WO2002040707A1 - Procede de mesure des lipides et reactif associe - Google Patents

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WO2002040707A1
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reagent
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silicone
lipoprotein
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Mitsuaki Yamamoto
Shoko Yamamoto
Mitsuhiro Nakamura
Kazunori Saito
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Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
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    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently and separately measuring a lipid component in a specific lipoprotein fraction by a simple operation with a small amount of a sample and a measuring reagent used in the method.
  • Cholesterol, triglyceride, and phospholipid which are the main lipids in the living body, are present in blood as lipoproteins together with apoproteins. These lipoproteins are classified into chylomicron, ultra-low-density lipoprotein (VLDL), low-density lipoprotein (LDL), high-density lipoprotein (HDL), and the like, depending on their physical properties.
  • VLDL ultra-low-density lipoprotein
  • LDL low-density lipoprotein
  • HDL high-density lipoprotein
  • LDL is one of the causative substances causing arteriosclerosis
  • HDL is known to exhibit an anti-atherosclerotic effect.
  • the method of measuring lipid components in blood includes measuring the total amount of specific lipids contained in all lipoproteins, for example, measuring total cholesterol and total triglyceride, and measuring specific lipids such as LDL and HDL.
  • specific lipids such as LDL and HDL.
  • the former is an enzyme for a lipid component to be measured, and a condition that enables a reaction between the lipid component and the enzyme without distinguishing lipoproteins (for example, low selectivity for lipoproteins such as Triton X-100). (Surfactant), and the lipid components to be measured in all lipoproteins are measured.
  • the latter is carried out by combining an enzyme for the lipid component to be measured and special conditions that allow the enzyme to react only with the lipid component to be measured in a specific lipoprotein, and the specific lipoprotein fraction
  • the measurement target lipid component in the minute is measured.
  • lipoproteins to be measured have been conventionally extracted from the measurement sample by means such as ultracentrifugation, electrophoresis, gel filtration, or precipitation with a flocculant (precipitation method). (Hereinafter, these are collectively referred to as "fractionation methods").
  • the object of the present invention is to make it possible to generate special conditions in the direct method while satisfying conditions such as not affecting measurement accuracy, placing a burden on measuring equipment, and easily obtaining them.
  • An object of the present invention is to provide a method for measuring lipids contained in blood and the like using such substances. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on the above problem, and as a result, when measuring a lipid component in a specific lipoprotein to be measured, for example, HDL cholesterol, an organic silicon compound was contained in a reagent, and cholesterol was converted to a substrate.
  • the present inventors have found that, when an enzyme to be measured is mixed with a measurement sample, only HDL cholesterol can be specifically measured even in the absence of a coagulant or a modifying enzyme.
  • the present invention provides a lipid measuring method characterized in that lipid is measured in the presence of an organic gay compound, and a reagent used for the method.
  • Figure 1 shows the HDL cholesterol concentration in the same serum sample measured by the method of the present invention shown in Example 2 and the method (control method) using the reagent not containing the organic gay compound of the present invention. It is the figure which investigated the correlation of the result with the result by a fractionation method.
  • A is the control method
  • B is the method of the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of the method of the present invention shown in Examples 3A and 3B and the method using the reagent not containing the organic gay compound of the present invention (control method). It is a drawing in which the terol concentration was measured and the correlation between the result and the result by the fractionation method was examined.
  • A is the control method
  • B is the method of Example 3A
  • C is the method of Example 3B.
  • FIG. 3 shows the results obtained by measuring the HDL cholesterol concentration in the same serum sample by the method of the present invention shown in Example 4 and the method using the reagent not containing the organic gay compound of the present invention (control method). It is the figure which investigated the correlation of the result with the result by a fractionation method.
  • A is the control method
  • B is the method of the present invention.
  • the method of the present invention is carried out by allowing an organic silicon compound to be present in a lipid-containing sample and measuring the lipid using a known lipid measuring reagent.
  • Examples of the organic silicon compound used in the present invention include silicone and its derivatives.
  • This silicone is composed of a polymer consisting of a repeating structure of siloxane bonds (Si-O) n- in which a silicon atom and an oxygen atom are bonded (collectively referred to as polysiloxane (polysiloxane)).
  • a substance having an organic group such as a aryl group. Due to this molecular structure, the physical properties of silicone vary in viscosity, volatility, etc., depending on the degree of polymerization, degree of polymerization, type of side group, degree of cross-linking, etc. Properties of liquid, grease, rubber, resin There are things.
  • silicones and derivatives thereof are commercially available under the class names of, for example, silicones, highly polymerized silicones, cyclic silicones, alkyl silicones, silicone surfactants, and modified silicone oils, and are readily available.
  • the modified silicone oil is obtained by introducing an organic group into silicone oil, and is classified into types such as amino-modified, epoxy-modified, carboxyl-modified, polyether-modified, and alkyl-modified according to the type of the introduced organic group. From the structural point of view, it can be classified into side chain type, both terminal type, one terminal type, and both side chain type. In order to achieve the object of the present invention, these silicones and derivatives thereof may be used alone or as a mixture of two or more. In addition, catalogs describing the characteristics of individual products from each company Logs have been issued, and it is possible to select the organic gay compound to be used with reference to these logs.
  • the organosilicon compound of the present invention can be added simultaneously with the sample and the target lipid measurement reagent, or mixed with the sample, and then mixed with the remaining reagent containing the lipid measurement component for the purpose.
  • the target lipid may be measured by mixing the sample and a part of the reagent for lipid measurement, and then adding the reagent containing the organic gay compound of the present invention.
  • the method of finally detecting the target lipid after the addition of the lipid measurement reagent is not particularly limited.
  • absorbance analysis performed by further combining peroxidase and a chromogen, coenzyme, hydrogen peroxide, etc. It is also possible to use a method for directly detecting a criterion.
  • the amount of the organic gay compound to be added to the sample depends on the type of lipid to be measured, the nature of the sample, the type of reagent to be used, etc., or the presence of a surfactant described below.
  • the optimum conditions should be selected experimentally, which differ depending on the amount and the amount thereof. Generally, however, 0.001 to 5% by mass (hereinafter simply referred to as “% J”) is preferable. is 0. 0 0 1-5 0/0 about.
  • the present invention can be carried out by the direct method exemplified above, in other words, the organic silicon compound can be used in combination with the reagent used in the direct method, and it is preferable that the method be used.
  • the method is used in combination with a surfactant that does not dissolve lipoproteins (Japanese Patent No. 2799835) or a surfactant that has lipoprotein selectivity (Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-056395). Then, the properties of these surfactants can be further enhanced.
  • the organic gayne compound in order to adjust the water solubility of the organic gayne compound, it may be mixed with a surfactant such as glycerol and emulsified before use.
  • a surfactant such as glycerol and emulsified before use.
  • the surfactant any of anionic, nonionic, cationic, and amphoteric surfactants can be used, and there is no particular limitation.
  • Tercarboxylates N-acylamino acid salts, alkyl phosphates, N-acyltaurine phosphates, sulfonates, alkyl sulfates, polyoxyethylene alkyl ether sulfates, betaines, imidazolines, alkylammonium Salt, amidoamine, polyhydric alcohol fatty acid ester, alkyl glyceryl ether and its fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxy Sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene lanolin, polyoxyethylene lanolin alcohol, polyoxyethylene honey derivative, polyoxyethylene Ren castor oil, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene sterol, polyoxyethylene hydrogenated sterol, polyethylene
  • the surfactants described above can be used alone or in combination of two or more, and can be added to the measurement system.
  • the combination or addition amount of these surfactants depends on the type of silicone and its derivatives, the type of surfactant, etc., and the optimal conditions should be selected experimentally. Is about 0.001 to 5%, more preferably about 0.001 to 5%.
  • high molecular weight emulsifiers such as acrylic acid, alkyl methacrylate copolymers, carboxylic acid polymers, organic solvents such as ethanol, silicones and their derivatives that do not impair the specificity of measurement are also water-soluble. Used to adjust Can be
  • the lipid measured by the method of the present invention may be any lipid in the living body, but lipoprotein-constituting lipids such as cholesterol, neutral fat, and phospholipid are particularly preferred.
  • any enzyme that uses the target lipid as a substrate can be used as the enzyme used for measuring the lipid.
  • the enzyme used for measuring the lipid for example, Clinical Laboratory
  • Enzymes used for measuring cholesterol, triglycerides, and phospholipids which are widely used and described in the 30th edition (Kinbara Publishing, published in 1993), can of course be used. Included in the scope of the invention.
  • any of those generally used for cholesterol measurement such as cholesterol dehydrogenase, cholesterol oxidase, and cholesterol esterase, can be used.
  • cholesterol dehydrogenase cholesterol oxidase
  • cholesterol esterase cholesterol esterase
  • These may be of microbial origin, animal origin, plant origin, etc., or may have been prepared by genetic manipulation, with or without chemical modification.
  • these enzymes can be used in combination with a coenzyme, an enzyme for detection, a color former, and the like.
  • the coenzyme includes nicotinamide adenine dinucleotide and the like, and the enzyme includes peroxidase and the like.
  • a color former a trimer dye, paminoantipyrine, or the like can be used.
  • enzymes for detection can be used alone or in combination of two or more.
  • the amount used varies depending on the enzyme, and is not particularly limited, but is preferably 0.01 to 10%. It can be used in 0 units L, preferably in 0.1 to 100 units L.
  • a lipid measurement reagent prepared by appropriately combining the above-mentioned organic gayne compound, an enzyme for measuring lipid, a color former, a coenzyme and the like can be used. Further, if necessary, other enzymes such as catalase may be used as long as the specificity of the measurement is not impaired and the specific lipoprotein is not aggregated. , Salt, buffer for pH adjustment, surfactant, preservative, proteins such as albumin, antibodies, antibiotics, reagents with affinity for specific lipoproteins such as saponins, lectins, polyadiones can do.
  • the buffer may be any of Good's buffer, phosphoric acid, tris, phthalate, etc.
  • the reaction solution can be set to have a buffering condition in the range of pH 4 to 10.
  • the amount of use is not particularly limited, but is 0.0005 to 2 mol I ZL, preferably 0.01 to 1 mol I L. In all cases, optimal conditions should be selected experimentally based on the characteristics of the enzyme used, the relationship with other components contained in the reagent, and the like.
  • the following are specific examples of the lipid measurement reagent for advantageously carrying out the method of the present invention.
  • Color former such as 4-aminoantipyrine and disulfobutylmeta toluidine
  • a surfactant having lipoprotein selectivity can be used.
  • the effects of the present invention were confirmed using the HDL and LDL fractions prepared by ultracentrifugation as samples.
  • a reagent having the following composition was used for the measurement of cholesterol in the HDL and LDL fractions.
  • the measurement was performed using a Hitachi 7170 automatic analyzer.
  • Sample 2. 240 jU L of the reagent was added, and about 5 minutes later, 80 L of the second reagent was further added.
  • the absorbance at 600 nm was measured immediately before the addition of the second reagent and 5 minutes after the addition, and the difference was taken as the sample absorbance.
  • a second reagent containing Triton X-100, 1% having low lipoprotein selectivity, in place of the organic gay compound of the present invention was used as a control.
  • the sample absorbance when measured with the second reagent containing Triton X-100 was defined as 100, and the relative sample absorbance when measured with the second reagent containing various organic gay compounds was determined.
  • the ratio between the relative sample absorbance for LDL and the relative sample absorbance for HDL was calculated to compare the effects. The results are shown in Table 1.
  • the relative absorbance ratio when measured with the second reagent containing the organic silicon compound of the present invention was 0.04 to 0.5. This indicates that the organogay compound of the present invention has created a special condition that enables the reaction between cholesterol in HDL and the enzyme as well as the reaction between cholesterol in LDL and the enzyme. It is shown.
  • the effects of the present invention were confirmed using 20 serum samples containing lipoprotein as samples.
  • a reagent having the following composition was used for the measurement.
  • (1st reagent) B is— Tris buffer (pH 6.0) 50 mm o IZL
  • the measurement was performed using a Hitachi 7170 automatic analyzer.
  • the absorbance at 600 nm was measured immediately before and 5 minutes after the addition of the second reagent, and the difference was used to determine the concentration of HDL cholesterol in the serum sample (2-point method).
  • a control serum with a known concentration was used as a calibration substance.
  • a second reagent containing no organosilicon compound of the present invention was used.
  • the HDL cholesterol concentration in the serum sample was measured using a commercially available fractionation reagent (HD L-C ⁇ 2 kit; manufactured by Daiichi Pure Chemicals).
  • the value of the fractionation reagent was X and the value of the example was Y, and the correlation coefficient and regression equation were compared. The results are shown in Table 2 and FIG. Table 2
  • the organosilicon compound of the present invention to be contained in the second reagent is NET—SG—60 A (Example 3A) or NET—S
  • the effect of the present invention was confirmed under the same conditions as in Example 2 except that G-60C (Example 3B) (both 0.05%, manufactured by Nippon Surfactant) was used. The results are shown in Table 3 and FIG.
  • Example 2 was repeated except that KF-700 (0.08%, manufactured by Shin-Etsu Silicone) was used as the sample and 30 samples of serum containing lipoprotein were used as the organic gerin compound of the present invention in the second reagent. Under the same conditions as above, the effect of the present invention was confirmed. The results are shown in Table 4 and FIG.
  • the effect of the present invention was confirmed under the same conditions as in Example 2, except that the serum sample of 20 cases containing lipoprotein was used as a sample and the organic gay compound of the present invention contained in the second reagent was as shown in Table 5. .
  • the organic gayen compounds of Examples 5A to 5D were dissolved in ethanol so that the concentration became 10%, and the organic gayenic compounds of 5E and 5F were obtained using SH 8400 (Toray Industries, Ltd. ⁇ Dissolved in ethanol together with a modified silicone oil (made of silicone) so that each would be 10%, and then used for the preparation of the second reagent.
  • SH 8400 Toray Industries, Ltd. ⁇ Dissolved in ethanol together with a modified silicone oil (made of silicone) so that each would be 10%, and then used for the preparation of the second reagent.
  • Table 6 Examples of organosilicon compounds (all made of Toray, Dow Kojung, and silicone)
  • the intercept was particularly improved as compared with the case where the measurement was performed using the second reagent not containing the organic silicon compound of the present invention.
  • lipids eg, cholesterol
  • lipids in specific fractions can be efficiently quantified by simple operations without the need for pretreatment such as centrifugation.
  • a specific measurement can be performed by a simple operation with a small number of samples, it can be applied to various automatic analyzers, and is extremely useful in the field of clinical testing.
  • lipoproteins Since the selectivity is high, the intercept and the slope are improved, and there is an advantage that a minute lipoprotein selectivity can be controlled.

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Description

明 細 害 脂質測定方法およびそれに用いる試薬 技術分野
本発明は、 少ない試料で、 簡便な操作により、 効率良く、 特定リポ蛋白画分中 の脂質成分を分別測定する方法およびこの方法に使用する測定試薬に関する。 背景技術
生体の主要な脂質であるコレステロール、 中性脂肪およびリン脂質は、 血液中 においてアポ蛋白と共にリポ蛋白を形成して存在している。 このリポ蛋白は、 物 理的な性状の違いにより、 カイロミクロン、 超低比重りポタンパク（V L D L )、 低比重リポタンパク（L D L )、 高比重リポタンパク（H D L ) 等に分類される。 これらリポ蛋白のうち、 L D Lは動脈硬化を引き起こす原因物質の一つであり、 H D Lは反対に抗動脈硬化作用を示すことが知られている。
以前より、 虚血性心疾患の予防や治療効果の判定を目的として、 血液中の総コ レステロール、 総中性脂肪の測定が行われてきたが、 疫学的な検討により、 L D L中のコレステロール量が動脈硬ィ匕性疾患の発症頻度と正相関を示す一方、 H D L中のコレステロール量が動脈硬ィ匕性疾患の発症頻度と逆相関を示す事が明らか にされ、 L D Lや H D Lといったリポ蛋白画分毎の変動を把握する重要性が認識 されるに至った。 そして、 今日では、 各リポ蛋白を構成する蛋白成分であるアポ 蛋白 Bやアポ蛋白 A— I、 あるいはリポ蛋白画分毎のコレステロールの測定が行 われている。
前記したように、 血液中の脂質成分の測定方法としては、 全てのリポ蛋白中に 含まれる特定の脂質の総量、 例えば総コレステロールや総中性脂肪を測定するも のや、 L D Lや H D Lといった特定のリポ蛋白中のコレステロールを測定する方 法などがある。
このうち前者は、 測定対象とする脂質成分に対する酵素と、 該脂質成分と酵素 との反応をリポ蛋白の区別なく可能にする条件 （例えば T r i t o n X - 1 0 0 などのリポ蛋白選択性の低い界面活性剤）を組み合わせて実施されるものであり、 全てのリポ蛋白中の測定対象脂質成分が測定される。
後者は、 測定対象とする脂質成分に対する酵素と、 該酵素を特定のリポ蛋白中 の測定対象脂質成分とのみ反応可能にする特殊な条件を組み合わせて実施される ものであり、 特定のリポ蛋白画分中の測定対象脂質成分が測定される。
この特殊な条件を作るために、 従来は、 超遠心分離、 電気泳動、 ゲル濾過、 あ るいは凝集剤による沈殿 （沈殿法） などの手段により、 測定試料中から、 測定対 象とするリポ蛋白を単離する方法 （以下、 これらを総称して 「分画法」 という） が採用されていた。
最近、 これら分画法によらず特殊な条件を生じさせる方法 （以下、 総称する時 は 「直接法」 という） として、 例えば、 H D Lコレステロール測定に関する、 胆 汁酸のリポ蛋白に対する反応時間の差を利用する方法 （特公平 6— 0 1 6 7 2 0 号）、 測定対象外のリポ蛋白を凝集させた状態で酵素反応を行う方法 （特開平 6 - 2 4 2 1 1 0号）、 糖化合物を使用する方法 （特許第 2 6 5 3 7 5 5号）、 修 飾酵素を使用する方法 （特許第 2 6 0 0 0 6 5号）、 リポ蛋白を溶解しない界面 活性剤を使用する方法 （特許 2 7 9 9 8 3 5号）、 測定対象外のリポ蛋白中のコ レステロールを予め酵素反応により消去する方法（特開平 9 _ 0 0 0 2 9 9号）、 カラギナンを使用する方法 （特開平 9— 1 2 1 8 9 5号）、 リポ蛋白選択性のあ る界面活性剤を使用する方法 （特開平 1 1 _ 0 5 6 3 9 5号）、 カリクスアレン を使用する方法 （国際公開 WO 9 8 5 9 0 6 8号）、 リン化合物を使用する方 法 （特開 2 0 0 0— 1 1 6 4 0 0号） など、 多数が考案されている。
これらの直接法のいくつかは、 操作が煩雑な分画法と比較して、 簡便であるた め、 実際に日常的な臨床検査の分野で使用されている。 しかしながら、 その実用 化された方法であっても、 例えば、 試薬に凝集剤を含有する方法においては、 生 じた凝集物が測定精度に影響を与えたり、 また、 凝集剤と測定機器用のアル リ 性洗浄剤とが反応し流路に凝集塊がつまるなど、 測定機器への負担が生じたリ、 あるいは、修飾酵素を使用する方法においては、酵素を修飾する際の工程管理（品 質の維持） や経費増の問題があった。
従って、 本発明の目的は、 測定精度に影響を与えず、 また、 測定機器に負担を かけず、 さらに容易に入手できる等の条件を満たしながら、 直接法における特殊 な条件を生じさせることが可能な物質を見出し、 これを利用した血液等にふくま れる脂質の測定方法を提供することにある。 発 明 の 開 示
本発明者らは前記課題について、 鋭意研究を行った結果、 測定対象とする特定 リポ蛋白中の脂質成分、 例えば H D Lコレステロールの測定に際し、 試薬中に有 機ケィ素化合物を含有させ、 コレステロールを基質とする酵素と測定試料を混合 すると、 凝集剤や修飾酵素の非存在下であっても、 H D Lコレステロールのみを 特異的に測定できることを見出し本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 有機ゲイ素化合物の存在下に脂質を測定することを特徴 とする脂質測定方法およびそれに使用する試薬を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 2に示した本発明方法と、 本発明の有機ゲイ素化合物を含まな い試薬を用いた方法 （対照法） で、 同じ血清試料中の H D Lコレステロール濃度 を測定し、 その結果と分画法での結果の相関を調べた図面である。 図中、 Aは対 照法、 Bは本発明方法である。
図 2は、 実施例 3 Aおよび 3 Bに示した本発明方法と、 本発明の有機ゲイ素化 合物を含まない試薬を用いた方法 （対照法） で、 同じ血清試料中の H D Lコレス テロール濃度を測定し、 その結果と分画法での結果の相関を調べた図面である。 図中、 Aは対照法、 Bは実施例 3 Aの方法、 Cは実施例 3 Bの方法である。 図 3は、 実施例 4に示した本発明方法と、 本発明の有機ゲイ素化合物を含まな い試薬を用いた方法 （対照法） で、 同じ血清試料中の H D Lコレステロール濃度 を測定し、 その結果と分画法での結果の相関を調べた図面である。 図中、 Aは対 照法、 Bは本発明方法である。 発明の実施の形態
本発明方法は、脂質を含有する検体中に有機ケィ素化合物を存在せしめ、以下、 公知の脂質測定試薬を用いて脂質を測定することにより実施される。
本発明において用いられる有機ケィ素化合物としては、 シリコーンおよびその 誘導体を挙げることができる。 このシリコーンは、 ゲイ素原子と酸素原子が結合 したシロキサン結合の繰り返し構造一 （S i — O ) n—からなる高分子 （総称し てポリシロキサン （po l ys i l oxane) という） のうちアルキル基ゃァリール基など の有機基を有するものを言う。 シリコーンの物性は、 この分子構造に起因してお リ、重合度、側基の種類、橋かけの程度などによって粘度、揮発性などが異なり、 性状としては、 液状、 グリース状、 ゴム状、 樹脂状のものがある。 これらのシリ コーンおよびその誘導体は、 例えば、 シリコーン、 高重合シリコーン、 環状シリ コーン、 アルキルシリコーン、 シリコーン系界面活性剤、 変性シリコーンオイル などの分類名で市販されており、 容易に入手可能なものである。 前記変性シリコ —ンオイルは、 シリコーンオイルに有機基を導入したもので、 導入される有機基 の種類からは、 ァミノ変性、 エポキシ変性、 カルボキシル変性、 ポリエーテル変 性、アルキル変性などのタイプに分類され、構造の点からは、側鎖型、両末端型、 片末端型、 側鎖両末端型に分類することができる。 本発明の目的を達成するため に、 これらシリコーンおよびその誘導体は、 単独で、 あるいは 2種類以上を混合 して使用してもよい。 また、 各社より個別製品の特性等について記載されたカタ ログが発行されており、 これらを参照して使用する有機ゲイ素化合物を選択する ことができる。
本発明の有機ケィ素化合物は、 検体および目的とする脂質測定用の試薬と同時 に加えても、 あるいは、 検体に混合させたのち、 残りの脂質測定用成分を含む試 薬を混合して目的とする脂質を測定しても、 検体と脂質測定用試薬の一部を混合 した後、 本発明の有機ゲイ素化合物を含む試薬を加えて目的とする脂質を測定し てもよい。
また、 脂質測定用試薬を添加した後、 最終的に目的とする脂質を検出する方法 は特に制限されず、 例えばパーォキシダーゼと色原体をさらに組み合わせて行う 吸光度分析、 補酵素や過酸化水素を直接検出する方法なども利用することができ る。
本発明において、 検体に対する有機ゲイ素化合物の添加量は、 測定すべき脂質 の種類、 検体の性質、 使用する試薬の種類等、 あるいは後記する界面活性剤もし <はグリセ口ールの配合の有無やその量によつて異なリ、 実験的に最適条件を選 択すべきであるが、 一般的には、 0 . 0 0 0 1 ~ 5質量％ (以下、 単に 「％J で 示す）、 好ましくは 0 . 0 0 1 〜 5 0/0程度である。
特に本発明は、 先に例示した直接法で実施されること、 換言すれば有機ケィ素 化合物と直接法に使用される試薬とを組み合わせて使用することができ、 そうす ることが好ましい。 例えば、 リポ蛋白を溶解しない界面活性剤 （特許 2 7 9 9 8 3 5号） や、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤 （特開平 1 1—0 5 6 3 9 5号） と組み合わせて使用すれば、 これらの界面活性剤の性質をより高めることができ る。
更に、 本発明においては、 有機ゲイ素化合物の水溶性を調節するために、 例え ぱ、 界面活性剤ゃグリセロールなどと混合し、 乳化させて使用してもよい。 このうち、 界面活性剤としては、 ァニオン系、 ノニオン系、 カチオン系、 両性 界面活性剤などのいずれでも使用可能であり、 特に制限はないが、 アルキルエー テルカルボン酸塩、 N—ァシルアミノ酸塩、 アルキルリン酸塩、 N—ァシルタウ リン塩、 スルホン酸塩、 アルキル硫酸塩、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル 硫酸塩、 酢酸べタイン類、 イミダゾリン類、 アルキルアンモニゥム塩、 アミ ドア ミン、 多価アルコール脂肪酸エステル、 アルキルグリセリルエーテルとその脂肪 酸エステル、プロピレングリコ一ル脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、 ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、 ソルビタン脂肪酸エステル、 ポリオキシソルビタン脂肪酸エステル、 ポリオキシ エチレンソルビット脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレンラノリン、 ポリオキシ エチレンラノリンアルコール、 ポリオキシエチレン蜜蠟誘導体、 ポリオキシェチ レンヒマシ油、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、 ポリオキシエチレンステロー ル、 ポリオキシエチレン水素添加ステロール、 ポリエチレングリコール脂肪酸ェ ステル、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリオキシエチレンポリオキシ プロピレンアルキルエーテル、 エチレンジァミンのポリオキシエチレンポリオキ シプロピレン縮合物、 ポリオキシエチレンアルキルフ Iニルエーテル、 ポリオキ シエチレンアルキルァミン、 ショ糖脂肪酸エステル、 ポリオキシエチレン脂肪酸 アミ ド、 ポリオキシエチレンアルキルフエニルホルムアルデヒド縮合物、 ポリオ キシエチレンアルキルェ一テルリン酸、 ポリオキシエチレンアルキルエーテルリ ン酸塩などを例示することができる。
上記した界面活性剤は、 単独で、 あるいは 2種類以上を組み合わせて使用し、 測定系中に添加することができる。 これら界面活性剤の組み合わせ、 あるいは添 加量は、 シリコーンおよびその誘導体の種類、 界面活性剤の種類等によって異な リ、実験的に最適条件を選択すべきであるが、一般的には測定系中の濃度として、 0 . 0 0 0 1〜5 %程度であり、 0 . 0 0 1〜5 %程度とすることがより好まししゝ。 また、 界面活性剤のほかに、 アクリル酸，メタクリル酸アルキル共重合体、 力 ルポキシビ二ルポリマーなどの高分子乳化剤、 エタノールなどの有機溶媒、 測定 の特異性を損なわないシリコーンおよびその誘導体なども水溶性の調整に使用す ることができる。
本発明の方法により測定される脂質は生体中にあるものなら何れでもよいが、 リポ蛋白を構成する脂質であるコレステロール、 中性脂肪、 リン脂質が特に好ま しい。
本発明の方法において、 脂質を測定するために使用される酵素としては、 目的 とする脂質を基質とするものなら何れも使用できる。 例えば、 臨床検査法提要第
3 0版 （金原出版、 1 9 9 3年発行） などに記載され、 汎用されているコレステ ロール、 中性脂肪、 リン脂質を測定するために使用される酵素は当然に使用可能 であり、 本発明の範囲に含まれる。
これら脂質のうち、 例えばコレステロールを測定する場合は、 コレステロール デヒドロゲナーゼ、 コレステロールォキシダーゼ、 コレステロールエステラーゼ など一般にコレステロール測定に使用されるものなら何れでも差し支えなく使用 できる。 これらは、 微生物由来、 動物由来、 植物由来など、 いずれでも、 また遺 伝子操作によリ作られたものでも良く、 化学修飾の有無も問わない。
これら酵素は必要に応じて、 補酵素や検出のための酵素や発色剤などと組合せ てを使用することができ、 補酵素としてはニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチ ドなどが、 酵素としてはペルォキシダーゼなどが、 発色剤としてはトリンダー系 の色素ゃァミノアンチピリンなどが使用できる。
これら検出のための酵素は、 単独で、 あるいは 2種類以上を組み合わせて使用 することができ、 またその使用量は酵素によって異なり、 特に制限されるもので はないが 0 . 0 0 1〜 1 0 0単位 Lで、 好ましくは 0 . 1〜 1 0 0単位 L で使用することができる。
本発明方法を有利に実施するためには、 上記した有機ゲイ素化合物、 脂質を測 定するための酵素、 発色剤、 補酵素等を適宜組み合わせて調製した脂質測定試薬 を使用することができる。 また更に、 必要に応じて測定の特異性を損なわず、 ま た、 特定のリポ蛋白の凝集を生じない範囲であれば、 カタラーゼなどの他の酵素 や塩、 p H調整のための緩衝剤、 界面活性剤、 防腐剤、 アルブミンなどの蛋白質 類、 抗体、 抗生物質、 サポニン、 レクチン、 ポリア二オンなど特定のリポ蛋白に 親和性を有する試薬を配合することができる。
これらのうち、 緩衝剤としては、 グッドの緩衝剤、 りん酸、 卜リス、 フタル酸 塩など何れでもよく、 反応液として p H 4から 1 0の範囲で緩衝作用を有する条 件が設定できるものであれば使用できる。 その使用量は、 特に制限させるもので はないが 0.0005〜2mo I ZLで、 好ましくは 0.01 ~ 1 mo I Lで使 用される。 いずれも実施にあたっては、 使用する酵素の特性あるいは、 試薬に含 まれるその他の成分との関係等から、 実験的に最適条件を選択すべきである。 なお、 本発明方法を有利に実施するための脂質測定試薬の具体例を示せば次の 通りである。
( H D L—コレステロール測定用試薬 ）
( 1 ) 有機ケィ素化合物
(2) コレステロールエステラーゼ
(3) コレステロールォキシダ一ゼ
(4) パーォキシダ一ゼ
(5) 発色剤 （4ーァミノアンチピリンとジスルホブチルメタ トルイジン等） * 所望により、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤などを使用できる。
( L D L—コレステロール測定用試薬 ）
( 第一試薬 ）
(1 ) 有機ゲイ素化合物
(2) コレステロールエステラーゼ
(3) コレステロールォキシダーゼ
(4) パーォキシダーゼ
(5) 二種組み合わせることにより発色する成分のうちの一方 （例えば、 4一 ァミノアンチピリン等） * 所望により、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤など
( 第二試薬 ）
(6) 二種組み合わせることにより発色する成分のうちの他方 （例えば、 ジス ルホブチルメタ トルイジン等）
(7) リポ蛋白選択性の低い界面活性剤 実 施例
次に実施例を挙げ、 本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれら実施例等 に何ら制約されるものではない。 実 施 例 1
超遠心分離法により調製した H D L、 L D L画分を試料として、 本発明の効 果を確認した。 H D Lおよび L D L画分中のコレステロールの測定には、 下記の 組成の試薬を使用した。
( 第一試薬 ）
P I P E S緩衝液 （p H 6. 5) 50 mm o
4一ァミノアンチピリン 0. 5 m o I
( 第二試薬 ）
P I P E S緩衝液 （p H 6. 5) 50 mm o I Z L
コレステロールエステラ一ゼ 1 単位 Zm L
コレステロールォキシダーゼ 1 単位 L
ジスルホブチルメタ 卜ルイジン 1. 0 mm o I / L
パーォキシダーゼ 5 単位 Zmし
有機ケィ素化合物 1 %
(いずれも日本ュニカー製）
測定は日立 7 1 70型自動分析機を使用して行った。 試料 2. 4 μ Lに第- 試薬 240jU Lを添加し、 約 5分後、 第二試薬 80 Lをさらに添加した。 第 二試薬添加直前と添加後 5分後の 600 nmにおける吸光度を測定し、 その差を 試料吸光度とした。対照として、リポ蛋白選択性の低い T r i t o n X— 1 00、 1 %を本発明の有機ゲイ素化合物の代わリに含有する第二試薬を使用した。
T r i t o n X- 1 00を含む第二試薬で測定した時の試料吸光度を 1 00と し、 各種有機ゲイ素化合物を含む第二試薬で測定した時の相対試料吸光度を求め た。 LD Lに対する相対試料吸光度と、 HD Lに対する相対試料吸光度の比を計 算し効果を比較した。 結果を表 1に示した。
表 1
Figure imgf000011_0001
本発明の有機ケィ素化合物を含む第二試薬で測定した時の、 相対吸光度の比 は 0.04~0. 5であった。 これは本発明の有機ゲイ素化合物が、 LD L中のコ レステロールと酵素との反応よリも、 H D L中のコレステロールと酵素の反応を よリ可能にすると言う特殊条件を生じさせていることを示すものである。
実 施 例 2
リポ蛋白を含む 20例の血清検体を試料として本発明の効果を確認した。 測定 には次の組成の試薬を用いた。
( 第一試薬 ） B i s— T r i s緩衝液 （ p H 6.0 ) 50 mm o I Z L
コレステロールォキシダーゼ 1 単位 Zm L
パーォキシダーゼ 1.25 単位
ジスルホブチルメタ トルイジン 0.5 mm o I
フルフ Iナム酸 1 50 m o \ XL
( 第二試薬 ）
B i s -T r i s緩衝液 （ p H 6 , ) 50 mm o I Zし
コレステロールエステラーゼ （旭化成 1. 5 単位 Zm L
4ーァミノアンチピリン 1.0 mm o I Zし、 ェマルゲン Β— 66 1. 5 %
有機ケィ素化合物 0.001 %
(NUC-Si I iconL720： 日本ュニ力一製）
測定は日立 7 1 70型自動分析機を使用して行った。 試料 2. 4 ！_に第一 試薬 240 Lを添加し、 約 5分後、 第二試薬 80 Lをさらに添加した。 第 二試薬添加直前と添加後 5分後の 600 nmにおける吸光度を測定し、 その差よ リ血清検体中の H D Lコレステロール濃度を求めた（2ポイント法）。 較正用物質 として濃度既知のコント口一ル血清を用いた。 対照として、 本発明の有機ケィ素 化合物を含有しない第二試薬を使用した。
市販の分画法試薬 （HD L— C ■ 2キット；第一化学薬品製） を用い、 同時に 血清試料中の H D Lコレステロール濃度を測定した。 分画法試薬の値を X、 実 施例の値を Yとし、 相関係数、 回帰式を比較した。 結果を表 2および図 1に示し た。 表 2
Figure imgf000013_0001
本発明の有機ゲイ素化合物を含む第二試薬で測定した場合、 本発明の有機ケィ 素化合物を含まない第二試薬で測定した場合に対し、 傾き、 切片がともに改善さ れていた。 これは本発明の有機ケィ素化合物が、 L D L中のコレステロールと酵 素との反応よリも、 H D L中のコレステロールと酵素の反応をよリ可能にすると 言う特殊条件を生じさせ、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤の特性をより向上さ せることを示すものである。
実 施 例 3
リポ蛋白を含む 2 6例の血清検体を試料として、 第二試薬に含有させる本発明 の有機ケィ素化合物を N E T— S G— 6 0 A (実施例 3 A ) あるいは N E T— S G-60 C (実施例 3 B) (いずれも 0.05%、 日本サーファクタン卜製） とす る以外は、 すべて実施例 2と同様の条件で本発明の効果を確認した。 結果を表 3 および図 2に示した。
表 3
Figure imgf000015_0001
本発明の有機ゲイ素化合物を含む第二試薬で測定した場合、 本発明の有機ケィ 素化合物を含まない第二試薬で測定した場合に対し、 傾き、 切片のいずれもが改 善されていた。 これは本発明の有機ゲイ素化合物が、 LD L中のコレステロール と酵素との反応よりも、 HD L中のコレステロールと酵素の反応をより可能にす ると言う特殊条件を生じさせ、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤の特性をより向 上させることを示すものである。
実 施 例 4
リポ蛋白を含む 30例の血清検体を試料として、 第二試薬に含有させる本発明 の有機ゲイ素化合物を KF— 700 (0. 08%、 信越シリコーン製） とする以 外は、 すべて実施例 2と同様の条件で本発明の効果を確認した。 結果を表 4およ び図 3に示した。
表 4
Sample 分画法 対照法 本法
1 98.6 98.7 98.2
2 95.0 94.5 95.0
3 87.4 87.9 89.4
4 84.0 84.7 84.5
5 80.4 82.6 81.8
6 76.6 79.0 79.2
7 74.2 76.6 76.1
8 71.8 74.6 74.1
9 69.2 70.6 70.0
10 63.6 67.6 67.4
11 60.0 63.8 64.2
12 60.8 64.7 63.9
13 59.8 63.2 62.9
14 58.6 60.9 61.3
15 55.8 59.7 59.2
16 55.8 60.0 59.1
17 54.4 58.3 57.1
18 52.0 56.3 54.6
19 49.0 53.8 52.8
20 48.6 49.5 48.8
21 45.0 48.2 47.5
22 43.4 47.1 46.6
23 45.0 46.8 46.0
24 44.6 47.0 45.8
25 42.0 44.0 42.9
26 41.8 43.0 42.0
27 38.0 42.3 40.9
28 38.4 41.1 39.9
29 37.0 38.5 37.2
30 35.0 37.0 36.0 相関係数 0.997 0.997 傾き 0.963 0.988 切片 4.7 2.7 本発明の有機ゲイ素化合物を含む第二試薬で測定した場合、 本発明の有機ゲイ 素化合物を含まない第二試薬で測定した場合に対し、 傾き、 切片ともに改善され ていた。 これは本発明の有機ケィ素化合物が、 L D L中のコレステロールと酵素 との反応よりも、 H D L中のコレステロールと酵素の反応をより可能にすると言 う特殊条件を生じさせ、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤の特性をより向上させ ることを示すものである。
実 施 例 5
リポ蛋白を含む 20例の血清検体を試料として、 第二試薬に含有させる本発明 の有機ゲイ素化合物を表 5とする以外は、 すべて実施例 2と同様の条件で本発明 の効果を確認した。 なお、 実施例 5A〜5 Dの有機ゲイ素化合物はエタノールに 1 0%となるよう溶解してから、 また、 5 Eおよび 5 Fの有機ゲイ素化合物は、 SH 8400 (東レ .ダウコ一二ング■ シリコーン製の変性シリコーンオイル） と一緒に、 それぞれが 1 0%となるようエタノールに溶解、 混合してから第二試 薬の調製に使用した。 結果を表 6に示した。 表 5 実施例 有機ケィ素化合物 （全て東レ ·ダウコーユング · シリコーン製）
5 A BY1 1-030 (0. 03%)
5 B BY22-008M (0. 05%)
5 C SH— 244 (0. 03%)
5 D SH- 245 (0. 05%)
5 E DC 345 ( 0. 02%)
5 F SH200 C-2 c s (0. 02%) 表 6
Figure imgf000019_0001
本発明の有機ケィ素化合物を含む第二試薬で測定した場合、 本発明の有機ゲイ 素化合物を含まない第二試薬で測定した場合に対し、切片が特に改善されていた。 これは本発明の有機ゲイ素化合物が、 L D L中のコレス亍ロールと酵素との反応 よりも、 H D L中のコレステロールとの反応をより可能にするという特殊条件を 生じさせ、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤の特性をよリ向上させることを示す ものである。 産 業 上 の 利 用 可 能 性
本発明によれば、 遠心分離などの前処理の必要がなく、 簡便な操作で効率良く 特定画分中の脂質 （例えばコレステロール） を定量する事ができる。 また、 少な い試料で、 簡便な操作により、 特異的な測定が可能であるため、 種々の自動分析 装置に適用でき、 臨床検査の領域においても極めて有用である。 特に、 リポ蛋白 選択性が高いため、 切片、 傾きが改善することになリ、 微小なリポ蛋白選択性の 制御が可能になるというメリットを有するものである。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 有機ゲイ素化合物の存在下に血液成分中の脂質を測定することを特徴とす る脂質測定方法。
2 . 有機ゲイ素化合物がシリコーンおよびノ又はその誘導体である請求項第 1 項記載の脂質測定方法。
3 . シリコーン又はその誘導体が、 高重合シリコーン、 環状シリコーン、 シリ コーン系界面活性剤および変性シリコーンオイルから成る群より選択されたもの である請求項第 1項または第 2項に記載の脂質測定方法。
4 . 脂質成分が特定のリポ蛋白に含まれる脂質である請求項第 1項乃至第 3項 の何れかの項に記載の脂質測定方法。
5 . 脂質成分がコレステロール、 中性脂肪またはリン脂質のいずれかである請 求項第 1項乃至第 4項のいずれかの項記載の脂質測定方法。
6 . 有機ゲイ素化合物が存在し、 凝集剤が存在しない条件において、 リポ蛋白 に酵素を作用させ、 リポ蛋白中に含まれている脂質を検出することを特徴とする 請求項第 1項乃至第 5項のいずれかの項記載の脂質測定方法。
7 . リポ蛋白中の脂質に対する酵素の作用を、 リポ蛋白選択性のある界面活性 剤の存在下行う請求項第 1項乃至第 6項の何れかの項記載の脂質測定方法。
8 . 有機ゲイ素化合物を含有することを特徴とする脂質測定試薬。
9 . 有機ゲイ素化合物がシリコーンおよび 又はその誘導体である請求項第 8 項に記載の脂質測定試薬。
1 0 . シリコーン又はその誘導体が、 高重合シリコーン、 環状シリコーン、 シリ コーン系界面活性剤および変性シリコーンオイルから成る群より選択される請求 項第 8項または第 9項に記載の脂質測定試薬。
1 1 . 脂質成分が特定のリポ蛋白に含まれる脂質である請求項第 8項乃至第 1 0 項のいずれかの項記載の脂質測定試薬。
1 2. 脂質成分がコレステロール、 中性脂肪またはリン脂質のいずれかである請 求項第 8項乃至第 1 1項のいずれかの項記載の脂質測定試薬。
1 3. 次の成分 （ 1 ) 〜 （ 5 )
(1 ) 有機ケィ素化合物
(2) コレステロールエステラーゼ
(3) コレステロールォキシダーゼ
(4) パーォキシダーゼ
(5) 発色剤
を含有する H D L—コレステロール測定用試薬。
1 4. 更に、 リポ蛋白選択性のある界面活性剤を配合した請求項第 1 3項記載の H D L一コレステロール測定用試薬。
1 5. 次の成分 （ 1 ) 〜 （ 5 )
(1 ) 有機ゲイ素化合物
(2) コレステロールエステラーゼ
(3) コレステロールォキシダーゼ
(4) パーォキシダーゼ
(5) 二種組み合わせることにより発色する成分のうちの一方
を含有する第一試薬と、 次の成分 （6) および （7)
(6) 二種組み合わせることにより発色する成分のうちの他方
(7) リポ蛋白選択性の低い界面活性剤
を含有する第二試薬とを組合せてなる L D L—コレステロール測定用キット。
1 6. 更に、 第一試薬にリポ蛋白選択性のある界面活性剤を配合した請求項第 1 5項記載の L D L—コレステロ一ル測定用キッ卜。
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