KR100606864B1 - 이뮤노에세이 - Google Patents

Abstract

물에 난용성인 단백질, 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 시료로부터 높은 추출효율을 유지한 채로 후속되는 면역반응에 보다 예민하고 간편하게 검출될 수 있는 방법을 제공한다.

시료중의 수 난용성의 단백질, 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 비교적 고농도의 이온성 계면활성제 함유 수성 용매에 의해 추출/가용화하고, 이어서 해당 추출액 중의 단백질을 단백질을 이온성 계면활성제로 변성시킨 단백질에 대하여 얻어진 항체를 사용하여 직접 검출하는 것을 특징으로 하는 고감도이며 간편한 이뮤노에세이.

이뮤노에세이, 수 난용성 단백질, 추출하기 어려운 단백질, 이온성 계면활성제

Description

이뮤노에세이{Immunoassays}

본 발명은 물에 난용성인 단백질 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 고감도로 측정하는 이뮤노에세이에 관한 것이다.

분자생물학의 급속한 진보에 수반하여 이뮤노에세이의 검출 감도 향상에 대한 요구는 당연히 높아지고 있다. 생명과학 분야에서는 막결합형의 각종 세포 표면 단백질이 세포내, 또는 세포간 정보 전달에서 극히 중요한 역할을 담당하고 있는 증거가 매일 집적되고 있다. 이들 세포 표면 단백질은 동물간, 또는 조직간에서 다양한 서브타입으로서 발현되며 또 그 시간적, 공간적 발현 벡터는 엄격하게 제어되고 있다. 따라서, 오늘날의 생명과학에 있어서 해당 세포 표면 단백질을 고감도로 추출하는 것은 각종 생명 현상의 이해상 불가결한 과제로 되어 있다. 그러나, 대부분의 막 결합형 세포 표면 단백질은 이온성 계면활성제를 포함하지 않는 수성 용매에 불용성/난용성이든가, 추출하기 어렵다.

또한, 공중위생 분야에서도 고감도 이뮤노에세이에 대한 요구는 이전보다 더욱 높아지고 있다. 유전자 조작 식물의 사용이나 BSE, 식물 알레르겐 등에 대한 소비자의 관심이 높아짐에 따라 식품 제조업자는 이들의 고감도 검출을 요구받고 있다. 특히, 가공식품중에 존재하는 경우, 식물 알레르겐 등의 단백질은 이들 자체는 물에 가용성이어도 그 가공식품중의 다른 성분과 복잡한 복합체를 형성하여, 이온성 계면활성제를 포함하지 않는 수성 용매를 사용하여서는 용이하게 가공식품으로부터 추출되지 않는 것이 경험되어 있다. 예컨대, 밀을 사용한 가공식품중에 포함되는 단백질은 밀 유래의 글루텐과 극히 견고하게 결합되어 있기 때문에, 이온성 계면활성제를 포함하는 수성 용매를 사용하지 않으면 해당 단백질을 충분하게 추출할 수 없다.

그러나, 그와 같은 물에 용해되기 어려운/추출하기 어려운 단백질의 존재를 고감도로 이뮤노에세이에 의해 검출하기 위해서는 극미량의 해당 단백질의 존재도 확인할 수 있도록 해당 에세이에 사용되는 항체의 특이성과 친화성을 향상시킬 것이 요구되지만, 그와 같은 특이성 및 친화성의 향상을 위해서는 일정한 한계가 있다.

따라서, 그와 같은 고감도 이뮤노에세이에서는 항체의 특이성 및 친화성 향상 이외에도 에세이 전체의 실험계획을 변경할 필요가 있다. 특히 측정 대상인 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 보다 효과적으로 추출하는 것은 에세이 전체의 감도를 비약적으로 향상시킬 것으로 고려되어, 해당 목적을 위해 도데실 황산나트륨(SDS)으로 대표되는 이온성 계면활성제를 사용하여 수 난용성 단백질 등을 가용화/추출하는 것이 극히 유력한 수법으로 될 수 있다. 그러나, 한편으로, 그와 같은 이온성 계면활성제는 후속되는 이뮤노에세이에서 항원-항체 반응도 저해하는 것으로 보여지고, 지금까지 고감도 이온성 계면활성제의 존재하에서 항원-항체 반응을 실시하는 것은 피하여 왔다.

요컨대, SDS 등의 이온성 계면활성제의 비교적 고농도로 극히 효율좋게 추출한 단백질을 종래의 면역측정법에 의해 측정하는 경우에는 미리 해당 추출액으로부터 이온성 계면활성제를 제거하든가, 또는 추출액을 충분하게 희석시켜 이온성 계면활성제의 농도를 면역반응에 악영향을 주지 않는 것으로 보여진 정도까지 저하시킬 필요가 있었다. 구체적으로는, 1) 해당 추출액을 셀로판 튜브 등을 사용하여 희석하거나, 2) 원심농축기 등을 사용하여 계면활성제를 포함하지 않는 용액으로 치환하거나, 3) 겔 여과나 이온 교환 크로마토그래피에 의해 계면활성제를 포함하지 않는 용액으로 치환하거나, 4) 화학물질을 첨가하여 계면활성제만을 침전시키는 방법 등에 의해, 추출액중의 이온성 계면활성제의 농도를 감소시키기 위한 전처리가 실시되고 있었다. 그러나, 이온성 계면활성제는 단백질과 용이하게 미셀을 형성하기 때문에, 계면활성제만을 제거하는 것은 매우 곤란한 경우가 많고, 상기의 제거 처리를 실시하는 것에 의해 목적하는 단백질의 회수율이 현저히 저하되는 원인으로 되기도 하며, 애초부터 해당 전처리 자체가 번잡한 것이다. 또한 다른 방법으로서 해당 이온성 계면화성제의 농도 저하를 위하여 추출액 전체를 대폭으로 희석시킨 것은 측정해야할 추출 단백질의 농도도 동시에 저하시키게 되어 버리므로, 결국 후속되는 면역반응을 유효하게 실행시키는 것은 양립되지 않을 것이라 여겨지고 있다.

특허문헌 1은 이온성 계면활성제인 SDS의 존재하에서의 항원-항체반응에 관하여 기재하고 있다. 상기 문헌은 불안정한 구조를 갖는 혈장 단백질 CETP(콜레스테릴 에스테르 전송 단백질)의 안정적이고 또 교차반응이 없는 이뮤노에세이에 관 한 것이고, 해당 에세이에서는 CETP를 0.001 내지 10% (W/V)의 SDS로 전처리한다. 또한 각 문헌에서는 CETP와 그 항체와의 사이의 항원-항체반응이 0.001 내지 0.3% (W/V)의 SDS 존재하에서도 실행될 수 있지만, 실제로 그 때 바람직한 범위는 0.02 내지 0.03% (W/V)으로 되어 있고, 실시예에서는 0.25% SDS로 전처리시킨 CETP를 또한 11배 희석(20 ㎕의 항체 용액을 첨가)시키고 SDS 농도를 약 0.023% 정도로 조정하여 상기 항원-항체 반응을 실시하고 있다.

즉, 해당 문헌도 SDS로 대표되는 이온성 계면활성제는 적어도 0.03% 이상의 농도에서 이뮤노에세이에 따른 항원-항체 반응을 저해한다는 전제에 있고, 항원-항체반응의 실행시에는 고농도의 SDS 함유 시료를 충분하게 희석시켜 SDS 농도를 0.03% 이하로 감소시켜야할 것을 교시하고 있는 것이다.

[특허문헌 1] 특개평 9-77798호 공보(제5쪽, 우측 칼럼, 제0030 단락; 제6쪽, 좌측칼럼, 제0033단락; 제10쪽, 좌측칼럼, 제0051단락)

발명의 개시

발명이 해결하고자하는 과제

따라서, 본 발명은 극히 고감도로 검출될 것이 요구되는 것과 같은, 물에 난용성인 단백질, 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 시료로 부터 높은 추출효율을 유지한 채로 후속되는 면역반응에 의해 예민하고 또 간편하게 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

지금까지 일반적으로 고려되어 온 것과는 달리, 많은 경우, 항원항체 반응 자체는 고감도의 이온성 계면활성제의 존재하에서도 검출불능인 레벨까지 저해되지 않는다는 놀랄만한 사실을 얻었다. 또한 외관상 항원항체 반응이 고농도의 이온성 계면활성제에 의해 저해되는 것과 같은 일부의 단백질에서도 상기 단백질을 이온성 계면활성제로 변성시키고, 해당 변성 단백질에 대하여 얻어진 항체를 이용하면 상기 항원항체반응이 만족될 만큼 실시될 수 있는 것을 밝혀내었다. 본 발명자는 이러한 발견을 기초로하여, 물에 난용성인 단백질, 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질의 고감도이며 간편한 면역학적 측정법을 완성시켰다. 즉, 본 발명에 의하면, 시료중에 함유되는 물에 난용성인 단백질 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 비교적 고농도의 이온성 계면활성제 함유 수성 용매에 의해 추출/가용화시키고, 이어 얻어진 추출액의 용매 치환없이 또는 검출불능인 레벨까지 상기 단백질의 농도를 저하시킴 없는 것과 같이 추출액을 본질적으로 희석함없이 직접 면역학적 측정법에 의해 추출액중의 단백질을 검출하는 것을 특징으로하는 고감도이며 간편한 이뮤노에세이를 제공할 수 있다.

그리고, 본 발명은,

시료중의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 존재를 검출하기 위한 면역학적 측정법에 있어서, 이하의 공정,

(I) 시료중의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 이온성 계면활성제를 포함하는 수성 용매로 추출 및/또는 가용화하는 공정,

(II) 공정(I)에서 이용하는 이온성 계면활성제로 미리 변성시킨 상기 수 난 용성/추출하기 어려운 단백질을 면역원으로하여 얻은 항체를,

a) 상기 공정(I)에서 얻은 단백질 용액에 대하여 용액을 실질적으로 희석함없이 첨가하든가; 또는

b) 상기 공정(I)에서 얻은 단백질 용액을 그 이온성 계면활성제 농도가 0.03%(W/V) 이하로 되지 않는 범위로 희석시킨 희석액에 대하여 첨가하는;

것에 의해 상기 수 난용성/추출하기 어려운 단백질과 상기 항체와의 사이에서 항원-항체 복합체를 형성시키는 공정, 및

(III) 형성된 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 측정법을 제공한다.

상기 공정(I)에서 수성 용매중의 이온성 계면활성제의 농도가 예컨대 0.3% (W/V)를 초과하는 경우에서도, 해당 수성 용매로 추출한 시료(단백질) 용액내에서의 항원-항체 복합체 형성이 저해되지 않는 것이 밝혀졌다. 즉, 상기 공정(II)에서 항원-항체 복합체는 0.3%(W/V)를 초과하고, 적합하게는 1%(W/V) 이상의 이온성 계면활성제의 존재하에서도 형성될 수 있다. 또는, 정량성의 확인 등의 목적으로 해당 시료 용액을 희석할 필요가 있는 경우에서도 이것은 양호한 항원-항체 반응에서 필요하다고 종래부터 믿어온 0.03%(W/V) 이하의 이온성 계면활성제 농도까지의 희석을 의도할 필요는 없고, 이것은 본 발명의 방법이 이온성 계면활성제가 갖는 높은 추출력을 희생함없이 실시할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 이온성 계면활성제는 도데실 황산 나트륨, 도데실 황산 리튬, 라우릴사르코신 나트륨, 브롬화 헥사데실트리메틸 암모늄, 염화 헥사데실트리메틸 암 모늄, 염화 헥사데실 피리디늄 등으로 부터 선택할 수 있고, 경우에 따라서는 이들을 혼합하여도 차이가 없다. 특히 해당 이온성 계면활성제로서 생화학 분야에서 많이 사용되는 도데실 황산나트륨(SDS)가 그 입수 용이성의 점에서도 바람직한 것으로 예시될 수 있다.

공정(I)의 수성 용매는 단백질을 또한 변성시킬 수 있는, 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨 등의 환원제를 포함할 수 있는 것이 명확하게 되었다. 따라서, 바람직한 공정(I)의 수성 용매의 비제한적인 예로서 1% (W/V)의 도데실 황산 나트륨 및 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 수성 용매를 들 수 있다.

또한 측정의 안정성 및 재현성을 확보하기 위하여, 상기 공정(I)에서 단백질 용액을 또한 끓이는 것이 바람직하며, 이러한 끓임은 적어도 80℃ 이상에서 5분 이상 계속되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 추출하기 어려운 상태에 있는 오보알부민, 오보뮤코이드, 카제인, β-락토글로불린, 메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질의 고감도 측정에 특히 유리하다. 오보알부민, 오보뮤코이드 및 카제인 등은 그 자체 물에 쉽게 용해되지만, 이들의 단백질이 가공식품 등의 복잡한 매트릭스중에 존재하는 경우 통상의 수성 용매로는 추출이 곤란한 경우가 있다. 본 발명의 방법은 그와 같은 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질의 고감도 측정에서 극히 유효하게 이용될 수 있다.

이와 같이, 이온성 계면활성제가 갖는 우수한 단백질 가용화 효과와 고농도의 이온성 계면활성제의 존재하에서 항원-항체 반응에 대한 새로운 발견을 기초로 한 본 발명의 방법은, 물에 난용성인 단백질, 또는 추출하기 어려운 상태에 있는 단백질을 고감도로 검출하는 것이 요구되는 것과 같은, 오늘날의 생명과학 연구나 식품의 품질보증에서 극히 유효하게 이용될 수 있는 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명이 대상으로 하는 "수 난용성/추출하기 어려운 단백질"은 이온성 계면활성제를 포함하지 않는 순수 또는 일반적으로 사용될 수 있는 생리학적 완충액에 대하여는 실질적인 용해성을 나타내지 않든가 또는 단순히 이들 완충액에서는 실질적으로 시료로부터 추출될 수 없는 단백질이고, 이들 단백질은 본 발명의 이온성 계면활성제를 포함하는 완충액류에 의해 이어지는 이뮤노에세이에 의한 검출이 가능한 농도까지 가용화되며, 또는 추출될 수 있다. 다시 말해, 본 발명에 따른 "수 난용성/추출하기 어려운 단백질"은 이온성 계면활성제를 포함하지 않는 순수나 완충액류에 대하여 용해도 및/또는 추출효과를 비교한 경우, 이온성 계면활성제를 함유하는 완충액 등에 대하여 의미있게 높여진 용해도 및/또는 추출효율을 나타낸다. 통상 본 발명의 대상으로 되는 "수 난용성/추출하기 어려운 단백질"은 이온성 계면활성제를 포함하지 않는 순수나 완충액류의 용해도 및/또는 추출효율과 비교하여 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 50배 이상의 용해도 및/또는 추출효율을 본 발명의 이온성 계면활성제 함유 완충액에 대하여 나타낼 수 있다. 이와 같은 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 비한정적인 예로서는 구조 단백질이나 막 결합성의 세포 표면 단백질을 들 수 있다. 특히 세포 표면 리셉터나 세포 부착 인자 등의 생화학적으로 중요한 기능을 담당하는 막 단백질이 흥미가 깊 다. 그외의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 예로서 가공식품 등의 내부에 존재하는 식물 알레르겐 단백질을 들 수 있다. 예컨대, 오보알부민, 오보뮤코이드, 카제인, β-락토글로불린, 메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질은 식물 알레르겐 단백질로서 중요한 것으로 고려되고 있다. 이들 단백질은 그 자체가 물에 가용성인 것을 포함하지만, 가공식품 내에서 해당 식품중의 다른 성분과 강하게 복합체화되어 그 매트릭스에 조립되는 것에 의해 추출하기 어려운 상태에 놓이는 경우가 있다. 이와 같은 추출하기 어려운 상태에 놓여진 수가용성 단백질도 본 발명의 이온성 계면활성제의 효과에 의해 처음으로 추출가능하게 되는 것이면, 여기서 말하는 수 난용성/추출하기 어려운 단백질에 포함될 수 있다.

본 발명에서 말하는 "시료"라는 것은 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 액체, 반고체 또는 고체중의 어느 하나 또는 그 혼합물일 수 있지만, 유리하게는 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 조립하는 고체 매트릭스를 포함하는 것일 수 있고, 예컨대 세포나 세포막, 조직, 기관 이외에 식품이나 재질 등을 포함하는 것이지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에서 상기의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 이온성 계면활성제를 포함하는 "수성 용매"로 가용화/추출한다. 상기 "수성 용매"는 순수; 염화나트륨, 염화칼륨 및 중탄산나트륨 등의 염 용액; 생화학 분야에서 통상 이용되는 각 완충액, 예컨대 인산 완충액, Tris-염산 완충액 및 시트레이트 완충액; 수산화 나트륨 또는 염산 등으로 pH를 조절시킨 알칼리성 용액 또는 산성 용액 등을 기본으로 한 용매를 의미한다. 또한 상기 수성 용매는 단백질의 용해도나 추출 효 율을 추가적으로 향상시키는 보조 성분으로서 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트 화합물, 포스포리파제와 같은 효소류 및 HLB가 조절을 위한 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 또한 상기 수성 용매에는 추출중 또는 보존중의 용액내에서 단백질의 분해를 제어하기 위한 프로테아제 저해제나 미생물의 번식을 방지하는 아지드화 나트륨 등의 항균성 물질, 아스코르빈산 등의 산화방지제를 첨가하여도 좋다. 또한 상기 수성 용매에는 후속되는 이뮤노에세이를 실시불능으로 하지 않는 범위에서 글리세롤이나 에탄올 등의 극성 유기 용매를 첨가할 수 있다.

상기 수성 용매에 첨가되는 본 발명의 이온성 계면활성제는 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 가용화나 추출을 실질적으로 향상시킬 수 있는 것이면 공지된 것중 어떤 것이나 사용하여도 상관없다. 적합하게는 상기 이온성 계면활성제는 도데실 황산 나트륨, 도데실 황산 리튬, 라우릴 사르코신 나트륨, 브롬화 헥사데실 트리메틸암모늄, 염화 헥사데실트리메틸암모늄, 염화 헥사데실 피리디늄 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특히, 입수 용이성이나 취급성 관점에서는 도데실 황산 나트륨(SDS)을 적합한 이온성 계면활성제의 예로서 들 수 있다. 특히 SDS는 SDS-Page 등의 전기 영동법에서 이용될 수 있는 범용의 이온성 계면활성제이고, 상기 전기영동과 이뮤노에세이의 상관을 용이하게 하는 목적 등에서도 바람직한 이온성 계면활성제이다.

첨가되는 이온성 계면활성제의 농도는 본 발명의 대상으로 되는 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 실질적인 가용화나 추출을 달성할 수 있는 농도이면 어떠한 농도이어도 상관없지만, 통상은 0.1%(W/V) 이상, 바람직하게는 0.3% (W/V) 초 과, 0.5% (W/V) 이상이어도 어떠한 차이가 없다. 보다 바람직하게는, 1% (W/V)의 이온성 계면활성제가 상기 수성 용매에 첨가될 수 있고, 10% (W/V) 정도의 고농도의 이온성 계면활성제도 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서는 그와 같은 고농도의 이온성 계면활성제를 함유하는 수성 용매에 의해 가용화/추출된 단백질도 이온성 계면활성제의 농도를 실질적으로 유지한 상태로 후속되는 이뮤모에세이에 의해 검출된다.

또한 본 발명의 특히 바람직한 수성 용매에는 상기의 고농도의 이온성 계면활성제에 더하여 2-머캅토에탄올이나 디티오트레이톨(DTT), 시아노붕소수소화 나트륨(SCBH), 디메틸 아민 보란(DMAB), 수소붕소화 나트륨(SBH) 또는 시스테인으로 대표되는 환원제를 첨가하는 것도 바람직하다. 그 원리는 명확하지 않지만, 상기 환원제의 첨가에 의해 후속되는 이뮤노에세이의 재현성이 향상되는 것이 자주 경험되기 때문이다. 적합하게는 상기 환원제가 1mM 내지 2M 정도의 농도, 통상 1M 정도의 농도로 수성 용매에 첨가될 수 있다.

이상에 의해, 보다 바람직한 본 발명의 이온성 계면활성제 함유 수성 용매는 1% (W/V)의 도데실 황산 나트륨 및 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 인산 완충액 등 일 수 있다.

이미 분명한 바와 같이, 본 발명의 방법의 이점은 높은 단백질 가용화 능력을 갖는 이온성 계면활성제에 의해 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 가용화/추출하고, 얻어진 추출용액을 실질적으로 희석함없이 계속되는 이뮤노에세이에 제공하는 점에 있다. 종래의 기술 상식으로는, SDS로 대표되는 이온성 계면활성제가 비 교적 고농도(예컨대 0.03% 이상)로 반응액내에 존재하면, 소망하는 항원-항체반응이 달성되기 어려운 것으로 생각되어 왔다. 따라서, 수 난용성/추출하기 어려운 단백질에 관한 전형적인 종래의 이뮤노에세이에서는 고농도의 이온성 계면활성제를 포함하는 시료 용액으로 항체를 첨가하기 앞서, 시료 용액에 대한 번잡한 전치리나 대폭적인 희석이 필요하여 왔고, 즉 상기 전처리나 희석에 의해 시료용액중의 이온성 계면활성제의 농도를 0.03% 정도로 까지 감소시킨 후에 항원-항체반응을 실시하여 온 것이다. 따라서, 예컨대 10% (W/V)의 SDS를 포함하는 수성 용매에 의해 추출한 난용성 단백질을 포함하는 시료 용액은 항원-항체 반응의 실시에 앞서서 적어도 300배 희석(0.03% - SDS)될 필요가 있고, 이것은 동시에 상기 단백질의 검출 감도를 300분의 1로 저하시키는 것을 의미한다.

이에 대하여, 본 발명의 방법에서는 항원-항체 반응 잔체가 꽤 고농도인 이온성 계면활성제의 존재하에서 충분하게 실시될 수 있고, 그와 같은 항원-항체 반응의 특이성 및 친화성은 목적하는 단백질을 동일한 이온성 계면활성제로 변성시킨 변성 단백질에 대한 항체의 사용에 의해, 현저하게 개선된다고하는 신규한 발견에 기초로 하며, 예컨대 1% SDS 함유 수성 용매로 가용화시킨 단백질의 용액을 실질적으로 희석시킴 없이 계속되는 항원-항체 반응을 위한 시료 용액으로 사용하여 에세이 전체의 감도 향상을 도모하는 것이다. 또는 본 발명의 방법에서는 10%(W/V) 이상의 SDS를 포함하는 용매로 가용화시킨 난용성 단백질을 10% SDS 용액 그대로 항원-항체 반응에 의해 측정하는 것도 가능하다. 또한 당연하지만, 시료용액중의 항원 단백질량을 정확하게 정량하는 경우에는 측정의 직선성을 확인하는 것 등을 목 적으로 상기 용액을 적당하게 단계적으로 희석할 필요도 있을 수 있다. 본 발명에서는 그와 같은 단계적 희석에서도 시료 용액의 SDS 농도를 저하시키는 것을 목적하는 할 필요는 없고, 이것은 SDS 농도의 저하에 의한 수 난용성 단백질의 추출의 위험성도 회피할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 고농도의 이온성 계면활성제를 포함하는 시료용액을 경우에 따라 희석하는 경우에서도 그 이온성 계면활성제 농도를 적어도 0.03% (W/V) 이하로 할 필요가 없다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 중요한 구성의 하나는 특정의 이온성 계면활성제에 의해 미리 변성된 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 면역원으로서 면역동물 등에 투여하고, 해당 면역동물에 유래하는 단백질에 대한 특이항체를 사용하여 항원-항체 반응에 기본하여 이뮤노에세이를 실시하는 것이다.

보다 구체적으로, 어떤 수 난용성/추출하기 어려운 단백질이 SDS를 포함하는 수성 용매에 의해 시료로 부터 추출가능한 것이 알려져 있으면, 본 발명의 항체 작성에 있어서 상기 단백질을 SDS로 변성시키고 그 변성 단백질을 면역원으로 하여 면역동물에 투여한다. 여기서, 단백질의 변성은 간편하게는 측정 대상인 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 고농도의 이온성 계면활성제 함유 용액에 용해 또는 현탁시키고, 하룻밤 이상 실온에서 방치하여 두는 것만으로 달성할 수 있다. 또한 단백질의 가용화/추출을 위한 수성 용매가 2-머캅토에탄올과 같은 추가의 환원제를 SDS와 함께 포함하는 본 발명의 바람직한 예에서는 항원 단백질의 변성을 상기 2-머캅토에탄올과 SDS의 존재하에서 실시하는 것이 바람직하다. 예컨대 측정 대상인 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 1% SDS와 1M의 2-머캅토에탄올을 포함 하는 수성 용매에 현탁/용해시키고, 이것을 실온에서 하룻밤 이상 방치하여 본 발명의 항체 작성에 이용되는 변성 단백질 면역원으로서 할 수 있다.

상기와 같이하여 수득한 변성 단백질을 면역동물에 투여하는 것은 당업자에게 알려진 공지된 것중 어느 한 방법을 사용할 수 있으며, 이와 같은 방법의 최적화도 당업자에게는 용이할 것이다. 면역동물로서는 마우스, 래트, 양, 토끼 등을 사용할 수 있다.

특히, 본 발명의 항체를 폴리클로날 항체의 형태로 사용하는 경우, 상기 폴리클로날 항체는 면역동물의 항혈청으로부터 제조한다. 구체적으로, 상기 면역동물로 부터의 항혈청은 예컨대 보조제(adjuvant)를 포함하는 상기 면역원을 면역동물에 피하주사하고, 그 피하주사를 적당한 간격(예컨대 1 주간)으로 소정 회수(예컨대 5회) 반복하여 최종 면역후에 전혈을 채집하고, 이것을 분리하는 것에 의해 얻을 수 있다. 그와 같은 방법은 예컨대 "Current Protocols in Immunology, 제2.4장 (발행처: John Wiley & Sons, Inc., New York)" 등에 기재되어 있다. 이어서, 상기 항혈청으로부터의 폴리클로날 항체의 정제는 동물의 면역에 사용된 변성 단백질을 크로마토그래피용의 수지, 예컨대 CNBr 활성화 세파로오스나 HiTrap NHS-activated (Amersham Pharmacia 제조)에 공유결합으로 고상화되고, 그 고상화 수지에 상기 항혈청을 제공하여 항혈청중의 항체를 특이적으로 수지상에 흡착시킨 다음 상기 수지상에 흡착된 항체를 적절한 완충액이나 카오트로픽 이온 등을 사용하여 용출시켜 회수하는 것에 의해서도 달성할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 항체를 모노클로날 항체로서 얻는 경우는, 당업자에게 공지된 수법을 이용하여, 면역시킨 마우스의 비장세포와 골수종 세포주 등의 세포융합용의 양친세포를 융합시켜 얻은 하이브리도마중 적합한 것을 선택하여 클론화하고, 이어서 그 융합 세포를 생체외 또는 생체내에서 배양하며, 이 배양혼합물로 부터 특이성이 높은 모노클로날 항체를 채집한다.

또한 본 발명의 항체로서는 상기한 바와 같은 폴리클로날/모노클로날 항체 이외에, 이들의 항체를 효소 소화 처리시켜 얻을 수 있는 것과 같은 해당 항체의 반응성 단편도 사용될 수 있다. 해당 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, V(v) 단편, H쇄 단량체 또는 이량체, L쇄 단량체 또는 이량체, 1개의 H쇄 및 1개의 L쇄로 구성된 이량체 등을 포함할 수 있다. 상기 단편은 예컨대 펩신이나 파파인 등의 프로테아제에 의해 완전한 항체를 소화하든가, 소화후, 필요에 따라서 환원제로 처리하는 것에 의해 얻을 수 있다. H쇄 및 L쇄 단량체는 완전한 항체를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리시킨 후 정제시킨 쇄상체를 분리하는 것에 의해 얻을 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 이온성 계면활성제 변성 단백질에 대한 항체를 이용하여 측정을 실시하는 것이 바람직하지만, 어떤 종의 단백질에 있어서는 그와 같은 변성 단백질에 대한 항체가 반드시 필요한 것은 아니고, 천연형(Native)의 단백질에 대한 항체를 사용하여도 허용가능한 검출을 실시할 수 있음이 분명해졌다. 그러나, 일반적으로, 그와 같은 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 검출에서는 이온성 계면활성제를 포함하는 시료 용액의 방치 시간에 비례하여 검출 감도가 감소 되는 것이 관찰되었다. 즉, 특정의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 이온성 계면활성제 함유 수성 용매로 추출한 후, 이것을 비교적 단시간내에 후속되는 항원-항체 반응에 제공하는 경우에는 비교적 안정한 항원-항체 복합체의 형성이 확인되지만, 추출후 시간이 경과함에 따라서 해당 복합체의 형성율이 감소되었다. 이것은 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 이뮤노에세이에서는 시간의존적으로 에세이의 재현성이 손상되는 것을 의미한다.

이에 대하여, 본 발명의 변성 단백질에 대한 항체를 사용하는 경우, 그와 같은 시간경과에 따른 변화는 미소하고, 특히 미리 추출액을 끓인 경우에서 재현성이 높은 에세이를 실시할 수 있는 것이 밝혀졌다. 즉, 본 발명의 보다 바람직한 양태로서는 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 고농도의 이온성 계면활성제 함유 수성 용매로 추출하고, 이어 얻어진 단백질 용액을 끓이는 것, 즉 적어도 80℃ 이상의 온도에서 5분 이상 가열시키고, 냉각후, 해당 용액에 대하여 이온성 계면활성제 변성 단백질에 대한 항체를 첨가하여 항원-항체 복합체를 형성시키는 것을 들 수 있다.

이렇게하여, 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 효율적으로 가용화/추출하고, 높은 추출율을 희석등에 의해 희생시키는 일 없이 효과적으로 항원-항체 반응을 달성할 수 있는 고감도 이뮤노에세이 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 면역학적 측정에는 상기와 같이 하여 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 것도 포함하지만, 해당 검출은 당업자에게 공지된 어떤 방법에 의해서도 좋은 것은 이해하고 있을 것이다. 예컨대 본 발명의 면역학적 측정의 일례인 샌드위치 이뮤노에세이에서는 1의 본 발명의 이온성 계면활성제 변성 단백질에 대한 항체가 웰 저면 등의 고상의 코팅에 사용되어 캡쳐(capture)측 항체를 제공할 수 있고, 상기 변성 단백질에 대한 다른 한편의 항체(캡쳐측 항체와 동일하거나 상이할 수 있음)가 방사성 물질이나 착색 입자 또는 효소로 표지되어 검출측 항체를 제공할 수 있다. 캡처측 항체를 갖는 웰내에 상기 이온성 계면활성제 함유 시료 용액이 첨가되며, 소정 시간 인큐베이트된 후 상기 추출액을 웰로부터 제거하고, 적합한 완충액 등에 의해 웰내를 충분하게 세정한 후 검출측의 항체가 웰에 첨가된다. 소정의 인큐베이션 후, 웰내를 세정하고, 캡쳐측 항체-측정대상물-검출측 항체 복합체의 생성을 검출한다. 검출은 검출측 항체에 표지된 표지물질의 성질에 의존하며, 방사성 표지이면 방사선량이, 착색 입자 표지이면 발색량이나 흡광도가, 또 효소 표지(ELISA법)이면 적합한 기질을 웰에 첨가하고 소정의 인큐베이션 후의 흡광도가 검출된다. 상기 ELISA법에서 효소 표지에 사용되는 효소로는 특히 제한은 없고, 예컨대 꽃양배추 퍼옥시다제나 알칼리성 포스파타제 등의 효소가 유리하게 사용될 수 있다. 꽃양배추 퍼옥시다제로 표지하는 경우, 해당 효소의 기질로서는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 등이 그 기질로서 이용가능하다. 알칼리성 포스파타제를 사용하는 경우는, 기질로서 p-니트로페닐인산을 들 수 있다. 상기 면역학적 측정 결과에 기본하여, 본 발명의 대상인 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 검출이 가능하게된다.

또한 설명하지 않더라도 지금까지 설명을 보는 당업자는 본 발명을 충분히 활용할 수 있을 것이다. 이하, 설명의 목적으로 실시예를 나타낸다. 이하에서 특 별한 제한없이 농도(%)는 중량/용량(W/V)%를 나타낸다.

도1은 표준 오보뮤코이드를 순차 단계로 희석시키고, 본 발명의 실시예의 방법(EIA의 원리에 기초한 고상 샌드위치법)에 의해 측정 파장 450 nm, 부파장 630 nm에서의 흡광도를 측정한 결과를 도시한다.

도2는 오보뮤코이드를 포함하는 미지 농도 검체(검체 a 내지 c)를 측정계에 사용하고, 본 발명의 실시예의 방법(EIA의 원리에 기초한 고상 샌드위치법)에 의해 측정 파장 450 nm, 부파장 630 nm에서의 흡광도를 측정한 결과를 도시한다.

도3은 HDTMAB, HDTMAC 및 HDPC의 존재하에서 오보알부민의 측정 결과를 도시한다(참고예). 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도4는 LDS, 라우릴 사르코신 나트륨 및 SDS의 존재하에서 오보알부민의 측정결과를 나타낸다(참고예). 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도5는 HDTMAB, HDTMAC 및 HDPC의 존재하에서 오보뮤코이드의 측정결과를 도시한다. 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도6은 LDS, 라우릴사르코신 나트륨 및 SDS의 존재하에서 오보뮤코이드의 측정 결과를 나타낸다. 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도7은 Tween20, Lubrol PX, Triton X-100 및 DOC의 존재하에서 오보알부민의 측정결과를 도시한다(참고예). 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도8은 Tween20, Lubrol PX, Triton X-100 및 DOC의 존재하에서 오보뮤코이드의 측정결과를 도시한다(참고예). 횡축은 각 계면활성제의 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다.

도9는 SDS의 존재하에서 카제인의 측정 결과를 도시한다. 횡축은 계면활성제(SDS) 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다. (■)은 항원이 있고, (◆)는 항원이 없다(대조).

도10은 SDS의 존재하에서 β-락토글로불린의 측정 결과를 도시한다. 횡축은 계면활성제(SDS) 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다. (■)은 항원이 있고, (◆)는 항원이 없다(대조).

도11은 SDS의 존재하에서 메밀 단백질의 측정 결과를 도시한다. 횡축은 계면활성제(SDS) 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다. (■)은 항원이 있고, (◆)는 항원이 없다(대조).

도12는 SDS의 존재하에서 밀 단백질의 측정 결과를 도시한다. 횡축은 계면활성제(SDS) 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다. (■)은 항원이 있고, (◆)는 항원이 없다(대조).

도13은 SDS의 존재하에서 땅콩 단백질의 측정 결과를 도시한다. 횡축은 계면활성제(SDS) 농도(%)를 나타내고, 종축은 흡광도를 나타낸다. (■)은 항원이 있고, (◆)는 항원이 없다(대조).

도14는 본 발명에 의한 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 오보알부민의 측정결과를 도시한다.

도15는 본 발명에 의한 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 방법에서, 오보알부민 시료 용액을 끓인 경우의, 시간 경과에 따른 검출 감도 안정성에 대한 효과를 도시한다. 참고예는 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하며, 동일한 시료 용액을 가열시킨 경우와 가열하지 않은 경우의 결과를 도시한다.

도16은 본 발명에 의한 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 방법에서, 오보뮤코이드 시료 용액을 끓인 경우의, 시간 경과에 따른 검출 감도 안정성에 대한 효과를 도시한다. 참고예는 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하며, 동일한 시료 용액을 가열시킨 경우와 가열하지 않은 경우의 결과를 도시한다.

도17은 본 발명에 의한 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 방법에서, 땅콩 단백질 시료 용액을 끓인 경우의, 시간 경과에 따른 검출 감도 안정성에 대한 효과를 도시한다. 참고예는 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하며, 동일한 시료 용액을 가열시킨 경우와 가열하지 않은 경우의 결과를 도시한다.

도18은 본 발명에 의한 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 방법에서, 메밀 단백질 시료 용액을 끓인 경우의, 시간 경과에 따른 검출 감도 안정성에 대한 효과를 도시한다. 참고예는 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하며, 동일한 시료 용액을 가열시킨 경우와 가열하지 않은 경우의 결과를 도시한다.

도19는 본 발명의 바람직한 형태인 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체 의 사용과 시료용액의 끓임을 조합함에 따른 에세이의 감도를 도시한다. 실시예는 각 농도의 오보알부민을 1% SDS, 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH6.5)에 용해시켜 시료 용액으로 한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것에 의해 가열하고, 냉각후에 측정한 ELISA의 결과이며, 참고예는 천연형 오보알부민에 대한 항체를 사용하며, 시료용액을 가열한 경우의 결과를 도시한다.

도20은 본 발명의 바람직한 형태인 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체 의 사용과 시료용액의 끓임을 조합함에 따른 에세이의 감도를 도시한다. 실시예는 각 농도의 오보뮤코이드를 1% SDS, 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH6.5)에 용해시켜 시료 용액으로 한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것에 의해 가열하고, 냉각후에 측정한 ELISA의 결과이며, 참고예는 천연형 오보뮤코이드에 대한 항체를 사용하며, 시료용액을 가열한 경우의 결과를 도시한다.

도21은 본 발명의 바람직한 형태인 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체 의 사용과 시료용액의 끓임을 조합함에 따른 에세이의 감도를 도시한다. 실시예는 각 농도의 땅콩 단백질을 1% SDS, 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH6.5)에 용해시켜 시료 용액으로 한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것에 의해 가열하고, 냉각후에 측정한 ELISA의 결과이며, 참고예는 천연형 땅콩 단백질에 대한 항체를 사용하며, 시료용액을 가열한 경우의 결과를 도시한다.

도22는 본 발명의 바람직한 형태인 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체 의 사용과 시료용액의 끓임을 조합함에 따른 에세이의 감도를 도시한다. 실시예는 각 농도의 메밀 단백질을 1% SDS, 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH6.5)에 용해시켜 시료 용액으로 한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것 에 의해 가열하고, 냉각후에 측정한 ELISA의 결과이며, 참고예는 천연형 메밀 단백질에 대한 항체를 사용하며, 시료용액을 가열한 경우의 결과를 도시한다.

실시예 1

고상 샌드위치법에 의한, SDS를 포함하는 검체중의 오보뮤코이드의 측정(천연형 오보뮤코이드에 대한 항체의 사용)

(1) 항 오보뮤코이드 항체의 고상화

토끼 항-(천연형) 오보뮤코이드 폴리클로날 항체를 탄산완충액(pH 9.6)에 1 ㎍/ml 으로 되도록 용해시켰다. 이것을 마이크로티터 플레이트(Nunc사, 마이크로모듈 플레이트, Maxsorp-F8)에 100 ㎕ 씩 나누어서 피펫으로 주입하고 상온에서 2시간 방치시켰다.

(2) 마이크로티터 플레이트의 블로킹

각 웰로부터 상기 항체 용액을 제거한 후, 300 ㎕의 블로킹 용액(150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.1% 소 혈청 알부민을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)을 가하여 상온에서 2시간 방치시켰다.

(3) 오보뮤코이드의 측정

각 웰중의 블로킹 용액을 제거한 후 각 웰에 검체 희석용액(0.1% 소 혈청 알부민: 150mM NaCl: 0.05% Tween20: 0%, 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.5% 또는 1%의 SDS 함유 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4))으로 단계적으로 희석시킨 오보뮤코이드 표준품(상품명: 에그트립신 억제제, 나칼라이 테스크 제조)을 100 ㎕ 가하고, 상온 에서 2시간 방치시켰다. (이하에 나타내는 각종 검체의 측정에서, 해당 검체에 포함되는 오보뮤코이드 양이 상기 계에서의 측정 범위 이외로 되는 경우에는 해당 검체를 또한 검체 희석 용액으로 희석시켜 상기 계의 측정 범위내로 되도록 하여 측정하였다.)

이어, 각 웰을 세정한 후 300 ㎕로 6회 세정한 후, 꽃양배추 퍼옥시다제 표지 항 오보뮤코이드 폴리클로날항체를 0.1% BSA, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 함유 200 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 희석시킨 용액을 100 ㎕씩 가하고 상온에서 30분간 방치시켰다. 이어, 각 웰을 세정액 300 ㎕로 5회 세정한 후, TMB 용액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 100 ㎕ 씩 가하고, 상온에서 차광하여 10분간 반응시켰다. 그후, 1N 황산을 100 ㎕씩 각 웰에 가하여 반응을 정지시켰다. 각 웰의 흡광도를 마이크플레이트 리더를 이용하여 주파장 450 nm, 부파장 630 nm에서 측정하였다. 얻어진 표준 곡선을 도1에 도시한다.

도1로부터 알 수 있듯이, 0.01 내지 1.0%의 SDS 용액중의 검체에 의한 표준 곡선은 SDS를 첨가하지 않은 용액중의 검체에 의한 곡선과 거의 동등하기 때문에, 본 측정계에서 SDS 존재하에서도 오보뮤코이드의 정량이 가능한 것이 확인되었다.

실제로 각종 검체중의 오보뮤코이드 양을 측정하는 경우에는 이와 같이 하여 얻어진 표준 곡선을 토대로 검체중의 오보뮤코이드양을 환산하였다.

(4) 검체의 면역 측정

상기 실험법에 따라서, 실제로 검체의 면역측정 시험을 실시하였다. 시판품의 삼종류의 마요네즈를, 1% SDS를 포함하는 검체 희석액으로 각각 3단계 희석시키 고, 동시에 측정한 표준 오보뮤코이드로 부터 얻은 표준곡선에 기초하여 검체의 오보뮤코이드 농도를 산출하였다. 도2의 결과에 도시한 바와 같이, 원점을 통하는 양호한 직선성을 얻을 수 있었다.

(5) 첨가 회수 시험

상기 시험법에 따라 항원의 첨가 회수 시험을 실시하였다.

시판품의 3종류의 비스켓을 검체로 하여 그 1% SDS 함유 추출액을 제조하였다. 즉, 해당 비스켓을 균일하게 분말화하고, 해당 분말 2g을 취하였다. 여기에 38 ml의 1% SDS 함유 검체 희석액을 가하고, 균질기를 이용하여 30초간 2회의 교반을 실시하고, 얻어진 혼합액을 3,000 X g으로 20분간 원심분리시켰다. 얻어진 상청액액을 5A의 여과지로 여과하고, 해당 여액을 식품 추출액(1% SDS 함유 추출액)으로서 측정에 사용하였다. 이어서, 해당 추출액에 표준 오보뮤코이드를 첨가하여 면역측정을 실시하고, 측정치로부터 첨가시킨 오보뮤코이드 양의 회수율을 구하였다. 회수율은 첨가 항원량을 100%로 하고, 첨가항원양에 대한 측정치로부터 고유한 검체 함유 항원양을 뺀 값의 비율로 나타낸다.

이하의 표 1에 도시한 바와 같이, 첨가 회수율은 88.7로부터 96.1%로 양호한 결과를 얻을 수 있었고, 본 발명의 방법에 따라 식품중의 오보뮤코이드가 정확하고 또 예민하게 측정할 수 있는 것을 나타내었다.

실시예 2

고상 샌드위치법에 의해 각종 이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제를 포함하는 검체중의 오보뮤코이드 및 오보알부민의 측정(항 천연형 단백질 항체의 사용)

상기 실시예와 동일한 조건으로, 본 발명의 음이온성 계면활성제의 일종인 SDS, 도데실 황산 리튬(LDS) 및 라우릴 사르코신 나트륨, 양이온성 계면활성제의 일종인 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄(HDTMAB), 염화 헥사데실트리메틸암모늄(HDTMAC) 및 염화 헥사데실 피리디늄(HDPC) 및 참고로서 비이온성 계면활성제인 Tween20, Lubrol PX 및 Triton X100 및 스테로이드 골격을 갖는 계면활성제인 데옥시콜산(DOC)의 오보뮤코이드 및 오보알부민(참고예)의 면역측정계에 대한 영향을 검토하였다.

즉, 1 ml당 64 ng의 오보알부민 및 64 ng의 오보뮤코이드를 포함하는 검체에 관하여 상기 각종 계면활성제의 각종 농도에 따른 면역측정을 실시하여 흡광도를 측정하고, 그 결과를 이하의 표 2 내지 5 및 도3 내지 도8에 도시한다.

본 시험의 결과, 오보알부민의 측정계에 있어서는 비교적 고농도(예컨대 0.1% 이상)의 이온성 계면활성제가 측정감도를 현저히 저하시키고, 면역측정을 저 해하는 것에 대하여, 오보뮤코이드의 측정계에 있어서는 10% 정도의 극히 높은 농도의 이온성 계면활성제 존재하에서도 그 측정이 충분히 가능한 것이 명확하게 되었다. 이점으로부터, 항-(천연형)오보알부민-항체를 사용하는 경우를 제외하고는 항 천연형 단백질 항체를 사용한 경우에서도 본 발명의 이온성 계면활성제가 갖는 높은 단백질 추출 능력을 합쳐서 우수한 검출 감도와 정확성을 달성하는 면역측정계가 제공될 수 있는 것이 실증되었다. 참고로한 비이온성 계면활성제 및 데옥시콜산은 오보알부민 및 오보뮤코이드중의 어느 측정계에도 영향을 주지 않았다.

실시예 3

카제인 및 β-락토글로불린의 측정(항 천연형 단백질 항체의 사용)

항-(천연형)오보뮤코이드-항체 대신 항-(천연형) 카제인-항체 또는 항-(천연형) β-락토글로불린-항체를 사용한 이외는 실시예 1과 거의 동일한 수순으로 카제인 또는 β-락토글로불린의 측정을 실시하였다. 즉, SDS 농도를 10%로부터 0.156% 까지 단계적으로 희석시킨 검체 희석액에 각각 1 ml당 우유 단백질 양으로서 64 ng의 우유 단백질을 첨가하여 측정용의 시료 용액을 제조하였다. 해당 시료중의 카제인 또는 β-락토글로불린을 실시예 1과 동일한 순서로 실시되는 시판되는 카제인용 우유 면역측정 키트 또는 β-락토글로불린용 우유 면역측정 키트(양쪽 모두 천연형 단백질에 대한 항체를 사용. 주식회사 모리나가 세이가가쿠 켄큐쇼로부터 입수. 상품명, 모리나가 특정원재료 측정 키트: 우유 측정 키트(카제인) 및 모리나가 특정 원재료 측정 키트: 우유 측정 키트(β-락토글로불린))로 측정하였다. 결과를 도9 및 도10에 도시하였다.

도9 및 도10으로부터 분명한 바와 같이, 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 경우에서도 카제인 및 β-락토글로불린에서 SDS로 대표되는 것과 같은 이온성 계면활성제의 고농도 존재하에서 면역측정이 양호하게 실시될 수 있는 것이 나타났다.

실시예 4

메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질의 측정(항 천연형 단백질 항체의 사용)

실시예 3과 동일하게 하여 메밀 단백질, 밀 단백질(글리아딘) 및 땅콩 단백질의 측정에 대한 이온성 계면활성제의 영향을 검증하였다. 첨가 실험에 사용된 메밀 단백질은 메밀 열매를 마쇄시키고, 해당 마쇄물에 염화 나트륨 등의 염류를 포함하는 완충액(트리스-염산 완충액 등)을 첨가하여 성분을 추출하는 것에 의해 수득한 추출물을 원심분리하여 그 상청액을 회수하고, 이어 상청액을 슈퍼덱스 G-200 이나 슈퍼로오스 6(양쪽 모두 Amersham Pharmacia 사 제조)의 겔 여과 칼럼에 제공하여 분자량 70 내지 500 kD의 범위로 용출되는 분획을 회수하는 것에 의해 준비하였다.

또한 밀 단백질(글리아딘)은 아사마 카세이 가부시끼가이샤로부터 입수한 시판품을 사용하고 땅콩 단백질은 땅콩 열매를 마쇄시키고 해당 마쇄물에 염화 나트륨 등의 염류를 포함하는 완충액(트리스-염산 완충액 등)을 첨가하여 성분을 추출하는 것에 의해 수득한 추출물을 원심분리하여 그 상청액을 회수하고, 이어 상기 상청액을 슈퍼엑스 G-200이나 슈퍼로오스 6(양쪽 모두 Amersham Pharmacia 사 제 조)의 겔 여과 칼럼에 제공하여 분자량 30 내지 100 kD의 범위로 용출되는 분획을 회수하는 것에 의해 준비하였다. 이들 시료를 사용한 면역측정법에 의한 시험은 각 시판의 측정 키트(가부시끼가이샤 모리나가 세이카가쿠 켄큐쇼 제조, 모리나가 특정 원재료 측정 키트: 메밀 측정 키트, 모리나가 특정 원재료 측정 키트: 밀 측정 키트(글리아딘) 및 모리나가 특정 원재료 측정 키트: 땅콩 측정 키트, 어느 것이라도 천연형 단백질에 대한 항체를 사용)에 의해 실시하였다. 결과를 도11 내지 도13에 도시하였다.

도11 내지 도13으로부터 메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질에서도 고농도의 이온성 계면활성제의 존재하에서 천연형 단백질에 대한 항체의 사용에 의해 면역측정이 양호하게 실시될 수 있는 것이 밝혀졌다.

실시예 5

항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체의 제조

실시예 1 내지 4로 부터, 오보뮤코이드, 카제인, β-락토글로불린, 메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질에서는 이들의 천연형 단백질에 대하여 산생된 항체를 사용하여도 고농도의 이온성 계면활성제 존재하에서 특이적 항원-항체 반응이 달성될 수 있는 것이 알려져 있지만, 오보알부민에서는 그와 같은 항원-항체 반응이 실시될 수 없었다. 그래서 이하와 같이 하여 이온성 계면활성제로 미리 변성시킨 단백질에 대하여 항체를 제조하고, 이것을 이용하는 방법을 검토하였다.

(1) 단백질의 변성

이하의 단백질을 0.1 내지 10 mg/ml의 농도에서 1% SDS 및 1M의 2-머캅토에 탄올을 포함하는 용액에 용해시키고, 하룻밤 실온에서 방치시켰다.

1. 오보알부민(세이카가쿠고교 가부시끼가이샤로부터 구입. 상표명: "Egg Albumin, 5x Cryst, (Chicken)")

2. 오보뮤코이드(나칼라이테스크사로부터 구입. 상품명: 트립신 억제제(닭 난백으로부터)

3. 땅콩 단백질은 이하와 같이 제조하였다.

1) 땅콩의 열매를 마쇄하고, 해당 마쇄물에 염화 나트륨 등의 염을 포함하는 완충액(트리스-염산 완충액)을 가하여 성분을 추출한다.

2) 추출물을 원심분리하여 상청액을 회수한다.

3) 상청액을 슈퍼덱스 G-200이나 슈퍼로오스6(양쪽 모두 Amersham Pharmacia사제)의 겔 여과 칼럼에 제공하고, 분자량 30 내지 100 kD의 범위로 용출되는 분획을 회수한다.

4. 메밀 단백질은 이하와 같이 제조하였다.

1) 메밀 열매를 마쇄하고, 해당 마쇄물에 염화 나트륨 등의 염을 포함하는 완충액(트리스-염산 완충액)을 가하여 성분을 추출한다.

2) 추출물을 원심분리에 의해 상청액을 회수한다.

3) 상청액을 슈퍼덱스 G-200이나 슈퍼로오스 6(양쪽 모두 Amersham Pharmacia 사 제조)의 겔 여과 칼럼에 제공하고, 분자량 70 내지 500 kD의 범위로 용출되는 분획을 회수한다.

(2) 토끼 폴리클로날 항체의 제조

상기와 같이 하여 변성시킨 단백질에 관하여 프로인트 보조제를 사용하여 유제를 제조하고, 해당 유제를 토끼의 피하에 주사하여 면역시켰다. 면역은 1회당 1 mg의 상기 변성 단백질이 투여되도록 실시하고, 일주간 간격으로 5회 투여하였다. 최종 면역 종료한지 1주간 후에 면역시킨 토끼의 전혈을 채집하고, 항혈청을 제조하였다. 해당 항혈청으로부터 본 발명의 항체의 제조는 이하의 수순에 따랐다. 즉, 상기 토끼의 면역에 사용한 변성 단백질을 HiTrap NHS-activated (Amersham Pharmacia 사 제조)에 공유결합으로 고상화시키고, 그 고상화 수지에 상기 항혈청을 제공하였다. 이어서 해당 고상화 수지상의 단백질 분획에 결합시킨 항체를 pH 2.7로 제조한 0.1M Gly-HCl로 용출시켜 본 발명의 항체를 얻었다.

실시예 6

항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체의 사용에 의한 측정

이하의 수순에 따라서 본 발명의 이온성 계면활성제 변성 단백질에 대한 항체의 사용에 의한, 면역학적 측정(ELISA)법을 평가하였다.

[항체 고상화]

1. 상기의 이온성 계면활성제 변성 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 탄산완충액(pH 9.6)에 1 ㎍/mL로 제조.

2. 마이크로티터 플레이트(Nunc 사 제조, 마이크로모듈 플레이트, Maxsorp-F8)에 100 μL씩 피펫으로 나눠 주입하고 상온에서 2시간 방치하였다.

[블로킹]

1. 항체 고상화 후, 항체 용액을 제거하고, 300 μL의 블로킹 용액(150 mM NaCl, 0.05% Tween20, 0.1% 소혈청 알부민을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액 (pH 7.4))를 가하여 2시간 방치.

[시료 용액의 제조]

1. 표준 단백질을 1% SDS, 1M 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH 6.5)에 용해시키고 1 내지 10분간, 100℃에서 끓여 비등 가열시킨다.

2. 가열 후, 상기와 동일한 완충액으로부터 표준 단백질 농도가 1 내지 64 ng/mL 농도로 되도록 희석시킨다.

[측정]

1. 블로킹 종료후의 항체 고상화 플레이트에 각 농도의 표준 단백질 용액을 100 μL씩 가하고, 1시간 상온에서 방치하여 반응시켰다.

2. 반응 후 각 웰을 세정한 후 300 μL로 6회 세정하고, 꽃양배추 퍼옥시다제 표지 항체를 0.1% BSA, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20을 포함하는 20 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 용해시킨 용액을 100 μL씩 가하고 상온에서 30분간 방치하여 반응시켰다.

3. 각 웰을 세정한 후 300 μL로 6회 세정한 후, TMB 용액(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 100 μL씩 가하고, 상온에서 차광시켜 10분간 반응시켰다.

4. 1N 황산을 100 μL씩 각 웰에 가하고 반응을 정지시켰다. 각 웰의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 사용하여 주파장 450 nm, 부파장 630 nm로 측정하였다. 결과는 2중 측정의 평균치를 나타내었다.

(1) 오보알부민의 측정

천연형 단백질에 대한 항체로는 측정이 불가능하였던 오보알부민(도3 및 도4 참조)에 관하여, 본 발명에 의한 항-이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용한 측정 결과를 도14에 나타내었다. 본 실시예에서는 각 농도의 오보알부민을 용해시킨, 1% SDS, 1M 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH 6.5)을 5분간, 100℃에서 끓여서 가열시키고, 냉각시킨 후, 상기의 ELISA 측정을 실시하였다.

도14로부터, 고농도의 이온성 계면활성제의 존재하에서 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 경우에 측정이 곤란한 단백질도 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용하면, 극히 고감도로 측정할 수 있음을 알 수 있다.

(2) 시료 용액의 끓임 효과

본 발명의 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 이용한 방법에서는 시료용액을 미리 끓이는 것에 의해 측정의 안정성과 감도를 현저하게 향상시킬 수 있는 것이 나타났다. 결과를 도15 내지 도18에 도시한다.

실시예에서는 64 ng/ml의 농도로 각 단백질을 1% SDS, 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH 6.5)에 용해시켜 시료용액을 제조한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것에 의해 가열하고, 그 후 실온에서 0 내지 6시간 방치한 경우의 본 발명의 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체에 의한 ELISA의 결과를 나타낸다. 한편, 참고예로서, 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하고, 동일한 시료 용액을 가열시킨 경우와 가열하지 않은 경우의 결과를 나타내었다. 결과는, 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 경우, 시료용액을 가열하지 않으면 비교적 단시간 사이는 높은 검출 감도를 유지할 수 있지만, 해당 감도는 시간이 경과함에 따라 감소함을 나타낸다. 또한 천연형 단백질에 대한 항체를 사용한 경우, 시료 용액을 가열하면 당초부터 검출 감도가 대폭 감소하는 것을 나타내고 있다.

이에 대하여, 본 발명의 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용하고, 미리 시료 용액을 끓인 경우에는 높은 검출 감도가 장시간 유지되며, 극히 재현성과 감도가 높은 에세이를 실시할 수 있는 것이 나타났다.

(3) 에세이의 감도

본 발명의 바람직한 형태인 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체의 사용과 시료용액의 끓임의 조합에 따른 에세이의 감도를 도19 내지 도22에 나타내었다. 실시예는, 각 농도의 단백질을 1% SDS, 1M 2-머캅토에탄올을 포함하는 완충액(PBS, pH 6.5)에 용해시켜 시료 용액으로 한 후, 시료용액을 5분간, 100℃에서 끓이는 것에 의해 가열시키고, 냉각 후에 측정한 ELISA의 결과를 나타낸다. 또한 도중, 참고예는 천연형 단백질에 대한 항체를 사용하고, 시료용액을 가열시킨 경우의 결과를 나타낸다. 도면으로부터, 본 발명의 방법이 극히 높은 재현성과 감도를 갖고 있는 것을 알 수 있다.

특히 실시예 6으로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 항 이온성 계면활성제 변성 단백질 항체를 사용하는 것에 의해, 단백질의 이뮤노에세이가 고농도의 이온성 계면활성제의 존재하에서도 충분히 실시될 수 있는 것을 알 수 있다. 이에 의해, 이온성 계면활성제의 우수한 단백질 가용화 효과를 이용하는 것에 의해 가용화/추출된 난용성/추출하기 어려운 단백질을 직접 이뮤노에세이로 검출하는 것 이 가능해지며, 그와 같은 고감도의 검출이 요구되는 것과 같은 생명과학 연구나 식품의 품질 보증에서 본 발명의 방법은 그히 유효하게 이용될 수 있다.

Claims (17)

1. 시료중의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질의 존재를 검출하기 위한 면역학적 측정법에 있어서, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 측정법.

   (1) 시료중의 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 이온성 계면활성제를 포함하는 수성 용매로 추출 또는 가용화하는 공정,

   (2) 공정(1)에서 이용하는 이온성 계면활성제로 미리 변성시킨 상기 수 난용성/추출하기 어려운 단백질을 면역원으로하여 얻은 항체를,

   a) 상기 공정(1)에서 얻은 단백질 용액에 대하여 용액을 희석함없이 첨가하든가; 또는

   b) 상기 공정(1)에서 얻은 단백질 용액을 그 이온성 계면활성제 농도가 0.03%(W/V) 이하로 되지 않는 범위로 희석시킨 희석액에 대하여 첨가하는;

   것에 의해, 상기 수 난용성/추출하기 어려운 단백질과 상기 항체와의 사이에서 항원-항체 복합체를 형성시키는 공정, 및

   (3) 형성된 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 공정.
2. 제1항에 있어서, 상기 공정(1)에서 수성 용매중의 이온성 계면활성제의 농도가 0.3% (W/V) 내지 10% (W/V)인 측정법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정(2)에 따른 항원-항체 복합체의 형성이 0.3% (W/V) 내지 10% (W/V)인 이온성 계면활성제의 존재하에서 실시되는 측정법.
4. 제1항에 있어서, 상기 이온성 계면활성제가 도데실 황산 나트륨, 도데실 황산 리튬, 라우릴사르코신 나트륨, 브롬화 헥사데실트리메틸 암모늄, 염화 헥사데실트리메틸 암모늄, 염화 헥사데실 피리디늄 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 측정법.
5. 제4항에 있어서, 상기 이온성 계면활성제가 도데실 황산 나트륨인 측정법.
6. 제1항에 있어서, 공정(1)의 수성 용매가 환원제를 더 포함하는 측정법.
7. 제6항에 있어서, 상기 환원제가 2-머캅토에탄올, 디티오트레이톨 또는 이들의 혼합물인 측정법.
8. 제7항에 있어서, 공정(1)의 수성 용매가 1% (W/V)의 도데실 황산 나트륨 및 1M의 2-머캅토에탄올을 포함하는 측정법.
9. 제1항에 있어서, 공정(1)에서 단백질 용액을 끓이는 것을 더 포함하는 측정법.
10. 제9항에 있어서, 상기 끓이기가 80℃ 내지 100℃에서 5분간 계속되는 측정법.
11. 제1항에 있어서, 상기 단백질이 추출하기 어려운 상태에 있는 오보알부민, 오보뮤코이드, 카제인, β-락토글로불린, 메밀 단백질, 밀 단백질 및 땅콩 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 측정법.
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