WO2003056331A1 - Medicaments permettant d'ameliorer le prurit, la rugosite de l'epiderme ou l'hypersensibilite epidermique ou de blanchir par inhibition de la production et de la liberation du facteur de cellules souches - Google Patents

Medicaments permettant d'ameliorer le prurit, la rugosite de l'epiderme ou l'hypersensibilite epidermique ou de blanchir par inhibition de la production et de la liberation du facteur de cellules souches Download PDF

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scf
skin
powder
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Yutaka Ashida
Hirofumi Aoki
Rumiko Fujiwara
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Shiseido Company, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an active ingredient that improves pruritus, rough skin and sensitive skin by suppressing the production and / or release of stem cell factor (hereinafter referred to as “SCF”), or exerts a whitening effect, and a method for screening the same.
  • SCF stem cell factor
  • L-ascorbic acid glutathione
  • kojic acid cysteine
  • hydroquinone hydroquinone
  • placental extract suppress melanin production. It has been used because it is excellent at preventing spots, freckles, etc. However, the effect is not always sufficient in any case, and the development of better drugs is desired.
  • SCF (alias: kit ligand [KL] or mast cell growth factor [M CF]) is known to be upregulated in the spots and the like, and that the expression of SCF is enhanced by UV irradiation (LH Kligman et al., Photochem. Photobiol. Vol. 63 , No. 2 (1996) pp. 123-127).
  • SCF is a protein produced in keratinocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, and the like.
  • SCF The effects of SCF include the proliferation of undifferentiated hematopoietic stem cells, the promotion of germ cell differentiation, the proliferation of mast cells, and the proliferation of pigment cells (Bio Science term library site Factor Yodosha (1995) Kohei Miyazono, Kazuo Sugamura). It is known that SCF includes a membrane-bound form (SCF-2) and a secreted form (SCF-1) released from a cleaved membrane by the action of a protease. SCF_2 remains bound to keratinocytes etc.
  • SCF-1 binds to the SCF receptor of the pigment cells to activate the proliferation of the pigment cells
  • SCF-1 is cleaved at the cleavage site and released from the cell membrane, and It binds to the mast cell SCF receptor, activates pigment cell proliferation, and activates mast cell proliferation and degranulation (T.
  • the present inventor has found that it is possible to promote the production or release of SCF by stimulating human epidermal keratinocytes such as desiccation, and consequently, the production and / or release of SCF. It has succeeded in efficiently screening active ingredients that can be effectively suppressed. Disclosure of the invention
  • the present invention screens an active ingredient that exhibits an effect of improving itching, rough or sensitive skin, or exhibiting a whitening effect by suppressing the production and release or release of SCF.
  • the present invention provides a method characterized by stimulating the SCF-expressing cells to promote SCF production and Z or release.
  • the stimulus is a dry stimulus, a UV radiation stimulus or a drug stimulus, preferably a dry stimulus.
  • the screening method comprises contacting the SCF-expressing cell with the test component, and then stimulating the cell. Thereafter, the amount of SCF produced and / or released by the cells is measured to select the active ingredient.
  • the present invention relates to a rose extract rose water, a cinnamon extract, a hop extract, a hawthorn extract, an azuki powder, a birch extract, a cinnamon extract, a chickpea extract, an anoreni extract, a button extract, a podaiju, a chlorella extract, a roman extract.
  • Mi Tsureekisu black tea extract, Eucalyptus extract, s ⁇ jutsu extract powder, bi yak predicates extract powder, ⁇ straight down tea extract powder, Ononisuekisu, Asenyakuekisu, blanking Douha extract, Boufuuekisu, click Waekisu, Nono 0 Li Etta Li Aekisu, Anne SCF production comprising one or more selected from the group consisting of sokko extract, stevia extract, hinoki, shobu root extract, dais extract, virginia moss, saveso extract, althea extract, otogirisou extract and mugwort extract Beauty / or inhibiting skin external agent that provides.
  • the present invention provides an external preparation for pruritus for pruritus, which comprises a component for suppressing the production and Z or release of SCF as an active ingredient for pruritus.
  • the pruritus-improving active ingredient includes hop extract, hawthorn extract, azuki powder, fritillary extract, roman mitsure extract, black tea extract, eucalyptus extract, soybean extract powder, syrup extract powder, oolong tea extract powder, ononis extract, Boufuueki scan, Nono 0 Rieta Li Aekisu, Anso Kkouekisu, stevia extract, sucrose naive root extract, force Gikazura, Savon Sou extract, Ru 1 or more der selected from the group consisting of Aruteaeki scan and O Togiri Souekisu.
  • the present invention provides a skin for preventing rough skin, comprising a component for suppressing the production and / or release of SCF as an active ingredient for preventing rough skin.
  • a skin for preventing rough skin comprising a component for suppressing the production and / or release of SCF as an active ingredient for preventing rough skin.
  • the rough skin prevention active ingredient hawthorn extract, Seo c Jutsuekisu end, aphrodisiac Jutsuekisu end, Ono Nisuekisu, click Waekisu, Nono 0 Li eth Li Aekisu, Ann Sokko ⁇ extract, Sutebiae kiss, a mounting key, sucrose naive It is one or more selected from the group consisting of a root extract, a potato sprout, a saponilla extract and an altea extract.
  • the present invention provides an external preparation for sensitive skin containing a component for suppressing the production and / or release of SCF as a sensitive skin improving active ingredient.
  • the active ingredient for improving sensitive skin is rose extract rose water, cherries extract, hop extract, hawthorn extract, azuki powder, shirakanok extract, kei extract, chiyouji extract, chlorella extract, red tea extract, eucalyptus extract. , Seojutsu extract powder, Biyakujutsue kiss powder, Oolong tea extract powder, Ononis extract, Asenjak extract, Budwort leaf extract, Bow extract, Kud extract, No.
  • the present invention provides a skin-whitening external preparation containing a component for suppressing the production and / or release of SCF as a whitening active ingredient.
  • the whitening active ingredients include rose extract, rose water, ononis extract, asejac extract, and no. It is one or more selected from the group consisting of rietalia extract, ansoco extract, svono extract, chlorella extract and lucarius extract.
  • the present invention provides for inhibiting the production and release or release of SCF. It is possible to apply it to human or mammal epidermis by applying an active ingredient which exerts an effect of improving pruritus, rough or sensitive skin or whitening effect. It provides a method for improving or whitening sensitive skin.
  • the present invention provides a drug containing a component that suppresses SCF expressed in keratinocytes or on cell membranes by ultraviolet irradiation.
  • the above-mentioned components are rose extract rose water, cherries extract, hop extract, hawthorn extract, azuki powder, birch extract, kei extract, chiyouji extract, anoleni extract, botan extract, bodaiju, chlorella extract, roma extract.
  • the component is Azuki powder, Alniki extract, Ononis extract or Ansocco extract.
  • Black tea was extracted by heating (60 ° C) for 5 hours using water or hydrated ethanol (30% ethanol) as a solvent, and an extract was obtained by a conventional method.
  • FIG. 1 is a graph showing the suppression of SCF by various crude drug extracts on cells subjected to dry stimulation.
  • FIG. 2 is a graph showing the suppression of SCF by various crude drug extracts on cells subjected to a dry stimulus.
  • FIG. 3 is a graph showing the enhancement of SCF expression in cells by ultraviolet light stimulation.
  • FIG. 4 is a graph showing enhancement of SCF expression in cells by drug stimulation.
  • FIG. 5 is a graph showing suppression of SCF by various crude drug extracts on cells stimulated with ultraviolet light.
  • the present invention provides a method of screening an active ingredient that exerts an effect of improving or whitening pruritus, rough or sensitive skin by suppressing the production and Z or release of SCF.
  • This screen jung The method comprises the steps of contacting a cell that expresses SCF with a test component, measuring the amount of SCF produced and released by the cell, or releasing the SCF and reducing the amount of SCF production and / or release as the active ingredient.
  • the method is characterized in that the SCF-expressing cells are stimulated to promote the production and / or release of SCF.
  • the present inventors have found that stimulation of skin cells, such as human keratinocytes, such as desiccation, promotes the production and / or release of SCF by cells. Therefore, by applying such a stimulus to the cells, it is possible to induce the cells to have abnormal expression of SCF, which is associated with the onset of pruritus, rough skin, sensitive skin and spots, freckles, and the like. Utilizing this fact, the present inventor provides a stimulus that promotes the production and / or release of SCF when applying a test component that suppresses the production and / or release of SCF to cells. And successfully screened an active ingredient that could effectively suppress SCF production and Z or release.
  • skin cells such as human keratinocytes, such as desiccation
  • Such stimuli include, in addition to drying stimuli, UV irradiation stimuli, thermal stimuli (heating and cooling), drug stimuli (for example, forskolin, theophylline), osmotic stimuli, oxidative stimuli, etc. Stress.
  • the stimulation of the cells in the screening method according to the present invention may be performed before, simultaneously with, or after the test component acts on the cells.
  • the cell is stimulated after the test component is acted on.
  • the screening method can be implemented, for example, as follows.
  • SCF-producing cells are cultured using an appropriate culture solution (for example, at about 25 to 37 ° C, preferably at about 37 ° C for several hours to several days, preferably for about 72 hours).
  • an appropriate culture solution for example, at about 25 to 37 ° C, preferably at about 37 ° C for several hours to several days, preferably for about 72 hours.
  • test component is prepared at a specified concentration (for example, 0.000 l% -0. 01%).
  • the cell culture solution of (1) is exchanged for the diluted test component and incubated (for example, at about 25 to 37 ° C, preferably at about 37 ° C for several hours to several days, preferably About 24 hours). At this time, optionally, as a control, also prepare cells to which a medium not containing the test component has been similarly acted.
  • a stimulus is given to the cells on which the test component has been acted. If the stimulus is a dry stimulus, remove the supernatant of the above cell culture and incubate under dry conditions. At this time, optionally, prepare cells that do not give the above stimulus as a control.
  • a medium is added to the stimulated cells and incubated (for example, at about 25 to 37 ° C, preferably at about 37 ° C for about 30 minutes to 4 hours, preferably about 2 hours).
  • the suppression of SCF production and release is defined as 100% when the medium alone is added, and when the SCF production is reduced by about 25% when the test component is added, the suppression is considered as suppression.
  • the test component should be added in a concentration range that does not cause significant cytotoxicity (for example, a decrease in respiratory activity to about 75%).
  • the SCF-producing cells to be used may be, for example, keratinocytes, fibroblasts, vascular endothelial cells, and the like derived from humans or other mammals, such as rats, mice, and egrets.
  • keratinocytes preferably, human keratinocytes are used.
  • stimuli include stresses such as drying stimuli, ultraviolet irradiation stimuli, thermal stimuli (heating and cooling), drug stimuli (eg, forscoline, theophylline), osmotic stimuli, and oxidative stimuli.
  • Dry stimulating If, for example, cells of CO 2 from about 1 to 5% CO 2 I Nkyube within a coater, humidity of about 0-100%, an appropriate time by removing the medium in an atmosphere at a temperature 25 to 37 ° C, for example about 15 The cells may be left to dry for a period of minutes to 6 hours, preferably about 1 hour.
  • the cells may be stimulated by irradiating the cells with ultraviolet light at about 290 to 320 nm and 10 to 60 mj / cm 2 .
  • the cells are placed in a CO 2 incubator and the CO 2 ⁇ 5%, humidity about 0 ⁇ : L00%, temperature 4 ⁇ 25 ° C or 37 ⁇ 42 ° C for an appropriate time, for example, about 5 minutes to 6 hours, preferably about 1 hour May be stimulating.
  • the screening method of the present invention is preferably performed in vitro, but can also be performed in vivo.
  • the measurement of the SCF produced and / or released by the SCF-expressing cells is preferably performed by qualitatively determining the SCF released by the cells into the culture medium or the SCF contained in the disrupted cells or the membrane fraction of the cells.
  • the SCF to be measured may be a secreted form (SCF-1) released from the cell membrane and released into the cell culture medium, or a membrane-bound form (SCF-2) contained in the cell membrane fraction.
  • SCF can be measured by methods known in the art, for example, immunoassays, such as ELISA using enzyme labels, RIA using radioactive labels, and the change in the absorbance of turbidity caused by the reaction between antibodies and antigens.
  • the immunoassay method includes a competition method and a sandwich method.
  • the measurement of SCF is preferably performed by ELISA.
  • the antibody specific to SFC used in the above immunoassay may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Monoclonal antibodies are particularly preferred. The production of monoclonal and polyclonal antibodies is well known to those skilled in the art.
  • the present inventors have found that the following crude drugs can reduce the amount of SCF derived from SCF-producing cells:
  • the crude drug extract is extracted from the raw material plant by a conventional method, and is not limited to the extraction method.
  • the extract is a foliage extract
  • dried and shredded the Japanese Pharmacopoeia clove 10 kg Can be obtained by adding 50 v / v% ethanol (based on cosmetic raw materials, prepared with absolute ethanol and purified water), immersing for 24 hours, and pressing and separating to obtain an extract.
  • 50 v / v% ethanol based on cosmetic raw materials, prepared with absolute ethanol and purified water
  • Pruritus refers to itching of the skin and scalp in a broad sense, and includes, for example, dryness, atopic dermatitis, and pruritus due to senile xeroderma.
  • the rough skin means a deteriorated state of the skin in a broad sense, and includes rough skin caused as a result of worsening and deterioration of fiattoby dermatitis due to pruritus, and rough skin due to drying.
  • Sensitive skin means skin with increased irritability and non-specific physicochemical stimuli from the outside world, such as puncture, warmth, sweating, sunlight, clothing, extraneous matter, etc. It refers to a condition of the skin that is sensitive to stress stimuli.
  • the whitening effect in the present invention is caused by overproduction of melanin induced by the binding of SCF released by cells due to sunburn, drying and other causes to the SCF receptor of pigment cells. It means improving spots, freckles, dullness, etc.
  • the pruritus, rough skin, sensitive skin and whitening agent of the present invention is usually used by mixing the above-mentioned active ingredient for suppressing SCF production and release in an aqueous solvent such as water or ethanol.
  • the blending amount of the SCF production / release inhibitor of the present invention is not particularly limited, but is preferably in the range of about 0.0001 to 0.01% by weight, particularly about 0.0001 to 0.005% by weight in terms of solids.
  • the drug according to the present invention is prepared as a bath agent, it is usually diluted about 100 to 1000 times at the time of use. Therefore, it is preferable to formulate the drug at a high concentration in consideration of the dilution.
  • the aqueous solvent is preferably a lower alcohol, and the content of the lower alcohol is 20 to 80% by weight, and more preferably 40 to 60% by weight, in the agent of the present invention.
  • the pruritus, rough skin, sensitive skin and whitening agents of the present invention include, in addition to the above essential components, components usually used in external preparations for skin such as cosmetics and pharmaceuticals, for example, other whitening agents, humectants, and antioxidants.
  • Agent oily component, An ultraviolet absorber, a surfactant, a thickener, an alcohol, a powder component, a coloring agent, an aqueous component, water, various skin nutrition agents, and the like can be appropriately compounded as needed.
  • sodium edetate, sodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metalate depending on the use of the drug , Sequestering agents such as dalconic acid, caffeine, tannin, verapamil, tranexamic acid and its derivatives, licorice extract, glabridin, hot water extract of carin fruit, various crude drugs, tocopherol acetate, dali tilritin Drugs such as acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, darcoside ascorbate, arbutin, kojic acid and other whitening agents, dalcoose, fnorectose, mannose, citric acid Sugars such as sucrose and trehalose, retinoic acid, retinoic acid, retinoic acid sulphate, and panolemic acid retinol Such data Mi emissions A compound may also be appropriately blended.
  • the pharmaceutical composition for pruritus, rough skin, sensitive skin and whitening of the present invention is used in accordance with the intended use, for example, cosmetics, pharmaceuticals, quasi-drugs, etc., for external use, such as lotions, creams, emulsions, lotions, packs , Bath preparations, ointments, hair lotions, hair tonics, hair liquids, shampoos, rinses, hair tonics, hair restorers, etc. It doesn't matter.
  • test crude extract was added to the culture solution to a final concentration of 0.005% w / v, and the mixture was incubated at 37 ° C for 24 hours. A control to which only ethanol (EtOH) was added was also included. During the last two hours, alamarBlue TM (Biosource 'International) was added to 10% to examine cell activity, that is, to examine the effects of the test crude extract on cytotoxicity. The fluorescence intensity (excitation 560 nm, emission 590 nm) of the supernatant was measured.
  • the control to which the test crude drug extract was inhibited in SCF level was evaluated using a control to which no drying stimulus was applied.
  • the cytotoxicity of the test crude extract was evaluated using the reduction amount of alamarBlue TM as an index.
  • FIGS. Figures 1 and 2 show the amount of alamarBlue TM reduced when each crude drug extract was added, and (b) show the free SCF in the culture medium of cells to which each crude drug extract was added and subjected to a dry stimulus.
  • the value obtained by subtracting the free SCF in the medium of the cells to which each crude drug extract was added and the cells were not given the drying stimulus was shown from the amount of.
  • various herbal extracts significantly reduced the amount of SCF in the culture broth as compared to ethanol, and thus effectively reduced the production and Z or release of SCF. It was found that it was possible to suppress it.
  • the resulting pellet was subjected to a 25 mM phosphate buffer (pH 6, 8) + 0.1% Triton-X100 solution 100 / z 1 [solvent power] to obtain a membrane fraction protein extract.
  • the amount of protein in this solution was measured by a standard method, and the amount of SCF was further measured to obtain the value of SCF amount / protein amount.
  • candidate crude drugs that reduce the value to 25% or less compared to the group to which only the solvent is added are regarded as the above-mentioned inhibitory drugs.
  • Figure 5 shows the results. As is clear from the results in FIG. 5, it was found that the expression of SCF was significantly suppressed in the cells treated with the various herbal extracts as compared with the cells treated only with ultraviolet irradiation.
  • Methylpolysiloxane 3 Decamethinolecyclopentasiloxane 13 Octamethylethylcyclotetrasiloxane 12
  • Polyoxyethylene.Methylpolysiloxane copolymer 1 Ethanol monoisorene 2
  • Isoprono Knol 1 Glycerin 3 Dipropylene glycol Cornole 5
  • Polyethylene glycol 6000 5 Sodium metaphosphate 0.05 DL- ⁇ -Tocopherol 2-L-ascorbic acid
  • Diestenoreca 0.1 Acetate DL- ⁇ -tocopherol 0.1 Caffeine 0.1 Fennel extract 0.1 Hamamelis extract 0.1 Ginseng extract 0.1 Soil beet extract powder 0.005
  • 1,3 butylene glycol 7 erythritol tonole 2 hardened oil 3 squalane 6 tetra 2—pentaerythritol ethylhexanoate 2 polyoxyethylene glyceryl isostearate
  • 1,3-butylene glycol 4 erythritol 1 polyoxyethylene methyl dalcoside 1 polyoxyethylene hydrogenated castor oil 0.5 citrate 0.02 sodium citrate 0.08 phenoxyethanol 0.25 N — coconut oil fatty acid L — argininetyl DL — pyrrolidone carboxylic acid 0.1 Vibrant water 0.0001 Purified water Residual Example 4
  • Etinoleanolone 10 Dipropylene glycol Cornole 1 Polyethylene glycol 1 0 0 0 1 Polyoxyethylene methyl methyl danolecoide 1 Jojoba oil 0.01 Triglyceryl hexanoate 0.1 Polyoxyethylene Hardened castor oil 0.2 Polyglyceryl diisostearate 0.15
  • Macadamia nut oil 1 Hydroxystearic acid phytosterinol 0.05 Lactic acid 0.05 Sodium lactate solution (50%) 0.2

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Description

明 細 書 幹細胞因子の産生 · 放出の抑制による搔痒、 肌荒れ、 敏感肌及び美 白用薬剤 技術分野
本発明は幹細胞因子 （以下 「 S C F」 ） の産生及び 又は放出を 抑制することによ り皮膚搔痒、 肌荒れや敏感肌を改善する、 又は美 白効果を発揮する有効成分のスク リーニング方法、 並びにかかる有 効成分を含む搔痒、 肌荒れ、 敏感肌及び 又は美白用薬剤に関する
背景技術
従来より、 皮膚搔痒、 肌荒れ、 敏感肌の改善効果や美白効果を有 するものと して種々の治療薬、 皮膚外用剤、 化粧料等が使用されて いる。 皮膚搔痒、 肌荒れ、 敏感肌の改善効果を発揮する従来の薬剤 や化粧料等においては、 有効成分と して消炎剤やアミ ノ酸、 多糖、 脂質等のほか、 抗炎症作用、 あるいは高い保湿作用を有する各種動 植物エキスが皮膚の痒み、 炎症、 角質層の水分の消失を防ぐ能力に 優れているために用いられてきた。 また、 美白効果を発揮する従来 の薬剤や化粧料等においては、 有効成分と して Lーァスコルビン酸 、 グルタチオン、 コウジ酸、 システィン、 ハイ ドロキノン、 胎盤抽 出物等がメ ラニンの生成を抑制してしみ、 そばかす等を防ぐのに優 れているために用いられてきた。 しかしながら、 いずれにおいても その効果は必ずしも十分ではなく、 よ り優れた薬剤の開発が所望さ れている。
S C F (別名 ： kit ligand [KL]又は mast cell growth factor [M CF]) がしみ部位等において発現が亢進しているこ と、 紫外線照射 によ り S C Fの発現が亢進するこ とは知られている （L. H. Kligma n et al. , Photochem. Photobiol. Vol.63, No.2 (1996) pp.123-1 27) 。 S C Fは角化細胞、 線維芽細胞、 血管内皮細胞等において産 生されるタンパク質である。 S C Fの作用と しては、 未分化造血幹 細胞の増殖、 生殖細胞の分化促進、 肥満細胞の増殖促進、 色素細胞 の増殖促進作用等がある （Bio Science 用語ライブラ リ ー サイ ト イカイ ン · 増殖因子 羊土社（1995) 宮園浩平、 菅村和夫編） 。 S C Fには膜結合型 （ S C F— 2 ) と、 タンパク質分解酵素の作用に よ り切断された膜から遊離する分泌型 （ S C F— 1 ) があるこ とが 知られている。 S C F _ 2は角化細胞などに結合したまま色素細胞 の S C F レセプターに結合して色素細胞の増殖を活性化し、 また S C F— 1 はその切断部位において切断されて細胞膜から遊離し、 色 素細胞や肥満細胞の S C F レセプターに結合し、 色素細胞の増殖を 活性化し、 また肥満細胞の増殖活性化及び脱顆粒化をもたらす （T.
Kunisada et al. , J. Exp. Med. , Vol.187, No.10, (1998) pp.15 65 - 1573)。 S C Fの異常産生は色素細胞の異常増殖につながり、 メ ラニン産生を亢進させ、 しみ、 そばかす、 くすみ等の原因となる。 また、 肥満細胞の異常増殖、 異常脱顆粒化にもつながり、 ヒ スタ ミ ン、 セロ トニン、 L T B 4等のケミカルメディエーターの遊離を亢 進させ (J. Grabbe et el. , Arch Dermatol Res (1984) 287:78 - 84 ) 、 搔痒、 肌荒れ、 敏感肌等の原因となる。
従って、 このよ うな搔痒、 肌荒れ、 敏感肌、 しみ、 そばかす等の 直接的な原因と考えられる S C Fの産生、 放出を効果的に抑制でき れば、 従来にない全く新たな、 且つ一段と有効な搔痒、 肌荒れ、 敏 感肌及び 又は美白用薬剤の提供に結びつく と考えられる。 しかし ながら、 従来技術において、 このよ うな S C F産生、 放出の抑制活 性をもつ物質又は生薬も、 そのような物質又は生薬の効果的なスク リーニグ方法も知られていない。 T. Kunisada et al (前掲） はト ランスジエニックマウスを利用した動物実験によ り肥満細胞及び色 素細胞に対する S C Fの作用を検討している。 しかしながら、 その ような動物実験の利用は時間及び費用がかさむため、 多種多様な生 薬、 薬剤のスク リ ーニングには適さず、 よ り簡便且つ廉価に S C F 産生、 放出の抑制活性をもつ有効成分又は生薬をスク リーニングで きる方法が所望されていた。
驚くべきことに、 本発明者は、 ヒ ト表皮角化細胞に乾燥等の刺激 を与えることで S C Fの産生又は遊離を促進させることができるこ とを見出し、 その結果 S C Fの産生及び 又は放出を効果的に抑制 することができる有効成分を効率的にスク リ ーニングするこ とに成 功した。 発明の開示
すなわち本発明は、 第一の態様において、 S C Fの産生及びノ又 は放出を抑制することによ り搔痒、 肌荒れもしく は敏感肌の改善効 果又は美白効果を発揮する有効成分をスク リーユングする方法であ つて、 S C Fを発現する細胞を被験成分と接触させ、 当該細胞が産 生及び 又は放出する S C Fの量を測定して S C Fの産生及び 又 は放出量を減少させる被験成分を前記有効成分と して選定する方法 の際、 当該 S C F発現細胞に刺激を与えて S C Fの産生及び Z又は 放出を促進させることを特徴とする方法を提供する。
一の観点において、 前記刺激は乾燥刺激、 紫外線照射刺激又は薬 剤刺激、 好ましくは乾燥刺激である。
別の観点において、 前記スク リーニング方法は、 前記 S C F発現 細胞を前記被験成分と接触させ、 次いで当該細胞に刺激を与え、 し かる後に当該細胞が産生及び/又は放出する S C Fの量を測定して 前記有効成分を選定する方法である。
第二の態様において、 本発明はバラエキスローズ水、 チヤエキス 、 ホップエキス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 シラカバエキス、 ケ ィ ヒエキス、 チヨ ウジエキス、 ァノレニ力エキス、 ボタンエキス、 ポ ダイジュ、 ク ロ レラエキス、 ローマ力 ミ ツレエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リ エキス、 ソウジュツエキス末、 ビヤクジュツエキス末、 ゥ 一ロ ン茶エキス末、 オノニスエキス、 ァセンャクエキス、 ブ ドウ葉 エキス、 ボウフゥエキス、 ク ヮエキス、 ノヽ0リ エタ リ アエキス、 アン ソッコゥエキス、 ステビアエキス、 ヒ ノキ、 ショ ウブ根エキス、 ダ ィズエキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアエキス、 ォ トギリ ソゥエキス及びョモギエキスから成る群から選ばれる 1又は 複数を含んで成る、 S C F産生及び/又は抑制皮膚外用剤を提供す る。
第三の態様において、 本発明は S C Fの産生及び Z又は放出を抑 制する成分を搔痒改善有効成分と して含有する搔痒用皮膚外用剤を 提供する。
一の観点において、 前記搔痒改善有効成分は、 ホップエキス、 サ ンザシエキス、 ァズキ末、 チヨ ウジエキス、 ローマ力 ミツレエキス 、 紅茶エキス、 ユーカ リエキス、 ソウジュツエキス末、 ビヤクジュ ツエキス末、 ウーロ ン茶エキス末、 オノニスエキス、 ボウフウエキ ス、 ノヽ0リエタ リ アエキス、 アンソ ッコゥエキス、 ステビアエキス、 ショ ウブ根エキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアェキ ス及びオ トギリ ソゥエキスから成る群から選ばれる 1又は複数であ る。
第四の態様において、 本発明は S C Fの産生及び/ /又は放出を抑 制する成分を肌荒れ防止有効成分と して含有する肌荒れ防止用皮膚 外用剤を提供する。
一の観点において、 前記肌荒れ防止有効成分はサンザシエキス、 ソ ウ ジュツエキス末、 ビヤク ジュツエキス末、 オノ ニスエキス、 ク ヮエキス、 ノヽ0 リ エタ リ アエキス、 アンソッコゥエキス、 ステビアェ キス、 ヒ ノ キ、 ショ ウブ根エキス、 力ギカズラ、 サボンソ ゥエキス 及びアルテアエキスから成る群から選ばれる 1又は複数である。 第五の態様において、 本発明は S C Fの産生及び 又は放出を抑 制する成分を敏感肌改善有効成分と して含有する敏感肌用皮膚外用 剤を提供する。
一の観点において、 前記敏感肌改善有効成分はバラエキスローズ 水、 チヤエキス、 ホ ップエキス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 シラ カノくエキス、 ケィ ヒエキス、 チ ヨ ウジエキス、 ク ロ レラエキス、 紅 茶エキス、 ユーカ リ エキス、 ソ ウ ジュツエキス末、 ビヤク ジュツエ キス末、 ウーロ ン茶エキス末、 オノ ニスエキス、 ァセンャクエキス 、 ブ ドウ葉エキス、 ボウ フゥエキス、 ク ヮエキス、 ノヽ0リ エタ リ ァェ キス、 アンソ ッ コ ゥエキス、 ステビアエキス、 ヒ ノ キ、 シ ョ ウブ根 エキス、 ダイズエキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテア エキス、 オトギリ ソゥエキス及びョモギエキスから成る群から選ば れる 1又は複数である。
第六の態様において、 本発明は S C Fの産生及び 又は放出を抑 制する成分を美白有効成分と して含有する美白用皮膚外用剤を提供 する。
一の観点において、 前記美白有効成分はバラエキスローズ水、 ォ ノ ニスエキス、 ァセンャクエキス、 ノ、。リ エタ リ アエキス、 アンソ ッ コゥエキス、 サボンソゥエキス、 ク ロ レラエキス及びュ一カ リエキ スから成る群から選ばれる 1又は複数である。
第七の態様において、 本発明は S C Fの産生及びノ又は放出を抑 制するこ とによ り搔痒、 肌荒れも しく は敏感肌の改善効果又は美白 効果を発揮する有効成分をヒ ト又は哺乳動物の表皮に塗布するこ と を含んで成る、 搔痒、 肌荒れもしく は敏感肌の改善又は美白方法を 提供する。
第八の態様において、 本発明は紫外線刺激によ り角化細胞内又は 細胞膜上に発現する S C Fを抑制する成分を含有する薬剤を提供す る。
一の観点において、 前記成分はバラエキスローズ水、 チヤエキス 、 ホップエキス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 シラカバエキス、 ケ ィ ヒエキス、 チ ヨ ウジエキス、 ァノレニ力エキス、 ボタ ンエキス、 ボ ダイジュ、 ク ロ レラエキス、 ローマ力 ミ ツ レエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リエキス、 ソウジュツエキス末、 ビヤクジュツエキス末、 ゥ 一ロ ン茶エキス末、 オノニスエキス、 ァセンャクエキス、 ブ ドウ葉 エキス、 ボウフ ゥエキス、 ク ヮエキス、 ノヽ0リ エタ リ ァエキス、 アン ソッコゥエキス、 ステビアエキス、 ヒ ノ キ、 ショ ウブ根エキス、 ダ ィズエキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアエキス、 ォ トギリ ソゥエキス及びョモギエキスから成る群から選ばれる 1又は 複数である。
別の観点において、 前記成分はァズキ末、 アル二力エキス、 オノ ニスエキス又はアンソッコゥエキスである。
上述の各態様の抽出エキスは以下のよ う な手法によ り得たものを 試験に供した。
① ョモギ、 ケィ ヒ、 ァズキ末、 ショ ウブ根、 ステビアは、 水を溶 媒と して室温から 50°Cまで加温して数時間抽出した後常法によ り各 エキスを得た。
② サボンソゥ、 サンザシ、 チヨ ウジ、 アルテア、 ボダイジュ、 ボ タン、 ユーカ リ 、 アンソッコゥ、 ヒ ノキ、 ウーロ ン茶、 ク ヮ、 ダイ ズ、 ァセンャクは、 含水エタノール （30%エタノール） を溶媒と し て室温で一週間浸漬 · 抽出した後常法によ り各エキスを得た。
③ 紅茶は、 水又は含水エタノール （30 %エタノール） を溶媒と し て、 加温 （60°C ) 5時間抽出した後常法によ りエキスを得た。
④ シラカバ、 チヤ、 オ トギリ ソゥ、 オノニス、 アル二力、 パリ エ タ リ ア、 ク ロ レラ、 バラエキスローズ水、 ブ ドウ葉、 ホップ、 口一 マ力 ミツレは、 80%又は 90 %エタノール水を溶媒と して、 60°C、 3 時間、 又は 90°C、 2時間加温 ' 抽出した後常法によ り得たものを供 した。 図面の簡単な説明
図 1 は、 乾燥刺激を与えた細胞に対する各種生薬エキスによる S C Fの抑制を示すグラフである。
図 2は、 乾燥刺激を与えた細胞に対する各種生薬エキスによる S C Fの抑制を示すグラフである。
図 3は、 紫外線刺激による細胞の S C F発現の亢進を示すグラフ である。
図 4は、 薬剤刺激による細胞の S C F発現の亢進を示すグラフで ある。
図 5は、 紫外線刺激を与えた細胞に対する各種生薬エキスによる S C Fの抑制を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
本発明を以下に詳細に説明する。
本願発明は、 S C Fの産生及び Z又は放出を抑制するこ とによ り 搔痒、 肌荒れも しく は敏感肌の改善効果又は美白効果を発揮する有 効成分をスク リ ーニングする方法を提供する。 このスク リ ーユング 方法は、 S C Fを発現する細胞を被験成分と接触させ、 当該細胞が 産生及びノ又は放出する S C Fの量を測定して S C Fの産生及び/ 又は放出量を減少させる被験成分を前記有効成分と して選定するこ とを含んで成るが、 その際、 当該 S C F発現細胞に刺激を与えて S C Fの産生及び 又は放出を促進させるこ とを特徴とする。
本発明者はヒ ト角化細胞のよ うな皮膚細胞に乾燥等の刺激を与え る と細胞の S C Fの産生及び 又は放出が促進されるこ とを見出し た。 従って、 細胞にこのよ うな刺激を与えることで、 搔痒、 肌荒れ 、 敏感肌やしみ、 そばかす等の発症に結びつく S C Fの異常発現を 細胞に対し誘導させるこ とができる。 このこ とを利用し、 本発明者 は S C Fの産生及び Z又は放出を抑制する被験成分を細胞に作用さ せる際、 S C Fの産生及び 又は放出を促進させる刺激を与えてお く こ とで S C Fの発現を亢進させ、 S C Fの産生及び Z又は放出を 効果的に抑制できる有効成分を効率的にスク リ ーニングするこ とに 成功した。 このよ う な刺激と しては、 乾燥刺激の他、 紫外線照射刺 激、 熱刺激 （加熱及び冷却） 、 薬剤刺激 （例えば、 フォルスコ リ ン 、 テオフィ リ ン） 、 浸透圧刺激、 酸化刺激等のス ト レスが挙げられ る。
本発明に係るスク リ ーニング方法における細胞の刺激は、 細胞に 被験成分を作用させる前、 同時、 又は後であってよい。 好ましく は 、 細胞に被験成分を作用させた後に細胞に刺激を与える。
詳しく は、 当該スク リ ーニング方法は、 例えば下記のよ う にして 実施するこ とができる。
(1) S C F産生細胞を適当な培養液を用いて培養する （例えば、 約 25〜37°C、 好ましく は約 37°Cにて数時間〜数日、 好ましく は約 72 時間） 。
(2) 被験成分を適当な細胞培養液によ り所定の濃度 （例えば 0.000 l%-0. 01%) に希釈する。
( 3 ) ( 1 )の細胞培養液を上記希釈被験成分と交換し、 イ ンキュベー シヨ ンする （例えば、 約 25〜37°C、 好ましく は約 37°Cにて数時間〜 数日、 好ましくは約 24時間） 。 その際、 任意的に、 コン トロールと して、 上記被験成分を含まない媒体を同様に作用させた細胞も用意 しておく。
( 4 ) 次に、 上記被験成分の作用された細胞に刺激を与える。 刺激 が乾燥刺激の場合、 上記細胞培養液の上清液を除去し、 乾燥条件下 でイ ンキュベーシ ョ ンする。 その際、 任意的に、 コ ン ト ロールと し て、 上記刺激を与えない細胞も用意しておく。
( 5 ) 上記刺激を与えた細胞に培地を添加し、 インキュベーショ ン する （例えば、 約 25〜37°C、 好ましく は約 37°Cにて約 30分〜 4時間 、 好ましく は約 2時間） 。
( 6 ) 上記細胞の上清液を回収し、 S C Fの量を測定し、 S C Fの 産生及び Z又は放出を抑制する成分を選定する。
S C Fの産生 · 放出量の抑制は、 媒体のみを添加した場合を 100 %と して、 被験成分を加えたときに S C F産生量が 25 %程度の低下 したときをもって、 抑制とする。 ただし、 顕著な細胞毒性 （例えば 、 75%程度までの呼吸活性の低下等） の起きない濃度範囲で被験成 分を添加するものとする。
使用する S C F産生細胞と しては、 例えばヒ ト又はその他の哺乳 動物、 例えばラッ ト、 マウス、 ゥサギ、 等に由来する角化細胞、 線 維芽細胞、 血管内皮細胞等であってよい。 好ましく は、 ヒ ト角化細 胞を使用する。
上述の通り、 刺激には、 乾燥刺激、 紫外線照射刺激、 熱刺激 （加 熱及び冷却） 、 薬剤刺激 （例えば、 フォルス コ リ ン、 テオフィ リ ン ) 、 浸透圧刺激、 酸化刺激等のス ト レスが挙げられる。 乾燥刺激の 場合、 例えば細胞を C O 2ィ ンキュベ一ター内で C O 2約 1〜 5 %、 湿度約 0〜100 %、 温度 25〜37°Cの雰囲気下で培地を除去して適当 な時間、 例えば約 15分〜 6時間、 好ましく は約 1時間放置するこ と で細胞に乾燥刺激を与えてよい。 紫外線照射刺激の場合、 例えば細 胞に約 290〜320nm、 10〜60 mj/cm2で紫外線照射するこ とで細胞に 刺激を与えてよい。 熱刺激の場合、 例えば細胞を C O 2イ ンキュべ —ター内で C O 2約：！ 〜 5 %、 湿度約 0〜： L00%、 温度 4〜 25°C又は 37〜 42°Cで適当な時間、 例えば約 5分〜 6時間、 好ましく は約 1 時 間放置するこ とで細胞に刺激を与えてよい。
本発明のスク リ ーニング方法は好ましく は in vi t roで行なわれる が、 in vivoで実施するこ と もできる。
S C Fの測定
本発明において、 S C F発現細胞が産生及び 又は放出する S C Fの測定は、 好ま しく は細胞がその培養液の中に放出する S C F又 は破砕した細胞や細胞の膜画分に含まれる S C Fを定性又は定量測 定するこ とによ り実施する。 測定する S C Fは、 細胞膜から遊離し て細胞培養液に放出される分泌型 （ S C F— 1 ) でも、 細胞の膜画 分に含まれる膜結合型 （ S C F— 2 ) でもよい。 S C Fの測定は当 業界周知の方法、 例えば、 免疫測定方法、 例えば酵素ラベルを利用 する E L I S A法、 放射性ラベルを利用する R I A法、 抗体と抗原 との反応で生ずる濁りの吸光度の変化から抗原量を定量する免疫比 濁法、 抗原と抗体感作ラテックスビーズもしく は抗体感作赤血球と の反応によって生ずる凝集反応の度合いから抗原量を測定するラテ ックス凝集法や赤血球凝集法等、 様々な方法が挙げられる。 免疫測 定法の方式には競合法やサン ドイ ッチ法が挙げられる。 他に、 電気 泳動法、 等電点電気泳動法、 ク ロマ トグラフィー法、 例えばゲル濾 過ク ロマ トグラフィー法、 イオン交換ク ロマ トグラフィー法、 逆相 ク ロマ トグラフィー法、 高速液体ク ロマ トグラフィー法、 ゥエスタ ンブロ ッ ト法、 等によ り実施するこ とができる。 本発明において、 好ましく は S C Fの測定は E L I S Aによ り実施する。
上記免疫測定方法において使用する S F Cに特異的な抗体はモノ ク ロ ーナル抗体でもポリ ク ロ ーナル抗体でもよい。 モノ ク ロ ーナル 抗体が特に好ま しい。 モノ ク ロ ーナル抗体やポリ ク ロ ーナル抗体の 作成は当業者に周知である。
本発明者は本発明に係るスク リ ーニング方法に従い、 以下の生薬 が S C F産生細胞由来の S C Fの量を減少させるこ とができるこ と を見出した ：
ノ ラエキス ローズ水、 チヤエキス、 ホ ップエキス、 サンザシェキ ス、 ァズキ末、 シラカバエキス、 ケィ ヒエキス、 チ ヨ ウ ジエキス、 ァノレニ力エキス、 ボタ ンエキス、 ボダイ ジュ、 ク ロ レラエキス、 口
—マ力 ミツレエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リ エキス、 ソウジュツエ キス末、 ビヤク ジュツエキス末、 ウーロ ン茶エキス末、 オノ ニスェ キス、 ァセンャクエキス、 ブ ドウ葉エキス、 ボウフゥエキス、 ク ヮ エキス、 ノヽ。リ エタ リ アエキス、 アンソ ッコゥエキス、 ステビアェキ ス、 ヒ ノ キ、 シ ョ ウブ根エキス、 ダイズエキス、 力ギカズラ、 サボ ンソゥエキス、 アルテアエキス、 オ トギリ ソゥエキス、 ョモギェキ ス。 かかる生薬の詳細については、 日本汎用化粧品原料集第 4版 （ 薬事日報） を参照されたい。
上記生薬エキスは、 常法によ り原料植物から抽出されたもので、 抽出法には制限されず、 例えば、 チヨ ウジエキスであれば、 日本薬 局方チョ ウジを乾燥し、 細切したもの 10kgに、 50 v/v % のェタノ ール （化粧品原料基準、 無水エタノール及び同精製水にて調製） を 加えて 24時間浸漬し、 圧搾分離してエキスを得るこ とによ り獲得で きる。 - 本発明における搔痒、 肌荒れ、 敏感肌は、 細胞によ り放出された
S C Fが肥満細胞の S C F レセプターに結合するこ とで誘導された ものをいう。 搔痒とは広義における皮膚、 頭皮の痒みを意味し、 例 えば乾燥、 ア ト ピー性皮膚炎、 老人性乾皮症による搔痒等が挙げら れる。 肌荒れとは広義における肌の劣化した状態を意味し、 搔痒に よる搔破ゃァ ト ビー性皮膚炎の悪化劣化の結果引き起こ される肌荒 れ、 乾燥による肌荒れ等が挙げられる。 敏感肌とは、 被刺激性が亢 進した状態の肌を意味し、 外界からの非特異的な物理化学的刺激、 例えば搔破、 温熱、 発汗、 日光、 衣服、 付着物等、 また精神的ス ト レス刺激に対して過敏に反応する肌の状態を指す。
本発明における美白効果とは、 日焼け、 乾燥その他の原因によ り 細胞によ り放出された S C Fが色素細胞の S C F レセプターに結合 するこ とで誘導されるメ ラニンの過剰生産によ り 引き起こされる し み、 そばかす、 くすみ等を改善するこ とを意味する。
本発明の搔痒、 肌荒れ、 敏感肌及び美白用薬剤は、 通常、 上記 S C F産生 · 放出抑制有効成分を水やエタノール等の水性溶媒に含有 させて用いられる。 本発明の S C F生産 · 放出抑制成分の配合量は 特に限定されないが、 固形分換算で 0. 00001〜0. 01重量％、 特に 0. 0 001〜0. 005重量％程度の範囲が好ましい。 尚、 本発明に係る薬剤を 入浴剤と して調製する場合、 使用時に通常 100〜： 1000倍程度に希釈 されるので、 配合はそれを加味した高濃度で処方されるのが好まし い。 上記水性溶媒と しては、 低級アルコールが好ましく 、 低級アル コールの含有量は、 本発明の薬剤中に、 20〜80重量％、 さ らに好ま しく は 40~ 60重量％である。
また、 本発明の搔痒、 肌荒れ、 敏感肌及び美白用薬剤には、 上記 必須成分以外に、 通常化粧品や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる 成分、 例えば、 その他の美白剤、 保湿剤、 酸化防止剤、 油性成分、 紫外線吸収剤、 界面活性剤、 増粘剤、 アルコール類、 粉末成分、 色 剤、 水性成分、 水、 各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合する こ とができる。
その他、 薬剤の用途に合わせ、 ェデ ト酸ニナ ト リ ウム、 ェデト酸 三ナ ト リ ウム、 クェン酸ナ ト リ ウム、 ポリ リ ン酸ナ ト リ ウム、 メ タ リ ン酸ナ ト リ ウム、 ダルコン酸等の金属封鎖剤、 カフヱイン、 タン ニン、 ベラパミル、 トラネキサム酸およびその誘導体、 甘草抽出物 、 グラブリ ジン、 カ リ ンの果実の熱水抽出物、 各種生薬、 酢酸 トコ フエロール、 ダリ チルリ チン酸およびその誘導体またはその塩等の 薬剤、 ビタ ミ ン C、 ァスコルビン酸リ ン酸マグネシウム、 ァスコル ビン酸ダルコシ ド、 アルブチン、 コウジ酸等の他の美白剤、 ダルコ ース、 フノレク トース、 マンノース、 シ ョ糖、 ト レハロース等の糖類 、 レチノイ ン酸、 レチノ一ノレ、 醉酸レチノ一ノレ、 パノレ ミチン酸レチ ノール等のビタ ミ ン A類なども適宜配合することができる。
本発明の搔痒、 肌荒れ、 敏感肌及び美白用薬剤は、 その用途に合 わせ、 例えば化粧料、 医薬品、 医薬部外品等の外用剤、 例えば化粧 水、 ク リーム、 乳液、 ローシ ョ ン、 パック、 浴用剤、 軟膏、 ヘアー ローシ ョ ン、 ヘアー トニック、 ヘアーリ キッ ド、 シャンプー、 リ ン ス、 養毛 · 育毛剤等、 従来皮膚外用剤に用いるものであればいずれ でもよ く、 剤型は特に問わない。
実施例
次に実施例によって本発明をさ らに詳細に説明する。
実験例 1
乾燥刺激によ り角化細胞膜から放出される SCFの測定と抑制薬剤の スク リ ーニング
市販のヒ ト表皮角化細胞 （新生児； Cryo NHEK- Neo，三光純薬） を 、 市販の無血清培地 （De f ined Kerat inocyt e-SFM，G I BCO社） を用い て培養した。 1 2穴マイ ク ロ プレー トに lxlO5 cells/mLで細胞をま いて、 コンフルェントになるまで約 37°Cで約 72時間培養した。
水またはエタノールで抽出した図 1及び 2に示す各生薬エキスを 2% w/v となるよ うに 70%ェタノールに溶解した。
培養液中に終濃度が 0.005% w/vとなるよ う に被験生薬エキスを加 え、 37°Cで 24時間イ ンキュベー ト した。 コン ト ロールと して、 エタ ノール（EtOH)のみを加えたものもィ ンキュベ一 卜 した。 最後の 2時 間は細胞の活性を検討するため、 即ち被験生薬エキスの細胞障害作 用による影響を調べるため、 alamarBlue TM (バイ オソース ' イ ン ターナショナル） を 10%となるよ う に添加し、 上清の蛍光強度（exc i tat ion 560nm , emission 590nm)を測定した。
乾燥刺激と して、 上清を完全に除去したのち C02イ ンキュベータ 内に 1 時間放置した。
次いで培地を添加し、 その 2時間後に上清を回収した。 上清中 SC F量を市販の ELISA法による測定キッ ト （R&D Systems社） で定量し た。
乾燥刺激を加えなかったものを対照と して、 被験生薬エキスの SC F量抑制作用を評価した。
同時に被験生薬エキスの持つ細胞傷害性を alamarBlue TMの還元 量を指標に評価した。
その結果を図 1及び 2に示す。 図 1及び 2の（a)は各生薬エキス を添加した場合の alamarBlue TMの還元量を示し、 （b)は各生薬ェキ スを添加し、 乾燥刺激を与えた細胞の培地中の遊離 S C Fの量から 、 各生薬エキスを添加し、 乾燥刺激を与えなかった細胞の培地中の 遊離 S C Fを差し引いた値を示す。 図 1及び 2の結果から明らかな 通り 、 各種生薬エキスはエタノールと比較して培養液中の S C Fの 量を有意に減少させ、 従って S C Fの産生及び Z又は放出を効果的 に抑制できるこ とがわかった。
実験例 2
各種刺激による角化細胞膜上での SCFの発現の亢進
10cmプレートに 150万個の角化細胞を播種し、 72時間培養した後 に、 （1)培地を PBS (-)に交換し、 UVBを 20mJ/cm2で照射し直ちに PBS (-）を培地に交換するか、 （2)フォルスコ リ ンを添加する又は（3)テ オフオ リ ンを添加して、 細胞に刺激を与えた。 24時間培養後細胞を 回収し、 50mMリ ン酸緩衝液（PH7.8)+プロテアーゼ阻害剤溶液 200 μ 1に細胞を拡散した後、 超音波破砕機によ り 30秒 5回 4°Cで細胞を破 砕した。 これを 10，000g、 20分、 4°Cで遠心分離し、 上清を更に 100， 000g、 60分 4°Cで遠心分離した。 得られたペレッ トを 25mMリ ン酸緩 衝液（PH6.8) + 0. l%Triton- X100溶液 100μ 1に溶かして、 膜画分タン パク抽出液と した。 この溶液のタンパク量を定法によ り測定し、 さ らに SCF量を測定して、 SCF量ノタンパク量の値を得た。
その結果を図 3及び 4に示す。 図の結果から明らかな通り、 細胞 に紫外線刺激、 又はフオルス コ リ ンゃテオフィ リ ン等の薬剤刺激を 与えると、 細胞内又は細胞膜上での S C Fの発現が亢進されること が明らかとなった。
実験例 3
紫外線刺激によ り角化細胞膜上に発現する SCFの測定と抑制薬剤の スク リ ーニング
10cmプレー トに 150万個の角化細胞を播種し、 72時間培養した後 に、 培地を PBS (-)に交換、 UVBを 20mJ/cm2で照射し、 直ちに PBS (-) を培地に交換する。 そこにス ク リ ーニング対象生薬を添加し、 24時 間培養後細胞を回収し、 50mMリ ン酸緩衝液（pH7.8)+プロテアーゼ 阻害剤溶液 200 μ 1に細胞を拡散した後、 超音波破砕機によ り 30秒 5 回 4°Cで細胞を破砕した。 これを 10，000g、 20分、 4°Cで遠心分離し 、 上清を更に 100 , 000g、 60分 4°Cで遠心分離した。 得られたペレツ 卜を 25mMリ ン酸緩衝液（pH6, 8 ) + 0. l%Tr i ton— X100溶液 100 /z 1【こ溶力 して、 膜画分タンパク抽出液と した。 この溶液のタンパク量を定法 によ り測定し、 さ らに SCF量を測定して、 SCF量/タンパク量の値を 得た。 この値について、 対象薬剤添加群のう ち、 溶媒のみを添加し た群と比べて 25%以下に低下せしめる候補生薬を、 上記抑制薬剤と する。
その結果を図 5 に示す。 図 5の結果から明らかな通り、 各種生薬 エキスで処理された細胞は、 紫外線照射のみで処理した細胞と比較 して S C Fの発現が有意に抑制されたこ とがわかった。
以下に、 種々の剤型の本発明による生薬エキス含有薬剤の処方例 を列挙する。
実施例 1
ボディ一用ク リ ーム
配合量 （重量部） メ チルポ リ シロ キサン 3 デカ メ チノレシク ロペンタ シロ キサン 13 ォク タ メ チルシク ロテ ト ラシロ キサン 12 ポリ オキシエチレン . メ チルポリ シロ キサン共重合体 1 ェタ ノ一ノレ 2 イ ソプロ ノ ノール 1 グリ セリ ン 3 ジプロ ピレングリ コーノレ 5 ポ リ エチレングリ コール 6000 5 メ タ リ ン酸ナ ト リ ウム 0. 05 DL- α -ト コ フエ ロール 2- L-ァス コルビン酸リ ン酸
ジエステノレカ リ ウム 0. 1 酢酸 DL- α -ト コフエ ロール 0. 1 カ フェイ ン 0. 1 ウイキヨ ウエキス 0. 1 ハマメ リ スエキス 0. 1 人参エキス 0. 1 ソウジュツエキス末 0. 005
L —メ ン ト一ノレ
パラオキシ安息香酸エステル
ェデ ト酸 3ナ ト リ ウム 0. 05 ジモルホ リ ノ ピリ ダジン 0. 01 ト リ メ ト キシ桂皮酸メ チルビス （ ト リ メ チルシ口 キシ）
シ リ ノレイ ソペンチル 0.
黄酸化鉄
チタン酸コバノレト
ジメ チルジステア リ ノレアンモニゥムへク ト ライ ト 1. 5 ポ リ ビニノレアノレ コ ーノレ 0. 1 ヒ ドロ キシェチノレセノレロース 0. 1 精製水 残余 ト リ メ チルシロ キシケィ酸 2 香料
実施例 2
乳液
配合量 （重量部） メ チルポ リ シロ キサン 2 ベへニノレアノレ コ ーノレ
キシ リ トール 1 ノ チノレアノレ コ 一ノレ 0. 5 グリセ リ ン 5
1， 3 —ブチレングリ コール 7 エ リ ス リ ト ーノレ 2 硬化油 3 スク ヮラン 6 テ ト ラ 2 —ェチルへキサン酸ペンタエリ ス リ ッ ト 2 ィ ソステアリ ン酸ポリ オキシエチレングリ セリル
モノステアリ ン酸ポリ オキシエチレングリ セリ ン
アンソ ッコゥエキス 0. 001 水酸化力 リ ウム
へキサメ タ リ ン酸ナ ト リ ウム 0. 05 フエノキシエタノーノレ
カルボキシビュルポリ マー 0. 11 精製水 残余 実施例 3
化粧水
配合量 （重量部） グリ セリ ン 2
1， 3—ブチレングリ コ一ノレ 4 エ リ ス リ ト ーノレ 1 ポリ オキシエチレンメチルダルコシ ド 1 ポリ オキシエチレン硬化ヒマシ油 0. 5 クェン酸 0. 02 クェン酸ナ ト リ ウム 0. 08 フエノ キシエタノール 0. 25 N —ヤシ油脂肪酸ァシル L —アルギニンェチル · D L— ピロ リ ドンカルボン酸 0. 1 力ギカズラ 0.0001 精製水 残余 実施例 4
美白化粧水
配合量 （重量部） ェチノレアノレコ ーノレ 10 ジプロ ピレングリ コーノレ 1 ポ リ エチレングリ コール 1 0 0 0 1 ポ リ オキシエチレンメ チルダノレコシ ド 1 ホホバ油 0.01 ト リ 2—ェチルへキサン酸グリ セ リ ル 0.1 ポリ オキシエチレン硬化ヒマシ油 0.2 ジイ ソステアリ ン酸ポリ グリ セリル 0.15
N—ステアロイルー L一グルタ ミ ン酸ナ ト リ ウム 0.1 クェン酸 0.04 クェン酸ナ ト リ ウム 0.18 水酸化力 リ ウム 0.4 グリ チルリ チン酸ジカ リ ウム 0.1 塩酸アルギニン 0.1
L一 ァス コノレ ビ ン酸 2 —グノレコ シ ド 2 黄金エキス 0.1 雪ノ 下エキス 0.1 パラベン 0.12 踊子草エキス 0.1 ジブチルヒ ドロ キシ トノレェン 0.01 ェデ ト酸 3ナ ト リ ウム 0.05 パラ メ ト キシ桂皮酸 2—ェチルへキシル 0.01 サボンソ ゥエキス 0. 005 精製水 残余 ミネラル水 3 香料
実施例 5
ト リ ー ト メ ン ト マスク
配合量 （重量部） エタ ノ ーノレ 10
1， 3 —ブチレングリ コーノレ 6 ポ リ エチレンダリ コール 4 0 0 0 2 オリ ーブ油
マカデミ アナッツ油 1 ヒ ドロ キシステア リ ン酸フィ ト ステ リ ノレ 0. 05 乳酸 0. 05 乳酸ナ ト リ ゥム液（50% ) 0. 2
L—ァス コルビン酸硫酸エステル 2 ナ ト リ ゥム 0. 1
DL— ト コ フ ェ ロ ーノレ 2— L—ァス コノレビン酸リ ン酸
ジエステル力 リ ゥム 0. 1 ビタ ミ ン Eァセテ一ト 0. 1 魚コラーゲン 0. 1 コ ン ドロイ チン硫酸 ト リ ウム 0. 1 パラォキシ安息香酸エステル 0. 1 カノレボキシメ チノレセノレロースナ ト リ ゥム 0. 2 ポリ ビュルアルコール 12. 5 ト ラネキサム酸
ビヤ ク ジュツエキス末 0. 001 精製水 残余 香料
実施例 6
美白エ ッセンス
配合量 （重量部） ワセ リ ン 2 メ チルポ リ シロ キサン 2 ェチノレアノレ コ ーノレ 5 ベへ： =·ノレアノレ コ 一ノレ 0. 5 ノ チノレアノレ コ ーノレ 0. 2 グリ セ リ ン 7
1 , 3 —ブチレングリ コール 5 ポ リ エチレンダリ コール 2 0 0 0 0 0. 5 ホ ホ ノ 油 3 スク ヮ ラ ン 2 ヒ ド ロキシステアリ ン酸コレステリノレ 0. 5 テ ト ラ 2 —ェチルへキサン酸ペンタエ リ ス リ ッ ト
ポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油 1 水酸化力 リ ウム 0. 1 ピ口亜硫酸ナ ト リ ウム 0. 01 へキサメ タ リ ン酸ナ ト リ ウム 0. 05 グリ チルレチン酸ステア リ ノレ 0. 1 ノヽ。ン トテニノレエチノレエーテノレ 0. 1 アルブチン 7 酢酸 トコフエ口 一ノレ 0. 1 ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウム 0. 05 ユー力 リ エキス 0. 001 パラォキシ安息香酸エステル ェデ ト酸 3ナ ト リ ウム 0.05 4一 t 一ブチル一 4 '—メ トキシジベンゾィノレメ タン 0.1 ジパラメ トキシ桂皮酸モノ ー 2 —ェチルへキサン酸
グリセ リ ノレ 0.1 黄酸化鉄 適量 キサンタンガム 0.1 カルボキシビュルポリ マー 0.2 精製水 残余 実施例 7
搔痒用入浴剤
配合量 （重量部） 流動パラフィ ン 35 ポリ エチレングリ コール 20 スク ヮラン 5
2 —ェチノレへキサン酸セチル 5 ポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油 5 クェン酸 0.1 クェン酸ナ ト リ ウム 0.2 グリ シン 0.5 ヒアノレロ ン酸ナ ト リ ウム 0.3 フエノキシエタ ノーノレ 0.5 パリ エタ リ アエキス 精製水 残余 香料
産業上の利用の可能性
本発明に従って、 S C Fの産生 ' 放出を生薬を効率的にスク リ ユングするこ とができる

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 幹細胞因子 （以下 「 S C F」 ） の産生及び Z又は放出を抑制 するこ とによ り搔痒、 肌荒れも しく は敏感肌の改善効果又は美白効 果を発揮する有効成分をスク リーニングする方法であって、 S C F を発現する細胞を被験成分と接触させ、 当該細胞が産生及び/又は 放出する S C Fの量を測定して S C Fの産生及び/又は放出量を減 少させる被験成分を前記有効成分と して選定する際、 当該 S C F発 現細胞に刺激を与えて S C Fの産生及び Z又は放出を促進させるこ とを特徴とする方法。
2. 前記刺激が乾燥刺激、 紫外線照射刺激又は薬剤刺激である、 請求項 1記載のスク リ ーニング方法。
3. 前記 S C F発現細胞を前記被験成分と接触させ、 次いで当該 細胞に刺激を与え、 しかる後に当該細胞が産生及び Z又は放出する S C Fの量を測定して前記有効成分を選定する、 請求項 1又は 2記 載のスク リ ーニング方法。
4. ノ ラエキス ローズ水、 チヤエキス、 ホ ッ プエキス、 サンザシ エキス、 ァズキ末、 シラカバエキス、 ケィ ヒエキス、 チ ョ ウ ジェキ ス、 ァノレニ力エキス、 ボタ ンエキス、 ボダイ ジュ、 ク ロ レラエキス 、 ローマ力 ミ ツ レエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リ エキス、 ソ ウ ジュ ツエキス末、 ビヤク ジュツエキス末、 ウーロ ン茶エキス末、 オノュ スエキス、 ァセンャクエキス、 ブ ドウ葉エキス、 ボウフゥエキス、 ク ヮエキス、 パリ エタ リ アエキス、 アンソッコゥエキス、 ステビア エキス、 ヒ ノ キ、 シ ョ ウブ根エキス、 ダイ ズエキス、 力ギカズラ、 サボンソ ゥエキス、 アルテアエキス、 オ トギリ ソ ゥエキス及びョモ ギエキスから成る群から選ばれる 1又は複数を含んで成る、 S C F 産生及び 又は抑制皮膚外用剤。
5 . S C Fの産生及びノ又は放出を抑制する成分を搔痒改善有効 成分と して含有する搔痒用皮膚外用剤。
6 . 前記搔痒改善有効成分が、 ホップエキス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 チヨ ウジエキス、 ローマ力ミツレエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リ エキス、 ソウジュツエキス末、 ビヤクジュツエキス末、 ゥ 一ロ ン茶エキス末、 オノニスエキス、 ボウフゥエキス、 ノ、。リ エタ リ ァエキス、 アンソッコゥエキス、 ステビアエキス、 ショ ウブ根ェキ ス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアエキス及びオ トギリ ソゥエキスから成る群から選ばれる 1又は複数を含んで成る、 請求 項 5記載の搔痒用皮膚外用剤。
7 . S C Fの産生及び Z又は放出を抑制する成分を肌荒れ防止有 効成分と して含有する肌荒れ防止用皮膚外用剤。
8 . 前記肌荒れ防止有効成分が、 サンザシエキス、 ソウジュツエ キス末、 ビヤクジュツエキス末、 オノニスエキス、 クヮエキス、 パ リ エタ リ ァエキス、 アンソ ッコゥエキス、 ステビアエキス、 ヒ ノ キ 、 ショ ウブ根エキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス及びアルテア エキスから成る群から選ばれる 1又は複数を含んで成る、 請求項 7 記載の肌荒れ防止用皮膚外用剤。
9 . S C Fの産生及び 又は放出を抑制する成分を敏感肌改善有 効成分と して含有する敏感肌用皮膚外用剤。
1 0 . 前記敏感肌改善有効成分が、 バラエキスローズ水、 チヤエ キス、 ホップエキス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 シラカバエキス 、 ケィ ヒエキス、 チヨ ウジエキス、 ク ロ レラエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リエキス、 ソウジュツエキス末、 ビヤク ジュツエキス末、 ゥ 一ロ ン茶エキス末、 オノニスエキス、 ァセンャクエキス、 ブドウ葉 エキス、 ボウフゥエキス、 ク ヮエキス、 ノヽ0リエタ リ ァエキス、 アン ソッコゥエキス、 ステビアエキス、 ヒ ノキ、 ショ ウブ根エキス、 ダ
25
訂正された用紙 （規則 91) ィズエキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアエキス、 ォ トギリ ソゥエキス及びョモギエキスから成る群から選ばれる 1又は 複数を含んで成る、 請求項 9記載の敏感肌用皮膚外用剤。
1 1 . S C Fの産生及び Z又は放出を抑制する成分を美白有効成 分と して含有する美白用皮膚外用剤。
1 2 . 前記美白有効成分が、 バラエキスローズ水、 オノニスェキ ス、 ァセンャクエキス、 ノヽ。リ エタ リ ァエキス、 アンソッコゥエキス 、 サボンソゥエキス、 ク ロ レラエキス及びユーカ リ エキスから成る 群から選ばれる 1又は複数を含んで成る、 請求項 1 1記載の美白用 皮膚外用剤。
1 3 . S C Fの産生及び Z又は放出を抑制することにより搔痒、 肌荒れもしく は敏感肌の改善効果又は美白効果を発揮する有効成分 をヒ ト又は哺乳動物の表皮に塗布することを含んで成る、 搔痒、 肌 荒れもしく は敏感肌の改善又は美白方法。
1 4 . 紫外線刺激によ り角化細胞内又は細胞膜上に発現する S C Fを抑制する成分を含有する薬剤。
1 5 . 前記成分がバラエキスローズ水、 チヤエキス、 ホップェキ ス、 サンザシエキス、 ァズキ末、 シラカバエキス、 ケィ ヒエキス、 チヨ ウジエキス、 アル二力エキス、 ボタンエキス、 ボダイジュ、 ク ロ レラエキス、 ローマ力 ミ ツレエキス、 紅茶エキス、 ユーカ リェキ ス、 ソウジュツエキス末、 ビヤク ジュツエキス末、 ウーロ ン茶ェキ ス末、 オノニスエキス、 ァセンャクエキス、 ブ ドウ葉エキス、 ボウ フゥエキス、 クヮエキス、 ノヽ0リエタ リ ァエキス、 アンソッコウエキ ス、 ステビアエキス、 ヒ ノキ、 ショ ウブ根エキス、 ダイズエキス、 力ギカズラ、 サボンソゥエキス、 アルテアエキス、 オ トギリ ソゥェ キス及びョモギエキスから成る群から選ばれる 1又は複数である、 請求項 1 4記載の薬剤。
1 6 . 前記成分がァズキ末、 アル二力エキス、 オノニスエキス又 はアンソッコゥエキスである、 請求項 1 4記載の薬剤。
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