩衝液
äž­PH7.2でUltrogen ACA ―カラム䞊でろ過
によ぀お回収した。濃瞮しそしお生理的食塩氎䞭
ぞ透析した埌ab′2フラグメントの〜mg
mlの郚分暙本をアゞ化ナトリりムの存圚
䞋に℃で貯蔵された。
(4) ab′2フラグメントでコヌチングしたラテ
ツクス 10重量䜓積ラテツクス0.8Ό懞濁液
100Όに、ab′2フラグメント300Ό党重量
1.2mgおよび倍に垌釈のグリシン緩衝食塩
氎0.17Mグリシンを0.1M NaCl䞭に含み
NaOHでPH9.2に調節しそしおアゞ化ナトリりム
保存剀0.4を含有800Όの混合物を加え
た。30分間宀枩に保枩した埌ラテツクスを床
倍垌釈のグシシン緩衝食塩氎mlで、そしお牛の
血枅アルブミンGBS―BSA10を含む
緩衝食塩氎mlで床掗぀た。GBS―BSA2mläž­
に再懞濁しそしお10秒間超音波凊理埌ラテツクス
を凍結也燥しそしお℃でよく栓をしたびんの䞭
に貯えた。毎日の䜿甚前にラテツクスを蒞留氎
200Ό䞭に再懞濁し、GBS―BSA1.8mlで垌釈し
そしお10秒間超音波凊理した。
党郚のIgGを䜿うずき〔そのab′2フラグメ
ントよりもむしろ〕、それは䞀般に同様な工合に
ラテツクス粒子䞊にコヌテむングされるこずがで
きる。
(5) 怜定手順 PACIAによる分析手順は本質的には次の通り
である。䞊蚘のように䜜られたすなわち抗血枅
たたはそのab′2フラグメントでコヌチングさ
れたラテツクスは分析されるべき詊料ず混合さ
れる。ラテツクスのあるものは凝集しおいるが残
りのものはそうではない。そこで凝集しないラテ
ツクスを算えるず、それは凝集したラテツクスの
量の蚈量を䞎え、それは分析しおいる詊料䞭の
IgEフラグメントの量の順次に瀺すものである。
人間の血枅においおは正垞なIgEずそしおアレ
ルギヌ性の応答に責任のある“抗䜓IgE”ずがあ
るものである。IgEの党䜓は党血枅をFc″フラグ
メントを生じるそしお他の血枅タンパク質を砎
壊するようにペプシン分析にかけるこずによ぀
お分析するこずができ、ここに生じたFc″フラグ
メントは次にラテツクスを䜿぀お分析される。そ
の代りずしおいずれかの遞択されたIgEを先ずそ
れを血枅から遞択的に抜出しそれから次にそれを
酵玠的に消化しおFc″フラグメントを䞎えるよう
にするこずによ぀お分析するこずができる。この
遞択的抜出は䟿宜的䞊述のようにRASTに察す
るものであるこずができ、すなわちそれはそのア
レルギヌ抗原に指向された特殊な“抗䜓―IgE”
ず遞択的に結合するアレルギヌ抗原をコヌチング
されたデむスクの䜿甚を含むこずができる。掗わ
れたデむスクは次にIgEを消化するようにそしお
それをFc″フラグメントに倉えるようにペプシン
ずい぀しよに保枩される。
血枅䞭の党郚のIgEの分析においおは、その血
枅は先ず等容積のフレオン113フレオンは登録商
暙であるで枅浄化され、枊動および円心分離を
分間5000回転分で行う。枅浄な䞊柄液の玄
100Όの郚分暙本を次に10分間37℃でHCl―ペプ
シン0.15モルHCl倍の再結晶
したペプシンずい぀しよに保枩する。モル
TRIS 20Όを添加しお消化を止める。こう
しおできた混合物を次にラテツクス粒子を䜿぀お
分析する。
䟋  詊料のペプシン凊理を䜿぀おのTSH分析 原理 カルボキシル化されたラテツクス粒子はTSH
を含む人間の粘液の抜出物のタンパク質は共有結
合でコヌチングされおいる。凝集は凝集剀ずしお
ラビツトの抗―TSH抗䜓ず人間のリりマチ因子
RFの混合物によ぀お起る。凝集は定量される
べきTSHによ぀お阻害される。詊料のペプシン
凊理は血枅の干枉を砎壊する。酵玠消化条件は
TSHが免疫孊的に反応性に残るそのような条件
であり、すなわちそれは実質的に消化によ぀お圱
響を受けない。
怜定 詊料凊理 リン酞塩で緩衝されそしお牛の血枅アルブミン
BSAを含有する塩類溶液である詊料10ÎŒ
をペプシンmlを含有する0.15NのHCl
100Όず混合する。保枩時間は宀枩で10分間ず
する。ペプシンによる消化を䞭止するように18
ポリ゚チレングリコヌルPEG6000を含有す
る0.3Na2HPO4100Όを添加する。
このように凊理された詊料30Όを匕続いおラ
ビツトの抗―TSHPBS―0.1BSA䞭に垌釈し
たもの30Ό、人間のRFPBS―0.1BSAäž­
に垌釈したもの30Όおよびラテツクス粒子
PBS―0.1BSA䞭に懞濁したもの30Όず混
合する。
保枩時間は37℃で25分ずする。この怜定系の感
床は0.1n TSHmlである。
【図面の簡単な説明】
添付図面はペプシン溶離法によ぀お埗られる結
果に぀いお、ラテツクス法ずRAST法ずの盞関
を瀺す盞関図である。 むはRAST法によるマむナス、ロはRAST法
によるプラス倀、ハはラテツクス法によるむナ
ス、そしおニはラテツクス法によるプラス倀を各
瀺す。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  怜定察象のタンパク質およびその他の皮た
    たはそれ以䞊の怜定察象倖のタンパク質を含む液
    䜓詊料ずタンパク質消化剀ずを混合し、抗原孊的
    に前蚘の察象タンパク質のみに特異的に存圚する
    フラグメントを前蚘の察象タンパク質が消化によ
    り前蚘混合物䞭に産生する条件䞋で、タンパク質
    消化を行うこずによ぀お、前蚘の察象倖タンパク
    質による干枉を軜枛ないし排陀し、そしお前蚘の
    特異的フラグメントに察する抗䜓ずの反応により
    該フラグメントを怜定し、そしおその結果から液
    䜓詊料䞭に存圚する前蚘の察象タンパク質の量を
    決定するこずから成る、察象倖タンパク質皮た
    たはそれ以䞊を含む液䜓詊料䞭の察象タンパク質
    の免疫孊的怜定法。  前蚘消化剀ずしお酵玠を䜿い、前蚘の察象タ
    ンパク質をその酵玠で分解しお特異的フラグメン
    トを産生する、前項に蚘茉の方法。  特異的フラグメントに察する抗䜓のab
    領域ず反応させるこずによ぀お特異的フラグメン
    トを怜定する、前項に蚘茉の方法。  抗䜓党䜓ず反応させるこずによ぀お特異的フ
    ラグメントを怜定する、前項に蚘茉の方法。  抗䜓のab′2フラグメントず反応させるこ
    ずによ぀お特異的フラグメントを怜定する、前項
    に蚘茉の方法。  埮现に分散した粒子の凝集皋床から察象タン
    パク質の量を枬定する粒子凝集法によ぀お特異的
    フラグメントを怜定する、前項に蚘茉の方法。  液䜓詊料ずしお生物孊的流䜓を䜿う、前項
    に蚘茉の方法。  タンパク質消化剀ずしおペプシン、パパむン
    およびトリプシンから遞んだ酵玠を䜿う、前項
    に蚘茉の方法。  (a) 怜定察象のタンパク質およびその他の
    皮たたはそれ以䞊の怜定察象倖タンパク質を含
    む生物孊的流䜓詊料ず前蚘詊料䞭の前蚘察象タ
    ンパク質にだけ遞択的に結合する反応䜓を担持
    する䞍掻性固䜓支持䜓材料ずを接觊させ、 (b) 詊料から、察象タンパク質を担持した前蚘支
    持䜓材料を取り出し、 (c) 前蚘の取り出した察象タンパク質から抗原孊
    的に察象タンパク質のみに特異的に存圚するフ
    ラグメントを圢成する条件䞋で前蚘の取り出し
    た察象タンパク質を消化し、そしお (d) 前蚘の特異的フラグメントに察する抗䜓ずの
    反応により該フラグメントを怜定し、その結果
    から液䜓詊料䞭の察象タンパク質の量を決定す
    る こずから成る、察象倖タンパク質による怜定干枉
    を排陀し、怜定の特異性ず正確性ずを改良した、
    察象倖タンパク質皮たたはそれ以䞊を含む生物
    孊的流䜓詊料䞭の察象タンパク質の怜定方法。  前蚘の察象タンパク質ずしお特定IgE抗䜓
    を䜿い、前蚘の察象倖タンパク質が前蚘の䞍掻性
    固䜓支持䜓材料䞊の反応䜓ず結合できない他の
    IgE少くずも個を含んでいるものを䜿う、前項
    に蚘茉の方法。  䞍掻性固䜓支持䜓材料ずしお特定IgEに察
    するアレルゲンを担持するシヌト状材料を䜿う、
    前項に蚘茉の方法。  工皋(d)においお特異的フラグメントをそれ
    ず反応性のある抗䜓のab領域ずの反応によ
    ぀お怜定し、そしおその怜定を粒子凝集法によ぀
    お行う、前項に蚘茉の方法。  特異的フラグメントを抗䜓党䜓ずの反応に
    よ぀お怜定する、前項に蚘茉の方法。  特異的フラグメントを抗䜓のab′2フラ
    グメントずの反応によ぀お怜定する、前項に
    蚘茉の方法。  工皋(c)における消化を酵玠によ぀お行う、
    前項に蚘茉の方法。  (a) 怜定察象のタンパク質の詊料に぀いお
    皮皮の条件䞋で予備的な酵玠的消化を行い、生
    成するタンパク質分画を分離し、抗原孊的に前
    蚘の察象タンパク質のみに特異的に存圚するフ
    ラグメントを産生する消化条件を決定し、 (b) 前蚘工皋(a)で決定した消化条件を䜿぀お、怜
    定察象のタンパク質およびその他の皮たたは
    それ以䞊の怜定察象倖タンパク質を含む液䜓詊
    料を酵玠的に消化し、 (c) 消化を止め、そしお (d) 埗られる混合物を怜定しおその䞭における抗
    原孊的に察象タンパク質のみに特異的なフラグ
    メントの量を決定し、そしおその結果から液䜓
    詊料䞭の察象タンパク質の量を決定する こずから成る、前蚘の察象倖タンパク質からの干
    枉を軜枛ないし排陀する、察象倖タンパク質皮
    たたはそれ以䞊を含む液䜓詊料䞭の察象タンパク
    質の怜定方法。  液䜓詊料ずしおヒトの血枅を䜿い、酵玠ず
    しおペプシンを䜿い、工皋(d)における特異的フラ
    グメントの怜定を埮现に分散した粒子の存圚䞋で
    特異的フラグメントに察する抗䜓ab領域ず
    の反応によ぀お行い、前蚘粒子の凝集の皋床を枬
    定するこずによ぀お特異的フラグメント量を決定
    する、前項に蚘茉の方法。  特異的フラグメントに察する抗䜓党䜓ずの
    反応によ぀お怜定を行う、前項に蚘茉の方
    法。  特異的フラグメントに察する抗䜓の
    ab′2フラグメントずの反応によ぀お怜定を行
    う、前項に蚘茉の方法。
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