WO1988008982A1

WO1988008982A1 - Method for immunoassay utilizing liposome and kit therefor

Info

Publication number: WO1988008982A1
Application number: PCT/JP1988/000435
Authority: WO
Inventors: Kenji Hosoda; Hideaki Suzuki; Tatsuji Yasuda
Original assignee: Teijin Limited
Priority date: 1987-05-06
Filing date: 1988-04-28
Publication date: 1988-11-17
Also published as: EP0313666A1; EP0313666B1; EP0313666A4; US5173406A; DE3880429T2; DE3880429D1

Description

ο 細リポゾーム免疫定法及びそのためのキット技術分野

本発明は、リボゾーム免疫測定法及びそのためのキット閿する。明

背;！技術

近年、医^分野においては、病気の診断等を行うために、抗原一抗体反応を利用した免疫涎定法がよく利用されている, 従来の免疫測定法は、大きくわけて、不均一測定法と均一測定法に分けられるが、疾患に閲する適格、簡便な診断の重要性は益々増して来ており、洗浄操作の不要な均一測定法が相丄 3 対的に重要度を増している。しかしながら、. 均一測定法は、測定感度の点で不十分なものが多い。

そこで、最近、感度を改善することを目的とした種々のリポゾ一ム免疫測定法が提案されている。これらの測定法においては、測定対象である抗原と、該測定対象抗原に対する抗体とマーカ一を封入したリポゾームとを連結して成るリポゾーム結合^体とを反応せしめることにより抗原一抗体^合体を形成せしめ、前記リポゾームからマ一力一を補体依存的に放出しめ、放出された^ ^を^定することにより測定対象 ί几 l ¾：■ OVi ί!ーる。

この铉なリポゾ一ム免疫測定法の 1つの態様として、測定対象抗原、該測定対象抗原に対する第一の抗体と標識を封入したリボゾームとを連結して成るリボゾーム結合抗体、及び該測定対象抗原に対する第二の抗体の三者を反応せしめることにより抗原一抗体三元複合体を形成せしめ、これに補体を作用せしめることにより複合体となったリポゾーム中の標識を放出せしめ、そして放出された標識を測定することにより測定対象抗原を測定する方法がある。この態様のリボゾーム免疫測定法として、特開昭 60— 138465明細書には、前記第一の抗体及び第二の抗体として種を異にする抗体を用いる方法が開示されている。特開昭 61— 250558明細書には、リン脂質及び糖脂質の少なくとも一方とコレステロールとからなるリボゾームに親水性の標識物質封入し、これに被験物質に対する抗体の少なくとも一部を固定化して用いる前記の態様に属する方法が記載されている。特開昭 61— 269070明細書には、前記の態様に属する一般的方法が記載されている。また、特開昭 61— 250560明細書には、被験抗原に対する第一抗体、該第一抗体に対する第二抗体と標識物質を封入したリボゾームとの接合体、被験抗原に対する第三抗体、及び補体の四者を反応せしめることを特徵：とするリボゾーム免疫測定法が開示されている。

これらのいずれの方法においても、第二抗体又は第三抗体として、（1) 分析対象抗原と特異的に反応することができ、且つ（2) 補体を活性化することができるという、二つの条件を満たす抗体を用いる必要があるが、この様な条件を満たす抗体を得ることは必ずしも容易ではない。従って、本発明は、前記第一の条件、すなわち分析対象抗原との反応性、及び第二の条件、すなわち補体を活性化する能力を別個の抗体に担当せしめ、これらの抗钵が特異的に結合することができる様にすることにより、前記の問題点を解決しようとするものである。発明の開示

前記の問題点は、測定対象抗原に対する第--の抗体と標識を封入したリポゾームとを連結して成るリポゾーム結合抗体. 測定対象抗原に対する第二の抗体、及び測定対象抗原を反応せしめることにより、抗原一抗体複合体を形成せしめ、補体の存在下で前記リポゾ—ムから測定対象抗原の量に依存する量において標識を放出せしめ、そして該放出された標識を測定することにより測定対象抗原を測定する方法において、前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ且つ補体を活性化する能力を有する第三の抗体を用いることを特徴とするリポゾーム免疫測定法により解決される。

本発明はさらに、

(1) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、標識を封入したリポゾームとを連結して成るリポゾーム結合抗体；

(2) 測定対象抗原に対する第二の抗体；

(3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ、且つ補体を活性化することができる第三の抗体；及び

(4) 補体

の内の少なくとも 1つを含んで成るリポゾ一ム免疫測定甩キット、を提供する。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明のリポゾーム免疫測定法の原理を示す模式図である。

第 2図は、第二の抗体に結合したハプテン DNP量と標識物質の放出量との関係を示すダラフである。

第 3図は、本発明の方法により分析対象抗原 " ₂ プラスミノ一ゲン * インヒビター（ ₂PI )を測定する場合における検量線の一例を示すグラフである。

第 4図は、本発明の方法で測定した ₂P I値と従来の薛素免疫測定法で測定した " ₂P I値の相関々係を示す図である。

第 5図は、第二の抗体として西洋ヮサビパ一ォキシダ一ゼ ( HRP)と結合した抗 " ₂P Iマウスモノクローナル抗体 — 2 ) を用いた場合における第二抗体濃度と標識の放出量との関係を示すグラフである。

第 6図は、異る第二の抗体を使用した場合の、該抗体の反応混合物中濃度と標識物質の放出效率との関係を示すグラフである。図中、 Aは抗原ポリペプチド分子上の第一の抗体の結合部位と第 2の抗体の結合部位が該ポリぺプチドの一次構造を基準にして比較的近い場合の結果を示し、そして Bは第一の抗体の結合部位と第二の抗体の結合部位が比較的遠い場合の結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明のリポゾーム免疫測定法の原理を第 1図に模式的に示す。本発明においては、（1) 測定対象抗原、（2) 該測定対象抗原に対する第一の抗体と、標識物質を封入したリポゾ一ムとを連結して成るリボゾーム結合抗体、（3) 該測定対象抗原に対する第二の抗体、及び（4) 該第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ、且つ補体を活性化することができる第三の抗体を反応せしめることにより抗原一抗体複合体を形成せしめる。これにより測定対象抗原の量に依存する量の抗原一抗体複合体が形成される。この複合体に補体を作用させることにより、前記複合体中の第三の抗体の作用により補体が活性化され、活性化された補体の作用により複合体に組み込まれたリポゾームが損傷されそれに封入されていた標識物質が放出される。従って、この放出された標識物質を測定することにより、測定対象抗原を測定することができる _c 従って、本発明の方法においては、リボゾーム免疫測定系においてリポゾームから標識物質を放出せしめるために必要な、測定対象抗原に対する結合能力と補体活性化能力とを別個の抗体により担当せしめるため、抗体を容易に得ることができ、広範囲の種類の測定対象に対して使用することができる o

本発明の測定系は、抗原性を有する極めて広範囲の種類の物質を測定するために使用することができる。例えば、本発明において好ましく測定される抗原としては、 " ₂ プラスミノーゲンィンヒビター（ " ₂ P I )、 " ₂ P I—プラスミン複合体、プロテイン（：、プロテイン s、プラスミノーゲン、組織プラスミノ一ゲンァクチベータ（TPA) 、 TPAインヒビタ一（TPA I ) TPA - TPA I複合体、アンチトロンビン Π ( AT M ) 、 ΑΤ Π一トロンビン複合体、フイブリノペプチド A、 B 15— 42等の凝固線溶系因子が挙げられる。さらには、一フエトプロティン、癌胎児性抗原（CEA) 、胎盤由来グルタチォンー S — トランスフェラ一ゼ（GST— π ) のごとき癌マ一力一； C反応性蛋白質（CRP) 等の炎症マーカー；ヒト胎盤性ゴナドトロピン HC&). 黄体形成ホルモン（LH)、卵胞刺激ホルモン放出因子 (FSH) 等のホルモン類；ォステオカルシン、骨アル力リホスファターゼ等の骨代謝関連物質；インタ一ロイキン一 1〜6、腫瘍壊死因子等各種の免疫関連物質等を測定することができ o

本発明において使用するリボゾームとしては、常用の種々のリボゾームを使用することができ、その組成及び調製方法はすでに知られている。例えば、構成成分としてコリン、ホスファチジルコリン、フフインゴミエリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン等のリン脂質；安定剤としてのつレステロール類；及びジチォピリジル化又はマレイミド化したホスファチジルエタノールアミン（架穰性リン脂質）等が用いられる。例えば、ホスファチジルコリン、コレスタノ一ル及びジチォピリジル化ホスファチジルエタノール了ミンを溶剤に溶解した後、溶剤を減圧除去してフィルムを形成した後、これに水性媒体を加えてボルテックスミキサー等により撹拌することによりリボゾーム懸濁液が得られる。本発明において使用される標識としては、免疫測定法において従来から使用されている任意のものを用いることができその検出、又は測定方法もよく知られている。例えば酵素、例えばグルコース 6 — リン酸脱水素酵素標識として用い、発色性にした酵素基質による可視光、蛍光又は紫外線を測定する方法；蛍光剤、例えばカルボキシルフルォレセイン、カルセィン等を標識として用い蛍光発色を測定する方法；発光物質、例えばルシゲ二ン、ルミノール、ルシフヱリン等を標識として用いて発色を測定する方法；色素、例えばスルホ口一ダミン等を標識として用いて色素の放出量を測定する方法；酵素基質、例えばグルコース 6 — リン酸を標識として使用し- 酵素、例えばダルコース 6 — リン酸脱水素酵素を発色剤として用いて可視光線を測定する方法、等が用いられる。これらの標識をリポゾームに封入するには、水溶性標識物質等を使用する場合には標識物質を前記調製法において水性媒体層に添加し、脂溶性標識物質を使用する場合にはフィルム形成時にフィルム中に導入するか、又は界面活性剤を用いて導入す ο

リポゾームに結合せしめる第一の抗体としては、測定对象抗原に対する任意の抗俅を使用することができる。例えば、測定対象抗原により感作されたゥサギ、ャギ、ヒッジ、ラット、ブタ、モルモット、ニヮトリ、マウス等の哺乳動物から得られる抗血清を使用することができる。また、好ましくはモノクローナル抗体、例えばマウスモノクロ一ナル抗体等を使用することができる。これらの抗体は、完全な抗体分子、例えば免疫グロブリン G (I gG)の形で使用することもでき、又はそのフラグメント、例えば F (a ）₂ , Fab 等の形で使用することもできる。これらのポリク一ナル抗血清及びモノクローナル抗体、並びに抗体断片の調製方法はよく知られており、本発明の前記抗体も既知方法に従って調製することができる。

前記のリポゾームと抗体分子との結合は共有結合により、 '通常はひンカーとしての二価試薬を用いて行われる。本発明に用いる二価性試薬としては、グルタルアルデヒド等のジ了ルデヒド化合物；トルエン一 2 , 4 —ジイソシアナ一ト、ジフエニルメタン一 4 ， 4 ^r ージイソシ.アナ一ト等のジイソシアナートィ匕合物；エチレングリコールジグリシジルェ一テル、グリセリンジグリシジルェ一テル等のジエポキシ化合物；ビス（ 4 —アジドフエ二ル）スルホン、ビス（ 4 一アジドフエニル）メタン等のビスジァゾ化合物； 1 ーェチルー 3 — ( 3 —ジメトキシァミノプロピル）カルボジイミド、 N , N ' 一ジシクロへキシルカルポジィミド、 1 ーシクロへキシルー 3 ― ( 2 —モルホリニル一 4 ーェチレ）カルボジィミドメチル — p — トルエンスルホナ一ト等のカルボジィミド化合物； N ― ( m—マレイミド安息香酸）一 N—サクシンイミドエステル、 4— ( N—マレイミドメチル）安息香酸一 N—サクシンィミドエステル、 4 一（ N—マレイミドメチル）シクロへキサン一 1—カルボン酸一 N—サクシンィミドエステル等のマレイミドーカルボン酸一 N—サクシンィミドエステル化合物 3— （ 2 — ピリジルジチォ）プロピオン酸ー N—サクシンィミドエステル等のピリジルジチオーカルボン酸一 N—サクシンィミドエステル化合物が挙げられる。これらの二価試薬を用いる連結反応の条件はすでによく知られている。

本発明の方法においては、測定対象抗原の量に関連する量の標識物質を補体依存的にリポゾームから放出せしめる手段として、測定対象抗原に対する第二の抗体と、該第二の抗体に直接的又は間接的に結合することができ且つ補体を活性化することができる第三の抗体とを用いる。この第二の抗体としては、測定対象抗原に対する抗体であり且つ前記第一の抗体とは異る抗原決定基に結合する任意の抗体を用いることができる。すなわち、測定対象抗原により免疫感作されたゥサギ、ャギ、マウス、ヒッジ、ラット、ニヮトリ、ブタ等の哺乳類から得られるポリク口一ナル抗体や、各種のモノクローナル抗体、例えばマウスモノクロ一ナル抗体を使用することができる。この第二の抗体も、第一の抗体と同様、完全な抗体分子の形態で使用することもでき又は種々の抗体フラグメント、例えば F b ) ₂ , Fab 等の形態で使用することができる o

第三の抗体としては、第二の抗体との結合の態様に依存して種々の抗体を用いることができる。例えば、第三の抗体として第二の抗体と直接的に結合することができる抗体を用いる場合、この第三の抗体は、第二の抗体を抗原として用いて調製した抗体であり、この様な抗体として種々のポリクロ一ナル抗体又はモノクローナル抗体を用いることができる。しかしながら、本発明の好ましい態様においては、第三の抗体を間接的に第二の抗体と結合せしめる。この態様においては、第二の抗体とは無関係のある種の抗原又はハプテンに對する第三の抗体を調製する。この場合、この第三の抗体の調製に用いた抗原又はハプテンあるいはこれらと同様に反応する物質を前記第二の抗体に例えば共有結合により結合せしめ、複合抗体を第二の抗体として用いる。この態様によれば、第二の抗体とは無関係に、補体活性化能の強力な第三の抗体を選択して使用することができ、極めて有利である。第三の抗体を調製するための抗原として、従ってまた第二の複合抗体のパートナーとして、種々の蛋白質又はポリぺプチドを用いることができ、好ましくは分子量 30， 000以下の種々の蛋白質又はポリペプチドを用いることができる。例えば、西洋ヮサビパ—ォキシダーゼ、ミオグロビン、グルタチオン一 S— トランスフェラーゼ、アビジン、種々の合成ペプチド等を用いることができる。しかしながら、本発明の最も好ましい態様においては、第三の抗体を調製するための抗原として、適当なキヤリヤーに結合した低分子ハプテンを用い、そして第二の複合抗体のパートナーとして該ハプテンを使用する。すなわち、第二の抗体として「低分子ハプテン化抗体」を使甩する c この様なハブテンとしては、 2 , 4—ジニトロフエニル基 (DNP) などのジニトロベンゼン類、 2 , 4 , 6 — トリニトロフエ二ル基（TNP) などのトリニトロベンゼン類、ピオチノィル、イミノビォチノィルなどのビォチン類、アルドステロン， 17— ^ —エストラジオ一ル、デストステロンなどのステロイド類、ジフエニルヒダントインなどのヒダントイン類、フルォロイソチオシァネートなどのフルォレセィン類等、適当なキヤリャ一との結合によって抗原性を発揮するものであればいずれでも良い。ハプテンを用いる抗体の調製方法はすでによく知られている。第二の抗体として抗原との複合抗体、又は低分子ハプテン化抗体を使用する場合、第二の抗体とハプテン等との連結方法としてはすでに知られている方法を用いることができる。例えば、第二の抗体と抗原蛋白質又はポリペプチドとを連結するには、例えば、リボゾームと抗体分子との結合に関して前に挙げた二官能価架橋剤を用いる。また- 第二の抗体と低分子ハプテンとを連結するには、低分子ハプテンの官能基を利用して抗体のアミノ基、カルボキシル基^ と縮合せしめるか、又はリポゾームと抗体分子との結合に関して前にを挙げた二官¾価架撟剤を用いる。ハプテン化抗体のハプテン置換基の数は 1 〜 2 0個 Z抗体分子が適当である _r 第三の抗体が第二の抗体に対する抗体である場合、及び第二の抗体とは無関係のハプテン等対する抗体である場合のいずれにおいても、第三の抗体は補休活性化能を有しなければならない。この様な抗体としては種々のポリク口ーナル抗体及びモノクロ一ナル抗体を使用することができ、例えばゥサギ由来の抗体やマウスモノクロ一ナル抗体を用いることができる。また、これらの抗体は完全な抗体分子として使用することができ、また、補体活性化能を維持している限り、抗体の各種のフラグメン卜の形で用いることもできる。

本発明において用いられる補体としては、任意の動物稀のものを用い得る力《、好ましいのはモルモットの補体である。本発明の方法の実施において用いる反応媒体としては P H約 5. 0 〜10. 0、好ましくは PH 6. 5 〜 8. 5の種々の緩衝液、例えばゲラキンべロナール緩衝液、 H epes 緩衝液、 Tr i s緩衝液等を用いることができる。反応温度は特に臨界的ではなく、例えば 2 5 〜 5 0 °C、好ましくは 3 0 °C〜 4 0 での範面であり、例えば 3 7 °Cである。

本発明の方法は、前記のごとく、（1) 測定对象抗原、（2) リボゾーム結合第一抗体、（3) 第二の抗体、（4) 第二の抗体に結合する第三の抗钵、及び）ハプテンの相互反応により行われるが、これらの反 iS成分の反応混合物への添加の順序は特に臨界的ではなく、任意の順序で添加することができ、又は実質的に同時に混合することができる。一つの好ましい態様においては、（1) 測定对象抗原、（2) リボゾーム結合第一抗体及び（3) 第二の抗体を混合して所定時間ィンキュベートすることにより、抗原一抗体三元複合体をまず形成せしめ、次に（4) 第三の抗体及び（5) ハプテンを添加して所定時間ィンキュペートすることにより標識物質の放出を行う。この様に二段階の反応を行う場合、例えば第一段階の反応は約 3 0 分間行い、そして第二段階の反応は約 1時間行う。

本発明はまた、前記のリボゾーム免疫測定法を行うためのキットに関する。前記の測定方法を実施するには、

(1) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、標識を封入したリボゾームとを違結して成るリボゾーム結合抗体；

(2) 測定対象抗原に対する第二の抗体；

(3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ、且つ補体を活性化することができる第三の抗体；及び (4) 補体；

が必要である。しかしながら、これらは測定実施の現場において調製することも可能であるから、本発明の測定キットは. 前記 4種類の成分をすベて含有するもののみならず、そのいずれか 1種類、 2種類又は 3種類の成分のみから成るものでもよい。この発明のキットはさらに、反応成分を稀釈するための緩衝液を含有することができ、さらに、放出された標識の検出のために必要であればそのための試薬を含有することもできる。

次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。実施例 1.

(a) 抗体封入リポゾームの作成

5 mMジノ、°ルミトイルホスファチジルコリン（DPPD) 100 、

1 0 ^ コレステロール 5 0 、 1 mMジチォピリジル化ジノ、。ルミトイルホスファチジルエタノールァミン（DTP— DPPE) 2 0 をナス型フラスコに入れ、溶媒を減圧除去し、フイルムを作成した。 3 0分間真空乾燥し、 0. 2 M 力ルボキシフルォレセイン（CF)溶液を加え、ボルテックスミキサ一で攪拌し、 CP含有リボゾーム（MLV)を作成した。遠沈によりリポゾームを洗浄した。一方、ァセチルメルカプト無水コハク酸を用い、常法により SH化した抗" ₂PI マウスモノクローナル抗体（MCA 1 ) (濃度 0. 5 / i) 1 r を、洗浄したリポゾームに加え、終夜反応させた。未反応の抗体を遠沈除去し、抗休封入リポゾームを作成した。 (b) DNP化抗体の作成

0. 1 M 炭酸緩衝液（PH8.0 ) 中 1 ingZ 濃度の抗 o ₂PI マウスモノクローナル抗体（MCA 2') (MCA 1 とは異な；亢原部位を認識する） 20( ^に、ジォキサン中 10、 5 、 2.5 、 1.25又は 0.62mgZm£のジニトロフルォロベンゼン（DNP) 溶液を加え、室温で 5時間反応させた。この場合、 MCA2 と D の比率は

MCA 2 /DNP = 1X200, 1X100, 1X50, 1X25, 1 Z12.5、又は 1Z6.25(WZW)となる。反応後、リン酸緩衝生理食塩氷 (PBS) に対して終夜透析を行い、各 DNP化量の抗《 ₂Π マウスモノクローナル抗体（DNT— MCA 2 ) を作成した。

(c) リポゾーム免疫測定法一（1)

測定対象抗原である " ₂ΡΙ の濃度 120ngZm£、 3 0 ngXm£ および 0 ngZ のものをそれぞれ 2 5 と、 MCA 1感作リポゾーム 5 0倍稀釈液（ゲラチンべロナール緩衝液、 PH7. 4、 5 mM Mg* 、 5 mM C a* ) 5 と、各 DNP化 MCA 2 (およびコントロールとして D P化されていない (濃度 5 /miY各 2 5 /^を混合し、 3 7 °Cで 3 0分間ィンキュベ一トした後、ゥサギ抗 DNP化抗体（濃度 2 0 m /mi) 2 5 およびモルモット補体 3 CH₅。25^を加え、 3 7 でで 1時間ィンキュぺ一トし、 MTP— 32螢光マイクロプレートリ一ダ一で螢光を測定した。この結果を第 2図に示す。マーカー（螢光）の放出割合は、明らかに DNP化量に比例しており、 D 化抗体が本免疫反応に有効に面与していることが明らかである。

(d) リポゾ一ム免疫測定法一（2)

DNP化第二抗体を用いた !Jポゾ一人免疫破壊測定法（し ILA) 各濃度（120 ， 60. 30 - 15 , 7. 5 ng r ) の抗原 ₂PI) 溶液 2 5 に、 MCA 1封入リポゾ一ム稀釈液 5 と DNP化第二抗体〔マウスモノクローナル抗体（MCA 2 ) 、 MCA 2 /D P = 1Z200 (反応比） = 1 Z15.3 (結合比）もの〕 2 5 を加え 3 7 °cにて 3 0分反応した後、第三の抗体としてのゥサギ抗 DNP化抗体 2 5 、およびモルモット補体 2 5 を加え 3 7 °Cにて 1時反応させた。また、比較実験として、ゥサギ抗 DNP抗体のみを除いたものを用いて、 LILAを行った。結果は第 3図に示したごとく、抗 ~ 1

5原（《 ₂PI)特異的に反応が進行していることがわかる。

(e) 本発明のリポゾーム免疫測定法と従来の酵素免疫測定法との比較

本測定法を用いて煩発性血管内凝固症候群（DIC) 患者 1 8 名の血漿中の《 ₂PI レベルを測定した。その結果を、従来法である " ₂P1 の酵素免疫測定法による結果と比較したところ、第 4図に示したごとく、 r = 0.9549と良好な相関を示し、本法がな ₂PI を特異的に測定していることが明白である。

実施例 2.

(a) 1 mgZ 濃度の実施例 1 (b) で使用した抗 " ₂PI モノク口一ナル抗体 — 2 ) 1 ？ ^に、マレイミドベンゾィルサクシンィミドエステル（MBS) 0. 2 mgZ 3 0 ジメチルホルム了ミド（DMP) を加え、 2 5 °Cにて 3 0分間反応させ、セフアデックス G— 25カラム（ ø 1 0 mm X 2 5 cm ) を通し、 MBS化 MCA— 2を得た。この MBS化 MCA— 2 と、 2. 8 mgZ◦. 2 ccの- SH化西洋ヮサビノヽ⁰—才キシダーゼ (horse raddish eroxidase HRP)を混合し、 4 °Cで終夜反応させ、ウルトロゲル Λ(:Λ34αΚΒ) カラム ( Φ 1. 5 cmX 2 5 cm) を通し、 HRP結合 MCA— 2を作成した。

(b) 実施例 1 (c) とほぼ同様の操作を行い、但し第三の抗体としてゥサギ抗 DNP抗体のかわりに、ゥサギ抗 HRP抗体を用いて LILAを行ったところ、第 5図に示すごとく、 " ₂PI 120 ngZ において、第二の抗体である HRP— に依存的にし ILAが進行することが明らかになった。

実施例 3.

第二の抗体の種類が測定に及ぼす影響を調べるため、第二の抗体として実施例 1 (b) において調製した DNP化 MCA— 2 (第 6図 A) のほかに、同様にして調製した DNP化 CA- 3 (第 6図 B) を使用し、これらの第二抗体の濃度と標識の放出量との闋係を諷ベた。第 6図から明らかなごとく、 MCA— 3を使用した場合、その最適濃度は MCA— 2に比較して狭かつた。しかしながら、本発明の方法は第二の抗体の濃度をあらかじめ最適な一定濃に固定して行うことができるから、 CA- 3の使用は必ずしも不利ではない。

三宝ら、 Blood, Vol 69， o2 (1987), PP 446〜453 によれば、第一の抗体として使甩した MCA— 3は "₂PI 抗原ポリべプチド分子上の中央部分に結合し、 MCA— 2は MCA— 1よりかなり離れた N—末端側に結合し、そして M A— 3は MCA— 1の結合部位の近傍であってその C末端側に結合する。従つて、本実施例の上記の結果は、発明の方法が第二の抗体に対する抗原決定基の部位によらず良好に適用し得ることを示している。

実施例 4.

測定キット

試薬 A 測定対象《 ₂ Π に対する第一の抗体と標識カルボキシフルォレツセィンを封入したリポゾームとを連結して成るリボゾーム結合抗体、及び ΤΝ Ρ (ハプテン）化抗体を含む懸濁液 (試験管 Α ) 試薬 B モルモット補体凍結乾燥粉末（試験管 Β ) ；試薬 C ゥサギ抗 ΤΝΡ抗体凍結乾燥タブレット（タブレツト C ) 。

使用法

試験管 Αに検体 5； ^を加え、 3 7 にて 3 0分間インキュベートした後、タブレツト Cを加え、次に試験管 Λの口と試験管 Bの口とを連結して上下をゆつくり逆転させて試薬 B及び Cを Aに溶させ、全体をさらに 3 7 °Cにて 1時問ィンキュベートした後、蛍光を測定する。

Claims

請求の範囲

1. 測定対象抗原に対する第 iの抗体と標識を封入したリポゾームとを連結して成るリボゾーム結合抗体、測定対象抗原に対する第二の抗体、及び測定対象抗原を反応せしめることにより抗原一抗体複合体を形成せしめ、補体の存在下で前記ひポゾームから測定対象抗原の量に依存する量において標識を放出せしめ、そして該放出された標識を測定することにより測定対象抗原を測定する方法において、前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ且つ補体を活性化する能力を有する第三の抗体を用いることを特徵とするリポゾーム免疫測定法。

2. 前記第三の抗体がゥサギ抗体である、請求の範囲第 i 項に記載の方法。

3. 前記第三の抗体がマウスモノク口一ナル抗体である請求の範囲第 1項に記載の方法。

4. 前記第三の抗体が低分子ハプテンを認識する抗体であり、そして前記第二の抗体として該低分子ハプテンと結合した抗体を用いる、請求項 1 に記載の方法。

5. 前記低分子ハプテンとして、 2 , 4—ジニトロフエ二ル基（DNP) などのジニトロベンゼン類、 2 > 4 , 6 — トリ二トロフエ二ル基（TNP) などのトリニトロベンゼン類、ビォチノィル、ィミノビォチノィルなどのビォチン類、アルドステ口ン、 17— iS—エストラジォ一ル、デストステロンなどのステロイド類、ジフエニルヒダントインなどのヒダントイン類. 又はフルォロイソチ才シァネートなどのフル才レセイン類を用いる、請求項 4 に記載の方法。

V

6. 標識物質として、カルボキシルォレセイン、カルセィ ' ン、ルシゲニン、スルホローダミン、酵素 RP)、基贾又は低分子酵素を用いる、詰'求の範囲第 1項に記載の方法。

7. 測定対象抗原が、 " ₂ プラスミノ一ゲンィンヒビタ一 ( a ₂Ρί)、 a ₂PI 一プラスミン複合体、プロテイン（：、プティン S、プラスミノーゲン、組織プラスミノ一ゲンァクチベータ（TPA) 、 ΤΡΛィンヒビタ一（ΤΡΛ I ) 、 TPA- ΤΓΛ I 複合体-、アンチトロンビン H (ΛΤΙΚ) 、 ΛΤΚΙート π ：'ビン複合体、フイブリノペプチド A , B ^ 15— 42等の凝固綿溶系因子、 α'— フエトプロテイン、 '癌跆児性抗原（CEA) 、グルタチオン一 S— - トランスフェラーゼ（GST— ）のごとき癌マーカ一； C反応蛋白質（CRP) 等の炎症マーカー；ヒト胎盤性ゴナドトロピン ) 、黄体形成ホルモン（LH)、 ^¾剌激ホルモン放出因子（FSH) 等のホルモン類；ォステオカルシン、骨アル力リホスファタ一ゼ等の骨代謝関連物質；又はィンターロイキン一 1〜 6、腫瘍壊死子である、請求項 1 に記載の方法。

8. (I) 測定対象抗原に対する第一の抗体と、標識を封入したリポゾームとを違結して成るリポゾーム結合抗体；

(2) 測定対象抗原に対する第二の抗体；

(3) 前記第二の抗体と直接的又は間接的に結合することができ、且つ補休を活性化することができる笕三の抗体；及び ) 補体；の少なくとも 1つを含んで成るボゾーム免疫測定法用測定ャット