JPH09211001A - 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体ｎｓ１９−９及びそれを用いる測定方法 - Google Patents
低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体ｎｓ１９−９及びそれを用いる測定方法Info
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- JPH09211001A JPH09211001A JP1796196A JP1796196A JPH09211001A JP H09211001 A JPH09211001 A JP H09211001A JP 1796196 A JP1796196 A JP 1796196A JP 1796196 A JP1796196 A JP 1796196A JP H09211001 A JPH09211001 A JP H09211001A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 モノクローナル抗体ＮＳ１９−９による消化
器系癌の検出、診断の信頼度を高めることを目的とす
る。 【解決手段】 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモ
ノクローナル抗体ＮＳ１９−９によるムチン上抗原、特
にシアリルルイスａ糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９の
測定方法、およびその標識モノクローナル抗体。
器系癌の検出、診断の信頼度を高めることを目的とす
る。 【解決手段】 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモ
ノクローナル抗体ＮＳ１９−９によるムチン上抗原、特
にシアリルルイスａ糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９の
測定方法、およびその標識モノクローナル抗体。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体ＮＳ１９−９によって認識されるムチン上抗原の測定
方法に関する。具体的には、低分子発光又は蛍光物質で
標識されたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を使用して
ムチン上抗原を測定する方法に関する。
体ＮＳ１９−９によって認識されるムチン上抗原の測定
方法に関する。具体的には、低分子発光又は蛍光物質で
標識されたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を使用して
ムチン上抗原を測定する方法に関する。
【０００２】本発明はまた、上記方法で使用し得る低分
子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体Ｎ
Ｓ１９−９に関する。
子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体Ｎ
Ｓ１９−９に関する。
【０００３】
【従来の技術】ヒト大腸癌細胞培養株をマウスに免疫し
て得られたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（M.Herlyn
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76,1438,1979）は、癌患
者血清中に存在する巨大分子ムチン上に存在するシアリ
ルルイスａ糖鎖上の糖鎖抗原ＣＡ１９−９を特異的に認
識し（H.Koprowski ら、Somat.Cell Genet., 5,957,197
9 ）、その抗原決定基は糖鎖ＣＡ１９−９の非還元末端
であるシアル化・ラクトースＮ−フコペンタオースIIで
あることが発見された（J.Magnani ら、J.Biol.Chem.,
257,14365,1982 ）。
て得られたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９（M.Herlyn
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76,1438,1979）は、癌患
者血清中に存在する巨大分子ムチン上に存在するシアリ
ルルイスａ糖鎖上の糖鎖抗原ＣＡ１９−９を特異的に認
識し（H.Koprowski ら、Somat.Cell Genet., 5,957,197
9 ）、その抗原決定基は糖鎖ＣＡ１９−９の非還元末端
であるシアル化・ラクトースＮ−フコペンタオースIIで
あることが発見された（J.Magnani ら、J.Biol.Chem.,
257,14365,1982 ）。
【０００４】ＣＡ１９−９は、消化器系癌の腫瘍マーカ
ーとして有用であり、特に膵臓癌、胆管癌に有用であ
り、膵癌組織と膵癌患者血清中に高率かつ高濃度に存在
することが発見された。ＣＡ１９−９は患者血清中では
分子量３００〜５００万の巨大ムチンの一部として存在
している（大倉久直、代謝、22,891,1985 ）。
ーとして有用であり、特に膵臓癌、胆管癌に有用であ
り、膵癌組織と膵癌患者血清中に高率かつ高濃度に存在
することが発見された。ＣＡ１９−９は患者血清中では
分子量３００〜５００万の巨大ムチンの一部として存在
している（大倉久直、代謝、22,891,1985 ）。
【０００５】既に、血清中ＣＡ１９−９のモノクローナ
ル抗体ＮＳ１９−９によるイムノアッセイに関し、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）（特表昭59-501519 号公
報、米国特許第4,783,420 号明細書、登谷大修ら、癌と
化学療法、 11(3)：PART. Ｉ 509〜514 ，1984，櫻林郁
之介ら、臨床病理 XXXII：5, 539〜545, 1984 ）、酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）（大倉久直ら、肝胆膵 11(1)：21
〜28，1985，太田英樹ら、癌の臨床 32(9)： 993〜997,
1986）が報告されている。
ル抗体ＮＳ１９−９によるイムノアッセイに関し、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）（特表昭59-501519 号公
報、米国特許第4,783,420 号明細書、登谷大修ら、癌と
化学療法、 11(3)：PART. Ｉ 509〜514 ，1984，櫻林郁
之介ら、臨床病理 XXXII：5, 539〜545, 1984 ）、酵素
免疫測定法（ＥＩＡ）（大倉久直ら、肝胆膵 11(1)：21
〜28，1985，太田英樹ら、癌の臨床 32(9)： 993〜997,
1986）が報告されている。
【０００６】ここで使用される測定法の原理の一つは、
固相化した一次抗体に検体中に存在する抗原を結合さ
せ、その上にラジオアイソトープ又は酵素で標識した二
次抗体を結合させるいわゆる「サンドイッチ法」といわ
れるものである。ＥＩＡ法で使用される酵素には、グル
コースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ等が使用される。
固相化した一次抗体に検体中に存在する抗原を結合さ
せ、その上にラジオアイソトープ又は酵素で標識した二
次抗体を結合させるいわゆる「サンドイッチ法」といわ
れるものである。ＥＩＡ法で使用される酵素には、グル
コースオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ等が使用される。
【０００７】しかし、ＲＩＡ法は、特別の施設を要する
こと、試薬の安定性等の短所を有する。一方、ＥＩＡ法
は、ＲＩＡ法の短所を克服するものであるが、ＲＩＡ法
で検出されるが、ＥＩＡ法で検出されない場合があるこ
とも知られており、検出感度の点で問題がある（大倉久
直、代謝22：臨時増刊号癌 '85， 891〜896 (1985)）。
このため、ＣＡ１９−９の検出の際には、アッセイ方法
の検出感度を向上させて正確な診断を可能にすることが
望まれる。
こと、試薬の安定性等の短所を有する。一方、ＥＩＡ法
は、ＲＩＡ法の短所を克服するものであるが、ＲＩＡ法
で検出されるが、ＥＩＡ法で検出されない場合があるこ
とも知られており、検出感度の点で問題がある（大倉久
直、代謝22：臨時増刊号癌 '85， 891〜896 (1985)）。
このため、ＣＡ１９−９の検出の際には、アッセイ方法
の検出感度を向上させて正確な診断を可能にすることが
望まれる。
【０００８】このような状況下において、本発明者ら
は、酵素又は放射性標識に代えて低分子発光又は蛍光物
質でモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を標識することに
よって、意外にもＥＩＡ法と比べてより高い感度でムチ
ン上抗原を検出できることを見出した。
は、酵素又は放射性標識に代えて低分子発光又は蛍光物
質でモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を標識することに
よって、意外にもＥＩＡ法と比べてより高い感度でムチ
ン上抗原を検出できることを見出した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、モノクローナル抗体ＮＳ１９−９によって認識され
るムチン上抗原の測定方法において、前記モノクローナ
ル抗体が低分子発光又は蛍光物質で標識されていること
を特徴とする方法を提供することである。
は、モノクローナル抗体ＮＳ１９−９によって認識され
るムチン上抗原の測定方法において、前記モノクローナ
ル抗体が低分子発光又は蛍光物質で標識されていること
を特徴とする方法を提供することである。
【００１０】本発明の第２の目的は、上記方法で使用し
得る低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナ
ル抗体ＮＳ１９−９を提供することである。
得る低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナ
ル抗体ＮＳ１９−９を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、モノクローナ
ル抗体ＮＳ１９−９によって認識されるムチン上抗原の
測定方法であって、前記モノクローナル抗体が低分子発
光又は蛍光物質で標識されていることを特徴とする方法
を提供する。
ル抗体ＮＳ１９−９によって認識されるムチン上抗原の
測定方法であって、前記モノクローナル抗体が低分子発
光又は蛍光物質で標識されていることを特徴とする方法
を提供する。
【００１２】本発明で使用される低分子発光又は蛍光物
質は、通常２，０００未満、好ましくは１，２００未
満、特に好ましくは８００未満の分子量をもつ化学発
光、生物発光又は蛍光性物質のいずれでもよく、例えば
アクリジニウム、ルシフェリン、ルテニウムキレート及
びフルオレセイン、又はそれらの発光性もしくは蛍光性
誘導体を挙げることができる。
質は、通常２，０００未満、好ましくは１，２００未
満、特に好ましくは８００未満の分子量をもつ化学発
光、生物発光又は蛍光性物質のいずれでもよく、例えば
アクリジニウム、ルシフェリン、ルテニウムキレート及
びフルオレセイン、又はそれらの発光性もしくは蛍光性
誘導体を挙げることができる。
【００１３】発光性アクリジニウムの例としては、特開
昭63-57572号公報、辻章夫と菅野剛史編著、「化学発光
イムノアッセイ」第２章、ライフ・サイエンス（1989
年）に記載される化合物、特開昭６３−１１２５６４号
公報、米国特許第３，５３９，５７４号明細書などに記
載の１０−アルキル・Ｎ−アルキル又はアリール−スル
ホニル−Ｎ−アルキル又はアリールスルホニルアクリジ
ニウム−９−カルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボン酸エステル、市販化合物アクリジニウ
ムエステル（ＤＯＪＩＮ製）を挙げることができる。
昭63-57572号公報、辻章夫と菅野剛史編著、「化学発光
イムノアッセイ」第２章、ライフ・サイエンス（1989
年）に記載される化合物、特開昭６３−１１２５６４号
公報、米国特許第３，５３９，５７４号明細書などに記
載の１０−アルキル・Ｎ−アルキル又はアリール−スル
ホニル−Ｎ−アルキル又はアリールスルホニルアクリジ
ニウム−９−カルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウ
ム−９−カルボン酸エステル、市販化合物アクリジニウ
ムエステル（ＤＯＪＩＮ製）を挙げることができる。
【００１４】ルテニウムキレートの例としては、G.F. B
lackburnら、Clin. Chem. 9:1534〜1539, 1991に記載
される下記構造：
lackburnら、Clin. Chem. 9:1534〜1539, 1991に記載
される下記構造：
【００１５】
【化１】
【００１６】をもつ化合物を挙げることができる。
【００１７】フルオレセインの例としては、フルオレセ
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン
チオヒダントイン、等の化合物を挙げることができる。
インイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン
チオヒダントイン、等の化合物を挙げることができる。
【００１８】本発明の実施態様により、発光性アクリジ
ニウム化合物が好適に使用される。
ニウム化合物が好適に使用される。
【００１９】本発明はさらに、低分子発光又は蛍光物質
で標識されたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を提供す
る。
で標識されたモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を提供す
る。
【００２０】本発明で使用されるモノクローナル抗体Ｎ
Ｓ−１９−９は、米国セントコア社のものを使用でき
る。この抗体は、ムチンすなわちムチン型糖タンパク質
上の抗原、特にシアリルルイスａ糖鎖上の糖鎖抗原ＣＡ
１９−９即ちシアル化・ラクトースＮ−フコペンタオー
スIIを認識する。ＣＡ１９−９は、ヒト大腸癌由来培養
株から見出された糖鎖抗原であるが、消化器癌の腫瘍マ
ーカーとして極めて有用であり、モノクローナル抗体Ｎ
Ｓ１９−９はＣＡ１９−９を特異的に認識することが知
られている（H. Koprowskiら、前掲）。
Ｓ−１９−９は、米国セントコア社のものを使用でき
る。この抗体は、ムチンすなわちムチン型糖タンパク質
上の抗原、特にシアリルルイスａ糖鎖上の糖鎖抗原ＣＡ
１９−９即ちシアル化・ラクトースＮ−フコペンタオー
スIIを認識する。ＣＡ１９−９は、ヒト大腸癌由来培養
株から見出された糖鎖抗原であるが、消化器癌の腫瘍マ
ーカーとして極めて有用であり、モノクローナル抗体Ｎ
Ｓ１９−９はＣＡ１９−９を特異的に認識することが知
られている（H. Koprowskiら、前掲）。
【００２１】本発明の低分子発光又は蛍光物質で標識し
たモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を用いて血清中のＣ
Ａ１９−９の値をＥＩＡ法と比較試験したときには、本
発明方法はＥＩＡ法で偽陰性である検体であっても正し
く陽性反応を与えることができる。
たモノクローナル抗体ＮＳ１９−９を用いて血清中のＣ
Ａ１９−９の値をＥＩＡ法と比較試験したときには、本
発明方法はＥＩＡ法で偽陰性である検体であっても正し
く陽性反応を与えることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】本発明をさらに詳細に説明する。
【００２３】本発明で使用されるモノクローナル抗体Ｎ
Ｓ１９−９に低分子発光又は蛍光物質を標識するには、
一般的なタンパク質修飾技術（マレイミド法）を使用す
ることができる。すなわち、抗体タンパク質のアミノ酸
残基例えばリジン残基のε−アミノ基と反応しうるよう
に、低分子発光又は蛍光物質をＮ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミドなどの
活性基導入化合物と反応させて該物質に活性基を導入し
たのち、活性化低分子発光又は蛍光物質を抗体タンパク
質と反応させることによって標識化を達成することがで
きる。必要に応じて、活性化に際し、活性基導入化合物
と反応しうるように、あらかじめ低分子発光又は蛍光物
質にカルボキシル基などの反応性基を導入しておく。あ
るいは、標識化は過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法
によって行なうことも可能である。
Ｓ１９−９に低分子発光又は蛍光物質を標識するには、
一般的なタンパク質修飾技術（マレイミド法）を使用す
ることができる。すなわち、抗体タンパク質のアミノ酸
残基例えばリジン残基のε−アミノ基と反応しうるよう
に、低分子発光又は蛍光物質をＮ−ヒドロキシスクシン
イミド、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマレイミドなどの
活性基導入化合物と反応させて該物質に活性基を導入し
たのち、活性化低分子発光又は蛍光物質を抗体タンパク
質と反応させることによって標識化を達成することがで
きる。必要に応じて、活性化に際し、活性基導入化合物
と反応しうるように、あらかじめ低分子発光又は蛍光物
質にカルボキシル基などの反応性基を導入しておく。あ
るいは、標識化は過ヨウ素酸法、グルタルアルデヒド法
によって行なうことも可能である。
【００２４】上記の低分子発光又は蛍光物質を抗体に標
識する方法は、直接抗体に結合させる方法、架橋分子を
介して抗体に結合させる方法等、通常のイムノアッセイ
で使用される方法を使用することができる。
識する方法は、直接抗体に結合させる方法、架橋分子を
介して抗体に結合させる方法等、通常のイムノアッセイ
で使用される方法を使用することができる。
【００２５】本発明の標識化モノクローナル抗体をアッ
セイに使用してムチン上抗原を測定する方法としては、
一般的な化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）手順を用
いることができる（辻および菅野ら、前掲）。通常、ヘ
テロジニアスな方法、好ましくはＢ／Ｆ分離法が好適に
使用される。また、競合法、サンドイッチ法などのＣＬ
ＩＡで一般的に使用可能な方法を用いることができる。
セイに使用してムチン上抗原を測定する方法としては、
一般的な化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）手順を用
いることができる（辻および菅野ら、前掲）。通常、ヘ
テロジニアスな方法、好ましくはＢ／Ｆ分離法が好適に
使用される。また、競合法、サンドイッチ法などのＣＬ
ＩＡで一般的に使用可能な方法を用いることができる。
【００２６】一般に、抗原抗体反応後にＢ／Ｆ分離し、
固相に付着した化学発光性の化合物を化学発光反応で検
出する。
固相に付着した化学発光性の化合物を化学発光反応で検
出する。
【００２７】競合法の場合、例えば、固相化した一次抗
原に、検体中に存在する抗体と低分子発光又は蛍光物質
を標識した二次抗体を競合させる手順でアッセイを行な
うことが可能であるし、またサンドイッチ法の場合、例
えば固相化した一次抗体に検体中に存在する抗原を結合
させ、その上に低分子発光又は蛍光物質を標識した二次
抗体を結合させる手順でアッセイを行なうことができ
る。
原に、検体中に存在する抗体と低分子発光又は蛍光物質
を標識した二次抗体を競合させる手順でアッセイを行な
うことが可能であるし、またサンドイッチ法の場合、例
えば固相化した一次抗体に検体中に存在する抗原を結合
させ、その上に低分子発光又は蛍光物質を標識した二次
抗体を結合させる手順でアッセイを行なうことができ
る。
【００２８】固相として磁性粒子、マイクロタイターウ
エルの内面、試験管壁、ラテックス粒子、ポリスチレン
ビーズなどを用いることができ、固相に付着した発光又
は蛍光物質がアクリジニウムの場合、測定前にトリガー
試薬処理、例えば過酸化水素例えば約０．０１％〜約
０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム例
えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶
液で処理してから発生する発光を例えばルミノメーター
で検出する。
エルの内面、試験管壁、ラテックス粒子、ポリスチレン
ビーズなどを用いることができ、固相に付着した発光又
は蛍光物質がアクリジニウムの場合、測定前にトリガー
試薬処理、例えば過酸化水素例えば約０．０１％〜約
０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリウム例
えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶
液で処理してから発生する発光を例えばルミノメーター
で検出する。
【００２９】磁性粒子を用いる場合、例えば、検体と発
光又は蛍光物質標識抗体とを反応させ、次いで第二抗体
結合磁性粒子を添加し反応させたのち、マグネット分離
し、磁性粒子に付着した発光又は蛍光物質を検出するこ
とができる。この方法は、本発明において特に好まし
い。
光又は蛍光物質標識抗体とを反応させ、次いで第二抗体
結合磁性粒子を添加し反応させたのち、マグネット分離
し、磁性粒子に付着した発光又は蛍光物質を検出するこ
とができる。この方法は、本発明において特に好まし
い。
【００３０】本発明の方法は、モノクローナル抗体ＮＳ
１９−９によって認識可能なムチン上抗原、特にそのシ
アリルルイスａの糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９（シ
アル化・ラクトースＮ−フコペンタオースII）を検出す
るものであるが、この抗体は消化器系癌、特に膵胆系癌
に特異性が高いために、これらの癌の腫瘍マーカーとし
て使用されており、本発明方法も消化器系癌の検出、診
断に用いられる。検体としては、一般に血液、好ましく
は血清、血漿が使用される。
１９−９によって認識可能なムチン上抗原、特にそのシ
アリルルイスａの糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９（シ
アル化・ラクトースＮ−フコペンタオースII）を検出す
るものであるが、この抗体は消化器系癌、特に膵胆系癌
に特異性が高いために、これらの癌の腫瘍マーカーとし
て使用されており、本発明方法も消化器系癌の検出、診
断に用いられる。検体としては、一般に血液、好ましく
は血清、血漿が使用される。
【００３１】本発明を下記の実施例によってさらに説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］悪性腫瘍患者血清中のＣＡ１９−９の測定 「抗体ＮＳ１９−９被覆磁性微粒子の調製」ＮＳ１９−
９を磁性粒子（ポリーマーラボ社製）３μｍに以下の方
法にて結合させた。
９を磁性粒子（ポリーマーラボ社製）３μｍに以下の方
法にて結合させた。
【００３３】まず、０．０５ＭのＭＥＳ（２−［Ｎ−モ
ルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ４．７）中
の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＡＣ；２．０ｍｇ／ｍｌ）を用いて
モノクローナル抗体ＮＳ１９−９を室温で１時間かけて
結合させた。次に１％ツイーン２０及び０．９％ＮａＣ
ｌを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を
用いて洗浄した。最終的には５％ＢＳＡ、０．１％ツイ
ーン２０、Ｏ．Ｏ９％ＮａＣｌ及び０．１％アジ化ナト
リウムを含有する０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．
４）中に貯蔵した。被覆磁性粒子の固形分が０．０４２
％になるように貯蔵緩衝液で希釈し、ＮＳ１９−９抗体
被覆磁性微粒子試薬とした。
ルホリノ］エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ４．７）中
の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド（ＥＤＡＣ；２．０ｍｇ／ｍｌ）を用いて
モノクローナル抗体ＮＳ１９−９を室温で１時間かけて
結合させた。次に１％ツイーン２０及び０．９％ＮａＣ
ｌを含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を
用いて洗浄した。最終的には５％ＢＳＡ、０．１％ツイ
ーン２０、Ｏ．Ｏ９％ＮａＣｌ及び０．１％アジ化ナト
リウムを含有する０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．
４）中に貯蔵した。被覆磁性粒子の固形分が０．０４２
％になるように貯蔵緩衝液で希釈し、ＮＳ１９−９抗体
被覆磁性微粒子試薬とした。
【００３４】「活性化アクリジニウムの調製」β−アラ
ニンアクリジニウム（１ｍｇ）を無水ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）中に溶解し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５．７５ｍｇ／ｍｌ、
５０μｌ）及びＥＤＡＣ（９．６ｍｇ／ｍｌ、５０μ
ｌ）を連続して添加し、暗所、２５℃で４８時間撹拌す
ることにより活性化した。
ニンアクリジニウム（１ｍｇ）を無水ジメチルホルムア
ミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）中に溶解し、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５．７５ｍｇ／ｍｌ、
５０μｌ）及びＥＤＡＣ（９．６ｍｇ／ｍｌ、５０μ
ｌ）を連続して添加し、暗所、２５℃で４８時間撹拌す
ることにより活性化した。
【００３５】「アクリジニウム標識ＮＳ１９−９抗体の
調製」調製ＮＳ１９−９抗体（４ｍｇ／ｍｌ）を含有し
ている０．９％ＮａＣｌ及び５％ＣＨＡＰＳを含む０．
１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に活性化アクリジニ
ウム（２ｍｇ／ｍｌ）を加え、反応混合物を室温で１０
分間撹拌した。反応物質をＰＤ−１０（分離用カラム）
（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて分離し、それぞれのフラク
ション（０．５ｍｌ）を３６９ｎｍ及び２８０ｎｍでの
紫外分光分析により分析し、アクリジニウムの結合量を
決定した。結合体を濃縮フラクション（約１００μｇ／
ｍｌ）中、約４℃で貯蔵し、使用前に０．１％ツイーン
２０、０．１％アジ化ナトリウム、１％ＢＳＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含有する０．０５ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６．３）で希釈し、アクリジニウム標識ＮＳ１９−９抗
体試薬とした。
調製」調製ＮＳ１９−９抗体（４ｍｇ／ｍｌ）を含有し
ている０．９％ＮａＣｌ及び５％ＣＨＡＰＳを含む０．
１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に活性化アクリジニ
ウム（２ｍｇ／ｍｌ）を加え、反応混合物を室温で１０
分間撹拌した。反応物質をＰＤ−１０（分離用カラム）
（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて分離し、それぞれのフラク
ション（０．５ｍｌ）を３６９ｎｍ及び２８０ｎｍでの
紫外分光分析により分析し、アクリジニウムの結合量を
決定した。結合体を濃縮フラクション（約１００μｇ／
ｍｌ）中、約４℃で貯蔵し、使用前に０．１％ツイーン
２０、０．１％アジ化ナトリウム、１％ＢＳＡ及び０．
９％ＮａＣｌを含有する０．０５ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ
６．３）で希釈し、アクリジニウム標識ＮＳ１９−９抗
体試薬とした。
【００３６】「ＮＳ１９−９−ＡＬＰ−アクリジニウム
結合体の調製」４９μｇのアルカリフォスファターゼ
（ＡＬＰ）（ベーリンガーマンハイム社）と７８８μｇ
（Ｓｉｇｍａ社製）の２−イムノチオレイン（ＰＩＥＲ
ＣＥ社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１５
５０μｌ）中に溶解し、３０分間室温にて撹拌すること
によりアルカリフォスファターゼを活性化し、その反応
物を２８０ｎｍで吸光度を分析し、タンパク質量を測定
した。
結合体の調製」４９μｇのアルカリフォスファターゼ
（ＡＬＰ）（ベーリンガーマンハイム社）と７８８μｇ
（Ｓｉｇｍａ社製）の２−イムノチオレイン（ＰＩＥＲ
ＣＥ社製）を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１５
５０μｌ）中に溶解し、３０分間室温にて撹拌すること
によりアルカリフォスファターゼを活性化し、その反応
物を２８０ｎｍで吸光度を分析し、タンパク質量を測定
した。
【００３７】同時に４ｍｇのＮＳ１９−９抗体と８０μ
ｌのＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ社製）にて溶解させた０．１７
９μｇのＳＭＣＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）（１３００μｌ）中に溶解し、３
０分間室温にて撹拌することによりＮＳ１９−９抗体を
活性化した。その反応物質を２８０ｎｍで吸光度を分析
し、タンパク質量を測定した。１．２９ｍｇ／ｍｌの活
性化ＮＳ１９−９溶液（１．５ｍｌ）と１．３３ｍｇ／
ｍｌの活性化ＡＬＰ溶液（１．５ｍｌ）を２時間室温に
て撹拌し、反応停止剤として ８０μｌのＤＭＦに溶解
した２．２３ｍｇ／ｍｌ Ｎ−エチルマレイミド（関東
化学社製）（８０μｌ）を添加し、その後３０分間撹拌
した。その反応溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液を用いて平衡化したＧ３０００ＳＷ（ＴＯＳＯＨ社製
Ｔｓｋ−Ｇｅｌ）のＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフ
ィーにかけ、溶出する各フラクション（１ｍｌ）の２８
０ｎｍでの吸光度を分析し、タンパク質量を測定して、
分子量約６０万の位置に溶出するＮＳ１９−９−ＡＬＰ
−結合体のピークを収集した。あとは「アクリジニウム
標識ＮＳ１９−９抗体の調製」に準じてアクリジニウム
を結合させ、（ＮＳ１９−９−ＡＬＰ）−アクリジニウ
ム結合体を調製した。
ｌのＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ社製）にて溶解させた０．１７
９μｇのＳＭＣＣ（Ｓｉｇｍａ社製）を０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）（１３００μｌ）中に溶解し、３
０分間室温にて撹拌することによりＮＳ１９−９抗体を
活性化した。その反応物質を２８０ｎｍで吸光度を分析
し、タンパク質量を測定した。１．２９ｍｇ／ｍｌの活
性化ＮＳ１９−９溶液（１．５ｍｌ）と１．３３ｍｇ／
ｍｌの活性化ＡＬＰ溶液（１．５ｍｌ）を２時間室温に
て撹拌し、反応停止剤として ８０μｌのＤＭＦに溶解
した２．２３ｍｇ／ｍｌ Ｎ−エチルマレイミド（関東
化学社製）（８０μｌ）を添加し、その後３０分間撹拌
した。その反応溶液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液を用いて平衡化したＧ３０００ＳＷ（ＴＯＳＯＨ社製
Ｔｓｋ−Ｇｅｌ）のＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフ
ィーにかけ、溶出する各フラクション（１ｍｌ）の２８
０ｎｍでの吸光度を分析し、タンパク質量を測定して、
分子量約６０万の位置に溶出するＮＳ１９−９−ＡＬＰ
−結合体のピークを収集した。あとは「アクリジニウム
標識ＮＳ１９−９抗体の調製」に準じてアクリジニウム
を結合させ、（ＮＳ１９−９−ＡＬＰ）−アクリジニウ
ム結合体を調製した。
【００３８】「検体」１２名から採取した血清を検体と
して用いた。
して用いた。
【００３９】「シアリダーゼ処理」５０ｍＵ／ｍｌのシ
アリダーゼ（シグマ社製）溶液と検体を各５０μｌ混合
し、１８時間、３７℃にて撹拌することによりシアリダ
ーゼ処理を行った。
アリダーゼ（シグマ社製）溶液と検体を各５０μｌ混合
し、１８時間、３７℃にて撹拌することによりシアリダ
ーゼ処理を行った。
【００４０】「アッセイ」化学発光免疫測定法（ＣＬＩ
Ａ）ではあらかじめ定められたＣＡ１９−９抗原の量を
含んでいる溶液を標準液として用いた。
Ａ）ではあらかじめ定められたＣＡ１９−９抗原の量を
含んでいる溶液を標準液として用いた。
【００４１】患者血清検体（１０μｌ）を容器に入れ、
これにＮＳ１９−９抗体被覆磁性微粒子試薬（７０μ
ｌ）とアクリジニウム標識ＮＳ１９−９抗体試薬（５０
μｌ）を添加し３７℃で１０分間反応させた。反応微粒
子を磁石にて捕捉し、０．１％トリス緩衝液（１ｍｌ）
で４回洗浄した。この反応容器に精製水（４００μｌ）
を添加し、化学発光読取り機に移し、０．２２５ＮのＮ
ａＯＨ中の０．４％過酸化水素を含むトリガー溶液（３
００μｌ）を添加し、磁性微粒子に結合したアクリジニ
ウムを発光させ、生じた光の量を測定した。標準液の値
から得られた標準曲線から、検体の濃度を算出した。酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）はＩＭｘ ＣＡ１９−９Ｋｉｔ
（ダイナボット社製）を用いて測定を行なった。
これにＮＳ１９−９抗体被覆磁性微粒子試薬（７０μ
ｌ）とアクリジニウム標識ＮＳ１９−９抗体試薬（５０
μｌ）を添加し３７℃で１０分間反応させた。反応微粒
子を磁石にて捕捉し、０．１％トリス緩衝液（１ｍｌ）
で４回洗浄した。この反応容器に精製水（４００μｌ）
を添加し、化学発光読取り機に移し、０．２２５ＮのＮ
ａＯＨ中の０．４％過酸化水素を含むトリガー溶液（３
００μｌ）を添加し、磁性微粒子に結合したアクリジニ
ウムを発光させ、生じた光の量を測定した。標準液の値
から得られた標準曲線から、検体の濃度を算出した。酵
素免疫測定法（ＥＩＡ）はＩＭｘ ＣＡ１９−９Ｋｉｔ
（ダイナボット社製）を用いて測定を行なった。
【００４２】結果を表１に示す。表１はアルカリホスフ
ァターゼ標識、アルカリホスファターゼ−アクリジニウ
ム共標識、アクリジニウム標識のモノクローナル抗体Ｎ
Ａ１９−９の３者によるＣＡ１９−９の検出を示す。表
１での検出の判定はすべてｃｕｔ ｏｆｆ値を３７Ｕ／
ｍｌとして行なった。アクリジニウムのみの標識の抗体
ＮＳ１９−９でＣＡ１９−９の検出が極めて優れている
ことを示す。又シアリターゼ処理で検体Ｎｏ．１、２が
陰性であることは、本発明方法での陽性判定が偽陽性で
ないことを示しており、この結果は、アルカリホスファ
ターゼのような酵素でモノクローナル抗体ＮＳ１９−９
が標識されたときには、酵素免疫測定法、化学発光免疫
測定法といった測定方法にはかかわらず抗体とＣＡ１９
−９との反応が抑制される可能性を示唆している。
ァターゼ標識、アルカリホスファターゼ−アクリジニウ
ム共標識、アクリジニウム標識のモノクローナル抗体Ｎ
Ａ１９−９の３者によるＣＡ１９−９の検出を示す。表
１での検出の判定はすべてｃｕｔ ｏｆｆ値を３７Ｕ／
ｍｌとして行なった。アクリジニウムのみの標識の抗体
ＮＳ１９−９でＣＡ１９−９の検出が極めて優れている
ことを示す。又シアリターゼ処理で検体Ｎｏ．１、２が
陰性であることは、本発明方法での陽性判定が偽陽性で
ないことを示しており、この結果は、アルカリホスファ
ターゼのような酵素でモノクローナル抗体ＮＳ１９−９
が標識されたときには、酵素免疫測定法、化学発光免疫
測定法といった測定方法にはかかわらず抗体とＣＡ１９
−９との反応が抑制される可能性を示唆している。
【００４３】
【表１】
【００４４】
【発明の効果】本発明によって、ＥＩＡで測定不能又は
偽陰性の検体もより高い信頼度で検出することができ
る。
偽陰性の検体もより高い信頼度で検出することができ
る。
Claims (8)
- 【請求項１】 モノクローナル抗体ＮＳ１９−９によっ
て認識されるムチン上抗原の測定方法であって、前記モ
ノクローナル抗体が低分子発光又は蛍光物質で標識され
ていることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記低分子発光又は蛍光物質が、アクリ
ジニウム、ルテニウムキレート及びフルオレセイン、又
はそれらの発光性もしくは蛍光性誘導体からなる群から
選択される請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記抗原が、ムチン上に存在するシアリ
ルルイスａ糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９即ちシアル
化・ラクトースＮ−フコペンタオースIIである請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 モノクローナル抗体ＮＳ１９−９によっ
て認識されるムチン上抗原の測定方法であって、前記モ
ノクローナル抗体がアクリジニウムもしくはその発光性
誘導体で標識されていることを特徴とする方法。 - 【請求項５】 前記抗原が、ムチン上に存在するシアリ
ルルイスａ糖鎖上の抗原決定基ＣＡ１９−９即ちシアル
化・ラクトースＮ−フコペンタオースIIである請求項４
に記載の方法。 - 【請求項６】 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモ
ノクローナル抗体ＮＳ１９−９。 - 【請求項７】 前記低分子発光又は蛍光物質が、アクリ
ジニウム、ルテニウムキレート及びフルオレセイン、又
はそれらの発光性もしくは蛍光性誘導体からなる群から
選択される請求項６記載のモノクローナル抗体ＮＳ１９
−９。 - 【請求項８】 前記低分子発光又は蛍光物質が、アクリ
ジニウムもしくはその発光性誘導体である請求項７記載
のモノクローナル抗体ＮＳ１９−９。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1796196A JPH09211001A (ja) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体ｎｓ１９−９及びそれを用いる測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1796196A JPH09211001A (ja) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体ｎｓ１９−９及びそれを用いる測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09211001A true JPH09211001A (ja) | 1997-08-15 |
Family
ID=11958351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1796196A Pending JPH09211001A (ja) | 1996-02-02 | 1996-02-02 | 低分子発光又は蛍光物質で標識されたモノクローナル抗体ｎｓ１９−９及びそれを用いる測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09211001A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009121874A (ja) * | 2007-11-13 | 2009-06-04 | Eisai R & D Management Co Ltd | 消化器癌の診断方法 |
| JP2020076668A (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-21 | 富士レビオ株式会社 | Ｃａ１９−９測定方法及びｃａ１９−９測定キット、並びに、これらに用いる抗体固定化担体及びその製造方法 |
-
1996
- 1996-02-02 JP JP1796196A patent/JPH09211001A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009121874A (ja) * | 2007-11-13 | 2009-06-04 | Eisai R & D Management Co Ltd | 消化器癌の診断方法 |
| JP2020076668A (ja) * | 2018-11-08 | 2020-05-21 | 富士レビオ株式会社 | Ｃａ１９−９測定方法及びｃａ１９−９測定キット、並びに、これらに用いる抗体固定化担体及びその製造方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20050308 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050913 |