WO2004111644A1 - 生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法 - Google Patents

生体分子マイクロアレイ用基板、生体分子マイクロアレイ、相互作用促進用装置および方法、ならびに、相互作用の検出方法 Download PDF

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biomolecule
substrate
microarray
immobilized
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Hideo Tashiro
Yasumitsu Kondoh
Tokuji Kitsunai
Satoshi Hatakeyama
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Riken
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Definitions

  • Biomolecule microarray substrate Biomolecule microarray substrate, biomolecule microarray, interaction promoting device and method, and interaction detecting method
  • the present invention provides a biomolecule microphone array substrate for quantification and digital analysis of biomolecule fixation, a biomolecule microarray characterized in that biomolecules are immobilized and written on the substrate, and the microarray is used.
  • the present invention relates to a biomolecule interaction promoting device, an interaction promoting method, and a biomolecule interaction detecting method.
  • Hybridization of a probe nucleic acid and a target nucleic acid is used for the purpose of detecting a certain kind of nucleic acid (target nucleic acid), such as genetic diagnosis, identification of pathogenic bacteria, or detection of single nucleotide polymorphism.
  • target nucleic acid such as genetic diagnosis, identification of pathogenic bacteria, or detection of single nucleotide polymorphism.
  • a method is employed in which thiol is conjugated to single-stranded DNA, and the thiolated single-stranded DNA is immobilized on, for example, a metal substrate. Then, test on the immobilized DNA The target DNA, which is a body, is acted on to detect the presence or absence of hybridization. The presence or absence of hybridization can be detected, for example, by measuring the fluorescence of a spot of the immobilized DNA hybridized with the target DNA using a fluorescence method.
  • a spotting type DNA microarray is prepared by placing a droplet containing probe DNA on a substrate and drying it.
  • This has the advantage that it can be produced at low cost, but has the disadvantage that the uniformity of the DNA immobilized on the substrate is not guaranteed, that is, the size and shape of the DNA detection spot varies.
  • These disadvantages are caused, for example, by the fact that the DNA-fixed substrate has been subjected to the DNA-fixed treatment (PLL treatment) on the entire surface of the substrate, and that the substrate surface is flat.
  • an object of the present invention is to promote the interaction of a biomolecule with a substrate having a biomolecule-immobilized region of a fixed shape on a biomolecule microarray, in particular, high-speed hybridization of nucleic acids and promotion of interaction of a small amount of sample.
  • Another object of the present invention is to provide a means for detecting and analyzing the interaction with high speed and high sensitivity.
  • Still another object of the present invention is to provide a device and a method for promoting interaction that can promote the interaction of biomolecules and efficiently form an interaction between biomolecules that can interact with each other.
  • the present invention provides a means for automatically performing a gridding operation, The aim is to enable the collection of fluorescence data from biomolecular microarrays and the automation of digital analysis. More specifically, the present invention provides a substrate for a biomolecule microarray, which can detect the interaction of biomolecules with high sensitivity, and preferably can also perform dalitting automatically, and a biomolecule immobilized on such a substrate. And a biomolecule microarray. It is a further object of the present invention to provide a method for detecting biomolecular interactions that enables automatic dalitting. DISCLOSURE OF THE INVENTION The means for achieving the object of the present invention are as follows.
  • a biomolecule microarray substrate having one or more spots for immobilizing biomolecules on the substrate surface
  • the biomolecule-immobilizing spot protrudes from the substrate surface, and has a spot plane at the top (hereinafter, referred to as a “projecting spot”); and
  • At least the substrate surface around the protruding spot portion, the side surface of the protruding spot portion, and the spot plane are made of a conductive material.
  • a biomolecule microarray substrate having one or more biomolecule fixing spots on the substrate surface The biomolecule immobilization spot protrudes from the substrate surface, and has a spot plane at the top (hereinafter, referred to as a “projection spot”);
  • a substrate characterized in that adjacent projecting spot portions are adjacent to each other by a projecting spot portion side surface, and at least the projecting spot portion side surface and the spot plane are made of a conductive material.
  • a biomolecule comprising the substrate and the biomolecule according to any one of (1) to (9), wherein the biomolecule is immobilized on at least a spot plane on the substrate.
  • biomolecule (11) The biomolecule according to (10), wherein the biomolecule is at least one selected from the group consisting of DNA, RN.A, PNA, protein, polypeptide, glycan, lipid, natural small molecule, and synthetic small molecule. Biomolecular microarray. (12) a biomolecule microarray having one or more biomolecule-immobilized spots on a substrate,
  • An electrode provided to face the surface of the microarray having the biomolecule-immobilized spot;
  • An apparatus for promoting interaction of biomolecules comprising:
  • the substrate constituting the biomolecule microarray has a biomolecule-immobilizing spot (hereinafter, referred to as a “projected spot”) that projects from the substrate surface and has a spot plane on the top.
  • a biomolecule-immobilizing spot hereinafter, referred to as a “projected spot”
  • At least the protruding spot has a conductive material surface
  • a biomolecule is immobilized on the conductive material surface of the spot plane, and the biomolecule-immobilized spot is formed;
  • the device for promoting interaction of biomolecules wherein the substrate has, on a surface other than the projecting spot portion on the substrate, a terminal capable of conducting electricity with the surface of the conductive material of the projecting spot portion.
  • the surface other than the projecting spots on the substrate has a conductive material coating layer, and the terminal is included in the conductive material coating layer or can be electrically connected to the conductive material coating layer.
  • a non-conductive spacer is provided between the microarray and the electrode (1 2) The apparatus according to any one of (1) to (15).
  • a solution containing a target biomolecule is arranged between the microarray and the electrode, and
  • a method for promoting interaction between biological molecules wherein an electric field is applied between the microarray and an electrode.
  • the microarray is placed in an environment capable of interacting with a target biomolecule using the method according to any one of (19) to (22), or (23) The method according to (23), wherein the method is placed in an environment capable of interacting with a target biomolecule.
  • the confocal detector reflects the projecting spot on the microarray from the difference in reflected light intensity due to the difference in height and / or shape between the projecting spot on the surface of the microarray and the other part.
  • the method according to any one of (23) to (25), wherein the method is detecting as an image.
  • a solution containing a target biomolecule is brought into contact with a biomolecule microarray having one or more spots on which biomolecules are immobilized on the substrate surface, and the immobilized biomolecule interacts with the target biomolecule.
  • An electric field is applied to the solution containing the target biomolecule so that phenylalanine is contained, and the target biomolecule in the solution is electrophoresed toward the biomolecule-immobilized spot, thereby promoting the interaction.
  • the microarray has, on a substrate, an electrode provided with a biomolecule-immobilized spot on a surface thereof, wherein an electrode facing the electrode on the substrate is used, and the solution containing the target biomolecule is the solution containing the target biomolecule.
  • a solution containing a target biomolecule is brought into contact with a biomolecule microarray having one or more spots on which immobilized biomolecules are immobilized on the substrate surface, and the immobilized biomolecules interact with the target biomolecules.
  • the solution containing the target biomolecule is phenylalanine, histidine, cal Nosin, and at least one buffer substance selected from the group consisting of arginine,
  • the substrate has at least one pair of opposed electrodes provided on the same surface as the surface on which the biomolecule-immobilized spot is provided, such that the biomolecule-immobilized spot is located between the pair of electrodes.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an optical system of a confocal detector used in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view of a projecting spot on the substrate of the present invention.
  • FIG. 3 shows an example (partially enlarged view) of a roughened spot plane of the substrate of the present invention.
  • FIG. 4 shows an enlarged view of a part of a substrate having a substantially V-shaped bottom surface.
  • FIG. 5 shows an example of the substrate according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of the device for promoting interaction of biomolecules of the present invention.
  • FIG. 7 shows a schematic diagram of an optical system of a confocal scanner capable of simultaneously detecting reflected light and fluorescence.
  • FIG. 8 shows a digital camera image and a confocal microscope image of the substrate manufactured in Example 1.
  • FIG. 9 shows a fluorescent image (a), a reflected image (b), and an image (c) obtained by superimposing the fluorescent image and the reflected image obtained in Example 2.
  • FIG. 10 shows a reflection image and a fluorescence image obtained in Example 3.
  • FIG. 11 shows a reflection image and a fluorescence image obtained in Example 4.
  • FIG. 12 is a graph showing the correlation between the target concentration and the fluorescence intensity in Example 4.
  • FIG. 13 is an example of a substrate that can be used in the method for interacting biomolecules of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing the hybridization signal intensity obtained in Example 5.
  • FIG. 15 is a graph comparing the hybridization signal obtained when an electric field was applied and the hybridization signal obtained when no electric field was applied in Example 6.
  • the biomolecule microarray substrate of the present invention is a biomolecule microarray substrate having at least one biomolecule immobilization spot on a substrate surface, wherein the biomolecule immobilization spot protrudes from the substrate surface, and Have a spot plane on top
  • projecting spots Furthermore, in the biomolecule microarray substrate of the present invention, at least the surface of the substrate around the projecting spot, the side surface of the projecting spot, and the spot plane are made of a conductive material (hereinafter referred to as “first mode”). Or adjacent protruding spot portions are adjacent to each other by a side surface of the protruding spot portion, and at least the side surface of the protruding spot portion and the spot plane are made of a conductive material. It is characterized by quality (hereinafter referred to as “second aspect”).
  • the biomolecule fixing spot is provided on the flat surface on the top of the protruding spot. Therefore, in the substrate according to the first aspect of the present invention, the spot plane (biomolecule fixing spot) on the top of the projecting spot is located one step higher than the substrate surface around the projecting spot. There is a height difference between the two.
  • a confocal detector used for detecting the interaction of biomolecules is a device that reflects reflected light or fluorescence from a focal plane on a sample to a pinhole placed on an imaging plane of an optical system. To detect.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of an optical system of the confocal detector 10 used in the present invention. The solid line a in FIG.
  • Solid line b represents reflected light or fluorescence from the focal plane
  • broken line represents reflected light or fluorescence from the non-focal plane.
  • the confocal point detector 10 the reflected light reflected from the focal plane on the microarray 1 and the fluorescence emitted from the focal plane on the sample enter the beam splitter 13 through the objective lens 2, The optical path is corrected by the beam splitter 3 so as to be perpendicularly incident on the detection lens 4, and is incident on the image plane 5 via the detection lens 4.
  • the confocal detector 10 is designed such that the focal point on the sample is also the focal point on the imaging plane. Therefore, light from the focal plane on the sample is focused on the imaging plane 5, passes through the pin hoe 6, and is detected by the detection unit 7.
  • the confocal detector light from the focal plane can be selectively detected.
  • a height difference between a substrate surface around the projecting spot portion and a spot plane (biomolecule fixing spot) on the top of the projecting spot portion is provided. Is greater than the depth of focus of the confocal detector used to detect the interaction between the biomolecule and the target biomolecule, the focal point of the confocal detector is adjusted to the height of the spot plane at the top of the projecting spot.
  • the detector can detect the fluorescence and reflected light from the spot plane at the top of the projected spot with higher intensity than the fluorescence and reflected light from the substrate surface around the projected part. it can. Therefore, in the microarray of the present invention in which biomolecules are immobilized on the spot plane on the top of the projecting spot portion of the substrate, information on the spot, for example, the presence or absence of interaction with the target biomolecule is detected with high sensitivity. be able to.
  • the adjacent protruding spot portions are adjacent to each other via the protruding spot portion side surface, and at least the protruding spot portion side surface is formed of a conductive material. It is characterized by comprising. FIG.
  • FIG. 5 shows an example of the substrate according to the second embodiment of the present invention.
  • an angle formed by the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is 90 degrees or more. Preferably, it is 90 to 135 degrees.
  • FIG. 2A is a cross-sectional view of a part of the substrate of the present invention.
  • “the angle formed by the spot plane at the top of the projecting spot portion and the side surface of the projecting spot portion” means the angle 0 in FIG. 2 (a).
  • the angle ⁇ can be determined, for example, from a cross section of the protruding spot portion cut perpendicularly to the substrate surface around the protruding spot portion.
  • the angle between the spot plane on the top of the projecting spot portion and the side surface of the projecting spot portion is 90 degrees or more, Since the size of the bottom of the cutting part is larger than the size of the spot plane on the top of the protruding spot part, the gridting is performed automatically and the position and size of the spot for immobilizing biomolecules are specified. There is an advantage that can be. Hereinafter, this point will be described in detail. As shown in Fig.
  • the confocal point detector detects only the reflected light from the spot plane on the top of the protruding spot, and does not detect the reflected light from the side surface.
  • an image corresponding to the spot plane on the top of the protruding spot is obtained as a reflection image, and the portion corresponding to the side surface of the protruding spot is black because almost no reflected light is detected. It appears as a border of In this reflection image, the inside of the black border corresponds to the biomolecule spot, and the size and position of the spot can be specified by this reflection image.
  • automatic gridting can be performed based on such a principle.
  • the focus of the confocal detector is If the height of the spot plane on the top of the protruding spot is adjusted, the reflected light from the substrate surface around the protruding spot is not focused, so the top of the protruding spot is Force is much weaker than the reflected light from the upper spot plane and is not detected. In the present invention, it is also possible to perform automatic dalitting using this height difference.
  • the height of the protruding spot is smaller than the depth of focus of the confocal detector used for detecting the interaction, as described above, it corresponds to the side of the protruding spot in the reflected image. If the spot appears as a black border, the size and position of the spot can be specified.
  • the height of the protruding spot portion is If the depth of focus is greater than or equal to the depth of focus of the confocal detector used to detect the spot, the position of the spot plane and the position of the spot The size can be specified and the grinding can be performed automatically.
  • the shape of the protruding spot portion may be, for example, a column shape or a prism shape.
  • the angle formed between the spot plane on the top of the protruding spot portion and the side surface of the protruding spot portion is 90 degrees or more, and around the protruding spot.
  • the substrate surface may be a substrate forming a substantially V-shaped bottom surface.
  • the reflected light intensity from the spot plane detected by the confocal detector becomes stronger than the reflected light intensity from the part other than the spot plane on the substrate.
  • FIG. 4 is an enlarged view of a part of a substrate having a “substantially V-shaped bottom surface”.
  • the “substantially V-shaped bottom surface” refers to, for example, a protrusion between adjacent protrusion spots. This means that the surface of the substrate around the pot portion is not flat, but forms a substantially V shape as shown in FIG. Furthermore, the substrate according to the first aspect of the present invention is characterized in that at least the surface of the substrate around the protruding spot portion, the side surface of the protruding spot portion, and the spot plane are made of a conductive material. In consideration of ease of manufacture and manufacturing cost, it is preferable that the substrate according to the first aspect of the present invention, other than the periphery of the projecting spot on the substrate, be made of a conductive material.
  • the substrate according to the second aspect of the present invention is characterized in that at least the side surface of the projecting spot and the plane of the projecting spot are made of a conductive material.
  • the substrate surface around the projecting spot portion, the side surface of the projecting spot portion, and the spot plane are at least in the substrate of the second aspect,
  • the projecting spot portion side surface and the spot plane are made of a conductive material.
  • an electrode facing the substrate is provided, and by applying an electric field, the biomolecules fixed to the spot plane are formed. Interaction with the target biomolecule can be promoted.
  • a good interaction result can be obtained even when the concentration of the target biomolecule is low, and a predetermined interaction result can be obtained in a shorter time when the concentration is the same.
  • the conductive substance has a property of reflecting light
  • the size and position of the biomolecule-immobilized spot can be specified by the reflected light, and the dalitting can be automatically performed. it can. This will be described later.
  • the height of the protruding spot can be appropriately set so as to be equal to or higher than the depth of focus of the confocal detector used for detecting the interaction.
  • the height of the protruding spot can be, for example, 10 to 500 ⁇ .
  • automatic glitching when performing automatic glitching by detecting a difference in reflected light intensity due to a difference in shape between the spot plane at the top of the projecting spot portion on the substrate and the other portion, even if the height of the protruding spot is smaller than the depth of focus of the confocal detector used for detecting the interaction, automatic gliding can be performed. This point will be described later.
  • the height of the projecting spot it is necessary to consider the diameter of a needle used for spot formation (stamping) of a biomolecule and the spot amount of a biomolecule solution such as a probe nucleic acid. For example, when spotting biomolecules on a circular projecting spot with a diameter of 100 ⁇ using a needle with a diameter of about 130 zm, if the height of the projecting spot is 15 ⁇ or more, The surface tension is preferable because the biomolecule is immobilized only on the fixing spot without the biomolecule solution flowing out of the spot plane on the top of the projecting spot.
  • the shape of the spot plane on the top of the protruding spot portion can be any shape as long as it can hold the spotted biomolecules, for example, a circle or a square. be able to.
  • the size of the spot plane can be appropriately set according to the amount of the biomolecule solution to be spotted and the needle used for the spot, and can be, for example, 10 to 500 ⁇ .
  • spot The “size of the spot plane” means, for example, the diameter of the spot plane when it is circular, and the length of one side when the spot plane is square.
  • the shape of the bottom surface of the protruding spot portion is not particularly limited, but is preferably the same shape as the spot plane in consideration of ease of manufacturing and the like. FIG.
  • FIG. 2 (b) is a schematic view of a protruding spot on the substrate of the present invention.
  • the shape of the bottom surface of the protruding spot refers to the hatched portion in FIG. 2 (b).
  • the spot plane on the top of the protruding spot may be roughened.
  • the spot plane on the top of the protruding spot portion has irregularities in the depth direction and the substantially horizontal direction with a depth within the focal depth of the confocal detector used for detecting the interaction. Is also good.
  • Figure 3 shows an example (partially enlarged view) of a roughened spot plane.
  • the spot plane is roughened in this way, as described later, when the enrichment effect of the target biomolecule by electrophoresis or dielectrophoresis is obtained, the spots on the irregularities (edges) are strongly affected. There is an advantage that an electric field is generated and the interaction is further promoted.
  • the method for roughening the spot plane is not particularly limited.
  • the substrate of the present invention is a plastic molded substrate, a microfabricated mold in which a base material etched by photolithography is anti-transferred by an electrolysis method is used. By using this, a substrate having a rough spot plane can be manufactured.
  • the substrate of the present invention may be such that the entire substrate is made of a conductive substance, or has a conductive substance coating layer on the surface of the substrate.
  • the conductive material is selected from materials having a property of reflecting light.
  • the conductive substance is selected from metals having a thiol group and a binding property.
  • the conductive material for example, a metal (e.g., gold, nickel, platinum, silver, titanium, aluminum, stainless steel, copper), conductive oxides (eg, I n 2 0 5 / S n 0 2) and the conductive Functional plastics (for example, polyacetylene).
  • a substrate having a conductive material coating layer include a substrate in which the surface of a substrate such as glass, silicon, plastic, or polypropylene is coated with the conductive material.
  • the thickness of the conductive material coating layer on the substrate is not particularly limited, and may be, for example, 0.1 to 10 ⁇ .
  • the molten metal is injected into a mold having a concave portion corresponding to a projecting spot portion having a desired shape, thereby forming the substrate.
  • Substrate can be obtained.
  • a metal substrate can be obtained by press molding.
  • the substrate of the present invention can also be a substrate in which a conductive substance is coated on a metal substrate.
  • the substrate of the present invention has a coating of a conductive substance on a silicon or plastic substrate
  • a silicon or plastic substrate is used. Molded plastic and its silicon
  • the substrate of the present invention can be obtained by coating a conductive substance on a plastic substrate by vapor deposition, plating, or the like. Further, the substrate of the present invention can also be manufactured by forming a projecting spot portion by etching or the like after coating a conductive coating layer on a flat substrate.
  • a method for manufacturing a substrate when the substrate of the present invention has a gold coating layer on a glass substrate will be described. However, the present invention is not limited to this embodiment.
  • chromium, titanium, nickel, and the like are deposited on the surface of the slide glass by a vacuum deposition apparatus, and then gold is deposited thereon.
  • a positive resist is applied on the gold-deposited slide glass by a spin coater and baked in an oven at 60 ° C. for 1 hour, for example.
  • the slide glass is irradiated with ultraviolet light through a photomask by an ultraviolet exposure apparatus.
  • a photomask having a pattern corresponding to the projecting spot portion having a desired shape is used.
  • a resist pattern can be formed on the surface of the slide glass with gold vapor deposition.
  • the gold surface around the resist pattern is etched with a gold etchant. After the substrate after the gold etching is washed with ultrapure water, further etching is performed with an etchant to remove chromium, titanium, nickel, and the like deposited under the gold, and the substrate is washed with ultrapure water.
  • the size of the entire substrate and the number of projecting spots on the substrate are not particularly limited, and can be appropriately set.
  • the substrate of the present invention can have about 100 to 500,000 protruding spots on a substrate having a size of 10 to 20 mm2.
  • a nucleic acid microarray of the present invention is a biomolecular microarray comprising the substrate of the present invention and a biomolecule, wherein the biomolecule is immobilized on at least a spot plane on the substrate.
  • the biomolecule comprises DNA, RNA, PNA, protein, polypeptide, sugar compound, lipid, natural small molecule, and synthetic small molecule. It can be at least one selected from the group, and can be selected according to the purpose.
  • examples of the sugar compound include a monosaccharide, an oligosaccharide, a polysaccharide, a sugar chain complex, a glycoprotein, a glycolipid, and a derivative thereof.
  • lipids examples include fatty acids, phospholipids, glycolipids, and glycerides.
  • Examples of natural small molecules include honolemon molecules, antibiotics, poisons, vitamins, bioactive substances, and secondary metabolites.
  • the synthetic small molecule examples include a synthetic product of a natural small molecule and a derivative thereof.
  • the projecting spot portion is used to immobilize the probe nucleic acid on the biomolecule fixing spot (projecting spot portion).
  • a solution containing a nucleic acid having at one end a group reactive with a metal on the top spot plane can be used as a spotting solution.
  • groups include thiol groups. Immobilization of the thiol group-containing nucleic acid chain on the metal surface can be performed by a known method.
  • a method of immobilizing DNA on a metal surface a method of performing the following treatment on a metal (having a surface oxide film activated and presenting a hydroxyl group) can also be used.
  • aminated DNA is immobilized on the substrate surface treated with aminosilane and then with glutaraldehyde.
  • Carboxylated DNA is immobilized on the aminosilane-treated substrate surface.
  • the thiolated DNA is immobilized on the thiolsilane-treated substrate surface.
  • immobilization by UV irradiation and immobilization via functional groups such as thiol, amino, carboxyl, and phosphate groups as described above are also possible.
  • the spotting of the biomolecule solution onto the spot plane can be performed by an ordinary method, for example, by contacting a needle holding a biomolecule solution at the tip with the spot plane at the top of the projecting spot. Can be. Examples of the spotting device used here include the devices described in JP-A-2001-46062 and JP-A-2003-57236.
  • the amount of the spot is adjusted so that the biomolecule solution does not flow out from the spot plane. It can be set appropriately according to the size of the working plane and the height of the projecting spot.
  • the invention further provides
  • An apparatus for promoting interaction of biomolecules comprising:
  • the substrate constituting the biomolecule microarray has a biomolecule-immobilizing spot (projecting spot portion) projecting from the substrate surface and having a spot plane on the top.
  • At least the protruding spot has a conductive material surface
  • a biomolecule is immobilized on the conductive material surface of the spot plane, and the biomolecule-immobilized spot is formed;
  • the device for promoting interaction of biomolecules characterized in that the substrate has, on a surface other than the projecting spot portion on the substrate, a terminal capable of conducting electricity with the surface of the conductive material of the projecting spot portion.
  • biomolecule interactions include, for example, hybridization between a probe nucleic acid and a target nucleic acid, an antigen-antibody interaction, a receptor ⁇ -1 ligand interaction, a protein-protein interaction, a DNA- Protein interactions.
  • the surface of the substrate other than the protruding spots has a conductive material coating layer, and the terminal is formed of a conductive material coating layer or a conductive material coating layer. It is preferable that the conductive material coating layer of the bracket and the conductive material surface of the projecting spot are provided as an integral conductive material coating layer.
  • the biomolecule microarray in the device can be the biomolecule microarray of the present invention. Further, the present invention provides a method for promoting the interaction of biomolecules using the device for promoting the interaction of biomolecules,
  • a solution containing a target biomolecule is arranged between the microarray and the electrode, and
  • the biomolecule microarray in the device has a projecting spot portion
  • the biomolecule microarray is provided so as to face a plane on which the biomolecules are fixed on the top of the projecting portion on the microarray and a surface of the microphone opening array having the biomolecule spot.
  • the electric field density increases between the surface of the electrode (counter electrode) and the surface opposite to the plane, and the target biomolecules in the solution can be electrophoresed (when a DC power supply is used) or dielectrophoresis (using an AC power supply). Is concentrated in the vicinity of the protrusion.
  • FIG. 6 (a) is a schematic view of the device for promoting the interaction of biomolecules of the present invention.
  • the counter electrode can be a substrate made of a conductive material, for example, a metal, a conductive oxide, a conductive plastic, or the like. Further, a conductive material coating layer is provided on a surface facing the microarray. It can also be composed of a substrate having In the present invention, in particular, if the counter electrode is a transparent electrode such as ITO (indium tin oxide) or tin oxide, the confocal type is simultaneously formed from above the transparent electrode during the interaction of biomolecules. The detector can detect reflected light and fluorescence, and the interaction can be detected in real time.
  • ITO indium tin oxide
  • tin oxide indium tin oxide
  • the substrate constituting the biomolecule microarray may be a substrate in which a transparent conductive coating layer is provided on light-transmitting glass or plastic, or may be a case where the entire substrate is made of a transparent conductive material.
  • a power supply for applying an electric field between the biomolecule microarray and the counter electrode may be a DC power supply or an AC power supply. More preferably, an AC power supply is used.
  • a DC power supply when a high voltage is applied, the target biomolecule solution is electrolyzed by the high voltage, and there is a concern that bubbles and the like are likely to be generated. Therefore, it is preferable to use a low voltage.
  • the DNA When using DNA as a target biological molecule, the DNA is negatively charged.When using a DC power supply, an electric field is applied so that the projecting spot side becomes positive. Is preferably added.
  • an AC power supply it is preferable to use a high-frequency AC because low-frequency AC may cause bubbles or the like to be generated due to electrolysis of the target biomolecule solution.
  • a spacer made of a non-conductive material may be interposed between the biomolecule microarray and the counter electrode so as not to cover the region having the projecting spot of the biomolecule microarray. it can. Examples of the non-conductive material include rubber, glass, and plastic.
  • the distance between the spot plane on the biomolecule microarray and the counter electrode can be set by the thickness of the spacer, and the spacer is surrounded by the spacer.
  • the filled space can be filled with a solution containing the target biomolecule.
  • the distance between the spot plane and the counter electrode can be appropriately set within a range in which the effect of target molecule bioconcentration by electrophoresis or dielectrophoresis can be obtained.For example, 1 to 500 ⁇ can do.
  • the interaction promoting device further includes a temperature control means such as a heater. The interaction can be further promoted by controlling the environment around the biomolecule to a temperature suitable for the interaction by the temperature control means.
  • the electric field applied between the biomolecule microarray and the counter electrode may be determined by electrophoresis or dielectrophoresis while considering the distance between the biomolecule microarray and the counter electrode.
  • the concentration can be appropriately set within a range in which the effect of concentration can be obtained. For example, it can be set to 0.001 to 1 OMV / m.
  • the type of buffer used for the target biomolecule solution It is preferable to appropriately set the applied electric field so as to obtain a high interaction promoting effect in accordance with the conditions.
  • the target biomolecules used in the above-described interaction promoting method are fluorescence-labeled in order to detect the interaction between biomolecules by detecting fluorescence with a confocal detector.
  • the fluorescent labeling of the target biomolecule can be performed by a known method.
  • the biomolecules immobilized on the microarray may be fluorescently labeled. Fluorescent labeling of biomolecules immobilized on the microarray can also be performed by a known method.
  • the target biomolecule solution may include a buffer. As a preferred buffer used for the target biomolecule solution, about
  • the pH is preferably in a neutral region.Therefore, it is preferable to use a buffer having a buffering capacity in the neutral region. preferable.
  • buffers containing the following buffer substances phenylalanine, carnosine, arginine, histidine, MES (2- (morpholine) ethanesulfonic acid), maleic acid, 3,3-dimethylglutaric acid , Carbonic acid, 4-Hydroxymethylimidazole, Cuenoic acid, Dimethinoleaminoethylamine, Prolinic acid, Glycerol-2-phosphate, PIPES (Piperazine- ⁇ -bis (2-ethanesulfonate)), Ethylenediamine, Imidazole, MOPS (3-( ⁇ morpholine) propanesulfonate), Phosphoric acid, TES Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfonate, 4-Methylimidazole, HEPES (2-Hydroxitytyl piperazine--2 -Ethanesulfonic acid), ⁇ ethylmorpholine, tri
  • the conductivity is used 1 0 ⁇ 5 0 0 ⁇ ⁇ 1 / !!! buffer, the conductivity is used 1 0 ⁇ 1 0 0 ⁇ 1 / !!! buffer Is more preferred. If the conductivity of the buffer is within the above range, the interaction of biomolecules can be favorably promoted.
  • the concentration of the buffer is preferably adjusted appropriately so as to obtain a conductivity within the above range.
  • a specific example of a preferable buffer includes a buffer containing phenylalanine, histidine, carnosine, and anoreginin as a substance of the buffer.
  • Example 5 when hybridization of a probe nucleic acid and a target nucleic acid is performed using a target biomolecule solution containing phenylalanine, a particularly high hybridization signal intensity can be obtained.
  • the application of an electric field can obtain a hybridization signal intensity twice or more as compared with the case where no electric field is applied.
  • phenylalanine is a buffer substance particularly effective in the present invention in which the interaction of biomolecules is promoted by applying an electric field.
  • the electric field applied between the microarray and the electrode is preferably set appropriately according to the buffer used so that a high biomolecular interaction promoting effect can be obtained.
  • phenylalanine when used as a buffer, 0.5 to 1.0 MV / m, for histidine, 0.5 to 1.0 MV / m, and carnosine for 0.25 to 0.75 MVZm, for arginine, 0.1 to 0.3
  • the present invention further provides a bioarray-immobilized spot of the microarray of the present invention, which is placed in an environment capable of interacting with the target biomolecule or placed in an environment capable of interacting with the target biomolecule.
  • the present invention also relates to a method for detecting an interaction between biomolecules, wherein the interaction between the biomolecule and the target biomolecule is detected by a confocal detector.
  • the principle of detection of reflected light and fluorescence by the confocal detector is as described above.
  • the method for detecting an interaction according to the present invention by using a confocal detector, the size and position of a spot are specified by a reflected image according to the above-described principle, whereby automatic gliding can be performed.
  • the biomolecule-immobilized spot on the microarray is reflected by the difference in the reflected light intensity due to the difference in height and / or shape between the biomolecule-immobilized spot on the microarray surface and the other portion. It can be detected as an image. Further, when fluorescence from the microarray is detected by the confocal detector, if the confocal detector is focused on the height of the spot plane at the top of the projecting spot on the microarray, the spot plane can be detected. By selectively detecting the fluorescence from the fluorescently labeled biomolecule (the biomolecule Z immobilized on the spot or the target biomolecule), a fluorescent image corresponding to the spot can be obtained.
  • a spot where an interaction occurs on a microarray can be specified by superimposing the reflection image and the fluorescence image thus obtained, and the degree of the interaction is measured based on the fluorescence intensity.
  • an interaction is detected by measuring the fluorescence from an interpolator using an intercalator.
  • a confocal scanner which can simultaneously detect reflected light and fluorescence.
  • FIG. 7 An example of such a device is shown in FIG. In the device shown in Fig. 7, the excitation light generated from the excitation light source (laser) 21 passes through the mirror 22, the dichroic mirror 23, the mirror 26, and the objective lens 24 to the sample (microarray) 25. Irradiated.
  • Reflected light is objective lens 24, mirror 26, dichroic mirror 23 (a part of reflected light is transmitted (less than a few percent)), dichroic mirror 27, neutral density filter 28, detection lens 29, pin
  • the light is guided to the reflected light detector 31 via the hole 30.
  • the fluorescent light passes through the two dichroic mirrors 23 and 27, is reflected by the mirror 32, and is guided to the fluorescent light detector 36 via the cut filter 33, the detection lens 34 and the pinhole 35.
  • the biomolecule-immobilized spot on the microarray is reflected from the difference in the reflected light intensity due to the difference in height and / or shape between the biomolecule-immobilized spot on the microarray surface and the other part.
  • the present invention provides a method for contacting a solution containing a target biomolecule with a biomolecule microarray having one or more spots on which immobilized biomolecules are immobilized on a substrate surface, Wherein the solution containing the target biomolecule contains phenylalanine, and the solution so that the target biomolecule in the solution migrates toward the biomolecule-immobilized spot.
  • Methods for contacting a solution containing a target biomolecule with a biomolecule microarray include a method of immersing a biomolecule microarray in a solution containing a target biomolecule, and a method containing a solution containing a target biomolecule in a microarray. And a method of dropping on a surface containing a biomolecule-immobilized spot. Further, as described later, when an electrode facing the microarray is provided, a solution containing a target biomolecule can be brought into contact with the biomolecule microarray by disposing a solution between the microarray and the electrode. .
  • an electric field is applied to the solution so that the target biomolecules in the solution containing the target biomolecules migrate toward the biomolecule-immobilized spot on the substrate.
  • the target biomolecule when an electric field is applied using a DC power supply, the target biomolecule is electrophoresed toward a biomolecule-immobilized spot on the substrate, and when an electric field is applied using an AC power supply, The target biomolecule performs dielectrophoresis toward the biomolecule-immobilized spot on the substrate.
  • the target biomolecule in the vicinity of the biomolecule spot is applied by applying an electric field and causing the target biomolecule to migrate toward the biomolecule spot on the substrate. It can increase the concentration and promote biomolecular interactions.
  • biomolecule interaction is remarkably promoted by incorporating phenylalanine, which has a low conductivity and a remarkably high biomolecule interaction promoting effect by applying an electric field, into the target biomolecule solution.
  • the conductivity of phenylalanine used in the method for interacting biomolecules of the present invention is preferably from 10 to 500 ⁇ - 1 "!!!, ⁇ 1 0 0 ⁇ ⁇ is more preferably an 1 / m. concentration of phenylene Ruaranin, as conductivity of the range is obtained, a method of interaction are preferred.
  • the biomolecule microarray used in (1) can be a biomolecule microarray having an electrode provided with a biomolecule-immobilized spot on the surface thereof on a substrate.
  • an electrode facing the electrode on the substrate can be used.
  • An electric field is applied between the two electrodes while a solution containing a biomolecule solution is in contact with the two electrodes.
  • a microarray having electrodes provided on a substrate and electrodes facing the electrodes on the substrate, and a solution containing a target living body disposed between the microarray and the electrodes; It is also possible to use the biomolecule interaction promoting device of the present invention, which can contact a solution containing molecules.
  • the electric field applied between the electrodes is as described in the description of the biomolecule interaction promoting device of the present invention.
  • the present invention provides a biomolecule microarray having at least one spot on which a biomolecule is immobilized on a substrate surface, and bringing a solution containing a target biomolecule into contact with the biomolecule microarray.
  • the solution containing the target biomolecule contains at least one buffer substance selected from the group consisting of phenylalanine, histidine, carnosine, and arginine,
  • the substrate is at least on the same surface as the surface on which the biomolecule-fixed spot is provided,
  • a pair of opposing electrodes is provided such that a biomolecule-immobilized spot is located between the pair of electrodes;
  • the types of biomolecules used in the method, the method for immobilizing the biomolecules on the substrate surface, and the types of biomolecular interactions are as described above.
  • Methods for bringing a solution containing a target biomolecule into contact with a biomolecule microarray include a method of immersing a biomolecule microarray in a solution containing a target biomolecule, and a method containing a solution containing a target biomolecule. A method of dropping the solution on a surface including a molecule-immobilized spot may be used.
  • the substrate used in the above method has at least one pair of opposed electrodes on the same surface as the surface on which the biomolecule-immobilized spot is provided, and the biomolecule-fixed spot is located between the pair of electrodes. It is provided as follows.
  • Figure 1 shows an example of such a substrate.
  • the substrate shown in FIG. 13 is one in which a layer made of a conductive material is formed on a part of the substrate by, for example, photolithography technology or the like to form a pair of counter electrodes.
  • a biomolecule microarray produced by immobilizing biomolecules on such a substrate can be used.
  • a biomolecule microarray having a biomolecule-immobilized spot between electrodes is brought into contact with a solution containing a target biomolecule; and An electric field is applied between the electrodes in a state where is brought into contact with.
  • the target biomolecule is directed toward the biomolecule-immobilized spot by dielectrophoresis (when an AC power source is used) or electrophoresis (when a DC power source is used), and the target biomolecule concentration near the biomolecule-fixed spot is detected.
  • the interaction of biomolecules can be promoted.
  • at least one buffer substance selected from the group consisting of phenylalanine, histidine, carnosine, and arginine, particularly phenylalanine, which has a remarkably high biomolecular interaction promoting effect by applying an electric field is used as a target.
  • the electric field applied between the electrodes can be appropriately set within a range in which the effect of enriching the target biomolecule by electrophoresis or dielectrophoresis can be obtained according to the type of the buffer substance to be used. .0 MV / m. Further, it is preferable to use a high frequency AC power supply for the reason described above.
  • the conductivity of at least one buffer substance selected from the group consisting of phenylalanine, histidine, carnosine, and arginine used in the method for interacting biomolecules of the present invention is as follows. 0 ⁇ 5 0 0 Q - 1 / is preferably m is, 1 0 ⁇ 1 0 ⁇ 1 / !!! more preferably is les. It is preferable to appropriately adjust the concentration of the buffer substance so as to obtain a conductivity in the above range. Examples Hereinafter, the present invention will be further described with reference to Examples. Example 1
  • Chromium was deposited to a thickness of 25 OA on the surface of the polished slide glass by a vacuum deposition apparatus, and then gold was deposited thereon to a thickness of 250 OA.
  • Positive resist S 1813 (Shipley Co.) was applied on a gold vapor-deposited slide glass with a spin coater and baked in a 60 ° C oven for 1 hour.
  • the slide glass was irradiated with ultraviolet light through a photomask by an ultraviolet exposure apparatus.
  • a photomask a circle having a diameter of 200 / zm and a square pattern having a side length of 200 m each having 11 ⁇ 11 patterns were used.
  • development was performed with a developing solution CD-26 (Shipley) to form a circular and square resist pattern having a diameter of about 200 ⁇ on the gold surface.
  • the above-mentioned gold-patterned glass substrate was immersed in 4.6% hydrofluoric acid for 50 minutes.
  • the glass surface is corroded to a depth of about 50 m and the undercut also erodes under the gold pattern from the lateral direction, resulting in a circle with a diameter of about 200 Attn and a square pattern with a side of about 200 ⁇ .
  • FIG. 8 a) is a photograph of the substrate manufactured in Example 1 taken with a digital camera. It can be seen from the image that the irregularities are formed.
  • Figure 8b) is a three-dimensional image of an optical section of a square spot taken with a confocal microscope. It can be seen that a projecting spot having a spot plane at the top is formed on the substrate. The height of the square spots had a height of about 50 / m.
  • the size of the spot plane on the substrate obtained in Example 1 was 90 ⁇ , and the angle between the substrate surface around the projecting spot and the side of the projecting spot was 110 °. .
  • Example 2 Example 2
  • a 5 ′ monofluorescent dye Cy 3 labeled DNA solution (tatgacaatg aatacggcta cagcaa cagg gtggtggacc tcatg (SEQ ID NO: 1) (gene name GAPDth solution composition: 50 ⁇ in 1 X microspotting solution (Telechem)) was supplied by RIKEN.
  • Developed DN A The arrayer stamped the spot plane on the top of the projecting spot of the nucleic acid microarray substrate prepared in Example 1.
  • the tip of the stamp needle was a circle with a diameter of 130 m.
  • the fluorescence and reflected light from the substrate on which the DNA solution was stamped were measured using a DNA microarray scanner capable of simultaneously measuring fluorescence and reflected light as shown in FIG.
  • the fluorescence image, (b) is the reflected light image, and (c) is the superposition of the two images.
  • the fluorescent image is displayed in red and the reflected image is displayed in green.
  • a circular fluorescent image displayed in red could be observed
  • a square fluorescent image displayed in red could be observed, and these fluorescent images were displayed in green.
  • the substrate of the present invention it matched the shape of the spot on the fluorescence image, demonstrating that the DNA stamp solution was stamped only on the spot plane at the top of the protruding spot on the substrate.
  • the focal depth for reflection of the scanner used in this example was 500 ⁇
  • the surface of the substrate around the protruding spot (the height difference from the spot plane on the top of the protruding spot: 50 m)
  • the reflected light from the spot was detected with almost the same intensity as the reflected light from the spot plane.
  • the angle between the substrate surface around the projecting spot and the side of the projecting spot was 110 degrees, the portion corresponding to the side in the reflection image was blackened.
  • the DNA microarray and the ITO electrode were faced to each other, a 0.17 mm glass was inserted between them for insulation, and the substrate and the electrode were fixed with clips.
  • a hybridization solution (cRNA: 1.45 g (equivalent to 0.05 ⁇ g of mRNA), hybridization buffer: 50 mM histidine) containing the above target in a space of 0.17 mm
  • cRNA 1.45 g (equivalent to 0.05 ⁇ g of mRNA)
  • hybridization buffer 50 mM histidine
  • a positive electrode was connected to the DNA microarray side, a negative electrode was connected to the ITO electrode, and a 3V DC charge was applied for 2 minutes at room temperature. Thereafter, washing was performed with 2 ⁇ SSC + 0.1% SDS, 1 ⁇ SSC (150 raM sodium chloride, 15 mM sodium citrate), and 0.1 ⁇ SSC.
  • the sample with charge (a) was brighter than the sample without charge (b).
  • the correlation between the target concentration and the fluorescence intensity is shown in Fig. 12. From Fig. 11 and Fig. 12, an AC charge was applied between the microarray and the counter electrode.
  • the effect of promoting the hybridization by dielectrophoresis can be obtained, and in this example, the fluorescence signal depending on the target concentration was obtained, and the signal was obtained by the negative control. Since no detection was detected, the degree of hybridization was measured based on the fluorescence intensity. You can see that you can do it. Also, by superimposing the fluorescence image of FIG. 11 (a) on the reflection image of FIG. 11 (c), it is possible to identify the spot where the hybridization has occurred.
  • the substrate prepared in Example 1 was stamped with a probe DNA solution (1 ⁇ microspotting solution (Telechem), 0.1 ° / oTween20) at a concentration of 180 ⁇ using a high-density arrayer.
  • the stamped probe gene is GAPDH (5, -gcagtggcaa agtggagatt gttgccatca acgacccctt cattg-3 '(SEQ ID NO: 8)), and the one modified with the linker for array 1 (Nisshinbo Industries, Inc.) on the 5, side did.
  • the substrate was irradiated with UV at 600 nJ m 2 , washed twice with ultrapure water for 5 min.
  • the hybridization reaction was performed while applying an electric field of 1 MHz ⁇ Vp-p 0 to 50 V between the microarray and the counter electrode for 10 minutes. After the reaction, the array was washed, and the hybridization signal intensity was calculated. The results are shown in FIG. (A) is a graph showing the correlation between the applied electric field and the intensity of the hybridization signal, and (b) is the result obtained when the hybridization was performed without applying the electric field. It is a graph which shows the intensity ratio with a signal (henceforth "signal increase rate"). In addition, Table 1 below summarizes the results for each buffer at the electric field where the signal increase rate was the maximum.
  • the electric field of phenylalanine is 6.54 times higher than that of 0.83 ⁇ 4 ⁇ -/ 111, and that of L-histidine is 0.40 times that of electric field-free hybridization. 3.66 times at 78M Vp-p / m, carnosine 2.16 times at 0.53M Vp-p / m, L-arginine 2.66 times at 0.25M Vp-p / m
  • the hybridization signal increase rate was shown ( Figures 3-1, 2: the figure number was changed later).
  • the substrate prepared in Example 1 was stamped with a probe DNA solution (1 ⁇ microspotting solution (Telechem), 0.1% Tween20) at a concentration of 180 ⁇ M using a high-precision arrayer.
  • the names and sequences of the 11 types of stamped probe genes are as shown in Table 2 below, and the 5′-side modified linker for array (Nisshinbo Industries, Ltd.) was used.
  • the substrate was irradiated with UV light at 600 mJ / cm 2 , washed twice with ultrapure water for 5 min. X, and dried.
  • a target DNA solution (5 ng / ⁇ l Cy3_ mouse brain cDNA, 50 mM L-histidine)
  • the mixture was heated at 95 ° C for 1 minute and left at room temperature for 2 minutes.
  • the DNA microarray thus obtained was placed on a thermal cycler set at 45 ° C, and a 30-mm-thick insulating film (Teijin Dupont film) was placed around the array as a spacer, and the target DNA solution was collected. 20 ⁇ l was applied to the stamp area. Then slide glass substrate (counter electrode) coated with ⁇ 0 (indium tin oxide) film Cover and fix both substrates.
  • the hybridization reaction was performed between the microarray and the counter electrode for 20 minutes at 1 MHz while applying an electric field at 3 O Vp-p. After the reaction, the array was washed with 2 ⁇ SSC / 0.1% SDS, 1 ⁇ SSC, and 0.2 ⁇ SSC solution at room temperature for 5 minutes each, and then subjected to a fluorescence scanner (Gene Scope II; Gene Focus). (Gene Focus) was used to calculate the hybridization signal intensity.
  • the upper part of FIG. 15 shows the intensity ratio between the signal obtained when the electric field was not applied and the signal obtained when the electric field was applied.
  • the lower column of FIG. 15 shows a graph obtained by plotting the signal intensity when an electric field is applied on the vertical axis and the signal when no electric field is applied on the horizontal axis for each sequence. '

Description

生体分子マイクロアレイ用基板、 生体分子マイクロアレイ、 相互作用促進用装置 および方法、 ならびに、 相互作用の検出方法
技術分野 明
本発明は、 生体分子固定の定量化及びデジタル解析が可能な生体分子マイク口 アレイ用基板、 前記基板に生体分子が固定さ書れていることを特徴とする生体分子 マイクロアレイ、 前記マイクロアレイを用いる、 生体分子の相互作用促進用装置 および相互作用促進方法、 ならびに、 生体分子の相互作用の検出方法に関する。
背景技術
遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸（ター ゲット核酸）を検出する目的で、プローブ核酸とターゲット核酸とのハイプリダイ ゼーシヨンが利用されている。 近年、 多数のプローブ核酸を基板に固定した D N Aチップや D NAマイクロアレイが実用されるようになり、 ターゲット核酸の検 出に使用されている。
D N Aチップや D NAマイクロアレイの作製においては、 基板に. D N Aを多数 スポットとして整列させて固定ィ匕する必要がある。 D N Aの固定化には、例えば、 チオールを一本鎖 D N Aに接合させ、 チオールィ匕した一本鎖 D N Aを、 例えば、 金属基板に固定化する方法が取られている。 そして、 固定化された D N Aに被検 体であるターゲット DN Aを作用させ、 ハイプリダイゼーシヨンの有無を検出す る。 ハイブリダィゼージョンの有無は、 例えば、 蛍光法を用いて、 ターゲット D N Aとハイブリダイズした固定化 D N Aのスポットの蛍光を測定することによつ て検出することができる。 スポッティング型の DNAマイクロアレイは、 プローブ DNAを含む液滴を基 板上に載せて乾かすことによって作製される。 そのため、 安価に作製できるとい う利点がある反面、 基板上に固定される DNAの均一さが保証されない、 すなわ ち、 DNA検出スポット部の寸法や形状がばらつくという欠点がある。 これらの 欠点は、 例えば DN A固定ィ匕基板において基板全面に DN A固定ィヒ処理 （PLL処 理） がされていることや、 また基板面が平らであることなどに起因する。 さらに、 スポッティング型の DNAマイクロアレイの場合、 DNA検出スポッ ト部の周囲に付着した固相化剤の存在により、 ターゲット DNAが非特異的に基 板上に吸着し、 ノイズの上昇を引き起こし、 S/N比を低下させるという問題も あった o また、 蛍光測定時において、 蛍光部分を特定するグリッディングという操作が 行われる。 グリッディングは、 アレイ上のスポットの縦横の数やスポット間隔、 スポットの直径の大きさを入力し、スポットを円で囲む操作をいう （「必ずデータ が出る DN Aマイクロアレイ実践マニュアル 基本原理、 チップ作製技術からバ ィォインフォマテイクスまで」、第 1版、 羊土社、 2002年 12月 1日、 p. 1 9— 21、 35, 106—108参照）。 しかし、 スタンプ形状および位置が安定 していないと、 蛍光解析時のグリッディング操作に非常に時間がかかる上、 正確 な解析が困難となる。 また、 グリッディングは、 スポットの位置がずれていると スポゾトを正確に囲むことが出来ないため、 ソフトウェアに、 自動で位置を補正 する機能が付いている。 しかるに、 すべての操作が自動になっているわけではな く、 手動でスポットの開始点の設定ゃ目視によりすベてのスポットのダリッドを 確認し補正する必要がある。 この操作は非常に煩雑であり、 D NAスポットの数 が数千以上になると非常に時間がかかる作業となり、 解析スピードを遅らせる要 因となっている。 一方、 基板上に固定化されたプローブ D N Aと試料ターゲット D N Aをハイブ リダィゼーシヨンさせるには、 通常、 十数時間要し、 しかも、 多量の試料ターゲ ット D NAが必要とされる。 そのため、 ハイブリダィゼーション時間および大量 の試料の調製に、 莫大な時間と費用、 労力が必要とされている。 特に、 低発現遺 伝子の解析を行う場合、 極めて多くのターゲット試料が必要となる。 そこで本発明の目的は、 生体分子マイクロアレイに一定形状の生体分子固定化 領域をもつ基板及び生体分子の相互作用、 特に核酸のハイブリダィゼーシヨンを 高速に行い、 かつ微量サンプルの相互作用を促進させ、 さらに高速 ·高感度に相 互作用を検出し解析する手段を提供することである。 更に、 本発明は、 生体分子の相互作用を促進して、 相互作用し得る生体分子間 で効率的に相互作用を形成させることができる相互作用促進用装置および方法を 提供することを目的とする。 更に、本発明は、グリツディング操作を自動で行う手段を提供することにより、 生体分子マイクロアレイからの蛍光データの収集おょぴデジタル解析の自動化を 可能にすることを目的とする。 より詳しくは、 本発明は、 高感度で生体分子の相互作用を検出でき、 好ましく は、 併せてダリッティングを自動で行うこともできる生体分子マイクロアレイ用 基板、 そのような基板に生体分子が固定化された生体分子マイクロアレイを提供 することを目的とする。 更に、 本発明は、 ダリッティングを自動で行うことを可能にする生体分子の相 互作用の検出方法を提供することを目的とする。 発明の開示 上記本発明の目的を達成するための手段は、 以下の通りである。
( 1 ) 基板表面に、 生体分子固定化用スポットを 1つ以上有する生体分子マイク ロアレイ用基板であって、
前記生体分子固定化用スポットが、 基板表面から突出し、 かつ頂上にスポット 用平面を有し （以下、 「突出スポット部」 という）、 かつ
少なくとも、 前記突出スポット部周辺の基板表面、 突出スポット部側面、 およ びスポット用平面が、 導電性物質からなることを特徴とする基板。
( 2 ) 前記突出スポット部周辺の基板表面が、 略 V字型底面を形成する （1 ) に 記載の基板。
( 3 ) 基板表面に、 生体分子固定化用スポットを 1つ以上有する生体分子マイク ロアレイ用基板であって、 前記生体分子固定化用スポットが、 基板表面から突出し、 かつ頂上にスポット 用平面を有し （以下、 「突出スポット部」 という）、
隣り合う突出スポット部は、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、 少なくとも、 前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、 導電性物質か らなることを特徴とする基板。
(4) 前記導電性物質が、 金、 ニッケル、 白金、 銀、 チタン、 アルミニウム、 ス テンレス、 銅、 導電性酸化物、 または導電性プラスチックである （1) 〜 （3) のいずれかに記載の基板。
(5) 前記基板は、 基板全体が導電性物質からなるか、 または、 基板表面に導電 性物質被覆層を有する （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載の基板。
(6) 前記導電性被覆層を有する基板が、 ガラス、 金属、 シリコン、 またはブラ スチックからなる （5) に記載の基板。
(7) 前記突出スポット部の高さが、 10〜500 μιηである （1) 〜 （6) の いずれかに記載の基板。
(8) 前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面との なす角が、 90度以上である （1) 〜 （7) のいずれかに記載の基板。
(9) 前記スポット用平面が粗面化されている （1) 〜 （8) のいずれかに記載 の基板。
(10) (1) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の基板および生体分子を含み、 生体 分子は、 前記基板上の少なくともスポット用平面に固定化されていることを特徴 とする生体分子マイクロアレイ。
(11) 前記生体分子は、 DNA、 RN.A、 PNA、 蛋白、 ポリペプチド、 糖化 合物、 脂質、 天然低分子、 および合成低分子からなる群から選ばれる少なくとも 一種である （10) に記載の生体分子マイクロアレイ。 (12) 基板上に 1つ以上の生体分子固定化スポットを有する生体分子マイクロ アレイ、
前記マイクロアレイの生体分子固定化スポットを有する面に対向するように設 けられた電極、 および
前記マイクロアレイと前記電極との間に電界を印加するための電源
を有する、 生体分子の相互作用促進用装置であって、
前記生体分子マイクロアレイを構成する基板は、 基板表面から突出し、 かつ頂 上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット（以下、「突出スポット部」 とレヽう） を有し、
少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、
前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化され、 前記生体分子 固定化スポットが形成されており、 かつ
前記基板は、 前記基板上の突出スポット部以外の表面に、 前記突出スポット部 の導電性物質表面と通電可能な端子を有することを特徴とする、 生体分子の相互 作用促進用装置。
(13) 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、 導電性物質被覆層を有し、 前記端子は、 前記導電性物質被覆層に含まれるか、 または、 前記導電性物質被覆 層と通電可能であり、 かっこの導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質 表面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられている（12)に記載の装置。
(14) 前記生体分子マイクロアレイが、 （ 10 ) または （ 11 ) に記載の生体分 子マイクロアレイである （12) または （13) に記載の装置。
(15) 前記スポット用平面と電極との距離が、 1〜500 μΐηである （12) 〜 （14) のいずれかに記載の装置。
(16) 前記マイクロアレイと電極との間に、 非導電性スぺーサーを有する （1 2) 〜 （15) のいずれかに記載の装置。
(17) 前記マイクロアレイの生体分子スポットを有する面に対向するように設 けられた電極が、 透明電極である （12) 〜 （16) のいずれかに記載の装置。
(18) 温度制御手段を更に有する （12) 〜 （17) のいずかに記載の装置。
(19) (12) 〜 (18) のいずれかに記載の装置を用いる、生体分子の相互作 用促進方法であって、
前記マイクロアレイと電極との間に、ターゲット生体分子を含む溶液を配置し、 かつ、
前記マイクロアレイと電極との間に電界を印加することを特徴とする、 生体分 子の相互作用促進方法。
(20) 前記マイクロアレイと電極との間に印加される電界が、 0. 001〜1 OMV/mである （19) に記載の方法。
(21) 前記ターゲット生体分子が、蛍光標識されている （19) または （20) に記載の方法。
(22)前記ターゲット生体分子を含む溶液が、フエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 およびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッフ ァー物質を含む、 （19) 〜 （21) のいずれかに記載の方法。
(23)ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれている力、または、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれていた （10) または （1 1) に記載のマイクロアレイの各生体分子固定化スポット上の生体分子と前記タ ーゲット生体分子との間の相互作用を、 共焦点型検出器によって検出することを 特徴とする生体分子の相互作用の検出方法。
(24) 前記マイクロアレイは、 （19) 〜 （22) のいずれかに記載の方法を用 いて、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれているか、 または、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれていた、 （2 3 )に記載の方 法。
( 2 5 ) 前記固定化スポット上の生体分子および/または前記ターゲット生体分 子が蛍光標識されている （2 3 ) または （2 4 ) に記載の方法。
( 2 6 ) 前記共焦点型検出器によって、 マイクロアレイ表面の突出スポット部と それ以外の部分の高さおよび/または形状の差による反射光強度の相違から、 マ イクロアレイ上の前記突出スポット部を反射像として検出する （2 3 ) 〜（2 5 ) のいずれかに記載の方法。
( 2 7 ) 前記反射像として検出された突出スポット部からの蛍光を検出すること により、 生体分子の相互作用を検出する （2 6 ) に記載の検出方法。
( 2 8 ) 基板表面に生体分子が固定ィ匕されたスポットを 1つ以上有する生体分子 マイクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固定化された 生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記ターゲット生体分子を含む溶液に、 フヱニルァラニンを含有させ、 かつ、 前記生体分子固定化スポットに向けて溶液中のターゲット生体分子が泳動する ように前記溶液に電界を印加して、 前記相互作用を促進する、 前記方法。
( 2 9 ) 前記マイクロアレイが、 生体分子固定化スポットを表面に設けた電極を 基板上に有するものであり、 前記基板上の電極と対向する電極を用い、 かつ前記 ターゲット生体分子を含む溶液が前記 2つの電極と接触する状態で、 前記電極間 に前記電界の印加を行う （2 8 ) に記載の方法。
( 3 0 ) 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子 マイクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固定化された 生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記ターゲット生体分子を含む溶液は、 フエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カル ノシン、 およびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッファー 物質を含有し、
前記基板は、 生体分子固定化スポットを設けた面と同一の面上に、 少なくとも 1つの対向する一対の電極を、 前記一対の電極間に生体分子固定化スポットが位 置するように設けたものであり、 かつ
前記ターゲット生体分子を含む溶液が上記一対の電極と接触する状態で、 上記 電極間に電界の印加を行い、 前記相互作用を促進する、 前記方法。 図面の簡単な説明 図 1は、 本発明で使用される共焦点型検出器の光学系の概略図である。
図 2は、 本発明の基板上の突出スポット部の概略図である。
図 3は、本発明の基板の粗面化されたスポット用平面の一例 （部分拡大図） を示 す。
図 4は、 略 V字型底面を有する基板の一部の拡大図を示す。
図 5は、 本発明の第二の態様の基板の一例を示す。
図 6は、 本発明の生体分子の相互作用促進用装置の概略図を示す。
図 7は、反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型スキャナーの光 学系の概略図を示す。
図 8は、実施例 1で作製した基板のデジタルカメラ像および共焦点顕微鏡像であ る。
図 9は、 実施例 2で得られた蛍光像 （a )、 反射像 （b )、 および、 蛍光像と反射 像とを重ね合わせた像 （c ) である。
図 1 0は、 実施例 3で得られた反射像およぴ蛍光像である。 図 1 1は、 実施例 4で得られた反射像およぴ蛍光像である。
図 1 2は、実施例 4におけるターゲット濃度と蛍光強度との相関を示十グラフで ある。
図 1 3は、本発明の生体分子を相互作用させる方法に使用することができる基板 の一例である。
図 1 4は、実施例 5で得られたハイブリダイゼーションシグナル強度を示すダラ フである。
図 1 5は、 実施例 6において、 電界を印加した場合に得られたハイブリダィゼ ーシヨンシグナルと電界を印加しなかった場合に得られたハイブリダィゼーショ ンシグナルを比較したグラフである。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明について更に詳細に説明する。
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本発明の生体分子マイクロアレイ用基板は、 基板表面に、 生体分子固定化用ス ポットを 1つ以上有する生体分子マイクロアレイ用基板であって、 前記生体分子 固定化用スポットが、 基板表面から突出し、 かつ頂上にスポット用平面を有する
(以下、 「突出スポット部」 という）。 更に、 本発明の生体分子マイクロアレイ用 基板は、少なくとも、前記突出スポット部周辺の基板表面、突出スポット部側面、 およびスポット用平面が、導電性物質からなるか（以下、「第一の態様」 という）、 または、隣り合う突出スポット部は、突出スポット部側面によつて隣接しており、 かつ、 少なくとも、 前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、 導電性物 質からなる （以下、 「第二の態様」 という） ことを特徵とする。
本発明の基板では、 生体分子固定化用スポットが、 突出スポット部の頂上の平 面に設けられている。 そのため、 本発明の第一の態様の基板では、 前記突出スポ ット部頂上のスポッ ト用平面 （生体分子固定化用スポット） は、 前記突出スポッ ト部周辺の基板表面より一段高い位置にあり、 両者間に高低差が生じる。 一方、 本発明において、 生体分子の相互作用の検出に用いられる共焦点型検出 器は、 試料上の焦点面からの反射光や蛍光を、 光学系の結像面に置かれたピンホ ールに通して検出する。 図 1に、 本発明で使用される共焦点型検出器 1 0の光学 系の概略図を示す。 図 1の実線 aは、 入射光を表す。 実線 bは、 焦点面からの反 射光または蛍光を表し、 破線は、 非焦点面からの反射光または蛍光を表す。 共焦 点型検出器 1 0では、マイクロアレイ 1上の焦点面から反射した反射光、および、 試料上の焦点面から放出された蛍光は、 対物レンズ 2を通ってビームスプリッタ 一 3へ入射し、 ビームスプリツター 3によって、 検出レンズ 4へ垂直に入射する ように光路が修正され、 検出レンズ 4を経て、 結像面 5へ入射する。 共焦点型検 出器 1 0は、 試料上での焦点が、 結像面でも焦点となるように設計されている。 よって、 試料上の焦点面からの光は、 結像面 5で焦点を結ぴ、 ピンホー 6を通 過して、 検出部 7で検出される。 一方、 試料上の非焦点面からの光は、 結像面 5 で焦点を結ばないため、 大部分がピンホール 6を通過せず、 検出部 7において検 出されない。 このように、 共焦点型検出器によれば、 焦点面からの光を、 選択的 に検出することができる。 本発明の第一の態様の基板では、 前記突出スポット部周辺の基板表面と、 前記 突出スポット部頂上のスポット用平面 （生体分子固定化用スポット） との高低差 が、 生体分子とターゲット生体分子との相互作用の検出において使用する共焦点 型検出器の焦点深度以上であれば、 共焦点型検出器の焦点を、 突出スポット部頂 上のスポット用平面の高さに合わせることにより、 検出器において、 突出部周辺 の基板表面からの蛍光や反射光よりも、 突出スポット部頂上のスポット用平面か らの蛍光や反射光を、 より高い強度で検出することができる。 従って、 本発明の 基板の突出スポット部頂上のスポット用平面に生体分子を固定化したマイクロア レイでは、 スポット上の情報、 例えば、 ターゲット生体分子との相互作用の有無 を、 高感度で検出することができる。 本発明の第二の態様の基板は、 隣り合う突出スポット部が、 突出スポット部側 面によって隣接しており、 かつ、 少なくとも、 前記突出スポット部側面おょぴス ポット用平面が、 導電性物質からなることを特徴とする。 本 明の第二の態様の 基板の一例を、 図 5に示す。 本発明の第一おょぴ第二の態様の基板において、 前記突出スポット部頂上のス ポット用平面と前記突出スポット部側面とのなす角は、 9 0度以上であることが 好ましい。 好ましくは、 9 0〜 1 3 5度である。 図 2 ( a ) は、 本発明の基板の 一部の断面図である。ここで、「突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポ ット部側面とのなす角」 とは、 図 2 ( a ) における角度 0をいう。 角度 Θは、 例 えば、突出スポット部を、突出スポット部周辺の基板表面に対して垂直に切断し、 その断面から求めることができる。 このように、 本発明の基板において、 突出スポット部頂上のスポット用平面と 突出スポット部側面とのなす角が 9 0度以上であることにより、 即ち、 突出スポ ット部底面の大きさが、 突出スポット部頂上のスポット用平面の大きさ以上であ ることにより、 グリツティングを自動で行って、 生体分子固定化用スポットの位 置おょぴ大きさを特定することができるという利点がある。 以下に、 この点につ いて、 詳述する。 図 2 ( a ) に示すように、 突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポッ ト部側面とのなす角が 9 0度以上である場合、 共焦点型の検出器を使用して反射 光を検出する際に、 突出スポット部頂上のスポット用平面に対して垂直な方向か ら照射した光 （図 2 ( a ) に矢印で表される光） に対する突出スポット部側面か らの反射光は、 入射光と同一方向には反射しない。 一方、 突出スポット部頂上の スポット用平面からの反射光は、 入射光と同一方向に反射する。 このため、 共焦 点型検出器では、 突出スポット部頂上のスポット用平面からの反射光のみが検出 され、 側面からの反射光は検出されない。 こうして得られた反射像には、 突出ス ポット部頂上のスポット用平面に相当する像が、 反射像として得られ、 突出スポ ット部側面に相当する部分は、 反射光がほとんど検出されないので黒色の縁取り として表れる。 この反射像では、 黒い縁取りの内部が生体分子スポットに相当す るため、 この反射像により、 スポットの大きさおよび位置を特定することができ る。 本発明では、 このような原理により、 自動グリツティングを行うことが可能 である。 また、 本発明の第一の態様の基板において、 突出スポット部の高さが相互作用 の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、 共焦点型検出器 の焦点を、 突出スポット部頂上のスポット用平面の高さに合わせれば、 突出スポ ット部周辺の基板表面からの反射光は、 焦点が合わないため、 突出スポット部頂 上のスポット用平面からの反射光よりもはるかに弱い強度でし力 \検出されない。 本発明では、この高低差を利用して自動ダリッティングを行うことも可能である。 但し、 前記突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の 焦点深度より小さい場合であっても、 前述のように、 反射像において、 突出スポ ット部側面に相当する部分が黒色の縁取りとして表れれば、 スポットの大きさお よび位置を特定することが可能である。 また、 本発明の第一の態様の基板では、 前記突出スポット部頂上のスポット用 平面と突出スポット部側面とのなす角が 9 0度未満であっても、 突出スポット部 の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深度以上である場合は、 スポット用平面と、 突出スポット部周辺の基板表面との高低差を利用して、 反射 像によって、 スポット用平面の位置および大きさを特定し、 自動でグリツティン グを行うことができる。 前記突出スポット部頂上のスポット用平面と突出スポッ ト部側面とのなす角が 9 0度である場合、前記突出スポット部の形状は、例えば、 円柱状または角柱状であることができる。 さらに、 本発明の第一の態様の基板は、 前記突出スポット部頂上のスポット用 平面と前記类出スポット部側面とのなす角が、 9 0度以上であり、 かつ、 前記突 出スポット周辺の基板表面が、略 V字型底面を形成する基板であることもできる。 このような基板では、 共焦点型検出器で検出されるスポット用平面からの反射光 強度が、基板上のスポット用平面以外の部分からの反射光強度より強くなるため、 この反射光強度の違いにより、 スポット用平面の位置および大きさを特定するこ とができる。 図 4は、 「略 V字型底面」 を有する基板の一部の拡大図である。 本発 明において、 「略 V字型底面」とは、 例えば、 隣り合う突出スポット部間の突出ス ポット部周辺の基板表面が平面ではなく、 図 4に示すように、 略 V字を形成して いることをいう。 更に、 本発明の第一の態様の基板は、 少なくとも、 前記突出スポット部周辺の 基板表面、 突出スポット部側面、 およびスポット用平面が、 導電性物質からなる ことを特徴とする。 製造の容易さや製造コストを考慮すれば、 本発明の第一の態 様の基板は、 基板上の、 前記突出スポット周辺以外の基板表面も、 導電性物質か らなるものであることが好ましい。 また、 本発明の第二の態様の基板は、 少なく ともと突出スポット部側面および突出スポット部平面が、 導電性物質からなるこ とを特徴とする。 本発明では、 前記のように、 第一の態様の基板においては、 少なくとも、 突出 スポット部周辺の基板表面、 突出スポット部側面、 およびスポット用平面が、 第 二の態様の基板においては、 少なくとも、 突出スポット部側面およびスポット用 平面が、 導電性物質からなることにより、 後述するように、 前記基板に対向する 電極を設け、 電界を印加することによって、 スポット用平面に固定化された生体 分子とターゲット生体分子との相互作用を促進することができる。 例えば、 ター ゲット生体分子の濃度が低い場合でも、 良好な相互作用結果を得ることができ、 また、 濃度が同一の場合には、 より'短時間で所定の相互作用結果を得ることがで きる。 また、 本発明では、 前記導電性物質が、 光を反射する性質を有するものであれ ば、 反射光によって、 生体分子固定化スポットの大きさおよび位置を特定し、 自 動でダリッティングを行うことができる。 この点については後述する。 本発明において、 前記突出スポット部の高さは、 相互作用の検出において使用 する共焦点型検出器の焦点深度以上の高さになるように、 適宜設定することがで きる。 通常の共焦点型検出器の焦点深度を考慮すると、 前記突出スポット部の高 さは、 例えば、 1 0〜5 0 0 μ πιとすることができる。 伹し、 前述のように、 基 板上の突出スポット部頂上のスポット用平面とそれ以外の部分との形状の差によ る反射光強度の相違を検出することによって自動グリツティングを行う場合は、 前記突出スポット部の高さが相互作用の検出に使用する共焦点型検出器の焦点深 度より小さくても、 自動グリツティングが可能である。 この点については、 後述 する。 また、前記突出スポット部の高さを決定する際は、生体分子のスポット形成（ス タンピング） に使用するニードルの直径や、 プローブ核酸等の生体分子溶液のス ポット量も考慮する必要がある。 例えば、 直径 1 0 0 μ πιの円形の突出スポット 部に対して直径 1 3 0 z m程度のニードルを用いて生体分子をスポットする場合、 突出スポット部の高さが 1 5 μ πι以上であれば、 表面張力のため、 突出スポット 部頂上のスポット用平面から生体分子溶液が流れ出すことなく、 固定化用スポッ トのみに、 生体分子が固定化されるため、 好ましい。 本発明の基板において、 突出スポット部頂上のスポット用平面の形状は、 スポ ットされた生体分子を保持し得る形状であれば、いずれの形状であることもでき、 例えば、 円形や正方形であることができる。 前記スポット用平面の大きさは、 ス ポットに用いるニードルやスポットする生体分子溶液の量に応じて適宜設定する ことができ、例えば、 1 0〜5 0 0 μ πιとすることができる。 ここで、 「スポッ ト 用平面の大きさ」 とは、 例えば、 スポット用平面の形状が円形の場合は、 その直 径をいい、 スポット用平面の形状が正方形の場合は、 その一辺の長さをいう。 突出スポット部底面の形状は、 特に限定されないが、 製造の容易さ等を考慮す れば、 スポット用平面と同様の形状であることが好ましい。 図 2 ( b ) は、 本発 明の基板上の突出スポット部の概略図である。 ここで、「突出スポット部底面の形 状」 とは、 図 2 ( b ) の斜線部をいう。 前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、 粗面化されていてもよい。 例え ば、 前記突出スポット部頂上のスポット用平面は、 深さ方向と略水平方向に、 相 互作用の検出において使用する共焦点型検出器の焦点深度以内の深さの凹凸を有 していてもよい。 図 3に、 粗面化されたスポット用平面の一例 （部分拡大図） を 示す。 粗面化されたスポット用平面の一例としては、 図 3に示すような、 数; 角の格子状の形状を設けたスポット用平面を挙げることができる。 このように、 スポット用平面が粗面化されていることにより、 後述するように、 電気泳動また は誘電泳動によるターゲット生体分子の濃縮効果を得る場合に、 凹凸の角 （エツ ジ） 部分に強電界が生じ、 相互作用が更に促進されるという利点がある。 スポット用平面の粗面化方法は特に限定されず、 例えば、 本発明の基板がブラ スチック成型基板の場合、 フォトリソグラフィ一によりエッチングした母材を、 電铸法により反転写した微細加工金型を用いることにより、 スポット用平面が粗 面化された基板を製作することができる。 本発明の基板は、 基板全体が導電性物質からなるか、 また、 基板表面に導電性 物質被覆層を有するものであることができる。 前述のように、 反射像によって自動グリツティングを行う場合には、 前記導電 性物質は、 光を反射する性質を有する物質から選択する。
また、 金属とチオール基との結合を利用して、 プローブ核酸の固定ィヒを行う場 合は、 前記導電性物質は、 チオール基と結合性を有する金属から選択する。 前記導電性物質としては、 例えば、 金属 (例えば、 金、 ニッケル、 白金、 銀、 チタン、 アルミニウム、 ステンレス、 銅）、 導電性酸化物 （例えば、 I n 20 5/ S n 0 2) および導電性プラスチック （例えば、 ポリアセチレン） を挙げること ができる。 また、 導電性物質被覆層を有する基板としては、 ガラス、 シリコン、 プラスチ ック、 具体的には、 ポリプロピレン等の基板の表面に、 前記導電性物質を被覆し たものを挙げることができる。 基板上の導電性物質被覆層の厚さは、 特に限定さ れるものではなく、 例えば、 0 . 1〜1 0 μ πιとすることができる。 本発明において、 前記基板が、 金属からなるものである場合は、 所望の形状の 突出スポット部に対応した凹部を有する錶型に、 熔融した金属を注入して鐯造す ることにより、 本発明の基板を得ることができる。 また、 プレス成形によって、 金属製基板を得ることもできる。 本発明の基板は、 金属からなる基板の上に、 導 電性物質を被覆したものであることもできる。 本発明の基板が、 シリコンまたはプラスチック製の基板上に導電性物質の被覆 を有するものである場合は、 例えば、 所望の形状の突出スポット部に対応した凹 部を有する成形型を用いてシリコンまたはプラスチックを成形し、 そのシリコン またはプラスチック製の基板上に、 導電性物質を、 蒸着、 メツキ等によって被覆 することにより、 本発明の基板を得ることができる。 また、 本発明の基板は、 平板状の基板上に導電性被覆層を被覆した後に、 エツ チング等により突出スポット部を形成することによって製造することもできる。 次に、 本発明の基板が、 ガラス基板上に金被覆層を有するものである場合の、 基板の製造方法の一例を説明する。 但し、 本発明はこの態様に限定されるもので はない。
まず、 スライドガラスの表面に、 真空蒸着装置により、 クロム、 チタン、 ニッ ケル等を蒸着し、 次いで、 その上に金を蒸着する。 この金蒸着スライドガラス上 に、 ポジ型レジストをスピンコーターで塗布し、 例えば 6 0 °Cでオーブンにより 1時間べ一キングする。
次いで、 紫外線露光装置により、 フォトマスクを通してスライドガラスに紫外 線を照射する。 このとき、 フォトマスクとしては、 所望の形状の突出スポット部 に対応したパターンを有するものを使用する。 紫外線照射後、 現像液によって現 像を行えば、 金蒸着スライドガラス表面に、 レジストパターンを形成することが できる。 次いで、 レジストパターン周辺の金表面を、 金エツチャントによってエツチン グする。 金エッチング後の基板を超純水によって洗浄した後、 金の下に蒸着され たクロム、 チタン、 ニッケル等を除去するために、 エツチャントにより更にエツ チングを行い、 超純水によって洗浄する。
アセトン等によってレジストを溶解した後、 超純水によって洗浄し、 更に残つ ているレジストを完全に除去するために、ビラユア溶液（硫酸：過酸化水素 = 1 ： 1 ) に例えば 1 0分間漬けて、 超純水で洗浄する。 これにより、 フォトマスクに 対応した金パターンを有するガラス基板を得ることができる。 次に、 上記基板を、 フッ化水素酸に浸漬し、 露出しているガラス表面をエッチ ングする。 このときに使用するフッ化水素酸の濃度および浸漬時間は、 所望の突 出スポット部の高さに応じて適宜設定することができる。 次に、 前述と同様に、 金およびクロム等のエッチングを行った後、 ピラニア溶 液および超純水によって基板を洗浄し、 所望の形状の突出スポット部を有するガ ラス基板を得ることができる。 .
このガラス基板に、 前述と同様に、 クロム等を蒸着し、 次いで、 金を蒸着する ことによって、 突出部を有し、 かつ、 金被覆を有する基板を得ることができる。 本発明において、 基板全体の大きさ、 基板上の突出スポット部の数おょぴ集積 度は特に限定されず、 適宜設定することができる。 例えば、 本発明の基板は 1 0 〜2 0， 0 0 0 mm2の大きさの基板上に、 突出スポット部を、 1 0〜5 0， 0 0 0個程度有するものであることができる。
[生体分子マイクロアレイ]
本発明の核酸マイクロアレイは、 本発明の基板および生体分子を含み、 生体分 子は、 前記基板上の少なくともスポット用平面に固定化されていることを特徴と する生体分子マイクロアレイである。前記生体分子は、 D NA、 R NA、 P NA、 蛋白、 ポリペプチド、 糖化合物、 脂質、 天然低分子、 および合成低分子からなる 群から選ばれる少なくとも一種であることができ、 目的に応じて選択することが できる。
ここで、 糖化合物としては、 例えば、 単糖、 オリゴ糖、 多糖、 糖鎖複合体、 糖 蛋白質、 糖脂質、 およびそれら誘導体などを挙げることができる。
脂質としては、 例えば、 脂肪酸、 リン脂質、 糖脂質、 グリセリ ドなどを挙げる ことができる。
天然低分子としては、 例えば、 ホノレモン分子や抗生物質、 毒物、 ビタミン類、 生理活性物質、 二次代謝産物などを挙げることができる。
合成低分子としては、 例えば、 天然低分子の合成物、 およびそれら誘導体など を挙げることができる。 本発明では、 生体高分子が核酸であり、 かつ、 前記導電性物質が金属である場 合、 プローブ核酸を生体分子固定化用スポット （突出スポ ト部） に固定化する ために、 突出スポット部頂上のスポット用平面の金属と反応性を有する基を一端 に有する核酸を含む溶液を、 スポッティング溶液として用いることができる。 そ のような基としては、 チオール基を挙げることができる。 チオール基を有する核 酸鎖の金属表面への固定化は、 公知の方法によって行うことができ、 例えば、 J.
Am. Chem. Soc. 1998， 120, 9787-9792を参照することができる。 金属表面への D NAの固定化方法としては、 金属 （表面酸化被膜を活性ィヒさせ 水酸基を提示させたもの）に対して以下の処理を行う方法を用いることもできる。
( 1 ) アミノシラン処理した基板表面に、 UV照射することにより、 D NAを固 定化する。
( 2 ) アミノシラン、 HS (N-ヒ ドロキシスクシンイミ ド） -ピオチン、 アビジン によつて順次処理した基板表面に、 ビォチン化 D N Aを固定ィ匕する。
(3)アミノシラン、 マレイミ ド-ビォチン、 アビジンによって順次処理した基板 表面に、 ビォチン化 DN Aを固定化する。
(4) アミノシラン、 次いでグルタルアルデヒドによって処理した基板表面に、 アミノ化 DNAを固定ィ匕する。
(5) アミノシラン、 次いでカルポジイミ ドによって処理した基板表面に、 アミ ノ化 DNAを固定化する。
(6) アミノシラン処理した基板表面に、 カルボキシ化 DN Aを固定化する。
(7) アミノシラン処理した基板表面に、 リン酸化 DNAを固定化する。
(8) アミノシラン、 次いで NHS—マレイミ ド化合物によって処理した基板表面 に、 チオール化 DN Aを固定化する。
(9) エポキシシラン処理した基板表面に、 アミノ化 DN Aを固定化する。
(10) チオールシラン処理した基板表面に、 チオール化 DN Aを固定ィ匕する。 また、 DNA以外の生体分子についても、 上記のような、 UV照射による固定 化や、 チオール基、 アミノ基、 カルボキシル基、 リン酸基などの官能基を介して の固定^:が可能である。 前記スポット用平面への生体分子溶液のスポッティングは、 常法により行うこ とができ、 例えば、 先端に生体分子溶液を保持したニードルを、 突出スポット部 頂上のスポット用平面に接触させることにより行うことができる。 ここで使用さ れるスポッティング用装置としては、 例えば、 特開 2001— 46062号公報 およぴ特開 2003— 57236号公報に記載の装置を挙げることができる。 ス ポット量は、 スポット用平面から生体分子溶液が流れ出さないように、 スポット 用平面の大きさや、突出スポット部の高ざに応じて、適宜設定することができる。
[相互作用促進用装置、 相互作用促進方法]
本発明は更に、
基板上に 1つ以上の生体分子固定化スポットを有する生体分子マイクロアレイ、 前記マイクロアレイの生体分子固定化スポットを有する面に対向するように設 けられた電極、 および
前記マイクロアレイと前記電極との間に電界を印加するための電源
を有する、 生体分子の相互作用促進用装置であって、
前記生体分子マイクロアレイを構成する基板は、 基板表面から突出し、 かつ頂 上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット （突出スポット部） を有 し、
少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、
前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化され、 前記生体分子 固定化スポットが形成されており、 かつ
前記基板は、 前記基板上の突出スポット部以外の表面に、 前記突出スポット部 の導電性物質表面と通電可能な端子を有することを特徴とする、 生体分子の相互 作用促進用装置
に関する。 このような生体分子の相互作用としては、 例えば、 プローブ核酸とタ 一ゲット核酸とのハイブリダィゼーシヨン、 抗原一抗体相互作用、 レセプタ^ ^一 リガンド相互作用、 タンパク一タンパク相互作用、 D N A—タンパク相互作用を 挙げることができる。
前記基板上の突出スポット部以外の表面は、 導電性物質被覆層を有し、 前記端 子は、 前記導電性物質被覆層に含まれるカゝ、 または、 前記導電性物質被覆層と通 電可能であり、 かっこの導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表面と は、 一体の導電性物質被覆層として設けられていることが好ましい。 前記装置に おける生体分子マイクロアレイは、 前記本発明の生体分子マイクロアレイである ことができる。 更に、 本発明は、 前記の生体分子の相互作用促進用装置を用いる、 生体分子の 相互作用促進方法であって、
前記マイクロアレイと電極との間に、ターゲット生体分子を含む溶液を配置し、 かつ、
前記マイクロアレイと電極との間に電界を印加することを特徴とする、 生体分 子の相互作用促進方法
に関する。 前記装置における生体分子マイクロアレイは、 突出スポット部を有するため、 マイクロアレイ上の突出部頂上の生体分子が固定化された平面と、 前記マイク口 アレイの生体分子スポットを有する面に対向するように設けられた電極 （対向電 極） の、 前記平面と対向する面との間で電界密度が高まり、 溶液中のターゲット 生体分子が、 電気泳動 （直流電源を使用した場合） または誘電泳動 （交流電源を 使用した場合） によって突出部近傍に濃縮される。
これにより、 突出スポット部に固定化された生体分子と、 ターゲット生体分子 との相互作用を促進させることができる。 特に、 前記生体分子マイクロアレイに おいて、生体分子が固定化されたスポット平面が粗面化されている場合、例えば、 スポット平面に、 共焦点型検出器の焦点深度以内で深さ方向と略水平方向に凹凸 を有する場合は、 凹凸の角 （エッジ） 部分に強電界が生じ、 相互作用が更に促進 されるという利点がある 前記対向電極は、 前記生体分子マイクロアレイと対向電極との間に電界を印加 することができるものであれば、 特に制限はない。 図 6 ( a ) に、 本発明の生体 分子の相互作用促進用装置の概略図を、 図 6 ( b ) に、 本発明の生体分子の相互 作用促進用装置の断面図を示す。 本発明において、 対向電極は、 導電性物質、 例 えば、 金属、 導電性酸化物、 導電性プラスチック、 等からなる基板であることが でき、 また、 マイクロアレイと対向する面に、 導電性物質被覆層を有する基板か らなるものであることもできる。 本発明では、 特に、 前記対向電極が、 例えば、 I T O (酸化インジウムスズ）、酸化スズなどの透明電極であれば、生体分子の相 互作用中に、 同時に、 透明電極の上から、 共焦点型検出器で反射光および蛍光の 検出を行うことができ、相互作用をリアルタイムで検出することができる。また、 前記生体分子マイクロアレイを構成する基板が、 光透過性のガラスやプラスチッ ク上に、 透明の導電性被覆層を設けたものである場合や、 基板全体が透明の導電 性物質からなる場合も、 同様に、 相互作用をリアルタイムで検出することができ る。 また、 前記相互作用促進用装置において、 生体分子マイクロアレイと対向電極 との間に電界を印加するための電源は、 直流電源でも、 交流電源でもよい。 より 好ましくは、 交流電源が用いられる。 直流電源を使用する場合は、 高電圧をかけ ると、 ターゲット生体分子溶液が高電圧により電気分解し、 気泡等が発生しやす いという懸念があるため、 低電圧を使用することが好ましい。 ターゲット生体分 子として D NAを使用する場合には、 D NAがマイナスに荷電されているため、 直流電源を使用する場合は、 突出スポット部側が、 プラスになるように電界を印 加することが好ましい。 交流電源を使用する場合は、 低周波交流では、 ターゲッ ト生体分子溶液の電気分解により気泡等が発生しゃすレ、という懸念があるため、 高周波交流を使用することが好ましい。 前記相互作用促進用装置において、 生体分子マイクロアレイと対向電極との間 には、 生体分子マイクロアレイの突出スポット部を有する領域が覆われないよう に、 非導電性材料からなるスぺーサーを挟むことができる。 前記非導電性材料と しては、 例えば、 ゴム、 ガラス、 プラスチックを挙げることができる。 本発明の 装置では、 このスぺーサ一の厚さにより、 生体分子マイクロアレイ上のスポット 用平面と対向電極との距離を設定することができ、 また、 このスぺーサ一によつ て囲まれた空間に、 ターゲット生体分子を含む溶液を充填することができる。 前 記スポット用平面と対向電極との距離は、 電気泳動または誘電泳動によるターゲ 5/ト生体分子濃縮の効果が得られる範囲で適宜設定することができ、 例えば、 1 〜5 0 0 μ πιとすることができる。 前記相互作用促進用装置は、 ヒーター等の温度制御手段を更に有することが好 ましい。 温度制御手段によって、 生体分子周辺の環境を、 相互作用に適した温度 に制御することにより、 相互作用を更に促進することができる。 前記装置において、 生体分子マイクロアレイと対向電極との間に印加される電 界は、 前記の生体分子マイクロアレイと対向電極との間の距離を考慮しつつ、 電 気泳動または誘電泳動によるターゲット生体分子の濃縮の効果が得られる範囲で 適宜設定することができ、 例えば、 0 . 0 0 1〜1 O MV/mとすることができ る。 また、 後述するように、 ターゲット生体分子溶液に用いるバッファーの種類 に応じて、 高い相互作用促進効果が得られるように、 印加電界を適宜設定するこ とが好ましい。 本発明では、 共焦点検出器によって蛍光を検出することにより生体分子間の相 互作用を検出するために、 前記の相互作用促進方法に用いられるターゲット生体 分子は、 蛍光標識されているものであることが好ましい。 ターゲット生体分子の 蛍光標識は、 公知の方法で行うことができる。 また、 本発明では、 マイクロアレ ィに固定化される生体分子が、 蛍光標識されていてもよい。 マイクロアレイに固 定される生体分子の蛍光標識も、 公知の方法で行うことができる。 本発明において、 ターゲット生体分子溶液はバッファーを含むことができる。 ターゲット生体分子溶液に用いるバッファ一として、 好ましいものとしては、 約
6〜 8付近の解離定数 (pKa)を有するものが挙げられる。プローブ核酸とターゲッ ト核酸とのハイブリダィゼーシヨンを効率よく起こさせるためには、 p Hが中性 域であることが好ましいため、 中性域で緩衝能を有するバッファーを使用するこ とが好ましい。 具体的には、 以下のバッファー物質を含むバッファーが挙げられ る ； フエ二ルァラニン、 カルノシン、 アルギニン、 ヒスチジン、 MES (2- ( モル ホリン）エタンスルホン酸）、 マレイン酸、 3， 3-ジメチルグルタル酸、 炭酸、 4-ヒ ドロキシメチルイミダゾール、 クェン酸、 ジメチノレアミノエチルァミン、 プロリ ン酸、 グリセロール- 2-リン酸、 PIPES (ピペラジン-^ -ビス（2-エタンスルホ ン酸））、 エチレンジァミン、 イミダゾール、 MOPS (3- (^モルホリン）プロパンス ルホン酸）、 リン酸、 TES トリス（ヒ ドロキシメチル）メチル- 2 -アミノエタンス ルホン酸）、 4 -メチルイミダゾール、 HEPES ( 2 -ヒ ドロキシェチルピペラジン - - 2-エタンスルホン酸）、 ^ェチルモルホリン、 トリエタノールァミン、 トリ ス（トリス（ヒ ドロキシメチル）ァミノメタン) ターゲット生体分子溶液に用いるバッファーの伝導率が過度に高いと、 パッフ ァ一中のイオンの移動により、 ターゲット生体分子の濃縮効果が低減するおそれ がある。 そこで、 本発明では、 伝導率が 1 0〜5 0 0 μ Ω 1/!!!のバッファーを 用いることが好ましく、伝導率が 1 0〜1 0 0 Ω 1/!!!のバッファーを用いる ことが更に好ましい。 バッファーの伝導率が上記範囲内であれば、 生体分子の相 互作用を良好に促進することができる。 また、 バッファーの濃度は、 上記範囲内 の伝導度が得られるように、 適宜調整することが好ましい。 以上の観点から、好ましいバッファ一の具体例としては、バッファ一物質として、 フエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 ァノレギニンを含むバッファーを挙げ ることができる。後述する実施例 5に示すように、プローブ核酸とターゲット核酸 とのハイブリダイゼーシヨンを、フエ二ルァラニンを含有するターゲット生体分子 溶液を用いて行うと、特に高いハイブリダイゼーションシグナル強度を得ることが でき、 し力も、電界印加により、電界を印加しない場合と比べて 2倍以上のハイブ リダィゼーシヨンシグナル強度を得ることができる。 このように、フエ二ルァラ二 ンは、 電界を印加することにより生体分子の相互作用を促進する本発明において、 特に効果を発揮するバッファー物質である。 なお、 マイクロアレイと電極との間に印加する電界は、 高い生体分子相互作用 促進効果が得られるように、 使用するバッファーに応じて適宜設定することが好 ましい。 例えば、 フエ二ルァラニンをバッファ一として用いる場合には、 0 . 5 〜1 . 0 MV/m、 ヒスチジンの場合は、 0 . 5〜1 . 0 MV/m、 カルノシン の場合は、 0 . 2 5〜0 . 7 5 MVZm、 アルギニンの場合は、 0 . 1〜0 . 3
MV/m、 の範囲の電界を印加することが好ましい。
[相互作用の検出方法]
本発明は更に、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境に置かれているか、 または、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境に置かれていた、 本発明のマ イクロアレイの各生体分子固定化スポット上の生体分子と前記ターゲット生体分 子との間の相互作用を、 共焦点型検出器によって検出することを特徴とする生体 分子の相互作用の検出方法にも関する。 共焦点型検出器による反射光および蛍光 の検出原理については、 前述の通りである。 本発明の相互作用の検出方法では、 共焦点型検出器を用いて、 前述の原理で反射像によってスポットの大きさおよび 位置を特定することで、 自動グリツティングを行うことができる。 即ち、 本発明 によれば、 マイクロアレイ表面の生体分子固定化スポットとそれ以外の部分の高 さおよび/または形状の差による反射光強度の相違から、 マイクロアレイ上の生 体分子固定化スポットを、 反射像として検出することができる。 更に、 共焦点型 検出器によって、 マイクロアレイからの蛍光を検出するときに、 マイクロアレイ 上の突出スポット部頂上のスポット平面の高さに、 共焦点型検出器の焦点を合わ せれば、 前記スポット平面上の蛍光標識された生体分子 （スポットに固定化され た生体分子おょぴ Zまたはターゲット生体分子）からの蛍光を選択的に検出して、 スポットに対応する蛍光像を得ることができる。 本発明では、 こうして得られた 反射像と蛍光像を重ね合わせることによって、 マイクロアレイ上の相互作用が起 こっているスポットを特定することができ、 その蛍光強度により、 相互作用の程 度を測定することができる。 なお、 本発明では、 インターカレーターを用いて、 ィンタ一力レーターからの蛍光を測定することによって相互作用を検出すること もできる 特に、 本発明では、 反射光と蛍光とを同時に検出することができる共焦点型ス キヤナーを用いることが好ましい。 そのような装置の一例を、 図 7に示す。 図 7 に示す装置では、 励起光源 （レーザー） 2 1から発生した励起光はミラー 2 2、 ダイク口ックミラーミラー 2 3、 ミラー 2 6、対物レンズ 2 4、を介して試料（マ イクロアレイ） 2 5に照射される。 反射光は対物レンズ 2 4、 ミラー 2 6、 ダイ クロックミラー 2 3 (反射光の一部を透過 （数パーセント以下)）、 ダイクロック ミラー 2 7、 減光フィルター 2 8、 検出レンズ 2 9、 ピンホール 3 0を介して反 射光検出部 3 1に導かれる。 蛍光は 2つのダイクロックミラー 2 3、 2 7を透過 し、 ミラー 3 2にて反射しカットフィルター 3 3、 検出レンズ 3 4、 ピンホール 3 5を介して蛍光検出部 3 6に導かれる。 このような装置によれば、 マイクロア レイ表面の生体分子固定化スポットとそれ以外の部分の高さおよび/または形状 の差による反射光強度の相違から、 マイクロアレイ上の生体分子固定化スポット を反射像として検出し、 同時に、 そのスポットからの蛍光を検出することによつ て、 生体分子の相互作用を検出することができる。 更に、 本発明は、 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有す る生体分子マイクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固 定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、 前記ターゲット生体分子を含む溶液に、 フエ二ルァラニンを含有させ、 かつ、 前記生体分子固定化スポットに向けて溶液中のターゲット生体分子が泳動する ように前記溶液に電界を印加して、 前記相互作用を促進する、 前記方法、 にも関 する。 前記方法において使用される生体分子の種類、 基板表面への生体分子の固定化 方法、 生体分子の相互作用の種類に いては、 前述の通りである。 生体分子マイ クロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させる方法としては、 タ一ゲ ット生体分子を含む溶液に、 生体分子マイクロアレイを浸漬する方法や、 ターゲ ット生体分子を含む溶液を、 マイクロアレイの生体分子固定化スポットを含む面 上に滴下する方法等が挙げられる。 また、 後述するように、 前記マイクロアレイ と対向する電極を設ける場合には、 マイクロアレイと電極との間に溶液を配置す ることにより、 生体分子マイクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触 させることができる。 前記方法では、 基板上の生体分子固定化スポットに向けて、 ターゲット生体分 子を含む溶液中のターゲット生体分子が泳動するように、 前記溶液に電界を印加 する。 この場合、 直流電源を用いて電界を印加する場合には、 ターゲット生体分 子は、 基板上の生体分子固定化スポットに向けて電気泳動し、 交流電源を用いて 電界を印加する場合には、 ターゲット生体分子は、 基板上の生体分子固定化スポ ットに向けて誘電泳動する。 前記本発明の生体分子を相互作用させる方法では、 このように、 電界を印加して、 基板上の生体分子スポットに向けてターゲット生 体分子を泳動させることにより、 生体分子スポット近傍のターゲット生体分子濃 度を高め、 生体分子相互作用を促進することができる。 更に、 本発明では、 伝導 率が低く、 かつ、 電界印加による生体分子相互作用促進効果が顕著に高いフエ二 ルァラニンを、 ターゲット生体分子溶液に含有させることにより、 生体分子相互 作用を顕著に促進することができる。 前記本発明の生体分子を相互作用させる方法において使用されるフエ二ルァラ ニンの伝導率は、前述のように、 1 0〜5 0 0 Ω— 1 "!!!であることが好ましく、 1 0〜1 0 0 μ Ω一1/ mであることがより好ましい。 フエ二ルァラニンの濃度は、 前記範囲の伝導率が得られるように、 適宜調整することが好ましい。 前記生体分子を相互作用させる方法において用いられる生体分子マイクロアレ ィは、 生体分子固定化スポットを表面に設けた電極を基板上に有する生体分子マ イクロアレイであることができる。'そのようなマイクロアレイとしては、 前記本 発明の生体分子マイクロアレイを用いることができる。 生体分子固定化スポットを表面に設けた電極を基板上に有する生体分子マイク ロアレイを用いる場合、 前記基板上の電極と対向する電極を用い、 かつ、 電界印 加による相互作用促進効果が顕著に高いフエ二ルァラニンを含有するターゲット 生体分子溶液を含む溶液が前記 2つの電極と接触する状態で、 前記電極間に電界 を印加して生体分子固定化スポット近傍のターゲット生体分子濃度を高めること により、 基板表面に固定化された生体分子とターゲット生体分子との相互作用を 促進することができる。 前記方法では、 生体分子固定化スポットを表面に設けた 電極を基板上に有するマイクロアレイと前記基板上の電極と対向する電極とを含 み、かつ、マイクロアレイと電極との間にターゲット生体を含む溶液を配置して、 生体分子マイクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させることがで きる、 前記本発明の生体分子相互作用促進用装置を用いることもできる。 また、 電極間に印加する電界については、 先に、 本発明の生体分子相互作用促進用装置 の説明で記載したとおりである。 更に、 本発明は、 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有す る生体分子マイクロアレイにターグット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固 定化された生体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であつて、 前記ターゲット生体分子を含む溶液は、 フエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カル ノシン、 およびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッファー 物質を含有し、
前記基板は、 生体分子固定ィヒスポットを設けた面と同一の面上に、 少なくとも
1つの対向する一対の電極を、 前記一対の電極間に生体分子固定化スポットが位 置するように設けたものであり、 かつ
前記ターゲット生体分子を含む溶液が上記一対の電極と接触する状態で、 上記電 極間に電界の印加を行い、 前記相互作用を促進する、 前記方法、 にも関する。 前記方法において使用される生体分子の種類、 基板表面への生体分子の固定化 方法、 生体分子の相互作用の種類については、 前述の通りである。 生体分子マイ クロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させる方法としては、 ターゲ ット生体分子を含む溶液に、 生体分子マイクロアレイを浸漬する方法や、 ターゲ ット生体分子を含む溶液を、 マイクロアレイの生体分子固定化スポットを含む面 上に滴下する方法等が挙げられる。 前記方法で用いられる基板は、 生体分子固定化スポットを設けた面と同一の面 上に、 少なくとも 1つの対向する一対の電極を、 前記一対の電極間に生体分子固 定ィ匕スポットが位置するように設けたものである。 そのような基板の一例を、 図
1 3に示す。 図 1 3に示す基板は、 例えば、 光リソグラフィー技術等によって、 導電性物質からなる層を基板上の一部に作製して一対の対向電極としたものであ る。 前記方法では、 このような基板上に、 生体分子を固定化して作製した生体分 子マイクロアレイを用いることができる。 前記方法では、 このようなマイクロア レイを用いて、 電極間に生体分子固定化スポットを有する生体分子マイクロアレ ィとターゲット生体分子を含む溶液とを接触させ、 かつ、 前記電極とターゲット 生体分子溶液とを接触させた状態で、 電極間に電界を印加する。 これにより、 タ ーゲット生体分子を生体分子固定化スポットに向けて誘電泳動 （交流電源を用い た場合） または電気泳動 （直流電源を用いた場合） させて生体分子固定ィヒスポッ ト近傍のターゲット生体分子濃度を高めることができ、 生体分子の相互作用を促 進することができる。 特に、 本発明では、 電界印加による生体分子相互作用促進 効果が顕著に高いフエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 およびアルギニ ンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッファー物質、 特にフエ二ルァラ ニンを、 ターゲット生体分子溶液に含有させることにより、 生体分子の相互作用 を顕著に促進することができる。 電極間に印加する電界は、 使用するバッファー 物質の種類に応じて、 電気泳動または誘電泳動によるターゲット生体分子の濃縮 の効果が得られる範囲で適宜設定することができ、 例えば、 0 . 5〜1 . 0 MV /mとすることができる。 また、 使用する電源は、 先に記載した理由から、 高周 波交流電源を用いることが好ましい。 前記本発明の生体分子を相互作用させる方法において使用されるフエ二ルァラ ニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 およびアルギニンからなる群から選ばれる少な くとも 1つのバッファー物質の伝導率は、 前述のように、 1 0〜5 0 0 Q - 1 / mであることが好ましく、 1 0〜1 0 Ω 1/!!!であることがより好ましレ、。 バッファー物質の濃度は、 前記範囲の伝導率が得られるように、 適宜調整するこ とが好ましい。 実施例 以下、 本発明を実施例によって更に説明する。 実施例 1
核酸マイクロアレイ用基板の作製
1) 表面研磨したスライ ドガラスの表面に、 真空蒸着装置により、 クロムを 25 OA厚で蒸着した後、 金をその上に 250 OA厚で蒸着した。
2) 金蒸着スライドガラス上にポジ型レジスト S 1813 (シプレー社） をスピ ンコーターで塗布し、 60°Cオーブンにより 1時間べ一キングした。
3) 紫外線露光装置により、 フォトマスクを通して上記スライドガラスに紫外光 を照射した。 フォトマスクは、 直径 200 /zmの円と 1辺 200 mの正方形の パターンがそれぞれ 11 X 11個形成されているものを使用した。 照射後、 現像 液 CD— 26 (シプレー社） により現像を行い、 直径約 200 μπιの円と正方形 のレジストパターンを金表面上に形成した。
4) 円と正方形のレジストパターンの周辺分の露出している金表面を金エツチヤ ント （ヨウ化カリゥム：ヨウ素：水 =6 ： 1 ： 80) により金をエッチングした。 超純水で洗浄した後、 金のエッチングにより露出したクロムをクロムエッチヤン ト （10%硝酸二セリウムアンモニゥム （I V)) によりエッチングを行レ、、超純 水で洗浄した。
5) アセトンにつけ、 レジストを溶解後、 超純水で洗浄し、 さらに残っているレ ジストを完全に除去するために、 ピラニア溶液 （硫酸：過酸化水素 =1 ： 1) に 10分間つけ、 超純水で洗浄した。 この段階で、 ファ トマスク通りに円と正方形 の金パターンを有するガラス基板が作製された。
6) 次に露出しているガラス表面をエッチングするために、 上記の金パターンガ ラス基板を 4. 6% フッ化水素酸に 50分間浸漬した。 これにより、 ガラス表 面は、 約 50 mの深さ分だけ腐食され、 またアンダーカットにより金パターン の下も横方向から侵食され、 直径約 200 Attnの円と 1辺約 200 μπιの正方形 のパターンは、 約 g O m (直径又は 1辺） のパターンとなった。
7) 4) と同様に、 金とクロムのエッチングを行った後、 ピラニア溶液、 超純水 で基板を洗浄した。
8) 1) と同様に、 クロムと金を蒸着し、 金が表面に蒸着された核酸マイクロア レイ用基板を作製した （図 8)。 図 8 a) は、 実施例 1で作製された基板をデジタルカメラにて撮影したもので ある。 凹凸が形成されていることが像からわかる。 図 8 b) は、 正方形のスポッ トについて、共焦点顕微鏡により光学切片を撮像し、 3次元構築したものである。 基板上に、 頂上にスポット用平面を有する突出スポット部が形成されていること がわかる。 正方形のスポットの高さは、 約 50 / mの高さを有していた。 実施例 1で得られた基板上のスポット用平面の大きさは、 90 μπιであり、 突出スポッ ト部周辺の基板表面と、 突出スポット部側面とのなす角は、 1 1 0度であった。 実施例 2
核酸マイクロアレイ用基板への D Ν Αスタンビング
5 ' 一蛍光色素 C y 3を標識した DN A溶液 (tatgacaatg aatacggcta cagcaa cagg gtggtggacc tcatg (配列番号 1 ) (遺伝子名 GAPDth溶液組成： 50 μΜ i n 1 Xマイクロスポッティング溶液（テレケム社)） を、理研で開発した DN A アレイヤーにより、 実施例 1で作製した核酸マイクロアレイ用基板の突出スポッ ト部頂上のスポット用平面へスタンプした。 スタンプ針の先端は、 直径 1 3 0 mの円形であった。 図 7に示す蛍光と反射光とを同時に計測することができる D N Aマイクロアレイスキャ^ "一によって、 D N A溶液をスタンプした基板からの 蛍光および反射光の計測を行った（図 9 )。 ( a )が蛍光像、 （b )が反射光像、 ( c ) が二つの画像の重ね合わせである。 ここで使用した D NAマイクロアレイスキヤ ナーでは、 蛍光像は赤色で、 反射像は緑色で表示される。 円形のスポットでは、 赤色で表示された円形の蛍光像が観察でき、 また、 正方形のスポットでは、 赤色 で表示された正方形の蛍光像が観察できた。 また、 これらの蛍光像を、 緑色で表 示された反射像と重ね合わせたところ、 蛍光像のスポットの形と一致したことか ら、 D NAスタンプ溶液が、 基板上の突出スポット部頂上のスポット用平面のみ にスタンビングされたことが証明された。 このように、 本発明の基板によれば、 反射像により、 基板上の突出スポット部頂上のスポット用平面の位置おょぴ大き さを認識し、 D N Aがスタンプされた領域を特定することができる。
なお、 本実施例で使用したスキャナーの反射用の焦点深度は 5 0 0 μ πιであつ たため、 突出スポッ ト部周辺の基板表面 （突出スポット部頂上のスポット平面と の高低差： 5 0 m) からの反射光も、 スポット平面からの反射光とほぼ同様の 強度で検出された。 但し、 本実施例では、 突出スポット部周辺の基板表面と、 突 出スポット部側面とのなす角が、 1 1 0度であったため、 反射像で、 側面部に相 当する部分が黒い縁取りとして表れることにより、 スポットの位置おょぴ大きさ を特定することができた。 実施例 3
電気泳動によるハイブリダイゼーションの促進効果の検証 （直流電荷） 実施例 1で得られた核酸マイクロアレイ用基板の突出スポット部頂上のスポッ 卜用平面に、 チォールイ匕 DN Aプローブ (tatgacaatg aatacggcta cagcaacagg g tggtggacc tcatg (配列番号 2)、 遺伝子名 GAPDH) を固定化し、 蛍光標識マウス脳 c RNAをターゲットとしてハイブリダイゼーションを行った。
DNAマイクロアレイと I TO電極を向かい合うようにし、 その間に絶縁のた めに 0. 1 7 mmのガラスをはさみ、 基板と電極とをクリップにより固定した。 0. 1 7 mmの空間に上記ターゲットを含有するハイブリダィゼーシヨン溶液（ c RNA： 1. 4 5 g (mRNA 0. 05 μ gに相当）、 ハイプリダイゼーショ ンバッファー： 50mMヒスチジン） を入れ、 DNAマイクロアレイ側には、 プ ラス電極をつなぎ、 I TO電極には、 マイナス電極をつなぎ、 室温で、 3Vの直 流電荷を 2分間かけた。 その後、 2 X S S C + 0. 1% SDS、 1 X S SC (1 50raM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム）、 0. 1 X S SCで洗浄を行つ た。
図 7に示す蛍光と反射光とを同時に計測することができる D N Aマイクロアレ ィスキャナーによって、 このマイクロアレイを観察した結果、 図 1 0に示すよう に、 電荷をかけたもの （c) では、 電荷をかけなかったもの （b) に比べ明らか に高い蛍光シグナルが得られ、 電気泳動により、 ハイブリダイゼーションの促進 効果があることが明らかとなった。 またこの蛍光像を、 反射像 （a) と重ね合わ せれば、 ハイブリダィゼーシヨンの生じたスポットを特定することができる。 実施例 4
誘電泳動によるハイブリダイゼーションの促進効果の検証 （交流電荷）
実施例 1で得られた核酸マイクロアレイ用基板の突出スポット部頂上のスポッ ト用平面に、 5種類の DNAプローブ （配列番号 3 ： ggccgttctgcttacagtggcttg cagagcagctcctacttgatg ·遣 ナ名 NFレ 酉己列番号 4 ： gtaccaacattgcctcctagcaga gaagtgtgtgtgtgagaagcc · 伝ナ名 Ubiquitin2eヽ 酉 d列番"^ 5 ： ttttgtccccccaact tgatgtatgaaggctttggtctccctggg iifeナ名 β - actin、 酉己歹! ]¾·号 6 ： gcagtggcaaag tggagattgttgccatcaacgaccccttcattg逾 子名 gapdh、酉己列番^" 7 ： agccaggaaat ttgtcgagagcgcagccacttctttcagtgttgc
Figure imgf000041_0001
psbP) を末端固 し、 5 光 C y3標識した各相補ォリゴ D N Aをターゲットとしてハイブリダイゼーシヨンを 行つた。ハイブリダイゼーション溶液は 50raMヒスチシ"ンとし、各相捕鎖ォリゴ D N A の最終ターゲット濃度を、配列番号 3の D N Aプローブについては 0. 001 μ Μ、配 列番号 4の D N Aプローブについては 0. 01 μ Μ、 配列番号 5の D Ν Αプローブに ついては 0. 1 μ Μ、配列番号 6の D NAプローブについては 1 μ Μ、配列番号 7の D Ν Αプローブについては Ο ^ Μ (無添加） として調製混合した。 マイクロアレイと 対向金電極を向かい合うようにし、その間に絶縁のために 0. 03膽のゴムシートを はさみ、マイクロアレイと電極とをクリップにより固定した。 0. 03mmの空間に上 記ターゲットを有するハイプリダイゼーシヨン溶液を入れ、 マイクロアレイと対 向金電極とを、 電源 ·発振器につなぎ、 1ΜΗζ、 0. 2MV/mの交流電荷を 2分間かけ た。 図 7に示す蛍光と反射光とを同時に計測することができる D N Aマイクロア レイスキャナーによって、 このマイクロアレイを観察した結果、 図 1 1に示すよ うに、 電荷をかけたもの （a ) では、 電荷をかけなかったもの （b ) に比べ明ら かに高い蛍光シグナルが得られた。 ターゲット濃度と蛍光強度との相関を、 図 1 2に示す。 図 1 1およぴ図 1 2より、 マイクロアレイと対向電極との間に交流電 荷を印加することによって、 誘電泳動によるハイプリダイゼーシヨンの促進効果 が得られることがわかる。 また、 本実施例で、 ターゲット濃度に依存した蛍光シ グナルが得られていること、 および、 ネガティブコントロールでシグナルが検出 されなかったことから、 蛍光強度により、 ハイプリダイゼーシヨンの程度を測定 することができることがわかる。 また、 図 1 1 (a) の蛍光像を、 図 1 1 (c) の反射像と重ね合わせれば、 ハイプリダイゼーシヨンの生じたスポットを特定す ることができる。 実施例 5
誘電泳動によるハイプリダイゼーションにおけるバッファーの影響
実施例 1で作製した基板に、高密度アレイヤーにより、 プローブ DN A溶液 (1 Xマイクロスポッティング溶液 （テレケム社）、 0. l°/oTween20) を、 180 ^Μの 濃度でスタンプした。 スタンプしたプローブ遺伝子は GAPDH (5， -gcagtggcaa agtggagatt gttgccatca acgacccctt cattg-3' (配列番号 8)) であり、 5， 側にァ レイ用リンカ一（日清紡績 （株)） 修飾を施したものを使用した。 スタンプ後処理 として、基板を 600nJん m2で UV照射し、超純水で 5min. X2回洗浄し乾燥させた。 ターゲット DNA溶液 （1μΜ5， 末端 Cy3蛍光-オリゴ DNA (プローブ DNAの 相補的な配^)、 10〜50mM のフエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 また はアルギニン含有バッファー） を調製した後、 前記アレイを 45°Cにセットした サーマルサイクラ一上に置き、 30 μπι厚の絶縁フィルム （帝人デュポンフィル ム） をスぺーサ一としてアレイ周辺部に配置し、 ターゲット DNA溶液 20 β 1 をスタンプエリアにアプライした。 引続き、 IT0 (インジウム '酸化スズ） 膜でコ ートしたスライドグラス基板 （対向電極） をかぶせ、 両基板を固定した （図 6)。 マイクロアレイと対向電極との間に、 10分間 1MHz · Vp-p 0〜50 Vの電界を 印加しながらハイプリダイゼーシヨン反応を行った。 反応後、 アレイを洗浄した 後にハイブリダィゼーションシグナル強度を算出した。結果を図 14に示す。（a ) は、 印加電界とハイプリダイゼーションシグナル強度との相関を示すグラフであ り、 （b) は、電界を印加せずにハイブリダィゼーシヨンを行った場合に得られた シグナルとの強度比 （以下、 「シグナル増加率」 ともいう） を示すグラフである。 更に、 下記表 1に、 各バッファーについて、 シグナル増加率が最大であった電界 における結果をまとめた。 表 1に示したように、 無電界ハイブリダィゼーシヨン と比べて、 フエ二ルァラニンは、 電界0. 8¾^ - /111にぉぃて6. 54倍、 L-ヒスチジ ンは、 電界 0. 78M Vp-p/mにおいて 3. 66倍、 カルノシンは、 電界 0. 53M Vp-p/m において 2. 16倍、 L-アルギニンは、 電界 0. 25M Vp- p/mにおいて 2. 66倍のハイブ リダイゼーシヨンシグナル増加率を示した （図 3-1, 2：図番は後で変更)。 これら の結果から、 フエ二ルァラ -ン、 ヒスチジン、 カルノシン、 アルギニンを含むパ ッファーを用いた場合に、 特に、 フエ二ルァラニンを用いた場合に、 本発明の生 体分子相互作用促進方法において、 高いハイブリダイゼーション促進効果が得ら れることがわかる。
表 1
Figure imgf000044_0001
実施例 6
実サンプル c D N Aを用いた誘電ハイブリダィゼーシヨン促進効果
実施例 1で作製した基板に、 高精度アレイヤーによりプローブ D N A溶液 (1 Xマイクロスポッティング溶液（テレケム社）、 0. l%Tween20) を、 180 μ Μ の濃度 でスタンプした。 スタンプした 1 1種類のプローブ遺伝子名と配列は下記表 2に 記載の通りであり、 5' 側にアレイ用リンカ一 （日清紡績 （株)） 修飾を施したも のを使用した。 スタンプ後処理として、 基板を 600mJ/cm2で UV照射し、 超純水で 5min. X 2回洗浄し乾燥させた。
ターゲット D N A溶液 (5ng/ μ 1 Cy3_マウス脳 c D N A、 50mM L-ヒスチジン） を調製した後、 95°Cで 1分間加熱し、 2分間室温に放置した。 こうして得られた D NAマイクロアレイを、 45°Cにセットしたサーマルサイクラ一上に置き、 30 ΠΙ 厚の絶縁フィルム （帝人デュポンフィルム） をスぺーサ一としてアレイ周辺部に 配置し、 ターゲット D NA溶液 20 μ 1をスタンプエリアにアプライした。 引続き ΙΤ0 (インジウム '酸化スズ） 膜でコートしたスライドグラス基板 （対向電極） を かぶせ、 両基板を固定した。
マイクロアレイと対向電極との間に 20分間 1MHzで、 3 O Vp-pで電界を印加し ながらハイブリダィゼーシヨン反応を行った。反応後、アレイを 2 X SSC/0. 1%SDS、 1 X SSC、 0. 2 X SSC溶液により、各々 5分間室温で洗浄した後、蛍光スキャナー（ジ ーンスコープ I I (Gene Scope I I ) ；ジーンフォーカス （Gene Focus) 社製） でハイブリダイゼーシヨンシグナル強度を算出した。 各配列について、 電界を印 加しなかつた場合に得られたシグナルと電界を印加した場合に得られたシグナル との強度比を、 図 1 5上欄に示す。 各配列について、 電界印加時のシグナル強度 を縦軸に、 電界を印加しなかった場合のシグナルを横軸にとってプロットして得 られたグラフを、 図 1 5下欄に示す。'
図 1 5に示すように、 各種配列に対して、 電界を印加した場合には、 電界を印加 しなかった場合と比べて、 5倍強の蛍光シグナル強度の増加が示された（図 1 5 )。 表 2
(1 )beta-actin 5 ' -TTTTGTCCCCCCMCTTGATGTATGAAGGCTTTGGTCTCCCTGGG-3 ' (配列番号 9)
(2)肌 5 ' -GGCCGTTCTGCTTACAGTGGCTTGCAGAGCAGCTCCTACTTGATG-3 ' (配列番号 10)
(3)Ubiqiiitin 2e 5 ' -GTACCAACATTGCCTCCTAGCAGAGMGTGTGTGTGTGAGMGCC-3 ' (配列番号 1 1 )
(4)hsc70 5 ' -CCTATGGTGCAGCTGTCCAGGCAGCCATTCTATCTGGAGACMGT-3 ' (配列番号 1 2)
(5)rpL3 5 ' -GGTGAGGTGACCMTGACTTCATCATGCTCAMGGCTGTGTGGTG-3 ' (配列番号 13)
(6)Akt 5 ' -GCTGGACMGGACGGGCACATCMGATMCGGACTTCGGGCTGTG-3' (配列番号 1 )
(7) Transthyretin 5 ' -ACCATCGCAGCCCTGCTCAGCCCATACTCCTACAGCACCACGGCT-3 ' (配列番号 15)
(8)rpS5 5 ' -CATTGCTGTGAAGGAGMGTATGCCAAGTACCTGCCCCACAGTGC-3 f (配列番号 16)
(9)HCN1 5 ' -GTGCCACAGCGTGTCACCTTGTTCAGACAGATGTCCTCGGGAGCC-3 ' (配列番号 17)
(10)GAPDH 5 ' -GCAGTGGCAMGTGGAGATTGTTGCCATCMCGACCCCTTCATTG-3 ' (配列番号 8)
(1 1 )LhblB2 5 ' -ACTCMGTTATCCTCATGGGAGCTGTTG GGCTACAGAGTCGCC-3 ' (配列番号 18) 産業上の利用可能性 本発明によれば、 生体分子マイクロアレイに一定形状の生体分子固定化領域を 持つ基板及び生体分子の相互作用、 特にハイプリダイゼーシヨンを高速に行い、 かつ微量サンプルの相互作用を促進させ、 さらに高速 ·高感度に相互作用を検出 し解析する手段を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 基板表面に、 生体分子固定化用スポッ トを 1つ以上有する生体分子マイクロ アレイ用基板であって、
前記生体分子固定化用スポットが、 基板表面から突出し、 かつ頂上にスポット 用平面を有し （以下、 「突出スポット部」 という）、 かつ
少なくとも、 前記突出スポット部周辺の基板表面、 突出スポット部側面、 およ びスポット用平面が、 導電性物質からなることを特徴とする基板。
2 . 前記突出スポット部周辺の基板表面が、 略 V字型底面を形成する請求項 1に 記載の基板。
3 . 基板表面に、 生体分子固定化用スポットを 1つ以上有する生体分子マイクロ アレイ用基板であって、
前記生体分子固定化用スポットが、 基板表面から突出し、 かつ頂上にスポット 用平面を有し （以下、 「突出スポット部」 という）、
隣り合う突出スポット部は、突出スポット部側面によって隣接しており、かつ、 少なくとも、 前記突出スポット部側面およびスポット用平面が、 導電性物質か らなることを特徴とする基板。
4 . 前記導電性物質が、 金、 ニッケル、 白金、 銀、 チタン、 アルミニウム、 ステ ンレス、 銅、 導電性酸化物、 または導電性プラスチックである請求項 1〜 3のい ずれか 1項に記載の基板。
5 . 前記基板は、 基板全体が導電性物質からなる力、 または、 基板表面に導電性 物質被覆層を有する請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の基板。
6 . 前記導電性被覆層を有する基板が、 ガラス、 金属、 シリコン、 またはプラス チックからなる請求項 5に記載の基板。
7 . 前記突出スポット部の高さが、 1 0〜5 0 0 /x mである請求項 1〜6のいず れか 1項に記載の基板。
8 . 前記突出スポット部頂上のスポット用平面と前記突出スポット部側面とのな す角が、 9 0度以上である請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の基板。
9 . 前記スポット用平面が粗面化されている請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載 の基板。
1 0 . 請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の基板および生体分子を含み、 生体分 子は、 前記基板上の少なくともスポット用平面に固定化されていることを特徴と する生体分子マイクロアレイ。
1 1 . 前記生体分子は、 D NA、 RNA、 P NA、 蛋白、 ポリペプチド、 糖化合 物、 脂質、 天然低分子、 および合成低分子からなる群から選ばれる少なくとも一 種である請求項 1 0に記載の生体分子マイクロアレイ。
1 2 . 基板上に 1つ以上の生体分子固定化スポットを有する生体分子マイクロア レイ、
前記マイクロアレイの生体分子固定化スポットを有する面に対向するように設 けられた電極、 および
前記マイクロアレイと前記電極との間に電界を印加するための電源
を有する、 生体分子の相互作用促進用装置であって、
前記生体分子マイクロアレイを構成する基板は、 基板表面から突出し、 かつ頂 上にスポット用平面を有する生体分子固定化用スポット（以下、「突出スポット部」 とレヽう） を有し、
少なくとも前記突出スポット部は導電性物質表面を有し、
前記スポット用平面の導電性物質表面に生体分子が固定化され、 前記生体分子 固定化スポットが形成されており、 かつ 前記基板は、 前記基板上の突出スポット部以外の表面に、 前記突出スポット部 の導電性物質表面と通電可能な端子を有することを特徴とする、 生体分子の相互 作用促進用装置。
1 3 . 前記基板上の突出スポット部以外の表面は、 導電性物質被覆層を有し、 前 記端子は、 前記導電性物質被覆層に含まれるか、 または、 前記導電性物質被覆層 と通電可能であり、 かっこの導電性物質被覆層と突出スポット部の導電性物質表 面とは、一体の導電性物質被覆層として設けられている請求項 1 2に記載の装置。
1 4 . 前記生体分子マイクロアレイが、 請求項 1 0または 1 1に記載の生体分子 マイクロアレイである請求項 1 2または 1 3に記載の装置。
1 5 . 前記スポット用平面と電極との距離が、 1〜5 0 0 μ πιである請求項 1 2 〜 1 4のいずれか 1項に記載の装置。
1 6 . 前記マイクロアレイと電極との間に、 非導電性スぺーサーを有する請求項 1 2〜1 5のいずれか 1項に記載の装置。
1 7 . 前記マイクロアレイの生体分子スポットを有する面に対向するように設け られた電極が、 透明電極である請求項 1 2〜1 6のいずれか 1項に記載の装置。
1 8 . 温度制御手段を更に有する請求項 1 2〜1 7のいずか 1項に記載の装置。
1 9 . 請求項 1 2〜1 8のいずれか 1項に記載の装置を用いる、 生体分子の相互 作用促進方法であって、
前記マイクロアレイと電極との間に、ターゲット生体分子を含む溶液を配置し、 力つ、
前記マイクロアレイと電極との間に電界を印加することを特徴とする、 生体分 子の相互作用促進方法。
2 0 . 前記マイクロアレイと電極との間に印加される電界が、 0 . 0 0 1〜1 0 MV/mである請求項 1 9に記載の方法。
2 1 . 前記ターゲット生体分子が、 蛍光標識されている請求項 1 9または 2 0に 記載の方法。
2 2 . 前記ターゲット生体分子を含む溶液が、 フエ-ルァラニン、 ヒスチジン、 カルノシン、 およびアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッフ ァー物質を含む、 請求項 1 9〜2 1のいずれか 1項に記載の方法。
2 3 . ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれているか、 または、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれていた請求項 1 0または 1 1に記載のマイクロアレイの各生体分子固定化スポット上の生体分子と前記ター ゲット生体分子との間の相互作用を、 共焦点型検出器によって検出することを特 徴とする生体分子の相互作用の検出方法。
2 4 . 前記マイクロアレイは、 請求項 1 9〜 2 2のいずれか 1項に記載の方法を 用いて、ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれている力、または、 ターゲット生体分子と相互作用し得る環境下に置かれていた、 請求項 2 3に記載 の方法。
2 5 . 前記固定化スポット上の生体分子および/または前記ターゲット生体分子 が蛍光標識されている請求項 2 3または 2 4に記載の方法。
2 6 . 前記共焦点型検出器によって、 マイクロアレイ表面の突出スポット部とそ れ以外の部分の高さおよぴ Zまたは形状の差による反射光強度の相違から、 マイ クロアレイ上の前記突出スポット部を反射像として検出する請求項 2 3'〜2 5の いずれか 1項に記載の方法。
2 7 . 前記反射像として検出された突出スポット部からの蛍光を検出することに より、 生体分子の相互作用を検出する請求項 2 6に記載の検出方法。
2 8 . 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子マ イクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固定化された生 体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、 前記ターゲット生体分子を含む溶液に、 フエ二ルァラニンを含有させ、 かつ、 前記生体分子固定化スポットに向けて溶液中のターゲット生体分子が泳動する ように前記溶液に電界を印加して、 前記相互作用を促進する、 前記方法。
2 9 . 前記マイクロアレイが、 生体分子固定ィ匕スポットを表面に設けた電極を基 板上に有するものであり、 前記基板上の電極と対向する電極を用い、 かつ前記タ ーゲット生体分子を含む溶液が前記 2つの電極と接触する状態で、 前記電極間に 前記電界の印加を行う請求項 2 8に記載の方法。
3 0 . 基板表面に生体分子が固定化されたスポットを 1つ以上有する生体分子マ イクロアレイにターゲット生体分子を含む溶液を接触させ、 前記固定化された生 体分子とターゲット生体分子とを相互作用させる方法であって、
前記ターゲット生体分子を含む溶液は、 フエ二ルァラニン、 ヒスチジン、 カル ノシン、 およぴアルギニンからなる群から選ばれる少なくとも 1つのバッファー 物質を含有し、
前記基板は、 生体分子固定化スポットを設けた面と同一の面上に、 少なくとも 1つの対向する一対の電極を、 前記一対の電極間に生体分子固定化スポットが位 置するように設けたものであり、 かつ
前記ターゲット生体分子を含む溶液が上記一対の電極と接触する状態で、 上記 電極間に電界の印加を行い、 前記相互作用を促進する、 前記方法。
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