WO1991019716A1 - Antitumor substance be-13793c - Google Patents

Antitumor substance be-13793c Download PDF

Info

Publication number
WO1991019716A1
WO1991019716A1 PCT/JP1990/000812 JP9000812W WO9119716A1 WO 1991019716 A1 WO1991019716 A1 WO 1991019716A1 JP 9000812 W JP9000812 W JP 9000812W WO 9119716 A1 WO9119716 A1 WO 9119716A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
strain
substance
cells
present
Prior art date
Application number
PCT/JP1990/000812
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Katsuhisa Kojiri
Hiroyuki Suda
Akira Okura
Kenji Kawamura
Masanori Okanishi
Original Assignee
Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to KR1019920700375A priority Critical patent/KR0163202B1/ko
Publication of WO1991019716A1 publication Critical patent/WO1991019716A1/ja
Priority to NO920614A priority patent/NO300812B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/14—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/625—Streptoverticillium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/908—Streptovirticillium

Definitions

  • the present invention is useful in the field of medicine, and more specifically, a novel compound that inhibits the growth of tumor cells and exerts an antitumor effect, a method for producing the same, a use thereof, and a novel streptova that produces the novel substance.
  • the present invention relates to a microorganism belonging to the genus Tissylium (Streptovertici Illium). Background art
  • the present inventors have screened a wide range of microbial metabolites for antineoplastic substances and found that the novel substances described below show excellent antitumor activity. Disclosure of the invention that completed the present invention
  • the present invention uses the formula
  • the present invention relates to a novel substance BE-13793C or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a process for producing the same, a use thereof, and a novel microorganism belonging to the genus Streptococci bacterium which produces the novel substance.
  • Solubility Insoluble in water, soluble in methanol, easily soluble in organic solvents such as tetrahydrofuran or dimethylsulfoxide-Acidic, neutral and basic: acidic Rf value: 0.45 (Merck, Kieselgel 60F 2S4 used,
  • the in vitro antitumor effect test on P388 tumor cells was performed by first dissolving the test compound in dimethyl sulfoxide, and then serially diluting it with a cell culture medium containing 20% dimethyl sulfoxide (20% DMS0-RPMI-1640 medium). each solution 2 ⁇ a that was added to 2 X10 4 or 3 X10 4 tumor cells for cell culture containing medium (calf serum 10% RPMI-1640 medium containing) 200 ⁇ .
  • P388 / S is a kind of normal mouse leukemia cells
  • P388 / V cells are ⁇ 388 leukemia cells that have acquired resistance to the antitumor substance pinklistin.
  • BE-13793C also exhibited a growth inhibitory effect on 388 / ⁇ cells, which had acquired resistance to the antitumor agent adoriamycin, and its 50% growth inhibitory concentration (I.) was 1.0 ⁇ . .
  • the compound of the invention designated BE-13793C, showed an antitumor effect against Ehrlich tumors (ascites type) implanted in mice. And have you to the test you administered 10 6 per mouse tumor cells (a lethal dose) intraperitoneally. Test compounds were diluted to three concentrations and administered intraperitoneally. Table 1 summarizes the above test results.
  • Tumor inoculation volume 10 s E. coli ascites carcinoma cells, intraperitoneal
  • the present invention is directed to the treatment of tumors in warm-blooded mammals, such as leukemia, or solid tumors such as the bladder, lung or colon Useful as an agent.
  • the compound of the present invention When used as an antitumor agent, it is used as a pharmaceutical composition comprising an effective amount of the compound of the present invention alone or an effective amount of the compound of the present invention and an inert and pharmaceutically acceptable carrier.
  • This pharmaceutical composition is produced by combining the compound of the present invention and an inert pharmaceutical carrier, and is orally, parenterally or topically administered in various formulations.
  • suitable compositions include solid compositions for oral administration such as tablets, capsules, pills, powders, granules and the like, solutions and liquid compositions for oral administration such as suspensions and emulsions. It can also be manufactured in the form of a sterile composition which can be dissolved in sterile water, physiological saline or other sterile injectable solvent immediately before use.
  • the content of the compound of the present invention in the pharmaceutical composition is preferably 10 to 100% W / W.
  • the pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention include, for example, salts with inorganic or organic bases such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium hydrogen carbonate, triethylamine or 2-aminoethanol. .
  • the actual preferred dosage of the compounds of the present invention will vary depending on the type of compound used, the type of composition formulated, the frequency of application and the particular site to be treated, the host and the tumor.
  • the daily dose per adult per day is 10 to 500 mg for oral administration and 10 to 100 mg per day for parenteral administration, preferably intravenous injection.
  • the microorganism used for the production of BE-13793C of the present invention or a mutant thereof may be any microorganism that produces BE-13793C.
  • microorganisms having the following mycological properties can be used. .
  • this strain forms well-developed aerial hyphae, and at regular intervals, a ring-shaped branch, and further forms 5 to 10 secondary branches, each of which has 5 to 10 tips. It is a spore chain.
  • the spores are cylindrical with a size of 0.5 X 1 to 1.510, and the surface is smooth.
  • Table 2 shows the properties of various agar plate cultures after 28 and 14 days of culture. -, ''
  • this strain was classified into the genus Actinomycetes Streptovertis seriatum, and it was classified as Bergey's Manual of Determinative Pacteriology, Eighth Edition, 1974 (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th). According to literature search such as the Actinomycetes and the Experimental Methods for Identification of Actinomycetes (edited by the Japanese Society of Actinomycetes), species that are closely related to Streptovertici ilium mobara-ense It is listed as.
  • the strains differ in the availability of roughinose and sucrose, and in terms of the color of the mycelium in the culture properties on the agar medium, etc., the green color of Streptococcus cerevisiae series Symbiosis mobaraens is based. However, this strain is different. Therefore, this strain is Streptoverticillium sp.BA-13793 (Streptoverticillium sp. Called.
  • the strain was deposited with the Research Institute of Microbial Industry and Technology of the Ministry of International Trade and Industry on January 20, 1989, and its deposit number is No. 10489 (FERM P- 10489). It was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on March 1, 1990, and its accession number is FERM BP-2785.
  • the mutant strain of the microorganism that produces BE-13793C of the present invention may be subjected to irradiation treatment with, for example, X-rays or ultraviolet rays, for example, nitrology: ⁇ : mustard, azaserine, nitrite, 2-aminopurine.
  • a mutagenic agent such as N-methyl- ⁇ '-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), phage contact, transformation, transduction or conjugation, etc.
  • NTG N-methyl- ⁇ '-nitro-N-nitrosoguanidine
  • a culture containing BE-13793C is obtained by inoculating a BE-13793C-producing strain BA-13793 strain into a nutrient-containing medium and growing aerobically.
  • a nutrient source a known nutrient source for actinomycetes can be used.
  • a carbon source commercially available glucose, glycerin, maltose, starch, sucrose, molasses, dextrin or the like is used alone or as a mixture.
  • Nitrogen sources include commercially available soy flour, corn 'gluten' meal, corn steep liquor, meat extract, yeast extract, cottonseed flour, nectar, wheat germ, fish meal, inorganic ammonium salt or Sodium nitrate or the like is used alone or as a mixture.
  • Commercially available inorganic salts include calcium carbonate, sodium chloride, potassium chloride, and sulfuric acid. Magnesium, phosphates, etc. can be used alone or as a mixture-if necessary, trace amounts of heavy metal salts such as iron, copper, cobalt, molybdenum, manganese or zinc can also be added.
  • any one can be used as long as it is used by the producing bacteria and is useful for the production of BE-13793C.
  • boron compounds and 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid can be used. Is mentioned.
  • the culture method may be the same as the general method for producing biological metabolites, and may be solid culture or liquid culture.
  • any of static culture, stirring culture, shaking culture, and aeration culture may be performed, but shaking culture or deep aeration stirring culture is particularly preferable.
  • the culture temperature is suitably from 20 ° to 37 ° C, preferably from 25 ° C to 30 ° C.
  • the pH of the preferred medium ranges from 4 to 8, and the culture time is from 24 hours to 192 hours, preferably from 48 hours to 120 hours.
  • a separation method usually used to collect the metabolite produced by the microorganism from the culture is appropriately used. Since BE-13793C is present in the culture filtrate and in the bacterial cells, the usual separation means from the culture filtrate or the bacterial cells, such as the solvent extraction method, the ion-exchange resin method, the adsorption or partition chromatography method, and the gel filtration method, etc.
  • the purification can be carried out singly or in combination. High-performance liquid chromatography and thin-layer chromatography are also used for extraction and purification. Available.
  • Preferred examples of separation-purification include the following methods. First, the culture solution is centrifuged to obtain bacterial cells. The obtained cells are extracted using an organic solvent such as methanol or acetone. The extract is concentrated under reduced pressure, and the concentrated solution is extracted with an organic solvent such as ethyl acetate. By concentrating this extract, a crude substance containing BE-13793C is obtained. Next, BE-13793C can be obtained as a yellow-orange crystalline substance by purifying it by column chromatography such as Sephdex LH-20. Next, the present invention will be described specifically with reference to examples.
  • the present invention is not limited to the examples, and the modification means of the examples, as well as the BE-13793C using known means based on the properties of BE-13793C revealed by the present invention, are used. Includes all methods for producing, concentrating, extracting, and purifying corn.
  • Actinomycetes BA-13793 strain cultured on a slope agar medium was prepared using glucose 0.1%, dextrin 2.0%, gluten meal 1.0%, fish meal 0.5%, yeast extract 0.1%, sodium chloride 0.1%, magnesium sulfate 0.05%, 0.05% calcium chloride, 0.0002% ferrous sulfate, 0.00004% cupric chloride, 0.00004% manganese chloride, 0.00004% cobalt chloride, 0.00008% zinc sulfate, 0.00008% sodium borate, 0.00024% ammonium molybdate, and 3- (N-morpholino) Inoculate 4 500ml Erlenmeyer flasks containing 100ml of medium (pH 6.7) containing 0.5% propanesulfonic acid (0.5%), and rotate on a rotary shaker (180 rpm) at 8 ° C for 72 hours ).
  • This culture 1 ml each of the solution was inoculated into 50 500 ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of the above medium, and cultured at 28 ° C for 120 hours on a rotary shaker (180 rotations per minute).
  • approximately 5 was filtered by a filtration method, and the obtained cells were washed with 500 mfi of deionized water, and then 2.5 £ of methanol was added to the cells and stirred at room temperature for 1 hour.
  • a methanol extract was obtained by a filtration method. The methanol extraction was performed once more, and the resulting methanol extract 5 ⁇ was concentrated to about 1.
  • the obtained concentrate was extracted with ethyl acetate 3 ⁇ , and the ethyl acetate extract was concentrated to dryness.
  • the residue obtained was washed with the addition of black form 500 and 720 mg of a crude substance containing BE-13793C was obtained.
  • an orange precipitate was obtained. This was filtered off to give a material containing 546 mg of BE-13793C.
  • Dissolve in a mixed solvent of methanol and tetrahydrofuran (1: 1) apply to column chromatography on Sephadex LH-20 (1.5 x 120 cm, manufactured by Pharmacia), and develop with methanol-tetrahydrofuran (1: 1).
  • BE-13793C fraction was obtained and concentrated to obtain 99 mg of BE-13793C as a yellow-orange crystalline substance.
  • BE-13793C described in the present invention has a growth inhibitory effect on tumor cells that have a toxicity to existing antitumor agents as well as cells that have not acquired resistance to the antitumor agents. It is useful as a therapeutic agent for tumors of warm-blooded mammals including humans.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

• 明 細 書 抗腫瘍性物質 BE-13793C 技術分野
本発明は医薬の分野で有用であリ、 さらに詳細には腫瘍細胞の増 殖を阻害し、 抗腫瘍作用を発揮する新規化合物、 その製法及びその 用途並びに該新規物質を産生する新規なストレブトバ一ティシリゥ ム（Streptovertici I l ium)属に属する微生物に関するものである。 背景技術
癌化学療法の分野においては、 ブレオマイシン（Bleomycin )及び ァドリアマイシン（Adriamycin )等の多くの微生物代謝産物を臨床的 に応用することが試みられ、 また、 これらは実際に臨床において使 用されている。 しかしながら、 様々な種類の腫瘍に対してその効果 は必ずしも充分ではなく、 また臨床上これらの薬剤に対する腫瘍細 胞の耐性現象が明らかにされるにつれ、 その臨床的応用性は複雑化 している〔第 47回日本癌学会総会記事、 12頁〜 15頁（1988年）参照〕。 このような状況においては、 常に新規抗腫瘍性物質の開発が臨床 上求められている。 即ち、 既存の抗腫瘍性物質に対する耐性を克服 する目的であり、 また既存の抗腫瘍性物貧が充分に効果を発揮でき ない種類の腫瘍に対して有効性を示す物質が求められている。
本発明者らは、 抗腫瘍性物質について微生物代謝産物を広くスク リーニングした結果、 後記の新規物質が優れた抗腫瘍作用を示すこ とを見い出して本発明を完成した 発明の開示
本発明は式
Figure imgf000004_0001
で表される新規物質 BE - 13793C又はその医薬として許容しうる塩、 その製造法及びその用途並びに該新規物質を産生する新規なストレ プトバ一テイシリゥム属に属する微生物に関するものである。
以下に、 本発明に係わる新規物質 BE-13793Cについて理化学的な 性状を示す。
BE-13793Cの理化学的性状
性状 ： 黄橙色アモルファス状固体若しくは結晶
分子式 ： C^ Hn Ns O
元素分析値 ： 理論値 炭素 67. 23 %、 水素 3. 10 %
実測値 炭素 67. 21 %、 水素 3. 12 % 融点 ： 295 °Cまで明瞭な分解点（融点）を示さない。
溶解性 ： 水に溶けにく く、 メタノールに可溶、 テトラヒ ドロフラ ン又はジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に易溶- 酸性、 中性、 塩基性の区別 ： 酸性 Rf値 ： 0.45(メルク社製、 キーゼルゲル 60F2S4使用，
展開溶媒； クロ口ホルム/メタノール（5:1)) 呈色反応 ： 過マンガン酸カリウム反応 陽性
マススぺク トル（FAB-MS) (m/z) ： 357 [ ] +
UVスぺク トル（ λ^， ηπι) ： 245, 298, 307, 327, 400
IRスペク トル（ V翳） ： 3430， 3270, 1743， 1710, 1590, 1485，
1408， 1335, 1290, 1245， 1060, 815, 800, 765
'Η - NMRスペク トル（DMS0-de， δ ppm) ：
6.98(2H, br d， J=7.6Hz), 7.13(2H, t, J=7.6Hz), 8.42 (2H, br d， J=7.6Hz), 10.19(2H, br s)， 10.87(1H, br s)， 11.57(2H, br s)
13C-NMRスペク トル（DMS0-d8， δ ppm) ：
110.9(d), 115.2(d), 115.5(s), 119.7(s)， 120.6(s) , 123.0(s), 128.7(s), 130.0(s), 143.3(s), 171.2(s)
BE-13793Cの生物学的活性
'¾発明の BE- 13793Cのマウス実験腫瘍細胞に対する増殖阻止作用 を決定するため、 in vitroで試験を行った。 P388腫瘍細胞に対する in vitroの抗腫瘍作用試験は、 試験化合物をまずジメチルスルホキ シドに溶解したのち、 20%にジメチルスルホキシドを含む細胞培養 用培地（20%DMS0-RPMI-1640培地）で逐次希釈した各溶液 2 ^を、 2 X104又は 3 X104個の腫瘍細胞を含む細胞培養用培地（仔牛血清 10 %含有 RPMI-1640培地） 200 ^に加えた。 得られた溶液を 37°Cで 72時 間、 5 %C02下で培養したのち、 コ一ルターカウンタ一にて生存す る細胞数をカウントし、 対照群と比較した。 その結果、 BE-13793C は P388腫瘍細胞に対し、 強い増殖阻止作用を示し、 その腫瘍細胞の 増殖を 50%阻止する濃度（I 。）は P388/S細胞に対して 0.7μΚであり、 P_388/V細胞に対しては 0.7 Μであった。
ここにおいて P388/Sは通常のマウス白血病細胞の一種であリ、 P388/V細胞は抗腫瘍性物質ピンクリスチンに対して耐性を獲得した Ρ388白血病細胞である。
更に、 BE-13793Cは抗腫瘙性物質ァドリァマイシンに対して耐性 を獲得した Ρ388/Α細胞に対しても増殖阻止効果を示し、 その 50%増 殖阻害濃度（I 。）は 1.0 Μであった。
BE - 13793Cと称される本発明の化合物は、 マウスに移植したエー ルリッヒ腫瘍（腹水型）に対して抗腫瘍効果を示した。 上記試験にお いてマウス一匹あたり 106個（致死量）の腫瘍細胞を腹腔内に投与す る。 試験化合物を三段階の濃度に希釈し、 腹腔内投与した。 上記試 験結果を第 1表にまとめた。
(以下余白）
BE-13793Cのエールリッヒ腹水癌1 ' 2に対する効果
Figure imgf000007_0001
(第 1表の脚注）
1 . 腫瘍接種量 ： 10s個エールリ ヅヒ腹水癌細胞、 腹腔内
2 . 宿 主 ： I CR雌性マウス
3 . 治療スケジュール ： BE-13793Cを腹腔内へ腫瘍接種後第 1 日目
'より 10日目まで 1 日 1回の連続投与
4 . MST： 生存中央期間 （日）
5 . % T/C： (治療- MST/対照- MST) X 100
6 . 基 準 ： ％ T/ 125の場合に、 試験化合物は、 その投与量で顕 著な抗腫瘍効果を示すものと判定した。
BE - 13793Cのマウス（ICI？、 雌性マウス）に対する急性毒性は 1回の
BE-13793C lOOmg/kgの腹腔内投与において投与後 5日目における死 亡例は見られなかった。
上述したように、 本発明の BE- 13793Cは、 マウス実験癌細胞に対 し、 顕著な増殖阻止作用を示す。 従って、 本発明は温血哺乳動物の 腫瘍、 例えば白血病、 又は冒、 肺若しくは結腸等の固形腫瘍の治療 剤として有用である。
本発明化合物を抗腫瘍剤として使培する場合、 有効量の本発明化 合物単独又は有効量の本発明化合物及び不活性且つ薬学的に許容し うる担体から成る医薬組成物として使用される。
この医薬組成物は、 本発明の化合物と不活性.な薬学的担体とを組 み合わせて製造され、 各種の処方で経口的、 非経口的若しくは局所 的に投与される。 適切な組成物の例としては、 錠剤、 カプセル、 丸 剤、 粉末、 顆粒等の経口投与用の固形組成物、 溶液、 サスペンジョ ン、 ェマルジヨンのような経口投与用の液体組成物を包含する。 ま た、 使用直前に滅菌水、 生理的食塩水若しくは他の注射用滅菌溶剤 に溶解しうる滅菌組成物の形で製造することもできる。
なお、 該医薬組成物中での本発明化合物の含量は、 好ましくは 10 〜100% W/Wである。
本発明化合物の薬学的に許容しうる塩としては、 例えば水酸化ナ トリウム、 水酸化カリウム、 炭酸水素ナトリウム、 トリェチルアミ ン又は 2-アミ ノエタノール等の無機又は有機の塩基との塩が挙げら れる。
本発明の化合物の実際に好ましい投与量は、 使用される化合物の 種類、 配合きれた組成物の種類、 適用頻度及び治療すべき特定部位、 宿主及び腫瘍によって変化することに注意すべきである。 一日当り の成人一人当りの投与量は、 経口投与の場合、 10ないし 500mgであ リ、 非経口投与、 好ましくは静脈内注射の場合、 1 日当り 10ないし lOOmgである。 なお、 投与回数は投与方法及び症状により異なるが、 1回ないし δ回である = .
BE- 13793Cの製造法について説明する。
本発明の BE- 13793Cの製造に使用する微生物又はその変異株は、 BE - 13793Cを産生するものならばいずれでも良いが、 例えば以下の .菌学的性状を有する微生物を拳げることができる。
1 . 形 態
本菌株は、 顕微鏡下で、 よく発達した気菌糸よリほぽ一定間隔の 輪生枝が形成され、 さらに 5〜 &本の二次分枝を形成し、 それらの 先端が 5〜 10ケの直状の胞子鎖となっている。
胞子の大きさが 0.5 X 1〜1 .5 10位の円筒状で、 その表面は平滑 である。
胞子のう、 鞭毛雎子、 菌核等の特殊な器官及び菌糸の分断は観察 されない。
2 . 培養性状
各種寒天平板培地における 28 、 14日間培養時の性状を第 2表に 示す。 -，''
(以下余白）
第 2 表 培 地 生 育 気（中）菌糸 基生菌糸の色 可溶性色素 イース ト ·麦芽 非常に良好 形成不良， 綿状 明るい茶 な し 寒天培地（ISP - 2) 平 坦 白 色
ォ—トミ—ル 非常に良好 形成不良， 綿状 な し 寒天培地（ISP - 3) 平 坦 白 色
スターチ ·無機塩 非常に良好 形成良好， 綿状. うす黄味橙 な し 寒天培地（ISP - 4) 平 坦 灰白色
グリセリン ·ァスパラギン 非常に良好 形成良好， 粉状 黄 橙 な し 寒天培地（ISP - 5) 隆起状 黄味白色
ペプトン，イースト ·鉄 非常に良好 形成良好， 粉状 うす茶 な し 寒天培地（ISP-6) しわ状 灰白色
チロシン 非常に良好 形成良好， 粉状 明るい茶 な し 寒天培地（ISP - 7) 隆起状 黄味 β色
栄養 非常に良好 形成良好， 粉状 うす黄味茶 な し 寒天培地 平 坦 白 色
シュクロース ·硝酸塩 不 良 形成僅少 無 色 な し 寒天培地
グルコース■ァスパラギン 不 良 形成僅少 黄 橙 な し 寒天培地
. 生育温度（イースト ·麦芽寒天培地、 14日間培養）
ire ：生育は不良で気菌糸を形成せず
2Q'C ：生育は不良で気菌糸を形成せず .
28°C ：生育及び気菌糸形成は良好
37°C ：生育は良好で気菌糸形成は不良
45'C ：生育せず
. 生理学的諸性質 '
(1)ゼラチンの液化 陰性
(グルコース ·ペプトン ·ゼラチン培地）
(2)スターチの加水分解 陽性
(スターチ ·無機塩寒天培地）
(3)脱脂牛乳の凝固及びぺプトン化 陰性
(スキムミルク培地）
(4)メラニン様色素の生成 陰性
(5)食塩耐性 食塩含有量 4 %以下で生育
(イースト ，麦芽寒天培地）
： 炭素源の利用能
プリ ドハム ·ゴドリーブ寒天を基礎培地として、 下記の各種糖を添加して,°C、 14日間培養した。 その結果を第 3表に示す。 第 3表
D-グルコース 十
D-キシロース ―
L -ァラビ Jース 十
L-ラムノース 土
D -フラク トース 十 + ：利用する
D-ガラク トース 十- 土 ：利用は疑わしい
ラフィ Jース 十 一：利用しない
D-マンニト一ル
イノシトール +
サリシン
シュクロース
6 . 細胞壁のアミ ノ酸
LL-ジアミノビメリン酸及びグリシンが検出された。
以上の菌学的性状により、 本菌株は放線菌ストレブトバーティシ リゥム属に分類され、 バージーズ ' マニュアル ' ォブ ' デターミナ ティブ ' パクテリォロジ一第 8版、 1974年（Bergey' s Manual of Determinative Bacteriology 8th Edition , 1974)及び放線菌の同 定実験法（日本放線菌学会編）などの文献検索によると、 ストレプト ノ 一ティ シ U ゥム · モノ ラエンス ( Streptovertici Il ium mobara- ense)が近縁な種として挙げられる。 しかし、 本菌株とはラフイ ノ —ス、 シュクロースの利用能が異なり、 また寒天培地上での培養性 状における菌糸の色調などの点では、 ストレブトバ一テイ シリゥム モバラエンスは緑色が基調になっており、 本菌株とは異なる。 従つ て、 新規な微生物であることから、 本菌株をス トレプトバーティ シ リ ウム · エスピー BA-13793(Streptovertici l l iuni sp . BA-13793) と称する。
なお、 本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平 成元年 1月 20日に寄託されており、 その微ェ研受託番号は微ェ研菌 寄第 10489号（FERM P-10489 )である。 ついで、 平成 2年 3月 1 日に ブダぺス ト条約に基.づく国際寄託に移管され、 その受託番号は微ェ 研条寄第 2785号（FERM BP-2785 )である。
本発明の BE- 13793Cを産生する微生物の変異株は、 例えば X線若し くは紫外線等の照射処理、 例えばナイ トロジ： ^：ン · マスター ド、 ァ ザセリン、 亜硝酸、 2-ァミ ノプリン若し は N-メチル -Ν' -ニトロ- N -ニトロソグァ二ジン（NTG )等の変異誘起剤による処理、 ファージ接 触、 形質転換、 形質導入又は接合等の通常用いられる菌種変換処理 方法によリ BE- 13793C産生菌を変異させた微生物である。
本発明の BE-13793Cを製造するにあたり、 BE-13793Cの生産菌株 BA - 13793株を栄養源含有培地に接種して好気的に発育させることによ リ、 BE-13793Cを含む培養物が得られる。 栄養源としては、 放線菌 の栄養源として公知のものが使用できる。 例えば、 炭素源としては、 市販されている、 ブドウ糖、 グリセリン、 麦芽糖、 デンプン、 庶糖、 糖蜜又はデキストリンなどが単独又は混合物として用いられる。 窒 素源としては、 市販されている、 大豆粉、 コーン ' グルテン ' ミー ル、 コーンスティ一プリカ一、 肉エキス、 酵母エキス、 綿実粉、 ぺ プトン、 小麦胚 、 魚粉、 .無機アンモニゥム塩又は硝酸ナトリウム などが単独又は混合物として用いられる。 無機塩としては、 市販さ れている、 炭酸カルシウム、 塩化ナトリウム、 塩化カリ ウム、 硫酸 マグネシウム、 リン酸塩などを単独又は混合物として使用すること ができる- その他必要に応じて、 鉄、 銅、 コバルト、 モリブデン、 マンガン又は亜鉛などの重金属塩を微量添加することもできる。 ま た、 発泡の著しい時には、 消泡剤として、 例えば大豆油又は亜麻仁 油等の植物油、 ォクタデカノ一ル等の高級アルコール類、 各種シリ コン化合物等を適宜添加しても良い。 これらのもの以外でも、 該生 産菌が利用し、 BE-13793Cの生産に役立つものであれば、 いずれも 使用することができ、 例えば、 ホウ素化合物及び 3- ( N-モルホリノ） プロパンスルホン酸等が挙げられる。
培養方法としては、 一般の徵生物代謝産物の生産方法と同様に行 えばよく、 固体培養でも液体培養でもよい。 液体培養の場合は、 静 置培養、 撹拌培養、 振盪培養又は通気培養などのいずれを実施して もよいが、 特に振盪培養又は深部通気撹拌培養が好ましい。 培養温 度は 20° 〜 37 °Cが適当であるが、 25 °C〜30°Cが好ましい。 好ましい 培地の pHは 4〜 8の範囲で、 培養時間は 24時間〜 192時間、 好まし くは 48時間〜 120時間である。
培養物から目的とする BE-13793Cを採取するには、 微生物の生産 する代謝物の培養物から採取するのに通常使用される分離手段が適 宜利用される。 BE-13793Cは培養濾液中及ぴ菌体中に存在するので、 培養濾液又は菌体より通常の分離手段、 例えば溶媒抽出法、 イオン 交換樹脂法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィ一法及びゲル濾 適法等を単独又は組合せて行うことによリ精製できる。 また高速液 体クロマトグラフィーや薄層クロマトグラフィ一なども抽出精製に 利用可能である。
好ましい分離一精製の例としては次の方法が挙げられる。 まず培 養液を遠心分離し、 菌体を得る。 得られ 菌体をメタノール又はァ セ トン等の有機溶媒を用いて抽出する。 抽出物を減圧下に濃縮し、 癉縮液を酢酸ェチルなどの有機溶媒で抽出する。 この抽出液を濃縮 することにより、 BE-13793Cを含む粗物質が得られる。 次に、 セフ アデックス LH- 20などのカラムク口マトグラフィ一を行って精製す れば、 BE - 13793Cを黄橙色の結晶状物質として得ることができる。 • 次に実施例を挙げ、 本発明を具体的に説明する。 しかしながら、 本発明は実施例に限定されるものではなく、 実施例の修飾手段はも ちろん、 本発明によって明らかにされた BE- 13793Cの性状に基づい て、 公知の手段を用いて BE-13793Cを生産、 濃縮、 抽出、 精製する 方法すベてを包括する。
実施例
斜面寒天培地に培養した放線菌 BA-13793株をグルコース 0.1%、 デキストリン 2.0%、 コ一シ'グルテンミール 1.0%、 魚粉 0.5%、 酵 母エキス 0.1%、 塩化ナトリウム 0.1%、 硫酸マグネシウム 0.05%、 塩化カルシウム 0.05%、 硫酸第一鉄 0.0002%、 塩化第二銅 0.00004 %、 塩化マンガン 0.00004%、 塩化コバルト 0.00004%、 硫酸亜鉛 0.00008%, ホウ酸ナトリウム 0.00008%、 モリブデン酸アンモニゥ ム 0.00024%、 及び 3-(N -モルホリ ノ）プロパンスルホン酸 0.5%から なる培地（pH6.7)100m£を含む 500m£容の三角フラスコ 4本に接種し、 8°Cで 72時間、 回転振盪機（毎分 180回転）上で培養した。 この培養 液を 1 m£ずつ、 上記の培地 100m£を含む 500m£容の三角フラスコ 50本 に接種し、 28 °Cで 120時間、 回転振盪機（毎分 180回転）上で培養した-„ 培養液（約 5 を濾過法によって濾過し、 得られた菌体を脱イオン 水 500mfiで洗浄し 後、 菌体にメタノール 2 .5 £を加え室温で 1時間 撹拌した。 濾過法によってメタノール抽出液を得た。 メタノール抽 出をもう一度行い、 得られたメタノール抽出液 5 βを約 こま で濃縮した。 得られた濃縮液を酢酸ェチル 3 βを用いて抽出し、 酢 酸ェチル抽岀液を濃縮乾固した。 得られた残渣にクロ口ホルム 500 を加えて洗浄すると、 BE- 13793Cを含む粗物質 720mgが得られた。 この粗物質をメタノール 2 βに溶解して濃縮していくと橙色の沈殿 が生ずるので、 これを濾取し、 BE-13793C 546mgを含む物質を得た。 この物質をメタノールーテトラヒ ドロフラン（1 : 1 )の混合溶媒に溶 解し、 セフアデヅクス LH-20 ( 1 . 5 X 120cm、 フアルマシア社製）の力 ラムクロマトグラフィーにかけ、 メタノール一テトラヒ ドロフラン ( 1 : 1 )で展開し、 BE- 13793C画分を得て濃縮することにより、 BE - 13793C 99mgを黄橙色結晶状物質として得た。 産業上の利用可能性
本発明に記載する BE-13793Cは、 既存の抗腫瘍剤に ¾性を有する 腫瘍細胞に対しても該抗腫瘍剤に耐性を獲得していない細胞と同程 度の増殖阻止効果を有することから、 人を含む温血哺乳動物の腫瘍 の治療剤として有用である。

Claims

嘈求の範囲
(1)式
Figure imgf000017_0001
で表される BE- 13793C又はその医薬として許容しうる塩,
(2)式
Figure imgf000017_0002
で表される BE-13793C又はその医薬として許容しうる塩を有効成分 とする抗腫瘍剤。
(3)式 で表される BE- 13793C又はその医薬として許容しうる塩の製造にお いて、 BE-13793Cを産生する微生物又はその変異株を培養して BE - 13793Cを蓄積させ、 採取することを特徴とする製法。
(4)ストレプトバーテイシリゥム · エスピー BA- 13793(Strepto- verticilliuin sp. BA-13793)株又はその変異株を培養することを特 徴とする第 3請求項記載の製法。
(5) BE-13793Cを産生する能力を有するストレブトバーテイシリゥム (Streptoverticillium)に属する微生物又はその変異株。
(6)ストレプトバーテイシリゥム · エスピー（Streptoverticillium sp.) BA-13793株又はその変異株であることを特徴とする第 5請求 項記載の微生物。
(以下余白）
PCT/JP1990/000812 1989-03-23 1990-06-20 Antitumor substance be-13793c WO1991019716A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019920700375A KR0163202B1 (ko) 1989-03-23 1990-06-20 항종양성 물질 be-13793c
NO920614A NO300812B1 (no) 1989-03-23 1992-02-17 Fremgangsmåte for fremstilling av antitumorsubstans BE-13793C, samt biologisk ren kultur istand til å frembringe denne

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7114989 1989-03-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1991019716A1 true WO1991019716A1 (en) 1991-12-26

Family

ID=13452261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1990/000812 WO1991019716A1 (en) 1989-03-23 1990-06-20 Antitumor substance be-13793c

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5106864A (ja)
EP (1) EP0388956B1 (ja)
JP (1) JP3010675B2 (ja)
KR (1) KR0163202B1 (ja)
AT (1) ATE110727T1 (ja)
AU (1) AU634247B2 (ja)
CA (1) CA2012955C (ja)
DE (1) DE69011913T2 (ja)
DK (1) DK0388956T3 (ja)
ES (1) ES2063186T3 (ja)
HU (1) HU210868A9 (ja)
NO (1) NO300812B1 (ja)
WO (1) WO1991019716A1 (ja)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE158298T1 (de) * 1990-05-11 1997-10-15 Banyu Pharma Co Ltd Be-13793c-derivat mit antitumorwirkung
US5478813A (en) * 1990-05-11 1995-12-26 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Antitumor substance BE-13793C derivatives
US5589365A (en) * 1991-11-29 1996-12-31 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Process for producing glycosylated indolopyrrolocarbazole derivatives by culturing certain microorganisms
US5591842A (en) * 1991-11-29 1997-01-07 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Indolopyrrolocarbazole derivatives
US5668271A (en) * 1991-11-29 1997-09-16 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Indolopyrrolocarbazole derivatives
EP0630242B1 (en) * 1992-03-20 1999-01-20 The Wellcome Foundation Limited Further indole derivatives with antiviral activity
DE4217964A1 (de) * 1992-05-30 1993-12-02 Goedecke Ag Indolocarbazol-Imide und deren Verwendung
DE4243321A1 (de) * 1992-12-21 1994-06-23 Goedecke Ag Aminosäurederivate von Heterocyclen als PKC-Inhibitoren
US5804564A (en) * 1994-05-09 1998-09-08 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Antitumor indolopyrrolocarbazole derivatives
US5922860A (en) * 1994-05-09 1999-07-13 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Antitumor indolopyrrolocarbazole derivatives
EP0769555B1 (en) * 1994-06-13 2003-09-03 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Gene coding for glycosyltransferase and use thereof
US5808060A (en) * 1995-12-11 1998-09-15 Cephalon, Inc. Fused isoindolones
AU2260897A (en) * 1996-02-07 1997-08-28 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Effective production method of be-13793c
GB9811624D0 (en) * 1998-05-29 1998-07-29 Merck Sharp & Dohme Therapeutic use
US6703373B1 (en) 1999-09-10 2004-03-09 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Indolopyrrolocarbazole derivatives and antitumor agents
FR2845996A1 (fr) * 2002-10-16 2004-04-23 Servier Lab Nouveaux derives de[3,4-a:3,4-c]carbazole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
DE102006038635B4 (de) * 2006-08-19 2010-04-15 Josip Marinic Magnettonabnehmer für ein Saiteninstrument
US10053660B2 (en) 2016-07-12 2018-08-21 California Institute Of Technology Substrates for high-density cell growth and metabolite exchange

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63295589A (ja) * 1987-01-22 1988-12-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 生理活性物質ｋ−２５２の誘導体

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3803620A1 (de) * 1988-02-06 1989-08-17 Goedecke Ag Indolocarbazol-derivate, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63295589A (ja) * 1987-01-22 1988-12-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 生理活性物質ｋ−２５２の誘導体

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOCHEMISTRY, Vol. 29, No. 1, (1990), WAKAMATSU K. et al., "Complex Formation of Peptide Antibiotic RO-09-0198 with Lysophosphatidylethanolamine Proton NMR Analyses in DMSO Solution", pages 113-118. *

Also Published As

Publication number Publication date
DE69011913D1 (de) 1994-10-06
ES2063186T3 (es) 1995-01-01
EP0388956A2 (en) 1990-09-26
KR920703597A (ko) 1992-12-18
CA2012955C (en) 2001-08-21
EP0388956B1 (en) 1994-08-31
JPH0320277A (ja) 1991-01-29
US5290698A (en) 1994-03-01
JP3010675B2 (ja) 2000-02-21
NO300812B1 (no) 1997-07-28
NO920614L (no) 1992-03-24
AU5835190A (en) 1992-01-07
ATE110727T1 (de) 1994-09-15
KR0163202B1 (ko) 1998-12-01
HU210868A9 (en) 1995-08-28
US5106864A (en) 1992-04-21
AU634247B2 (en) 1993-02-18
NO920614D0 (no) 1992-02-17
EP0388956A3 (en) 1991-10-02
CA2012955A1 (en) 1990-09-23
DK0388956T3 (da) 1994-11-14
DE69011913T2 (de) 1995-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3010675B2 (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ―１３７９３ｃ
EP0106341B1 (en) Physiologically active substance p-23924, its production and use
US5217885A (en) Antitumor substance BE-13793C
KR0177585B1 (ko) 항종양성 물질 b e-13793c-생성 균주
EP0399444B1 (en) New carcinostatic or antitumor antibiotic, conagenin, and production and uses thereof
JP2803182B2 (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ―１２２３３
JPH0341069A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ―１３７９３類
JPH041179A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ―１４１０６
JPH10147594A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−４３５４７類
JP2803178B2 (ja) 抗腫瘍性物質 ｂｅ―１６４９３
JPH0446194A (ja) Ｗｓ１２７９ａ物質、その生産法及び用途
JPH1121263A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−４５９８５類
JPH06256338A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−３４７７６
HU212160B (en) Process for producing antitumour compound be-13793c
JPH04316492A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−２３２５４及びその製造法
EP0381138A2 (en) Antitumor substance BE-12406
JPH06228185A (ja) Ｄ３２９物質とその誘導体，その製造法及び用途
JPH08198874A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−４８０２１
JPH0987284A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−４２３０３類
JPH0725893A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−１３７９３ｘ及びｂｅ−１３７９３ｘａ
JPH11349522A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−６９７８５ａ及びその製造法
JPH09208575A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ−５２４４０類及びその製造法
JPH03197481A (ja) 抗腫瘍性物質ｂｅ―１０９８８
JP2001261668A (ja) 抗腫瘍性物質ｊ−１２４１３１及びその製造法
JPH02218676A (ja) エストロゲン物質ｂｅ―１４３４８ｂ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU HU KR NO

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019980703857

Country of ref document: KR