JP2000004881A - 核酸塩基結合オリゴマー - Google Patents

核酸塩基結合オリゴマー

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JP2000004881A
JP2000004881A JP10174599A JP17459998A JP2000004881A JP 2000004881 A JP2000004881 A JP 2000004881A JP 10174599 A JP10174599 A JP 10174599A JP 17459998 A JP17459998 A JP 17459998A JP 2000004881 A JP2000004881 A JP 2000004881A
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nucleobase
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oligomer
binding
scf
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English (en)
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Hiroshi Yaguchi
寛 矢口
Hideki Obata
秀樹 小畠
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Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Factory Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】ヒトステムセルファクター（ＳＣＦ）の生合成
を選択的に抑制（阻害）する作用を有し、抗アレルギー
剤、抗炎症剤等として有用な核酸塩基結合オリゴマーを
提供。 【解決手段】例えばヒトＳＣＦをコードする遺伝子の第
３〜７コドンに対して相補的な配列を有するＤＮＡ、ペ
プチド核酸等の核酸塩基結合オリゴマー。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な核酸塩基結合オ
リゴマー、より詳しくは肥満細胞の遊走、接着、分化増
殖因子であるステムセルファクター（Stem cell facto
r, 以下ＳＣＦという）遺伝子、特にヒトのＳＣＦ遺伝
子、の少なくとも１部の塩基配列に相補的な塩基の配列
部分を含み、ＳＣＦのｍＲＮＡとハイブリダイズしてＳ
ＣＦ生合成を選択的に抑制（阻害）する作用を有し、例
えば抗アレルギー剤や抗炎症剤等として有用な、新しい
核酸塩基結合オリゴマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、アトピー性皮膚炎をはじめとする
アレルギー疾患は、成人患者数の増加と難治化の面よ
り、我国において社会問題となってきている。かかるア
レルギー疾患における炎症症状の慢性化は、特にその抑
制が望まれる重要な課題である。
【０００３】現在、アレルギー性皮膚炎の治療剤として
は、一般的にステロイド外用剤が用いられてきている。
該ステロイド外用剤は、症状緩和の点で後述する他の各
種薬剤よりも優れているため、第１選択の薬剤として幅
広く用いられている。しかしながら、ステロイド外用剤
は、周知の通りその副作用が臨床現場でしばしば問題と
されている。またその長期使用によればむしろ症状が悪
化するケースがある旨の報告もなされている。従って、
該ステロイド外用剤は、上記の点でアレルギー疾患の治
療剤としては、尚改善される余地があり、満足できな
い。
【０００４】上記ステロイド外用剤以外の薬剤として
は、抗アレルギー剤が知られている。該抗アレルギー剤
は、アレルギー反応の反応相を次の３つに分け、各反応
相を標的とするものに分類される。即ち、アレルギー反
応において、ＩｇＥ抗体の産生誘導からFceRとの結合ま
でを第一反応相、ＩｇＥとFceRとの結合から起炎性化学
伝達物質の誘導までを第二反応相、遊離された各種起炎
性化学伝達物質と標的組織細胞の当該受容体との反応か
ら実際のアレルギー炎症までを第三反応相として、上記
第一反応相を標的とする薬剤には、例えばトシル酸スプ
ラタスト、ＤＳＣＧ等が、第二反応相を標的とする薬剤
には、例えばトラニラスト等の酸性型抗アレルギー剤
や、ケトチフェン等の塩基性型抗アレルギー剤が、また
第三反応相を標的とする薬剤には、例えば抗ヒスタミン
剤や抗ロイコトリエンＲ等が、それぞれ包含される。
【０００５】之等の抗アレルギー剤は、主として掻痒の
軽減や症状の安定化を目的として用いられているが、そ
の殆どは、上記各反応相において炎症症状に関与する様
々な炎症メディエーターの内のいずれか一つの機能を抑
制する作用を有するものでしかない。しかるに、実際の
炎症の症状は、様々な炎症メディエーターの機能の総和
として現われてくるので、その内の一つを抑える薬剤で
は、尚炎症症状を充分に抑制することは困難である。
【０００６】上記のようなアレルギー疾患治療の現状を
打破するために、副作用が少なく、作用メカニズムが明
確であり、しかも様々な炎症メディエーターの抑制を同
時に可能とする新しい抗アレルギー剤の研究開発が、現
在精力的に行なわれているが、いまだ満足すべき薬効を
奏し得る薬剤は開発されるに至っていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、その作用メカニズムが明確であり、様々な炎症メデ
ィエーターを同時に抑制する作用を奏し得、しかも副作
用の少ないアレルギー疾患の治療及び予防剤を提供でき
る、新しい活性物質を提供することにある。
【０００８】本発明者は、上記目的より鋭意研究を重ね
た。特に、アトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギーの皮膚
炎では、局所において肥満細胞が分化増殖しており、そ
れが様々な炎症メディエーターを放出するという事実に
着目し、該肥満細胞の分化増殖を抑制することができれ
ば、皮膚炎症状、特にＩ型アレルギーの遅発反応（慢性
炎症）の軽減につながるという見地より、研究を進め
た。
【０００９】その課程において、ヒトの肥満細胞の分化
増殖には、唯一ＳＣＦがその因子として大きく関与して
いるとの報告〔J. Immunol., 148, 772 (1992)〕に注目
し、該ＳＣＦの合成阻害、例えば該ＳＣＦをコードする
遺伝子から生成されるｍＲＮＡの蛋白質への翻訳を阻害
すれば、ＳＣＦ産生を抑制でき、かくして皮膚炎症の機
構の根本である肥満細胞の分化増殖を抑制できるとの着
想から更に研究を重ねた。その結果、ＳＣＦ遺伝子由来
のｍＲＮＡの機能を妨害する作用を有する新しい特定の
塩基配列を有するオリゴマーを見出だすと共に、該オリ
ゴマーが実際にＳＣＦの合成を阻害し、アレルギー疾患
の治療及び予防に有用であることを見出し、ここに本発
明を完成するに至った。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ヒトＳ
ＣＦをコードする遺伝子（ヒトＳＣＦ遺伝子）の少なく
とも一部の塩基配列、殊に、該遺伝子の第３〜７コドン
の塩基配列又は配列番号：１に示される塩基配列、に相
補的な塩基の配列部分を有することを特徴とする核酸塩
基結合オリゴマーが提供される。
【００１１】上記核酸塩基結合オリゴマーには、まず第
一に、ＤＮＡ形態を有するもの、殊に、ＤＮＡを構成す
るリン酸ジエステル結合（以下単に「リン酸結合」とい
う）がヌクレアーゼによる分解を受けない化学修飾を施
されたもの、より好ましくは該化学修飾がホスホロチオ
エート化であるものが包含される。その代表例として
は、式（１）： d-Ｃ※p(s)Ｃ※p(s)Ａ※p(s)Ａ※p(s)Ｇ※p(s)Ｔ※p(s)
Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｇ※p(s)Ｔ※p(s)Ｇ※p(s)Ｔ※p(s)Ｃ
※p(s)Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｃ※p(s)Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｃ※
p(s)Ａ※p(s)Ｔ※ 〔式中、ｄはデオキシリボヌクレオシド単位から構成さ
れることを示し、Ｃ※は２′−デオキシシチジンを、Ｔ
※は２′−チミジンを、Ｇ※は２′−デオキシグアノシ
ンを、Ａ※は２′−デオキシアデノシンをそれぞれ示
し、p(s)はホスホロチオ酸による５′位と３′位との結
合手を示す。〕で表わされるユニットを有するものが例
示できる。
【００１２】上記核酸塩基結合オリゴマーには、また、
ペプチド核酸形態を有するもの、殊に、繰返し単位
（２）：
【００１３】
【化２】
【００１４】〔式中、Ｂは核酸塩基を示す。〕で表わさ
れるポリアミド骨格を有するものが包含される。その代
表例としては、上記繰返し単位中のＢの配列が、ヒトＳ
ＣＦ遺伝子の第３〜７コドンに相補的な配列であるもの
が提供できる。
【００１５】本明細書において、ヒトＳＣＦ遺伝子の塩
基配列は、マーチンら〔Cell, 63 (1), 203 (1990)〕に
よって報告されたそれに従うものとする。かかる塩基配
列及びその他の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
の規定[IUPAC-IUB Communication on Biological Nomen
clature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)]、「塩基
配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガ
イドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記
号に従うものとする。
【００１６】また本明細書において、核酸塩基結合オリ
ゴマーとは、核酸を構成する塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）
の複数個が、リン酸結合やペプチド結合により結合して
なる鎖状分子を構成する各繰返し単位のそれぞれに結合
して、塩基配列を形成している化合物をいう。該オリゴ
マーには、上記した通り、鎖状分子を構成する繰返し単
位が糖であるＤＮＡやＲＮＡの形態を有するもの（リン
酸結合によるもの）と共に、鎖状分子を構成する繰返し
単位がアミノ酸であるペプチド核酸（ペプチド結合によ
るもの）の形態を有するものが包含される。その長さ
は、得られるオリゴマーが、ヒトＳＣＦ遺伝子のｍＲＮ
Ａ転写物の少なくとも一部に対して相補的な塩基の配列
部分を有し、これに基づいてヒトＳＣＦの生合成を阻害
する作用を奏し得ることを前提として、特に限定的では
ない。
【００１７】本発明核酸塩基結合オリゴマーは、ＤＮＡ
形態及びペプチド核酸形態のいずれを有する場合にも、
その構成塩基の配列が、ヒトＳＣＦ遺伝子の少なくとも
一部の塩基配列に相補的であることを特徴とし、これに
基づいて、ヒトＳＣＦ遺伝子（コーディング鎖）に特異
的にハイブリダイズし得る特徴を有する。この特徴は、
またヒトＳＣＦ遺伝子のｍＲＮＡ転写物に対しても同様
に相補的であり、該転写物に対しても特異的にハイブリ
ダイズし得ることを意味する。従って、本発明核酸塩基
結合オリゴマーは、このｍＲＮＡとのハイブリダイズに
よって、該ｍＲＮＡの生物学的機能を妨害し、例えばｍ
ＲＮＡの蛋白質への翻訳等を遮断し、かくして、ＳＣＦ
生合成を阻害する作用を奏し得る。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明核酸塩基結合オリゴ
マーにつき、これをＤＮＡ形態を有するもの及びペプチ
ド核酸形態を有するものに大別して、順次詳述する。
【００１９】まず、ＤＮＡの形態を有する本発明核酸塩
基結合オリゴマーには、ＤＮＡ自体の他、該ＤＮＡのリ
ン酸結合がヌクレアーゼによる分解を受けない化学修
飾、例えばホスホロチオエート化を施されているものが
包含される。
【００２０】上記ＤＮＡ形態を有する本発明核酸塩基結
合オリゴマーは、これをそのまま、生体内投与に適した
薬剤形態に調製して、生体に投与することによって、所
望のＳＣＦ合成阻害効果を奏し得る。特に、上記化学修
飾されたＤＮＡ形態を有する本発明核酸塩基結合オリゴ
マーは、体内ヌクレアーゼにより分解されて失活するお
それがないため、より確実に、所望のＳＣＦ合成阻害効
果を奏し得る利点がある。
【００２１】上記化学修飾の方法としては、例えばホス
ホロチオエート化する方法、ホスホロジチオエート化す
る方法、アルキルホスホネート化する方法等、より好ま
しくはホスホロチオエート化する方法が挙げられる。之
等化学修飾の方法は、一般的な各種の方法に従い実施す
ることかできる。例えばホスホロチオエート化は、Gen
e, 72, 343 (1988)等により、ホスホロジチオエート化
は、Necleic Acids Res., 19(21),5843(1991)等によ
り、またアルキルホスホネート化は、Nucleic AcidsRe
s., 6(9), 3009(1979)等により、それぞれ実施すること
ができる。尚、上記化学修飾は、原料とする各デオキシ
リボ核酸について実施することもでき、之等を常法に従
い結合させて得られるポリヌクレオチドについて実施す
ることもできる。
【００２２】上記化学修飾されたＤＮＡ形態の本発明核
酸塩基結合オリゴマーの好ましい一具体例としては、例
えば上記式（１）で表わされるユニットを有するものを
例示できる。
【００２３】尚、上記式（１）に示されたホスホロチオ
酸による５′位と３′位との結合手とは、下式（３）で
示される結合手を意味し、この結合手により結合された
ＤＮＡをホスホロチオエート型という。
【００２４】
【化３】
【００２５】上記ホスホロチオエート型の本発明核酸塩
基結合オリゴマーは、体内ヌクレアーゼによる分解を実
質的に受けないものであり、所望のＳＣＦ合成阻害効果
を常に安定して確実に発揮できる点より特に好ましい。
【００２６】上記式（１）で示される好ましい本発明核
酸塩基結合オリゴマーは、ヒトＳＣＦ遺伝子の第１〜７
コドンに対して相補的な塩基配列を有しているが、本発
明核酸塩基結合オリゴマーの塩基配列は、特にこれに限
定されず、ヒトＳＣＦ遺伝子の少なくとも一部の塩基配
列に相補的なものであればよい。即ち、本発明核酸塩基
結合オリゴマーがヒトＳＣＦ遺伝子とハイブリダイズし
てその発現を抑制できるものであればよい。該塩基配列
の好ましいものとしては、ヒトＳＣＦ遺伝子の第３〜７
コドンの塩基配列に対して相補的なものを挙げることが
できる。
【００２７】本発明核酸塩基結合オリゴマーはまた、例
えば上記ヒトＳＣＦ遺伝子の第３〜７コドンに相補的な
塩基配列をその最小必須ユニットとして、該ユニットの
前後にＡ、Ｔ、Ｃ及びＧを核酸塩基とするデオキシリボ
核酸又はそれらのポリマー、即ちポリヌクレオチド（Ｄ
ＮＡ配列）を付加されたものであってもよい。かかる付
加的配列はＳＣＦ遺伝子のＤＮＡ配列と同じであっても
よいし、異なるものであってもよい。また、上記付加的
配列は、最小必須ユニットを構成する配列と同様に、例
えばホスホロチオエート型等の化学修飾されたものであ
ってもよく、ループ構造をもつものであってもよい。
【００２８】尚、本発明核酸塩基結合オリゴマーの有す
る塩基配列の長さは、得られるオリゴマーの特徴、特に
ＳＣＦ合成阻害の効力、安定性、細胞内への取込まれ易
さ、コストや、合成、精製の容易さ等を考慮して、適宜
決定でき、特に限定されるものではない。通常、上記し
た好ましい本発明核酸塩基結合オリゴマーのとる塩基配
列の長さを必須として、それ以上、即ち該塩基配列を含
むものであればよい。
【００２９】上述したＤＮＡ形態の本発明核酸塩基結合
オリゴマーは、デオキシリボ核酸乃至化学修飾されたデ
オキシリボ核酸を原料として、従来より知られている各
種の方法、例えば自動シンセサイザーを用いる方法等に
より簡便に製造できる。また、例えばスティクらの方法
〔J. Am. Chem. Soc., 106, 6077 (1984); J. Org. Che
m., 50, 390 (1985)〕を参照して製造することもでき
る。
【００３０】上記方法においては、市販の試薬や原料を
全て用いることができ、必要に応じて市販の試薬を常法
に従い適当に誘導体化して、例えば化学修飾、保護基の
付加、活性化等を行なって、用いることができる。
【００３１】次いで、ペプチド核酸形態の本発明核酸塩
基結合オリゴマーにつき詳述すれば、該ペプチド核酸形
態の本発明オリゴマーは、総じて、ＤＮＡ形態のそれに
比して、相補的配列を有するＤＮＡやＲＮＡ鎖により強
く結合する性質を有しており、しかも体内ヌクレアーゼ
やプロテアーゼによって分解されない特徴をも有してお
り、これらの点で抗アレルギー剤等のＳＣＦ合成阻害剤
としての用途により好適である。
【００３２】本発明核酸塩基結合オリゴマーのとり得る
ペプチド核酸形態としては、従来知られている各種のモ
ノマー単位からなるペプチド鎖のいずれであってもよ
い。その好ましい一つのモノマー単位としては、例えば
文献〔J. Am. Chem. Soc., 114(5), 1985 (1992)〕に記
載の、前記式（２）で表わされるポリアミド骨格をその
繰返し単位（ユニット）とするものを例示することがで
きる。
【００３３】該繰返し単位を有する本発明ペプチド核酸
形態の核酸塩基結合オリゴマー中、特に好ましいものと
しては、該繰返し単位中のＢの配列が、ヒトＳＣＦ遺伝
子の第３〜７コドンに相補的な配列であるものを例示で
きる。
【００３４】かかるペプチド核酸形態の本発明結合オリ
ゴマーにおける式（２）で示される繰返し単位中のＢの
配列は、これがその一部分にヒトＳＣＦ遺伝子の配列、
特にコーディング鎖の部分配列に相補的な配列を含む限
り、該配列のみからなるものであっても、また該配列の
前後に、更に任意の１又は複数の塩基を有するモノマー
を付加されたものであってもよい。該付加的ペプチド核
酸塩基の配列は、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧの単独又は之等の組
合せであることができ、これは特にヒトＳＣＦ遺伝子の
配列に相補的な塩基配列である必要はない。その配列及
び長さは、得られるオリゴマーの効力、安定性、細胞内
への取込まれ易さ、コスト、合成や精製の容易さ等を考
慮して適宜決定できる。
【００３５】上記ペプチド核酸形態の本発明核酸塩基結
合オリゴマーは、まず各核酸塩基を結合させたモノマー
を製造した後、之等のモノマーを、従来より知られてい
る一般的なペプチド合成方法に従って、反応させること
により実施できる。例えば固相合成法に従い、自動シン
セサイザーを用いて、所定の配列となるように反応させ
ればよい。上記モノマーの製造法は、既に知られている
〔例えばＷＯ９６／４０６８５号公報参照〕。
【００３６】尚、上記方法においては、市販の試薬や原
料を全て用いることができ、必要に応じて市販の試薬を
常法に従い適当に誘導体化して、例えば原料とするアミ
ノ酸の反応に関与しないＮ末端、Ｃ末端、側鎖官能基等
の保護反応を行なって、用いることができる。
【００３７】かくして得られる本発明核酸塩基結合オリ
ゴマーは、これがＤＮＡ形態を有する場合も、ペプチド
核酸形態を有する場合も、通常の分離手段により容易に
単離精製できる。かかる手段としては、例えば高速液体
クロマトグラフィー、電気泳動クロマトグラフィー、溶
媒抽出、塩析等を例示できる。
【００３８】本発明核酸塩基結合オリゴマーは、ＳＣＦ
ｍＲＮＡにハイブリダイズし、該ｍＲＮＡの通常の機能
を妨害し、ＳＣＦ（蛋白質）の産生を阻害乃至抑制する
作用を有している。従って、これは、皮膚組織において
肥満細胞の増加がみられる皮膚疾患、特に肥満細胞症や
アトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギー疾患の治療及び予
防に有用である。また、本発明核酸塩基結合オリゴマー
は、比較的少量で所望の薬効を示し、標的蛋白質のみに
特異的に効果を発揮するので、副作用が極めて少なくそ
の使用が安全である利点もある。
【００３９】本発明核酸塩基結合オリゴマーは、之等を
有効成分として通常の製剤担体と共に用いて、一般的な
医薬製剤組成物の形態とされ実用される。該製剤担体と
しては製剤の使用形態に応じて、通常使用される溶解
液、充填剤等の希釈剤乃至賦形剤を例示できる。これら
は得られる製剤の投与単位形態に応じて適宜選択使用さ
れる。上記医薬製剤組成物の形態としては、各種形態が
治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては
イオントファレシス、ソノフォトーシス、遺伝子銃等の
デバイスを必要とするものを含む経皮吸収製剤や、ネブ
ライザー等を使用した経気道吸収製剤を、好適なものと
して例示できる。また、その他の形態としては、経口剤
形態、注射剤形態、坐剤形態等が挙げられる。之等の各
種形態への調製は、通常の方法に従い行なうことができ
る。
【００４０】ＤＮＡ形態の本発明核酸塩基結合オリゴマ
ーの場合は、とりわけ、該オリゴマーが細胞内に取込ま
れ易くするために、之等をカチオン性リポソームや遺伝
子導入用に工夫された合成ポリマー等との複合体として
製剤化するのが好ましい。ここで用いられるカチオン性
リポソームとしては、例えばリボフェクチン（商品名：
ギプコ社製）等を、合成ポリマーとしては、例えばスー
パーフェクト（商品名：キアゲン社製）等を、それぞれ
例示できる。また、遺伝子銃を用いて投与される場合
は、金でコーティングした製剤とすることができる。
【００４１】ペプチド核酸形態の本発明核酸塩基結合オ
リゴマーは、上記の如き製剤化を行なわずとも通常の製
剤によって、実用できる有利がある。
【００４２】更に、上記で調製される医薬製剤組成物中
には、通常の緩衝剤、安定化剤、徐放化剤、吸収促進剤
等を必要に応じて添加配合することもできる。
【００４３】上記医薬製剤組成物中に含有させるべき本
発明核酸塩基結合オリゴマーの量は、特に制限されず広
範囲より適宜選択されるが、通常医薬製剤組成物中に約
１〜９０重量％程度含有されるものとするのがよい。
【００４４】医薬製剤の投与量は、その用法、患者の年
齢、性別その他の条件、疾患の程度等によりデリバリー
方法を考慮して適宜選択できる。通常有効成分である本
発明核酸塩基結合オリゴマーの量が、１日成人体重１ｋ
ｇ当り約０．１ｎｇ〜１ｍｇ程度とするのがよく、該製
剤は１日に１回もしくは２〜４回に分けて投与すること
ができる。
【００４５】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、本
発明核酸塩基結合オリゴマーの製造例を実施例として挙
げ、次いでそれらを用いた薬理試験例を挙げる。之等の
各例は、本発明の一実施態様を示すものであって、本発
明は之等の例により何等限定されるものではなく、本発
明の要旨を逸脱しない範囲において種々の態様で実施し
得るのは勿論である。
【００４６】
【実施例１】 ＤＮＡ形態の本発明核酸塩基結合オリゴ
マーの製造 自動シンセサイザーとしてＡＢＩ社製ＤＮＡ／ＲＮＡ合
成機を用いて、表１に示す試薬を用いてプログラム通り
に合成を行なって、前記式（１）に示す核酸塩基の配列
の本発明核酸塩基結合オリゴマー（ＤＮＡ形態）を得
た。
【００４７】
【表１】
【００４８】かくして得られた本発明核酸塩基結合オリ
ゴマーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、そ
の条件等を表２に示す）の結果、図１（縦軸：ピーク強
度（２６０ｎｍでの吸光度）、横軸：保持時間（分））
に示す溶離パターンを示した。その保持時間は１８．９
分であった。
【００４９】
【表２】
【００５０】また得られた本発明オリゴマーは、31Ｐ−
ＮＭＲスペクトル分析の結果、ホスホロチオエートのＰ
のシグナルが、通常のリン酸エステルのＰのシグナルよ
りも低磁場側に１本のみ観察されたことから、１００％
ホスホロチオエート化されたものであることを確認し
た。
【００５１】
【実施例２】ペプチド核酸形態の本発明核酸塩基結合オ
リゴマーの製造 自動シンセサイザーとしてパーセプティブバイオシステ
ムズ社製の自動合成機を用い、表３に示す各モノマーを
用いてプログラム通りに反応を行なわせて、前記繰返し
単位（２）で表わされるポリアミド骨格構造を有し、該
単位（２）中のＢの配列が、配列番号：２で示されるも
のである本発明核酸塩基結合オリゴマーを得た。該配列
は、ヒトＳＣＦ遺伝子の第３〜７コドンの配列に相補的
なものである。
【００５２】
【表３】
【００５３】尚、表中、Fmoc-aeは、その後の結合する
グリシン(-Gly)の窒素原子に２−〔Ｎ−（９Ｈ−フルオ
レン−９−イル）〕アミノエチル基が結合していること
を示す。また、Gly(A-Bhoc)-OHは、グリシンの窒素原子
上に、アミノ基をジフェニルメトキシカルボニル基(Bho
c)で保護されたアデニン(A-Bhoc)が、アセチル基を介し
て結合していることを示す。Gly(G-Bhoc)-OH及びGly(C-
Bhoc)-OHは、同様に、グリシンの窒素原子上に、アミノ
基をジフェニルメトキシカルボニル基で保護されたグア
ニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）がそれぞれ、アセチル基
を介して結合していることを示す。また、Gly(T)-OH
は、グリシンの窒素原子上に、チミン（Ｔ）が、アセチ
ル基を介して結合していることを示す。
【００５４】かくして得られたペプチド核酸形態の本発
明核酸塩基結合オリゴマーは、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ、その条件等を表４に示す）の結果、図
２に示す溶離パターン（縦軸：ピーク強度（ｍＶ）、横
軸：保持時間（分））を示した。
【００５５】
【表４】
【００５６】また、マトリックス補助レーザー脱離フラ
イト時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクト
ル）（マトリックス：シナピン酸）による分析の結果、
図３（縦軸：カウント数、横軸：Mass(m/z),(M+H)+）に
示すように、４０５７．４７に（Ｍ＋Ｈ）+ のピークが
観察された（理論値＝４０５８．９１）。
【００５７】
【薬理試験例１】 ＳＣＦ合成阻害作用 ＳＣＦを産生することが知られている培養細胞ＢＡＬＢ
／３Ｔ３ Ａ３１クローン（J. Cell Physiok., 88(3),
277(1976)）よりＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ（Rever
se transcribed-Polymerase chain reaction; E.S. Kaw
asaki, et al., Amplification of RNA. In PCR Protoc
ol, A Guide to methods and applications, Academic
Press, Inc, SanDiego, 21-27 (1991)）によってＳＣＦ
の遺伝子のみを増幅させた。このＰＣＲ産物とＲＮＡポ
リメラーゼ（Ｔ７）のプロモーター領域を結合（ライゲ
ーション）し、これを更にＰＣＲで増幅させることによ
って、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域を含むＳＣ
Ｆ遺伝子を調製した。この遺伝子から、ｍＣＡＰ ＲＮ
Ａキャッピングキット（STRATAGEN社製）を用いてＲＮ
Ａ合成を行なって、ＳＣＦのＲＮＡ基質とした。
【００５８】次いで、上記で得たＲＮＡ１μｇを、総反
応用量５０μｇのIn vitroトランスレーションシステム
（アマシャム社製、表５にその組成を記載する）に加
え、更にＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）を、１．２Ｕ／μ
ｌの濃度となるように加え、同時に実施例１で得られた
本発明核酸塩基結合オリゴマーの所定量を添加し、３０
℃で３０分間インキュベートした後、ビオチン修飾され
た蛋白質の合成量を以下の方法により測定した。
【００５９】
【表５】
【００６０】即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後、蛋白
質を膜にトランスプロットし、更にＨＲＰ（西洋ワサビ
パーオキシダーゼ）標識されたストレプトアビジンを結
合させてＥＣＬ検査法（Anal. Biochem., 206(2), 267
(1992)）によりビオチン標識された蛋白質を検出した。
感光させたポラロイドフィルムに現われた電気泳動バン
ドを画像解析ソフトＮＩＨイメージで解析し、そのバン
ド面積より、合成された蛋白質を定量した。検体を加え
ない場合の蛋白質の合成量を基準（１００％）として、
検体を加えたときの蛋白質合成抑制効果を百分率で求め
た。
【００６１】尚、対照として、本発明核酸塩基結合オリ
ゴマーの代わりにシクロヘキシミド（シグマ社製）を添
加して同様の操作を行なって得られる結果を求めた。
【００６２】結果を図４（縦軸：ＳＣＦ相対量（％）、
横軸：投与量（ｎＭ））に示す。図中の各値は、同一試
験を３回繰り返して得られた測定値の平均値である。
【００６３】図４より、本発明核酸塩基結合オリゴマー
は、モル濃度での比較において、シクロヘキシミドより
約４倍ＳＣＦ蛋白質合成の抑制効果が高いことが判っ
た。
【００６４】また、本発明核酸塩基結合オリゴマーの蛋
白質選択性を検討するために、ＳＣＦの代わりにＢＭＶ
（Brome Mosaic Virus）由来のＲＮＡ（Bull.Soc.Fr.Ph
ysiol.Veg., 12(4), 299(1966)）を用いて、上記と同様
にして無細胞転写翻訳系を調製し、該系におけるＢＭＶ
蛋白合成に対する本発明核酸塩基結合オリゴマーの影響
を検討した。
【００６５】その結果を図４と同様にして図５（縦軸：
相対蛋白量（％）、横軸：本発明結合オリゴマー濃度
（ｎＭ））に示す。
【００６６】図５に示される通り、本発明核酸塩基結合
オリゴマーのＳＣＦ以外の蛋白質に対する抑制効果は、
ＳＣＦの約１／２０〜１／５０倍程度と非常に低く、こ
のことから本発明核酸塩基結合オリゴマーはＳＣＦに対
する選択性の高いものであることが明らかとなった。
【００６７】更に、実施例２で得られた本発明結合オリ
ゴマーについて、上記と同一試験を行なった結果、上記
とほぼ同様の結果が得られた。
【００６８】以上のことから、本発明核酸塩基結合オリ
ゴマーは、肥満細胞の遊走、接着、分化増殖因子である
ＳＣＦ蛋白質を選択的に抑制することが確認された。
【００６９】
【配列表】 (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Ostuka Pharmaceutical Factory, Inc. (ii) TITLE OF INVENTION: 核酸塩基結合オリゴマー (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (vi) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: (B) FILING REFERENCE: 12E8JP (C) FILING DATE: 22-June-1998
【００７０】 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 21 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA(cDNA) (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: ATGAAGAAGA CACAAACTTG G 21
【００７１】 （２） ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： （ｉ） ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ： （Ａ） ＬＥＮＧＴＨ： ２１ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ （Ｂ） ＴＹＰＥ： ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ （Ｃ） ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ： ｓｉｎｇｌｅ （Ｄ） ＴＯＰＯＬＯＧＹ： ｌｉｎｅａｒ （ｉｉ） ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＴＹＰＥ： ｏｔｈｅｒ ＤＮＡ（ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ） （ｘｉ） ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ： ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２： ＣＣＡＡＧＴＴＴＧＴ ＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡ Ｔ
２１
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得た本発明核酸塩基結合オリゴマー
のＨＰＬＣによる溶離パターンを示すグラフである。
【図２】実施例２で得られた本発明核酸塩基結合オリゴ
マーのＨＰＬＣによる溶離パターンを示すグラフであ
る。
【図３】実施例２で得られた本発明核酸塩基結合オリゴ
マーの質量分析結果を示すグラフである。
【図４】本発明核酸塩基結合オリゴマーのＳＣＦ合成の
抑制効果を明らかにするグラフである。
【図５】ＢＭＶ蛋白合成に対する本発明核酸塩基結合オ
リゴマーの影響を検討した結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA01 CA06 CA11 CA12 GA13 HA17 HA20 4C084 AA07 AA13 BA02 BA35 MA13 MA63 NA05 NA06 ZA892 ZB132 4C086 AA03 EA16 NA05 NA06 ZA89 ZB13

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ヒトのステムセルファクターをコードする
    遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に相補的な塩基の配
    列部分を有することを特徴とする核酸塩基結合オリゴマ
    ー。
  2. 【請求項２】ヒトのステムセルファクターをコードする
    遺伝子の少なくとも一部の塩基配列が、該遺伝子の第３
    〜７コドンである請求項１に記載の核酸塩基結合オリゴ
    マー。
  3. 【請求項３】ヒトのステムセルファクターをコードする
    遺伝子の少なくとも一部の塩基配列が、配列番号：１に
    示されるものである請求項１に記載の核酸塩基結合オリ
    ゴマー。
  4. 【請求項４】ＤＮＡ形態を有する請求項１〜３のいずれ
    かに記載の核酸塩基結合オリゴマー。
  5. 【請求項５】ＤＮＡ形態が、これを構成するリン酸ジエ
    ステル結合がヌクレアーゼによる分解を受けない化学修
    飾を施されたものである請求項４に記載の核酸塩基結合
    オリゴマー。
  6. 【請求項６】化学修飾が、ホスホロチオエート化である
    請求項５に記載の核酸塩基結合オリゴマー。
  7. 【請求項７】式d-Ｃ※p(s)Ｃ※p(s)Ａ※p(s)Ａ※p(s)Ｇ
    ※p(s)Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｇ※p(s)Ｔ※p(s)Ｇ※
    p(s)Ｔ※p(s)Ｃ※p(s)Ｔ※p(s)Ｔ※p(s)Ｃ※p(s)Ｔ※p
    (s)Ｔ※p(s)Ｃ※p(s)Ａ※p(s)Ｔ※ 〔式中、ｄはデオキシリボヌクレオシド単位から構成さ
    れることを示し、Ｃ※は２′−デオキシシチジンを、Ｔ
    ※は２′−チミジンを、Ｇ※は２′−デオキシグアノシ
    ンを、Ａ※は２′−デオキシアデノシンをそれぞれ示
    し、p(s)はホスホロチオ酸による５′位と３′位との結
    合手を示す。〕で表わされるユニットを有する請求項６
    に記載の核酸塩基結合オリゴマー。
  8. 【請求項８】ペプチド核酸形態を有する請求項１〜３の
    いずれかに記載の核酸塩基結合オリゴマー。
  9. 【請求項９】ペプチド核酸形態が、繰返し単位 【化１】 〔式中、Ｂは核酸塩基を示す。〕で表わされるポリアミ
    ド骨格を有するものである請求項８に記載の核酸塩基結
    合オリゴマー。
  10. 【請求項１０】繰返し単位中のＢの配列が、ヒトのステ
    ムセルファクターをコードする遺伝子の第３〜７コドン
    に相補的な配列である請求項９に記載の核酸塩基結合オ
    リゴマー。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003056331A1 (fr) * 2001-12-27 2003-07-10 Shiseido Company, Ltd. Medicaments permettant d'ameliorer le prurit, la rugosite de l'epiderme ou l'hypersensibilite epidermique ou de blanchir par inhibition de la production et de la liberation du facteur de cellules souches
WO2004100966A1 (ja) * 2003-05-16 2004-11-25 Bbk Bio Corporation 病態起因物質の生体への接触防止用製剤

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