UA129740C2 - Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази а (аса) - Google Patents

Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази а (аса)

Info

Publication number
UA129740C2
UA129740C2 UAA201507721A UAA201507721A UA129740C2 UA 129740 C2 UA129740 C2 UA 129740C2 UA A201507721 A UAA201507721 A UA A201507721A UA A201507721 A UAA201507721 A UA A201507721A UA 129740 C2 UA129740 C2 UA 129740C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
shche
zhe
shk
shi
zhk
Prior art date
Application number
UAA201507721A
Other languages
English (en)
Inventor
Назіла Саламат-Міллер
Кетрін Тейлор
Поль Кампольєто
Зара Шарок
Цзін Пань
Лоренс Чарнас
Тереза Ліа Райт
Перікл Каліас
Original Assignee
Такеда Фармасьютікал Компані Лімітед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45352777&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA129740(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Такеда Фармасьютікал Компані Лімітед filed Critical Такеда Фармасьютікал Компані Лімітед
Publication of UA129740C2 publication Critical patent/UA129740C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/761—Adenovirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06008—Cerebroside-sulfatase (3.1.6.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/06—Sulfuric ester hydrolases (3.1.6)
    • C12Y301/06013—Iduronate-2-sulfatase (3.1.6.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01045—Glucosylceramidase (3.2.1.45), i.e. beta-glucocerebrosidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01046—Galactosylceramidase (3.2.1.46)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0105—Alpha-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.50)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y310/00—Hydrolases acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10)
    • C12Y310/01—Hydrolases acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10) acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10.1)
    • C12Y310/01001—N-Sulfoglucosamine sulfohydrolase (3.10.1.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Abstract

Винахід стосується застосування композиції, що включає білок арилсульфатази А (АСА) та фармацевтично прийнятний наповнювач у лікуванні метахроматичної лейкодистрофії (МЛД).

Description

Дана заявка претендує на пріоритет за попередніми заявками на патент США під номерами 61/358,857 з датою подачі 25 червня 2010 р.; 61/360,786 з датою подачі 1 липня 2010 р.; 61/387,862 з датою подачі 29 вересня 2010 р.; 61/435,710 з датою подачі 24 січня 2011 р.; 61/442,115 з датою подачі 11 лютого 2011 р.; 61/476,210 з датою подачі 15 квітня 2011 р.; і 61/495,268 з датою подачі 9У червня 2011 р.; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання.
Родинними для даної заявки є заявки на патент США під заголовком "Способи та композиції для доставки до ЦНС гепаран-М-сульфатази" з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС ідуронат-2-сульфатази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС р-галактоцереброзидази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС арилсульфатази А", та ж дата подачі; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання.
Замісна ферментна терапія (ЗФТ) включає системне введення суб'єктам природних або рекомбінантних білків і/або ферментів. Схвалені терапевтичні засоби зазвичай вводять суб'єктам внутрішньовенно і зазвичай вони є ефективними при лікуванні соматичних симптомів первинної ферментної недостатності. У результаті обмеженого розподілу введеного внутрішньовенно білка і/або ферменту по клітинах і тканинах центральної нервової системи (ЦНС) лікування захворювань, що мають етіологію, пов'язану з ЦНС, є особливо складним завданням, оскільки введені внутрішньовенно білки і/або ферменти не проникають у достатній мірі через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ).
Гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) - це структурна система, яка складається з ендотеліальних клітин, функцією яких є захист центральної нервової системи (ЦНС) від шкідливих речовин у крові, таких як бактерії, макромолекули (наприклад, білки) та інші гідрофільні молекули, шляхом обмеження проникнення подібних речовин через ГЕБ до спинномозкової рідини (СМР) і ЦНС.
Існує декілька способів обійти ГЕБ для покращення доставки терапевтичного агента до мозку, в тому числі пряма внутрішньочерепна ін'єкція, короткочасна пермеабілізація ГЕБ і модифікація активного агента, яка змінює розподіл у тканинах. Пряма ін'єкція терапевтичного агента до тканин мозку повністю обходить судинну систему, але пов'язана в першу чергу з ризиком ускладнень (інфекція, ушкодження тканин, імунна відповідь), які виникають у результаті внутрішньочерепних ін'єкцій і слабкої дифузії активного агента з місця введення. На даний момент пряме введення білків до мозкової речовини не забезпечило значного терапевтичного ефекту внаслідок існування бар'єра для дифузії та обмеженого об'єму складу, який може бути введений. Була вивчена дифузія з конвекцією через катетери, розміщені в паренхімі мозку, з використанням повільної довгострокової інфузії (Вобо, еї аїЇ., Ргос. МаїЇ. Асай. 5сі. 0.5.А 91, 2076-2080 (1994); Мдиуеп, еї аї. У. Меигозигод. 98, 584-590 (2003)), однак у жодному зі схвалених способів терапії цей підхід не використовується для тривалого лікування. Крім того, розміщення внутрішньомозкових катетерів є вкрай інвазивним і є менш бажаною клінічною альтернативою.
Також були розпочаті спроби здійснити інтратекальну (ІТ) ін'єкцію або введення білків до спинномозкової рідини (СМР), але вони також не призвели до терапевтичного успіху. Однією з основних проблем при такому лікуванні є схильність активної речовини до дуже щільного зв'язування з епендимною вистилкюою шлуночка, яке заважає наступній дифузії. У даний час є відсутніми дозволені продукти для лікування генетичного захворювання мозку шляхом прямої доставки агентів до СМР.
Насправді, багато хто вважає, що бар'єр для дифузії на поверхні мозку, а також відсутність ефективних і зручних способів доставки, є занадто суттєвою перешкодою для досягнення відповідного терапевтичного ефекту в головному мозку при лікуванні будь-якого захворювання.
Багато які з лізосомних хвороб накопичення зачіпають нервову систему, що особливо ускладнює лікування цих хвороб за допомогою традиційних методів терапії. Часто зустрічаються значні накопичення глюкозоаміногліканів (ГАГ) у нейронах і в мозкових оболонках хворих індивідів, що призводить до різних форм симптомів з боку ЦНС. На сьогоднішній день не відомі випадки успішного лікування симптомів з боку ЦНС, викликаних лізосомними хворобами, з використанням доступних засобів.
Таким чином, залишається велика потреба в ефективній доставці терапевтичних речовин до мозку. Зокрема, існує велика потреба в більш ефективній доставці активних речовин до центральної нервової системи для лікування лізосомних хвороб накопичення.
Даний винахід забезпечує ефективний і менш інвазивний підхід для прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Зокрема, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, який полягає в тому, що заміщуючий фермент бо (наприклад, арилсульфатаза А (А5А)) лізосомних хвороб накопичення (наприклад, МЛД) може бути прямо введений до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування, у високій концентрації (наприклад, більше З мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл або більше), завдяки чому фермент ефективно й активно проникає через різні поверхні та поширюється в різних областях мозку, включаючи глибокі області мозку.
Зовсім несподівано автори даного винаходу продемонстрували, що доставка такої високої концентрації білка може бути досягнута з використанням простих фізіологічних або буферних розчинів, не викликаючи суттєвих побічних ефектів, таких як різко виражена імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, даний винахід забезпечує високоефективний, клінічно бажаний і зручний для пацієнта підхід для прямої доставки до ЦНС для лікування різних захворювань і розладів, пов'язаних із компонентами ЦНС, зокрема лізосомних хвороб накопичення. Даний винахід являє собою значне досягнення в області спрямованої доставки речовин до ЦНС і замісної ферментної терапії.
Як докладно описано нижче, автори даного винаходу розробили стабільні склади для ефективного інтратекального (ІТ) введення білка арилсульфатази А (АБА). Припускається, однак, що різні стабільні склади, описані в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до
ЦНС терапевтичних агентів, включаючи різні інші лізосомальні ферменти. Дійсно, стабільні склади згідно з даним винаходом можуть бути використані для доставки до ЦНС за допомогою різних способів і шляхів, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, інтраветрикулярне церебральне (ЩВ), інтратекальне (тобто ІТ-поперекове, ІТ-мостомозочкове) введення або будь-який інший метод і шлях прямого або непрямого введення до ЦНС і/або до СМР.
Припускається також, що різні стабільні склади, представлені в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до ЦНС терапевтичних агентів, таких як терапевтичні білки, включаючи різні заміщуючі ферменти для лікування хвороб лізосомного накопичення. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент може бути синтетичним, рекомбінантним, ген- активованим або природним ферментом.
У різних варіантах реалізації даний винахід включає стабільний склад для прямого інтратекального введення до ЦНС, який містить білок арилсульфатазу А (АБ5А), сіль і поверхнево-активну речовину полісорбат. У деяких варіантах реалізації, білок АЗА є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 1-300 мг/мл (тобто 1-250 мг/мл, 1-200 мг/мл, 1-150 мг/мл, 1- 100 мг/мл, 1-5Омг/мл). У деяких варіантах реалізації, білок АБА є присутнім у концентрації, обраній із: 2 мг/мл, З мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл чи вище. 35 У різних варіантах реалізації даний винахід включає стабільний склад для будь-якого застосування, наведеного в даній заявці, у яких білок АБА включає амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО:1. У деяких варіантах реалізації, білок АБА включає амінокислотну послідовність, щонайменше на 6095, 6595. 7095, 7595, 8095, 85595, 9095, 9595 або 9895 ідентичну послідовності 5ЕО ІЮО МО:1. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад для будь-якого застосування, описаного в даній заявці, включає сіль. У деяких варіантах реалізації, сіллю є
Масі. У деяких варіантах реалізації, Масі є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0- 300 ММ (тобто 0-250 мМ, 0-200 мМ, 0-150 мМ, 0-100 мМ, 0-75 мМ, 0-50 мМ або 0-30 мМ). У деяких варіантах реалізації, Масі є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 137-154 мМ. У деяких варіантах реалізації, Масі є присутнім у концентрації приблизно 154 мМ.
У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у якому поверхнево-активна речовина полісорбат обрана з групи, яка включає полісорбат 20, полісорбат 40, полісорбат 60, полісорбат 80 і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, поверхнево-активна речовина полісорбат є полісорбатом 20. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0-0,02 95. У деяких варіантах реалізації, полісорбат 20 є присутнім у діапазоні концентрацій приблизно 0-0,005 95.
У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації представлених у даній заявці, причому зазначений склад додатково включає буферний агент. У деяких варіантах реалізації, буферний агент обраний із групи, яка складається з фосфату, гістидину і сукцинату, трис(гідроксиметил)амінометану ("Трис") ії їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації, агентом для буферизації є фосфат. У деяких варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не вище 50 мМ (тобто не вище, ніж 45 ММ, 40 мМ, 35 мМ, 30 мМ, 25 мм, 20 мм, 15 мм, 10 мм або 5 мм). У деяких варіантах реалізації, фосфат є присутнім у концентрації не вище 20 мМ. У різних варіантах реалізації, бо даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації,
представлених у даній заявці, у яких склад має рН приблизно 3,0-8,0 (тобто приблизно 4-7,5; 5- 8; 5-7,5;5 5-6,55 5-7,0;5 5,5-8,0;5 5,5-7,7; 5,5-6,5; 6-7,5 або 6-7,0). У деяких варіантах реалізації, склад має рН приблизно 5,5-6,5 (тобто 5,5; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4 або 6,5). У деяких варіантах реалізації, склад має рН приблизно 6,0.
У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у яких склад є рідким складом. У різних варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці, у яких склад має лікарську форму ліофілізованого сухого порошку.
У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає стабільний склад для інтратекального введення, який містить білок арилсульфатазу А в концентрації приблизно 1-300 мг/мл, Масі у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005595 ї рн приблизно 6,0. У деяких варіантах реалізації, білок АБА є присутнім у концентрації приблизно 10 мг/мл. У деяких варіантах реалізації, білок АБА є присутнім у концентрації приблизно 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл або 300 мг/мл.
У різних аспектах даний винахід включає контейнер, що містить дозовану лікарську форму стабільного складу в різних варіантах реалізації, представлених у даній заявці. У деяких варіантах реалізації, контейнер може бути обраним із групи, що включає ампули, віали, пляшки, картриджі, резервуари, шприци "Іуо-іесї" або попередньо заповнені шприци. У деяких варіантах реалізації контейнер є попередньо заповненим шприцом. У деяких варіантах реалізації, попередньо заповнений шприц обраний із групи, що включає шприци з боросилікатного скла з термічно обробленим силіконовим покриттям, шприци з боросилікатного скла з нанесеним шаром силікону й пластикові шприци без силікону. У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за 50 мл (тобто меншому за 45 мл, 40 мл, 35 мл, 30 мл, 25 мл, 20 мл, 15 мл, 10 мл, 5 мл, 4 мл, З мл, 2,5 мл, 2,0 мл, 1,5 мл, 1,0 мл або 0,5 мл). У деяких варіантах реалізації, стабільний склад є присутнім у об'ємі, меншому за 3,0 мл.
У різних аспектах реалізації, даний винахід включає способи лікування метахроматичної лейкодистрофії, які включають інтратекальне введення суб'єкту, що цього потребує, складу згідно з будь-яким із варіантів реалізації, представлених у даній заявці.
У деяких варіантах реалізації, даний винахід включає спосіб лікування метахроматичної лейкодистрофії, який включає інтратекальне введення суб'єкту, що цього потребує, складу, який включає білок арилсульфатазу А (АБА) в концентрації приблизно 1-300 мг/мл, Масі у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат 20 у концентрації приблизно 0,005595 ї рн приблизно 6,0.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення не викликає у суб'єкта суттєвих побічних ефектів, таких як тяжка імунна реакція. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення не викликає у суб'єкта суттєвої адаптивної Т-клітинної імунної відповіді.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу забезпечує доставку білка арилсульфатази А до різних тканин-мішеней у головному мозку, спинному мозку і/або периферичних органах. У деяких варіантах реалізації інтратекальне введення складу забезпечує доставку білка арилсульфатази А до тканин-мішеней головного мозку. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені головного мозку включають білу речовину і/або нейрони в сірій речовині. У деяких аспектах білок арилсульфатаза А доставляється до нейронів, клітин глії, периваскулярних клітин і/або менінгеальних клітин. У деяких варіантах реалізації, білок арилсульфатаза А доставляється до нейронів у спинному мозку.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу додатково забезпечує системну доставку білка АБА до периферичних клітин-мішеней. У деяких варіантах реалізації, периферичні клітини-мішені обрані з групи, яка включає печінку, нирки, селезінку і/або серце.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до його лізосомальної локалізації в тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження накопичення сульфатидів у тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, накопичення сульфатидів знижується щонайменше на 1095, 2095, 3095, 4095, 50 905, 60 90, 7095, 80 905, 90 95, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем (тобто накопиченням у суб'єкта ГАГ до терапії). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження вакуолізації в нейронах (щонайменше на 20 95, 40 95, 50 95, 60 95, 80 90, 90 95, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем). У деяких варіантах реалізації, нейрони містять клітини Пуркіньє.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до підвищення ферментативної активності АБА в тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку іабо периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність АБА підвищується щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в З рази, в 4 рази, в 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів або в 10 разів у порівнянні з контролем (тобто ендогенною ферментативною активністю у суб'єкта до лікування). У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність АБА становить щонайменше приблизно 10 нмоль/год./мг, 20 нмоль/год./мг, 40 нмоль/год./мг, 50 нмоль/год./мг, 60 нмоль/год./мг, 70 нмоль/год./мГг, 80 нмоль/год./мг, 90 нмоль/год./мг, 100 нмоль/год./мг, 150 нмоль/год./мг, 200 нмоль/год./мг, 250 нмоль/год./мг, 300 нмоль/год./мг, 350 нмоль/год./мг, 400 нмоль/год./мг, 450 нмоль/год./мг, 500 нмоль/год./мг, 550 нмоль/год./мг або 600 нмоль/год./мг.
У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність АБА підвищується в поперековому відділі. У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність АБА в поперековому відділі становить щонайменше приблизно 500 нмоль/год./мг, 600 нмоль/год./мг, 700 нмоль/год./мг, 800 нмоль/год./мг, 900 нмоль/год./мг, 1000 нмоль/год./мг, 1500 нмоль/год./мг, 2000 нмоль/год./мг, 3000 нмоль/год./мг, 4000 нмоль/год./мг, 5000 нмоль/год./мг, 6000 нмоль/год./мг, 7000 нмоль/год./мг, 8000 нмоль/год./мг, 9000 нмоль/год./мг або 10000 нмоль/год./мг.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення складу призводить до зниження інтенсивності, тяжкості або частоти, або вповільнення прояву щонайменше одного симптому чи ознаки хвороби МЛД. У деяких варіантах реалізації щонайменше один симптом чи ознака хвороби МЛД являє собою підвищений внутрішньочерепний тиск, замісну гідроцефалію, накопичення сульфатованих гліколіпідів у мієлінових оболонках у центральній і периферичній нервовій системі та у внутрішніх органах, прогресуючу демієлінізацію та втрату аксонів у ЦНС і
ПНО і/або рухову й когнітивну дисфункцію.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на 2 тижні. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють один раз на 2 місяці. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують у комбінації з внутрішньовенним введенням. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на тиждень. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на два тижні. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на два місяці. У певних варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють частіше, ніж один раз на місяць, наприклад, введення двічі на тиждень, один раз на тиждень, один раз через тиждень або два рази на місяць.
У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють у той самий день. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення не здійснюють протягом деякого періоду часу між введеннями, наприклад, у межах щонайменше 2 днів, у межах щонайменше З днів, у межах щонайменше 4 днів, у межах щонайменше 5 днів, у межах щонайменше б днів, у межах щонайменше 7 днів або в межах щонайменше одного тижня. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють за перемінним графіком, наприклад, перемінне введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення заміняють інтратекальним введенням у графіку введень, наприклад, при графіку внутрішньовенного введення один раз на тиждень, один раз на два тижні, два рази на місяць або один раз на місяць, кожне третє або четверте, або п'яте внутрішньовенне введення в цьому графіку може бути замінене на інтратекальне введення замість внутрішньовенного введення.
У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне та інтратекальне введення здійснюють послідовно, наприклад, спочатку здійснюють внутрішньовенне введення (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячне дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року і більше) з наступним ІТ введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більш ніж двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють першим (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць, щомісяця, один раз на два місяці, один раз на три місяці, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше) з наступним внутрішньовенним введенням (наприклад, щотижня, бо один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більш ніж двох
А тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше).
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують при відсутності внутрішньовенного введення.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення застосовують при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії.
Фігура 1 ілюструє показові дані з концентрації арилсульфатази А (гпППАЗА) у сироватці після
ВВ введення.
Фігура 2 ілюструє показові дані з концентрації гпПАБА у сироватці після ІТ поперекового введення.
Фігура З ілюструє показові дані з концентрації ГПАЗА у СМР після ВВ введення.
Фігура 4 ілюструє показові дані з концентрації ГПАЗА у СМР після ІТ поперекового введення.
Фігура 5 ілюструє показове дослідження впливу буфера і рН на температурну стабільність
ГПАБА.
Фігура 6 ілюструє показовий аналіз ГпПАБА методом електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) з додецилсульфатом натрію (ДСН) (офарблення Кумассі) після зберігання протягом 2 тижнів при температурі 40:52 76.
Фігура 7 ілюструє показовий аналіз ПАЗ5А у складі для ІТ введення методом електрофорезу в ПААГ з ДСН (офарблення Кумассі) після зберігання протягом З місяців при температурі 5 Сі 2576.
На Фігурі 8 показаний показовий зовнішній вигляд лікарської субстанції й лікарського препарату ПАЗА після 48 годин перемішування (А) і струшування (В).
На Фігурі 9 показаний показовий зовнішній вигляд лікарського препарату ПАЗА (без Р20) з (п-2) і без вільного простору (п-1) над продуктом після перемішування протягом 48 годин.
Фігура 10 ілюструє показові дані з буферної ємності лікарської субстанції гпАЗА у порівнянні з контрольним буфером при титруванні хлористоводневою кислотою.
На Фігурі 11 наведені показові дані з буферної ємності лікарської субстанції гпАБА у порівнянні з контрольним буфером при титруванні 1 М гідроксидом натрію.
На Фігурі 12 зображені показові зразки гпАБА у сольовому розчині, рН 6,0, з різною концентрацією.
Фігура 13 ілюструє показовий аналіз ГПАБА методом ексклюзійної ВЕРХ (рН рухомої фази 5,5) в 154мМ Масі, рНн5,9.
Фігура 14 ілюструє показовий аналіз ГПАБА в 154 мМ Масі, рН 5,9 методом ексклюзійної
ВЕРХ (рН рухомої фази 7,0).
Фігура 15 ілюструє показові профілі ексклюзійної хроматографії зразків ГПАЗА у початковій точці відліку часу та зразків, що зберігалися протягом 11 місяців вивчення стабільності в 154 мМ масі, рн 5.
На Фігурі 16 наведена типова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми та високими дозами, обидві статі) після лікування.
На Фігурі 17 наведена інша показова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми та високими дозами, обидві статі) після лікування.
На Фігурі 18 наведена показова мікрофотографія тканин мозку, периваскулярних, інфільтратів (групи з середніми дозами - чоловіки; групи з високими дозами - жінки) після лікування.
На Фігурі 19 наведене показове офарблення, з використанням альціанового синього, спинного мозку імунотолерантних мишей МЛД, які одержували гпАБЗА, і результати, що демонструють зменшення сульфатидів, яке було визначене шляхом оофарблення, з використанням альціанового синього, шийного відділу спинного мозку у тварин, які одержували інтратекальні ін'єкції рекомбінантного гПАЗА у 1, 8, 15 і 22 день у дозі 520 мг/кг маси мозку, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач. Як показано, обробка шляхом інтратекального введення рекомбінантної ГПАБЗА призводила до зниження накопичення сульфатидів у спинному мозку, в тому числі у шийному відділі спинного мозку.
Фігура 20 ілюструє показовий морфометричний аналіз офарблення, з використанням альціанового синього, відділів хребта у імунотолерантних мишей МЛД, що одержували гпАЗА, включаючи типові результати, які ілюструють оптичну щільність альціанового синього всього спинного мозку (3-СМ), усієї сірої речовини (3-СР), сірої речовини поперекового відділу (П-СР), сірої речовини шийного відділу (Ш-СР), усієї білої речовини (3-БР), білої речовини поперекового відділу (П-БР) і білої речовини шийного відділу (Ш-БР), як визначено з використанням морфометричного аналізу. Статистично значуще зменшення офарблення, показане офарбленням альціановим синім, було виявлене у тварин, що одержували гпАБА, у порівнянні з контрольними мишами, яким вводили наповнювач.
На Фігурі 21 показане показове зменшення офарблення на ГАМР у білій речовині (фімбрія) імунотолерантних мишей із МЛД, що одержували гпА5БА, наведені показові результати, що ілюструють рівень ГАМР-1 у бахромці, визначений із використанням імуногістохімії. Збільшення 20х. Показано, що обробка шляхом інтратекального введення гпА5БА призводила до зменшення
Г АМР-1 у білій речовині головного мозку.
На Фігурі 22 наведені результати показового морфометричного аналізу офарблення на
АМР тканин мозку імунотолерантних мишей МЛД, що одержували гАбА, і зображені показові результати, які ілюструють інтенсивність офарблення на ГАМР-1Ї у мозолистому тілі (МТ), бахромці (Б), білій речовині мозочка (Моз-БР) і стовбурі мозку (СтМ) тварин, що одержували 20 мг/кг внутрішньовенно гпАБА, 300 мг/кг маси мозку інтратекально ПАЗА, 520 мг/кг маси мозку внутрішньовенно гпАЗА, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач.
Фігура 23 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення наповнювача один раз на два тижні протягом 6 місяців - загальна некропсія.
Фігура 24 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення ПАЗА у дозі 1,8 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців - загальна некропсія.
Фігура 25 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення ПАЗА у дозі 6,0 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців - загальна некропсія.
Фігура 26 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення гпАБА у дозі ІЗ,бмг один раз на два тижні протягом 6 місяців - загальна некропсія.
Фігура 27 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні (ФСБ як контроль) протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 28 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після Ії введення один раз на два тижні (РДН) наповнювача протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 29 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення ПАЗА у дозі 1,8 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців- прижиттєвий розтин.
Фігура 30 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення ПАЗА у дозі 6,0 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 31 ілюструє як приклад концентрацію гпПАБА у фрагментах тканин головного мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення ПАЗА у дозі 18,6 мг один раз на два тижні протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 32 ілюструє як приклад концентрацію гпАБА в обраних фрагментах тканини головного мозку, взятих із поверхні мозку тварин із контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,98 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії).
Фігура 33 ілюструє як приклад концентрацію гпАБА в обраних фрагментах тканини з глибокої білої речовини головного мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,98 мг, 6,0 мг ії 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії).
Фігура 34 ілюструє як приклад концентрацію гпАБА в обраних фрагментах тканини з глибокої сірої речовини головного мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,98 мг, 6,0 мг ії 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній некропсії).
Фігура 35 ілюструє як приклад концентрацію гпА5БА в обраних фрагментах тканини з різних областей головного мозку тварин із контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, усі інші дані отримані при загальній бо некропсії).
Фігура 36 ілюструє як приклад концентрацію гпА5А у відділах хребта молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 37 ілюструє як приклад концентрацію гпА5А у відділах хребта молодих довгохвостих макак після ІТ введення один раз на два тижні протягом 6 місяців - прижиттєвий розтин.
Фігура 38 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 39 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 40 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 41 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 42 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 43 ілюструє як приклад анатомічне положення деяких фрагментів тканин головного мозку.
Фігура 44ДА-С ілюструє концентрацію рекомбінантної людської арилсульфатази (гпАЗА) у виділених фрагментах тканин головного мозку дорослих і молодих довгохвостих макак, яким ін'єккгували або наповнювач, або 1,8 мг гпАБА, або 18,6 мг гпАБА. Кожна з Фігур 44А-О відповідає області тканини головного мозку, показаної на Фігурі 39.
Фігура 45А і В ілюструє показове порівняння концентрації рекомбінантної людської арилсульфатази А (ПАБ5А), визначеної в глибокій білій речовині (Фігура 45А) або в глибокій сірій речовині (Фігура 458) тканин мозку дорослих або молодих довгохвостих макак, які одержували інтратекальні або інтрацеребровентрикулярні ін'єкції гпА5А.
Фігура 46А ілюструє як приклад концентрації гпПАБА, визначені в декількох фрагментах тканин, отриманих у молодих (12 місяців від народження) довгохвостих макак, які одержували інтратекальні ін'єкції 18,6 мг рекомбінантної людської арилсульфатази А (ПАБА). Як показано на обох Фігурах 46А і В, концентрація гпАбБА, доставленої до тканин, була в межах або перевищувала необхідну терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг білка. Анатомічними областями тканин мозку, які відповідають зразкам тканини, показаним на Фігурі 4бА і Фігурі 468, є: підкіркова біла речовина (1); перивентрикулярна біла речовина і глибока біла речовина (2); підкіркова біла речовина (3); підкіркова біла речовина (4); внутрішня капсула (5); хвостате ядро внутрішньої капсули (б); глибока біла речовина (7); підкіркова біла речовина й кора (8); шкарлупа (9); підкіркова біла речовина й кора скроневої долі (10); глибока сіра речовина (11); глибока сіра речовина (12); перивентрикулярна й підкіркова лобові долі (13); підкіркова біла речовина, кіркова поверхнева речовина (14); мозолисте тіло й навколомозолиста підкіркова біла речовина (15); глибока підкіркова біла речовина (16); глибока сіра речовина (17); глибока сіра речовина (18); перивентрикулярна біла речовина (19); глибока підкіркова біла речовина (20); гіпокамп (21); мозолисте тіло (22); глибока біла речовина (23); підкіркова біла речовина, потилична доля (24); і біла речовина мозочка (25).
На Фігурі 47А показані ділянки тканин глибокої білої речовини, отриманої від довгохвостих макак, які одержували інтратекальні ін'єкції 1,8 мг ГПА5А. Фігура 47В ілюструє імуноофарблення тканин глибокої білої речовини й виявлений розподіл ПАЗА у відповідних клітинах. Фігура 47С ілюструє, що ІТ введена гПА5БА демонструє органельну колокалізацію в тканинах глибокої білої речовини у довгохвостих макак і, зокрема, у лізосомах. На Фігурі 47С у верхньому лівому вікні показане імуноофарблення на А5А.
На Фігурі 48 наведене порівняння розподілу 127І1-міченої арилсульфатази (АБА) з використанням ПЕТ-сканування через 24 години після Ії або ІЦВ введення довгохвостим мавпам А5ЗА, міченої зазначеним способом.
Фігура 49 ілюструє розподіл 7"27Іі-міченої АБА відразу після ІЦВ введення довгохвостим мавпам і порівняння розподілу ІТ введеної 127І-міченої АБА протягом 2-5 годин. Як показано, ІТ введення доставляє 727І-мічену АБА до тих самих початкових відділів (цистерна і проксимальний відділ хребта), як це показано для ІЦВ введення.
На Фігурі 50 наведені результати показового ІЦВ і Ії введення на моделі миші.
На Фігурі 51 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ).
На Фігурі 52 показаний приклад низькопрофільної системи доступу РОКТ-А-САТНФ, що інтратекально імплантується.
На Фігурі 53 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів 60 (ПІДЛЗ).
На Фігурі 54 показаний приклад пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ), який дозволяє вводити в домашніх умовах ферменти до ЦНС при замісній ферментній терапії (ЗФТ).
Фігура 55 ілюструє типову схему пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ) із захисним механізмом.
На Фігурі 56А показаний приклад розташування ПІДЛЗ на тілі пацієнта. На Фігурі 568 показані різні компоненти пристрою інтратекальної доставки лікарських препаратів (ПІДЛЗ); на
Фігурі 56С показаний приклад розташування впровадженого до тіла пацієнта пристрою для ІТ поперекової ін'єкції.
Для полегшення розуміння даного винаходу нижче надані визначення деяких термінів.
Додаткові визначення наступних термінів та інші терміни наведені в тексті опису.
Приблизно або близько: У даній заявці термін "приблизно" або "близько" стосовно одного або більше розглянутих значень відноситься до значення, яке є близьким до зазначеного еталонного значення. У деяких варіантах реалізації термін "приблизно" або "близько" відноситься до діапазону значень, які входять до діапазону 25 95, 20 95, 19 95, 18 95, 17 95, 16 90, 1595,1495,1395,1295,1 195, 1095, 995, 895, 7 95, б 95, 5 95, 4 95, З 95, 2 95, 1 Уб або менше в будь-якому напрямку (більше або менше) від установленого еталонного значення, якщо не зазначено інше або інше не є очевидним із контексту (окрім випадків, коли таке значення перевищує 100 95 від можливого значення).
Покращення: У даній заявці "покращення" означає попередження, скорочення або тимчасове полегшення стану, або покращення стану суб'єкта. Покращення включає, але не обов'язково, повне видужання або повне попередження хворобливого стану. У деяких варіантах реалізації, покращення включає підвищення рівнів відповідного білка або його активності, які є недостатніми у відповідних хворих тканинах.
Біологічна активність: У даній заявці вираз "біологічна активність" відноситься до характеристики будь-якого агента, який має активність у біологічній системі й, зокрема, в організмі. Наприклад, агент, який при введенні до організму демонструє біологічний вплив на організм, вважається біологічно активним. У конкретних варіантах реалізації, у випадках, коли білок або поліпептид є біологічно активним, ту частину білка або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білка або поліпептиду, як правило, називають "біологічно активною" частиною.
Наповнювач: У даній заявці термін "наповнювач" відноситься до сполуки, яка додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізованої таблетки (наприклад, полегшує виробництво по суті однорідної ліофілізованої таблетки, яка підтримує структуру з відкритими порами). Приклади таких наповнювачів включають манітол, гліцин, хлорид натрію, гідроксиетилкрохмаль, лактозу, сахарозу, трегалозу, поліетиленгліколь і декстран.
Катіон-незачежний маноза-б6-фосфатний рецептор (СІ-МКР): У даній заявці термін "катіон- незалежний маноза-б6-фосфатний рецептор (СІ-МКР)" відноситься до клітинних рецепторів, які зв'язують фрагменти маноза-б6-фосфату на попередниках кислих гідролаз у апараті Гольджи, призначених для транспорту до лізосом. На додаток до маноза-б6-фосфатів, СІ-ММКР також зв'язує інші білки, у тому числі ІСОР-ІЇ. СІ-МЕР також відомий як рецептор "Мб6Р/ЛОБ-ІІ", рецептор "СІ-МКРЛОБ-Н", "рецептор 1СБ-И" або "рецептор ІСЕ2". Ці терміни і їхні скорочення використовуються в даній заявці взаємозамінно.
Супутня імунопригнічуюча терапія: У даній заявці термін "супутня імунопригнічуюча терапія" включає будь-які способи імунопригнічуючої терапії, які використовуються як попереднє лікування, прекондиціювання або паралельно зі способом лікування.
Розчинник: У даній заявці термін "розчинник" відноситься до фармацевтично прийнятної (наприклад, безпечної та нетоксичної для ін'єкції людині) розчиняючої речовини, застосовної для приготування відновлюваного складу. Приклади розчинників включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (БВІ), буферний розчин (наприклад, фосфатно-сольовий буфер), стерильний фізіологічний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози.
Лікарська форма: У даній заявці термін "лікарська форма" і "дозована лікарська форма" відноситься до фізично дискретної одиниці терапевтичного білка для лікування пацієнта. Кожна одиниця містить деяку кількість активної речовини, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту. Слід розуміти, однак, що загальна доза в композиції буде визначена лікарем у рамках обгрунтованого медичного висновку.
Замісна ферментна терапія (ЗФТ): У даній заявці термін "замісна ферментна терапія (З3ФТ)" відноситься до будь-якої терапевтичної стратегії яка коректує дефіцит ферменту з використанням доставки відсутнього ферменту. У деяких варіантах реалізації, відсутній бо фермент доставляють шляхом інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації,
відсутній фермент доставляють шляхом інфузії до кров'яного потоку. Після введення фермент поглинається клітинами і транспортується до лізосом, де фермент діє, видаляючи речовини, які накопичуються в лізосомах у результаті ферментної недостатності. Як правило, замісна ферментна терапія лізосомальними ферментами є ефективною, терапевтичні ферменти доставляються до лізосом у клітинах відповідних тканин-мішеней, де проявляється дефект накопичення.
Покращення, збільшення або зменшення: У даній заявці терміни "покращення", "збільшення" або "зменшення" чи граматичні еквіваленти вказують на значення, які співвідносяться зі значеннями базових вимірювань, наприклад, у того ж самого індивіда, до початку обробки/лікування, описаного в даній заявці, або значеннями, виміряними у контрольних індивідів (або декількох контрольних індивідів) при відсутності обробки/лікування, описаного в даній заявці. "Контрольні індивіди" являють собою індивідів, які страждають на ті ж самі форми лізосомної хвороби накопичення, що й індивіди, які проходять лікування, і вони приблизно того ж віку, що й індивіди, які проходять лікування (для того, щоб стадії захворювання індивіда, який проходить лікування, і контрольного індивіда (індивідів) були порівнянними).
Індивід, суб'єкт, пацієнт: У даній заявці терміни "індивід", "суб'єкт" або "пацієнт" відносяться до людини або тварини, відмінної від людини. Індивід (який також згадується як "пацієнт" або "суб'єкт"), що проходить лікування, являє собою індивіда (плід, немовля, дитину, підлітка або дорослу людину), що страждає на розглянуте захворювання.
Інтратекальне введення: У даній заявці термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція" відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть бути використані різні методики, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру або т.п. У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до ІТ введення або доставки через поперекову область або відділ, наприклад, поперекове ІТ введення або доставка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, відділу хребта 12-51.
Лінкер:; У даній заявці термін "лінкер" відноситься до амінокислотної послідовності в гіоридному білку, крім тієї, яка зустрічається в конкретному положенні в природних білках і, як правило, лінкер сконструйований таким чином, що він є гнучким або являє собою проміжну структуру, таку як а-спіраль, між двома частинами білка. Лінкер також відноситься до спейсера.
Ліопротектор: У даній заявці термін "ліопротектор" відноситься до молекули, яка попереджає або зменшує хімічну і/або фізичну нестабільність білка або іншої речовини при ліофілізації та наступному зберіганні. Приклади ліопротекторів включають цукри, такі як сахароза або трегалоза; амінокислоти, такі як глутамат натрію або гістидин; метиламіни, такі як бетаїн; ліотропні солі, такі як сульфат магнію; багатоатомні спирти, такі як трьеохатомні або вищі спирти, наприклад, гліцерин, еритрит, гліцерол, арабітол, ксиліт, сорбіт і манітол, пропіленгліколь, полієтиленгліколь; плюроніки; і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, ліопротектор являє собою невідновлений цукор, такий як трегалоза або сахароза.
Лізосомальний фермент: У даній заявці термін "лізосомальний фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який є здатним зменшити накопичені в лізосомах тварин сполуки або який може попередити чи покращити один або більше симптомів лізосомної хвороби накопичення. Лізосомальні ферменти, придатні для даного винаходу, включають як фермент дикого типу, так і модифікований лізосомальний фермент, і вони можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних методик або можуть бути виділені з природних джерел. Приклади лізосомальних ферментів перераховані в Таблиці 1.
Лізосомна ферментна недостатність: У даній заявці термін "лізосомна ферментна недостатність" відноситься до групи генетичних захворювань, які є результатом недостатності щонайменше одного ферменту, який є необхідним для руйнування макромолекул (наприклад, ферментних субстратів) до пептидів, амінокислот, моноцукрів, нуклеїнових кислот і жирних кислот у лізосомах. У результаті у індивідів, що страждають на лізосомну ферментну недостатність, накопичуються сполуки в різних тканинах (наприклад, ЦНС, печінці, селезінці, кишечнику, стінках кровоносних судин та в інших органах).
Лізосомна хвороба накопичення: У даній заявці термін "лізосомна хвороба накопичення" відноситься до будь-якої хвороби в результаті недостатності одного або декількох лізосомальних ферментів, необхідних для метаболізму природних макромолекул. Ці 60 захворювання, як правило, призводять до накопичення незруйнованих молекул у лізосомах, що призводить до збільшення числа запасних гранул (також називаних запасними пухирцями). Ці захворювання й різні приклади описані більш докладно нижче.
Поліпептид: У даній заявці "поліпептид", у цілому, являє собою ланцюжок із щонайменше 2 амінокислот, з'єднаних одна з одною за допомогою пептидного зв'язку. У деяких варіантах реалізації, поліпептид може включати щонайменше 3-5 амінокислот, кожна з яких з'єднана з іншими з використанням щонайменше одного пептидного зв'язку. Фахівцям у даній області відомо, що поліпептиди можуть включати "неприродні" амінокислоти або інші молекули, які, проте, здатні до інтеграції в поліпептидний ланцюг.
Заміщуючий фермент: У даній заявці термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь- якого ферменту, який може діяти як заміщуючий, щонайменше частково, при недостатності або відсутності ферменту при лікуванні хвороби. У деяких варіантах реалізації, термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, дія якого може заміщувати, щонайменше частково, недостатність або відсутність лізосомальних ферментів при лізосомних хворобах накопичення, що підлягають лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент дозволяє знизити накопичення речовин у лізосомах ссавців або може попередити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. Заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, включають обидва з ферменту дикого типу і модифікованого лізосомального ферменту та можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних способів або виділені з природних джерел. Заміщуючий фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, ген-активованим або природним ферментом.
Розчинний: У даній заявці термін "розчинний" відноситься до здатності терапевтичного агента утворювати гомогенний розчин. У деяких варіантах реалізації, розчинність терапевтичного агента в розчині, до якого він введений і з використанням якого він транспортується до ділянки-мішені (наприклад, до клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до сайту- мішені. Декілька факторів можуть впливати на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх косолюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції складені так, що солі кальцію виключаються з таких композицій. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти відповідно до даного винаходу є розчинними у відповідній фармацевтичній композиції. Слід мати на увазі, що хоча ізотонічні розчини, як правило, є переважними для парентерального введення складів, застосування ізотонічних розчинів може обмежувати адекватну розчинність для деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було продемонстровано, що злегка гіпертонічні розчини (наприклад, до 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) ії цукровмісні розчини (наприклад, до 2 95 сахарози в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) добре переносяться мавпами. Наприклад, найпоширенішою прийнятою композицією болюсного складу для ЦНС є фізіологічний розчин (150 мМ Масі у воді).
Стабільність: У даній заявці термін "стабільність" відноситься до здатності терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усю або переважно всю його передбачувану біологічну активність і/або фізико- хімічну цілісність) при тривалому періоді часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента можуть бути оцінені протягом тривалого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). Загалом, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом були створені таким чином, щоб вони були здатні стабілізувати або ж сповільнювати чи запобігати деградації одного або більше терапевтичних агентів, поєднаних із ними (наприклад, рекомбінантних білків). У контексті даного винаходу стабільним складом є той, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свої фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й під час обробки (наприклад, заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена за утворенням високомолекулярних агрегатів, втратою ферментативної активності, формуванням пептидних фрагментів і зміщенням профілів заряду.
Суб'єкт: У даній заявці термін "суб'єкт" означає будь-якого ссавця, включаючи людину. У деяких варіантах реалізації даного винаходу суб'єкт являє собою дорослого, підлітка і немовля.
Крім того, даний винахід передбачає введення фармацевтичної композиції і/або здійснення способів лікування внутрішньоутробно.
Суттєва гомологія: У даній заявці словосполучення "суттєва гомологія" відноситься до порівняння між послідовностями амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло бо фахівцям у даній області, дві послідовності зазвичай вважаються "по суті гомологічними", якщо вони містять гомологічні залишки у відповідних положеннях. Гомологічні залишки можуть бути однаковими залишками. Крім того, гомологічні залишки можуть бути неідентичними залишками, які мають адекватно близькі структурні і/або функціональні характеристики. Наприклад, як добре відомо фахівцям у даній області, деякі амінокислоти зазвичай класифікують як "гідрофобні" або "гідрофільні" амінокислоти і/або такі, що мають "полярні" або "неполярні" бічні ланцюги. Заміна однієї амінокислоти на іншу того ж типу часто може вважатися "гомологічною" заміною.
Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як ВГА5ТМ для нуклеотидних послідовностей і ВГАЗТР, дарреа ВІ АТ ї РБІ-ВІА5БТ для амінокислотних послідовностей.
Приклади таких програм описані в АївБепиї, еї аї., Вавіс Іоса! аїдптепі зеагспі (сої, 9. Мої. Віої, 215(3): 403-410, 1990; АїІвБспиї, еї аїЇ., Меїодз іп Еп2гутоїіоду, АБС, еї а!., "Сарреа ВІ А5Т апа
РБІ-ВГА5Т: а пем/ депегайоп ої ргоївіп даїаразе зеагсп ргодгатев", Мисівїс Асійб5 Кев. 25:3389- 3402, 1997; Вахемапів, еї аї., Віоіпіоптаїйісв: А Ргасіїсаї Сціде (о (Ше Апаїузіз ої Сепе5 апа
Ргоївіпо, УМіеу, 1998; апа Мізепег, еї аї., (еаз.) Віоіїптогтаїййс5 Мещтоаз» апа Ргоїосої5 (Меїйподв іп
МоїІесшіаг Віоіоду, МоїЇ. 132), Нитапа Ргез5, 1999. На додаток до ідентифікації гомологічних послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня гомології.
У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно гомологічними, якщо щонайменше 50 95, 5595, 6095, 6595, 70905, 7595, 8095, 8595, 9095, 91 95, 9295, 93 95, 94 95, 9595, 96 95, 97 95, 98 95, 9995 або більше їхніх відповідних залишків є гомологічними до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка залишків є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків.
Суттєва ідентичність: У даній заявці словосполучення "суттєва ідентичність" відноситься до порівняння послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності, як правило, вважаються "по суті ідентичними", якщо вони містять однакові залишки у відповідних позиціях. Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як ВГАЗТМ для нуклеотидних послідовностей і ВІГА5ТР, даррей ВГАБ5Т і РБІ-
ВГА5Т для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Ай5епиї, еї аї.,
Вавіс Іосаї аїїдпітепі зеагсі (сої, У. Мої. ВіоїІ., 215(3): 403-410, 1990; АїївснНиї, еї аї., Меїйодвз іп
Епгуто!оду; АїЇївспиі еї аї!., Мисієїс Асіаз Кев. 25:3389-3402, 1997; Вахемапіз еї а!., Віоіптогітаїйсв:
А Ргасіїса! Сціде (0 (Пе Апаїузіз ої Сепез апа Ргоївіп5, Умієу, 1998; апа Мізепег, еї аї., (едв.),
Віоіптогтаййсв Меїйпоаз апа РгоїосоЇїє (Меїйоа5 іп МоЇІесшаг Віоіоду, МоїЇ. 132), Нитапа Ргезз, 1999. На додаток до визначення однакових послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня ідентичності. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно ідентичними, якщо не менше 50 95, 55 95, 60 95, 65 95, 70 90, 7595,8095,8595,90 95,91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше їхніх відповідних залишків ідентичні до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків.
Синтетична СМР: У даній заявці термін "синтетична СМР" відноситься до розчину, який має рН, електролітний склад, вміст глюкози і осмос, що відповідають таким характеристикам у спинномозковій рідині. Синтетичну СМР також називають штучною СМР. У деяких варіантах реалізації, синтетична СМР являє собою розчин Елліотта В.
Підходящий для доставки до ЦНС: У даній заявці фраза "підходящий для доставки до ЦНС" або "підходящий для інтратекальної доставки" стосовно фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, як правило, відноситься до стабільності, переносимості та властивостей розчинності таких композицій, а також до здатності таких композицій доставляти ефективну кількість терапевтичного агента, що міститься в ньому, до цільових місць доставки (наприклад, до СМР або мозку).
Тканини-мішені: У даній заявці термін "т«канини-мішені" відноситься до будь-якої тканини, на яку впливає лізосомна хвороба накопичення, яка розглядається для лікування, або будь-якої тканини, в якій недостатньо лізосомальних ферментів, виражених у нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, в яких існує помітна або аномально висока бо кількість ферменту, субстрату, наприклад, накопичених у клітинних лізосомах тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають сприйнятливість до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, які відображають патології, супутні хвороби, симптоми або функції. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатньо лізосомальних ферментів, як правило, в нормі експресованих на високому рівні. У даній заявці ""«канини-мішені" можуть являти собою тканини- мішені головного мозку, тканини-мішені спинного мозку і/або периферичні тканини-мішені.
Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче.
Терапевтична група/фрагмент: У даній заявці термін "терапевтична група/фрагмент" відноситься до групи/фрагменту молекули, яка обумовлює терапевтичний ефект молекули. У деяких варіантах реалізації, терапевтична група/фрагмент являє собою поліпептид, що має терапевтичну активність.
Терапевтично ефективна кількість: У даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка (наприклад, заміщуючого ферменту), який дає терапевтичний ефект у суб'єкта що пройшов лікування, відповідно до розумного співвідношення користь/ризик, застосовного для будь-якого медичного лікування.
Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто вимірюваним із використанням деяких випробувань чи маркерів) або суб'єктивним (тобто суб'єкт проявляє ознаки або відчуває ефект).
Зокрема, "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка або композиції, яка забезпечує лікування, покращення або попередження бажаного захворювання чи стану або демонструє помітний терапевтичний чи профілактичний ефект, такий як покращення симптомів, пов'язаних із хворобою, попередження або затримка прояву захворювання і/або зменшення тяжкості або частоти симптомів захворювання. Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять у режимі введення, який може включати багаторазове введення доз. Для будь-якого конкретного терапевтичного білка, терапевтично ефективна кількість (і/або відповідна доза з ефективним режимом введення) може варіювати, наприклад, у залежності від способу введення, в комбінації з іншими фармацевтичними засобами. Крім того, конкретна терапевтично ефективна кількість (1/або доза) для кожного конкретного пацієнта може залежати від різних факторів, включаючи захворювання, яке лікують, тяжкість захворювання; активність застосовуваного конкретного фармацевтичного агента, конкретного застосовуваного складу; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта, час введення, шлях введення і/або швидкість виведення або метаболізму застосовуваного конкретного гібридного білка, тривалість лікування і подібні фактори, які добре відомі в медицині.
Допустимий/переносимий: У даній заявці терміни "допустимий/переносимий' (|і "переносимість" відносяться до здатності фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом не викликати побічних реакцій у суб'єкта, якому вводять таку композицію, або, як варіант, не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводять таку композицію. У деяких варіантах реалізації, фармацевтична композиція згідно з даним винаходом добре переноситься суб'єктом, якому вводять таку композицію.
Лікування: У даній заявці термін "лікування" (а також "лікувати/обробляти") відноситься до будь-якого введення терапевтичного білка (наприклад, лізосомального ферменту), яке повністю або частково пом'якшує, покращує стан, знімає, гальмує, затримує настання, зменшує тяжкість іМабо зменшує частоту одного чи декількох симптомів або особливостей конкретного захворювання, розладу і/або умови (наприклад, синдрому Хантера, синдрому Санфіліппо типу
В). Таке лікування/обробка може проводитися для суб'єкта, який не проявляє ознак відповідного захворювання, розладу і/або стану, і/або суб'єкта, який демонструє тільки перші ознаки захворювання, розладу і/або патологічного стану. Як альтернатива або доповнення таке лікування може проводитися для суб'єкта, який має одну або більше виражених ознак відповідного захворювання, розладу і/або патологічного стану.
Даний винахід передбачає, серед іншого, покращені способи для ефективної прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Як уже обговорювалося вище, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, що заміщуючий фермент (наприклад, білок АБ5А) для лізосомної хвороби накопичення (наприклад, метахроматичної лейкодистрофії) може бути безпосередньо введений до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єкта, що потребує лікування, у високих концентраціях, не викликаючи суттєвих несприятливих ефектів у суб'єкта. Найбільш дивно, автори даного винаходу виявили, що заміщуючий фермент може бути доставлений у простому фізіологічному розчині або буферній композиції без застосування синтетичної СМР. Ще більш несподіваним є те, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу не призводить до суттєвих побічних ефектів, таких як тяжка імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, у деяких варіантах реалізації бо інтратекальну доставку відповідно до даного винаходу можна застосовувати при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії (наприклад, без індукції імунної толерантності з використанням попередньої обробки або попередньої підготовки).
У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує ефективну дифузію до різних тканин головного мозку, що призводить до ефективного заміщення ферменту в різних тканинах-мішенях на поверхні головного мозку, до неглибоких і/або глибоких областей головного мозку. У деяких варіантах реалізації інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує достатню кількість заміщуючого ферменту, який циркулює в периферичній системі кровообігу. У результаті в деяких випадках інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу призводить до доставки заміщуючого ферменту до периферичних тканин, таких як печінка, серце й нирки. Цей результат є несподіваним і може бути особливо корисним для лікування лізосомних хвороб накопичення, що зачіпають як ЦНС, так і периферичні компоненти, які, як правило, потребують як регулярного інтратекального введення, так і внутрішньовенного введення. Припускається, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу може дозволити зменшити дози і/або частоту внутрішньовенної ін'єкції без шкоди для терапевтичного ефекту при лікуванні периферичних симптомів.
Даний винахід забезпечує різні несподівані й корисні ознаки, які забезпечують ефективну та зручну доставку заміщуючого ферменту до різних тканин мозку, що призводить до ефективного лікування лізосомних хвороб накопичення, прояв яких пов'язаний із ЦНС.
Різні аспекти даного винаходу докладно описані в наступних розділах. Використання розділів не призначене для обмеження даного винаходу. Кожний розділ можна застосувати до будь-якого аспекту даного винаходу. У даній заявці використання "або" означає "і/або", якщо не зазначено інше.
У деяких варіантах реалізації, способи згідно з винаходом і композиції, представлені в даному винаході, застосовують для доставки білка арилсульфатази А (АБА) до ЦНС для лікування метахроматичної лейкодистрофії. Підходящим білюм АБА може бути будь-яка молекула або сукупність молекул, які здатні замінити активність білка арилсульфатази А (А5А) природного походження або позбавити від одного або більше фенотипів чи симптомів, асоційованих із дефіцитом АБА. У деяких варіантах реалізації, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є поліпептид, що має М- і С-кінці й амінокислотну послідовність, суттєво подібну або ідентичну зрілому білку АБА людини.
Зазвичай АБА людини синтезується у вигляді молекули-попередника, яка потім процесується в зрілу форму. Цей процес зазвичай відбувається шляхом видалення сигнального пептиду, який складається з 18 амінокислот. Зазвичай форму попередника також називають повнорозмірним попередником або повнорозмірним білком АЗА, який містить 507 амінокислот. 18 М-кінцевих амінокислот відрізаються, у результаті чого утворюється зріла форма довжиною 489 амінокислот. Таким чином припускають, що 18 М-кінцевих амінокислот зазвичай не є необхідними для активності білка А5А. Амінокислотні послідовності зрілої форми (ЗЕО ІЮ МО 1) і повнорозмірного попередника (5ЕО ІО МО:2) показового білка АБА людини дикого типу, тобто природного походження, представлені в Таблиці 1.
Таблиця 1
Арилсульфатаза А людини
КЕВМІМВО КАБЕЛЕМ МКУ ТЕМІ НМ М и КЕп ІМЗО пУуськовжьвинолиннвт втоми Квр сосок певний авиш КАМНІ ККУ го
Зріла форма панни нн і в нд
ПАОВЕВЕМУТЬЦОКОБОВ етос ЕКиРовОКУКОпУ КАТОК КА персиків ТЕКУ АВСЕВЕКЦМІШИНрО ТВО
Таблиця 1 (продовження)
Повнорозмірний КРЕТЬТУАВИНТИУвОКВОрОКВЕВОСКОВЕОООММЕКМ АВМ РАВ, попередник ЕБТЕУТЕТАТМОКВТМВМАВОСсСВОІОВСсКОТТУвООУВЕрА Моне НІДЕ
Таким чином, у деяких варіантах реалізації терапевтичним фрагментом, підходящим для даного винаходу, є білок АБА людини (5ЕО ІЮО МО:1). У деяких варіантах реалізації, підходящим терапевтичним фрагментом може виступати гомолог або аналог зрілого білка АБА людини.
Наприклад, гомологом або аналогом зрілого білка АБА людини може виступати модифікована зріла форма білка АБА людини, яка містить одну або більше амінокислотну заміну, делецію і/або інсерцію в порівнянні з білюом АБА дикого типу або природного походження (наприклад,
ЗЕОІОМО:1) та зберігає суттєву активність білка АБА. Таким чином, у деяких варіантах реалізації терапевтичним фрагментом, підходящим для даного винаходу, є білок, суттєво гомологічний до зрілої форми білка АБА людини (З5ЕО ІО МО:1). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 95, 65 95, 70 905, 75 95, 80 95, 85 90, 9095, 9195, 9295, 9395, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ
МО:1. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, суттєво ідентичний зрілій формі білка АБА людини (ЗЕО ІЮО МО:1). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 95, 65 905, 7095, 75 95, 80 95, 8595, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше ідентичну 5ЕО ІО МО':1. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний фрагмент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, містить фрагмент або частину зрілої форми білка АБА людини.
Крім того, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є повнорозмірний білок АБА. У деяких варіантах реалізації підходящий заміщуючий фермент може бути гомологом або аналогом повнорозмірного білка АБА людини. Наприклад, гомолог або аналог повнорозмірного білюа АБА людини може бути модифікованим повнорозмірним білком АБА людини, який містить одну або більше амінокислотну заміну, делецію і/або вставку в порівнянні з повнорозмірним білююм АБА дикого типу або природного походження (наприклад, 5ЕО ІЮ
МО:2) та по суті зберігає активність білка АБА. Таким чином, у деяких варіантах реалізації заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є білок, суттєво гомологічний до повнорозмірного білка АБА людини (ЗЕО ІЮО МО:2). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 5595, 6095, 65905, 7095, 7595, 8095, 8595, 90 905, 91 905, 9295, 93 95, 94 95, 95 95, 96 95, 97 95, 98 95, 99 95 або більше гомологічну ЗЕО ІЮ МО:2. У деяких варіантах реалізації, заміщуючим ферментом, підходящим для даного винаходу, є білок, по суті ідентичний повнорозмірному білюку АБА людини (ЗЕО ІЮ МО:2). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, має амінокислотну послідовність, щонайменше на 50 95, 55 95, 60 95, 65 95, 70 905, 75 95, 80 95, 85 90, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 96, 95 96, 96 95, 97 У, 98 У, 99 95 або більше ідентичну ЗЕО ІЮО МО:2.
У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, придатний для застосування згідно з даним винаходом, містить фрагмент або частину повнорозмірного білка АБА людини. У контексті даної заявки повнорозмірний білок АБА зазвичай містить сигнальну пептидну послідовність.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок включає терапевтичний фрагмент (наприклад, націлюючу на лізосоми послідовність) і/або пептид, який проникає через мембрани.
У деяких варіантах реалізації, націлююча на лізосоми послідовність, і пептид, що проникає через мембрани, є внутрішньою частиною терапевтичного фрагмента (наприклад, зв'язаною за допомогою хімічного зв'язку або такою, що утворює з терапевтичним фрагментом химерний білок). У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент манозо-6-
фосфату. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент ІСБЕ-Ї. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент ІСЕ-1І.
Припускається, що способи та композиції згідно з даним винаходом можна застосовувати для лікування інших лізосомних хвороб накопичення, зокрема, лізосомних хвороб накопичення, що мають етіологію і/або симптоми ЦНС, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: аспартилглюкозамінурію, хворобу накопичення холестеринових ефірів, хворобу Вольмана, цистиноз, хворобу Данона, хворобу Фабрі, ліпогрунуломатоз Фарбера, хворобу Фарбера, фукозидоз, галактазидоз ІЛІ типів, хворобу Гоше ІЛІЛІЇ типу, лейкодистрофію глобоїдних клітин, хворобу Краббе, хворобу накопичення глікогену Ії, хворобу Помпі, СМІ-гангліозидоз ІЛІЛІ! типу,
ОМ/12-гангліозидоз | типу, хворобу Тея-Сакса, СМ2-гангліозидоз ІІ типу, хворобу Сандхофа,
ОМ2-гангліозидоз, а-манозидоз ІЛІ типу, Р-манозидоз, метахроматичну лейкодистрофію, муколіпідоз типу І, сіалідоз типу ІЛІ, муколіпідоз ПЛІЇ типу, хворобу клітинних включень, муколіпідоз типу ПС, муколіпідоз ЇЇ типу, мукополісахаридоз І типу, мукополісахаридоз ЇЇ типу, мукополісахаридоз ША типу, синдром Санфіліппо, мукополісахаридоз ПІВ типу, мукополісахаридоз ПС типу, мукополісахаридоз ПО типу, мукополісахаридоз ІМА типу, синдром
Моркіо, мукополісахаридоз ІМВ типу, мукополісахаридоз МІ типу, мукополісахаридоз МІ! типу, синдром Слая, мукополісахаридоз ЇХ типу, множинний дефіцит сульфатази, нейронний цероїдний ліпофусциноз, хворобу Баттена СІ М1, хворобу Баттена СІ М2, хворобу Німана-Піка типу А/В, хворобу Німана-Піка типу СІ, хворобу Німана-Піка типу С2, пікнодизостоз, хворобу
Шиндлера ІЛІ типу, хворобу Гоше і хворобу накопичення сіалових кислот.
Докладний огляд генетичної етіології, клінічних проявів і молекулярно-біологічних механізмів лізосомних хвороб накопичення докладно викладений у роботі 5сгімег еї аї., єавз., Тпе Меїабоїїс апа МоїІесшаг Вавів ої Іппепеа бОізеазе, 7.5!ирй Еа., Мої. ІІ, Мсдгами НІЇЇ, (1995). Таким чином, ферментна недостатність при вищезгаданих захворюваннях відома фахівцям у даній області, деякі з таких захворювань наведені як приклади в Таблиці 2 нижче:
Таблиця 2 ' олігосахариди холестерину ацетилтрансфераза
Таблиця 2 (продовження)
Синдром Слая (МР МІ) |Реаглюкоронідаза.//://|Ї7777777111111111111111111111сСс1с у : Сіалілолігосахариди
Голдберга) захисного білка
Хвороби Шиндлера (о-М-ацетил-галактозамінідаза |: пе ! ся леерня ния
Гепаран сульфат хвороба) фосфотрансфераза
Поет
Хантер полідистрофія)
Мевкоснти до и о со
Хвороба Салла . білок глюкуронова кислота накопичення сіалових кислот |білок глюкуронова кислота цероїдний ліпофусциноз кислоти (Просапозин.///////////// |СапозиниА,В.СІЮЇГ/-: |. /777777777777777771111111сСсш
Способи згідно з даним винаходом можна застосовувати для доставки інших різних заміщуючих ферментів. У даній заявці заміщуючі ферменти, придатні для застосування для даного винаходу, можуть включати будь-який фермент, який може діяти як такий, що заміщує, щонайменше частково, активність недостатнього або відсутнього лізосомального ферменту при лізосомній хворобі накопичення, що підлягає лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент здатний знизити накопичені речовини в лізосомах або здатний полегшити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення.
У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти можуть являти собою будь-які лізосомальні ферменти, про які відомо, що вони пов'язані з лізосомною хворобою накопичення, лікування якої проводиться. У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти обрані з ферментів, перерахованих вище в Таблиці 2.
У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати послідовність дикого типу або природну послідовність. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати змінену послідовність, по суті ідентичну або гомологічну послідовності дикого типу або природній послідовності (наприклад, таку, що має щонайменше 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 98 95 ідентичності послідовності з послідовністю дикого типу або природною послідовністю).
Заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може бути отриманий будь-яким доступним способом. Наприклад, заміщуючі ферменти можуть бути отримані рекомбінантним шляхом з використанням системи клітини-хазяїна, в якій експресуються нуклеїнові кислоти, які кодують заміщуючий фермент. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути отримані шляхом активації ендогенних генів. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути частково або повністю отримані шляхом хімічного синтезу. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти також можуть бути виділені з природних джерел.
При отриманні ферментів рекомбінантним шляхом можна застосовувати будь-яку систему експресії. Наприклад, відомі системи експресії включають, наприклад, яйцеклітини, бакуловіруси, рослини, дріжджі або клітини ссавців.
У деяких варіантах реалізації, ферменти, підходящі для даного винаходу, отримують у клітинах ссавців. Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають лінію мишачої мієломи ВАГВ/с (М5О/Л, ЕСАСС Мо: 85110503);
ретинобласти людини (РЕК.Сб, СгисеїЇ, Лейден, Нідерланди); лінію СМ! нирок мавпи, трансформовану 5М40 (СО5-7, АТОС СНІ 1651); лінію клітин нирки ембріона людини (293 або 293 клітини, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Сгапйат еї аї., У. беп Мігої, 36:59,1977.); клітинну лінію фібросаркоми людини (наприклад, НТ1080); клітини нирок дитинчат хом'яка (ВНК, АТСС СС 10); клітини яєчника китайського хом'ячка 4/-ОНЕК (СНО, Шпацб апа
Спавзіп, Ргос. Май. Асайд. сі. ОБА, 77:4216, 1980); клітини Сертолі миші (ТМ4, МаїйНег, Віо|.
Кергод., 23:243-251, 1980); клітини нирки мавпи (СМТ АТСС ССІ 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (МЕКО-76, АТСС СКІ-1 587); клітини цервікальної карциноми людини (Неіа, АТСС СС 2); клітини нирки собаки (МОСК, АТСС СС 34); клітини печінки пацюків риїаїо (ВК. ЗА, АТСС СК. 1442); клітини легені людини (МУ138, АТСС СС 75); клітини печінки людини (Нер 2, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТОС
ССІ 51); клітини ТКІ (МаїПег еї а!І., Аппаіє М.М. Асай. 5сі., 383:44-68, 1982); МКС 5 клітини; клітини Е54 і лінія гепатоми людини (Нер 2).
У деяких варіантах реалізації, запропоновані способи відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючи ферментів, які виробляються клітинами людини. У деяких варіантах реалізації, способи, які пропонуються, відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючих ферментів, які виробляються клітинами СНО.
У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, які доставляються з використанням способу згідно з даним винаходом, містять молекулу, яка зв'язується з рецепторами на поверхні клітин головного мозку, що сприяє поглинанню клітинами і/або націлюванню на лізосоми.
Наприклад, такий рецептор може являти собою катіон-незалежний маноза-6-фосфат рецептор (СІ-МРЕ), який зв'язується з залишком маноза-б6-фосфату (МбР). Крім того, СІМРЕК також зв'язується з іншими білками, у тому числі ІСЕ-ІЇ. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить залишки МбР на поверхні білка. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може містити біс- фосфорильовані олігосахариди, які мають більш високу афінність зв'язування з СІ-МРЕ. У деяких варіантах реалізації, підходящий фермент містить щонайменше приблизно 20 95-біс- фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. У інших варіантах реалізації, підходящі ферменти можуть містити приблизно 10 95, 15905, 1895, 20 95, 2595, 30 95, 3595, 40 95, 4595, 50 95, 55 90, 6095 біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. Хоча такі біс-фосфорильовані олігосахариди можуть природно бути присутніми в ферменті, слід зазначити, що ферменти можуть бути модифіковані з отриманням ферментів, які містять такі олігосахариди. Наприклад, підходящі заміщуючі ферменти можуть бути модифіковані з використанням деяких ферментів, які здатні каталізувати перенос М-ацетилглюкозаміна-Ь-фосфату з ШОР-СІСМАс в положенні б'є- 1,2-зв'язаних маноз на лізосомальні ферменти. Способи і композиції для отримання і застосування таких ферментів описані, наприклад, СапіїєЇй еї аЇ. у патенті США Мо 6537785 і патенті США Мо 6534300, кожний із яких включений до даної заявки за допомогою посилання.
У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти для застосування в даному винаході можуть бути кон'юговані або гібридизовані з молекулами, що обумовлюють спрямовану доставку (таргетинг) до лізосом, які здатні зв'язуватися з рецептором на поверхні клітин головного мозку. Підходящими молекулами для лізосомного таргетингу є ІСБ-Ї, ІСЕ-ІІЇ, КАР, ре7 і їх варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи їх пептиди, що мають послідовність, щонайменше на 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95 або 95 95 ідентичну послідовності зрілого пептиду людини ІСБР-І, ІОБР-ІЇ, КАР, р97 дикого типу).
У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, не модифіковані для покращення доставки або транспорту таких агентів через ГЕБ і до ЦНС.
У деяких варіантах реалізації терапевтичний білок включає націлюючий фрагмент (наприклад, націлюючу на лізосоми послідовність) і/або пептид, який проникає через мембрани.
У деяких варіантах реалізації, націлююча на лізосоми послідовність і пептид, що проникає через мембрани, є внутрішньою частиною терапевтичного фрагмента (наприклад, зв'язаною за допомогою хімічного зв'язку або такою, що утворює з терапевтичним фрагментом химерний білок). У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить манозо-б6-фосфат фрагмент. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент ІСБЕ-Ї. У деяких варіантах реалізації, націлююча послідовність містить фрагмент ІСЕ-1І.
Водні фармацевтичні розчини та композиції (тобто склади), які зазвичай використовуються для доставки до ЦНС суб'єкта, зазвичай включають традиційний небуферний ізотонічний сольовий розчин і розчин Елліотта В, який являє собою штучну СМР. Порівняння складу СМР і розчину Елліотта В наведене в Таблиці 3. Як показано в Таблиці 3, концентрації речовин у розчині Елліотта В близькі таким концентраціям у СМР. Розчин Елліотта В, однак, містить дуже бо низькі концентрації буфера і, відповідно, не може забезпечити адекватну буферну ємність,
необхідну для стабілізації терапевтичних агентів (наприклад, білків), особливо протягом тривалого періоду часу (наприклад, у ході зберігання). Крім того, розчин Елліотта В містить деякі солі, які можуть бути несумісними зі складами, призначеними для доставки деяких терапевтичних агентів і, зокрема, білків або ферментів. Наприклад, солі кальцію, присутні в розчині Елліотта В, сприяють осадженню білків і тим самим знижують стабільність складу.
Таблиця З мЕкв/л | мЕкв/л | мЕкв/л | мЕкв/л | мЕкв/л | мЕкв/л мг/л мг/л
Розчин | 149 | 26 | 27 | 24 | 226 | 132 |60-75| 23 | 80 в
Даний винахід забезпечує склади, які перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, для терапевтичних агентів, які були складені таким чином, що вони є стабільними або ж сповільнюють чи запобігають деградації одного або більше терапевтичного агента, що входить до їхнього складу (наприклад, рекомбінантних білків). У деяких варіантах реалізації, дані склади забезпечують ліофілізований склад для терапевтичних агентів. У деяких варіантах реалізації, дані склади забезпечують рідкий склад для терапевтичних агентів. У деяких варіантах реалізації, склади є стабільними складами.
У даній заявці термін "стабільний" відноситься до можливості терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усі або більшість видів передбачуваної біологічної активності і/або фізико-хімічну цілісність) протягом тривалого періоду часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента може бути оцінена протягом тривалого періоду часу (наприклад, більш переважно протягом щонайменше 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). У даному контексті стабільний склад є таким складом, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свою фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й при проведенні з ним різних операцій (наприклад, у ході заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена на основі утворення високомолекулярних агрегатів, на основі втрати ферментативної активності, формування пептидних фрагментів і за зміщенням профілів заряду.
Стабільність терапевтичного агента має особливо важливе значення для підтримки певного рівня концентрації терапевтичного агента, необхідного для можливості здійснення агентом його бажаної терапевтичної функції. Стабільність терапевтичного агента може бути також оцінена за біологічною активністю і фізико-хімічною цілісністю терапевтичного агента протягом тривалого періоду часу. Наприклад, стабільність у цей момент часу може бути зіставлена зі стабільністю в більш ранній момент часу (наприклад, при створенні складу в день 0) або може бути зіставлена зі стабільністю терапевтичного агента без допоміжних речовин, і результати цього порівняння виражені у відсотках. Переважно фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом зберігають щонайменше 10095, щонайменше 9995, щонайменше 9895, щонайменше 97 905, щонайменше 95 95, щонайменше 90 95, щонайменше 85 95, щонайменше 80 95, щонайменше 7595, щонайменше 7095, щонайменше 6595, щонайменше 6095, щонайменше 5595 або щонайменше 50 95 біологічної активності терапевтичного агента або фізико-хімічної цілісності протягом тривалого періоду часу (наприклад, при вимірюванні протягом щонайменше 6-12 місяців, при кімнатній температурі або при спеціальних умовах зберігання).
Терапевтичні агенти є переважно розчинними в фармацевтичних композиціях згідно з даним винаходом. Термін "розчинний" стосовно терапевтичних агентів згідно з даним винаходом відноситься до здатності таких терапевтичних агентів утворювати гомогенний розчин. У переважному варіанті розчинність терапевтичного агента в розчині, в якому його вводять і з яким він транспортується до сайту-мішені дії (наприклад, клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до цільових ділянок-мішеней. Декілька факторів можуть вплинути на розчинність терапевтичних агентів.
Наприклад, відповідні фактори, які можуть вплинути на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх солюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції створені таким чином, що з їхнього складу виключені солі кальцію.
Підходящі склади, що перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, можуть містити цільовий терапевтичний агент у різних концентраціях. У деяких варіантах реалізації, підходящі склади можуть містити білок або терапевтичний агент у концентрації в межах від приблизно 0,1 мг/мл до 100 мг/мл (тобто від приблизно 0,1 мг/мл до 80 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 60 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 30 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 25 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 15 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 10 мг/мл, від приблизно 0,1 мг/мл до 5 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 10 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 20 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до 40 мг/мл, від приблизно 5 мг/мл до 100 мг/мл, від приблизно 5 мг/мл до 50 мг/мл або від приблизно 5 мг/мл до 25 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, склади відповідно до винаходу можуть містити терапевтичний агент у концентрації приблизно 1 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 70 мг/мл, 80 мг/мл, 90 мг/мл або 100 мг/мл.
Склади згідно з даним винаходом характеризуються переносимістю або в формі водних розчинів, або у вигляді відновлених розчинів ліофілізату. У даній заявці термін "переносимий" і "переносимість" відноситься до здатності фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом не викликати побічної реакції у суб'єкта, якому вводиться дана композиція, або не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводиться дана композиція. У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом добре переносяться суб'єктом, якому вводяться дані композиції.
Багато терапевтичних агентів, зокрема білки і ферменти згідно з даним винаходом, потребують контрольованого рН і специфічних допоміжних речовин для підтримки їхньої розчинності та стабільності в фармацевтичній композиції згідно з даним винаходом. У Таблиці 4 наведені деякі аспекти прикладів білкових складів, які є важливими для підтримки розчинності й стабільності білкових терапевтичних агентів згідно з даним винаходом.
Таблиця 4
Іноді також для розчинності фосфат або Трис Може також впливати на стабілізацію
Концентрація 5-50 ММ Для підтримки рН буфера Може також стабілізувати й додавати йонноїсили тонічності ізотонічного розчинів
Поверхнево- гм . . розділу і при зміщенні речовина ме ПШЕЄТ лет нене т приблизно сотні мМ стабільності рН складу є додатковим фактором, який здатний змінити розчинність терапевтичного агента (наприклад, ферменту або білка) у водному складі або пре-ліофілізованому складі. Відповідно, склади згідно з даним винаходом переважно містять один або декілька буферів. У деяких варіантах реалізації, водні склади містять кількість буферів, достатню для підтримки оптимального рН зазначеної композиції приблизно між 4,0 і 8,0 (тобто приблизно 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,2; 6,4; 6,5; 6,6; 6,8; 7,0; 7,5 або 8,0). У деяких варіантах реалізації, рН складу становить приблизно між 5,0 і 7,5, приблизно між 5,5 і 7,0, приблизно між 6,0 і 7,0, приблизно між 5,5 і 6,0, приблизно між 5,5 і 6,5, приблизно між 5,0 і 6,0, приблизно між 5,0 і 6,5 і приблизно між 6,0 ї 7,5. Підходящі концентрації буфера включають, наприклад, ацетат, цитрат, гістидин, фосфат, сукцинат, трис(гідроксиметил)ламінометан ("Трис") та інші органічні кислоти.
Концентрації буфера та діапазон рН фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом є факторами, що контролюють і регулюють переносимість складу. У деяких варіантах реалізації, буферний агент присутній у концентрації, що перебуває в діапазоні від приблизно 1 мМ до приблизно 150 мМ або від приблизно 10 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 15 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 20 мМ до приблизно 50 мМ, або від приблизно 25 мМ до приблизно 50 мМ. У деяких варіантах реалізації, підходящий буферний агент присутній у концентрації приблизно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мм, 30 мМ, 35 мм, 40 мм, 45 мм, 50 ММ, 75 мМ, 100 мМ, 125 мМ або 150 мм.
У деяких варіантах реалізації склади, що перебувають або в рідкій, або в пре- ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, містять ізотонічний агент для підтримки ізотонічності складу. Зазвичай термін "ізотонічний" означає, що склад, який розглядається, по суті має такий же осмотичний тиск, що й кров людини. Ізотонічні склади зазвичай мають осмотичний тиск від 240 мОсм/кг до 350 моОсм /кг. Ізотонічність можна виміряти з використанням, наприклад, тиску парів або осмотичної точки заморожування. Приклади ізотонічних агентів включають, але не обмежуються перерахованими: гліцин, сорбіт, маніт, хлорид натрію та аргінін. У деяких варіантах реалізації, підходя щі ізотонічні агенти можуть бути присутніми у водних і/або пре-ліофілізованих складах у концентрації 0,01-5 95 (наприклад, 0,05; 0,15 0,1550,2:50,35 0,45 0,55 0,75; 1,0; 1,25; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 4,0 або 5,0 95) за вагою. У деяких варіантах реалізації, склади для ліофілізації містять ізотонічний агент, що підтримує пре- ліофілізаційні склади або відновлені склади ізотонічними.
Хоча ізотонічні розчини зазвичай є переважними для парентерального введення лікарських препаратів, застосування ізотонічних розчинів може змінити розчинність деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було показано, що слабко гіпертонічні розчини (тобто такі, що містять більше 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфаті натрію, рН 7,0) і цукор- вмісні розчини (тобто більше 2 95 сахарози в 5 ММ фосфаті натрію, рН 7,0) добре переносяться.
Найбільш часто застосовуваним складом для болюсного введення до ЦНС є композиція в сольовому розчині (близько 150 мМ Масі у воді).
У деяких варіантах реалізації, склади можуть містити стабілізуючий агент, або ліопротектор, для захисту білка. Зазвичай підходящим агентом є цукор, невідновлюючий цукор або амінокислота. Приклади цукрів можуть включати, але не обмежуватися наступними: декстран, лактозу, манітол, манозу, сорбітол, рафінозу, сахарозу і трегалозу. Приклади амінокислот можуть включати, але не обмежуються перерахованими: аргінін, гліцин і метіонін. Додаткові стабілізуючі агенти можуть включати хлорид натрію, гідроксиетиловий крохмаль і полівінілпіролідон. Кількість стабілізуючого агента в ліофілізованому складі підбирається, головним чином, так, щоб склад був ізотонічним. Проте, гіпертонічні відновлені склади можуть також підходити. Крім того, кількість стабілізуючого агента не повинна бути занадто низькою, такою, при якій має місце неприйнятна деградація/агрегація терапевтичного агента. Приблизні концентрації стабілізуючого агента в композиції можуть варіювати від 1 мМ до 400 мМ (наприклад, від 30 мМ до 300 мМ, від 50 мМ до 100 мМ) або, навпаки, від 0,195 до 15 95 (наприклад, від 1 95 до 10 95, від 5 95 до 15 95, від 595 до 10 95) за вагою. У деяких варіантах реалізації, відношення масової кількості стабілізуючого агента і терапевтичного агента становить приблизно 1:11. У інших варіантах реалізації, співвідношення маси стабілізуючого агента і терапевтичного агента може становити приблизно 0,1:1; 0,2:1; 0,25:1; 0,4:1; 0,5:1; 11; 2:11; 2,6:1; 3:1; 4:1; 5:1; 10:11 або 20:1. У деяких варіантах реалізації, підходящий для ліофілізації стабілізуючий агент є ліопротектором.
У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять аморфні матеріали. У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять суттєву кількість аморфних матеріалів (наприклад, склади на основі сахарози). У деяких варіантах реалізації, рідкі склади, придатні для застосування згідно з даним винаходом, містять частково кристалічні / частково аморфні матеріали.
У деяких варіантах реалізації, підходящі склади для ліофілізації можуть також включати один наповнювач або більше. "Наповнювач" - це компонент, який додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізату. Наприклад, наповнювач може покращити зовнішній вигляд ліофілізованої таблетки (тобто, наприклад, забезпечити по суті однорідний ліофілізат). Підходящі наповнювачі включають, але не обмежуються перерахованими: хлорид натрію, лактозу, манітол, гліцин, сахарозу, трегалозу, гідроксиетиловий крохмаль. Зразкові концентрації наповнювачів становлять від приблизно 1 95 до приблизно 10 95 (тобто 1,095, 1,5595,2,095, 2,595, 3,095, 3,5 95, 4,095, 4,595, 5,0 90, 5,5 90, 6,0 95,6,5 95, 7,0 95, 7,5 905, 8,0 95, 8,5 95, 9,0 96, 9,5 бі 10,0 95).
У деяких варіантах реалізації є бажаним додавання до складу поверхнево-активної речовини. Приклади поверхнево-активних речовин включають нейонні поверхнево-активні бо речовини, такі як полісорбати (наприклад, полісорбат 20 або 80); полоксамери (наприклад,
полоксамер 188); тритон; додецилсульфат натрію (ДСН); лаурил сульфати натрію; октил глікозиди натрію; лаурилсульфат; мірістил-, лінолеїл-, або стеариловий-сульфобетаїн; лауриля-, мірістил-, лінолеїл- або стеариновий саркозин; лінолеїл-, мірістил- або цетил-бетаїн; лауроамідопропіл; кокамідопропіл; лінолеамідопропіл; мірістамідопропіл; пальмідопропіл або ізостеарамідопропіл-бетаїни (наприклад, лауроамідопропіл); мірістарнідопропіл-, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропіл-диметиламіни; метил натрію, кокоїл- або динатрію метил-офеїл таурати та серії МОМАООАТТМ (Мопа Іпадизігіев, Іпс, Патерсон, штат Нью-Джерсі), поліетилен гліколь, поліпропіл гліколь і співполімери етилену та пропілен гліколю (наприклад,
РіІнгопісх, РЕб68 і т.д.). Звичайна кількість поверхнево-активної речовини є такою, що вона зменшує агрегацію білка і зводить до мінімуму утворення часток або спінювання. Наприклад, поверхнево-активна речовина може бути присутньою в складі в концентрації приблизно 0,001- 0,5 95 (наприклад, приблизно 0005-0,05 95 або приблизно 0,005-0,01 95). Зокрема, поверхнево- активна речовина може бути присутньою в складі в концентрації приблизно 0,005 95, 0,01 95, 0,0295,0,195, 0,2 95, 0,3 95, 0,4 96, або приблизно 0,5 95 і т.д. Додатково поверхнево-активна речовина може додаватися до ліофілізованого складу, пре-ліофілізованого складу і/або до відновленого складу.
Інші фармацевтично прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори, такі як ті, що описані в Кетіпдіоп'є Ріпагтасеціїса! Зсіеєпсез 161 еєайоп, О5ої, А. Ей. (1980), можуть бути включені до складу (і/або до ліофілізованого складу, і/або до відновленого складу) за умови, що вони не виявляють побічної дії на бажані характеристики складу. Прийнятні носії, допоміжні речовини або стабілізатори є нетоксичними для реципієнта в застосовуваних дозах та концентраціях і включають, але не обмежуються перерахованими: додаткові буферні агенти, консерванти; допоміжні розчинники; антиоксиданти, включаючи аскорбінову кислоту й метіонін; хелатуючі агенти, такі як ЕДТА; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок); біодеградовані полімери, такі як поліефіри; і/або протийони, що утворюють солі, такі як натрій.
Склади, що перебувають або в рідкій, або в пре-ліофілізованій, або в ліофілізованій, або у відновленій формі, відповідно до даного винаходу можуть бути оцінені на основі аналізу якості продукції, часу відновлення (якщо склад ліофілізований), якості відновлення (якщо склад ліофілізований), великої молекулярної маси, вологості й температури склування. Зазвичай аналіз якості білка й продуктів включає аналіз швидкості руйнування продукту з використанням методів, які включають, але не обмежуються перерахованими: ексклюзійну ВЕРХ (5Б-НРІ С), катіонообмінну ВЕРХ (СЕХ-НРІ С), рентгенівську дифракцію (РД), модульовану диференціальну скануючу калориметрію (МДСК) ВЕРХ зі зворотною фазою (КР-НРІ С), багатокутове світлорозсіювання (МАГ5), флуоресценцію, поглинання в ультрафіолеті, нефелометрію, капілярний електрофорез (КЕ), електрофорез у ПААГ з ДСН і їхні комбінації. У деяких варіантах реалізації, оцінка продукту відповідно до даного винаходу може включати етап оцінки зовнішнього вигляду (зовнішній вигляд рідини або таблетки).
Зазвичай склади (ліофілізовані або водні) можуть зберігатися протягом тривалого часу при кімнатній температурі. Температура зберігання може коливатися від 0 "С до 45 "С (наприклад, 4"С, 20, 25С, 45 С і т.д.-). Склади можуть зберігатися протягом періоду від декількох місяців до декількох років. Строк зберігання, як правило, становить 24 місяці, 12 місяців, 6 місяців, 4,5 місяці, З місяці, 2 тижні або 1 місяць. Склади можуть зберігатися безпосередньо в контейнері, застосовуваному для введення, що дозволяє виключити етап переносу.
Сполуки можуть зберігатися безпосередньо в ліофілізаційному контейнері (якщо вони ліофілізовані), який може функціонувати як посудина для відновлення, щоб виключити етап переносу. Крім того, ліофілізований лікарський склад може бути дозований із невеликим інкрементом для зберігання. У процесі зберігання в цілому необхідно уникати впливів, які призводять до руйнування білків, у тому числі, без обмежень, впливів сонячних променів, ультрафіолетового випромінювання та інших форм електромагнітного випромінювання, надмірного тепла або холоду, швидкого теплового шоку й механічного шоку.
Способи згідно з винаходом згідно з даним винаходом можуть застосовуватися для ліофілізації будь-яких матеріалів, зокрема терапевтичних агентів. Зазвичай пре-ліофілізований склад додатково містить обрані відповідним чином допоміжні речовини або інші компоненти, такі як стабілізатори, буферні агенти, наповнювачі й поверхнево-активні речовини для запобігання деградації цільового компонента (наприклад, агрегації білка, деамідування і/або окиснення) під час заморожування-сушіння та зберігання. Склади для ліофілізації можуть включати один або більше додаткових компонентів, включаючи ліопротектори або стабілізуючі агенти, буфери, наповнювачі, ізотонічні агенти й поверхнево-активні речовини.
Після того, як цільова субстанція й будь-який додатковий компонент змішані разом, склад бо ліофілізують. Ліофілізація зазвичай включає три основні стадії: заморожування, первинне сушіння та вторинне сушіння. Заморожування необхідне для перетворення води в лід або певного аморфного компонента в кристалічну форму. Первинне сушіння - етап процесу, під час якого лід видаляється із замороженого продукту шляхом прямої сублімації при низькому тиску й температурі. Вторинне сушіння - етап процесу, під час якого зв'язана вода видаляється з матриці продукту із застосуванням дифузії залишкової води до випаровуючої поверхні.
Температура продукту протягом вторинного сушіння зазвичай вища, ніж протягом первинного сушіння. Див. Тапо Х. еї аї. (2004) "Оевідп ої їтее2е-агуіпд ргосеззез Гог Рпагтасеціїса!5: Ргасіїсаї адмуісе, " Рпагт. Кев., 21:191-200; Май 5.Г. еї а. (2002) "Бпипдатепіа!5 ої ІПееге-агуіпд, " іп
ОемеІюртепі апа тапиїасіиге ої ргоївіп Ріпаптасешіса!є. Май 5.Г. еайог Мем/ ЖМогКк: Кіпуег
Асадетіс/Ріепит Рибіїзпег5, рр 281-353; М/апод еї аї. (2000) "Гуорпйї2айоп апа демеортепі ої зоій ргоївіп РПпаптасешіісаІ!5, " Іпї../. РІапт., 203:1-60; УміШат»е М.А. еї аї. (1984) "Те
Іуорпійї2айоп ої рпагтасеціїса!; А ІШегайшге геміем/." У. Рагепіега! Зсі. Тесппої, 38:48-59. Загалом, будь-який процес ліофілізації може бути використаний разом із даним винаходом.
У деяких варіантах реалізації етап відпалювання може бути включений протягом початкового заморожування продукту. Етап відпалювання може скоротити загальний час циклу.
Не будемо вдаватися в теорію, але логічно припустити, що етап відпалювання може допомогти стимулювати кристалізацію допоміжної речовини й формування більших кристалів льоду завдяки рекристалізації малих кристалів, сформованих під час охолодження, що, у свою чергу, покращує відновлення. Зазвичай етап відпалювання включає інтервал або коливання температури під час заморожування. Наприклад, температура заморожування може бути - 40 "С, і температура на етапі відпалювання буде підвищена до, наприклад, -10 "С, ії дана температура буде підтримуватися протягом певного періоду часу. Час етапу відпалювання може перебувати в діапазоні від 0,5 годин до 8 годин (тобто 0,5; 1,0;1,552,052,5;3:4;61і8 годин). Температура відпалювання може перебувати між температурою заморожування та 0 "с.
Ліофілізація може здійснюватися в ємності, такій як туба, контейнер, бутель, ванна, віала (наприклад, скляна віала), шприц або інша підходяща ємність. Ємності можуть бути одноразового використання. Ліофілізацію також можна здійснювати у великому масштабі або в малому масштабі. У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати білок у тій же ємності, в якій буде здійснюватися відновлення білка з метою уникнути етапу переносу. Ємністю в такому випадку може бути, наприклад, віала об'ємом 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 см3.
Безліч різноманітних ліофілізаторів є доступними для даних цілей, таких як лабораторні ліофілізатори Ниї!Ї рії зсаІе агуег (ЗР Іпдивзігіе5, США), Сепевіз (ЗР Іпдивігієв) або будь-які ліофілізатори, здатні контролювати задані параметри процесу ліофілізації. Ліофілізація супроводжується заморожуванням складу та наступною сублімацією льоду з замороженого вмісту при температурі, підходящій для первинного сушіння. Початкове заморожування забезпечує температуру складу нижче приблизно -20 "С (тобто -50 С, -45 С, -40 "С, -35 С, - 30 С, -25 70 і т.д.) зазвичай не більше, ніж на приблизно 4 години (тобто не більше, ніж на приблизно З години, не більше, ніж на приблизно 2,5 години, не більше, ніж на приблизно 2 години). У даних умовах температура продукту зазвичай є нижчою від евтектичної точки або температури руйнування складу. Зазвичай температура для первинного сушіння перебуває в діапазоні від приблизно -30 "С до 25 "С (забезпечуючи знаходження продукту нижче від точки плавлення протягом вторинного сушіння) при підходящому тиску, який зазвичай перебуває в діапазоні від приблизно 20 до 250 мТорр. Склад, розмір і тип ємності, який містить зразок (тобто скляної віали), і об'єм рідини будуть обумовлювати час, необхідний для сушіння, який може перебувати в діапазоні від декількох годин до декількох днів. Етап вторинного сушіння проходить при температурі приблизно 0-60 "С у залежності, переважно, від типу й розміру ємності та типу використовуваного терапевтичного білка. Аналогічно, об'єм рідини буде головним чином залежати від часу, необхідного для сушіння, який може перебувати в діапазоні від декількох годин до декількох днів.
У остаточному підсумку, в результаті ліофілізації одержують ліофілізований склад, у якому вміст вологи становить менше, ніж приблизно 595, менше, ніж приблизно 4 95, менше, ніж приблизно З 95, менше, ніж приблизно 2 95, менше, ніж приблизно 1 95, і менше, ніж приблизно 0,5 95.
Хоча фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом зазвичай перебувають у рідкій формі під час введення суб'єктові, у певних варіантах реалізації фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є ліофілізованими. Такі композиції повинні бути відновлені шляхом додавання до них одного або більше відновників перед введенням суб'єктові. На бажаному етапі, зазвичай у відповідний час перед введенням пацієнтові, ліофілізований склад може бути відновлений за допомогою відновника з одержанням бажаної концентрації білка у відновленому бо розчині.
Різні відновники можуть використовуватися відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації підходящим відновником для відновлення є вода. Вода, яка використовується як відновник, може бути оброблена з використанням безлічі способів, включаючи зворотний осмос, дистиляцію, дейонізацію, фільтрацію (наприклад, фільтрацію з використанням активованого вугілля, мікрофільтрацію, нанофільтрацію) і комбінацію цих способів обробки. Зазвичай вода є підходящою для ін'єкцій, включаючи стерильну воду або бактеріостатичну воду для ін'єкцій, але не обмежуючись ними.
Додаткові приклади відновників включають буферні розчини з постійним рН (наприклад, фосфатно-буферний сольовий розчин), стерильні сольові розчини, розчин Елліотта, розчин
Рінгера або розчин декстрози. Підходящі відновники можуть додатково містити консервант.
Консерванти, що наводяться для прикладу, включають ароматичні спирти, такі як бензиловий спирт або фенол. Кількість консерванту, яку необхідно застосувати, визначається шляхом оцінки сумісності різних концентрацій консервантів із білком і дослідженням ефективності консервантів. Наприклад, якщо консервантом виступає ароматичний спирт (такий як бензиловий спирт), він може бути присутнім у кількості приблизно 0,1-2,0 95, приблизно 0,5- 1,5 95 або приблизно 1,0-1,2 95.
Відновники, придатні для застосування для даного винаходу, можуть включати різноманітні добавки, включаючи, але не обмежуючись ними: буферні агенти, що забезпечують постійне значення рН (наприклад, Трис, гістидин), солі (наприклад, хлорид натрію) та інші добавки (наприклад, сахароза), включаючи описані вище (наприклад, стабілізуючі агенти, ізотонічні агенти).
Згідно з даним винаходом, ліофілізована субстанція (наприклад, білок) може бути відновлена до концентрації щонайменше 25 мг/мл (наприклад, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл) і до будь-якого діапазону концентрацій між ними. У деяких варіантах реалізації, ліофілізована субстанція (наприклад, білок) може бути відновлена до концентрації, що перебуває в діапазоні від приблизно 1 мг/мл до 100 мг/мл (наприклад, від приблизно 1 мг/мл до 50 мг/мл, від 1 мг/мл до 100 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 5 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 10 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 25 мг/мл, від приблизно 1 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 30 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 10 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 50 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 25 мг/мл до приблизно 100 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 75 мг/мл, від приблизно 50 мг/мл до приблизно 100 мг/мл). У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути вищою, ніж концентрація в пре-ліофілізованому складі. Припускається, що висока концентрація білка у відновленому складі є особливо корисною, коли бажаною є підшкірна або внутрішньом'язова доставка відновленого складу. У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути в приблизно 2-50 разів більшою, ніж у пре- ліофілізованому складі (наприклад, у приблизно 2-20 разів, у приблизно 2-10 разів або в приблизно 2-5 разів). У деяких варіантах реалізації, концентрація білка у відновленому складі може бути щонайменше в приблизно 2 рази більшою, ніж у пре-ліофілізованому складі (наприклад, щонайменше в приблизно 3, 4, 5, 10, 20, 40 разів).
Відновлення згідно з даним винаходом може здійснюватися в будь-якій ємності. Ємності, придатні для застосування для даного винаходу, наприклад, включають, але не обмежуються перерахованими: туби, віали, шприци (наприклад, однокамерні або двокамерні), контейнери, пляшки й ванни. Підходящі ємності можуть бути зроблені з будь-яких матеріалів, таких як скло, пластик, метал. Ємності можуть бути одноразового або багаторазового використання.
Відновлення також може здійснюватися у великому масштабі або в малому масштабі.
У деяких випадках може бути бажаним ліофілізувати білкову композицію в тій же ємності, в якій буде проводитися відновлення білка з метою виключення етапу переносу. Ємністю в такому випадку може бути, наприклад, віала об'ємом 3, 4, 5, 10, 20, 50 або 100 см3. У деяких варіантах реалізації, підходящою ємністю для ліофілізації й відновлення є двокамерний шприц (наприклад, шприци Іуо-еске (МеЦег)). Наприклад, двокамерний шприц може містити як ліофілізовану субстанцію, так і відновник, кожний в окремій камері, розділеній перегородкою (див. Приклад 5). Для відновлення плунжер може бути приєднаним до перегородки з боку відновника й надавлений для переміщення відновника до камери з продуктом таким чином, щоб відновник міг контактувати з ліофілізованою субстанцією і відновлення могло пройти, як описано в даній заявці (див. Приклад 5).
Фармацевтичні композиції, склади й пов'язані способи даного винаходу придатні для бо доставки безлічі терапевтичних агентів до (ЦНС суб'єкта (наприклад, інтратекально,
інтравентрикулярно або інтрацистернально) і для лікування супутніх захворювань.
Фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом є особливо корисними для доставки білків і ферментів (наприклад, у замісній ферментній терапії) суб'єктові, що страждає на лізосомні хвороби накопичення. Лізосомні хвороби накопичення представляють групу відносно рідкісних спадкових метаболічних захворювань, які викликають розлади лізосомної функції. Лізосомні захворювання характеризуються накопиченням нерозщеплених макромолекул у лізосомах, що викликає збільшення розміру та кількості лізосом і, в остаточному підсумку, клітинну дисфункцію та клінічні відхилення.
Припускається, що різні стабільні склади, описані в даній заявці, є в цілому підходящими для доставки до ЦНС терапевтичних агентів. Стабільні склади згідно з даним винаходом можуть бути використані для доставки до ЦНС за допомогою різних способів і шляхів, які включають, але не обмежуються перерахованими: інтрапаренхімальне, інтрацеребральне, інтраветрикулярне церебральне (ІЦВ), інтратекальне (наприклад, ІТГ-поперекове, ІТ- мостомозочкове) введення і будь-який інший спосіб і шлях для введення прямо або непрямо до
ЦНС і/або СМР.
У деяких варіантах реалізації заміщуючий фермент доставляють до ЦНС у складі, описаному в даній заявці. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до
ЦНС шляхом введення до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення використовують для доставки бажаного заміщуючого ферменту (наприклад, білка АБЗА) до СМР. У контексті даної заявки, інтратекальне введення (також називане інтратекальною ін'єкцією) відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір навколо спинного мозку). Можуть бути використані різні способи, включаючи, без обмежень, латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру і т.п. Типові методи описані в І а2опйев еї аї.
Адуапсез іп Огид Оеїїмегу бузіет5 апа Арріїсайоп5 іп Мейгозигдегу, 143-192 ії Отауа еї аї.,
Сапсег Огид Оеїїмегу, 1: 169-179, зміст яких включений до даної заявки за допомогою посилання.
Відповідно до даного винаходу фермент може бути ін'єктований до будь-якої області навколо спинномозкового каналу. У деяких варіантах реалізації, фермент ін'єктують до поперекової області або цистерни, або інтравентрикулярно до простору мозкового шлуночка. У даній заявці термін "поперековий (люмбальний) відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, до відділу хребта 12-51. Зазвичай інтратекальні ін'єкції через поперековий відділ або поперекову область також називають "поперековою Ії доставкою" або "поперековим ІТ введенням". Термін "цистерна" відноситься до простору навколо й нижче мозочка через отвір між черепом і у верхній частині хребта. Зазвичай інтратекальне введення через цистерну також згадується як "доставка до великої цистерни". Термін "шлуночок мозку" відноситься до порожнини мозку, яка продовжується в центральному каналі спинного мозку. Зазвичай ін'єкції через мозкову порожнину шлуночка називають інтравентрикулярною церебральною (ІЦВ) доставкою.
У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до поперекового Ії введення або доставки, наприклад, доставки між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш конкретно, 12-51 відділу хребта. Припускається, що поперекове ІТ введення або доставка відрізняється від доставки до великої цистерни тим, що поперекове ІТ введення або доставка відповідно до даного винаходу забезпечує кращу й більш ефективну доставку до дистального каналу хребта, хоча цистернова доставка, крім усього іншого, як правило, не забезпечує доставку складу до дистального каналу хребта.
Різні пристрої можна застосовувати для інтратекальної доставки відповідно до даного винаходу. У деяких варіантах реалізації, пристрій для інтратекального введення містить порт введення рідини (наприклад, ін'єкційний порт): порожній резервуар (наприклад, катетер), який включає перший отвір для рідини, сполучений із вхідним портом для рідини, і другий отвір для рідини, виконаний із можливістю введення до спинного мозку, і блокуюче пристосування для блокування введення порожнистої основної частини до спинного мозку. Як приклад, але не обмеження, на Фігурі 42 показано, що підходяще блокуюче пристосування включає одну або більше опуклостей, виконаних на поверхні порожнистої основної частини, і блокуюче кільце виконане з можливістю установки над однією або більшим числом опуклостей для запобігання вислизанню порожнистої основної частини (наприклад, катетера) зі спинного мозку. У різних варіантах реалізації, порт введення рідини включає резервуар. У деяких варіантах реалізації, бо порт введення рідини включає механічний насос (наприклад, інфузійний насос). У деяких варіантах реалізації, імплантований катетер з'єднують із резервуаром (наприклад, для болюсної доставки) або з інфузійним насосом. Порт введення рідини може бути таким, що імплантується, або бути зовнішнім.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення може бути виконане або з використанням спинномозкової пункції (тобто повільний болюс) або через систему доставки порт-катетер (наприклад, інфузія або болюс). У деяких варіантах реалізації, катетер вводять між пластинками поперекових хребців, і наконечник вставлений до міжоболонкового простору до бажаного рівня (як правило, І 3-І 4) (На Фігурі 63).
Однократна доза, підходяща для інтратекального введення зазвичай є невеликою в порівнянні з внутрішньовенним введенням. Зазвичай інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу підтримує баланс складу СМР, а також внутрішньочерепний тиск суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка здійснюється при відсутності відповідного вилучення СМР у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної дози, може бути, наприклад, меншим за 10 мл, 8 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, З мл, 2 мл, 1,5 мл, 1 мл, 0,5 мл, або в деяких варіантах реалізації, об'єм, підходящий для однократної дози, може становити приблизно 0,5-5 мл, 0,5-4 мл, 0,5-3 мл, 0,5-2 мл, 0,5-1 мл, 1-3 мл, 1-5 мл, 1,5-3 мл, 1- 4мл або 0,5-1,5 мл. У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу включає стадію попереднього вилучення необхідної кількості спинномозкової рідини.
У деяких варіантах реалізації, перед ІТ введенням видаляють менше, ніж 10 мл (наприклад, менше, ніж 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, З мл, 2 мл, 1 мл) СМР. У тих випадках підходящий об'єм однократної дози може становити, наприклад, більше З мл, 4 мл, 5 мл, 6 мл, 7 мл, 8 мл, 9 мл, 10 мл, 15 мл або 20 мл.
Різні інші пристрої можуть бути використані для здійснення інтратекального введення терапевтичної композиції. Наприклад, склади, що містять бажані ферменти, можуть бути надані для використання з резервуаром Омайя, який зазвичай застосовують для інтратекального введення лікарських засобів при менінгеальному карциноматозі (Гапсеї 2: 983-84, 1963).
Зокрема в цьому способі вентрикулярну трубку вводять через отвір, сформований у передньому розі спинного мозку, і підключають до резервуара Омайя, встановленого під шкірою голови, і резервуар проколюють підшкірно для інтратекальної доставки заміщуючого ферменту, який вводять до резервуару. Інші пристрої для інтратекального введення терапевтичних композицій або складів описані в патентах США Моб217552, включених до даної заявки за допомогою посилання. Крім того, склад може бути введений інтратекально, наприклад, шляхом однократної ін'єкції або інфузії. Слід розуміти, що лікувальна доза може являти собою або одноразову дозу, або багаторазову дозу.
Для ін'єкції склади даного винаходу можуть бути приготовані у вигляді рідких розчинів. Крім того, фермент може входити до складу в твердому вигляді і може бути повторно розчиненим або суспендованим безпосередньо перед застосуванням. Ліофілізовані форми також передбачені. Ін'єкція може бути, наприклад, у вигляді болюсної ін'єкції або безперервної інфузії ферменту (наприклад, із використанням інфузійних насосів).
У одному варіанті реалізації даного винаходу, фермент вводять шляхом латеральної церебровентрикулярної ін'єкції в головний мозок суб'єкта. Ін'єкцію можна здійснити, наприклад, через трепанаційний отвір у черепі суб'єкта. У іншому варіанті реалізації, фермент і/або інший фармацевтичний склад вводять до шлуночка мозку суб'єкта через хірургічно введений шунт.
Наприклад, ін'єкція може бути здійснена в бічні шлуночки, які мають більший розмір. У деяких варіантах реалізації, може бути також здійснена ін'єкція в третій і четвертий шлуночки, розмір яких менший.
У ще одному варіанті реалізації, фармацевтичні композиції, які застосовуються в даному винаході, вводять у вигляді ін'єкцій до великої цистерни або поперекової області суб'єкта.
У іншому варіанті реалізації способу згідно з даним винаходом, фармацевтично прийнятний склад забезпечує безперервну доставку суб'єктові, наприклад, "повільне вивільнення" ферменту або іншої фармацевтичної композиції, яка застосовується в даному винаході, протягом щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох тижнів або більш тривалого періоду часу, після того як фармацевтично прийнятні склади вводять суб'єктові.
У даній заявці термін "безперервна доставка" відноситься до безперервної доставки фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом іп мімо протягом тривалого періоду часу після введення, переважно щонайменше декількох днів, тижня або декількох тижнів.
Безперервна доставка композиції може проявлятися, наприклад, у тривалому терапевтичному ефекті ферменту, що вводиться, протягом тривалого періоду часу (наприклад, стійка доставка ферменту може проявлятися в триваючому зменшенні об'єму запасних гранул у суб'єкта). Крім того, безперервна доставка ферменту може проявлятися у виявленні присутності ферменту іп мімо протягом тривалого періоду часу.
Як уже обговорювалося вище, одна з несподіваних і важливих ознак даного винаходу полягає в тому, що терапевтичні агенти, зокрема заміщуючі ферменти, вводяться з використанням способів згідно з даним винаходом, і композиції згідно з даним винаходом здатні ефективно й широко дифундувати через поверхню мозку й проникати до різних шарів або областей мозку, у тому числі до глибоких областей мозку. Крім того, способи згідно з даним винаходом і композиції згідно з даним винаходом відносяться до ефективної доставки терапевтичних агентів (наприклад, ферменту АБА) до різних тканин або нейронів спинного мозку, у тому числі до поперекової області, до якої важко здійснювати спрямовану доставку з використанням існуючих способів доставки до ЦНС, таких як ІЦВ ін'єкція. Крім того, способи згідно з даним винаходом і композиції згідно з даним винаходом забезпечують доставку достатньої кількості терапевтичних агентів (наприклад, ферменту АБА) у кров і до різних периферичних органів і тканин.
Таким чином, у деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, фермент АБА) надходять до центральної нервової системи суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, фермент А5ЗА) надходять до однієї або більше тканин-мішеней головного мозку, спинного мозку і/або периферичного органа. У даній заявці термін "тканина- мішень/цільова тканина" відноситься до будь-якої тканини, ураженої лізосомною хворобою накопичення, яку лікують, або будь-якої тканини, в якій лізосомний фермент, рівень якого знижений, експресується в нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких виявлена аномально висока кількість субстрату ферменту, наприклад, накопиченого в лізосомах клітин тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають схильність до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, які демонструють патології, симптоми або ознаки, асоційовані з такою хворобою. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатній лізосомальний фермент у нормі експресується на високому рівні. У даній заявці тканина-мішень може являти собою тканину-мішень головного мозку, тканину-мішень спинного мозку і/або периферичну тканину-мішень. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче.
У цілому, головний мозок може бути розділений на різні відділи, шари і тканини. Наприклад, менінгеальні тканини являють собою систему мембран, яка включає центральну нервову систему, у тому числі головний мозок. Мозкові оболонки містять три шари, в тому числі тверду мозкову оболонку, павутинну тканину і м'яку мозкову оболонку. Зазвичай основною функцією мозкових оболонок і спинномозкової рідини є захист центральної нервової системи. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний білок відповідно до даного винаходу доставляють до одного або декількох шарів мозкових оболонок.
Головний мозок складається з трьох основних відділів, у тому числі півкуль головного мозку, мозочка і стовбура мозку. Півкулі головного мозку розташовані вище від більшості інших структур головного мозку й покриті корковим шаром. Під півкулями головного мозку лежить стовбур мозку, який нагадує стебло, до якого прикріплені півкулі головного мозку. У задній частині мозку під півкулями головного мозку і за стовбуром мозку перебуває мозочок.
Проміжний мозок, який знаходиться недалеко від середньої лінії головного мозку і вище від середнього мозку, включає таламус, метаталамус, гіпоталамус, епіталамус, преталамус і претектум. Середній мозок, який також називають мезенцефалоном, містить дах, тегумент, вентрикулярний мезоцелиій і церебральні ніжки, червоне ядро і черепні нерви І ядра. Середній мозок пов'язаний із зором, слухом, керуванням рухом, сном/неспанням, уважністю та регуляцією температури.
Області тканин центральної нервової системи, включаючи головний мозок, можуть бути охарактеризовані на основі глибини тканин. Наприклад, тканини ЦНС (наприклад, головний мозок) можуть бути охарактеризовані як поверхневі тканини або неглибокі, тканини середньої глибини і/або глибокі тканини.
Відповідно до даного винаходу терапевтичний білок (наприклад, заміщуючий фермент) може бути доставлений до будь-якої підходящої тканини-мішені мозку, пов'язаної з хворобою суб'єкта, яку лікують. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки (наприклад, заміщуючий фермент) відповідно до даного винаходу доставляють до поверхневих або неглибоких тканин- мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляються до тканин-мішеней мозку на середній глибині. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу бо доставляють до комбінації поверхневих або неглибоких тканин-мішеней головного мозку,
тканин-мішеней головного мозку середньої глибини і/або глибоких тканин-мішеней мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні білки відповідно до даного винаходу доставляють до глибоких тканин мозку, що лежать щонайменше на 4 мм, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм і глибше (або внутрішні) від зовнішньої поверхні мозку.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше поверхневих або неглибоких тканин головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку знаходяться в межах 4 мм від поверхні головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку обрані з тканин м'якої мозкової оболонки, кори головного мозку, гіпокампу, простору Вірхова-Робіна, кровоносних судин у просторі ВР, гіпокампу, частин гіпоталамуса на нижній поверхні мозку, зорових нервів і шляхів, нюхової цибулини і проекцій, і їх комбінацій.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини головного мозку розташовані на 4 мм (наприклад, 5 мм, 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм або 10 мм) глибше від (або всередину відносно) поверхні головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини головного мозку включають кору головного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини головного мозку включають одну або більше тканин проміжного мозку (наприклад, гіпоталамус, таламус, вентральний таламус, субталамус і т.д.), заднього мозку, сочевицеподібні ядра, базальні ганглії, хвостате ядро, шкарлупу, мигдалеподібне тіло, бліду кулю і їх комбінації.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше тканин мозочка. У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин- мішеней мозочка обрані з групи, яка включає тканини молекулярного шару, тканини шару клітин
Пуркіньє, тканини зернистого шару, ніжки мозочка і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин мозочка, включаючи, без обмежень, тканини шару клітин Пуркіньє, тканини зернистого шару клітин, глибокої білої речовини мозочка (наприклад, глибокі відносно зернистого шару клітин) і глибокі тканини ядер мозочка.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше тканини мозку. У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин- мішеней мозку включають тканини білої речовини стовбура головного мозку і/або тканини ядер стовбура мозку.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до різних тканин мозку, включаючи, без обмежень, сіру речовину, білу речовину, перивентрикулярні області, м'яку-'лавутинну оболонку, до мозкової оболонки, кори головного мозку, мозочка, до глибоких тканин кори головного мозку, молекулярного шару, дорсального стріатуму, середнього мозку, глибинних областей моста і довгастого мозку, а також їх комбінацій.
У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) надходять до різних клітин у мозку, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: нейрони, гліальні клітини, периваскулярні клітини і/або менінгеальні клітини. У деяких варіантах, терапевтичний білок доставляють до олігодендроцитів глибокої білої речовини.
У цілому, області або тканини спинного мозку можна охарактеризувати в залежності від глибини тканин. Наприклад, тканини спинного мозку можуть бути охарактеризовані як поверхневі або неглибокі тканини, тканини середньої глибини і/або глибокі тканини.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше поверхневих або неглибоких тканин спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку знаходяться в межах 4 мм від поверхні спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку включають м'яку оболонку і/або ділянки білої речовини.
У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до однієї або більше глибоких тканин спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, цільові глибокі тканини спинного мозку розташовані всередині на глибині 4 мм від поверхні спинного мозку. У деяких варіантах, цільові глибокі тканини спинного мозку включають сіру речовину спинного мозку і/або епендимні клітини.
У деяких варіантах, терапевтичні агенти (наприклад, ферменти) доставляють до нейронів спинного мозку.
У даній заявці периферичні органи або тканини відносяться до будь-якого органа або бо тканини, які не є частиною центральної нервової системи (ЦНС). Периферичні тканини-мішені можуть включати, без обмежень, кровоносну систему, печінку, нирки, серце, ендотелій, кістковий мозок і клітини-похідні кісткового мозку, селезінку, легені, лімфатичні вузли, кістки, хрящі, яєчники і сім'яники. У деяких варіантах, терапевтичні білки (наприклад, заміщуючий фермент) відповідно до даного винаходу доставляють до однієї або більше периферичних тканин.
У різних варіантах реалізації, після доставки до тканини-мішені терапевтичний агент (наприклад, фермент АЗА) локалізується внутрішньоклітинно. Наприклад, терапевтичний агент (наприклад, фермент) може локалізуватися в екзонах, аксонах, лізосомах, мітохондріях і вакуолях клітини-мішені (наприклад, нейрону, такого як клітина Пуркіньє). Наприклад, у деяких варіантах реалізації ферменти, які вводяться інтратекально, характеризуються такою динамікою переміщення, що фермент рухається в периваскулярному просторі (наприклад, шляхом конвективних механізмів із пульсацією). Крім того, поширення білка або ферменту, що вводиться інтратекально, в більш глибоких тканинах центральної нервової системи може забезпечуватися або яким-небудь способом полегшуватися механізмами активного аксонного транспорту, пов'язаними з асоціацією білка або ферменту, що вводиться, з нейрофіламентами.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, фермент АБА), який доставляється відповідно до даного винаходу, може досягати терапевтично або клінічно ефективного рівня чи активності в різних тканинах-мішенях, описаних у даній заявці. У даній заявці терапевтично або клінічно ефективний рівень чи активність являє собою рівень чи активність, які достатні для надання терапевтичного ефекту в тканині-мішені. Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто вимірюваним із використанням ряду тестів чи з використанням маркера) або суб'єктивним (тобто сам суб'єкт повідомляє про ефект або відчуває такий ефект). Наприклад, терапевтично або клінічно ефективний рівень чи активність можуть являти собою рівень чи активність ферменту, які є достатніми для полегшення симптомів, пов'язаних із захворюванням у тканині-мішені (наприклад, накопиченням ГАГ).
У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може досягати рівня або ферментативної активності, що становить щонайменше 5 95, 10 95, 2095, 30 95, 4095, 5095, 6095, 70 905, 80 95, 9095, 95 95 від нормального рівня або активності відповідного лізосомального ферменту в тканині-мішені. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може досягати рівня або ферментативної активності, яка збільшена щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в З рази, в 4 рази, 5 разів, б разів, 7 разів, 8 разів, 9У разів або 10 разів у порівнянні з контролем (наприклад, ендогенний рівень або активність без лікування). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може досягати підвищеного рівня або ферментативної активності щонайменше приблизно 10 нмоль/год./мг, 20 нмоль/год./мг, 40 нмоль/год./мг, 50 нмоль/год./мг, 60 нмоль/год./мг, 70 нмоль/год./мг, 80 нмоль/год./мг, 90 нмоль/год./мг, 100 нмоль/год./мг, 150 нмоль/год./мг, 200 нмоль/год./мг, 250 нмоль/год./мг, 300 нмоль/год./мг, 350 нмоль/год./мг, 400 нмоль/год./мг, 450 нмоль/год./мг, 500 нмоль/год./мг, 550 нмоль/год./мг або 600 нмоль/год./мг у тканині-мішені.
У деяких варіантах реалізації, способи згідно з даним винаходом особливо застосовні для спрямованої доставки (таргетингу) в поперекову область. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може досягати підвищеного рівня або ферментативної активності в поперековій області що становить щонайменше приблизно 500 нмоль/год./мг, 600 нмоль/год./мг, 700 нмоль/год./мг, 800 нмоль/год./мг, 900 нмоль/год./мг, 1000 нмоль/год./мг, 1500 нмоль/год./мг, 2000 нмоль/год./мг, 3000 нмоль/год./мг, 4000 нмоль/год./мг, 5000 нмоль/год./мг, 6000 нмоль/год./мг, 7000 нмоль/год./мг, 8000 нмоль/год./мг, 9000 нмоль/год./мг або 10000 нмоль/год./мг.
У цілому, терапевтичні агенти (наприклад, заміщуючий фермент), які доставляються відповідно до даного винаходу, мають досить тривалий період напівжиття в спинномозковій рідині й тканинах головного мозку, спинного мозку і периферичних органів. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може мати період напівжиття щонайменше 30 хвилин, 45 хвилин, 60 хвилин, 90 хвилин, 2 години, З години, 4 години, 5 годин, 6 годин, 7 годин, 8 годин, 9 годин, 10 годин, 12 годин, 16 годин, 18 годин, 20 годин, 25 годин, 30 годин, 35 годин, 40 годин, до З днів, до 7 днів, до 14 днів, до 21 дня або до місяця. У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, може зберігатися на детектованому рівні або при детектованій активності в бо спинномозковій рідині або крові після 12 годин, 24 годин, 30 годин, 36 годин, 42 годин, 48 годин,
54 годин, 60 годин, 66 годин, 72 годин, 78 годин, 84 годин, 90 годин, 96 годин, 102 годин або тижня після введення. Детектований рівень або детектована активність може бути визначена з використанням різних способів, відомих у даній області.
У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, досягає концентрації щонайменше 30 мкг/мл у тканинах і клітинах ЦНС у суб'єкта після введення (наприклад, через один тиждень, З дні, 48 годин, 36 годин, 24 години, 18 годин, 12 годин, 8 годин, 6 годин, 4 години, З години, 2 години, 1 годину, 30 хвилин або менше після інтратекального введення фармацевтичної композиції суб'єктові). У деяких варіантах реалізації, терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент), який доставляється відповідно до даного винаходу, досягає концентрації щонайменше 20 мкг/мл, щонайменше 15 мкг/мл, щонайменше 10 мкг/мл, щонайменше 7,5 мкг/мл, щонайменше 5 мкг/мл, щонайменше 2,5 мкг/мл, щонайменше 1,0 мкг/мл або щонайменше 0,5 мкг/мл у цільових тканинах або клітинах суб'єкта (наприклад, тканині мозку або нейронів) після введення такому суб'єктові (наприклад, через один тиждень, З дні, 48 годин, 36 годин, 24 години, 18 годин, 12 годин, 8 годин, Є годин, 4 години, З години, 2 години, 1 годину, 30 хвилин або менше після інтратекального введення такої фармацевтичної композиції суб'єктові).
Метахроматична лейкодистрофія (МЛД) являє собою аутосомно-рецесивне захворювання, обумовлене недостатністю ферменту арилсульфатази (АБА). АБА, яка кодується геном АКБА людини, являє собою фермент, що розщеплює цереброзид-3-сульфат або сфінголіпід 3-0- сульфогалактозилцерамід (сульфатид) на цереброзид і сульфат. При відсутності ферменту сульфатиди накопичуються в нервовій системі (наприклад, у мієлінових оболонках, нейронах і гліальних клітинах) і меншою мірою у вісцеральних органах. Наслідком таких молекулярних і клітинних подій є прогресуюча демієлінізація і втрата аксонів у ЦНС і ПНС, що супроводжуються моторними й когнітивними розладами з тяжким клінічним проявом.
Визначальною клінічною ознакою цього захворювання є дегенерація центральної нервової системи (ЦНС), яка призводить до когнітивних розладів (наприклад, розумової відсталості, нервових розладів і сліпоти та ін.).
МЛД може проявлятися у дітей раннього віку (пізня інфантильна форма), при цьому у хворих дітей симптоми проявляються зазвичай відразу після першого року життя (наприклад, приблизно 15-24 місяців), і, як правило, такі діти не живуть більше 5 років. МЛД може проявлятися у дітей (ювенільна форма), при цьому у хворих дітей когнітивні розлади проявляються зазвичай приблизно у віці 3-10 років, а тривалість життя може варіювати (наприклад, у діапазоні 10-15 років після появи симптомів). МЛД може проявлятися у дорослих (доросла форма) і може з'являтися у людей будь-якого віку (наприклад, зазвичай у віці 16 років і більше), а прогресування захворювання може сильно варіювати.
Композиції та способи згідно з даним винаходом можуть бути використані для ефективного лікування індивідів, що страждають на або мають схильність до МЛД. У даній заявці терміни "лікувати" або "лікування", які використовуються в даній заявці, відносяться до покращення одного або більше симптомів, асоційованих із захворюванням, запобігання або затримки настання одного або більше симптомів захворювання і/або зменшення тяжкості чи частоти одного або більше симптому захворювання. Приклади симптомів включають, але не обмежуються перерахованими: підвищений внутрішньочерепний тиск, гідроцефалію внаслідок атрофії речовини головного мозку, накопичення сульфатованих гліколіпідів у мієлінових оболонках центральної та периферичної нервових систем і у внутрішніх органах, прогресивну демієлінізацію, втрату аксонів у ЦНС і ПНС і/або моторну й пізнавальну дисфункцію.
У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до часткового або повного покращення, полегшення, гальмування, затримки початку, зниження тяжкості і/або частоти неврологічних розладів у пацієнта з МЛД. У даній заявці термін "неврологічні розлади" включає різні симптоми, пов'язані з розладом центральної нервової системи (наприклад, головного та спинного мозку).
Симптоми неврологічних розладів можуть включати, наприклад, затримку розвитку, прогресуючі когнітивні розлади, ослаблення слуху, розлад розвитку мови, дефіцит моторних навичок, гіперактивність, агресивність і/або розлад сну поряд із іншими симптомами. У деяких варіантах реалізації, різні симптоми МЛД асоційовані з розладами периферичної нервової системи (ПНС). У деяких варіантах реалізації, неврологічні розлади у пацієнта з МЛД характеризуються погіршенням загальної моторики. Очевидно, що загальну моторику можна оцінювати за будь-яким підходящим методом. Наприклад, у деяких варіантах реалізації загальна моторика вимірюється як зміна відносно базової лінії з використанням Сго55 Моїог
Еипсебйоп Меазиге-88 (СМЕМ-88) і загальної початкової оцінки.
У деяких варіантах реалізації лікування відноситься до зменшення накопичення бо сульфатидів у різних тканинах. У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до зменшення накопичення сульфатидів у тканинах-мішенях головного мозку, у нейронах спинного мозку і/або периферичній тканині-мішені. У певних варіантах реалізації, накопичення сульфатидів зменшується приблизно на 5 95, 10 95, 1595, 20 95, 25 95, 30 95, 35 95, 40 95, 45 95, 5095, 5595, 6095, 6595, 7095, 75595, 8095, 8595, 9095, 9595, 100 95 ії більше в порівнянні з контролем. У деяких варіантах реалізації, накопичення сульфатидів зменшується щонайменше в 1 раз, 2 рази, З рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9 разів або 10 разів у порівнянні з контролем. Бажано, щоб рівень накопичення сульфатидів оцінювався будь-яким підходящим методом. Наприклад, у деяких варіантах реалізації накопичення сульфатидів вимірюється за допомогою офарблення альціановим синім. У деяких варіантах реалізації, накопичення сульфатидів вимірюється за допомогою офарблення І АМР-1.
У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до зниження вакуолізації в нейронах (наприклад, нейронах, що включають клітини Пуркіньє). У деяких варіантах реалізації, вакуолізація в нейронах зменшується приблизно на 595, 10 95, 1595, 2095, 2595, 30 95, 35 90, 4095, 4595, 5095, 55595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 90 95, 9595, 100 95 і більше в порівнянні з контролем. У деяких варіантах реалізації, вакуолізація зменшується щонайменше в 1 раз, 2 рази, З рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9 разів або 10 разів у порівнянні з контролем.
У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до збільшеної активності ферменту
АБА в різних тканинах. У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до збільшеної активності ферменту АБА у тканинах-мішенях головного мозку, нейронів спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, активність ферменту АБЗА збільшена на приблизно 5 905, 10 95, 15 95, 20 95, 25 95, 30 95, 35 95, 40 95,45 95, 50 95, 55 905, 60 90, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 95 95, 100 95, 200 95, 300 95, 400 95, 500 95, 600 95, 700 95, 80095, 900 95 1000 95 або більше в порівнянні з контролем. У деяких варіантах реалізації, активність ферменту АБА збільшена щонайменше в 1 раз, 2 рази, З рази, 4 рази, 5 разів, 6 разів, 7 разів, 8 разів, 9У разів або 10 разів у порівнянні з контролем. У деяких варіантах реалізації, активність ферменту АБА становить щонайменше приблизно 10 нмоль/год./мг, 20 нмоль/год./мг, 40 нмоль/год./мг, 50 нмоль/год./мг, 60 нмоль/год./мг, 70 нмоль/год./мг, 80 нмоль/год./мг, 90 нмоль/год./мг, 100 нмоль/год./мг, 150 нмоль/год./мг, 200 нмоль/год./мг, 250 нмоль/год./мг, 300 нмоль/год./мг, 350 нмоль/год./мг, 400 нмоль/год./мг, 450 нмоль/год./мг, 500 нмоль/год./мг, 550 нмоль/год./мг, 600 нмоль/год./мг або більше. У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність АБА збільшується в поперековій ділянці. У деяких варіантах реалізації, збільшена ферментативна активність АБА в поперековій ділянці становить щонайменше приблизно 2000 нмоль/год./мг, 3000 нмоль/год./мг, 4000 нмоль/год./мг, 5000 нмоль/год./мг, 6000 нмоль/год./мг, 7000 нмоль/год./мг, 8000 нмоль/год./мг, 9000 нмоль/год./мг, 10000 нмоль/год./мг або більше.
У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до зниження прогресування втрати когнітивної здатності. У деяких варіантах, прогресування втрати когнітивної здатності зменшується приблизно на 595, 1095, 1595, 20 95, 25 95, 30 95, 35905, 40 95, 4595, 50 95, 55 95, бО95, 6595, 7095, 7595, 80 95, 8595, 9095, 95 95, 100 95 і більше в порівнянні з контролем. У деяких варіантах, лікування відноситься до зниження затримки в розвитку. У деяких варіантах, затримка розвитку зменшується приблизно на 5 95, 1095, 15 95, 20 95, 2595, 30 95, 35 95, 40 95, 4595, 50 95, 55 95, 60 95, 6595, 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 95, 95 95, 100 95 і більше в порівнянні з контролем.
У деяких варіантах реалізації, лікування відноситься до збільшення виживаності (наприклад, тривалості життя). Наприклад, лікування може призводити до збільшення тривалості життя пацієнтів. У деяких варіантах реалізації, лікування згідно з даним винаходом призводить до збільшення тривалості життя пацієнтів більше, ніж на приблизно 595, приблизно 10 95, приблизно 15 95, приблизно 20 95, приблизно 25 95, приблизно 30 95, приблизно 35 95, приблизно 40 95, приблизно 45 95, приблизно 50 95, приблизно 55 95, приблизно 60 95, приблизно 65 95, приблизно 70 95, приблизно 75 95, приблизно 80 95, приблизно 85 95, приблизно 90 95, приблизно 9595, приблизно 100 95, приблизно 10595, приблизно 110 95, приблизно 11595, приблизно 120 95, приблизно 125 95, приблизно 130 95, приблизно 135 95, приблизно 140 95, приблизно 145 95, приблизно 150 95, приблизно 155 95, приблизно 160 95, приблизно 165 95, приблизно 170 95, приблизно 175 95, приблизно 180 95, приблизно 185 95, приблизно 190 95, приблизно 195 95, приблизно 200 95 або більше в порівнянні з середньою тривалістю життя одного або більше пацієнтів, що страждають на таке ж захворюванням, але не піддавалися лікуванню. У деяких варіантах реалізації, лікування згідно з даним винаходом призводить до збільшення тривалості життя пацієнта більше, ніж на 6 місяців, приблизно на 7 місяців, приблизно на 8 бо місяців, приблизно на 9 місяців, приблизно на 10 місяців, приблизно на 11 місяців, приблизно на
Зо
12 місяців, приблизно на 2 роки, приблизно на З роки, приблизно на 4 роки, приблизно на 5 років, приблизно на 6 років, приблизно на 7 років, приблизно на 8 років, приблизно на 9 років, приблизно 10 років або більше в порівнянні з середньою тривалістю життя одного або більше пацієнтів, що страждають на таке ж захворювання, але не піддавалися лікуванню. У деяких варіантах реалізації, лікування відповідно до даного винаходу призводить до тривалої виживаності пацієнта. У даній заявці термін "тривала виживаність" відноситься до виживаності або тривалості життя більше 40 років, 45 років, 50 років, 55 років, 60 років або довше.
Терміни "покращити", "збільшити" або "зменшити" в даній заявці вказують на значення відносно контролю. У деяких варіантах реалізації, підходящий контроль являє собою базове (фонове) вимірювання, наприклад, вимірювання у того ж самого індивіда до початку лікування, описаного в даній заявці, або вимірювання у контрольного індивіда (або декількох контрольних індивідів) при відсутності лікування, описаного в даній заявці. "Контрольний індивід" являє собою індивіда, що страждає на таку ж форму МЛД (наприклад, у пізній інфантильній, ювенільній або дорослій формі), приблизно такого ж віку і/або статі, як і індивід, що одержує лікування (для того, щоб стадії захворювання індивіда, що одержує лікування, і контрольного індивіда (індивідів) були порівнянними).
Індивід (також називаний "пацієнтом" або "суб'єктом"), що одержує лікування, являє собою індивіда (плід, немовля, дитину, підлітка або дорослу людину), що має МЛД або має ймовірність розвитку МЛД. Такий індивід може мати залишкову ендогенну експресію і/або активність АБ5А, або вимірювана активність АБА може бути відсутньою. Наприклад, індивід, що має МЛД, може мати рівень експресії АБА, який становить менше 30-50 95, менше приблизно 25-30 95, менше приблизно 20-25 95, менше приблизно 15-20 95, менше приблизно 10-15 95, менше приблизно 5- 10 95, менше приблизно 0,1-5 95 від нормального рівня експресії АБ5А.
У деяких варіантах реалізації, індивід є індивідом, у якого нещодавно була діагностована хвороба. Зазвичай раннє лікування (лікування, що починається як можна більш швидко після встановлення діагнозу) є важливим для мінімізації впливу хвороби й максимізації переваг лікування.
Зазвичай інтратекальне введення терапевтичного агента (наприклад, заміщуючого ферменту) відповідно до даного винаходу не викликає тяжких побічних ефектів у суб'єкта. У даній заявці тяжкі побічні ефекти включають, але не обмежені перерахованим: суттєву імунну відповідь, токсичність або смерть. У даній заявці термін "суттєва імунна відповідь" відноситься до тяжких або серйозних форм імунних відповідей, таких як адаптивна Т-клітинна імунна відповідь.
Таким чином, у багатьох варіантах реалізації, способи відповідно до даного винаходу не включають проведення супутньої імунопригнічуючої терапії (тобто будь-якої імунопригнічуючої терапії, яка використовується як попереднє лікування/попередня обробка або одночасно зі способом даного винаходу). У деяких варіантах реалізації, способи згідно з даним винаходом не пов'язані з індукцією імунної толерантності у суб'єкта, який проходить лікування. У деяких варіантах реалізації, способи відповідно до даного винаходу включають попереднє лікування або попередню обробку суб'єкта із застосуванням агентів, які імуносупресують Т-клітини.
У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення терапевтичних агентів може викликати імунну відповідь проти цих агентів. Таким чином, у деяких варіантах реалізації, може бути необхідним викликати у суб'єкта, що отримує заміщуючий фермент, толерантність до замісної ферментної терапії. Імунна толерантність може бути індукована із застосуванням різних способів, відомих у даній області. Наприклад, може бути призначений початковий 60- денний режим приймання агента, який імуносупресує Т-клітини, такого як циклоспорин А (Сва), і антипроліферативного агента, такого як азатіоприн (Ага), у комбінації зі щотижневими інтратекальними інфузіями малих доз бажаного заміщуючого ферменту.
У комбінованому лікуванні згідно з даним винаходом можна застосовувати будь-який імуносупресуючий агент, відомий фахівцям у даній області. Такі імуносупресуючі агенти включають, але не обмежені перерахованими: циклоспорин, ЕК5БОб, рапаміцин, СТІ АА4-194 і агенти, що діють проти ТМЕ, такі як етанерцепт (див., наприклад, Модег, 2000, Апп. АПегду
Авіпта Іттипої!. 84, 280-284; Меміп5, 2000, Си. Оріп. Реаіаїг. 12, 146-150; Кипірего еї аї., 2000, зсапа. 9. Іттипої. 51, 224-230; Ідедисті еї аї., 2000, Мешйгозсіепсе 95, 217-226; Роцегеї аї., 1999,
Апп. М.У. Асай. Зсі. 875, 159-174; 5іамік єї а!., 1999, Іттипої. Кев. 19, 1-24; Салем еї аї., 1999,
Вопе Маїтоу/ Тгапзріапі. 25, 689-696; Непгу, 1999, Сііп. Тгапзріапі. 13, 209-220; Ситтегчі еї аї., 1999, У. Ат. Зос. МерпгоїЇ. 10, 1366-1380; Оі еї аї., 2000, Тгаперіапіайоп 69, 1275-1283). Як імуносупресуючі агенти також можна застосовувати антитіло до рецептора 1/2 (альфа- субодиниці) - даклізумаб (наприклад, 7епарах'"М), який показав ефективність у пацієнтів після бо трансплантації (див., наприклад, У/ізетанп еї аї., 1999, Огиде 58, 1029-1042; Вепіатіпомії еї аї.,
2000, М. Епої У. Мед. 342, 613-619; Ропіїсеїїї еї аІ., 1999, Огидзе К. 0. 1, 55-60; Вегага еї аї., 1999,
РПпаптасоїНегару 19, 1127-1137; ЕсКноїї еї а!., 2000, Тгапзріапіайоп 69, 1867-1872; ЕКбего еї аї., 2000, Тгапері. Іпї. 13, 151-159). Інші імуносупресуючі агенти включають, але не обмежені перерахованими, ліганди, що діють проти СО2 (Вгапсо еї аї!., 1999, Тгаперіапіайоп 68, 1588- 1596; РггеріогКка еї аї., 1998, Віоса 92, 4066-4071), проти СО4 (Магіпоуха-Мшиаїснієма еї а!., 2000,
Ап Кпецт. 43, 638-644; Рівпм/йа еї аї., 1999, Сііп. Іттипої. 92, 138-152) і проти СО40 (Нопд еї аіІ., 2000, бетіп. Мернгої. 20, 108-125; Спіппше еї аї., 2000, 9. МігоЇ. 74, 3345-3352; ПО еї аї., 2000, 9. Іттипої. 164, 1230-1235).
Способи згідно з даним винаходом передбачають як однократне, так і множинне введення терапевтично ефективної кількості терапевтичних агентів (наприклад, заміщуючих ферментів), описаних у даній заявці. Терапевтичні агенти (наприклад, заміщуючі ферменти) можна вводити через регулярні проміжки часу, в залежності від характеру, ступеня тяжкості й стану суб'єкта (наприклад, лізосомної хвороби накопичення). У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективну кількість терапевтичного агента (наприклад, заміщуючого ферменту) згідно з даним винаходом можна вводити інтратекально періодично через рівні проміжки часу (наприклад, один раз на рік, один раз на півроку, один раз на п'ять місяців, один раз на три місяці, один раз на два місяці, щомісяця (один раз на місяць), раз на два тижні, щотижня.
У деяких варіантах, інтратекальне введення можна застосовувати в комбінації з іншими шляхами введення (наприклад, внутрішньовенно, підшкірно, внутрішньом'язово, парентерально, трансдермально або через слизову оболонку (наприклад, перорально або назально)). У деяких варіантах реалізації, такі інші способи введення (наприклад, внутрішньовенне введення) можуть здійснюватися не частіше, ніж раз на два тижні, один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці, один раз на чотири місяці, один раз на п'ять місяців, один раз на шість місяців, щорічно.
У даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" в основному визначають на основі загальної кількості терапевтичного агента, який міститься в фармацевтичній композиції згідно з даним винаходом. Як правило, терапевтично ефективна кількість є достатньою для досягнення значущого сприятливого ефекту у суб'єкта (наприклад, лікування, модуляція, виліковування, запобігання і/або покращення розглянутого захворювання або патологічного стану). Наприклад, терапевтично ефективна кількість може являти собою кількість, достатню для досягнення бажаного терапевтичного і/або профілактичного ефекту, наприклад, кількість, достатню для модуляції лізосомних рецепторів, ферментів або їхньої активності, для лікування лізосомної хвороби накопичення або її симптомів (наприклад, зменшення або усунення наявності чи поширення "смугастих тілець" або клітинної вакуолізації після введення композиції згідно з даним винаходом суб'єктові). Як правило, кількість терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного лізосомального ферменту), який вводиться суб'єктові, що цього потребує, буде залежати від характеристик суб'єкта. Такі характеристики включають стан, ступінь тяжкості захворювання, загальний стан здоров'я, вік, стать і масу тіла суб'єкта. Фахівець у даній області зможе легко визначити потрібні дозування в залежності від цих та інших факторів. Крім того, можна застосовувати як об'єктивні, так і суб'єктивні тести для визначення оптимального діапазону дози.
Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять, використовуючи введення, яке включає множину однократних доз. Для будь-якого конкретного терапевтичного білка терапевтично ефективна кількість (і/або відповідна доза в межах ефективного режиму введення) може варіювати, наприклад, у залежності від шляху введення, комбінації з іншими фармацевтичними засобами. Крім того, конкретна терапевтично ефективна кількість (і/або доза) для кожного конкретного пацієнта може залежати від різних факторів, у тому числі від конкретного розладу, який лікують, і тяжкості захворювання; активності конкретного застосовуваного фармацевтичного засобу; конкретної застосовуваної фармацевтичної композиції, віку, маси тіла, загального стану здоров'я, статі й раціону пацієнта, часу введення, шляху введення і/або швидкості виведення або метаболізму конкретного застосовуваного гіоридного білка, тривалості лікування та інших подібних факторів, добре відомих фахівцям у області медицини.
У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективна доза перебуває в діапазоні від приблизно 0,005 мг/кг маси головного мозку до 500 мг/кг маси головного мозку, наприклад, від приблизно 0,005 мг/кг маси головного мозку до 400 мг/кг маси головного мозку, від приблизно 0,005 мг/кг маси головного мозку до 300 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 200 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 100 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного бо мозку до 90 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до
80 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 70 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 60 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 50 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 40 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 30 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 25 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 20 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до 15 мг/кг маси головного мозку, приблизно від 0,005 мг/кг маси головного мозку до мг/кг маси головного мозку. 10 У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективна доза більша, ніж приблизно 0,1 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 0,5 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 1,0 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно З мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 5 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 10 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 15 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 30 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 40 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 50 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 60 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 70 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 80 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 90 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 100 мг/кг маси головного мозку, більша, 20 ніж приблизно 150 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 200 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 250 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 300 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 350 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 400 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 450 мг/кг маси головного мозку, більша, ніж приблизно 500 мг/кг маси головного мозку.
У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективні дози також можуть бути визначені в мг/кг маси тіла. Як зрозуміло фахівцеві в даній області, маса мозку і маса тіла можуть корелювати. ОеКарап А5. "Спапдез іп Бгаіп меїднів аигіпуд (пе зрап ої Ппитап Іе: геІайоп ої Бгаїп меіднів то роду Пеїднпів апа Боду мжмеїднів," Апп Меиго! 1978; 4:345-56. Таким чином, у деяких варіантах реалізації, дозування можуть бути перетворені, як показано в Таблиці 5.
Таблиця 5
Кореляція між вагою головного мозку, вагою тіла і віком у чоловіків
У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективні дози також можуть бути визначені в мг/15 см3 СМР. Як зрозуміло фахівцеві в даній області, терапевтично ефективні дози, розраховані на основі ваги головного мозку і ваги тіла, можуть бути перетворені в мг/15 см?
СМР. Наприклад, об'єм СМР у дорослої людини становить приблизно 150 мл (допапзоп СЕ, єї аі!. "Мийіріїску ої сегергозріпа! Яшцід Типсіопе: Мем спаПепдез іп Неаї( апа аїізеазе," Сегергозріпаї!
ЕРіціа Кез. 2008 Мау 14;5:10). Таким чином, ін'єкція в дозі від 0,1 мг до 50 мг білка для дорослої людини буде становити приблизно від 0,01 мг/15 см? СМР (0,1 мг) до 5,0 мг/15 см? СМР (50 мг) дорослої людини.
Слід також розуміти, що для будь-якого конкретного суб'єкта конкретні режими введення повинні бути скоректовані з часом відповідно до індивідуальних потреб і думки фахівця або особи, що здійснює контроль над проведенням замісної ферментної терапії, і діапазони дозувань, установлені в даному документі, наведені тільки для прикладу й не призначені для обмеження об'єму або обмеження здійснення на практиці заявленого винаходу.
Даний винахід також передбачає набори або інші вироби, які містять склад згідно з даним винаходом та інструкції з його відновлення (якщо склад ліофілізований) і/або застосування.
Набори або інші вироби можуть містити контейнер, ПІДЛЗ, катетер і будь-які інші вироби, пристрої або устаткування, застосовні для інтратекального введення й пов'язаних із ним операцій. Підходящі контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони, шприци (наприклад, попередньо заповнені шприци), ампули, картриджі, резервуари або шприци "Іуо-іесї". Контейнер може бути виготовлений з різних матеріалів, таких як скло або пластик. У деяких варіантах реалізації, контейнер являє собою попередньо заповнений шприц. Підходящі попередньо заповнені шприци включають, але не обмежені перерахованим: шприци з боросилікатного скла з термічно обробленим силіконовим покриттям, шприци з боросилікатного скла з нанесеним шаром силікону або пластикові шприци без силікону.
Як правило, контейнер може включати склад і етикетку, прикріплену або прикладену до контейнера, на якій можуть бути зазначені інструкції з відновлення і/або застосування складу.
Наприклад, на етикетці може бути зазначено, що склад необхідно відновити до концентрації білка, описаної вище. Етикетка може також містити інформацію про те, для чого застосовний або призначений склад, наприклад, для ІТ введення. У деяких варіантах реалізації, контейнер може містити одну дозу стабільного складу, який містить терапевтичний агент (наприклад, заміщуючий фермент). У різних варіантах реалізації, разова доза стабільного складу присутня в об'ємі менше 15 мл, 10 мл, 5,0 мл, 4,0 мл, 3,5 мл, 3,0 мл, 2,5 мл, 2,0 мл, 1,5 мл, 1,0 мл або 0,5 мл. Крім того, контейнер, що містить склад, може являти собою флакон для багаторазового застосування, який дозволяє проводити повторні введення (наприклад, від 2-6 введень) складу.
Набори або інші вироби можуть додатково включати другий контейнер, який містить підходящий розчинник (наприклад, БВІ, фізіологічний розчин, буферний розчин). Після змішування з розчинником і підготовки складу кінцева концентрація білка у відновленому складі, як правило, становить не менше 1 мг/мл (наприклад, щонайменше 5 мг/мл, щонайменше 10 мг/мл, щонайменше 25 мг/мл, щонайменше 50 мг/мл, щонайменше 75 мг/мл, щонайменше 100 мг/мл).
Набори або інші вироби можуть додатково включати інші речовини, бажані з комерційної точки зору і з точки зору зручності користувача, в тому числі інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, ПІДЛЗ, катетери, шприци і вкладиші з інструкціями з застосування.
Даний винахід буде більш зрозумілим при розгляді наступних прикладів. Приклади не повинні розглядатися як такі, що обмежують об'єм даного винаходу. Усі процитовані джерела включені за допомогою посилань.
Приклади
Приклад 1: дослідження токсичності штратекального введення арилсульфатази А
Щоб оцінити здатність інших ферментів, що вводяться інтратекально, до розподілу до клітин і тканин ЦНС, проводили дослідження відповідно до Сі Р (належної лабораторної практики), в якому оцінювали багатократне інтратекальне (ІТ) введення рекомбінантної арилсульфатази А людини (гПАБЗА) з точки зору токсикології та фармакологічної безпеки протягом одного місяця у молодих (молодше 12 місяців) довгохвостих макак. Лікарську форму ПАЗА готували і складали із застосуванням основи з 154 мМ Масі, 0,005 95 полісорбату 20 при рН 6,0.
Для досягнення мети дослідження дев'ять самців і дев'ять самок молодих довгохвостих макак випадковим чином розподіляли в залежності від маси тіла до однієї з трьох груп, як зазначено в Таблиці 6. Зазначені тварини (за винятком 1 самця в групі дози 1) одержували короткострокову інфузію об'ємом 0,6 мл з 0, З або 31 мг/мл гПАБА (сумарна доза 0, 1,8 або 18,6 мг) один раз на два тижні - усього три дози на одну тварину. Стежили за масою тіла, клінічними ознаками, показниками неврологічного й фізикального обстеження, даними лабораторної діагностики, даними офтальмологічного обстеження й токсикокінетичними пробами. Усіх зазначених тварин піддавали розтину в день 29, 30 або 31 (424 години після останнього Ії введення препарату). Обрані тканини відбирали, зберігали й піддавали мікроскопічному дослідженню.
Таблиця 6
Номінальна
Група Кількість тварин концентрація в дозі Об'єм дози (мл) |Доза, яку вводили(мг) (мг/мл) 1171 зМм3ажї77771711о01111111717711111106 1110 2 | змМЗжЖж и 73177106 118 2 щ з | змМзжЖж | 77173717 06 | 186
Концентрації гпАБА, які визначали в тканинах ЦНС довгохвостих макак, визначали за допомогою ЕГІБА і порівнювали з терапевтичним цільовим значенням 10 95 від нормальної концентрації ГПАБЗА у людини, що відповідає приблизно 2,5 нг/мг тканини. Проби тканини або біопсичні зразки вилучали з різних областей головного мозку довгохвостих макак і далі аналізували на наявність гПАБА. Фігура 24 ілюструє тканини, з яких брали біопсію. Отримані при біопсії проби тканини продемонстрували збільшення концентрації ГПАБА, що відображено на
Фігурі 25А-С0, і був виявлений градієнт відкладання від кори великих півкуль до глибоких шарів білої речовини й глибоких шарів сірої речовини.
Концентрації гпА5А, які визначали з використанням однакової біопсії, як при ІТ, так і при ІЦВ шляху введення у 6 мавп, що одержували дозу гПАБ5А 18,6 мг, проілюстровані на Фігурі 26 А-В.
Концентрації гАЗА, які визначали в глибоких шарах білої речовини (Фігура 25А) і в глибоких шарах сірої речовини (Фігурі 268) головного мозку дорослих і молодих довгохвостих макак, що одержували гпАБА інтратекально (ІТ) або інтрацеребровентрикулярно (ІЦВ), були порівнянними.
Потім отримані при біопсії проби тканини головного мозку дорослих і молодих довгохвостих макак аналізували з метою визначення концентрації гпА5бА, яка відклалася у вилученій пробі тканини, та порівнювали отримані концентрації з терапевтичною цільовою концентрацією 2,5 нг
ГПАЗА на 1 мг білка (відповідає 10 95 від нормальної концентрації гпПА5А у здорової людини). Як проілюстровано на Фігурі 27А, у кожній аналізованій пробі тканини, отриманої при біопсії, ІТ введення гПАБА в дозі 18,6 мг призводило до концентрації ГПАБА, що перевищувала цільову терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг білка. Аналогічно, коли гпАБА у дозі 1,8 мг ІТ вводили молодим довгохвостим макакам, у кожній аналізованій пробі тканини, отриманої при біопсії, концентрація гпАБА була в межах або перевищувала цільову терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг білка, а медіани концентрації гпПАБА були вищими від терапевтичного цільового рівня для тестованих тканин, отриманих при біопсії (Фігура 278).
Щоб визначити, чи розподілилася введена ІТ гпАБА до відповідних клітин, аналізували тканину з глибоких шарів білої речовини яванської макаки, що одержувала гпАБА у дозі 1,8 мг
ІТ, з області, показаної на Фігурі 28А. Імунне офарблення глибоких шарів білої речовини виявило розподіл гГпПАБА до олігодендроцитів довгохвостих макак, що ілюструє Фігура 288.
Аналогічно, Фігура 28С ілюструє, що введена Ії г(пАБА демонструє сумісну локалізацію в глибоких шарах білої речовини довгохвостих макак. Зокрема, при офарбленні явно видно сумісну локалізацію з цільовими органелами, такими як лізосома (Фігура 28С), що підтверджує висновок про те, що введена ІТ гпПАБА здатна розподілятися до відповідних клітин, тканин і органел ЦНС, включаючи лізосоми олігодендроцитів. Вищевикладене підтверджує висновок про те, що відмінність між ІЦВ та ІТ доставкою також виявилася мінімальною при доставці гпАЗА.
Приклад 2: Бюрозподіл Радіоактивно-Міченого Білка
ІПАБА, мічений випромінювачем позитронів - 727, готували і складали із застосуванням основи з 154 мМ Масі, 0,005 95 полісорбату 20 при рН 6,0. Дорослим довгохвостим макакам інтрацеребровентрикулярно (ІЦВ) та інтратекально (ІТ) вводили об'єм лікарської форми, еквівалентний З мг гПпПАЗА (відповідний приблизно 38 мг/кг головного мозку). Довгохвостих макак піддавали позитронно-емісійній томографії з високою роздільною здатністю (мікроПЕТ Ра.) з метою оцінки розподілу введеної 124І-міченої гпПАБА.
Дані ПЕТ (Фігура 29) підтверджують, що введена ІТ /2Іі-мічена гпАБА ефективно розподілялася до тканин ЦНС і, зокрема, 727І-мічена гпА5А, яку вводили через ІТГ-катетер у поперековому відділі, негайно й рівномірно поширювалася в спинномозковій рідині (СМР) по всій довжині хребта. Зокрема, як показано на фіг. 29, після ІЦВ та ІТ введення в тканинах ЦНС випробуваних довгохвостих макак, включаючи головний мозок, спинний мозок і СМР, визначалися терапевтичні концентрації 727Іі-міченої ГПАБЗА. Концентрації гпА5А, які визначали в зазначених тканинах ЦНС і, зокрема, в тканинах головного мозку, перевищували цільову терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг білка.
Хоча розподіл білка гпАБА був порівнянним при ІТ та ІЦВ шляху введення, ІЦВ шлях введення призводив до значно меншого відкладання в хребетному стовпі, що підтверджується
Фігурою 29.
Через двадцять чотири години після введення лікарської форми, яку вводили як ІЦвВ, так і ІТ, 124ї-мічена АБА ефективно розподілялася до тканин ЦНС. Зокрема, через двадцять чотири години після ІТ введення 12,4 95 введеної дози виявлялося в головному відділі, тоді як при ІЦВ введенні в головному відділі виявлялося 16,7 95 від введеної дози. Відповідно, концентрації
ГАБА, які виявляли в зазначених тканинах ЦНС і, зокрема, в тканинах головного мозку, у випадку ІТ введення гпПАБА наближалися до концентрацій, які виявляли після ІЦВ введення такої ж дози.
ІЦВ ін'єкція 727|Ї-міченої ГПАБА призводить до негайного переносу введеного об'єму до мостомозочкової цистерни, мостової цистерни, міжніжкової цистерни та проксимального відділу хребта, як проілюстровано на Фігурі 30. На Фігурі 30 також проілюстрований той факт, що через 2-5 годин після ІТ введення "л|-мічена гпАБА доставляється до тих же початкових компартментів (цистерн і проксимального відділу хребта), доставка до яких була показана і при
ЩВ введенні. Через двадцять чотири години після як ІЦВ, так і ІТ введення розподіл 724І-міченої
ТАБА до областей цистерн і проксимального відділу хребта був порівнянним, що бо проілюстровано на Фігурі 31. Відповідно, вищевикладені результати свідчать, що, на відміну від низькомолекулярних лікарських препаратів, для ІгпАБА ІЦВ введення супроводжується мінімальними перевагами в порівнянні з ІТ-введенням.
Зазначені результати підтверджують, що ГППАБА можна доставляти до організму суб'єкта із застосуванням менш інвазивного ІТ шляху введення і при цьому досягати терапевтичних концентрацій у клітинах і тканинах-мішенях.
Лізосомні хвороби накопичення являють собою сімейство генетичних розладів, які викликаються відсутністю або дефектом ферментів, які призводять до аномального накопичення субстратів. Хоча периферичні симптоми, пов'язані з деякими із зазначених захворювань, можна ефективно полегшувати шляхом внутрішньовенного введення рекомбінантних ферментів, не можна очікувати, що внутрішньовенне введення таких рекомбінантних ферментів значно вплине на прояви з боку ЦНС, пов'язані з більшістю лізосомних хвороб накопичення. Наприклад, рекомбінантна ідуронат-2-сульфатаза людини (ідурсульфаза, ЕлапразаФ; «Зпіге Нитап Сепеїїс ТПегаріе5, Іпс.», Лексингтон, Масачусетс) схвалена для лікування соматичних симптомів синдрому Хантера, але не є засобом медикаментозної терапії неврологічних проявів, які включають затримку розвитку і прогресуюче зниження розумової діяльності. Почасти це пов'язано з природою 125, яка являє собою великий фермент із високим ступенем глікозилювання і з молекулярною масою приблизно 76 кДа, який не проходить через гематоенцефалічний бар'єр після внутрішньовенного введення.
Таким чином, автори даного винаходу розробили програму для вивчення інтратекальної доставки лікарських форм для інтратекального введення рекомбінантних ферментів людини, наприклад, таких як ідуронат-2-сульфатаза (125), арилсульфатаза (ПАЗА) і альфа-М- ацетилглікозамідаза (Мадій). Результати, представлені в даній заявці, оприлюднюються вперше, щоб продемонструвати, що ІТ введення рекомбінантних лізосомальних ферментів до поперекового відділу призводить до доставки суттєвої частки введеного білка до головного мозку і, зокрема, призводить до масштабного відкладання таких білків у нейронах головного мозку та спинного мозку як у довгохвостих макак, так і у собак. Імуногістохімічний аналіз тканин
ЦНС продемонстрував, що білки направляються до лізосом, - ділянки патологічного накопичення глікозаміногліканів при лізосомних хворобах накопичення. Крім того, морфологічні покращення, продемонстровані в моделі синдрому Хантера на мишах ІКО, у моделі хвороби
Санфіліппо типу В на Мадіи-дефіцитних мишах і в моделі метахроматичної лейкодистрофії (МЛД) на нокаутних мишах, підтверджують той експериментальний факт, що фермент, який вводиться ІТ, розподіляється до відповідних тканин і транспортується до відповідних компартментів та органел клітин.
Подібності характеру розподілу, який спостерігається після Ії та ІЦВ введення 125, дозволяють припустити масове пересування й активне перемішування СМР. Таким чином, у клінічних умовах і ІТ, і ІЦВ шлях введення є потенційно застосовним, однак відкладання 125 у спинному мозку, яке спостерігається після ІТ введення, забезпечує явну перевагу даного шляху введення при боротьбі зі спинномозковими наслідками й компонентами лізосомних хвороб накопичення, таких як синдром Хантера. Крім того, порти для ін'єкцій у спинний мозок є менш інвазивними, і припускається, що вони більше підходять для тривалого застосування, особливо у педіатричних пацієнтів.
Дані, отримані при офарбленні периваскулярних клітин і при оцінці динаміки транслокації білків, які спостерігалися при вищезгаданих ПЕТ дослідженнях, вказують на те, що фермент рухається периваскулярним простором, ймовірно за допомогою конвекційних механізмів, що супроводжуються пульсацією. На основі спостережуваного взаємозв'язку 125 із нейрофіламентами можна припустити, що додатковим механізмом транспорту є аксональний транспорт. Останній, ймовірно, починається із взаємодії білка з нейрональними рецепторами маноза-б6-фосфату (МбР), які повсюдно експресуються в клітинах спинного та головного мозку і які при прямому введенні до паренхіми головного мозку можуть призводити до того, що фермент І25 буде легко всмоктуватися до клітини-мішені (Ведієу, еї аіІ., Си Рпагт Оез (2008) 14: 1566-1580).
Хоча вказівки на аксональний транспорт лізосомальних ферментів раніше вже одержували непрямими методами іп мімо і шляхом візуалізації іп міго, у даних дослідженнях були отримані перші прямі підтвердження аксонального транспорту невірусних або експресованих ферментів, що доставляються через СМР. Таким чином, доставка білків зі СМР до поверхні головного мозку з більш глибоких тканин головного мозку очевидно залежить від процесів активного переносу, жоден із яких раніше не був описаний або пояснений для доставки білків чи ферментів до клітин, тканин і органел головного мозку.
На противагу переважній точці зору про те, що динаміка потоку в інтерстиції паренхіми й бо СМР може перешкоджати розподілу білків, що вводяться інтратекально до поперекового відділу, у білій речовині головного мозку, дані дослідження явно демонструють, що ІТ доставка лізосомальних ферментів призводить до розподілу і накопичення білка в усіх тканинах головного мозку й до відкладання їх у лізосомальному компартменті клітин-мішеней, які є ділянкою патологічного накопичення глікозаміногліканів (див., наприклад, Репзіегптаснег еї аї.,
Апп М У Асай 5сі (1988) 531:29-39 апа біспіго еї аїЇ., Меигоіоду (1976) 26:1-8). У сукупності з менш інвазивним характером ІГ-поперекової доставки даний шлях введення забезпечує клінічно значущий спосіб доставки біопрепаратів до головного мозку, зокрема у дітей.
Приклад 1: Склади для ІТ введення арилсульфатази А
Даний приклад узагальнює роботу з розробки рідкої лікарської форми з високою концентрацією гппАБА (арилсульфатази А) і складання лікарської субстанції та лікарського продукту для лікування метахроматичної лейкодистрофії (МЛД) через інтратекальний (ІТ) шлях введення.
Дані з вивчення стабільності демонструють, що склади лікарської субстанції та лікарського продукту на основі сольових розчинів (без ФБР 20) є стабільними протягом 18 місяців при « -65 76 і 18 місяців при 2-8 "С. Під час фармацевтичної розробки даного білка були досліджені розчинність і стабільність гПАБА в умовах обмеженості буферного розчину й допоміжних речовин у результаті її передбачуваної доставки до ЦНС. Раніше були проведені попередні дослідження з розробки складу для внутрішньовенного (ВВ) введення. Грунтуючись на результатах даних експериментів, склад, що містить 30 мг/мл гпАБА в 10 мМ цитратно- фосфатному буфері, рН 5,5, з додаванням 137 мМ Масі і 0,15 95 полоксомеру 188, був обраний для складу для ВВ введення. Також був розроблений склад для ІТ доставки ПАЗА у трьох варіантах, і дані з вивчення стабільності цього білка були вивчені в цих умовах. Були використані проби гпАБА, зроблені на одній ділянці з початкової сировини. Результати показали, що гПА5БА була стабільною в 154 мМ розчині хлориду натрію з додаванням 0,005 95 полісорбату 20 (Р20), рН 6,0, протягом щонайменше 18 місяців при 2-8 "С. Крім цього, були проведені дослідження, що показують стабільність при заморожуванні -відтаванні та деградації, викликаній трясінням.
Партії для розробки очищали, піддали ультрафільтрації та діафільтрації (УФ/ДФ) до 10 мМ цитратно-фосфатного буферу, 137 мМ Масі, рН 5,5, з наступною УФ/ДФ до кінцевого сольового розчину з концентрацією приблизно 40 мг/мл. Процедури УФ/ДФ підсумовані в Таблиці 7.
Таблиця 7
Відібрані склади для процедур УФ/ДФ з ХсеїІегех-Оегімей
Початковий буфер і УФ/ДФ до сольового розчину 10 мМ цитратно-фосфатний, 137 мМ Масі, рН 5,5. Наступна о . я
А УФ/дф до 154 мМ Масі. Кінцевий рн 5,9 0,005 76 полісорбат 20 10 мМ цитратно-фосфатний, 137 мМ Масі, рН 5,5. Наступна
УФ/ДФ до 5 мМ фосфату натрію, 145мМ Масі, рН 6,0. Кінцевий) 0,005 95 полісорбат 207 рнб,о 10 мМ цитратно-фосфатний, 137мМ Масі, рН 5,5. Наступна
Сб УФ/ДФ до 10 мм цитратно-фосфатного, 137 мМ Масі, рН 7,0, її 0,005 95 полісорбат 207 друга УФ/ДФ до 154 мМ Масі. Кінцевий рН 6,5
ГПАБА
ГАБА в складі 40 мг/мл гпАБА в 10 мМ цитрат-фосфаті натрію з 137 мМ Масі, рН 5,6, діалізували до п'яти складів, які були використані для досліджень складів для Ії введення (Таблиця 8).
Таблиця 8
Буфери, обрані для вивчення складів, сумісних з ІТ введенням
Номер складу Буфер 111171 М5амМ масі 1111712 54 мМ масі" 77717173 77 БМ фосфатний буфер з 145 мМ Масі | 60
Таблиця 8 (продовження)
Для визначення температури плавлення (Тп) за допомогою диференціальної скануючої калориметрії (ДСК) був використаний капілярний ДСК-мікрокалориметр (МісгоСаї) із частотою сканування 60 "С/год. і діапазоном температури 10-110 "С. Базові лінії буфера віднімалися з графіків білка. Зображення нормували за концентрацією білка в кожному зразку (виміряною за допомогою УФ-поглинання при 280 нм із використанням коефіцієнта екстинкції 0,69 (мг/мл).см"
У. Для початкових експериментів з вивчення короткострокової стабільності, лікарську субстанцію гпПА5БА піддали впливу або 40 "С протягом двох тижнів, або 40 "С протягом одного місяця. Додаткові зразки помістили на 2-8 "С на З місяці для вивчення короткострокової стабільності. Зразки фільтрували (МіПроге, Р/М 5 ЗМОЗ33К5) і аліквоти об'ємом 0,5 мл були розподілені до пробірок об'ємом 2 мл з 13 мм пробками Рінигоїес.
Вплив складу композиції (Таблиця 8) на Тп (температурна серединна точка денатурації, викликаної температурою) досліджували, використовуючи ДСК. Значення Тп для різних композицій складів показані на Фігурі 5. Значення Тп демонстрували схожі температури денатурації для більшості складів, за винятком низьких значень Тп, які спостерігалися для
ГПАЗА в складі з 5 ММ фосфатом натрію з додаванням 154 мМ Масі, рН 7,0, або 1 мм фосфату натрію з 2 мМ Сас» і 137 мм Масі, рН 7,0.
Вплив температурного руйнування на гпА5БА у п'ятьох обраних складах (Таблиця 8) також був досліджений. Зразки зберігали або протягом 2 тижнів, або протягом одного місяця при 40 С, або протягом З місяців при 2-8 "С. Аналіз методом електрофорезу в ПААГ з ДСН (офарблення Кумассі) зразків, що зберігалися протягом 2 тижнів при 40 "С, показав фрагментацію гппАБА у складі з 5 мМ фосфатом натрію з 154 мМ Масі, рН 7,0, які з 1 мм фосфатом натрію з 2 мМ Сасі» і 137 мМ Масі, рН 7,0 (Фігура 6). Подібна деградація не спостерігалася для інших складів.
Присутність продуктів деградації узгоджується з меншим вмістом основного піку, який спостерігали за допомогою ВЕРХ зі зворотною фазою (КР-НРІ С) для тих же часових точок (Таблиця 10). Також було встановлено, що гПА5А у складі з 1 мМ ФБР з 2 мМ Сасі», рН 7,0, не підтримувала рН на початку і протягом короткострокового впливу умов температурного стресу.
Системи для ВЕРХ виробництва УМаїес: були використані для аналізу методами ексклюзійної ВЕРХ і ВЕРХ зі зворотною фазою. Для початкового аналізу методом ексклюзійної
ВЕРХ 50 мкг ПАЗА вводили до колонки Адііепі 2ограх СЕ-250 (4,6 мм х 250 мм) і аналізували в ізократичному режимі при швидкості потоку 0,24 мл/хв, використовуючи як рухому фазу 100 мМ цитрат натрію, рН 5,5 (визначення октомера) з довжиною хвилі детектора 280 нм. Аналізи повторювали, використовуючи як рухому фазу 100 мМ цитрат натрію, рН 7,0 (визначення димера).
Усі зміни буфера й етапи концентрування здійснювали з використанням пробірок Сепігісоп-
Ріиз 20 (Мійроге, 10 Коба МУУСО).
Дослідження складів - вплив виду буфера і рн
У зв'язку з обмеженою кількістю підходящих композицій, які застосовуються для введення до ЦНС, тільки п'ять ізотонічних композицій розчинів, які перераховані в Таблиці 8, були відібрані для вивчення.
Пам'ять рН
Перед вибором буферів для вивчення тривалої стабільності були проведені два експерименти з "пам'яті рН" для того, щоб установити здатність білка, буфер якого був замінений на сольовий розчин, підтримувати рН початкового буфера. У початковому експерименті гпА5А у концентрації приблизно 8 мг/мл спочатку діалізували до 10 мМ цитратно- фосфатного буфера з 137 мМ Масі, рн 5,5 або 7,0, після чого здійснювали другий діаліз до сольового розчину. У другому експерименті гпПАБА спочатку діалізували до 10 мМ цитратно- фосфатного буфера з 137 мМ Масі, рН 5,5 або 7,0, з наступною заміною буфера й концентруванням у сольовому розчині до концентрації приблизно 35 мг/мл.
Коли гпАБА в 10 мМ цитратно-фосфатному буфері з 137 мМ Масі, рН 5,5 або 7,0, діалізували до сольового розчину, не спостерігалося підвищення мутності. рН кінцевого сольового розчину був подібним до рН попереднього цитратно-фосфатного буфера, в якому він містився. Коли гпПАБА в 10 мМ цитратно-фосфатному буфері з 137 мМ Масі, рН 5,5 або 7,0,
діалізували до сольового розчину і потім концентрували до концентрації приблизно 35 мг/мл, використовуючи пробірки Сепігісоп, рН сольового розчину білка зміщався від 5,5 до 5,8 або від 7,0 до 6,8 відповідно. Обидва концентровані розчини гПАБА в сольових розчинах мали слабку опалесценцію та значення оптичної щільності при довжині хвилі 320 нм у діапазоні від 0,064 (рн 6,8) до 0,080 (рН 5,5).
Вибір допоміжних речовин
Полісорбат 20 (Р20) був включений до всіх 5 обраних розчинних композицій у кінцевій концентрації 0,005 95. Вибір поверхнево-активної речовини був зроблений, грунтуючись на попередніх експериментах іп мімо з переносимості Р20 у концентрації 0,005 95 для доставки до
ЦНС інших білків. Готували розчин 595 Р20 (об'єм/об'єм) і необхідний об'єм додавали до кожного складу білка для одержання кінцевої концентрації 0,005 905.
Дослідження стійкості складу - вивчення стабільності
Грунтуючись на початкових результатах, отриманих при вивченні різних видів буфера і значень рН, три склади розчинів були відібрані для вивчення довгострокової стабільності (готування зразків проводили відповідно до Таблиці 8). Дослідження тривалістю один рік розпочали для запропонованих складів (Таблиця 9). Стабільність зразків у кожній часовій точці аналізували методами ексклюзійної ВЕРХ, ВЕРХ зі зворотною фазою, електрофорезу в ПААГ з ДСН (офарблення Кумассі), вимірювання оптичної щільності при 320 нм (00320), а також за параметрами концентрації білка, рН, питомою активністю та зовнішнім виглядом.
Таблиця 9
Склади для вивчення довгострокової стабільності 75 Би доорат крю ТАБ ВИ КеСГ вно еи
РТ
Ніяких суттєвих змін у питомій активності зразків, які піддавали стрес-умовам, не було виявлено (Таблиця 10). Аналіз методом ексклюзійної ВЕРХ виявив деяку деградацію зразка в 5 ММ фосфаті натрію з 154мМ Масі, рН 7,0, який зазнав температурного стресу протягом 2 тижнів. Деградація була більш вираженою при аналізі методом ексклюзійної ВЕРХ із використанням рухомої фази з рН 5,5 - тобто умов, що викликають асоціацію гПАБЗА в октамер.
В умовах цієї рухомої фази, гппАЗА у складі лікарської форми з рН 7,0 в 1 мМ ФБР із 2 мМ Сасі» також демонструвала значну деградацію.
Зразки в складі лікарської форми в 5 мМ ФБР, рН 7,0, і 1 мМ ФБР, рН 7,0, з 2 мМ Сасі;, витримані протягом місяця при 40 "С, демонстрували фрагментацію при аналізі методом електрофорезу в ПААГ з ДСН (дані не показані). На додаток до цього дослідження, зменшення процентного вмісту основного піку також спостерігалося при аналізі методами ВЕРХ зі зворотною фазою та ексклюзійної ВЕРХ для зразків, що зберігалися в лікарській формі з цими двома складами з рН 7 (Таблиця 11). Зниження питомої активності, проте, було виявлене тільки для ІППАБА у лікарській формі в 5 мМ ФБР, рН 7,0.
Таблиця 10
Стабільність обраних складів після зберігання протягом 2 тижнів при 40:52 С
Ексклюзій|Ексклюзій . на ВЕРХ | на ВЕРХ |. ВЕРХ зі
Концентра О032 (основног (основног зворотною Питома
Склад Зовнішній вигляд! ція білка 0 о піку) о піку) фазою (95 |рН| активність (мг/мл) основного (Од/мг) при рН | при рН . 5,5 7,0 піку)
Прозорий до
Точка злегка 29,9. |0,044| »999 99,7 99,8 |5,6 74
ВІДЛІКУ опалесцентного
Таблиця 10 (продовження)
Ексклюзій|Ексклюзій . на ВЕРХ | на ВЕРХ |. ВЕРХ зі
Концентра зворотною Питома у г 0032 (основног| (основног о .
Склад Зовнішній вигляд! ція білка 0 о піку) о піку) фазою (95 |рН| активність (мг/мл) У У) основного (Од/мг) при рН | при рН . 5,5 7,0 піку)
Прозорий до умови опалесцентного
Сольовий розчин, рН 7,0
Прозорий до відліку опалесцентного
Прозорий до умови опалесцентного
ММ ФБР, рі 6,0
Прозорий до відліку опалесцентного
Прозорий до отрес злегка зо,5 0076! 98,8 99,7 99,7. |5,9 95
У опалесцентного 5 ММ ФБР, рН 7,0
Прозорий до відліку опалесцентного
Злегка
Стрес- |опалесцентний | 35 0041) 954 99,4 98,0 94 умови до опалесцентного 1 мМ ФБР, рН 7,0 з 2 мМ Сасі», рН 7,0
Прозорий до відліку опалесцентного
Злегка
Стрес- опалесцентний 277 0,042 94,8 99,8 93 умови до опалесцентного
Таблиця 11
Стабільність обраних складів для ІТ введення після зберігання протягом 1 місяця при 405276 и --| ВЕРХ зі
Ексклюзій | Ексклюзій зворотно
Концентр на ВЕРХ | на ВЕРХ р Питома у ший 0032 ю фазою :
Склад Зовнішній вигляд (ація білка 0 (основного(основного (в рН активніст (мг/мл) піку) при | піку) при " ь (Од/мг)
Н5Б 5 рН 7,0 основно ри»; " о піку)
Сольовий розчин, рН 5,9 відліку опалесцентного умови опалесцентного
Таблиця 11 (продовження) я -«-| ВЕРХ зі
Ексклюзій | Ексклюзій зворотно
Концентр на ВЕРХ | на ВЕРХ р Питома у ший 0032 ю фазою :
Склад Зовнішній вигляд (ація білка 0 (основного(основного (в рН активніст (мг/мл) піку) при | піку) при " ь (Од/мг) основног рН 5,5 рН 7,0 . о піку)
Сольовий розчин, рН 7,0 відліку опалесцентного мови опалесцентного
ММ ФБР, рН, відліку опалесцентного умови опалесцентного 5 ММ ФБР, рН 7,0 відліку опалесцентного место ру в умови до опалесцентного 1 мМ ФБР, рН 7,0 з 2 мМ Сасі», рН 7,0 відліку опалесцентного умови до опалесцентного
Після зберігання протягом З місяців при 2-8 "С гпА5А зберігав активність у лікарській формі для всіх складів (Таблиця 12). Крім того, ГПАЗА зберігав » 99,8 95 площі основного піка, що було 5 встановлено методом ексклюзійної ВЕРХ в умовах обох рухомих фаз. Дані зі стабільності протягом З місяців підсумовані в Таблиці 12.
Таблиця 12
Стабільність обраних варіантів буфера протягом з місяців при 2-8 С я «| ВЕРХ зі
Ексклюзій |Ексклюзій зворотно
Концентр на ВЕРХ | на ВЕРХ р Питома у ший 0032 ю фазою :
Склад Зовнішній вигляд ація білка 0 (основног | (основног (в рН активніст (мг/мл) о піку) при піку) при " ь (Од/мг) основног рН 5,5 рН 7,0 . о піку)
Сольовий розчин, рН 5,9 відліку опалесцентного умови опалесцентного
Сольовий розчин, рН 7,0 відліку опалесцентного умови опалесцентного 5 ММ ФБР, рН 6,0 відліку опалесцентного
Таблиця 12 (продовження) я «| ВЕРХ зі
Ексклюзій |Ексклюзій
Концентр наВЕРХ на ВЕРХ ГОрОтно Питома у ший 0032 ю фазою :
Склад Зовнішній вигляд ація білка 0 (основног | (основног (96 рН активніст (мг/мл) о піку) при піку) при ь (Од/мг) рН | рн, | сновног о піку) умови опалесцентного
ШО есте и ви рою яв в ері відлік опалесцентного міх ожиною те | ог | теорі тео умови опалесцентного
ШТ, Гн те сив рою чне т (звер я відліку опалесцентного
МЕ Конні ве пов зе нене умови опалесцентного
ГПАЗА в лікарській формі з сольовим буфером, рН 7,0, ії 1 мМ ФБР, рН 7,0, з 2 мМ Сасі» також досліджували після зберігання протягом З місяців у прискорених умовах при 25 "С. Як показано на Фігурі 7, гпАБА в лікарській формі з цими складами піддавали незначній фрагментації (з інтенсивністю, яка дорівнює піку приблизно 0,5 95 домішки БСА).
У сукупності дослідження складів продемонстрували, що стабільність гпПАБА зберігається при значенні рН у діапазоні від 5,5 до 6,0. У всіх дослідженнях з використанням складів розчинів із рН 7,0, гтАБА демонструвала фрагментацію, яка є одним із механізмів її деградації.
Результати з вивчення температурного стресу, отримані для потенційних складів для ІТ введення при рН 7,0, були подібними до результатів з вивчення температурного стресу, отриманих для складів для ВВ введення (10 мМ цитрат-фосфат натрію з 137 мМ Масі) при рн 7,0, де також спостерігалася фрагментація. Грунтуючись на цих дослідженнях, три склади, наведені в Таблиці 9, були обрані для вивчення довгострокової стабільності.
Дослідження заморожування-відтавання
Експерименти з заморожування-відтавання проводили зі здійсненням трьох циклів контрольованого заморожування-відтавання від кімнатної температури до -50 "С зі швидкістю 0,1 "С/хв на полицях ліофілізатора Мегпів Сепевзів З5ЕЇ. Аліквоти лікарської субстанції об'ємом 1 мл з концентрацією 30 мг/мл у лікарській формі кожної з п'яти композицій розчину (Таблиця 8) були поміщені до скляних віал об'ємом З мл для дослідження.
Для всіх експериментів заморожування-відтавання використовували лікарську субстанцію (38:4 мг/мл). Для експериментів з контрольованого заморожування-відтавання малого масштабу аліквоти лікарської субстанції об'ємом 2 мл поміщали до скляних віал об'ємом 5 мл із 20 мм пробками РЕїІйгоїес. Експерименти з вивчення стрес-умов заморожування-відтавання проводилися або на полицях ліофілізатора Міпіз Сепевзів З5ЕЇ,, або на полицях програмувальної кріоморозильної камери (Теппеу г Оргідні Тезі Спатбег, модель: ТШОК-А-МЕКМ). Три цикли заморожування до -50 "С і відтавання до 25 "С були здійснені або зі швидкістю заморожування й відтавання 0,1 С/хв (використовуючи програмувальну кріокамеру), або зі швидкістю заморожування 0,1 "С/хв і зі швидкістю відтавання 0,03 "С/хв (використовуючи ліофілізатор).
Для основної маси досліджень заморожування-відтавання, 90 мл лікарської субстанції поміщали до бутлів з полікарбонату об'ємом 250 мл. Для досліджень заморожування- відтавання на сухому льоді, З мл лікарської субстанції поміщали до віал з полікарбонату об'ємом 5 мл (Віоїаіпег Р/М 3500-05) з поліпропіленовими кришками, що загвинчуються, і без них. Зразки були заморожені протягом ночі до « -65 "С і потім поміщені на сухий лід у закритому лотку. У цих експериментах скляні віали, закриті пробкою, які містять той же об'єм зразка, були використані як контроль. Для досліджень заморожування-відтавання розведеної лікарської субстанції, аліквоти об'ємом 1 мл із концентрацією 1 і 5 мг/мл поміщали до поліпропіленових туб і заморожували до «х -65 "С. Заморожені зразки потім відтавали на робочій поверхні стола. Цикл повторювали більше 10 разів для імітації будь-якого потенційного стрес-впливу, який може виникнути при маніпуляціях з аліквотами зразка порівняння.
Вплив заморожування-відтавання на якість ГПАБА у запропонованих складах з 0,005 95 Р2О0 був досліджений після 3 циклів заморожування-відтавання з контрольованою швидкістю (0,1 "С/хв). Ніяких змін у зовнішньому вигляді ГПАБА не було зафіксовано і ніяких розчинних агрегатів або продуктів деградації не було виявлено з використанням методів ексклюзійної
ВЕРХ і ВЕРХ зі зворотною фазою. Крім цього, ніяких смуг, що відповідають продуктам фрагментації або агрегації, не було виявлено при аналізі методом електрофорезу в ПААГ з
ДСН в редукуючих умовах (дані не показані). У Таблиці 13 підсумовані результати цих досліджень.
Таблиця 13
Вплив заморожування-відтавання в малому масштабі на якість лікарської субстанції ГПАЗА и м ВЕРХ зі
Ексклюзійна | Ексклюзійна зворотно у . ВЕРХ ВЕРХ р Питома
Зовнішній Концентрація ю фазою :
Склад : (основного | (основного о рН. активність вигляд білка (мг/мл) : : (до піку) при піку) при (Од/мг)
Н5Б рн7,) основног ри», " о піку)
Сольовий розчин, рН5,9
Прозорий до
Точка злежа 29,9 НА" НА НА 56) 102 відліку опалесцентног о
Прозорий до
Стрес- |злега 294 »99,9 994 | 55 умови опалесцентног о 12202000 11 розчин.
Прозорий до
Точка злещка 29,0 НА НА НА |67 94 відліку опалесцентног о
Прозорий до
Стрес- злегка 25,0 »99,9 99,2 умови опалесцентног о 5 ММ ФБР, рН,
Прозорий до
Точка злещка 29,8 НА НА НА |59 92 відліку опалесцентног о
Прозорий до
Стрес- зпещжка 31 »99,9 997 995 | 5,9 95 умови опалесцентног о 5 ММ ФБР, рН 7,0
Прозорий до
Точка злегка 29,7 НА НА НА відліку опалесцентног о
Прозорий до
Стрес- злегка 29,9 »99,9 112 умови опалесцентног о 1 мМ ФБР,
Таблиця 13 (продовження) и м ВЕРХ зі
Ексклюзійна | Ексклюзійна зворотно м й ВЕРХ ВЕРХ р Питома
Зовнішній Концентрація ю фазою :
Склад : (основного | (основного о рН. активність вигляд білка (мг/мл) : : (до піку) при піку) при (Од/мг) основног рно,5 рн, . о піку)
Прозорий до
Точка злежа 27,5 НА НА НА. | 56 відліку опалесцентног о
Прозорий до
Стрес- зпетка 27,3 »99,9 993 | 6,7| 103 умови опалесцентног о "Не аналізували
Результати досліджень з заморожування-відтавання з контрольованою швидкістю в малому масштабі були здійснені в трьох повторах на аліквотах лікарської субстанції об'ємом 2 мл і підсумовані в Таблиці 14. Ніяких змін якості субстанції не було зафіксовано. Зовнішній вигляд замороженої й відталої лікарської субстанції був порівнянним із зовнішнім виглядом базового зразка. Не було виявлено ніякого зниження концентрації або чистоти матеріалу.
Таблиця 14
Вплив заморожування-відтавання в малому масштабі на якість лікарської субстанції ГПАЗА 01 С/лхв заморожування-0,1 "С/хв відтавання 01 С/лхв
Швидкість заморожування/відтавання | Точка відліку | з використанням заморожування- програмувальної | 0,03 "С/хв відтавання кріоморозильной З використанням камери ліофілізатора
Прозорий до Прозорий до . ни злегка Прозорий до злегка
Зовнішній вигляд злегка опалесцентно опалесцентного о опалесцентного
Концентрація білка (мг/мл)
Оптична щільність при 320 нм 0,044 0,045 0,043
Ексклюзійна ВЕРХ (основного піку) 99,6 95 99,7 90 99,7 90 ї о,
ВЕРХ («|зі зворотною фазою (95 299,9 9; 299,9 9; 299,9 9; основного піку)
Специфічна активність (Од/мг) 65 | 69 !/ 7 /
Усі експерименти продемонстрували, що гпАБА зберігає параметри якості після заморожування-відтавання. Слід зазначити, що тенденція до незначного зниження була відмічена для активності й процентного вмісту основного піку при аналізі методом ВЕРХ зі зворотною фазою для зразка гпАБА з концентрацією 1 мг/мл після десяти циклів заморожування-відтавання, як показано в Таблиці 15.
Таблиця 15
Вплив заморожування-відтавання в малому масштабі на якість лікарської субстанції гпПАЗА, розведеної до концентрації 1 мг/мл основного пік рн77777777711111111111111111111111111158 | 58 | 58 | 58 |ДЮБК 58 (Специфічнаактивність(Од/м)).й | 78 | 76 | 75 | 69 | 65
Експерименти зі струшування
Аліквоти об'ємом 1,0 мл стерильного відфільтрованого білка в лікарській формі з концентрацією 30 мг/мл у кожній із п'яти обраних композицій розчинів (Таблиця 8) з Р20 поміщали до скляних віал об'ємом З мл з 13 мм пробкою Ріпгоїес. Віали в горизонтальному положенні поміщали на орбітальний струшувач (І абіїпе Огбйа! Зпакег) і струшували протягом 24 годин при 100 об/хв. Потім частоту підвищували до 200 об/хв протягом наступних 24 годин струшування.
З метою вивчити чутливість ГПАБА до струшування проводили вивчення струшування й перемішування як для лікарської субстанції, так і для лікарського препарату в концентрації 35,4 і 30 мг/мл відповідно. Для даних досліджень, аліквоти лікарської субстанції об'ємом 1,0 мл поміщали до скляних віал об'ємом З мл з 13 мм пробками РіІнигоїес. Віали, які піддавали струшуванню, перевіряли щогодини протягом перших 8 годин і потім у часових точках 24 і 48 годин. Віали виймали з появою перших ознак помутніння й аналізували. Оцінювали зовнішній вигляд зразків, потім зразки аналізували методом ексклюзійної ВЕРХ, а також за параметрами рН, питомою активністю та оптичною щільністю при 320 нм. Дослідження струшування лікарського препарату проводили в трьох повторах (в 154 мМ Масі, рН 6,0, з 0,005 95 Р2О) і порівнювали з дослідженням лікарської субстанції в одному повторі (в 154 мМ Масі, рН 6,0).
Дослідження струшування також повторювали без включення Р20 до складу сольового розчину.
Для цих досліджень, аліквоти лікарського препарату з концентрацією 30 мг/мл об'ємом 1 або
З мл поміщали до віал об'ємом З мл для дослідження впливу струшування, а також об'єму вільного простору над продуктом на якість ГПАБА. Для цих досліджень впливу струшування була використана швидкість 220 об/хв.
Початкові дослідження струшування, проведені для розробки складів для ВВ введення
ГАБА, продемонстрували потенційну перевагу присутності поверхнево-активної речовини. При розробці сполук для Ії введення, 0,005 95 Р2О був обраний і включений до складів для дослідження струшування. Після 15-24 годин струшування при 100 об/хв не було встановлено ніяких візуальних змін у жодному складі, і швидкість струшування збільшили до 200 об/хв.
Ніяких змін зовнішнього вигляду зразків, які піддавали струшуванню, у запропонованих варіантів складів не було зафіксовано після сумарного струшування протягом 48 годин при 100 і 200 об/хв. Зразки тестували за закінченням цього періоду; отримані результати підсумовані в
Таблиці 16. Ніяких змін не було зафіксовано жодним із аналізів. Аналіз методом електрофорезу в ПААГ з ДСН у редукуючих умовах при офарбленні Кумассі також не виявив додаткових смуг із більшою або меншою молекулярною масою в зразках, які піддавали струшуванню (дані не показані).
Таблиця 16
Результати досліджень струшування обраних складів для ІТ введення
Ексклюзійна ВЕРХ зі
Концентрація ВЕРХ зворотною Питома
Склад Зовнішній вигляд знцентрац 00320 | (основного | фазою (95 | активність білка (мг/мл) . піку) при рН | основного (Од/мг) піку)
Сольовий розчин, рН 5,9 відліку | опалесцентного умови |опалесцентного
Сольовий розчин, рН 7,0 відліку | опалесцентного умови |опалесцентного 5 ММ ФБР, рН 6,0 відліку | опалесцентного умови |опалесцентного 5 ММ ФБР, рН 7,0 відліку | опалесцентного умови |опалесцентного 1 мМ ФБР, рН 7,0,32мМ С відліку | опалесцентного мови |опалесцентного " У зв'язку з проблемами з колонкою профіль димерних форм методом ексклюзійної ВЕРХ з рухомою фазою з рН 7,0 не був отриманий. "є Не аналізували
Ніяких змін лікарської субстанції (в 154 мМ Масі, рН 6,0) або лікарського продукту (в 154 мМ масі, рН 6,0, з 0,005 95 Р20) не було виявлено після перших 4 годин перемішування. Після 6 5 годин перемішування як лікарська субстанція, так і лікарський препарат стали злегка мутними (дані не показані). Помутніння стало більш вираженим після 48 годин перемішування у випадку, якщо Р20 не був присутнім у складі. До того ж, лікарська субстанція та лікарський препарат, які піддавали струшуванню, стали мутними через 24 години. Фігура 8 демонструє результати дослідження струшування протягом 48 годин.
Таблиця 17 і Таблиця 18 підсумовують результати досліджень струшування.
Таблиця 17
Зовнішній вигляд лікарської субстанції та лікарського препарату (З Р20) гппАЗА після перемішування
Лікарська субстанція після . . . .
Години . Лікарський препарат після перемішування перемішування
Точка Безбарвна, опалесцентна, я у. б. є. ' : Безбарвний, опалесцентний, вільний від часток відлік вільна від часток 6 |Пластівці(1-2),злегкамутна )|Волокнистий матеріал, злегкамутний.д//-://:/С/ 8 |Пластівці(1-2),злегкамутна )|Волокнистий матеріал, злегкамутний.д//-://://С/
Пластівці (1-2), злегка мутна |Волокнистий матеріал, дуже мутний
Таблиця 18
Зовнішній вигляд лікарської субстанції та лікарського препарату (З Р20) гппАЗА після струшування
Лікарська субстанція після струшування | Лікарський препарат після струшування
Безбарвна, опалесцентна, вільна від. | Безбарвний, опалесцентний, вільний від
Точка відліку часток часток 1116 |Беззмн/////////7777777777777777771 |Беззмн//////////////////ССсС 11178 |Беззмн//////////777777777777777771 |Беззмн////////////////ССсС
Пластівці (1-2) Волокна (1-2)
Волокна (1-2)
Зразки, які піддавали струшуванню, були проаналізовані методами ексклюзійної ВЕРХ і
ВЕРХ зі зворотною фазою, а також за параметрами 00320, рН, питомою активністю.
Результати представлені в Таблиці 19 і Таблиці 20. У цілому, не було виявлено ніяких суттєвих змін якості ГПА5БА після перемішування та струшування, за винятком змін зовнішнього вигляду.
Таблиця 19
Вплив 48-годинного струшування на лікарську субстанцію та лікарський препарат
Швидкість точка Лікарська субстанція Лікарський препарат заморожування/відтавання відліку після 48 годин після 48 годин струшування (п - 1) струшування (п - 3)
Оптична щільність при 320 нм 0,080 0,053 0,048
Ексклюзійна ВЕРХ (основного піку)| 99,7 95 99,7 90 99,7 90 ї о,
ВЕРХ «зі зворотною фазою (95 299,9 9; » 99,9 9; » 99,9 9; основного піку)
РН 77771111 11601111171717117160 71175989. ЮЖ БР
Специфічнаактивність(Од/м)ї | 96 | 7 !/ 72
У ході перемішування лікарського препарату з 0,005 95 Р2О через б годин один із трьох зразків у паралелі став мутним. Цей зразок був видалений, а два зразки, що залишилися, перемішували до 48 годин.
Таблиця 20 демонструє середні результати аналізу зразків у двох повторах.
Таблиця 20
Вплив 48-годинного перемішування на лікарську субстанцію та лікарський препарат
Лікарська . . бстанція після 6 Лікарський препарат . . Точка СУ ц після 48 годин
Швидкість заморожування/відтавання г. годин Й відліку ; перемішування перемішування (п - 2) (пе) ї о, вн 777711111111111111111111111111111160 1.7 60 | ЮюЮюЮюв6во сш (Специфічнаактивність(Од/м)ї | 69 | 73 | 7
На основі отриманих результатів і візуального дослідження лікарська субстанція й лікарський препарат не є високо чутливими до деградації, викликаної струшуванням, якщо останнє являє собою безперервне перемішування протягом 4 годин (при установці Мо 5) або безперервне енергійне струшування протягом 8 годин (при 220 об/хв) до прояву змін їхнього зовнішнього вигляду.
Дослідження впливу струшування були проведені повторно з лікарським препаратом без додавання Р20. Для цих досліджень кожну віалу наповнювали або 1 мл, або З мл лікарського препарату з метою вивчення впливу струшування, а також об'єму вільного простору над продуктом на якість ГПА5А. Для 1 мл препарату, поміщеного до віали об'ємом З мл, ніяких змін у зовнішньому вигляді лікарського препарату не було виявлено протягом 8 годин перемішування при 220 об/хв (п - 2, дані не показані). У віалах без вільного простору над продуктом (п - 1) спостерігалося утворення дрібних пластівців, декількох волокон і згустку швидше в порівнянні з віалами з більшим вільним простором над продуктом. Результати 48-годинного дослідження представлені на Фігурі 9.
Результати візуального визначення також підсумовані в Таблиці 21 і Таблиці 22.
Таблиця 21
Зовнішній вигляд лікарського препарату при відсутності полісорбату 20 після 48 годин струшування з наповненням віал 1 мл та З мл лі й . . . . Контроль (лікарський ікарський препарат після| Лікарський препарат після .
Години | струшування МІ О-200І- Іструшування МІ О-2001І -003 без препарат після 001 без Р?О РО струшування МІ 0О-2001 -001 з Р20)
Точка . . . я. 6 |Беззмн.///////////// |Беззмн//////////////// |Беззмнб 8 |Беззмн.////////////// |Беззмн//////////////// |Беззмнб
Таблиця 22
Зовнішній вигляд лікарського препарату при відсутності полісорбату 20 після 48 годин струшування з наповненням віал 1 мл ТА З мл . й . Контроль (лікарський препарат
Лікарський препарат після струшування МІ 0- |.
Годинник 2001001 без Р2О після струшування ут-О001тов З
Точка . М . я. відліку Безбарвний, опалесцентний, переважно вільний від часток 6 |Невеликіпластівці,кількаволоконізгусток |Беззмн///-/-: 8 |Невеликіпластівці,кількаволоконізгусток |Беззмн///-/-:
Ніяких змін концентрації білка не було виявлено. Крім того, ніяких розчинних агрегатів не було виявлено з використанням методу ексклюзійної ВЕРХ для об'ємів наповнення 1 мл або З мл (Таблиця 23 і Таблиця 24). Аналіз методом електрофорезу в ПААГ з ДСН в редукуючих умовах при офарбленні Кумассі також не виявив додаткових смуг із більшою чи меншою молекулярною масою в зразках, які піддавали струшуванню (дані не показані).
Таблиця 23
Результати 48 годин струшування лікарського препарату при відсутності полісорбату 20 з наповненням віал 1 мл та З мл
Лікарський препарат Лікарський препарат Контроль . Точка після 24 годин після 48 годин .
Аналіз о. ї й (п-1) З відліку | струшування (п - 2) без | струшування (п - 2) РО
Р2О без Р20
Концентрація (мг/мл) сютична щільність при 320 0,164 0,160 0,163 0,169
Ексклюзійна ВЕРХ) 99,5 99,5 99,5 (основного піку)
РН 171611 17171711 6111117 11111160 1160
Специфічна активність в в3 в? 72 (Од/мг)
Таблиця 24
Результати 48 годин струшування лікарського препарату при відсутності полісорбату 20 з наповненням віал 1 мл та З мл
Лікарський препарат | Лікарський препарат
А . Точка після 48 годин після 48 годин Контроль наліз а. и о відліку струшування струшування (п - 1) | (п - 1) з Р2О (п - 1) без Р2О без Р20
Концентрація (мг/мл) 31,02 сютична щільність при 320 0,152 0,163 0166 0,151
Ексклюзійна ВЕР (основного піку)
РН 17160 1 777171717171607717|1777171115896..ЮД.1| .Б60
Специфічна активність 70 в4 65 7 (Од/мг)
Дослідження буферної ємності
Для визначення буферної ємності гппАБА продукт титрували в трьох повторах або розведеною кислотою, або розведеним лугом. Аліквоти лікарської субстанції об'ємом 10 мл із концентрацією 38 або 30 мг/мл (остання для імітації лікарського препарату) поміщали до скляних віал об'ємом 20 мл, до яких поклали магнітну мікромішалку. Аліквоти об'ємом 1 мкл ІМ хлористоводневої кислоти (НСІ) додавали до розчину білка, перемішували вміст і вимірювали рН. Експеримент продовжили з додаванням по 1 мкл НСІ без промивання рН-чутливого електрода між вимірюваннями для запобігання розведення до досягнення величини рн приблизно 5,5. Експеримент проводили в трьох повторах; 5 ММ фосфатний буфер, що містить 150 мм хлорид натрію, рН 6,0, паралельно титрували для порівняння. Аналогічно, лікарську субстанцію в обох концентраціях титрували ТМ гідроксидом натрію (МаоН) до досягнення кінцевої величини рН приблизно 6,5. З метою дослідження наявності будь-якого залишкового фосфату в гпАЗА, лікарську субстанцію аналізували за допомогою методу мас-спектрометрії з індуктивно-зв'язаною плазмою (ІЗП-МС). Буферну ємність розведеної лікарської субстанції
ТАЗА також вивчали для того, щоб переконатися, що значення рН розчину не змінюється в результаті розведення розчину білка. Розведені зразки з діапазоном концентрацій від 30 мг/мл до 1 мг/мл готували в пробірках епендорф об'ємом 1,5 мл і вимірювали значення рнН після розведення та через один тиждень зберігання при 2-8 76.
Результати вивчення титрування розведеною кислотою й розведеним лугом продемонстрували відповідну буферну ємність розчинів ГПАБА. У дослідженні титрування з використанням НСІ початкове додавання приблизно 2 мкл 1 М кислоти не змінювало рнН ні лікарської субстанції, ні контрольного буфера. При збільшенні об'ємів кислоти, проте, спостерігалося стрімке зниження рН буфера в порівнянні з лікарською субстанцією гпА5А. Після додавання 13 мкл 19 М НС, рН контрольного буфера був більше, ніж на 2 одиниці рН нижчим, ніж рН лікарської субстанції. Лікарська субстанція з концентрацією 30 мг/мл була також включена до цих експериментів для імітації концентрації лікарського препарату. Фігура 10 ілюструє буферну ємність лікарської субстанції гГПАЗА в порівнянні з 5 мМ натрій-фосфатним буфером, рН 6,3, з 150 мм хлоридом натрію при титруванні кислотою.
Титрування лікарської субстанції гпАЗА гідроксидом натрію демонструвало відносно відмінні результати (Фігура 11) стосовно підтримання рН. Ступінь зміни рН суттєво не відрізнявся між лікарською субстанцією та контрольним буфером.
На основі отриманих результатів, не вдаючись у теорію, можна припустити, що ІПАБА вносить вклад у буферну ємність розчину, оскільки бічні ланцюги аспарагінової кислоти, глутамінової кислоти й гістидину мають здатність виступати як акцептори і/або донори протонів з метою підтримання рН розчину. Буферна ємність цього білка також раніше вивчалася під час попередніх досліджень складів, коли був виявлений ефект "пам'яті рН". Підтримання рН було продемонстроване декілька разів як у лабораторному масштабі, так і в процедурах великого масштабу. У сукупності результати, отримані в цих двох експериментах, свідчать, що буферна ємність ПАБА у сольовому розчині переважає в кислотному напрямку. Згідно з літературними даними, буферна ємність при більш низьких значеннях рН є прямим свідченням великої кількості залишків аспарагінової кислоти й глутамінової кислоти в даному білку в порівнянні з залишками гістидину. Не будемо вдаватися в теорію, але це може дійсно мати місце у випадку арилсульфатази А, яка містить у цілому 45 залишків глутамінової та аспарагінової кислот у порівнянні з 18 залишками гістидину.
Буферна ємність лікарської субстанції може також обумовлюватися залишковими зв'язаними фосфатами, присутність яких у лікарській субстанції була показана з використанням
ІЗП-МСОС. Таблиця 25 демонструє кількість залишкового фосфату, присутнього в трьох різних пробах лікарської субстанції вироблених у великому науково-дослідному лабораторному масштабі. Ці дані також підтверджують необхідність етапів ультрафільтрації та діафільтрації для процесів пілотного масштабу.
Таблиця 25
Залишкова кількість фосфату в лікарській субстанції, виробленій у великому науково- дослідному лабораторному масштабі
Концентрація фосфату (мільйонні частки)
Таблиця 25 (продовження)
Концентрація фосфату (мільйонні частки)
З метою подальшого з'ясування буферної ємності даного білка, також досліджували вплив розведення на рН. При розведенні лікарської субстанції ГПАБА сольовим розчином до менших концентрацій білка не було виявлено ніяких змін значення рН лікарської субстанції. Потім розведену лікарську субстанцію зберігали при 2-8 "С протягом одного тижня, після чого була проведена зміна рН. Отримані дані представлені в Таблиці 26. Результати показують, що розведення та зберігання при 2-8 "С не впливають на значення рН розведеної лікарської субстанції. Ці дослідження підтримують висновок досліджень з кислотного та лужного титрування, які продемонстрували відповідну буферну ємність лікарської субстанції гпАБА, приготованої в сольовому розчині.
Таблиця 26
Значення рН розведеної лікарської субстанції ГгПАБА
Номінальна Концентрація лікарської субстанції, Значення рН після концентрація виміряна за допомогою Початкове зберігання лікарської субстанції | спектрофотометричного методу при |значення рН Іпротягом тижня при (мг/мл) довжині хвилі 280 нм (мг/мл) 2-876 1117310 Ї77771717171717171717171717113868777777777777777717 | 1600 17111162 11171250... | ...7.7Ю7Ю7/0 28377771 | 1604 | щ 609 2 щ-"Н( 1017 1771111111111111111о111111111111111 16 17111160
Під час дослідження розведення і рН гПАБЗА було встановлено, що в зовнішньому вигляді розведених зразків спостерігалося зниження опалесценції, яке залежить від концентрації, тобто зразки гПА5А з більшими концентраціями були більш опалесцентними в порівнянні зі зразками з меншими концентраціями, які були практично прозорими. Фігура 12 показує спостережуваний зовнішній вигляд розведеної гпПАБА. Розчин гпАБА з концентрацією 1 мг/мл мав зовнішній вигляд, схожий з водою, тоді як зовнішній вигляд розчину з концентрацією 30 мг/мл був оцінений у діапазоні між Розчином порівняння ІІ і І або ПІ і ІМ.
Дослідження стабільності
Для дослідження стабільності лікарську субстанцію готували в концентрації 3834 мг/мл в 154 мм масі, рН 6,0, лікарський препарат готували в концентрації 30-43 мг/мл в 154мМ Масі, рн 6,0, при наявності та відсутності 0,005 95 полісорбату 20. Аліквоти лікарської субстанції об'ємом 1 мл поміщали до бутлів з полікарбонату об'ємом 5 мл з поліпропіленовими кришками, що закручуються, і зберігали при х -65 С, від -157С до -257С і 2-80. Аліквоти лікарського препарату об'ємом від 1,0 до 1,1 мл поміщали до скляних віал об'ємом З мл з 13 мм пробками
Рійгоїес і зберігали при 2-8 С, 25:22 70 і 40:12 "б. Віали з лікарським препаратом зберігали у вертикальному положенні для початкових досліджень стабільності та міняли на протилежну орієнтацію для наступних досліджень, використовуючи лікарський препарат без Р20. У кожній часовій точці зразки, стабільність яких досліджувалася, аналізували методами ексклюзійної
ВЕРХ і ВЕРХ зі зворотною фазою, електрофорезу в ПААГ з ДСН (офарблення Кумассі), а також за параметрами оптичної щільності при довжині хвилі 320 нм, концентрацією білка, рН, питомою активністю та зовнішнім виглядом. Пептидне картування, аналіз складу полісахаридів і процентного вмісту формілгліцину проводили щорічно. Крім того, останні аналізи були також проведені для стрес-умов і умов прискореного зберігання. У сукупності результати попередніх досліджень складів, заморожування-відтавання й дослідження струшування свідчать, що тільки три склади були прийнятними для подальшої розробки. Дослідження довгострокової стабільності були розпочаті для цих трьох складів у присутності 0,005 95 Р20. У Таблиці 27,
Таблиці 28 і Таблиці 29 підсумовані дані з вивчення стабільності трьох складів в обраних часових точках.
Таблиця 27
Довгострокова стабільність гГПА5БА в 154 мМ Масі, рН 5,9 при 2-8 70
Прозорийдо | ПРрорійло Проюрейл Проюрнйле
Зовнішній вигляд злегка опалесцентног| опалесцентног| опалесцентног опалесцентного о о о
Ексклюзійна ВЕРХ »99,9 99,8 99,8 (основного піку) при рН 5,5
Ексклюзійна ВЕРХ) 99 99,4 99,7 (основного піку) при рН 7,0
ВЕРХ зі зворотною фазою 99,7 99,8 »99,9 (95 основного піку)
РН 7777777717171717171717117111111717158..ЮДЦ.| Ю.60 26 ЮБДЩ | 60 | щДщ 60
Специфічна активність 95 79 87 (Од/мг)
Відповідає стандартному зразку З
Електрофорез у ПААГ з|відсутністю . . . . . .
ДСН (офарблення Кумассі) |додаткових смуг з Відповідає Відповідає Відповідає більшою інтенсивністю, ніжі у 1 96 контролю
Таблиця 28
Довгострокова стабільність гпПАБА В 154 мМ Масі, рН 7,0 при 2-8 70 / Зовншнявитях Посем до злета Прозорий до Прозорий до Прозорий до овнішній вигляд злегка злегка злегка опалесцентного опалесцентного | опалесцентного | опалесцентного (мг/мл)
Ексклюзійна ВЕРХ) (основного піку) при 97,5 99,8 »99,9 рно,о
Ексклюзійна ВЕРХ) (основного піку) при 99,4 99,2 99,8 рн,
ВЕРХ зі зворотною фазою (95 основного 99,7 »99,9 піку)
РН 77777777711717117111117117165.ЮЙДЙЦЙ.| 6 ЮДщ(6б6 | 67 | 652
Специфічна активність
Само ма | ев |в 1
Відповідає стандартному
Електрофорез у ПААГ з Вст ністю З ден (офарблення доу Відповідає Відповідає Відповідає
Кумассі) додаткових смуг з більшою інтенсивністю, ніжі у 1 95 контролі
Таблиця 29
Довгострокова стабільність ГПАБА в 5 мМ фосфатному буфері, рН 6,0, при 2-8 70
Прозорий до Прозорий до Прозорий до Прозорий до
Зовнішній вигляд злегка злегка злегка злегка опалесцентного |опалесцентного |опалесцентного | оспалесцентного пдшених 91961 (основного піку) при рН 5,5 донні 25188215 основного піку) при рН 7,0 пе вве (95 основного піку)
РН 77777771 Ї1117171758..ЮД.| 6 ЮДщ М60 | рюрюрюрж60 1158 Ж НРЗ'ШЇ
БШКе и вв (Од/мг)
Відповідає стандартному зразку З
Електрофорез у ПААГ з ВіДСУТНІСТЮ . . . . . .
ДСН (офарблення Кумассі) додаткових смуг Відповідає Відповідає Відповідає
З більшою інтенсивністю, ніж у 1 95 контролі
Дослідження стабільності, проведені протягом більше, ніж 11 місяців при 2-8 "С, свідчать, що якість гпАБА підтримується в пілотних варіантах складів. Показові профілі гпАЗА у сольовому розчині, рН 5,9, отримані методом ексклюзійної ВЕРХ, представлені на Фігурах 13 і 14. Методом ексклюзійної ВЕРХ не було зареєстровано жодної суттєвої зміни в асоційованому стані ГПАБА після зберігання протягом 11 місяців при 2-8 70.
У цілому, якість лікарського препарату в усіх трьох варіантах складів підтримувалася при зберіганні протягом 11 місяців при 2-8 "С.
Приклад 4: Токсикологічні дослідження
У даному прикладі проілюстроване багаторазове інтратекальне (ІТ) введення гпАзА протягом 6 місяців з точки зору токсикології та фармакологічної безпеки. У даному дослідженні тестованою речовиною, яку вводили ІТ, була гпА5БА. 36 самців і 36 самок довгохвостих макак випадковим чином розподіляли до п'яти лікувальних груп. Тваринні групи 1 служили контролем вживления пристрою (порт і катетер) без введення препарату, і їм не вводили ні основу, ні тестовану речовину; зазначеним тваринам вводили 0,6 мл ФБР за графіком, який відповідає графіку введення тестованої речовини. Тваринам груп 2-5 робили ІТ інфузії 0,6 мл розчину з 0, 3, 10 або 31 мг/мл гпАЗА (сумарна доза 0, 1,8, 6,0 або 18,6 мг) один раз на два тижні (тобто усього 12 доз). Тварин піддавали розтину через 6 місяців (через 24 години після останнього ІТ введення препарату), а 4 тварин/стать/групу, що залишилися, піддавали розтину наприкінці 4- тижневого періоду відновлення. Обрані тканини відбирали, зберігали й піддавали мікроскопічному дослідженню.
У цілому, зміни, які викликалися тестованою речовиною, можна було віднести до двох основних типів, і виникали вони при всіх рівнях доз (1,8, 6,0 або 18,6 мг/дозу). Збільшення інфільтратів (лейкоцитів, зазвичай із вираженим еозинофільним компонентом) у оболонках мозку, паренхімі головного мозку, паренхімі спинного мозку, трійничному вузлі й рідко в корінцях спинномозкових нервів/спінальних гангліях (або епіневрії, який оточує зазначені структури).
Зазначене збільшення інтерпретували як таке, що пов'язане з наявністю тестованої речовини (білка) в інтратекальному просторі й у тканинах нервової системи. Легке осередкове збільшення числа клітин мікроглії в спинному і головному мозку у деяких тварин (мікрогліоз не спостерігався у жодної тварини, що одержувала високу дозу). Обидві категорії морфологічних змін інтерпретували як реакцію на наявність тестованої речовини. У жодної тварини не було ознак некрозу нейронів. Ніякі пов'язані з тестованою речовиною зміни не були пов'язані з якими- небудь біологічно значущими небажаними реакціями в головному і спинному мозку, корінцях спинномозкових нервів або гангліях. Більш конкретно, не було виявлено ніяких ознак некрозу нейронів або біологічно значущої реакції з боку глії. У тканинах поза нервовою системою ніяких пов'язаних із тестованою речовиною уражень не було.
Після місячного періоду відновлення (період без введення препарату) зміни, які викликалися тестованою речовиною, або повністю врегульовувалися, або зводилися до залишкового збільшення запальної реакції, пов'язаного з наявністю тестованої речовини. У тварин, що пройшли період відновлення, ніяких небажаних морфологічних ефектів не було. За даними сліпого мікроскопічного дослідження, в якому напівкількісно оцінювали ступінь офарблення, імуногістохімічне офарблення на арилсульфатазу А (ПАЗА; тестована речовина) при кінцевому розтині збільшувалося в головному та спинному мозку в клітинах різних типів, за винятком нейронів, у всіх групах, що одержували тестовану речовину. Зазначене збільшення також було явним у купферівських клітинах печінки. Після місячного періоду відновлення офарблення на
АБА у тварин, що одержували тестовану речовину (групи всіх доз), поверталося до контрольного рівня (контроль введення пристрою/контроль із введенням основи). У одного самця з групи, що одержувала низьку дозу, виявлялися множинні осередки астроцитозу та втрати нейронів у корі великих півкуль, що вказує на множинні області попередньої ішемії. Хоча точний патогенез зазначених уражень у даної тварини не ясний, відсутність аналогічних уражень у яких-небудь інших тварин, що одержували тестовану речовину, включаючи тих тварин, які одержували в 10 разів більш високу дозу, говорить про те, що зазначені ураження не були пов'язані з тестованою речовиною.
У даному дослідженні тестованою речовиною, яку вводили ІТ, була ПАЗА. 36 самців і 36 самок довгохвостих макак випадковим чином розподіляли до п'яти лікувальних груп. Тваринні групи 1 служили контролем вживления пристрою (порт і катетер) без введення препарату, і їм не вводили ні основу, ні тестовану речовину; однак зазначеним тваринам вводили 0,6 мл ФБР за графіком, який відповідає графіку введення тестованої речовини. Тваринам груп 2-5 робили
ІТ інфузії 0,6 мл розчину з 0, 3, 10 або 31 мг/мл гпА5А (сумарна доза 0, 1,8, 6,0 або 18,6 мг) один раз на два тижні (тобто усього 12 доз). Тварин піддавали розтину через 6 місяців (через 24 години після останнього Ії введення препарату), а 4 тварин/стать/групу, що залишилися, піддавали розтину наприкінці 4-тижневого періоду відновлення. Обрані тканини відбирали, зберігали й піддавали мікроскопічному дослідженню. У нижченаведеній таблиці представлена схема експерименту, оскільки вона має відношення до патологічного аспекту даного дослідження.
Під час розтину звільняли матрикс головного мозку, зрізаючи фронтальний зріз товщиною приблизно З мм. Перший зріз і далі кожний наступний зріз фіксували в формаліні для гістопатологічної оцінки та імуногістохімічного аналізу. З головним мозком працювали в формі повних фронтальних зрізів. Зазначені зрізи включали щонайменше наступні відділи головного мозку.
Зрізи нової кори головного мозку (включаючи лобові, тім'яні, скроневі й потиличні долі): від 1 до 8 (і зріз 9, якщо був присутній).
Зрізи прадавньої кори головного мозку (нюхові цибулини і/або грушоподібна доля): від 1 до
З
Зрізи базальних гангліїв головного мозку (включаючи хвостате ядро і шкарлупу): від 1 до З
Зрізи лімбічної системи головного мозку (включаючи гіпокамп і поясні звивини): 4 і 5
Зрізи таламуса/гіпоталамуса й областей середнього мозку головного мозку: 4 і 5
Зрізи мозочка, моста й довгастого мозку головного мозку: від б до 8 (і зріз 9, якщо був присутній)
Зрізи головного мозку перераховані в таблиці даних під номерами 1-8/9 (зріз 9 надавався тестуючою лабораторією для деяких тварин). Одержання зрізів дещо відрізнялося у різних тварин. Зрізи головного мозку (1-8/9), зазначені вище, мали приблизне розташування в різних анатомічних областях. Зрізи головного мозку перераховані в таблиці даних як окремі зрізи, із вказівкою діагнозу, що відноситься до даного зрізу, щоб полегшити можливий подальший аналіз зрізів (якщо такий буде проводитися). Під час інтерпретації даних індивідуальні анатомічні ділянки головного мозку (перераховані вище) порівнювали, щоб ідентифікувати унікальні ефекти тестованої речовини (тобто унікальні для конкретного відділу головного мозку). Для дослідження токсичності всі зрізи головного мозку від усіх тварин поміщали в парафін, нарізали з кроком 5 мікрон, орарблювали гематоксиліном і еозином (Г/Е) та проводили мікроскопічне дослідження. Крім того, головний мозок контрольних тварин і тварин із групи, що одержувала високу дозу, офарблювали РІйого-у-аде В (барвник, що підвищує чутливість оцінки на дегенерацію нейронів у головного мозку) і срібним барвником Більшовського (спосіб, який бо дозволяє прямо візуалізувати аксони, дендрити й філаменти нейронів) і проводили оцінку.
Зі спинного мозку (шийний, грудний і поперековий відділи) виготовляли зрізи товщиною один сантиметр. Перший зріз і кожний наступний зріз фіксували в формаліні для гістопатологічної оцінки й імуногістохімічного аналізу. Зрізи спинного мозку (шийний, грудний (включаючи кінчик катетера) і поперековий відділ) у всіх тварин розрізали з кроком приблизно 5 мікрон, офарблювали Г/Е й досліджували поперечний і косий зріз, отриманий на кожному рівні. Серії зрізів спинного мозку від контрольних тварин і тварин, що одержували високі дози, додатково офарблювали срібним барвником Більшовського (імуногістохімічний барвник, який дозволяє прямо візуалізувати зірчасті клітини та їхні відростки).
Задні корінці спинномозкових нервів і ганглії (взяті з середини шийного, середини грудного й середини поперекового відділу) поміщали в парафін та серії зрізів орарблювали Г/Е. Крім того, серії зрізів, отриманих від контрольних тварин і тварин, що одержували високі дози, офарблювали срібним барвником Більшовського.
Для зрізів сідничного, великогомілкового й литкового нерва, отриманих від усіх тварин: поздовжній зріз кожного нерва поміщали в парафін, одержували зрізи з приблизним кроком 5 мікронів і офарблювали Г/Е. Поперечний зріз кожного нерва згодом фіксували в осмії, поміщали в смолу Спурра, одержували зрізи з приблизним кроком 1-2 мікрони й офарблювали толуїдиновим синім. Наступна фіксація в осмії та поміщення в смолу забезпечує більш надійне збереження мієліну в периферичних нервах, а отже, є можливим більш докладне дослідження нерва.
Усі відібрані тканини та осередки макроскопічних уражень, відібрані при розтині у всіх тварин, також поміщали в парафін, офарблювали Г/Е і піддавали мікроскопічному дослідженню.
Гістопатологічна обробка й оцінка, а також імуногістохімічний аналіз проводили за допомогою
ТРБ.
Офарблення на арилсульфатазу А (гпПА5А)
Зрізи для позитивного контролю надавав спонсор. Зазначені зрізи являли собою зрізи печінки мишей, яким вводили гпАБА. На зрізах для позитивного контролю були отримані достатні підтвердження того, що гППАБА є присутньою в купферівських клітинах (синусоїдальних макрофагах) у печінці. Зрізи для позитивного контролю зберігали з іншими зрізами, отриманими в ході даного дослідження. Усі види оцінки офарблених на гпА5А зрізів спочатку проводили сліпим способом відносно лікувальної групи, до якої належала тварина. Це досягалося завдяки тому, що патоморфолог спочатку реєстрував показники офарблення на ПАЗА на зрізах, і при цьому маркування із вказівкою номера тварини було від нього сховане (з використанням асистента, який знав, зріз якої тварини аналізується), диктував бал (ступінь тяжкості) під час оцінки, а той же асистент відразу ж записував бал офарблення (ступінь тяжкості) до таблиць даних. Щоб гарантувати точність введення даних, потім ідентифікаційний номер тварини звіряли невропатолог дослідження й зазначений асистент. Дану процедуру проводили так, щоб не вносити ніякої необ'єктивності в оцінку загальної інтенсивності офарблення імуногістохімічним барвником при визначенні внутрішньоклітинної гППАЗА. У всіх зрізах головного і спинного мозку оцінювали відносний ступінь офарблення нейронів, оболонкових макрофагів, периваскулярних макрофагів і клітин глії (астроцитів і клітин мікроглії, але, ймовірно, переважно клітин мікроглії). Середні бали тяжкості на кожному рівні головного і спинного мозку для кожної групи підсумували (по групах) і реєстрували у вигляді загального офарблення на гпАЗА в графі тканин головного мозку і загального офарблення на гПАБА в графі спинного мозку.
У цілому, офарблення на гпА5БА в нейронах головного мозку служило показником відносно нейронів кори великих півкуль та інших ядер у головному мозку. Офарблення на гАЗА в оболонкових макрофагах вказувало на захоплення тестованої речовини оболонковими макрофагами і/або на ендогенну гПАБА в оболонкових макрофагах. Офарблення на гпАБА периваскулярних макрофагів служило показником захоплення гпАБА (або ендогенної гпА5БА) макрофагами в головному/спинному мозку, хоча слід зазначити, що периваскулярний простір у головному і спинному мозку (простір Вірхова-Робіна) сполучається з оболонками головного мозку. У цілому, оцінка інтенсивності офарблення на гпА5А в клітинах глії переважно служила показником захоплення тестованої речовини/проникнення тестованої речовини до сірої і/або білої речовини, особливо до кори великих півкуль (променистий вінець у білій речовині під корою великих півкуль). Офарблення на гпАБА в білій речовині, очевидно, відповідало астроцитам і клітинам мікроглії.
Для оцінки ступеня офарблення на гпАБА клітин різних типів (нейронів, клітин глії, макрофагів), застосовували наступну оцінювальну шкалу.
Пояснення до шкали (95 від можливого офарблення клітин) 1 - менше 10 95 60 2 - більше 10, до 25 95
З - більше 25, до 50 95 4 - більше 50, до 75 95 - більше 75 95
Слід зазначити, що зазначена шкала не є строго кількісною. її застосовували як ефективний 5 напівкількісний спосіб оцінки офарблення на гпАБА тканин головного і спинного мозку.
Невропатолог дослідження помітив, що не всі області нейронів проявляли однакове офарблення на гпАБА. Також було відмічено, що у деяких контрольних тварин мало місце ендогенне офарблення нейронів і що клітини судинного сплетення й нейрони гангліїв задніх корінців мали тенденцію до сильного офарблення на гпАЗА навіть у контрольних тварин.
Офарблення судинного сплетення і гангліїв задніх корінців не оцінювали за зазначеною шкалою, але невропатолог дослідження відзначив, що воно було вираженим, навіть у контрольних тварин.
Примітка: групи, що одержували всі дози: низька доза - 1,8 мг/дозу; середня доза - 6,0 мг/дозу; висока доза - 18,6 мг/дозу. У тканинах поза нервовою системою не було уражень, пов'язаних із тестованою речовиною, за винятком підвищеного офарблення на гПАБА у печінці в групах, що одержували всі дози (самці та самки; див. нижче).
Умертвіння тварин наприкінці дослідження (введення препара ту протягом 6 місяців один раз на два тижні): офарблення зрізів на ГпПАБА
У наступних типах тканин/клітин мала місце підвищена інтенсивність офарблення на гПАЗА.
При оцінці дії тестованої речовини на ступінь офарблення на ПАЗА в конкретному типі клітин у груп, що одержувала конкретну дозу, для порівняння оцінювали рівень офарблення в супутньому контролі основи та контролі вживления пристрою (умертвлення одночасно з тваринами, які пройшли період відновлення).
Головний мозок, оболонки мозку, макрофаги (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Головний мозок, периваскулярний простір, макрофаги (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Головний мозок, клітини глії (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Спинний мозок, оболонки мозку, макрофаги (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Спинний мозок, периваскулярний простір, макрофаги (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Спинний мозок, клітини глії (групи, що одержували середню й високу дози, самці й самки)
Печінка, купферівські клітини (групи, що одержували всі дози, самці й самки)
Через ендогенне офарблення було найбільш важко визначити точно рівень офарблення на
ГАБА в нейронах головного та спинного мозку. Був продемонстрований незмінно підвищений рівень ППАЗА в макрофагах оболонок мозку і периваскулярних макрофагах головного/спинного мозку, а також у клітинах глії. Помітних відмінностей у офарбленні на гпАБА нейронів у контрольних тварин і тварин, що одержували тестовану речовину, виявлено не було.
Умертвіння тварин після періоду відновлення (введення препарату протягом 6 місяців один раз на два тижні й наступний період відновлення тривалістю один місяць без введення препарату)
У цілому у тварин, які перед розтином відновлювалися протягом одного місяця без введення препарату, зміни, пов'язані з тестованою речовиною, або повністю врегульовувалися, або помітно зменшувалися. Були присутніми наступні мікроскопічні зміни з частотою/тяжкістю, яка вказує на можливий взаємозв'язок із тестованою речовиною.
Мікроскопічні зміни, пов'язані з тестованою речовиною (тварини, що пройшли період відновлення)
Головний мозок, оболонки мозку, інфільтрати (групи, що одержували середню й високу дози, обидві статі) (Фігура 16 і Фігура 17)
Головний мозок, оболонки мозку, інфільтрати, 906 еозинофілів (самці, що одержували середню дозу; самки, що одержували високу дозу)
Головний мозок, периваскулярний простір, інфільтрати (самці, що одержували середню дозу; самки, що одержували високу дозу) (Фігура 18)
Головний мозок, периваскулярний простір, інфільтрати, 95 еозинофілів (самці, що одержували середню дозу; самки, що одержували високу дозу)
Головний мозок, сіра речовина, інфільтрати (групи, що одержували всі дози, обидві статі)
Головний мозок, сіра речовина, інфільтрати, 95 еозинофілів (самці, що одержували низьку дозу)
Головний мозок, сіра речовина, еозинофіли, некроз (самці, що одержували низьку дозу)
Спинний мозок, оболонки мозку, інфільтрати (самці, що одержували середню й високу дози; бо самки, що одержували низьку й високу дози)
Спинний мозок, оболонки мозку, інфільтрати, 95 еозинофілів (самці, що одержували середню дозу; самки, що одержували низьку дозу)
Спинний мозок, сіра речовина, інфільтрати (самки, що одержували низьку дозу)
Спинний мозок, сіра речовина, інфільтрати, 95 еозинофілів (самки, що одержували низьку дозу)
Задні корінці й ганглії спинномозкових нервів, епіневрій, інфільтрати (самки, що одержували середню дозу)
Корінці й ганглії спинномозкових нервів, інфільтрати, еозинофіли (самці, що одержували середню й високу дози; самки, що одержували всі дози)
Трійничний вузол, інфільтрати, еозинофіли (самці й самки, що одержували середню дозу)
Усі зазначені зміни інтерпретували як залишкові явища виражених запальних змін, що виявляються у тварин, умертвлених після закінчення введення препарату. Хоча у тварин, умертвлених після закінчення введення препарату, не було ознак виражених інфільтратів запальних клітин, вони все-таки були присутніми у деяких тварин, що пройшли період відновлення, вказуючи на морфологічні зміни, які викликали якісь небажані ефекти. У тканинах поза нервовою системою уражень, пов'язаних із тестованою речовиною, не виявлялося.
Умертвіння тварин після періоду відновлення (введення препарату протягом 6 місяців один раз на два тижні й наступний період відновлення тривалістю один місяць без введення препарату): офарблення на гпПАБА
У самців і самок, що пройшли період відновлення, у порівнянні з контролем вживления пристрою та контролем основи ніяких вказівок на більш сильне офарблення на гПА5А не було.
У головному мозку самців, що одержували низьку, середню й високу дози та пройшли період відновлення, у деяких типах клітин (вони варіювали серед лікувальних груп) були реальні вказівки на більш сильне офарблення на гПАБА в порівнянні з контролем вживления пристрою і контролем основи. Причина цього не ясна, у тому числі не ясно, чи здійснювало це реальну дію.
Одне з можливих пояснень може полягати в тому, що введення екзогенної ГПАБА може призводити до зниження вироблення ендогенної гГПАБА. У спинному мозку зазначених самців аналогічного результату не було. У самців і самок, що пройшли період відновлення, офарблення сріблом давало результат, аналогічний результату в контролях.
У цілому, зміни, пов'язані з тестованою речовиною, можна було віднести до двох основних типів, і вони були присутніми при всіх рівнях доз (1,8, 6,0 і 18,6 мг/дозу).
Збільшення інфільтратів (лейкоцити, зазвичай із вираженим еозинофільним компонентом) у оболонках мозку, паренхімі головного мозку, паренхімі спинного мозку, трійничному вузлі й рідко - у корінцях/гангліях спинномозкових нервів (або епіневрії, що оточує зазначені структури).
Зазначене збільшення інтерпретували як пов'язане з наявністю тестованої речовини (білка) в інтратекальному просторі й у тканинах нервової системи.
Легке осередкове збільшення числа клітин мікроглії в спинному та головному мозку у деяких тварин (мікрогліоз не спостерігався у жодної тварини, що одержувала високу дозу). Обидві категорії морфологічних змін інтерпретували як реакцію на наявність тестованої речовини. У жодної тварини не було ознак некрозу нейронів. На момент написання даного проміжного звіту оцінка офарблених на гПА5БА зрізів ще проводиться. Ніякі пов'язані з тестованою речовиною зміни не були пов'язані з якими-небудь біологічно значущими небажаними реакціями в головному та спинному мозку, корінцях спинномозкових нервів або гангліях. Більш конкретно, не було виявлено ніяких ознак некрозу нейронів або біологічно значущої реакції з боку глії. У тканинах поза нервовою системою ніяких пов'язаних із тестованою речовиною уражень не було.
Після місячного періоду відновлення (період без введення препарату) зміни, які викликалися тестованою речовиною, або повністю врегульовувалися, або зводилися до залишкового збільшення запальної реакції, пов'язаного з наявністю тестованої речовини. У тварин, що пройшли період відновлення, ніяких небажаних морфологічних ефектів не було.
За даними сліпого мікроскопічного дослідження, в якому напівкількісно оцінювали ступінь офарблення, імуногістохімічне офарблення на арилсульфатазу А (ПАЗА; тестована речовина) збільшувалося в головному і спинному мозку в клітинах різних типів, за винятком нейронів, у всіх групах, що одержували тестовану речовину. Зазначене збільшення також було явним у купферівських клітинах печінки. Після місячного періоду відновлення офарблення на гАЗА у тварин, що одержували тестовану речовину (групи всіх доз), поверталося до контрольного рівня (контроль введення пристрою/контроль із введенням основи). У одного самця з групи, що одержувала низьку дозу, виявлялися множинні осередки астроцитозу і втрати нейронів у корі великих півкуль, що вказує на множинні області попередньої ішемії. Хоча точний патогенез зазначених уражень у даної тварини не ясний, відсутність аналогічних уражень у яких-небудь 60 інших тварин, які одержували тестовану речовину, включаючи тих тварин, які одержували дозу в 10 разів вищу, говорить про те, що зазначені ураження не були пов'язані з тестованою речовиною. На момент випуску даного попереднього звіту і строго грунтуючись на макроскопічних та мікроскопічних результатах (на зрізах тканин, поміщених у парафін, офарблених гематоксиліном і еозином), отриманих у даному дослідженні, рівнем відсутності спостережуваних небажаних ефектів (МОАЕЇ) був визнаний рівень 18,6 мг.
Приклад 5: Фармакокінетичні дані
Результати б-місячного введення
У даному прикладі описаний інтерпретований аналіз концентрацій гпАБА і сироваткових анти-ПАБА антитіл (від компанії "МопіВпегп Віотеаісаї! Кезеагсиі, Іпс.") у сироватці та СМР.
Мета даного прикладу полягала в оцінці багатократного інтратекального (ІТ) введення
ГПАЗА з точки зору токсикології та фармакологічної безпеки у молодих (молодше 12 місяців) довгохвостих макак. Усього за період шість місяців вводили 12 доз. Тварин піддавали розтину через 24 години після введення останньої дози препарату. Схема експерименту показана в
Таблиці 30.
Таблиця 30
Схема експерименту . К-сть тварин,
Номінальна К-сть тварин, . тварин : вводили (мг) м місячного періоду дозі (мг/мл) через 6 місяців . відновлення 1 ами ос 170111 - 11 маш 2 |8М8Ж що | 0 | амМмзжЖж | «ма 4 |8мМажЖ ло | 60 | амижЖ | «ма ре « контроль пристрою; тварини в групі 1 не одержували ні основи, ні тестованої речовини. а Тварина Мо 044 з групи контролю введення основи померла в день 50 через витік у катетері.
Способи кількісного визначення - аналіз антитіл
Кількісне визначення анти-ПпАФЗА антитіл у сироватці та СМР довгохвостих макак проводили з використанням способу, що пройшов валідацію. Якщо коротко, кількісне визначення починали з блокування планшета, покритого стрептавідином М5О, після чого проводили інкубацію з
ТАЗА, міченою біотином. Після етапу відмивання до планшета додавали розведені проби, калібрувальні стандарти і стандарти для контролю якості та інкубували його. Після додаткового етапу промивання додавали лікарську речовину, мічену ЗОЇ ГО ТАС, та інкубували. Проводили остаточний етап відмивання й додавали буфер зчитування М5О. Зчитування показників із планшета проводили негайно. Дані про сигнал у відносних одиницях люмінесценції (КО) аналізували з використанням шаблонів Зойтах Рго.
Концентрації в сироватці та СМР
Кількісне визначення анти-ПпАФЗА антитіл у сироватці та СМР довгохвостих макак проводили з використанням методу, що пройшов валідацію. Зазначений спосіб оснований на технології твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Якщо коротко, титраційний мікропланшет покривали поліклональними антитілами кролика (5НО40), що утворювалися на рекомбінантну арилсульфатазу А людини (АБ5БА). Після інкубації зі стандартним зразком А5А і тестованими пробами білок АБА, що зв'язався, виявляли з використанням кон'югованого з пероксидазою хріну (ПХ) анти-АБА моноклонального антитіла (клон 19-16-3). Потім планшет інкубували з субстратом ПХ, ТМВ. Зазначену реакцію "фермент-субстрат" зупиняли шляхом додавання 2Н сірчаної кислоти (Н25О4), і поглинання кожної лунки визначали на довжині хвилі 150 нм із опорною довжиною хвилі 655 нм. Концентрації АБА в пробах розраховували на основі калібрувальної кривої для гПАЗА, зареєстрованої в тому ж планшеті.
Підсумкові дані з концентрацій гппАБА в сироватці та СМР і з концентрацій антитіл проти
ГАБА в сироватці та СМР, а також частота виявлення антитіл у залежності від групи і статі наведені в Таблицях 33-39 нижче.
Таблиця 33
Підсумкові дані про концентрації ГПА5А в сироватці довгохвостих макак
РУПЕ ПОТ Середнє СВ | п о (|Середнє| СВ | п
Моментчасуї 77717171) н/мло/ нумло////// | нумло| нумл| З:
Передвведеннямдози?. /-: | 0104 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози?2 1 011014 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиї4.//-:/ 1 0104 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози4. -:/ 1 011014 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиб.ї /-:/ | 0 10 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядозиб.д /-:/ 1 011014 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози8.д/-:/ | 0 10 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози8.д 10171014 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози!ї0 | 0 1 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози!0 -:/ 1 0 10 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози12 | 0 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози!ї2 гг 010 4 | 0 | 0 | 4 (Серединаперіодувідновленняд/-: | 0 / 0 4 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУ Є Середнє СВ | п о (|Середнє| СВ | п
Моментчасуї 77717171) нумло) нумло///// | номлу| номл| З
Передвведеннямдози?. /-: 10108 | 0 | 0 | 7
Післявведеннядози?2 1011018 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдозиї4.//-:/ 10108 | 0 | 0 | 7
Післявведеннядози4 /-:/ 1011018 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиб.ї 1 01108 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози8./-:/ | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози8.д 1 017018 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози!0 | 0 0 | 8 | 0 | 0 | 7
Післявведеннядози!0 1010 8 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдози12 | 0 0 | 8 | 0 | 0 | 7 розтином пюя аніони мс | 000000 розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіодувідновленняд/-: | 0 / 0 4 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУТ Середнє СВ | п (|Середнє| СВ | п
Моментчасуї 77717171) нумло) нумло///// | номлу| номл| З
Передвведеннямдози? | 010 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози?2 1 492 | 468 | 8 | 403 | 273 | 8
Передвведеннямдозиї4./-:/ | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози4. /-:/ 1 008 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиб.ї /-:/ 1 0108 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози8.//-:/ | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозив. 1011018 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози!ї0 | 0 1 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози!0 1010 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози!ї2 | 0 1 0 8 | 0 | 0 | 8 розтином ля аніон вся | 000000 розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіодувідновленняд/-: | 0 / 0 4 | 0 | 0 | 4 (Розтин після перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Таблиця 33 (продовження) рута пого А Середнє| СВ | п |Середнє| СВ | п
РУЛЕТ Середнє СВ | п о (|Середнє| СВ | п
Моментчасуї 77717171) нумло) нумло///// | номлу| номл| З
Передвведеннямдози?. | 0108 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози?2 3 173,6 | 695 8 | 1432 | 890 | 8
Передвведеннямдозиї4.//-:/ | 0108 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози4 | 17 149 8 | 638 | 1199| 8
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиб.ї /-: 1 01108 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози8./-:/ | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози8.д 1 017018 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози!10 | 0 1 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози!0 10 10 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози12 | 0 1 0 | 8 | 0 | 0 | 8 розтином пюязакнасння вся | 000000 розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіодувідновленняд/-: | 0 / 0 4 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУТ Середнє СВ | п о (|Середнє| СВ | п
Моментчасуї 77717171) нумло) нумло///// | номлу| номл| З
Передвведеннямдози?. 1/0 108 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози?2 348,0 272,9 8 | 5623 | 2043| 8
Передвведеннямдозиї4.//-:/ | 0 108 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози4 7) 105,7 / 274,6 8 | 1720 | 1413| 8
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиб 204 384 | 8 | 886 | 1214 | 8
Передвведеннямдози8./-:/ | 0 10 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози8д 10177101 8 | 540 | 894 | 8
Передвведеннямдози!10 | 0 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядози!0 1 0717770 8 | 6 | 18 | 8
Передвведеннямдози12 | 0 1 0 | 8 | 0 | 0 | 8 розтином пюя аніони мс | 000000 розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіоддувідновленняд/-: | 0 / 0 4 | 0 | 0 | 4 (Розтин після перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Таблиця 34
Підсумкові дані про концентрації ГПАБА у СМР довгохвостих макак рута пломте А Середнє! СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77717171 | нумло| нимло| | номло| нумло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози?2. | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози4.//-:/ | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози4 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиб.їд /-: | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядозиб.ї | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози8.ї/-:/ | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Післявведеннядози8.Ї | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4 (Передвведеннямдози!ї0.ї | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4 бо
Таблиця 34 (продовження)
РУТЕ ПОоАТе Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Післявведеннядозиї0 | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози!ї2 | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4
Післявведеннядозиї2 | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4 (Серединаперіоддувідновлення.д | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77717171 | нумло| нимло| | нумло| нумло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 7
Післявведеннядози?2 | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдози4.//-: | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 6
Післявведеннядози4 | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдозиб.їд /-: | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Післявведеннядозиб.ї | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдози8.ї/-:/ | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Післявведеннядози8.Ї | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдози!ї0. | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 5
Післявведеннядозиї0 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдози1ї2 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 5
ПлонншнШ 21111 розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіоддувідновлення.д/-/: | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | з
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77717171 | нумло| нимло| | нумло| нмл
Передвведеннямдози2 | 42491 | 59255 | 7 )| 42217 | 47300 | 6
Післявведеннядози?2 | 95886 | 22626 | 7 )|125717| 61723| 6
Передвведеннямдози4 | 17664 | 24372 | 6 )| 50829 | 41891| 6
Післявведеннядози4 | 106783| 42823 | 6 )|138400)| 49908| 6
Передвведеннямдозиб | 39400 | 50105 | 4 | 45817 | 38404| 6
Колос о зе тивів» в розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіоддувідновлення.д | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 2
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
РУТ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77717171 | нумло| нимло| | нумло| нумл
Передвведеннямдози2 | 75203 | 67002 | 8 )|146979/|233673| 6
Післявведеннядози?2 | 360000|179276| 8 )|267667|103369| 6
Передвведеннямдози4 | 58064 | 77210 | 8 | 53285 | 73340 | 5
Післявведеннядози4 | 369250|241251| 8 )|305517|152232| 6
Передвведеннямдозиб | 77253 | 91407 | 8 | 97987 |146762| 6
Таблиця 34 (продовження)
Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіоддувідновлення.д | 0 | 0 | з | 0 | нз | 1
Розтинпісля перодувідновленняд | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4 7 Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77717171 | нумло| н/мло| | нумло| нумл | (
Передвведеннямдози?2 289917 |291188| 7 )|2013390|250774| 8
Передвведеннямдози4 150238 |210302| 7 )|169895)|185675| 6
Післявведеннядози4 984857 |570039| 7 )|965167|425924| 6
Передвведеннямдозиб 265479 |252067| 7 )|288879)|226889| 6
Післявведеннядозиб 758143 |102009| 7 )|1270000| 558533| 6
Передвведеннямдози8 190529 |240081| 7 )|196021|199396| 6
Передвведеннямдози10 176297 |272500| 7 )|168864/|191087| 6
Передвведеннямдози12 142334 |196793| 5 )|430542|436534| 6
Колос ниток мне они то ою тек в розтином після закінчення 6 місяців) (Серединаперіоддувідновлення.д | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 2 (Розтин після перодувідновлення.д | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Таблиця 35
Підсумкові дані про концентрації анти-ПАБА антитіл у сироватці основи Середнєї СВ | п |СереддєЇ! СВ | п
Моментчасуї 77717177 | номло| н/мло/ | номло| нмло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози4.//-:/ | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози8.//-:/ | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози1ї0.ї | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози!ї2 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4 (Серединаперіодувідновлення.д | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля періодувідновлення | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Середнєї СВ | п |СереддєЇ! СВ | п
Моментчасуї 77717177 | номло| н/мло/ | номло| нмло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози4.//-: | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдози8.//-:/ | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдози1ї0. | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдози1ї2 | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 7 пн введення останньої дози) (Серединаперіоддувідновлення.д | 0 | 0 / 4 | 0 | 0 | 4 (Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Таблиця 35 (продовження) основи Середнєї СВ | п |СереднєїЇї СВ | п / 7 Середне| СВ | п |СереддєЇ! СВ | п
Моментчасуї 77777710 | нумло| ну/мло///// | номло| нмло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози4 | 18409 | 21371 | 8 | 27648 | 37504 | 8
Передвведеннямдозиб | 75913 | 64863 | 8 | 85625 | 79871 | 8
Передвведеннямдози8 | 132163 | 95576 | 8 )/) 1519001 97818| 8
Передвведеннямдози10 | 392338 | 606026 8 )/) 290675 | 186213| 8
Передвведеннямдози12 | 499438 | 735028 / 8 )/) 524438 | 569523| 8 введення останньої дози) 7 Середне| СВ | п |СереддєЇ! СВ | п
Моментчасуї 77777710 | нумло| ну/мло///// | номло| нмло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози4 | 30419 | 30561 | 8 | 64000 | 89510 | 8
Мередвведеннямдозиб | 143693 | 128094 8 )/) 191750 | 150511| 8
Передвведеннямдози8 | 325750 | 190651 8 )/) 305850 | 224707| 8
Передвведеннямдози10 | 669125 | 515458 8 )/) 832188 | 846241| 8
Передвведеннямдози12 | 946125 | 651530 8 )/1060775|1088889| 8 введення останньої дози) 7 Середне| СВ | п |СереддєЇ! СВ | п
Моментчасуї 77777710 | нумло| ну/мло///// | номло| нмло
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 / 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози4 | 56873 | 39107 | 8 | 39994 | 53411 | 8
Передвведеннямдозиб | 311638 | 237796 8 )/) 193263 | 208952| 8
Передвведеннямдози8 | 482875 | 270130 8 )/ 399363 | 360425| 8
Передвведеннямдози 10 1006750) 857916 8 )/) 866875) 894776| 8
Передвведеннямдози 12 /|1419000|1382276/ 8 )/1341500/|1373771| 8 введення останньої дози)
Таблиця 36
Підсумкові дані про концентрації анти-ПпА5А антитіл у СМР основи Середнє| СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 77777771 | нмло| нумло| | нумло/) нумл
Операця 7/1 10 1 0 | 4 | 0. 0 4
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиї4.//-: | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдозиб.ї /-: | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Передвведеннямдози8./-:/ | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4 (Передвведеннямдози!т0.ї | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 4
Таблиця 36 (продовження) основи Середнє СВ | п |Середнєї. СВ | п
Передвведеннямдозиї2 | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4 (Серединаперіодувідновлення.ї7/ | 0 | 0 | з | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 4 | 0 | о | 4
РУ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї ////////7/7/7/7/////0/ | вну/мло| н/мло| | нумло| н/мл
Операця.ї -:/ | 0 | 0 | 7 | 0 | 01 6
Передвведеннямдози?2.//-:/ | 0 | 0 | 6 | 0 | 0 | 7
Передвведеннямдозиї4./-:/ / | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 6
Передвведеннямдозиб./-:/ | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдози8.//:/Н | 0 | 0 | 5 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдозиї0ї /-: | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | 5
Передвведеннямдозиї2 | 0 | 0 | 4 | 0 | 0 | з пн 2 151 введення останньої дози) (Серединаперіодувідновлення.ї7// | 0 |нз3 | 1 | 0 | 0 | з
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 4 | 0 | о | 4
РУТ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї 777770 | вну/мло| н/мло| | нумло| н/мл
Операця.ї -:/ | 0 | 0 | 7 | 0 | 0. в
Передвведеннямдози?2.//-:/ | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 6
Передвведеннямдозиї4./-:/ // | 0 | 0 | 6 | 41 | 101 | 6 введення останньої дози)
РУТ Середнє СВ | п |Середнєї СВ | п
Моментчасуї ////////7/7/7/7/////0/ | вну/мло| н/мло| | нумло| н/мл
Операця.ї -:/ | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 1 6
Передвведеннямдози?2.//-:/ | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози4 | 102 | 192 | 7 | 0 | 0 | 6
Передвведеннямдозиб | 233 | 351 | 7 | 1506 | 3234 | 6
Передвведеннямдози8 | 3378 | 5931 | 7 | 6367 | 9865 | 6
Передвведеннямдози1!0 | 16327 | 24035 | 7 | 19567 | 27542 | 6
Передвведеннямдози172 | 11596 | 16406 | 5 | 15143 | 24351 | 6 введення останньої дози)
Таблиця 37
Концентрації гпА5А у сироватці та СМР, об'єднані дані самців і самок (нг/мл) основи
Моментчасу 0000 Середнє! СБ 120по0 середнє СВОЇ Ло у о онумло| н/мл | | ну/мл | нумл | (КБ
Передвведеннямдози?2 0 | 0 | 8 | 0 | 0 ДЮ Х8
Післявведеннядози?2 010 | 8 | 0 | 0 .Ю Юз(8
Передвведеннямдозиї4.//-: 0 | 0 | 8 | 0 | 0 ДЮ 8
Післявведеннядози4. /-: 010 | 8 | 0 | 0 .Ю щ Юз(8
Передвведеннямдозиб.ї /-: 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиб 010 | 8 | 0 | 0. Ю (8
Передвведеннямдози8.//-:/ 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | Ю 8
Післявведеннядози8.д 7010 | 8 | 0 | 0 .Ю ж ЮЧг8
Передвведеннямдози!ї0. 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Післявведеннядозиї0 0 1 0 | 8 | 0 | 0 Ю 7
Передвведеннямдози!ї2 | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 7
Післявведеннядозиї2 0 1 0 | 8 | 0 | 0 Ю 7 (Серединаперіоддувідновленняд | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 7
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Група 2:0 мг - !
Моментчасу 0000 Середнє! СБ 120по0 середнє СВОЇ Ло у о онумло| н/мл | | ну/мл | нумл | --(К(
Передвведеннямдози?2 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | з
Післявведеннядози?2 7010 16 | 0 | 0 .Ююж сг
Передвведеннямдозиї4.//-: 0 10 | 16 | 0 | 0 | "м
Післявведеннядози4 7010 | 16 | 0 | 0 БЮ ж 10
Передвведеннямдозиб.ї /-: 0 1 0 | 15 | 0 | 0 | о
Післявведеннядозиб 70110 15 | 0 | 0. БЮюж Ал
Передвведеннямдози8.//-:/ 0 10 | 15 | 0 | 0 | ло
Післявведеннядози8д 170110 15 | 0 | 0. БЮюж Хо
Передвведеннямдози!ї0 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | 9
Післявведеннядозиї0 0 10 | 15 | 0 | 0. БЮ ж Ю9
Передвведеннямдози!12 | 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | 9 шо нен ов розтином після закінчення 6 15 10 місяців (Серединаперіоддувідновленняд | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 5
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Група 3: 1,8 мг - :
Моментчасу 0000 Середнє! СБ 120по0 середнє СВОЇ Ло у о онумло| н/мл | | ну/мл | нумл | (КБ
Передвведеннямдози?2 0 1 0 | 16 | 42365 | 51844 | 13
Передвведеннямдози4 0 10 | 16 | 34247 | 36982 | 12
Післявведеннядози4 17701110 | 16 | 122592) 47311 | 12
Передвведеннямдозиб 0 1 0 | 16 | 43250 | 40831 | 10
Післявведеннядозиб 1701710 | 16 | 100167 | 2799214.Й.Ч:.ОЯ:У7
Передвведеннямдози8. 0 10 | 16 | 43736 | 40298.Й.ЧУ(Х-О9
Післявведеннядози8д 01171016 | 132333 | 53926 Й-: ХО
Передвведеннямдози!0 0 2 | 0 | 16 | 28401 | 28890 .4Й.ДН-09
Післявведеннядози!0 70 170 | 16 | 98433 | 37220 |ЙЦ-:9 (Передвведеннямдози!ї2 | 0 | 0 | 16 )| 59209 | 58253 | 9
Таблиця 37 (продовження) основи ше не сов же ют в розтином після закінчення 6 16 39092 42786 13 місяців) (Серединаперіоддувідновленняд | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 5
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Група 4: 6,0 мг - !
Моментчасу 0000 Середнє! СБ 120по0 середнє СВОЇ Ло у о онумло| н/мл | | нумл | нумл | КБ
Передвведеннямдози?2 0 1 0 | 16 |105964 | 157408 14
Передвведеннямдози4 010 | 16 | 56226 | 72638 | 13
Передвведеннямдозиб 0 2 | 2 0 | 16 | 86139 | 113563 14
Післявведеннядозиб 7010 | 16 | 393800 | 206033 10
Передвведеннямдози8. 0 10 | 16 | 42009 | 65286 |/Й-:(:9
Післявведеннядози8д 0170 16 | 334333 | 16990514.ЙДБє09 жюКБжБі
Передвведеннямдози!0 0 2 | 0 | 16 )|106452| 130375 Щ 7
Післявведеннядози!0 70170 16 | 364429 | 160707 .-:7
Передвведеннямдози!12 | 0 | 0 | 16 | 70344 | 87227 |:-::7 ше не гово нин но розтином після закінчення 6 16 111707 | 151129 11 місяців) (Серединаперіоддувідновленняд | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Група 5: 18,6 мг - :
Моментчасу 0000 Середнє! СБ 120по0 середнє СВОЇ Ло у о онумло| н/мл | | нуимл | н/мл | КУ
Передвведеннямдози?2 0 10 | 16 |242676| 264338 15
Передвведеннямдози4 0 10 | 16 | 159311 | 191264 13
Передвведеннямдозиб. 0 1 0 | 16 )|276279|231010 | 13
Передвведеннямдози8. 0 1 0 | 16 |193064 | 213058 13
Передвведеннямдози!0 0 2 | 0 | 16 | 172866 | 228817 13
Передвведеннямдози!12 | 0 | 0 | 16 )|299538| 365275 1
Після введення дози 12 (перед ною місяців (Серединаперіодувідновлення.д/ | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 5 (Розтинпісля перодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8 бб
Таблиця 38
Концентрація анти-пПАбЗА антитіл у сироватці та СМР, об'єднані дані самців і самок (нг/мл) основи сироватці (нг/мл) СМР.(нг/мл) 1111111111111110|0Групавсукупності | Групавсукупності 11111111 |Середнєї СВ | п |Середнєї.Ї СВ | п
Моментчасуї 7777770 | внимло| н/мло| | нумло| н/мл | Г/(К("Ж
Операця 7 ЇЇ Ї11111171ї11111171110 10 11 8
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдозиї4. | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдозиб.ї | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози8./-:/ | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози1ї0.ї | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Передвведеннямдози1ї2 | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 7 (Серединаперіодувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 7
Розтинпісля перодувідновленняїд 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8 рупа 2:0 мг . сироватці (нг/мл нг/мл 111111111111110|0Групавсукупності | Групавсукупності 11111111 |СереднєЇї. СВ | п |Середнєї.Ї СВ | п
Моментчасуї 7777770 | вноимло| н/мло| | н/мло| нумл | :Г/ГР(К(ФБЖ
Операця 77 ЇЇ Ї111111171110 10 | 3
Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | 13
Передвведеннямдози4.//-:/ | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | "
Передвведеннямдозиб.ї | 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | ло
Передвведеннямдози8. | 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | ло
Передвведеннямдози1ї0. | 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | 9
Передвведеннямдози!ї2 | 0 | 0 | 15 | 0 | 0 | 9 пня в 03155 введення останньої дози) (Серединаперіоддувідновлення | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 4
Розтинпісля перодувідновленняїд 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8
Група 3: 1,8 мг . сироватці (нг/мл) (нг/мл) 11111111 Групавсукупності | Групавсукупності 11111111 | Середнеї, СВ | п |СереднєЇї,ї СВ | п
Моментчасуї 77717171 нмло| нмло| | нумло| н/умл | Г/Г/(К«
Операція: 77717711 11111111 110 10 | 5
Передвведеннямдози?2 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | з
Передвведеннямдозиб 80769 | 70467 | 16 | 656 | 1284 | 9
Передвведеннямдози(5 142031 | 93979 | 16 | 2206 | 3796 | 9
Передвведеннямдози 10 341506 | 436656 | 16 | 4597 | 9386 | 9
Передвведеннямдози12 511938 | 635340 | 16 | 9916 | 20970 | 9
Под нню виш! о те пе о введення останньої дози) (Серединаперіодувідновлення / 358213 | 226397 | 8 | 25064 | 29302 | 5
Розтинпісля періоду відновлення 504013 | 766860 | 8 | 16499 | 18552 | 7
Група 4: 6,0 мг . сироватці (нг/мл) (нг/мл) 11111111 Групавсукупності | Групавсукупності 11111111 | Середнеї, СВ | п |СереднєЇї,ї СВ | п
Моментчасуї 77717171 нмло| нмло| | нумло| н/умл | Г/Г/(К«
Операція: 77717711 11111111 110 10 | 5 (Передвведеннямдози?2 | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | з
Таблиця 38 (продовження) основи сироватці (нг/мл) СМР.(нг/мл)
Передвведеннямдози8 315800 | 201572 | 16 | 11470 | 14344 | 9
Поднсншвеи лю! о | жю вк 7 введення останньої дози) (Серединаперіодувідновлення /1270750| 938646 | 8 | 53875 | 42430 | 4
Розтинпісля періоду відновлення 953125 | 763122 | 8 | 39474 | 26274 | 7
Група 5: 18,6 мг . сироватці (нг/мл) (нг/мл) 11111111 Групавсукупності | Групавсукупності 11111111 | Середнеї, СВ | п |СереднєЇї,ї СВ | п
Моментчасуї 77717171 нмло| внмло| ////// |нумло Ц|нумл
Операція: 77717771 11111111 11111111 11010 | з
Передвведеннямдози? | 0 | 0 | 16 | 0 | 0 | 5
Под ево тою! о | аю тю о введення останньої дози) (Серединаперіодувідновлення /2492875)|1686472| 8 | 51346 | 36819 | 5 (Розтин після періоду відновлення) 2005125 |1347857| 8 | 44258 | 31114 | 8
Таблиця 39
Частота виявлення антитіл при розтині антитілами (позитивні/всього антитілами (позитивні/всього протестовано) протестовано)
Група Розтин Розтин | Розтин ) Розтин | Розтин | Розтин | Розтин Розтин після після після після після після після після . періоду |закінченн| періоду |закінченні| періоду |закінченн| періоду закінчення) . . й . 6 місяців відновле| я б відновлен| я б відновлен| я б відновленн ння місяців ня місяців ня місяців я
Межа кількісного визначення гАЗА у сироватці довгохвостих макак становить 39,1 нг/мл, і у всіх пробах сироватки з груп 1 і 2 концентрації були вищими від межі кількісного визначення (МКВ), див. Таблицю 33. Рівень ПАЗА у сироватці визначали перед введенням доз 2, 4,6, 8, 10 та 12 і через 24 години після введення зазначених доз (розтин після закінчення б-місячного періоду), у середині періоду відновлення і перед розтином після періоду відновлення. Рівень
ГПАЗА у групі З (1,8 мг/дозу), групі 4 (6,0 мг/дозу) і групі 5 (18,6 мг/дозу) був таким, що його неможливо було визначити, перед введенням доз 2, 4, 6, 8, 10 і 12, після введення дози 12, у середині періоду відновлення та перед розтином після періоду відновлення. Після введення дози 2 рівень ППА5БА був дозозалежним. Після введення дози 4 (група 3), дози 6 (групи Зі 4) і дози 8 та 10 (групи З і 4 та самці групи 5) рівень гГПАБА був таким, що його неможливо було визначити. Рівень ПАЗА в сироватці знижувався в групі 4 (6,0 мг/дозу) після введення дози 4 і в групі 5 (18,6 мг/дозу) після доз 4 та 6 у самців, і після введення доз 4, 6, 8 та 10 у самок.
Зазначене передбачуване зниження рівня гпАБА у сироватці могло бути пов'язанє зі збільшенням концентрації анти--'пПАБА антитіл. Явних статевих відмінностей у рівні ГПАБА у сироватці виявлено не було з урахуванням варіабельності між пробами і малого числа груп у даному дослідженні.
Межа кількісного визначення гпПАЗА у СМР довгохвостих макак становить 19,5 нг/мл, і у всіх пробах СМР із груп 1 і 2 концентрації були ВОЇ, див. Таблицю 31. Концентрація гпА5ЗА була такою, яку можливо було визначити, в СМР перед введенням доз 2, 4,6, 8, 10 та 12 і після введення всіх зазначених доз (розтин після закінчення б-місячного періоду) у всіх групах, що одержували препарат. Зазначений рівень був вищим після введення доз (приблизно через 24 години після введення) і залежав від дози. Рівень гГпПАЗА у СМР був набагато вищим, ніж у сироватці. Явних статевих відмінностей у рівні гппАБА у сироватці виявлено не було з урахуванням варіабельності між пробами і малого числа груп у даному дослідженні. У всіх групах, що одержували препарат, у середині періоду відновлення й перед розтином після періоду відновлення гпПАБА не виявлялася. Рівень ГПАБА у СМР при відборі під час дози 12 (розтин) у групах, що одержували гпА5бА, був нижчим, ніж рівень після дози 8 і 11. Можливі причини більш низького рівня ППА5А при розтині включають взяття об'єму (72,25 мл всього для визначення лейкоцитарної формули, біохімії, рівня гпА5БА ії анти-ппА5БА антитіл) при розтині, більшого ніж об'єм, що відбирається в моменти часу прижиттєвого відбору проб (до 0,5 мл перед або після введення дози для оцінки концентрації гпА5бА). Крім того, у деяких тварин при розтині просвіт катетера був закритим, і проби відбирали за допомогою спинномозкової пункції, а не через катетер. У пробах, відібраних таким шляхом, визначувані концентрації гпА5А були незмінно нижчими, ніж у пробах, відібраних через катетер. Імовірно, це пов'язано з обмеженим рострокаудальним напрямком об'ємного потоку СМР, який, як передбачається, має місце у тварин із вертикальною орієнтацією тіла, таких як мавпи, і людей (наприклад, добре відомо, що компоненти СМР проявляють виражений рострокаудальний градієнт протягом усього життя особини).
У кожної тварини, що одержувала гпАБА, в який-небудь момент часу в сироватці виявлялися анти-пПпА5А антитіла, див. Таблицю 34. Тварин вважали позитивними за анти-г'пАБА антитілами, якщо рівень анти-(пАБА антитіл був вищим від межі кількісного визначення (78,1 нг/мл). Після того, як тварини ставали сероконвертованими, вони залишалися позитивними за анти-пПпА5А антитілами. У момент часу перед введенням дози 2 жодна тварина не була позитивною за анти-ППАЗА антитілами. Усі тварини, що одержували гПАБЗА, за винятком самця Мо 026 (група 4; 6,0 мг/дозу), демонстрували анти-гппАЗА антитіла в сироватці в момент часу перед введенням дози 4. Самець Мо 026 був позитивним за анти-ппАбБА антитілами в сироватці в момент часу перед введенням дози 6. У групі 5 (18,бмг/кг) у пробах, відібраних при розтині, рівень антитіл був нижчим. Зазначене передбачуване зниження може бути пов'язане з присутністю гпПАБА, що перешкоджає кількісному визначенню. У цілому титр був вищим у групах, що одержували високі й середні дози (6,0 і 18,6 мг/дозу), ніж у тварин, що одержували низьку дозу (1,8 мг/дозу). Присутність анти-ІПАБА антитіл - результат, очікуваний на основі даних лікування довгохвостих макак рекомбінантними білками людини. З урахуванням варіабельності результатів, явних статевих відмінностей виявлено не було.
У всіх тварин із рівнем анти-ПпА5БА антитіл у СМР, який можливо було визначити, був також таким, що можливо визначити, рівень анти-пПпАФЗА антитіл у сироватці, за винятком самок Мо 049 (група 3; 18,6 мг/дозу) і Мо 057 (група 4; 6,0 мг/дозу). Варіабельність концентрації антитіл і частота їх утворення перешкоджала визначенню залежності "доза-відповідь". Тварин вважали позитивними за анти-ПпПАЗА антитілами, якщо рівень анти-гГпПАБА антитіл був вищим від межі кількісного визначення (78,1 нг/мл).
Об'єднані для самців і самок значення рівня гпПАЗА у сироватці та СМР і рівня анти--ПАБА антитіл наведені в Таблиці 36 і Таблиці 37. Об'єднані для самців і самок результати подібні до результатів для кожної окремої статі, які обговорювалися вище.
Приклад 6: Ефективність
У даному прикладі, 11 контрольних мишей дикого типу (тАБА ж/- ПАБА -/-) розподілили до групи А, яка не одержувала препарат. Тридцять чотири (34) миші ПАБАСб695/А5А -/-розподілили до 5 різних груп, що одержували основу (група В) або гПАБЗА в дозах 20 мг/кг (внутрішньовенно
ІВВІ; група С), 0,04, 0,012 ї 0,21 мг (групи 0, Е ії Е відповідно) у дні 1, 9, 15/16 і 22. Усі внутрішньовенні дози вводили до хвостової вени. Усі інтратекальні (ІТ) дози вводили у вигляді бо інфузії в об'ємі 12 мкл із приблизною швидкістю 2 мкл/20 секунд (Таблиця 40).
Таблиця 40
Схема експерименту мг/кг
Загальн .
К-сть Шлях Умертвінн| маси
Група Тип тварин Препарат Доза а к-сть тварин введення |., 1... я головно ін'єкцій го мозкуз
Контроль
А 11 пАБАІ, Немає н/З н/З н/з н/З н/З
ПАЗА -/-)
Контроль із ІТ введенням| основа | поперековий основи відділ вена) Через 24
ІТ 4 години
ПАБАСбО95/ ГПАБА 0,04 мг | поперековий (Дні 1,9, після 100
АБА -/- відділ 15/165 і | введення
ІТ 22) | четвертої
Е 5 ГПАБА 0,12 мг | поперековий дози 300 відділ
ІТ
Е 10 ГПАБА 0,21 мг | поперековий 520 відділ
Н/з - не застосовне; ІТ «- інтратекально; ВВ - внутрішньовенно. а Маса головного мозку у миші становить приблизно 0,0004 кг. ь Групи С, 0 і Е одержували препарат у день 15; групи В і Е одержували препарат у день 16.
Миші з нокаутованим геном АЗА-ПАБАСбОБ/АБАЦ-/-) - є загальноприйнятою моделлю метахроматичної лейкодистрофії, і їх широко застосовують для тестування потенційних засобів 5 лікування зазначеного захворювання. Інтратекальний шлях введення є планованим шляхом введення у людини. Внутрішньовенний шлях введення тестували для даної сполуки та аналогічної сполуки у мишей із метахроматичною лейкодистрофією. Контрольну групу із внутрішньовенним введенням додали як позитивний контроль для оцінки гістологічних змін, очікуваних у периферичних органах. Тварини одержували 100, 300 або 520 мг/кг маси головного мозку (0,04, 0,12 або 0,21 мг відповідно) ГПАБА. Обраний для даного дослідження рівень доз, нормований на масу головного мозку, відповідає дозам, які планується застосовувати у людини, або він застосовувався в токсикологічних дослідженнях чи в попередніх моделях лізосомних хвороб накопичення для оцінки ефективності. Очікується, що зазначені дози не мають якої- небудь токсичності.
Об'єкт
Вид Миша (Миз тизсии5)
Лінія миші ПНАЗАСб95/АЗА (-/-) і контроль дикого типу
Вік після прибуття приблизно 14-17 місяців
К-сть груп 6
К-сть тварин 34 миші, нокаутні за АЗА, -- 11 контрольних тварин дикого типу
Після прибуття кожну тварину оглядали, оцінюючи стан її здоров'я.
Вміст
Тварин утримували групами в клітках із полікарбонату з верхом-фільтром, підстилка була виконана з паперу Сагенгезі, у клітках стояли флакони з водою. Кожну клітку чітко маркували з використанням таблички із вказівкою проекту, групи, номерів тварин і їхньої статі. Кожну то тварину ідентифікували унікальним кодом із застосуванням системи проколювання вушної раковини. Тварин утримували відповідно до федеральних вказівок.
Цільові умови навколишнього середовища в приміщенні, де утримували тварин, і світловий період були наступними:
Температура 22"Сзь3Ус
Вологість 50 95 ж 20 95
Цикл світло - темрява 12 годин світла і 12 годин темряви
Під час і після введення препарату світловий період може тимчасово перериватися для проведення запланованих заходів. Такі перерви вважаються такими, що не впливають на результат або якість даного дослідження.
Усіх наявних у розпорядженні тварин дикого типу (11) розподілили до групи А, і їм присвоїли номери від 35 до 45. Тваринам із генотипом АБА (-/-) ПАЗА (ч7-) присвоїли номери по порядку (від 1 до 34), для чого їх брали з їхніх кліток, зважували і здійснювали проколювання вушної раковини в період акліматизації. Потім тварин розподіляли до груп лікування з використанням інструмента Кезеєагсп Капдотігег (м/млу.гапаотігег.огу) З січня 2011р. Перші 9 номерів були присвоєні групі В, наступні 5 - групі С, наступні 5 - групі О, наступні 5 - групі Е ї останні 10 номерів - групі Е. Тварин розподілили до груп наступним чином, як описано в Таблиці 41:
Таблиця 41
Розподіл тварин до груп 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 в' Її 9 | 7, 13, 17, 22, 23, 24, 28, 29, 30 6, 16, 192, 21, 32 0 ЇЇ 5 | 5, 9, 14, 18, 27 1,2,4,8,11 3», 10, 12, 15, 20, 25, 26, 31, 33, 34 а Тварину Мо 19 не могли знайти під час введення препарату. ь Тварина Ме З загинула до початку введення препарату.
Тестована речовина і основа
Тестована речовина
Найменування ТАЗА
Опис рекомбінантна арилсульфатаза А людини (АКЗА)
Умови зберігання приблизно 4 "С
Основа
Най основа для гпАБА (154 мМ Масі, 0,005 95 полісорбат 20, рн айменування -6,0)
Умови зберігання приблизно ас
Приготування основи
Зазначену основу застосовували у встановленому порядку. її нагрівали на поверхні робочого стола (кімнатна температура). Як тільки основа нагрівалася, речовину змішували за допомогою акуратного обертання й перевертання флаконів. Флакони не збовтували й не струшували. Перед відбором речовини флакон висушували. Будь-який залишок основи повертали до холодильника (від 1 "С до 8 7).
Приготування лікарської форми для введення
ГАБА розводили в основі з одержанням необхідної концентрації. Тестовану речовину нагрівали на поверхні робочого стола (кімнатна температура). Як тільки тестована речовина нагрівалася, її змішували за допомогою акуратного обертання й перевертання флаконів.
Флакони не збовтували й не струшували.
Барвники для відстеження речовини, яку вводили:
Для відстеження речовини, яку вводили, застосовували барвник, що поглинає в інфрачервоній області (такий як ІКОуефФ, "ГІ-СОК Віозсіепсев", Лінкольн, Небраска). Такі барвники широко застосовувалися при інтратекальних ін'єкціях як спосіб оцінки "виживаності" речовини після інтратекального введення. Зазначений барвник змішували з тестованою речовиною перед введенням; до тестованої речовини додавали 1 нм барвника в об'ємі 1 мл.
Для відстеження речовини, яку вводили, крім барвника, що поглинає в інфрачервоній області, застосовували 1 мкл РОС Біце Мо 1 (0,25 95). Зазначений синій барвник є загальноприйнятою харчовою добавкою і, в цілому, вважається безпечним і нетоксичним.
ІТ введення гПАЗА або основи до попереково-крижового відділу
Тваринам із груп В, 0, Е і ЕР робили інтратекальні ін'єкції в дні 1,9, 15 або 16, і 22.
Дорослих мишей піддавали анестезії за допомогою внутрішньочеревинної ін'єкції 1,25 95 2,2,2-триброметанолу (авертину) в концентрації 200-300 мл/10 грамів маси тіла (250-350 мг/кг).
Шерсть на спині зрізали від основи хвоста до області лопаток з використанням ножиців.
Обголену область протирали тампоном зі скрабом на основі повідину/бетадину і далі - ізопропіловим спиртом. Над попереково-крижовим відділом хребта робили маленький розріз шкіри по серединній лінії (1-2 см) і знаходили місце перетину серединної лінії спини та ближчого до голови краю крил клубової кістки (одиночна клубова кістка). М'яз у клубовій ямці (середня сіднична) являє собою м'яз у формі серця. Дві сторони верхівки "серця" вказують приблизне розташування крил клубової кістки. Голку 32 калібру, приєднану до герметичного скляного шприца Гамільтона об'ємом 10-20 мкл, вводили доти, доки не виникав опір з боку кістки, що лежить нижче. Потім проводили ін'єкцію 10 мкл тестованої речовини, 1 мкл барвника, що поглинає в інфрачервоній області, та 1 мкл БОС Біе Мо 1 (сумарний об'єм, який вводили, 12 мкл) із приблизною швидкістю 2 мкл/20 секунд (12 мкл/2 хвилини). Розріз шкіри зашивали шляхом накладення кліпс.
Успішність введення оцінювали за допомогою візуалізації, визначаючи, чи розподілився барвник, що поглинає в інфрачервоній області, а також синій барвник у ЦНС. Після візуалізації тварині давали відновитися в реабілітаційній камері.
Внутрішньовенна ін'єкція ГПАБА
Тваринам із групи С робили внутрішньовенні ін'єкції в дні 1, 9, 15 і 22.
Для проведення ВВ ін'єкцій тварин піддавали анестезії з використанням ізофлурану, за необхідності, і поміщали до обмежувача. Для розширення хвостової вени, хвіст розігрівали, акуратно постукуючи по ньому пальцем. Ділянку ін'єкції протирали 7095 етанолом. Як альтернатива, тварину поміщали до теплої камери (40 С) на 1-1,5 хвилини. Для введення тестованої речовини застосовували голку 28-30 калібру. Об'єм, який вводили, становив 5- 10 мл/кг.
Приблизно через 24 години після введення четвертої дози, тварин із груп В-Е піддавали евтаназії. Далі проводили різні процедури відбору тканин у тварин, як описано нижче. Тваринам із групи А ніяких препаратів не вводили; однак їх піддали евтаназії 27 або 28 січня 2011 р., і були виконані процедури відбору тканин, як описано нижче.
Сироватка (усі тварини)
Термінальну пробу крові (приблизно 0,5 мл) відбирали у всіх тварин (групи А-Е) за допомогою ретроорбітальної пункції під ізофлуорановою анестезією. До очної ямки вводили скляну трубку, акуратно проводили її до області за очним яблуком і тим самим порушували венозний відтік за очним яблуком. Кров збиралася завдяки капілярному ефекту і/або руху самопливом. Після відбору крові на очну ямку надавлювали, щоб припинити кровотечу.
Проби цільної крові обробляли, одержували сироватку й заморожували її при « -80 76.
Сироватку зберігали при -80 "С і аналізували на наявність антитіл.
Тканини для дослідження під світловим мікроскопом (групи А-Е; 5 мишей на групу) (02321
Після відбору крові тварин піддавали евтаназії за допомогою удушення СО». Перед перфузією відбирали фрагмент хвоста й заморожували його для можливого генотипування. Порожнину перикарда піддавали обробці. Трьом (3) мишам на групу проводили транскардіальну перфузію гепаринізованим фізіологічним розчином (1 Од/мл гепарину натрію в 0,995 Масі, після стерильної фільтрації), охолодженим на льоді, а потім 4 95 параформальдегідом приблизно при 4 "С. Вилучали головний мозок і розкривали черевну порожнину для наступної роботи з внутрішніми органами. Головний мозок і тушку поміщали в параформальдегід, за винятком фрагмента хвоста, який заморожували.
Тканини для аналізу ліпідного складу (групи А, В і Е; тварини 6, 4 і 5 відповідно)
Після відбору крові тварин піддавали евтаназії за допомогою удушення СО». Перед перфузією відбирали фрагмент хвоста й заморожували його для можливого генотипування. бо Порожнину перикарда піддавали обробці. Для аналізу ліпідного складу 4-6 мишам на групу проводили транскардіальну перфузію гепаринізованим фізіологічним розчином (1 Од/мл гепарину натрію в 0,9 95 Масі, після стерильної фільтрації), охолодженим на льоді. Приклади тканин, відібраних для аналізу ліпідів, представлені в Таблиці 42.
Таблиця 42
Тканини, що відбираються для аналізу ліпідного складу зважений) (Спинний мозок(вилученийізхребта)їд /-/:/ї1с1С
Сідничний нерв (2) (відділений від м'язів) перфузіею)
При відборі тканини зважували, а потім заморожували або на сухому льоді, або поміщаючи в морозильник із температурою -80 "С. Головний мозок розділяли на ліву й праву півкулю.
Праву півкулю застосовували для аналізу ліпідного складу методом МС. Ліва півкуля призначалася для можливого аналізу на М-ацетил-і -аспартат (МАА). Тканини зберігали при - 80 "С до проведення аналізу (див. Таблицю 43).
Таблиця 43
Умови зберігання проб
ГПАБЗА знижувала накопичення сульфатидів у спинному мозку мишей із МЛД, особливо в білій речовині, Фігура 19. Морфометричний аналіз спинного мозку продемонстрував, що оптична щільність офарблення альціановим синім статистично значущо знижувалася після введення гпАБА. Фігура 20. У мишей із МЛД, що одержували гпАБА, також була знижена активність лізосом у головному мозку, Фігура 21. Зазначене зниження було статистично значущим у групі, що одержувала високу дозу (0,21 мг - 520 мг/кг маси головного мозку) у порівнянні з мишами, що одержували тільки основу, Фігура 22.
Імунотолерантні миші з МЛД (ПАЗАСб95/АБА(-/-)) старші 1 року одержували пПАБА інтратекально до поперекового відділу один раз на тиждень протягом 4 тижнів (усього 4 дози).
Дози включали основу (154 мМ Масі, 0,005 95 полісорбату 20, рН -6,0), 0,04, 0,12, 0,21 мг/дозу (нормовані дози становили 100, 300, 520 мг/кг маси головного мозку відповідно). У термінальні моменти часу ефективність визначали за допомогою |імуногістохімічної оцінки кліренсу сульфатидів і активності лізосом у головному та спинному мозку. Зрізи спинного та головного мозку офарблювали альціановим синім, який націлений на сульфатиди в тканинах. Зрізи головного мозку також офарблювали на наявність асоційованого з лізосомами мембранного білка (ГАМР) як індикатора лізосомальних процесів. Крім того, на зрізах спинного та головного мозку, офарблених альціановим синім і ГАМР, проводили морфометричний аналіз.
Зазначені попередні результати демонструють ефективність інтратекального введення
ГАБА до поперекового відділу. У порівнянні з мишами, що одержували тільки основу, у мишей із МЛД, що одержували гпАБА, були отримані підтвердження покращення на основі гістологічних маркерів захворювання, таких як скорочення накопичення сульфатидів (виявляється за офарбленням альціановим синім), і лізосомальної активності в головному мозку. Зазначені гістопатологічні зміни спостерігалися поблизу ділянки введення (поперековий відділ спинного мозку), у дистальних відділах спинного мозку, а також у дистальних відділах головного мозку.
Приклад 7: Біорозподіл 2
Короткий огляд
У даному дослідженні 36 самців і 36 самок молодих довгохвостих макак (вік « 12 місяців на початку дослідження) випадковим чином розподіляли до 5 лікувальних груп, і вони одержували
ГПАБА у дозах 0 (контроль вживления пристрою; тварини одержували 0,6 мл ФБР), О (контроль із введенням основи), 1,8, 6,0 або 18,бмг (групи 1, 2, 3, 4 і 5 відповідно) один раз на два тижні протягом 6 місяців: усього 12 доз. Усі дози вводили в формі інфузії в об'ємі 0,6 мл, після чого пристрій введення промивали 0,5 мл ФБР приблизно протягом 10 хвилин (Таблиця 44).
Таблиця 44
Схема експерименту . К-сть тварин,
Номінальна К-сть тварин, .
Група | К-сть тварин |концентрація в Доза, яку умертвлених через умертвлених пісЛЯ дозі (мг/мол) вводили (мг) 6 місяців місячного періоду відновлення 1 | «МмаЖж | ос | 0 | юю юьЙ- | «ма 2 | 8МвЖ | о 770 | 4Ммз3же | 7 4МмаЖжо0ш 4 | вмажЖ | ло | 60 | «амижЖж | «Ма ре « контроль пристрою; тварини в групі 1 не одержували ні основи, ні тестованої речовини. а Тварина Мо 044 з групи контролю введення основи померла в день 50 через витік у катетері.
Матеріали і методи
Відбір тканин
Головний мозок нарізали в спеціальному середовищі з товщиною фронтального зрізу приблизно З мм. З кожного головного мозку одержували повні фронтальні зрізи, що включають нову кору (включаючи кору лобових, тім'яних, скроневих і потиличних долей), прадавню кору (нюхові цибулини і/або грушоподібну долі), базальні ганглії (включаючи хвостате ядро й шкарлупу), лімбічну систему (включаючи гіпокамп і поясні звивини), таламус, гіпоталамус, відділи середнього мозку (включаючи чорну речовину), мозочок, міст і довгастий мозок. Місця, звідки були отримані індивідуальні проби тканини (через біопсичний прокол 4 мм), показані на
Фігурах 133-138. Зображення на Фігурах 133-138 отримані з Університету Вісконсину та
Мічиганської Державної Порівняльної Колекції Мозку Ссавців (також називаної Національним музеєм здоров'я та медицини). Зразок із проколу Мо 22 не відбирали, оскільки даної структури не було під час розтину. Усі проби тканин головного мозку заморожували і зберігали при -60 "С або нижче до проведення аналізу на ПАЗА з використанням твердофазного імуноферментного аналізу.
Перший зріз головного мозку і далі кожний наступний зріз фіксували в формаліні для гістопатологічної оцінки й імуногістохімічного аналізу. Другий зріз головного мозку й кожний наступний другий зріз заморожували для аналізу тестованої речовини. Перед заморожуванням проби тканин головного мозку для аналізу біорозподілу брали з правої частини зрізів головного мозку для аналізу тестованої речовини під парними номерами. Локалізацію проб головного мозку фотографували при розтині й записували номери зрізів головного мозку. Проби відбиралися або через 4 мм круговий прокол, або через розріз, виконаний скальпелем, щоб оптимізувати кількість білої речовини, яку відбирали. Усі біопсичні зразки заморожували при - 60 "С або нижче для проведення аналізу тестованої речовини. Залишок зрізу головного мозку заморожували і зберігали при -60 "С або нижче для можливого проведення аналізу тестованої речовини. Розташування біопсичних зразків показане в Додатку В.
Зі спинного мозку (шийний, грудний і поперековий відділи) виготовляли зрізи товщиною один сантиметр. Перший зріз і кожний наступний зріз фіксували в формаліні для гістопатологічної оцінки й імуногістохімічного аналізу. Другий зріз спинного мозку й кожний наступний другий зріз заморожували і зберігали при -60 "С або нижче для аналізу тестованої речовини. Розподіл зрізів коректували так, щоб зріз із кінчиком інтратекального катетера (зріз 0) можна було фіксувати в формаліні й піддавати гістопатологічному аналізу.
Приготування екстрактів головного мозку, печінки й спинного мозку та визначення концентрації ГПАБА
Біопсичні зразки головного мозку, проби спинного мозку й печінки аналізували з використанням способу, що пройшов валідацію відповідно до принципів Належної лабораторної практики (СІ Р) Управління з контролю харчових продуктів і лікарських препаратів США (ЕОА) 21
СЕРЕ, Частина 58 та відповідно до застосовних Стандартних операційних процедур біологічних досліджень на Середньому Заході. Проби тканини гомогенізували в лізуючому буфері, т4 центрифугували для видалення уламків тканин і зберігали при -80 "С до проведення аналізу.
Концентрацію гпАБА у розчинних фракціях гомогенатів визначали з використанням ЕГІЗА із застосуванням поліклонального антитіла кролика 5НО40 як іммобілізованого антитіла і кон'югованого з ПХ (пероксидазою хріну) моноклонального анти-АБА антитіла 19-16-3 як детекторного антитіла. Після етапу відмивання, спрямованого на видалення речовини, що не зв'язалася, розчин субстрату тетраметилбензидину (ТМВ) реагував із пероксидазою в присутності ПХ-кон'югованого антитіла, формуючи колориметричний сигнал, який був пропорціональним кількості ГППАБА, зв'язаній анти-А5БА антитілом на першому етапі. Підсумкову кількість ГПАБА у гомогенаті кожної тканини обчислювали шляхом інтерполяції стандартної кривої.
Проби також аналізували з використанням способу визначення білків за участю біцинхонінової кислоти (ВСА), щоб дізнатися концентрацію білка в пробі. Концентрацію білка в кожній пробі визначали шляхом інтерполяції стандартної кривої для альбуміну. Потім результати визначення концентрації ГПАБА нормували на загальний вміст білка в екстрактах тканини, який визначили за допомогою способу за участю біцинхонінової кислоти.
Рівень гпАБА у всіх біопсичних зразках для груп, що одержували основу, 1,8 мг/дозу, 6,0 мг/дозу і 18,бмг/дозу, показаний на Фігурі 23, Фігурі 24, Фігурі 25 і Фігурі 26 відповідно. Рівень
ТАЗА у всіх біопсичних зразках у тварин, що пройшли період відновлення з груп контролю введення пристрою, основи, 1,8 мг/дозу, 6,0 мг/дозу і 18,6 мг/дозу, показаний на Фігурі 27, Фігурі 28, Фігурі 29, Фігурі 30 і Фігурі 31 відповідно.
Рівень гпАБА у вибраних біопсичних зразках, які відбирали поблизу поверхні (оболонки мозку) головного мозку показаний на Фігурі 32. Рівень ПАЗА у вибраних біопсичних зразках, які, як припускається, повинні містити в основному глибокі шари білої речовини головного мозку, показаний на фігурі 33. Біла речовина складається з пучків мієлінізованих нервових клітин (або аксонів). Обрані пучки, які містять в основному глибокі шари білої речовини головного мозку, показані на Фігурі 34. Сіра речовина містить тіла нервових клітин, на відміну від білої речовини.
Значення концентрації гпАБЗА у вибраних біопсичних зразках з поверхні, з глибоких шарів білої речовини і глибоких шарів сірої речовини для кожної групи показані на Фігурі 35.
Дані про концентрацію в спинному мозку наведені на Фігурі 36.
Дані про концентрацію в печінці наведені на Фігурі 37.
У деяких випадках рівень ППАБА в печінці, спинному й головному мозку групи контролю пристрою та контрольної групи, що одержує основу, був таким, що його можливо було визначити. Рівень у печінці й спинному мозку був нижчим, ніж у кожній із груп, що одержували
ТАЗА (Фігура 23, Фігура 32 і Фігура 33). Рівень ПАЗА у групі контролю пристрою та контрольній групі, що одержує основу, відображає перехресну реактивність між анти-гпА5А антитілом, яке застосовується в ЕЇ154А, з нативним білком довгохвостих макак. Наведені значення в тканинах групи контролю пристрою та контрольної групи, що одержує основу, не відображають кількісних показників ГПА5А в тканинах довгохвостих макак, оскільки ступінь перехресної реактивності між антитілом і ГпПАБА довгохвостих макак невідомий і у зв'язку з тим фактом, що в стандартах аналізу застосовується ГПАБА. Однак коливання рівня гПА5А, які виявляються між тканинами групи контролю пристрою та контрольної групи, що одержує основу, можна інтерпретувати як демонстровану варіабельність відносних кількостей гпАБА у довгохвостих макак у різних тканинах і анатомічних відділах.
Рівень АБА в зрізах спинного мозку варіював у діапазоні 160-2352, 1081-6607 і 1893- 9252 нг/мг білка у самців та в діапазоні 0-3151, 669-6637 і 1404-16424 нг/мг у самок із груп, що одержували 1,8, 6,0 і 18,6 мг/дозу відповідно (Фігура 32). Рівень АБА був вищим у поперековому відділі спинного мозку, ніж у шийному відділі. Рівень білка АБ5БА, який визначався в печінці, у групах, що одержували АБА, залежав від дози й був дуже низьким у групі, що одержувала основу. Середній рівень АБ5БА становив 88, 674 і 2424 у самців та 140, 462 і 1996 нг/мг білка у самок для груп, що одержували 1,8, 6,0 і 18,6 мг/дозу відповідно (Фігура 33).
У цілому, представляється, що рівень АБА залежить від дози в пробах, приготовлених зі зрізів спинного мозку й печінки тварин із груп, що одержували АБ5БА. У багатьох із тестованих відділів спинного мозку була продемонстрована залежність рівня АБА від дози, яку вводили, хоча в інших відділах залежність від дози була менш визначеною. У цілому, рівень АБА в головному мозку підвищувався зі збільшенням дози АЗА.
Приклад 8: Вивчення фармакокінетики та біорозподілу
Мета даного дослідження полягала в оцінці фармакокінетики (ФК) і біорозподілу різних ферментів для замісної ферментної терапії після інтратекального (ІТ) та внутрішньовенного (ВВ) введення довгохвостим макакам.
У даному дослідженні всього дванадцять самців і самок довгохвостих макак із інтратекальним катетером у поперековому відділі (ІТ-П) випадковим чином розподіляли в залежності від маси тіла до чотирьох лікувальних груп для Фази Та (введення 125) і Фази 15 (введення АБА).
У обох фазах проби крові та СМР (з ІТ-П катетера) відбирали через задані інтервали часу після введення препарату. Після відбору останніх проб у Фазі 1а тварин залишали на 7-денний період відмивання, після чого починали Фазу 16.
Після відбору останніх проб у Фазі 15 тварин залишали на 7-денний період відмивання, після чого починали Фазу 2. Усього 12 самців і самок довгохвостих макак із Фази 15 випадковим чином розподіляли в залежності від маси тіла до дванадцяти лікувальних груп для одержання
І25 (групи Та-ба) і АБА (групи 16-65).
Абсолютна біодоступність АБ5А у сироватці після ІТ-П введення склала -30-40 95. На відміну від цього, при ВВ введенні біодоступними в СМР були лише 0,5 95 від введеної дози.
Вплив АБ5А у сироватці після ІТ-П введення збільшувався більш ніж пропорційно дозі.
Після ІТ-П введення вплив АЗА у СМР при збільшенні дози зростав менш ніж пропорційно дозі. ФК показники гпАЗА у сироватці, ФК показники ПАЗА у сироватці в СМР і біодоступність показані в Таблицях 45-47.
Таблиця 45
Підсумкові ФК показники АЗА у сироватці довгохвостих макак
ДМ ее Кв фени
А (фаза ІБ: ВВ 1 | (фаза ІБ:1Т-П 1,8 А (фаза ІБ: ІТ-П 6 | (фаза ІБ: ІТ-П 18,6 мг/кг) мг) мг) мг) м111111781111111716 11111818
Таблиця 46
Підсумкові ФК показники КНА5БА у СМР довгохвостих макак
БИК фл
А (фаза 1Б6:ВВ ТА (фаза Ір: 1Т-П|іа А (фаза 16: ІТ-| (фаза Ір: ІТ-П 18,6 мг/кг) 1,8 мг) П 6 мг) мг)
М171111111417111111716 1118 18
Таблиця 47
Біодоступність ПАЗА у сироватці та СМР 11111111 Порівнянняабсолютноїбіодоступності.//-:/ ///СССССС9 и орви у р
ІТ-П 1,8 мг) 16: ІТ-П 6 мг) ІТ-П 18,6 мг)
Біодоступність гПАЗА у сироватці після ІТ-П введення склала -30-40 95. На відміну від цього, при ВВ введенні біодоступними в СМР були лише 0,5 95 від введеної дози.
Таблиця 48
Розподіл СМР: сироватка (фаза 165: ВВ 1 мг/кг) 16: 1Т-П 1,8 мг) (фаза1б: ІТ-Пбмг) | (фаза 16: 1Т-П 18,6 мг)
Приклад 9: Лікування пацієнтів із МЛД
Пряме введення до ЦНС, наприклад, за допомогою ІТ доставки, можна застосовувати для ефективного лікування пацієнтів із МЛД. Даний приклад ілюструє багатоцентрове дослідження зі збільшенням дози, спрямоване на оцінку безпеки З рівнів доз ГПА5БА, що вводяться один раз на два тижні (р/2 тижн) протягом 40 тижнів через пристрій інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ3) пацієнтам із інфантильною формою МЛД. Різні варіанти пристроїв інтратекальної доставки лікарських засобів, які застосовуються для лікування людей, показані на Фігурах 45-48.
Усього в дослідження було включено до 20 пацієнтів:
Когорта 1: 5 пацієнтів (мінімальна доза)
Когорта 2: 5 пацієнтів (середня доза)
Когорта 3: 5 пацієнтів (максимальна доза) 5 пацієнтів були рандомізовані до групи, що не одержує препарат.
Для участі в дослідженні пацієнтів відбирали на основі наступних критеріїв включення: (1) наявність перших симптомів до настання віку 30 місяців; (2) ходячий стан на момент скринінгу (визначається як здатність самостійно вставати й проходити вперед 10 кроків (при підтримці за одну руку)); (3) наявність неврологічних ознак у момент скринінгу. Зазвичай пацієнтів із трансплантацією гемопоетичних стовбурних клітин в анамнезі виключають.
Визначають безпеку доз ППА5А, що збільшуються, які вводили шляхом ІТ ін'єкцій, протягом 40 тижнів дітям із пізнім початком інфантильної форми МЛД. Крім того, оцінюють клінічну активність гпАБА відносно загальної моторики, а також фармакокінетику однократних і багатократних доз препарату в сироватці та концентрації в спинномозковій рідині (СМР).
Хоча певні сполуки, композиції та способи, які описуються в даній заявці, були описані специфічно в рамках певних варіантів реалізації, наступні приклади служать тільки для ілюстрування сполук згідно з даним винаходом, але не повинні обмежуватися тільки цими сполуками.
Застосовувані в даному документі в описі та в доданій формулі винаходу форми однини, якщо явно не зазначено інше, включають множину. Умови формули винаходу або опису, в яких зустрічається "або" між одним або більше членами групи, вважаються задоволеними, якщо один, більше одного або вся група членів присутні, використовуються або іншим чином відносяться до даного продукту чи способу, якщо не зазначено протилежне або інше не випливає явно з контексту. Даний винахід включає варіанти реалізації, в яких один член зазначеної групи точно присутній, використовується або іншим чином відноситься до даного продукту або способу. Даний винахід також включає варіанти реалізації, в яких більше одного або ціла група членів присутня, використовується або іншим чином відноситься до даного продукту чи способу. Крім того, слід розуміти, що даний винахід охоплює всі варіанти, комбінації й перетворення, в яких одне або більше обмежень, елементів, умов, описових виразів та ін., з одного або більше перерахованих пунктів формули винаходу введені до іншого пункту формули винаходу, залежного від того ж основного пункту формули винаходу (або, якщо це є значущим, кожного іншого пункту формули винаходу), якщо не зазначено інше або якщо фахівцеві в даній області техніки не очевидно, що може виникнути протиріччя чи невідповідність.
Коли елементи присутні в переліках (наприклад, група Маркуша або аналогічна форма), слід розуміти, що також розкривається кожна підгрупа елементів і будь-які елементи з даної групи можна видалити.
Слід розуміти, що зазвичай там, де даний винахід або аспекти винаходу описуються як такі, що містять конкретні елементи, ознаки та ін., певні варіанти реалізації даного винаходу або аспектів винаходу включають чи по суті включають такі елементи, ознаки та ін.
З метою спрощення в даній заявці зазначені варіанти реалізації не були в кожному випадку описані так буквально.
Слід розуміти, що будь-який варіант реалізації або аспект даного винаходу можна в явній формі виключити з формули винаходу, незалежно від того, чи обмежене таке конкретне виключення в описі.
Публікації, інтернет-сайти та інші довідкові матеріали, на які посилається даний документ із метою опису рівня техніки в області винаходу та для надання додаткових подробиць стосовно його впровадження в практику, включені до даного документа за допомогою посилання.

Claims (18)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази А (АСА) та фармацевтично прийнятний наповнювач у лікуванні метахроматичної лейкодистрофії (МЛД), де білок АСА присутній у композиції в концентрації, що становить 10 мг/мл або більше, і де композиція містить до 10 мМ фосфату, МасСіІ та поверхнево-активну речовину полісорбату при рН в діапазоні 5,5-7,0.
2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що білок АСА містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: І.
3. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що білок АСА присутній у концентрації від ЗО до 100 мг/мл.
4. Застосування за п. 3, де білок АСА присутній у концентрації 30 мг/мл.
5. Застосування за п. 1, де МасС1 присутній у концентрації 100-200 мМ.
6. Застосування за п. 5, де Масі присутній у концентрації 154 мМ.
7. Застосування за п. 1, де поверхнево-активну речовину полісорбату вибирають із групи, що складається з полісорбату-20, полісорбату-40, полісорбату-60, полісорбату-80 та їх комбінацій.
8. Застосування за п. 7, де поверхнево-активною речовиною полісорбату є полісорбат-20.
9. Застосування за п. 8, де полісорбат-20 присутній у концентрації нижче 0,02 905.
10. Застосування за п. 9, де полісорбат-20 присутній у концентрації 0,005 95.
11. Застосування за п. 1, де композиція містить фосфат у концентрації не більше 5 мМ.
12. Застосування за будь-яким з пп. 1-11, де композиція має значення рН 6,0.
13. Застосування за п. 1, де композиція містить МасСі у концентрації приблизно 154 мМ, полісорбат-20 у концентрації приблизно 0,005 95 і рН приблизно 6.
14. Застосування за будь-яким з пп. 1-13, де композиція призначена для введення в об'ємі приблизно 1-5 мл.
15. Застосування за будь-яким з пп. 1-14, де введення здійснюють в інтервалі, вибраному з одного разу на кожні два тижні, одного разу на кожен місяць або одного разу на кожні два місяці.
16. Застосування за п. 1, де композиція призначена для прямого введення у ЦНС.
17. Застосування п. 16, де композиція призначена для внутрішньошлуночкового введення.
18. Застосування за п. 16, де композиція призначена для інтратекального введення.
ее. я ше й ; ПИ АНЯ пом. ЖК ее лена сульжатава еф Мі ЖЖ. В мк тов о м їх У ь ія ї Е 1 ее МКВ с М) ве ГІ 4 ся сад В зе ОНИ ; ся ї хх З ож М 1 КЕ ті хЬ хм У ї ся : Ме с М ти ес
Ко. ЗЕ с. З ї чо в нн п щі 4 ХУ їх х хи Ж ї ке В 7 роко тут ле дол ту тур лю м ромен г їх їх Б дих а З ах ха Бе й БУ з г «МЕ щі В КЕ їв я Мовмнальнай чає годі
Фіг. 1 седне лова сх в фл сіра БОБ: Б вУнівурюя «а Ех пнжднн Зурхеа су дж фжаза о юань МОЇ бом івеюх З
З . сей Дану яь аж сю ката ВВ: ХХ б меківнод Є К с ; шк т Му КЖ Оз соку х - Е ї ее Ар нех вва каз лю аж: МОМ З мрія Е у мот й І В Її - зосе» ВАЖІУ се ЗО КЕ вия
В. ав В їх ТУ ЕЗ ема - Ж Б ХЕ с с : і ВК ; сок Оу бе їх щі с і ку хх КЕ КО Зв ї їх що 55 і -х КЕ З -к хх ї ОК Я Фо Р одну чна днк уночі нн рахорововводрлннновоносо І т хх хх - Ук КХ 5 ех ба чи Ов 0 в в'я мМ є в Можональний засід
ФГ. 2
1ай Ко Ах жу ож пз дих ват, дних че а о а. щ . ОМ ее држтуяю фати А фаза МИ БЕ. Ї ме же Перед З к т -е МК с КО 5 вул Ко То і як і З х їх в В ї ім лих що тм иро : о Ін то і « КИ і о ї У ї Де між мм м маю м Зае хх ї я з ше же (ххх хх сх жо ххх. ЖхЖ ссхх «ххх ххх хххУ ххх. хх ххх ххх кю ххх ххх СЯ ЕК. ол з ях ще ЕЕ Ж сохне, ; Е з Мі пек З - - ЧО 8 Її око, А че - я 55 і бою, І : т р снеки : 4 З КУ нложкмтоккх, й ї ТЕ НИ ееекллсоєк мм хх 4 т Кк ях ї - ї м ХК 4 ром їх ! рука і - ! що І де Її ДАК НК КН т Ка г 1К СК хх Ка їх дак А ХММБНАНЬЖИ ак ОЖ
Фіг. З збе «ВЕК ежжь фе кам о (ваза ЗБ: ТУ 4 ме Мерювя ніж КК гас аж ор ов ховаю ВО Б й ш о: з я долею мойви ракета с фаза МВ ЗЕЗЕ а мж Перед а В ї й не вну ьвата а База А ВЕ мк МевО я
К я. сесйеє Ману ьША таж ев ТОЇ їв ерюм о ЯКЕ ум Ме вк . й о т с г ! С сект ВЖЕ ж ВЕЖ меня Б 7 ТЕ. т «ее КУ В МО й ія У хх ж а їх хг Кк т 35 З х чайна х В чн їх З шен стем КЕ ща ХХ М о ке ї . З Ж Кемк,
В . х ї- ее Пенн й що ше Мою АК Ж поет, Кк ВЕ Ку юку,
Ка. в ях ! ск «ки ж АК жи ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ. ЖЖ кжЖ КЖ Жжже жк кю кжее ЖЖ Же хи же жк чкжю чи пе 15 І5а що У Кох ія Кк СОМ З леж 7 ПДМ у КУ У у у У У ру уки куму хуя а Ж ж В Зх Ки ях заг где зм ще 2 кох і " ше як і 6 РЕ ОВО ОКО БОКОМ жк. . ск х Є Момацьвия час под з
Фіг. 4 і і і Мт: ща т век : ВЕ г Зх о во МОХ ес Вк я Вч же г че ше? МО : 5 кон Ж ще Е з З - ї ДК Я хе ж Ко дк їх ший Бе оо жо Хо М - сш ше. Ж Ї КУ ж ж ще ох хо ме я З жи що Я ся жов де мех КК КУ КОЖ т ж ох З ї е з й ТМ Ко со хе г БО я ПК. та Ех ж кг ра що Кия ех дя ее мВ ? щем еко Мижя Ми Мр Свій : СОУ х Ех ЖЕ КЕ о ш х Б ув о н Я м ж роде я М ж ще ок я х Ж х 5 БОСаКУ и ж сво в важ о, у Кн з я се М Тв : ск т ре ГО КЕРх о Б ЕД но кі вих Керн ку Ме ще же й ОБ тя Ба ке Ой Тк. Зх за ою я АК у я Ся в ОО Ми Ух Мей о хх Кр «а 1 БВ дея Ме Те ще БЖ ж ХХ со о ОНЯ й КУ КОК хх Саня Ночатковей. з г - х Е ЗЕ сову ще З хх З я М ЗВ звутерЕх Ж я " м Крові дев ВК ваененая кА КАВА
Тіг. х Явроюка бржниє рН - З Мав; меле анрк мас чвар х Хазосю зе: пани ши с. й змо ни звазак о НЕ. пише г Ек парку моя 3 хх на Що 4 КЛОН КНУ ЧК, 8 сх Ї ПОПИТІ : 7 мМ ок в ТИ ВОК схе : х ів о ТЯ де СЕН 2 «з жк. вих - щух З кате Ка М щі СКАЖУ ДО: Пак. вх п : З й ІЛЛІ, ї
О. (ріг. 6 їі 2 З 48 й Ж В 5 Ії 5 З я Б Би г. х с Мк у кух зей ! ДИНА ВАЗ же : сп в пилки Б : т Мізрваеі і еку янв и ання 4 де ех З Кота не рака цк ще ї Й хо созжку Ж КУ пе . ї « Жечжв жінки 0 вонімвені рнкачн. до 32 ТТ « ве ЯК, 0 КОВІ ке, УК А Я П тт у п звідси сек ско уки у гук туту же т Е «В ие поши Аня я Жочкя Віжшщхе КеКІвК Кан: реч ВЕК ТЯ Б ОК КВ КН х дтиз фо о НЯ НН С що КЕ ЖК х ТУЯ. й ОЖНО. СЕННЯ ТК От І АПВ НИЕ ПУ де КТ ВМ, жк вкуя чен ЗАТ З но н З Жоанотя ме ібажниї 15 щи пу КЕ ква кра «Пак ся ! Дврожка Зваак ОО : ' і Мізекяв мазекуз ярої мас
ВО. пиши : В Казку ук Зк зрнхних Б сі яй - : : шк ов ух ЗЕ бо ШИЯ, З Зїюз яв ее, в мА С пд з їі З ЕД и Ед ХЕ КОХ ще БЕ, ви А хе КЕН КК СОЯ к зросхущі фони (ВХ - іх пе 5 Гак він КР. али п 5 Бе, ваг. МВ в Те ре і ПЕТлЦЇ З пе п т Течка вів, З в ВЕК ви а з сво З МОНУ В 5 що Я ВАК. ВН Зх а жа в ЗЕ, ві ІМ ВЕР, ви вс, її «ик ТУДИ ШЕ ИН З АТ - ит ПТХ ; : че БРВ ВЕТО
Фіг. см М ви ІА НН КН Я ОК В КК о ни щ В с ш сс ЗНАЙ вх, з о. Во о сто ВК. фе ВК УААН я ку М ку кити І Чечка о ее БМ с З Ва ВО ЧК й до с ще В пу суку ВК ТТ ЖК тії ж Я адиніюю вили ях 0 Ббюнля З В МЕН . сю 0020 а шо В с. пе, ан 000 авто
З 5. квалі що М ОО ВУВАННЯ с мпруваеНх Ко ОО сс Ва М МЕ ОК пт М В п ВО В кеВ В докнюєксня и НС: З 3 нн о 0 ( ( Вщ шо ВАМ В В КК
Фіг. ЗД чВвввфвЕНЕНІ В чффффчфввв: В лляна Я ПОХЖКОНККХ МІХ С ОО ВК 5 я ОО Я ПВ .- Що Що ССЗ ПО тот, т
ЗО. З ОВК, І СО ок ХК ке В МО БЕХ МОХ санки В ММК ОО оредки 0 Же Задоку - ОНКО ЯКЕ г шк МАТ
В М. з ще М Х мосук уми к 22200 дедю ак В З ка шо - В ЗОБУ с нене Й . Мена ЗЕ т п келужую Мо ке 555 ШО ой ташн ЗВ х у щх ООККЕКК М еккчкунксик М ще Ко сві стветюх. ЗХ о усюмевих сх стру а ЕН ВОМ КК я ЗНМ що 55 ВАННЯ о Ва М ОО оовв ооо ой, г МОМ ММ ММ ! : п я ще : ОБ о ВОК ОК З о КК ОК ОО 0 КК З У с ЗУ МО ММ Я МЕМ СК ПК ВІККА и Кох ХХ
Фіг. ЗВ вом: ВЕ І її |і зо В «8 Кез вильншока В: М ВАТУ Зх
КВ . 1 ВОВК оси м НОЯ що М сті ско тури хи ДК ЕК В от се ох ж С я щу ЕХ. т ще КЗ ВІ ин ЗУ ієкидоенютткниюх «ВК схка я МК соскою кддорюєєюєєкккєкєєкюссєєєюі ИЙ ВОЗ ви ого ДЕ НЯ вождя г АН: КК Я злі авису В ЯННУ БНе Ядіно ВЕБ а Е ЖЕКів Кодшю в ки В ї Маса их ї шив го. Ж І З ТТ МИ ІМЕН З МяМЕНАИ 3 ЖИ ТІВ Ж ІВ х ПЛИТ : ит Е ї х ОС ї : : З ; ОК Кн хх ОВ В онко ее МН І І МО МКК ВЕ КМ ХК ММ ХО МХП КН КК КАМ МН ОХ М І КІ ЕХ В МКК ВИН КеКВ УМ КМ ПМЖ ТУТ ДООИХККК КВК КЕКВ ФО СПОЗММКЖЕИИИИЕНИХ у ЖЕД их Х ХМК КК КВК ПУ ММ х : З ТЕТУ х ВО ПУЖИМХ КОХ фуд ЖИТИ пропо ВК ПІТИШИИИЕШИ мл СКК 5 ЕК ОК КК ОВ ВАК М п ОК дод ВВ КО ОХ МНН КВК КН В ДК НИМИ МКК ВН Ве ВОК В ОК, ПФК КЕ ВИК ЖИЛИ В ОКО В МАВ ХДАК КК ВЕ ЕТ ЕЕ КОКО «дн ТК АК т що си В нн В шо В Є Ми о: ТОНКЕ Хохекумнм пикв Кене то ОХЛИМ МВИТК ил . у
Чит. о Кз я патжв У й - щи я ск те Діванька суфевннхим. ЗМ ЕКВКя Кз мя Ту тА нах но й сеечбх ще хх пеки вл зі ЦіЖвреежа СЕМ НІАЯ. ЖУКІВ КК Зіни ня Ї уже Камо БИМ ФР й ЩЕ Кон софе МЕ юю с Ї я Ки ї поля з ан я і Шок МЕТУ о : у Кр хай ; зд що Тл ФМ Ж т ке ї о ї Ку й Е - їх ї се ї х я кт у : Ех ї й «дн дк юю не уекк ртют у кр фнтюк фнкркфкнккннкюн о я ОЗ вв жи ЯЗ у 45 35 Ба я я 6 В Б ЯбКоз ВСЮ
Фіг. 10 у х мах ху жи с г ся сн ку ак ку 5 ЗУ «жуки зе іжаревжа себстжню,. хениентвація АТ вояж ухва в кісок сиву ви зе У діву -е ЖЕ НВсвКА СЖОСТВИМЯ, КОМУ Ва М ве вія зе Кентразьшнй Фужерю жк 4 і во ше ке дюни У ний дай ній щея щи о нд дк мит і донні ше ш і ян 5-5 вазі м Ше -коО З оса вух ее 3 ех ех вк 3 дк де що - в пев шк ей ев і ев їх де ки дя веж хх деки в ! оф ск он вве ї сої ЩО Ду реченню ре р ро рю фо рик рун КУ з ГАЗ Ух Х хх ху їх. з Я 4 ем 5 вв за 'єза НК дме
ФГ. с МВ т. ще х ЗО є ща ЕКОН ВО ОО о ее ЗД СВЙ - В о С КВК ХУ КК В С Ж КК паж тю А хни АК охквиинни дюн В сут и КЗ ГО ІТТ ма КК ПИВ КЕ Ж ме ОО УЖ Ж оку ско м МИХ М помах пу ВИМИ СКУ сю ММ Ж ко го нн меня . зму МН ме м ОО ма . ЗВ зврля КЕ оозооння ев НВ М вх о нн с о СО Х Є Х 5 555 ОМ М НН ша как МЕМ спи В ОТОЖ У КОВО КО ВК КО ВА со ВК ок ПН В о с є . о ПО ОВК ОКО є КЕКВ Ко о КК КК А и с Я АК ек кА сив
Фіг. 15
ЦИ Курорт КК кА АК А КАХ АК ККАЛ ХАЛАААА АКА АКА АААЛАЛА АЛ ТАЛА ТАТА тн МЕ М 5 ї З ї У 3 й су ; з ї - іо : га гуде х Ж же кв уже Н ре З і м МУ Зк Х ЗК ВН Н б дн БОМ х ! КЕ КеХ х х ї ВУ ОКО ї ку х ї т че ож де ї е Я ПЕ і яку я : -х ТЛ жк ї ї Е с ТЕ иа укл г і ї Ж СЯ я На і; ї І) ДІДД у осеютеккетаккоккоо окон ооо ня - ї ск МЛ х я х є ї у А і УНН МК ЕК гх ссккккю сскккжнк. и р ; ї т Е - 3 ія Е в. -Ж ї Ж ие суки Е - -Ж і вв ах У, ко ЗК ї Е лева ЧО я Е - КУ Оу й х т, вві Її са с Ж їх Ж й ї г 4 м х Ух Ж В МеВ М г бок, г т Ж м ї Х теж со х У Ж м - а дегегтт Кі КА ей ї Ж о Сн нн сухе ї м МАК Ко КСО ММео ооо ооо мое ооо ооо ооо ооо ооо ооо ои ооо ооо ооо ххх еооо осо ро оюююї її т. нн нн и я УЖЕ : х ї Е : У х ї : ї х КУ : ; шк дв я ї ї Ї х Я каву ї КЕ -Ї : па оз» У ж. вав ї 2 - ОО щ ВКа Ся : ї й гк дм ха Е юки М В х. п Е - ТЕХ і ї ї : м МК ї мажо ї с г : Ха З Тс вас 4 : кі ї ШК КЕ бом З : : з З 2 З ї в їх ї : й 5 ще ож ЖК ККУ АК УК ККУ КК ун 1 Кк ї з ВВ Дюк кутя іч хи Е Маю БК ох х Ко «Вжжжжжжетттткти юю юю ж кт Кит іконок Ж ЖЖежЖКІЖЖЖ ж Ж ЖЖ КК Кисті іконі ЖЖ ЖЖ ЖЖ ЖЖ іже ж жк ЖЖ Кот кіт но ж ж ж ж ж Ж ж ЖЖ о кт У Я 2 лляна т АТААААХАААААААААА у А ТАТА АААААААХААХАААА ДАХАААА ТТ А ТАТА АААХААХААХАААААХА ТАТА АААААААААХААЛААТААК, МАМО Ї х ї т З : х іоУ : їх хх ж ший х. ІЗ ж : З яУЕ у ри ; х я ву чих х КС, 1 касяжов Є лий ОВ я - й НЕ хЕ Кошжкоу к у Мч ї шо БАК : ;; Є ї м я - : ем їз ; ш з таз їі жк, г Ї ях з ча покжжн Ко Коля : ха пиши М я о Щ п КУ й : пи нн ан щ МпіІшкее : АК щі ТЕ хх. ревно кр у реф ор фр у р у вч рр р ут р р ек р фу тр ін в у в фр фр фр У зхоакох мол ХК Я схо дк мк Я век хх полу ли кож ОБЖ ЩІ КУ ІЕМ сі КИ хх ТЕ МЕЖ, ХУ Ух х ЗО БЩЕ 506 що БО ЩО 51 КЕН Я
Фіг.
жа НК А А КК КК А А А Я ЩЕ ї ща ТА ща т, є, ї у ї Х Ж хе зу ЖФУХХуУХеХе т д : ОЧОК чі УМЮЖНКУ - аж | х : х М пас й Маю і 5 ї во МАКАК, Я ПЧ ж ; її , Ще Ки ОМ г . 7 т : Я й Х клему, 2 ї Ше : ракета деяке дк ОО і тв й АААЛАХАХААХАНЧН ккд он ДАХИ ТК КК КК кю юю ї схе ОА пив і ЩІК ї ї ї є ї х шої а х ще ї « з і х ХО о ВЕЖ : Зх : вчи нки : щ : ИН У і т пік ї жу Я шк : МАК Мо ет як ї з ж : ве М я іш НК Я с їх : ш ; Ма ЕВ ща Я і Е я ой З : С : с я окрооллллччччюеечнчнаккнн нн і А ох ся є дну КК юю се для ТЛІжКья пессотееетевчкццкАКАКАХ АААКН КК нн КАМЮ т ще сеї МАЛА Я Ка І ДА 7 КУ й ї ще са В дасколоо г е І е : їх ще ее КОЖ, в ка : а й ВДЕ і х не ; що чав век о. бе ї-ч-. х : Паб, си й їх З хо У 7 й скддююй х т сок пон ооо нн 1 в до АААААААААХАААААХАААХАААК КК ХА КК КК КК них х Е
АК . ї я «А, ока нн ою юююююююююосскккюююююкх Кк ооооооооюююююююооссссккккхххююккк кокос екс хи КК АК УККАККККККК В пк ге це міх 3 іЯ жу ж х КА 3 ч т - я щих У ОС, і висищвх Кк я ! ца шо х - з ММК. : ОО х т УК х ; ях КВ ї х т ! Е й що «нм х 5 З З ч ї. ГУБ хх Ох і Бо Її ї з іч Я х шо ЖК хи Е є г 7 Я; «и ща тм й кклкці Її У з і а х є ве ЧИН ї з й ке . а сеть ААУ юю з З ДІ ВД ефе кн Кн ск ню Ко ооо мсчкжнно ї ! ьо ти я ч ОАКОМЯ у З чинної х фору у рр руку рух У я ме хх зт з ах 5 не ее 3 ох З ЩА А Бе ЩЕ ЗИ НЕК БА НЕ АК Хан: АННУ
«Чт. 14
КК АКА КК КК АХА кни хм. и. ож т, Ох кН С. і 2 Кф фу ун З ; ї ї : ї їі спр фахом ук ІК м КУ ї ка ЕК Тече ВЕК. й й В З Її х і й МЕ : х М м ша Х КЕ Х 8 У Ї х ПО ІЗ ї й ке її : 5 і в ага я Стр ож 5 Ж ВБІК рес сс у ефуекккеееессссстесесссскоо, ї х ща: НС нн ї Її хх зу кВ. Кт коло ш- що ї х З ї зе КЕ ЕІЖ з З ї в вх 1 МЕ щі БІ ЩІ ї ІА Е щоОМААКЕ хі ЖХевваиних ї д я ЩЕ АЕН ЄНЯ ї ОЇ дзай ї - ДИ | р Ж ї :
їх . : «За :
їх . : пай х Е ї ї я х Я З а он вою ух КК КК КК нку ку ну то осот ЯК роорюєдеоюо руту сорооосоре сорок со ооорооороо ор росродрооророукоросрсоророооророцртс кох с сей зх Ух Ра сок «ки. УЖ З жах да ох ж як квилевие КАААААААААААККАААК КАК КАК КАК КАК КАК АААААААААААААКАААААААККААККААК КАК КАК КК КК АХАААК АЛАНА КАК КАК КАК КК КК КК Аа КАК АКА ААККИ аа сут й ВУ Ї БЕ кот З : ЗХ з У т ДК У нм : Кі ; У Е х КО айва хг вжи н і зе Е 3 КО ах я, ВА місваів КН: : і ШЕ Е 7 х : : ї з иж ї 5 й я кЕї її 4 с нм ХЕ Я ЖЕ ВД іх ТЕ ше З І її ЕК Кс уд нн Е ї Ко й Ж ай Х ї з ее Хо сххкхКаи Кум : Мая х ; тк ща Що ї - ЗМ ї сковух че шо ж отих ї її Ов а 5. БО ск яех ях В З й з є І х 5 ех. х 5 аж і Жавлех Е ї і ї | ї : ад 5 ї Кк В. : ї х : їх х 3. І у ЖЖ їЕ : ї В х Ге і Х З : ї чи і міх п сік ї ЕЕ ІВ Трек мотором отеттт ні ЕХ ККУ ее кто Ху Ку ДК у КО о фо у у Кс у р у ду кі і лох ах ТЕ А ка кг кв 2 ТЕ чай ма -а ЩЕ ЯК БЮ Ще я ЩО Аваленя ріг. Я КО в се ОД Кв ПК ши ши 00000 В Дн я Ж Ве ЛИПИ КМИН ИН й Ж шт о п у ТІ РОТ П НИКИ Ин и ї и М Ки ТИПИ ПЕПИЛИ НИМИ ППП ПИЛКИ и ПИ Кол Пт я МУ Кв М ТЕ, Б З ЕК нти ве ВК ек. Кол КК пу Ще Ко ВО А ОК я ПК КК ПИВ МА ши В МКК, НК НН й ВПК о КМ КЕХ КВН, ПКУ МЕ КК УК КК Кк ПЕК СХ МК НО ОК МО МЕ Я о Ж МО ПАК Я ОВ КК ОО КО В Ко В ОО я ОК М ЕХО ОВ МЕ ОКО КК оо ВО пише. МЕ ВОК о. Ех МОМ ММ ЗХ З се юю сих е Е ле жо о о о о р НК КК х Я УНН ВВЕ х КК КК КК о ДК х Св В о и ТОМ В ОК НЕО Ме НН КК і ще а о ИН х КМИН КОМ Б. х
МІН. А АЖ ХЕПКЛМННИКИМВ ЕМО ЩЕ М ПИВ х КК и " ЩЕ ПЕН ЕП АЖ АК о В КА хх ШК ПЕВ КАК ДМК З АК Кв УК ВЖК ОККО КК х ШИ МКМ КУ т ПК «ИНШИХ ПЕК ЖЖ СК Ко еВ МКК Ж ОО А фОХИКИ НКИ МК М КЗ МЛМ Ка МТК ях ЕК ШИМИ ИН ВК МИА ИКО ШИМКО КВ В ОК МИКИТИН ЗЕ о ноя КЕ ПИШИ ММК я ОК, ПЕКИ КК ї Ви 7 МО В СЕК Ж о Х ОМ М К пикшиНт еВ З є ЗД или ЗМК КІВ В ско ИН Щи ШК УВИ пов КК дин МІ. и ДОК ЗДИРЖЛКД ТО ТОВ ; ВК я КЕ МЕ ХП АЛ МВ Е КО Я най ОСИКИ МКУ Ж шт В З Он ПО КОНЯ ШЕ ЖК ДЕ ТЕМ Мк В В ОО КК коса пен нд Кн МИ попе ни ДВ я МН ОХ М ПК ПТК ДТ Див Я я : ХК ВЕ ПМК ШНМ ЕЕ пн В ; М ОК В енВя Док В В х ОО КЕ ХХ МКК ПОД ПЕКИ КА и В хх и о о Во о ж в и ен ОМ СО Я ПЕД КВК и ; ЕЕ: Ме ке Хе У ЗОВ ЕХ БО М ІК КАК НК ДЕ КК х МУК ЕД ШІ Т ТИМИ КИМ ШИ КВ 3 ОО ОО можн ОН Св НВ в. ОО В СО КВК ПЕ ен Ки я В ОХ КО ОЕМ Ве ОН о ни ШК ПАНЕ ПЕН В ДУМ КОН ПЕОМ КК НН ЕКОН 000 КК КН КК КК КВ у БНО СЕ. У у ВО ПО в дО Я ДОНИНІ В ВОК Е ОО В В В А ОВ.
ЕЕ . ші я ВОК З ПК КАН ОК МЕ М Ж тий ММ КАК КН и и Кн и 0 МИ КК КК Е: ; ХВ хо ДО М СО ОКА : о КЕКВ ПІДКОВИ КК Ко ОО: я ОК ПИ щи ОН Я ШК МИ НКИ АВ 3 МОМ Я о НН о НЯ Х МНК НМ НЕ КК Кв КК а Я ; ЕХО ВИ ОН ЕММА ХЕ 3 Х НН Мен ; х ЕШЛІ я я КИ З т у хр, СЯ ох З гук тдузих сук. ЖК ско ДА Паповнвая неролі Її ДУсовкий зви: СНбраблені ЇХ виее; озерних Я мене ще З) ек Мем звів Сбреблені ТК ж озера Я щетнаенві вози З) мак Урі уки Ка еру в А ДВЗ хакі с збУ шк був вагекалевнако мае ВА ВЗ ви, Зх зпмМвоацеВеВ ти чі
Фіг. 19
ЖК нове ЩО ЗБ, вуж вагу кох КВ гака, ВН їх лк Її Ж Ж онкве хе : ват В Хо ож - і ж що ї щих Ж се | 1 КЕ ї и че Кс КИЙ ов Б і | деУз мав Х У ро Ге Зоя Мих «Жхх с де 11Ми ех КК ми УНК мех Ж я ї ше Е КУ т КО І ОВ Ко ж ОК хоя ї и 5 С УВК т, т их "пре давава Ех й ОКУ г Ко о КЕ У ХУ мо Не сх ння ЖК моз мі М Кк МУ КО еВ М СОУ па око Кок Ме КОВІ Ан КУ Кк ї КТ пк БОС В же КЕ НК Е КВУ В Ме В Ки ме Ен мк У еВ пІКІ БО я ОКХ 5 КО Ми КУ ТАН Мт КВ ПМ 0 Мих я ри Мих ох ї в ак ХНН ме КК Ми З МКУ Ме ОК її КК Же Кт ОЖХ Ко ОВН КУ КК ем КЕ що КУМ КР а СОУ КОВО БУ КК ЗЕ хо ок ТЕКУ скор жу хтж Юр ЗМО Зв о Я це о во ОБР пьЬБр "ех; я Бо ЯК ее веною сКлеН УКВ зураза ЗЕ свейівавичавнма ок ще ше .. ух. гук: к серп и МС с: сви вич и вмер ового Він ІОВ сс єфра речовина янекогя винне ЗАЯБЖ сх ви МЕсвж речове ЖЕ ях фу вхчеувиюеюв вуовхеЕ а евекия ВІВ
МЕМ. е прех зечаввя вен ніде ох
Фіг. 20 тини Кн ОН Ки ММА пДНЛИ КК Ин пи ЕК В о Ко м В шк МНК М ВК КИМ ПЕН ДИ ШК пи Ж ТИХ НН НК ЛЕВИ КК и ВШ А НИ КИ НК ПЕН КИМ КИ п у ПТ Ж ПИЖМА ВВ ННИИ К КОМИ КОІВ ПКОСПММДИМКИ КИ ЖК ТІ пИМолиОС т Ох ПОЕМИ ИЖ и М ПИ МИИ КИ ОКУ Кп , х пом ПИ ВИК То. о нн и НН ЕК киш и Жак Кт ВК пи Ж М и ПА и ЕЕ В ЕМ и КИ КК ЖИ т КО ок т ук КИТ МОВИВ УМА ТТШЕ УТ В ВОК в дані ті о Мо пошу. МЕ ВЕНИ МДЖ ІЙ ЗМК ливе ПИ ДАЙ СІ ТЕКИ МЕЕТИМИШИИНЕ ЕВ ОМ В ВУ и у Ж: МУ ПЕ Ех ТОШХНИ ФО КЕ Ж Ж п КОКО КО ЕХ НЕ. ке ВВ туш ТЕ ВЕ ОЕМ ВВ КТК МК Ст тт ШИ тт КПА КВК КН КИ КИ В Ен ОНИ ж ІЛ Пт ЖЖ и КЕДИ ВВ КИ КВ В о В ти в МВТ ВИКО ВО ой МИНА Поки и р вд п ЦИ пт КДД КК КМ т КОХ ІК Пн ЕВ о: ВКМ Ви т ШИК ОО плит ЩУП ШЕ ШЕ НЕК КВК к ДЕ Мер Вк шу Яд и в ШИШ ШОК ук ВВ а В ї ЕК в в ЕХ Вп ЛЕК ТЕ А А В: ОКО В кДж юр ПЕ СТ ОКА В ФЕН ЕК ПОТ мо ЛОЖКИ СВИНКИ В ОК КК КК М ти их Тори ие ит ОМЕЛИ НИКИ МЕДИ Мк ЕВ ткож З ох м кону ам іх МЕ ДЕ БЕзае вол цех Обрані Її ЕК нова кт їі Кк КК се. век вав их ле зірка каквккімху меру М ик кт арнннх зяє СМБр еобовивх ЯК мене: зржеоиючина: З вив ноненї нки ЗО закл вага геловного УВА А ОВО ме, Зх збіднення яіг. 21 ож са; а п. з ЇХ Навоввах зе ЩО ме ВВ кеш о ; : ГТК кре виуУ кеаавею му са ї ж хо де св че» х Ка ! Ге зерокт вдачя теловоге мех Е Її щ-- Е НИ УНН ї ї Її : ї 3 я ЗО: та М Кі. Ї щу МОМ ож ож Її ! н А ї ж ї ї дк ї АХ ЕЕ В в КВ щ Кона ї ї Ов тн АГ КЕ щ о Х Ж ї я їх ЖЕ 1 КК ЕВ ох Я ЛЕ тую - ї о, я 1- ОК: фейк їх ОО її З КК ВК її к- Б еВ я о МО М: АХ да КИ ВОЕЕ А М У оч хх : МКК ї- ЛИ о ИН ЗХ о КИМ НТ я КК КІ, х ї ть КК іо ттту ТАКЕ : ТЕЗ НК КОЖ Її Х ПиттХ її кн КУ отв ожноВ У Ех со пес БО ї Місце ЕВ ріг. 22 2 сажеджх сук с ккд ек Же кто ке мат ЕКЗ ЗКУ. ЗМ АЖ ЗХ Он МАК З З ї я ї їх З ї я : ї2 ї Е ж х Е зе ї Е 7: щ : - Ї Е х щої : Е Е Кз 1 З ї. Ж : Я: Б ї : М Е М ї я Її Б: ї що с . : Ук ї з г 8 : - КІ: Е Ї К ї щ ї : : Е - хе ї же ї о х ЕЕ: ! сх ї хе і -к Б: Ех а З З 1 У Х ох Ж Ох ке я си х Н Ж " хх ІК 5 ХО ХОЧ їх хр ЗУ с ее М й я ох Мт ух с АХ Є хі 5 ЕК: ке. і у М ЕК Ж Ж Сн ку с ж КЕ т Ж - ж МЕ К ї їі жи БО о й ї В т ТЕМ ЖК в Бо М ОК т БО щи ОРЗ МО Р ї т хи ХО вв гл ЕОРОР ОЇ ЕХ кої ІК в де Сх ї ше РО: В З : Й рек ефеті ва кено комер т меню рес фонів юс осерн КОЮ ТК Є ВО я ХК ВО Ок ВН С Й о а кб ох ий хол ково кі дл Ме хв
Фіг. 23
Я їх т КЕ ху г лк таж ев зв. м: ше жука оАеВ ще «ат АВ МЕ. заральне мекроювх ск - : Й : : : Е - Ст З Е що Я ї ' ря 1 к я : ї Е р І І Е ве : з За З ї вок я КН і Ї их 1 ї ї Жов : : -- ЗК їх Е -й ІМ Ї Е т : КЕ я ів то БО ї Ко ї : ї їх ї Її к ї т ою ож жа То її Я а ік В дк х Ба 1 ск. Б З Ж 7 ща ЩЕ шк ебБисе?, в Я І т ЕВ не т я ВЦВК зх " ВВА 0 'єраоВ ї Дрбереея попе ую КК оре си фер естроген р оон» оо о й й В ОМ. й Я Ай ук й сов АЙ У ТУ хо А Б Аа ьо Кк вк папера Же пращ
Фіг. 24 ЗКУ го сукні. сажі сег д схгз ні А ее. ЗБК ВАЕМ ВЕЖ За ЯК а и жук і ж шо ВА» яко ем г . х в А х 5 ож шо М Ї г сх рі ж В ж ох кК Б | ж й Б г ї Я Е . Кз ак з х . КО ЕЕ 1 М Я | ї Кз що ! ; х ' Я зав т : т щі Я НК У і Ме Тв г. я ЗЕ ї 5 ї - ККУ; жу : В ї і Ж Е де ї ще ка Е Ії й ІЧ що 1 ке і . Фі, ща З КУКСИ шк Бі шко Ї й МеУ В ОБО Ве ку вх хх х.. ЖЕ с Кох Ко Як з ЗИ Ж УМ ЕВ т я Бізе т я 2 й ж С я хі Х 5-3 В «Ж ДОВ середня Яке Кор одн кре содою.
х. с х Е ЕХ Кк г жо осйтх. Кк, ж. й г 5 сто ож кох в вк ква ом е іа Зв жива фіг 25 і Звзз вне. заселена неКкВОНех ДЕ ЖК : У сер ШЕ 3 Ї і А - 3 см А - 1 ВК ! - ск, : : х хе ї : ї ТЕЖ лк : : 5 с їй ї : ЕД о ва ! ще ; - ВВ ЩЕ Бо ї ї ї 3 3 Ж око : 3 1 Б : : КОЖ У жк ї хе : ї ї с аваях ї : І , «й У ї : хі ЖІ Ж - ще сі ; я ї ШО та «0 ЩО їх ЕН ТЕ т Ж Її Боб ем КИ ч Щи с : й | ма в жан Я ек пох ж, шо я ї КОЗА ям МВ ще ТЯ КО з и ї хе ще вт Ї КО Ж ж в І Б - ОМ и В ЯК шви 1 во ОН щи 5 ви МІЯ ЕМ ЯМ ше в ВНІ ї СОБІ З "Ба 7 ж Ку е х її ве я - : у 7 в Дод утту в ет реюртвх песфутефетотхуттт р того репо рооо о д д НК т оерокрттеттрях шо жу - й ще й й Б ЖЖ ОА ОВО Ж Ат А Ж са хе зе ПУ Моз У Бу мекв ак ко ка и ва
Янг. йо
ЩЕ. Зоя реа зхвие В ЗК ЕХ еВ теку чня ЗКУ я т їх М имя З щ ще Жах зх ше М Б Я се х ре ї . х х . т ; БУ ї ТК ї ле ; ще 3 ож КК : М . ше МК ка З ОЇ 53 і вах я Ж ду ща і Кк є Я з К-Я М КО я У зх г з 5 ох як й ї В Я ; щі За я и шнНю М Хе Ко як ВО Б Я У ОК М ях В Ії ЩЕ с: ЯМ ва о ші у : Б У во ВХ ВО У ще х ї МОЯ Е Ге ОО хв - БЕ о Ко ; ро ї і Ки в - х " я я мк В БЯЇ Бак ї щи Те КУ і Що ВС, Ме ї Б І кв и її й ех о оф Зх кл во кроках чакр КК аа фра 8 х що Ж 5 У ЖЕ «жу ко К ов 5 г б сь ку у В хх Мо ка ки о о і по Я аж ху Можж Я зщеакя се
Фіг. 2ї
М фізнуовнниа, Хек Е кеВ козх і і : і і Ї Ї Ї Ї і як Е гу ї - ї о ї ї я Е : кі я щ і їх КУ ск 8 ї. хе с ї ще Ве ї З о . ТЯ ох . .
ж ї. я с Тр ж і хе як як КЕ - че їй На за З о хв Мо г КУ Е ОЖУ Ми з ВИ МК ри М ж Ж що ЖЖ Ж 5 Ма Те : ще о хо : Я й т ЕХ хе ї не КУ МЕЖ хо | ов З ЩІ за ж І КМ в ЕК ож За 1 - В їх ї ох ж ге З РАБИ З ех І ще . : і Кок Ка КЗ з -Х. З : ЕЕ І. р ї ї пи ї ! : а «Коритееююнх песен оферти Ї ефек фот фетр фест и вна як Я, ж 5 3 5 М б У ой г у В ой СЯ х3 дб З Мов в кв в ко і ре я
Фіг. ей « ! тіж Я Ж Ж. ЗЦВЕОККЕ ХК ЄЮЧНХВ рек; 1 : : зв : То : мо І В З я ля З ХЕ М з ОО - ; -
В. : ї хх : 0 х Е ж з ЕК - І я ї : - ж х о «же ке ї хе у а і Ж : що ї о : ж Я ШЕ і с о че ? ; Е хи ЩЕ В а о ху. ха ї Е Ще х а ме КА МИ" сх зб З ГУ, : ї до МУ Їж т Я 3 -Х Ж ОК КК я з ШО щ- 3 ; о я КВ Я обох Ух Її М му : ці: ОКХ я
ВИ. ОО з МА К Ме ЩЕ ЖЕ и т ме Б Ех ВЕ ше КК КИ НК х Ж ! т де Кк Ж Її 3 х ЕЕ З пе юр я Боже МУ Кк Ех щої 3 1 р 5 Що ТІ Ж й З Б ма ЦИ МК жк КЕ Її х З : Пе ОК ої 1 МО г У ї ії ШЕ: мо : м Ж Я ох Ко х Ж 1 у 1 Ж 5 ї ДУМОК фе су В х ще оефеетрутоднря Кренпуфетртя т ро їх їн й, Я М дю Фо тей М А ШО М шко ж М їх. Ж. Ой «ьо 5 ОА В как ЖЕ хе ді ЕК ЕК «Ах «В ка те то то - г З реа
ФГ. 29 жах Ма Б ме, кре тен разкНе см Ще ' ! т Те і і КЕ Е ни: : ї ї ї Ії КУ М ї ; і Мак І Ж каску : ї : м ї І ши з Км: їх : ЗК В : ж Ж ї з т Я Ж -- Я чо 7 А ї о : ОТ ї - і Тр уже ї ся ї сх -Е МУ ї і ж СБ В ж в ї ОЖЕх З - Я дез ко м і і Н. хх ї мое х о Кн я ; я. Х М ї З 1 Ж о З я : о 1 В ЗИ ще і о Х о Ух КК ї о Я З М яко ВВ Б о їх т БК за Я Кох що й Б ХУ сх о Ії ж а т Бе Ок ї ск що Ко ї М ве МК МК З Я як Кк Ки: дента В ва хе ВК х ех КЗ : Ух г; вх ва і ; ї є КЗ дя Б що КО АК НЯ с: Я ЗКУвУ ладимх Вк: перуть руку 3 х КОЮ ко я ой як й Я В. шк КО й М АВК Ж НЕ НК й Кк ох в ьо ік в КВ р но Ж вра г. 0 ЖЖ ск Ж С коре дкру порою ре юну КК щу в кукі вика аз бл вк. КЕКВ КСВ ДК ММ ятки « х 7 Ех 1 ; аж х ; ж : ; . 3 1 МОЯ і ОО ! хе 3 1 це ї 7 х 1 вк З ї 5 і «й 3 х 3 1 т З х . х З х М ї ї 3 Ж В т З о ї Ж Е ; зх й ї КК юн ЗШ м яз їж ж зх т з її ВМ ж КБ я мох ЗХ я ж їх з ї БОБИ Я их с С КВ жу Я з У ж ж У х КУ ех СЯ З хх Жана кі В п Я Зх ОКУ Ж ОО З КУЖ А МАКИ її Ба хх - шия ти ши СИ ІЗ «БУМ ор ев В КУ зерна нер КМ ні ВАМ чав в
Ж й. 6 5 ж у М В ик і Кеті вив ши ше и и ох со ЖЕ вуооя
Фиг.
Трава Х -е ДУ ша дехжму те - Мо ї-ї С амкй ОЗ Ї Б ям со жим : БУ НК ' : Ж і КЕ: х Ж дк с Її ех 7 Ен ей ге ок Мо Ся М зу їх ще кі СУ - Кей КЕ Б; АЙ ді - 5 хх Тена Кукада ЗА аа «ет ВМТ сит, у ЕІ КЗ Сава Ж Ї сом Ж : ВК ско феї КО т т Т х ї ї : ті що Е жі Ї І і ям Б «вій їх х 88 Я І поем КВ : т Її но : Р ТЕ ж ї ї ї ї жо с ті і щ : З т зо ї : ПИ я РІВ 13 1 7 Я я зх хх соя в ек я що я - ох Є » я Би: хе дтзучвумх я о ЕТ ОК ЕЕ Самий да Ж й 8 лев хо у : їз : Х жа : ОБЖ в ! де й 3 ж КЕ | і Се : Її т : - и Др еннкучттттотооуесеоесес КК ВН нт як: "м й : я Ка а не щі ва як Ще хо ей а ям й сш Гухв з
Фіг. 32
Прада З Ед х 1 Ярова 7 1 РОК лак ОМ як. вх ї й 7 х ї пулу . 8 щюх В Самеж зе : С скной х ї кА т Е Ії : ш ВИ У Я Савжи ТЗ дол Її и т яеЯ є з Р з ; Х ее МК с ї : ї ж : ї я : т Ї ті РІ Б їх х : х : : КИ ві т ; іа х їж 3 с Я я ЯМ ї т 4 Її «ою ох 3 І і фо Т І помян ХВ І МК і же В пи З х КК «Ж "Ж, З Ах 5 3 : 55 зе анна ЯК з ІІ З ік 3155 В І х с. к З я Е «ЖЕ « ка КУЩ к ее ШИ ЩІ І Я я ще и Ме же я мя щу С Я х ; о я 5 ди ой МК Ж а В о «Ве КЕ НИ 7 й в Круш ВК. Є у ши и Я Твувчи ЗЕ З Пнаба 23 я КАК Кк п х іс жк ї З КЗ Її Ер ЖЕ Х БУ тих ШЕ : і в: шалі Се ; - Вк ЩО Савже ше ні Сонця Її ОМ ОК Кос г ї я Ї - ММ Я С звик к в ява ; 5 жи й ЖОЗММІ і щ - 51 «ож Е Ж і ж В м ЖИ «хі ОО я ЩЕ: я т 1 жооздікВії 5 ЩеВІВ жав І їй От засів в ШЕ Ка За КВ КИ х ЛЕ і ІБ й («ех Кк Н пал лу. Я. ї ІК ТЕ в й хе я и Ще Є МДЖ. ЕК. МК. са и т ще ки КК Й й ОО « «ЕЕ ЩЕ Ще ще «и а Гах а ЩЕ мишей ше ей Груве Се аь ! ТЕреайз За Я ке г ї и о га ово Ї Самці і щ М 2 ї ШЕ б ляхи : - ї Едді Ї я ВН й з ! я Ще ї М х ї 5 ще з їж же т ТБ то Кх 3 їж 53 и КЕ Й оААнНМ В КЗ ще - АК ще де сх ваш а ох о ши жа ж о я де Ж ще Ом Кс У чу я КІ Гохих
Фіг. 3
КПоей З Про М ЩО ци. . я ше « ше НО ! я і Пе ЄМ я ВН г Сьці іш ве ї М оНЕЙ нн ій Сава шк Стеки т ГК вда. ОМ Сл п е в. щу Ж . ї БЕ Кз ї Гах І г : ї ТІ Кк що ті БК Б В я в і і З я ПЕ, ее КК ЖЕ й х ще Я о ТК 15 Сх ТЗ тіж ще МЕР Вк се БІО Б х ЯТЬ т є її ее шо Е ; ПП г І В і й | а МВВ ПК ото вК : за. В хеой. ; ї Є ж ж ее ск х - ж а оя як КУ г Ж" Як Ух Кз ке ще дк ще А а и Ко ж о а в ов ай а «жк, С « ХЕ х ох я щк МО а зу ВК ен кА | й | ква КЗ Гвудя ща де Гвжжя «У ке ОКО, я ке да х с «й ою я Мровба М Лреада ща ста ШК і ве ее Фе Ж алі . г ; І Ст 7 хе | ссссе І в С зму о з пам ї жк зу т: хі з їх т СІ В БК ВЕ т БІБ ГІ - : СІ ше БЕ М па т ох хх Ж шк З БЕЖ т я « 13 ЕЕ І ШИ ши ще х ї г хо 1 З де скін нн с Кри соки ї о з ї ї. Я и тр х . . - В ДВ В й ВАК. ех м й е а | « У : З Кя Я Як «де ВЕ ; з НИЩЕея ОЗ й яку Мо щь Я Мо як ох щх З ЦО 5 С че Же а ох а ОО я Ж еулуєи ва ХК шк в МО груди вх ша ріг. Зі
Жоонскрев віх ховхоуу» В зів лати мах ДУ узнати ВІ. ОО хат товінана ї т г тяжкий ок ух Маки ку с , ї З гака вужа меча М Тов кова нечиквнаа ї і ск в соя аква се, У 5. су Я 1 г хунок иуинаАхххх ФК ВВ Побока кір дезанихх . Мах і Я Гові "ке ойкавечникна Ж -я КВ Повх ї С Ї жд СО ееруня В ОМ Е - ЩЕ ШЕ ші ї Же хо і М. ТТ х : пе ж Ж в ху вал КОР ХУ чо на В В 1 бі В 5 іа і вік ЕН ВК т ад всьо В ж ОЗ Я Уві а ВЕ ап З о ОМ кН р ЕВ в ВО у ПІ Ох св жк В ж Не х ст й ЗЕ ІБК о. ВХ ам ЩІ ж ВЧ у в що це Я ї о - ї 1 І ЕЕ Зоо З ооо В : КБ п в є Др жк дя лою, бок Ву яп око ШЕ щ- й аж. КО Мк ть р ХК ВБУках т паца кКае Ве Як вва З прав Деза 1. мк. Зв ВОЛНЕХНВВХ МХазж мк: Зк важаткяння "З Гекбнкх кн венах що ММ ПЗ Е п КК Тл х 1 Ж : ї ск . х о вая ї й Ше - КОХ Кевк ки В кух ве чай «ек АК Ж че КА їх: кі ї ї м УК їх ВО Гхебакв сука декана ще п ї х ж 1 їх Ще ціх ж ї її Е и: ж лож 11 1 1 В в мовУкї СІ ЕНН Ку чі ОВ Же як Ел ОХ Тож щ З ж Я Ж В ва ооо І Еш ке ДОК ях : ах що : о ів 33 с шк, м : й ОХ : ж, (І І п якко ї ЖК Х т Ж в Ян вс ЕВ екв не п Акофкьк в вке Я павем «МЕ ка еЕН Леза Б мо. аа ну хнаВ. соки з ВЖК: КЕ. Во з ща я Я ті Я ХЕ БАСУКА ВМЕХ ВАЖКИМ: т- КОХ З х КЕ хх - я Що В Я ї а в Ж т Мф іахбокх фо ухтях о пух : 3 я З : пек яр Е т Мі В 0 бб'нювіва м . 7 їх х Ка я дію ва ВІ нн нн вро ВМ ЇМ ва М ВК ДК ДЗ ту ен ме ках КВ МУ Ж крови , ЖЕ а
Фіг. За ї а ї У Ко К Хе ЗЮЖЕ: ЗУ Ме В КЗОВ дае : шк СЕ ж іх й сила! ті х ШЕ «Вк Напоевевних «-е ЗК т АК І спе ЯМИ ї ї й жі 1 є Є : І Кк т ЗЕ «ДУ. ВК тен ВИКО Ж ЕЕ ДРУ х : їі У Же 7 7 ха Горять. Р. хк ЗЕ 1 т КО ОТ. ах КЕ ж БО ЖОР 1 Ж ї ї "7 ї 2-х з я жеери рот ї ше Б «ж З Ж важ: ПИ КК В НКУ НИЯ УЖ у ! ї Кг ж Е : ' х - 1 шкоди з ї Божо як о Ж же а : ' 1 Кк НЯ ей Ж и пнту че Я БИ му. ВЕНУ К ТКУ ВІК НЖ і Ї с и дю С ; М - ї ї й ДЕ МО вх В в зе В Я В ВВ В Я Ж Ж Я Б БО о зви ККЕАК ВК УА пе Зах з. і я Ж вижрьтії умунк у, СДММКМХ У сн ВУХ УКХ -е ЗЖКВХ її о КЕКВ ВЕ Е р т «Вр» Брак кнув МУКУ КЕКВ ДАК ск Е 31 се ХЕ я -оошо В ї «ве БЖ щу хх і о ж Яд. Я МКК. ТЕМРЯВІ вок ти в ЯКА не им Те і со шОАМІ чую К. не ВДЕ г : в Да я ши й . Х ро а Ж ее зак ОО ЩА му. фрезу тео рот я і в з Ол й | пи е не Кб ВЕ Драйв Шк шк «йо І лк щак. Мена х тов резуни Зри (ріг. 35 аа схжу і ї ЩО «в ї ї ж ї І Ж а З ща Б Кк Я а у о я М У ЯМ Ж зв «5 я.
т я. щу КЕ А ее Я ох я я й Ж ни я що -й Я М т ак КУ - КЕ кт о 5 я «і БК Ку як а и Е я Я ще КК ж ее: ДН КО с у су З «й м а У -? - ШК ву Не й Гвтша Заз
Фіг. З бе 458 Звіз Я т в я свй, МЕНЕ свв ЕЕ що КЕШ, ДеООМеН о тн Ве ІН не с М и и а в Я Ве ни з НН ПЕ в М и Ш ШИПИТИВе СИНИ ШИ ШИ ЗИ ЛИ ШИМИ ИН ЖИ их. ППД МУК ПТ, ШИШ т Мій ЗО ПЕН т ОН т т ДМ Жид и пе ПДМ пи МК ИШЕИТИН ОСЛЕДЕВИВ З ТЕІТ ОТ ИДИЕЕИЖКТ КК Сов ПЕ ПЕКТИ КИ, ЕТ ДНи Ше НЯ ою ПЛИНИ З: ПЕКИ пор Ен ПИЛИ МИМО МЕ НИ я и В ИН п ОВ М НИ ПЕН в КН Кв ИН ПЕШИШІТИ ТК К ри МЕ ПЕВ ТЕ ПЕКИ ПИХКДКИ КИТ ПИШИФИ ПИТИ ШИНИ ИИНИИ СПИНИ НИКИ КИ ПИТ МВМИИ ПИ ИИМНИМ СИМ ИН ПЕВНЕ ПДК в ЗШ ОТІЕИШТИ ЧТ КУВИИХ ОРЕ КН ТИ : Й ЕЕ ВКХхаууенви Жак ВУ ван кре СУКИ і. жакортнхааюна БЕ
З. Пееухенмхна зак нання. Ж зв лненуюче білих рюечамазвах З М уаковтнК ж КЕ голку мімохчмкмопмков їм
Фіг.
шк НН З І фе Ся і: бут їз с ПОМ зи І й сити Я ТАТІ НЕ ЕТ, т ВЕН ИЙ т ПОПИ и ТИКИ ов т ; КЕДИ, ши ИН вх «оо нь ен а НН п ПЕВ Кн Б ЕЛЕН КАМИ КД ту зшЕ о ПДМ М ВЕ п Ш а в нн я г сек я її. ЗаДНИНИЗВИНИ СТИЖШИЛЕИИНи ииюИ ТІ КИК ПИИ ЗУ І В ИНИК ЛИШ ЗМО МЖК ДИТ нн ПЕКІН ЕННУНиИ КІ КЕКВ КК ШТ ТМ МИКВЖ У піш Дині ОКОМ ШИ о о ПН ди ВДАІ п п пн вен а НН В 3 в тиша в ПЛЕД ту? ДЕК ж я КЕКВ пи ТЕО Я Ват І ї НОВ в Я ПЕ т пі ЕН не Ен кн пня у КК КАК іс: Підп знизу вмчнх спе
З. Велозиет я жів КЕ кавою КУМ УК ую. ВВ дн; ота.
З. Бихувниви Бакун а б. Кееурінння капсули вегуаує яЩВа
З. зве інв зе аена
Я. Кеажнваснот: Фісхо речових зом
З. Шк вра ЯКЕ Мібожеек тв Кене димова я везе ері ме
Фіг. З
62-133 »962 Її шо с) ше пи я и пен сен ен ше А сити а ва о 6 пов 0 і СЕ 0 СИМ ПОТ вжи І КЕ ел нии ше 5 А п МЕНА ТЕМНЕ ТОМИ МЕ ПЕ Жана ї ЛЕМКІВ НК 0 сен В І шу ши шо. пев . М и ЖИМУ ПОТІШИТИ ТИЖ Ки ТИЛ ТОЕИМИКИ Чон зано г ве по Що ша ПН І їхш ТЕ ідиано» вватовчанвх сгруювтю:
КЕ. Клзивенв сквів рани.
ЕХ. К ленфююв єр реукеюен Ж Ж ох віник ЄВ ума вва, онуржье у нек кава і МЕ ЮК Нива гани яю.
ДЯ. КТ Бокова Бе вчемв нов ЖУКОВ. «ОМ КІМ ВУЗ: Ва У ЖЖВІМЕ В Дн дирежетя
Фіг. 40 до-133 Зв їв ж 305 в: и Не я ше свв жі В и КК дО КОМИ лов ОЗ рію ем я пох ше ДЕШИх о 5 А З ТЕНТ КК КЕ, ПИМИКТИЩНОМех ЕП лин ВК ДК ШКО нт КТ ЛИШО да и в а а и ННЯ подо ННЯ и мне и ОО НВ Ше я Би ше он ву
ДН. ДИТ МНВК ПП ЛО т Ки ЖІ Кк Я ПЛМЛЮШШИ Тиша МВ де пов дв в й и НЕ пн ШЕ їй в бю о о А НН С, їх ш . пн ов й шо дн ан УТ ПИЛИ 7 БИТИ си п ПОЛМИРИт й и иа Ж ЛК пути, ВИПИШИ СУ ОК Кв р ІК ПК ПИТ ТИ ТУТ ЕК МЕТ ше ШТ" ПЛИТИ ПИ МоТООЛи Мо, и І ВЕ ВКМ, Питні ПАК Ж В ро ВИКО - шу ВАК ЗИМ дл при я (8) пд ПООЖЕ шій лише у іїхм Я урузнеях зав аних екв
5. Мізвлюмете хво Гек ке кв кет Е м знаки: МО ден Юа
Зк. Клифіевея упхеестнекова в Бісже знову еня
7. Клвибека св знечахняа
ЕН. СЕ зна вва: зе овха.
ЯМУ. ПЕ ев ек з ДК КВН. КАН КВК ОКБЕННК З Підвівквия Бек вечеря ЗА Крхежажих
Фіг. З сит ОНИ 0 ХМК ПРП ви МЕН НО шрнн в С ВЕ ня пи ше нт ЕТ ТЕН и о о ЗЕМ ов, и ВЕК В Ба нн и Ши в НН на со неви ик о ово о ШИК РЕ ПИШЕ МЕН и Ж и пол у Кона ет сив т и пох ай НВ в ІШЛИ МШЕИЮ ВИДУ ШИММИИ 1 ІД ПИЩИК ТИПИ ПМ ж Мол ЖИДИИ КОМИ, ПЕК не їх МЕ пое а й пед, ДИНЯ ЕХ вв ВОК ПК пики но с м ПО ФЕН то ни 0 ДО шани ово ВН БО шк НН не НН. Он НН НН а МОНВЕМ Іти ТУ ЗЕ ПЛАН пи ДМЕ лише СЕ Ж ШИТИ о нн о НИ З в и НИ НИ ПДК Кв у ПТН и г ИН ин, ши нн МИТ Мини: . МВВ СНИ І ІМЕННИКИ САНИ КІН ВК ОВЕН КЕН Мине ОВЕН ВВ ПЕ Ве ло ВО п а НН НЯ її /! шин ни нена и 7 ШІ ІМТ Кх Б реа І ко ЗМХДУДМИТИ МО Її ве Піно зате юнах керуєте в 32, Ббозо ка міле а о : КІ Й и. Я зовн на речення
Фіг. 4 й я Зв В зи З В В ЕВ Ба ж 14 сонне ни о в ПЕН Кв шо СЕК а щи ов о ЕВ о ДНК ЩЕ МИ ПДМ ПІДЕ В ЕК ПЕК МЕ а ши ше Ковпак п АЛ ОД НВ ші б Б ня ДЕ ПЕНІ ПАНЕ ПИ ом ОК ПО шов пн с Да в В шині МУ ВЕ ЗНДИНК ин ТИКИ МИХЖ МИ ТИИИщИ ма Пк ТИЙ ПИМИМе ИЖИ ИИМ ПИЙ ЗИ, ПИШЕ т ОСЕНІ ШЕМИ ЕХ пи я В, СИШІЛМЕМАИ ПИБИНИНІ ПИВ ЛИМИКе ПОКИ ПЛИНИ по т пуд п пи ни ее ВВ Ко» гО. ОУЕН ВНУ ВА ЕЕОМ ОНКО НВ пп 0 Кл и СлИЩ Фк тЕв ЕЕ ще ж о же поз ОО нн п и о НИ Ес ЛО па і я га Я ПОЖНЕШ семи КК шк МКК а п пи пі м М ще М овия : пд ЯК я Топ пе до ех п СЕ ВВ ще Ж ВЗ ох сх ДИШТО ПШИЕМУ МЕ Ку ПЕЖО Ж дя З ЖЖ и т ПК і ї ЖК ТИ п дих на їсм КЕудхавиезх звонок етвук хв: ХА Зрджівкава випа песен. пет вже
2. Дкілюа речееенеа мапзееккто теж дае; ЗУ не ЗМК
Фіг. 43 ох Ж ле Мура Я ня Врайз я ФМ С я ї ку ях од жк; чд ї й ВМО З сах : Ж ж з т Кі ш ях ї - їх їх І - : мо кжимкмх оооооюююююююкй ше Пн в НН р ОХ ква ля ЕУКОК ххх ння ник ннннккккх Нркнечвкввовь їж МЕ іа ме Кракова ій ме 15жнх Яазх Яаза
Фіг. ЯчА
Фіг. ЗАВ
Права А ! Крат їх од -я Же жу їх
!
т. ЯК ж 7 : во шк як Й ! КЕ 13 «а і пе м ї ме ЖЕО м ОК я ов ; х х ОТ ; ОВ чух ші : МОХ Ж к й ї іх оккркю КЕ з 5 Ж вд ях КЕ ММК тт ПИИ6 ТИХО СИХ ХЕ спіжснсжоя скік, УК. п с і» У їх сх У Ї ї п сей ; окосекмююссоосссофоессоюскин ооо соросссооссссссх Мотнихнавая З у Маму сх ВА гак учуввввьея і5 му іБдхк МЕ Доза Який
Фіг. 44С Фіг. 40 ре В «м - З Бра З мап хесороюсе ах ЖАТК : ! т- і ; т пив : яд акт. я Ян я Ко хо Же : Е кої я У рові КУ і щ- ди дн к І к Мей З ш ям З не ш 4 Я ся Я у я 0 В 1 Кох ок м ї лк я о, хх К м ; а Ж Ї З ; іХ Х ж дя чай - | У М ; кн ООБАТІ Мн Я ї М ; І ї Ї . МО ше Е ППМХМ ШЕ Я ААУ ; с ща ко . ЦД века ркннн ее ПУЕ оооннеснтотттеттрнностеннннсь м З м задання . ши щи о, ї Хо и Напевннная її ЗВ. вх ков Дячи Браквровнака ах БМ ів мух ріг. 41Е Дози тіг.44Е Мвроба ЯЗ з вх вн - ююосюросоє З внюжа дізя резон ту ї ТА як ше ; ж оч схо я ї - ВДВ» БО її шх ї ОО сх жук ух у як : КЕ що ї НИК м ї х : ви х І - ї их є. Ех сим щ Ї Ми Ж ї ВО 0 БВ Я зд Ме "В ; . с - і МИ Е і о. М «5 Да Ки - щі 51 ї ТИ ж Ї КОМ МЕККА я КЕ ї о й пово 7 ї ОО КИНЕ ї Є Ал в у с, ! сн Дроденісоотівчувтвоткіопіоввотввкорнююттввккювоккгвотіувскчнтотня Й янв сотррстесвнтнь "п ВІН пін ки Збазенкння ик іх МЕ ї8За ме « Фіг. 45А яка
Фіг. 44
Глнбожа же вич вини ЕЕ хр
Ех . х мк З що Ж мх Ж Ук двукУю я ак зд о х ке КЕ х . ях ї ря Ж же ї ж. ик Я с «ЗВУКИ Сх ее ПО Ве х КК ОО. КУ ч УК: ОМ ОО - ї Х ОВО Я МОМ Ме т ї о ХО ОККО її КК М ОКХ ОХ. х с ХК Пе т шо ЕЕ НН Ероокннннсннкко нн нн нн У ке ту і пах сухе ж вх ку г ЩЕ шви т Як
Фіг. 458 іх 45 жк секр А ЕЕ хе. вон Ф їх СИ а ж х жк ж «к ЖК чя 2 с. с Кк ЗК я с о КЕ ; і ЕЙ щх 5 Кола у КА: ЩЕ 5 х
Ж . їх не В ша х кв . . ще ЗХ ок, ях КУ ж: ВК С я З Ко ЖК ае ЩЕ КК ОК Я МЕ «ВВ сна вин Кк ви Зо Ме ЗЕ еконо кни. ХУХКи В КВК ВВ МКК Ку по У шк МН КВ о Нр янимна дом КЕ їх о. п іа неї СЕ Ж 7 о ЕК хх КК КК КК КЕ Кт ШИХ зак ЕВ о іо ви Кн Я йо У М М М М М В ке МЕККА ЕК КИ КАК А ЕК КК ЕК м ва п шо МАК М М І М А М Я - ЕК 7 ШМК ПОКИ ЛЕ КК й ПЕ Я т 7 ЛКК ИН К КК КМ А КК КК МАМ МККИ : Б 5 І до ВЕ ПО ПО КК КК пе ОО С т 5 і ОО КО КО В ОО КМ ЖК Кв МКК МКК КК А КК КК КК КК ще Ен ех и х ТАКЕ ук я ЗУ й. 5 5 жу Я бо 5 Я у ж о Ж и НУ и і «Кр а ВН вра ТЕБЕ СЯ БВ В пон пед Якіг. А
В М р пет скк» ФВ. тіж» ях ссннн іх ВКЖЕ МК ря дж, пах хек ток; ЗКу» У хи т ах же їх док 35 мк жи . і щі. Її. шЩ. її ОН Гой х же Як Я Ве ж» ХК Ко МОУ І КЕ І жк ВКОООІК 3 УКЯ КВ І 0 Ме ЩЕ З Мо . 1 Ж КК ЕХ Ку ХУ В ДЗ У КУ КК ККЗ Е ва в Ж ТЕН ОК КА з ем: хз КЕ ВІК МОЗ З ЕВ Ме З ЗК ЗК У ЗК КЕ : ші Ж ІБ ЗЕ з ее ЗК КУ Я 35-55 хх Х, В Ж З їх Е ККЗ 53 КО ВК 3 як ЕЕ. ОО а - ВЗ І В МІН М СВ З я її КН Б, . М В ОК МКК Кі ; см групи демозє их митці Бо Ох В ККУ 5 СО МК ВО «55 М Берацвемтиеня Мне не: КУН ун Б мер, МЕЗа Борех хо т Вк Ж ке ж ще КВ ОВ Ох ж КО хх о ож, КК . М КО ВК КК КВ ко Ки руна І зррагженан кан (Віг. 468 652-133 з7во а» Б лвбока ля речення нт ЕН ня то тан нг ЕХ ше во и Пен ПЕН Вон кВ КВ КЕЕКЯ, ПЕНІ М КТ Ин НН и НН и а и в В ЕНН нн нн нн о Я в Я Б в а
С. ми 0000 ще 00 Он МЕИИИИИНИИМ ШИ ИН ЕІПИШИ ПИ ПІДПИС, ІМК по бак Шо Со Ж ки МК НЯ ЗЕ я п ш ОН ЗЕ ОЕККЕВЯ шо Її єм зт я-тя
Чиг. ТА
ВОК Ко Ко коки ФРОММ Кок МКК Ки МК КОМИ Я ПК ВО ОВ ОВК З п о с ЩЕ 3 с ПИ Кн в ОХ С ОК ОК НКИ У В а ПЕК ХОМ АЖ М я 5 КЕ ОК о ОО МК вищ ПИВ Пи КВ КК ВН я В ДИВ МЕ о Ек ШОК о У НН о ПОХООККК ее с ХХ ЩО З ОО ПМЖ ТІК ПАХ КПУ МК ІК КОКОН в Я о и ЕМ ОК о Мо ПИШНИМ ОН ПМЖ МК ЗО Кок в ПИКА ВИМ КК оо Пе ДОВ в В не КОКОН АК в В х ПЕН ЩЕ ИИЕЕКИО, ОБ п БЕКОНОМ КК ПЕН ОВО ШЕ вв ХМ МЕМ КК НЕ пе І НН що и. Я Ов о ММ ШКО ОО де ДЕ - З ОК КК КВ ПОКИ КВК КЕ ХО ПИВ М Я І ОА, ОККО нн п В о ВН ПОМ КОХ ОО В Я КЕДИ В п ПЕ по с о ШЕ ИН и ПОМ В КАК СУОКОВО ОК я но ЕЕ о і А и пеня Пе В в ВУ З МКК ХК п ПМК ОККО По МО А ПМЕМОо пи ПЕМИНННК ПЕК КК Во ПМ Пен КИ ОО В у ОКО п с Я КЕН АК ОКО ж ОН А М М М Я КУКИ М и ЕК М ОО КК ЕН с ВЕС пе ДЕ АХ ша МО МЕДИ В ОЯ ОО А ОМ п ЕК КЕ З М ЛИ : соя с с Мет Напоеновач п хайх м Я пе МВВ АК Оу ДІА ЕМ У ІВ МКК ХАКХЕДЯ, В Ком У о ох онов 0: ша» ОО нон ОКО хо Ор ВМО
: . сушку М КК г і і ОХ гізІвзаНКЯцЯ ПО ессдодвовосх М М юю МмН 0000 М пн ОО КК ох ВХ ша М Ох 55555555 ОО МО В М ЕК ОО ОО " КН НН ОК я. 5555555 ОП М І М В 55555555 5555 ОО М 55555555 : ОО рем ОО В 55555555 5555 0 І ОКО ПО ОО В В
0. М я 55555555 ОО КО В 55555555 Б ОО Я ОХ. ОМ ОХ ОО В о ОО ж ОЕМ М ММ ММ ОО З І: Ся о ОО 55555555 С вн ОО 555555 ОО с ок в «(С і С:
о. о. А ою КК ОККО Х ОМ а а М В ї її ж ОО о В ОК В МИ фіг Я
КК Ап мм о. ук хх уІІООВТТВІООО ШИ УМ Ж КОС ММ . --иа я ОПО ТЕ МО о ОО х ЗЕ ОО НИ ,І,ПююООМММММММ МЕ І ПККИККИНКК КК КК М ПУ ке ОО М ММ і КК М КК Є М пИЖХ ПОргМЖ аа М М М М М КМ М М М ЇХ КОХ З М ЕК ЖЕК ОО ОМ ХК З По ЖИ ІИ М М М А НМ М М М М С І В КО ОО В МОМ Я М У пох КОМ ОО ПН КК Во ПО М ММ КК ПЕ ОО КО В В ПК ОККО я ОК КВ В В КК Ка ПО ДООКОМою ЕК ОО ОО МКК ПО, мМ Оиьрлр р МвюЛюциДМл М Ж и , ОМ М М КИ КК в Ох КО НН МА ПІ М М В ШЕЖХ О,лОАОІО М А А А І М М М М М КЕ лАлМлМ М М І ТЛ М М М ж ОО що ОО М М І ШК кОм М НН М М КМ КМ КМ і кі М І Кк и Кк А М КМТ М КК КК що п М В ОХ ЖЕ ООАІюММММММ ММ а А А М г ОПО КОДУ у ОО МІ ММ М М м ОО о Те ІІІ У КК шану оту ОО я - БВ ПО дит ЕК юю М М М М М тТПВПЇХОО В ССЮ:ШВ ьИО дО во ЗоФФ ФО ОМ с С. З хх хи МОМ Н ОО ОМ ОН НН М Н М Н пк ОО ПО ,,ПІЮХМММЕ а а А ПМ ША ПТ ТЦ І М М КК КН КК Ох МОХ ОО М М ММ ММ КМ М і М КК І І В ММ ММ ОО ОО ОА М Пт М М М І с І СК М ОКОМ п ВО В В В ЕН КО и Я ХО М ММ ММ М я й І ОХ М КК М КК ОО ОО В ОА М М М я У я ММК ПО з и В ІМ ОО М 55555555 А М М М ПП М ПП МЛ ПК ОО А КМ Му ,ІОулдДлММММММММ М М КМ М і МАК Оа а а МАО М М і і і КК КООМОМЕОИМ І и М М ММ М ОО кри ДМ т АІАИАИАММ М М М ОО ПК М Іо м М М М В А В М М ОК ПО КК он ОО М М ОО ОО и ОК ММ М ОКО о а де КО ОКО ВН МНН ОО М В Б М я МКК М МО КО ОБ с ОК ВХ ОО ЕНН МО М М НН і і КК 3 555555 КК Х ММ ММ ХХ ОО АДМ ОО А МК о 55555555 КОН АІАІ М Пп ОО ОО о З ЗО Я АП КА КО М М М і ОО М ОК ОН ОО М М В є ОХ ОД М М М Є ОКО 55555555 кОСОСЛЄОЛМІЛІМОЕООВЄЄ ЗЛІІІІІОООЄЄСОЮОВЄВТЦ6ВНВТ КЮВВ ВІМККСТНІЯВКККМ ІОВ М ОО ОО М ВХ Ох ХОМ М М М і Кк М ММ М М а М М М М М ККУ МА І п ОО ЗУ пули вввв гл ННЕ У ШИ МО Її КУ СО паче КЕ Кохткралі ВОМ : ТроневЕчний М: Коронервних МО КОРЖ КАЛЬМКНЕ З х ПО У. но в НН хе ее 'не'єч' чч ж ч' Фо чнон4отяиляооообБ( 4ц и Донфооксї її я ювофоомБмНММмМмМ ПО НО ї зі х АМНННКК ПН ОН МІ 5 хво ния МОМ МО ОО в Тамя кн тк МУК М М М ОН ВО Би МОЯ ОК п ХО 3 зроб М М Є 3 ЗБ КЕЩК 3 ОХ ОКХ п ії М ММ УМО ЗБК КК У МОМ М І М ОО І В М ЕОМ КК ОК Зоо ОО ЗО . КОХ ОО ОО ПО І ПО МО ЕЕ ПІІ М ПН КА Ох ПОМ с ОМ и о. ОКОМ ММ М ПО ОО ОХ МОЄ ОО ,АІлІуМА А м А ПІОІММММММО М ОМ КОС зорово я зе н ИН с с ОК и МО КО КЕ п. ОО ОО я и ММК КОКО а НК ПК ММ МК І М КОХ ОК У 5 о М І ПП М М І ПО ТР ух ОК ПО ПК ї ххх А НЕ ПІ ВЕБМННН ОХ ик У МО ОО 2 с в ОН В РО ОХ ОО У ПО МО А А МП М М М М ПОМ ОКО й шк КОКО о ЕНИККННН НИК ККУ ОО море ОО и М ВО У МОБ ОО М ОН КО ЕК КК ї ОКХ ПО ВОМ ОХ ОО ПО М М ВОМ ОК М М КОМОЮ ВБЄНХ МОНЕ ЕМ УК ОО М М І КУ ПО М І Я ВУЄ УМО
МНН ОН : ІА о в а а п в Б В С В я п я М о М ПК ОО ЕК КК Х КОХ КК А ПО ОО НМ о ЕНН НН А ОМ МВВ Кв КК В ОК ОДН ОКА М ПОВ СХ ОО НН ОКХ ОК ОХ М о я М А М Б ОХ ОКХ хх МОХ НК КЛ ЗХ ХА ОК М ОК ОХ ОКОМ 3 оо о ОО А А М М КОН ВХ Я М ЕХ о ОО КК 5. ОО ОО я КК ТК М о» : СКК ОККОО ОК МО ЗМ А КМ НН ММ с А М М М М А 5 с ОК ОК ОХ ММ І СО З ОМ В ОМ ОО я 0 М А ТЕ ет фіг. 50 «ВВЕ т в з жа В фея ь кі - Сх, х Ох й А а Іо с, й Ж в ке ее Ме ХТТИТ, ие КЕ і ка До ний « се їх ожини сво, я Ух те вм. ї-ї во Ка, Даднчачнлнчннн У КЕ "Боня їх зі ще ЙО Ко у з сх ендо, окон, ши В не Ж ке Во ОХ одокчя ! і окон мч ЇЖТЕ і: з в Я Кв х а й С УК ОХ Кім «Й Контакт жк тт Здснлся їх т есосссеід К Я Крот ТТ т т цу 0 У т тт т т А т КУА ТАК КАНА АКА зу? сви т
Фіг. 51
ОА ХО У ХК ОХ ЗХ У М МО ОК ж Ко ХкохВее п п с па. о я о Фіг. 52 о. о с ще Е а о ЗО З ОО о о. ще о. о. є зок с с с я ня у ть а г о о 7 ь о --- п о о ОКО ОК М ЗУ ОО Ох щ с ОК КУ ЗУ М
. шини тт нн и а м на в «ут тн ШИБКИ Ко ОВ Лрзвамеюа пля дома ромен я М ЕН. З ОКО КВВЕ Кв ще ша м ї М . с хІВІМатТьЬМиМ ТхНЕчННМ Мен КО о. ЕЛ СКК ОМ ОКО ПІ пЕомщУтя : я ОК ВВ : шт ПОБУ с ї ПИВ пок х ЗАВІВ М ОМП ЦК КУСЕКНМ Б сли ож хх ОВ З ЗЕ МЕТИ ЕК я УК КК МКМ пк У М хе мими т нки 8. а ок пд БУ ТЕ зх МОДІ В АЖ ИТУ ВАТУ ХЕ ХИТ КОСА п ша. З пух Я т В ОХ ХУ ОК с НЕ 3 с тла й в Кізлаленвй мама ТАК ля МЕ В шо, - ї К х какао чення маком ленє Ну чхиКих ож ВОНИ фест ЗЕ З Се зно МЕ ХК ТТхисипех ЩО щ осв МИХ ВАК п. їх ШЕ х АХ Є ВЖК х ще ї ЖЕ що ї Е х . з. ГУ с ОХ що їжак Дзвефевцва вір ОБ факто ко ща КК ї Ж ї Запикк ШОВ Її Я КА Ко . х КІ М ко : Пре вени х КЗ ї шення шию ЕН Я І шаг. з. г н е Ше хх Я РО ЖІ УИ каченя зу уаме ї М вик вити ОБ на. : ЖІ . « т їОЖІЇ кепки ЩО Х Стевнавня 00 Р ЖІ Жехакх ккувккняях ЕК 0 осмрюєтюх стат ЕВ я ЖК поши ОХ що и ї я зви чаяані . : Ж : ккд повені 5 БЕ щей ї 5 ї ОК ЩІ хоомимюх 00000, КИ соми мрадек ХЕ М ОВЕБ зікаке ее ми т : їх ї ВОЗ Ех сек МИХ МУ Ки Ж оо РИ пи ПЕ. т мм УК дув ож НК ВВХ ПЕ вн ЖК се ОХ
Ат . ХИКМЛК ПИ ни ПУЕ ТИКИ СН, ку "дикій кате Пен НК Ах ЗДА й КОКОН ПКУ : я
Фиг. а джтнтннтнкннк, Неридф -к Ше і я Е ЯіпУвлаті є Ї 5 ВУ БУВ Е ч Її т, У г дииеике ик, ях ї ай Її т ко, ж те т і й У ФО хе няння фаху уник о АКА ЖАЛАЛАААА А кажу Е ї х : Що ДО НИ ї ї Ї | бос я? х Її З "7 т т Кі Е х кх У ї « Ку ож т х т -ї КЗ т т Є ; - я якою К екнєкннтююнх У ку т я є М кт Батетер вавкунУче кічьне, яке жк, що ї і ВеглЛюЮЄєТьЬКИ ! " ЕНН У МВ й зу и
Янг. 5 якожж ооо МКМ ВИННХ І о мор хипТраиткм, г. у їв пезшевию : ТА катиху ХК УКХ. КК х ОО Я «т. "
і 3.
Що. г ПК КК Ки ПАК
ОВ . с ПЕК В СХ ОО ААК КК Б С В ОО КЕ введсзря ЕГУЄ: взконечнме кизезена казки Чи, од Ніакснечних ТеУрачка улутия КЕ І ' І СЕУ сювори не Пермевровка кВУстевя квесту а мавсовечииКу оленя - : щк т пору Б о у. Б КЕ о о о с М же : у ХХ АКА АК КК ОО МКК КЕ
Фіг. зов ренту ї К і їх пні ше Кк інфе АК од ; -Т - й фен дехкюннн і х ї т ше шк и : ення ОД евсос ЖЕсках візки МІУ ВЗА КВ ВУЮТЬ, пеововюююювалалаьйям, Ко я (ей ср Брпкюнннс З шк і і : і ЕІ т я і и Кора | че хі ї г ка ї їх ї
11. те 7 чи у м іі з Кеннет РЕАК ер ГЕ і Її ка он жи я ее ТЕ У їй КЕ ; ЩЕ і ех и У Ї пи м я г ЯТІ Є ше А й / ОК ох х С її з у й / с-ї сої ох ! и чн з і чу еко, і й : сей і 1 дня
Фіг. оС 0 Компютернаверстка А. Крижанівський (00000000 "до "Український національний офіс інтелектуальної власності та інновацій", вул. Дмитра Годзенка, 1, м. Київ - 42, 01601.
UAA201507721A 2010-06-25 2011-06-25 Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази а (аса) UA129740C2 (uk)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35885710P 2010-06-25 2010-06-25
US36078610P 2010-07-01 2010-07-01
US38786210P 2010-09-29 2010-09-29
US201161435710P 2011-01-24 2011-01-24
US201161442115P 2011-02-11 2011-02-11
US201161476210P 2011-04-15 2011-04-15
US201161495268P 2011-06-09 2011-06-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA129740C2 true UA129740C2 (uk) 2025-07-23

Family

ID=45352777

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201507721A UA129740C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-25 Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази а (аса)
UAA201507719A UA125060C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-25 Способи та композиції для доставки до цнс ідуронат-2-сульфатази
UAA201507529A UA125743C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-25 Застосування фармацевтичної композиції, що включає фермент заміщення для лізосомального ферменту

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201507719A UA125060C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-25 Способи та композиції для доставки до цнс ідуронат-2-сульфатази
UAA201507529A UA125743C2 (uk) 2010-06-25 2011-06-25 Застосування фармацевтичної композиції, що включає фермент заміщення для лізосомального ферменту

Country Status (24)

Country Link
US (17) US9814764B2 (uk)
JP (22) JP6250616B2 (uk)
CN (4) CN104857504A (uk)
AR (6) AR082025A1 (uk)
BR (1) BR112012033214B1 (uk)
CA (1) CA3171308A1 (uk)
CL (7) CL2012003656A1 (uk)
DK (3) DK3626258T3 (uk)
ES (3) ES2858726T3 (uk)
HK (1) HK1214149A1 (uk)
HR (3) HRP20211660T1 (uk)
HU (6) HUE046409T2 (uk)
LT (3) LT3626258T (uk)
MX (1) MX354776B (uk)
NZ (2) NZ702803A (uk)
PE (8) PE20130578A1 (uk)
PL (1) PL2588130T3 (uk)
PT (6) PT3626258T (uk)
RS (3) RS62620B1 (uk)
RU (1) RU2761342C2 (uk)
SI (3) SI3103469T1 (uk)
SM (1) SMT201600385B (uk)
TW (9) TW201701899A (uk)
UA (3) UA129740C2 (uk)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8497246B2 (en) 2006-08-18 2013-07-30 Armagen Technologies, Inc. Methods for diagnosing and treating CNS disorders by trans-blood-brain barrier delivery of protein compositions
JP5901877B2 (ja) 2007-07-27 2016-04-13 アーメイゲン・テクノロジーズ・インコーポレイテッドＡｒｍａｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ． 中枢神経系のα−Ｌ−イデュロニダーゼ活性を増加させるための方法および組成物
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
RU2012154576A (ru) 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
US20220133863A1 (en) * 2010-06-25 2022-05-05 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of sanfilippo syndrome type b
CN104857504A (zh) 2010-06-25 2015-08-26 夏尔人类遗传性治疗公司 芳基硫酸酯酶a cns递送的方法和组合物
BR112012033216B1 (pt) 2010-06-25 2022-10-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc Uso de uma formulação estável compreendendo uma proteína arilsulfatase a (asa) e formulação estável para administração intratecal
UA115648C2 (uk) 2010-06-25 2017-12-11 Шае Хюмен Дженетік Терапіс, Інк. Доставка терапевтичних агентів до цнс
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
WO2013096899A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
US9682129B2 (en) * 2011-12-23 2017-06-20 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of cognitive impairment of hunter syndrome by intrathecal delivery of iduronate-2-sulfatase
CA2912678C (en) * 2013-05-15 2023-10-10 Regents Of The University Of Minnesota Adeno-associated virus mediated gene transfer to the central nervous system
US10538589B2 (en) * 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
CA2985235A1 (en) 2015-05-07 2016-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
PL3397270T3 (pl) * 2015-12-30 2024-08-19 Green Cross Corporation Kompozycje do zastosowania w leczeniu zespołu huntera
EP4275751A3 (en) 2016-02-24 2023-12-27 BioMarin Pharmaceutical Inc. Improved naglu fusion protein formulation
WO2017181113A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsyvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
WO2019060662A1 (en) 2017-09-22 2019-03-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENE THERAPY FOR THE TREATMENT OF MUCOPOLYSACCHARIDOSE TYPE II
EP3760220B1 (en) * 2018-02-28 2025-02-19 Seikagaku Corporation A package comprising lyophilized chondroitinase abc and method for manufacturing the same
CN108534695A (zh) * 2018-05-04 2018-09-14 无锡恩特卫自动化检测设备有限公司 一种基于机器视觉系统的瓶塞漏酒检测方法及装置
KR102671857B1 (ko) * 2018-05-30 2024-06-04 주식회사 녹십자 대뇌 측뇌실 투여에 의해 헌터증후군을 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR20210024082A (ko) 2018-06-25 2021-03-04 제이씨알 파마 가부시키가이샤 단백질 함유 수성 액제
JP7253771B2 (ja) * 2019-01-18 2023-04-07 株式会社大一商会 遊技機
JP7253770B2 (ja) * 2019-01-18 2023-04-07 株式会社大一商会 遊技機
CR20230178A (es) 2020-10-14 2023-07-26 Denali Therapeutics Inc Proteínas de fusión que comprenden enzimas sulfoglucosamina sulfohidrolasa y métodos de estas
CN113283465B (zh) * 2021-04-02 2022-04-29 电子科技大学 一种弥散张量成像数据分析方法及装置
CN117999278A (zh) 2021-06-21 2024-05-07 裘美娜治疗公司 再生性多肽及其用途
CN115116623A (zh) * 2022-06-28 2022-09-27 深圳市儿童医院 一种基于icd疾病编码的抗菌药物使用指标评价方法、终端
WO2025054521A1 (en) * 2023-09-07 2025-03-13 Juvena Therapeutics, Inc. Igf2 fusion protein formulations and therapeutic uses thereof
WO2025075929A1 (en) * 2023-10-02 2025-04-10 Neurona Therapeutics Inc. Methods of treating seizure activity

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3133001A (en) * 1959-11-26 1964-05-12 Muset Pedro Puig Stabilization of enzymes
US4743265A (en) 1986-04-23 1988-05-10 Dij Catheter Corp Articulated catheter placement device
US5222982A (en) 1991-02-11 1993-06-29 Ommaya Ayub K Spinal fluid driven artificial organ
JP3946246B2 (ja) * 1993-02-02 2007-07-18 ゾーマ・コーポレイション 殺菌性／浸透性増大タンパク質（Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＰＩ）及び界面活性剤を含有する医薬組成物
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
US6118045A (en) 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
AUPN674895A0 (en) 1995-11-23 1995-12-14 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian alpha-N-acetylglucosaminidase and genetic sequences encoding same
ES2185117T3 (es) 1997-08-22 2003-04-16 Seikagaku Kogyo Co Ltd Agente terapeutico para disco intervertebral herniado.
KR20010101131A (ko) 1998-12-07 2001-11-14 추후기재 폼페병의 치료 방법
US6217552B1 (en) 1999-03-01 2001-04-17 Coaxia, Inc. Medical device for selective intrathecal spinal cooling in aortic surgery and spinal trauma
US7412285B2 (en) 1999-04-09 2008-08-12 Oncostim, Inc. Method and device for treating cancer with electrical therapy in conjunction with chemotherapeutic agents and radiation therapy
US6368315B1 (en) 1999-06-23 2002-04-09 Durect Corporation Composite drug delivery catheter
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US6534300B1 (en) 1999-09-14 2003-03-18 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods for producing highly phosphorylated lysosomal hydrolases
US20020099025A1 (en) * 1999-12-30 2002-07-25 Heywood James A. Treatment of neurological disorders
US6866844B2 (en) * 2002-11-07 2005-03-15 Biomarin Pharmaceutical Inc. Precursor N-acetylgalactosamine-4-sulfatase, methods of treatment using said enzyme and methods for producing and purifying said enzyme
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
AU2002256423B2 (en) 2001-04-30 2008-07-24 Zystor Therapeutics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20030040479A1 (en) 2001-07-02 2003-02-27 Omeros Corporation Rotational intrathecal analgesia method and device
AU2002347910A1 (en) 2001-10-16 2003-04-28 Symbiontics Inc. Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
WO2003068159A2 (en) 2002-02-11 2003-08-21 Wake Forest University Compositions and methods for treating pain using cyclooxygenase-1 inhibitors
ES2367257T3 (es) * 2002-04-25 2011-10-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Tratamiento de deficit de alfa-galactosidasa a.
AU2003237314B2 (en) 2002-05-29 2010-03-04 Biomarin Pharmaceutical Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1426069A1 (en) 2002-12-02 2004-06-09 Diana Evelyn Miller Drug delivery system
EP1587923B1 (en) 2003-01-22 2011-08-24 Duke University Improved constructs for expressing lysosomal polypeptides
CN102586205A (zh) 2003-01-31 2012-07-18 纽约大学西奈山医学院 酶和酶的活性部位特异性陪伴分子的组合
JP5036302B2 (ja) 2003-02-10 2012-09-26 ティオー − ビービービー ホールディング ベスローテン フェンノートシャップ 炎症状態下に血液脳関門で示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）に発現される核酸
CN1788017B (zh) * 2003-02-10 2013-04-24 to-BBB控股股份有限公司 炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸
US20050026823A1 (en) 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
WO2005002515A2 (en) 2003-06-20 2005-01-13 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US7442372B2 (en) 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
JP4586027B2 (ja) * 2004-01-30 2010-11-24 シャイア ファーマシューティカルズ アイルランド リミテッド 組換えアリールスルファターゼａの製造及び精製
US20060029656A1 (en) 2004-02-03 2006-02-09 Biodelivery Sciences International, Inc. Replacement enzyme cochleates
EP1720405A4 (en) 2004-02-06 2008-08-27 Biomarin Pharm Inc PREPARATION OF STRONG PHOSPHORYLATED LYSOSOMAL ENZYMES AND THEIR USE
JP4914224B2 (ja) 2004-02-10 2012-04-11 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
UA11577U (en) 2004-04-21 2006-01-16 Academician A P Romodanov Inst Device for intrathecal drug administration into spinal canal
CA2565972A1 (en) * 2004-06-15 2005-12-29 Baxter International Inc. Ex-vivo application of solid microparticulate therapeutic agents
EP1781805B1 (en) * 2004-08-11 2009-12-09 Basf Se Enzyme-based time temperature indicator
IL165334A0 (en) * 2004-11-22 2006-01-15 Mediwound Ltd Debriding composition from bromelain and methods of producing same
JPWO2006121199A1 (ja) * 2005-05-11 2008-12-18 日本ケミカルリサーチ株式会社 脂質小胞体組成物
WO2006133446A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of cns disorders associated with mutations in genes encoding lysosomal enzymes
AR059089A1 (es) * 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
MX392030B (es) 2006-02-09 2025-03-21 Genzyme Corp Agentes y usos de los mismos para prevenir y/o tratar enfermedades neurológicas
CN101410408A (zh) * 2006-04-04 2009-04-15 希尔制药爱尔兰有限责任公司 用于浓缩多肽的方法
EP2628746B1 (en) 2006-04-04 2019-01-09 Chiesi Farmaceutici S.p.A. A process for the concentration of a polypeptide
GB0611463D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Novartis Ag Organic compounds
US20080076120A1 (en) 2006-09-14 2008-03-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification, evaluation and treatment of patients having CC-Chemokine receptor 2 (CCR-2) mediated disorders
WO2008070769A1 (en) * 2006-12-06 2008-06-12 Medtronic, Inc. Intrathecal catheter
WO2008109677A2 (en) 2007-03-06 2008-09-12 Saint Louis University Modified enzyme and treatment method
JP5341756B2 (ja) 2007-06-29 2013-11-13 国立大学法人名古屋大学 神経障害に基づく機能不全の改善剤およびＲｈｏキナーゼ活性化抑制剤
WO2009017005A1 (ja) 2007-07-27 2009-02-05 Sharp Kabushiki Kaisha 移動局装置、基地局装置、通信システム及びプログラム
CN103298935A (zh) 2007-08-15 2013-09-11 阿穆尼克斯公司 用于改善生物活性多肽性能的组合物和方法
WO2009062348A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-22 Institute Of Microbiology, Chinese Academy Of Sciences Methods for inhibiting influenza virus infection and their drugs
NZ622583A (en) 2007-11-30 2015-08-28 Abbvie Biotechnology Ltd Protein formulations and methods of making same
MX2010007846A (es) 2008-01-18 2010-10-05 Biomarin Pharm Inc Fabricación de enzimas sulfatasa lisosomal humana altamente fosforilada, activa y usos de las mismas.
US7722865B2 (en) * 2008-01-18 2010-05-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
TW200936156A (en) * 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
WO2009131698A2 (en) 2008-04-23 2009-10-29 Iowa State University Research Foundation, Inc. PHOSPHORYLATED RECOMBINANT N-ACETYL-alpha-D- GLUCOSAMINIDASE (NaGlu) AND USES THEREOF
US20110223147A1 (en) 2008-05-07 2011-09-15 Zystor Therapeutics, Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
US8436489B2 (en) 2009-06-29 2013-05-07 Lightsail Energy, Inc. Compressed air energy storage system utilizing two-phase flow to facilitate heat exchange
UA115648C2 (uk) 2010-06-25 2017-12-11 Шае Хюмен Дженетік Терапіс, Інк. Доставка терапевтичних агентів до цнс
WO2011163651A2 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF β-GALACTOCEREBROSIDASE
RU2012154576A (ru) * 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
NZ702801A (en) 2010-06-25 2016-08-26 Shire Human Genetic Therapies Treatment of sanfilippo syndrome type b
PL2593131T3 (pl) 2010-06-25 2020-01-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Sposoby i kompozycje do dostarczania sulfatazy-2-iduronianiu do oun
CN104857504A (zh) 2010-06-25 2015-08-26 夏尔人类遗传性治疗公司 芳基硫酸酯酶a cns递送的方法和组合物
BR112012033216B1 (pt) 2010-06-25 2022-10-11 Shire Human Genetic Therapies, Inc Uso de uma formulação estável compreendendo uma proteína arilsulfatase a (asa) e formulação estável para administração intratecal
JP2012062312A (ja) 2010-08-19 2012-03-29 Yoshikatsu Eto ハンター症候群の治療剤
US8580922B2 (en) * 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
WO2013096899A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
US10603364B2 (en) 2014-08-11 2020-03-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting and uses thereof
BR112017002741A2 (pt) 2014-08-11 2018-02-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc peptídeos contendo manose-6-fosfato fundidos a enzimas lisossômicas
EP3220958A1 (en) 2014-10-24 2017-09-27 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lysosomal targeting of enzymes, and uses thereof
US9673835B1 (en) 2015-12-04 2017-06-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Pipelined SAR with TDC converter

Also Published As

Publication number Publication date
JP2016040335A (ja) 2016-03-24
JP2021167340A (ja) 2021-10-21
TW201206465A (en) 2012-02-16
HK1214149A1 (zh) 2016-07-22
JP2017214434A (ja) 2017-12-07
LT3626257T (lt) 2021-12-10
PE20170938A1 (es) 2017-07-13
HUE046856T2 (hu) 2020-03-30
JP6346162B2 (ja) 2018-06-20
US20250375506A1 (en) 2025-12-11
TWI790444B (zh) 2023-01-21
US12161702B2 (en) 2024-12-10
TW201726161A (zh) 2017-08-01
JP2018002735A (ja) 2018-01-11
JP2018002734A (ja) 2018-01-11
US20160158324A1 (en) 2016-06-09
US20230026836A1 (en) 2023-01-26
PE20130589A1 (es) 2013-05-19
CN104857504A (zh) 2015-08-26
JP2022024176A (ja) 2022-02-08
HUE052944T2 (hu) 2021-05-28
TW201212936A (en) 2012-04-01
MX354776B (es) 2018-03-20
US20220133862A1 (en) 2022-05-05
US20180071212A1 (en) 2018-03-15
CN106139133B (zh) 2020-12-04
US12121569B2 (en) 2024-10-22
RS61683B1 (sr) 2021-05-31
CL2012003656A1 (es) 2013-07-19
PE20130579A1 (es) 2013-05-19
JP2023099216A (ja) 2023-07-11
TW201825111A (zh) 2018-07-16
US20180085438A1 (en) 2018-03-29
SI3626257T1 (sl) 2021-12-31
US9220677B2 (en) 2015-12-29
TW201701899A (zh) 2017-01-16
US11065307B2 (en) 2021-07-20
TW201815411A (zh) 2018-05-01
AR081680A1 (es) 2012-10-10
BR112012033214B1 (pt) 2020-11-03
RU2018113327A (ru) 2019-03-01
RU2017125281A3 (uk) 2020-11-09
US11260112B2 (en) 2022-03-01
PT2593131T (pt) 2019-10-30
US20250161417A1 (en) 2025-05-22
ES2896060T3 (es) 2022-02-23
JP2021181489A (ja) 2021-11-25
TWI609694B (zh) 2018-01-01
AR081681A1 (es) 2012-10-10
ES2895655T3 (es) 2022-02-22
PL2588130T3 (pl) 2017-09-29
US9814764B2 (en) 2017-11-14
TWI602573B (zh) 2017-10-21
JP2020079297A (ja) 2020-05-28
US20190183984A1 (en) 2019-06-20
JP6466538B2 (ja) 2019-02-06
HUE046409T2 (hu) 2020-02-28
TW202112391A (zh) 2021-04-01
JP2016041755A (ja) 2016-03-31
HUE055963T2 (hu) 2022-01-28
US10456454B2 (en) 2019-10-29
JP2019038853A (ja) 2019-03-14
US20250121040A1 (en) 2025-04-17
JP2024097029A (ja) 2024-07-17
CN105664142A (zh) 2016-06-15
HRP20211660T1 (hr) 2022-02-04
CL2012003655A1 (es) 2013-04-19
MX2013000321A (es) 2013-04-03
AR081679A1 (es) 2012-10-10
HRP20211520T1 (hr) 2021-12-24
PE20130648A1 (es) 2013-07-03
JP2023062114A (ja) 2023-05-02
PE20130637A1 (es) 2013-06-13
US10646554B2 (en) 2020-05-12
AR081678A1 (es) 2012-10-10
DK3103469T3 (en) 2021-02-22
CA3171308A1 (en) 2011-12-29
JP7448507B2 (ja) 2024-03-12
CL2012003654A1 (es) 2013-06-14
PT2588130T (pt) 2016-11-25
JP6938456B2 (ja) 2021-09-22
AR082025A1 (es) 2012-11-07
JP6898909B2 (ja) 2021-07-07
US20170042978A1 (en) 2017-02-16
RU2018113327A3 (uk) 2021-07-21
JP2020079298A (ja) 2020-05-28
JP7543459B2 (ja) 2024-09-02
CN105233277B (zh) 2019-01-01
RU2761342C2 (ru) 2021-12-07
PT3103469T (pt) 2021-03-04
BR112012033214A2 (pt) 2017-05-23
PE20180130A1 (es) 2018-01-18
US12409210B2 (en) 2025-09-09
US20200113981A1 (en) 2020-04-16
NZ702800A (en) 2017-03-31
US20140271598A1 (en) 2014-09-18
US20200405825A1 (en) 2020-12-31
JP2021167341A (ja) 2021-10-21
US11471516B2 (en) 2022-10-18
US20170042977A1 (en) 2017-02-16
JP2020079244A (ja) 2020-05-28
US20230165942A1 (en) 2023-06-01
JP2023052868A (ja) 2023-04-12
HRP20210298T1 (hr) 2021-04-16
UA125060C2 (uk) 2022-01-05
JP6285409B2 (ja) 2018-02-28
TW202337489A (zh) 2023-10-01
TWI698252B (zh) 2020-07-11
PT2585104T (pt) 2019-10-30
JP6522072B2 (ja) 2019-05-29
JP7087175B2 (ja) 2022-06-20
ES2858726T3 (es) 2021-09-30
JP2019006826A (ja) 2019-01-17
HUE031036T2 (en) 2017-06-28
LT3103469T (lt) 2021-03-25
LT3626258T (lt) 2021-12-10
JP7359827B2 (ja) 2023-10-11
RU2018137304A3 (uk) 2022-02-22
DK3626258T3 (da) 2021-09-20
PE20180801A1 (es) 2018-05-09
JP2016040337A (ja) 2016-03-24
SI3626258T1 (sl) 2021-11-30
NZ702803A (en) 2017-05-26
JP2019031575A (ja) 2019-02-28
UA125743C2 (uk) 2022-06-01
HK1218719A1 (zh) 2017-03-10
PT3626257T (pt) 2021-11-12
TWI876260B (zh) 2025-03-11
CL2020000468A1 (es) 2020-09-04
TWI669128B (zh) 2019-08-21
US11065308B2 (en) 2021-07-20
DK3626257T3 (da) 2021-11-08
JP2016094451A (ja) 2016-05-26
RS62620B1 (sr) 2021-12-31
SI3103469T1 (sl) 2021-04-30
US20200046810A1 (en) 2020-02-13
CN105233277A (zh) 2016-01-13
RS62520B1 (sr) 2021-11-30
SMT201600385B (it) 2017-03-08
CL2016003159A1 (es) 2017-05-12
HUE056884T2 (hu) 2022-03-28
RU2017125281A (ru) 2019-01-31
RU2018137304A (ru) 2019-03-21
TW202506172A (zh) 2025-02-16
PT3626258T (pt) 2021-10-19
JP6250616B2 (ja) 2017-12-20
JP7591476B2 (ja) 2024-11-28
JP6797876B2 (ja) 2020-12-09
US12168041B2 (en) 2024-12-17
PE20130578A1 (es) 2013-05-19
JP6522073B2 (ja) 2019-05-29
CL2012003657A1 (es) 2013-04-19
CL2017002488A1 (es) 2017-12-15
AR081677A1 (es) 2012-10-10
JP2016037504A (ja) 2016-03-22
US20130295077A1 (en) 2013-11-07
CN106139133A (zh) 2016-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA129740C2 (uk) Застосування композиції, що включає білок арилсульфатази а (аса)
RU2671503C2 (ru) Способы и композиции для доставки в цнс арилсульфатазы а
KR102345973B1 (ko) 치료제들의 cns 전달
TWI611808B (zh) 於腦脊髓膜內遞送艾杜糖醛酸鹽（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）-２-硫酸酯酶之方法及組合物
KR20130043166A (ko) 산필리포 증후군 b형의 치료
RU2783380C2 (ru) Способы и композиции для доставки в цнс арилсульфатазы а
EA043909B1 (ru) Способы и композиции для доставки арилсульфатазы a в цнс
HK1230922A1 (en) Methods and compositions for cns delivery of iduronate-2-sulfatase
BR112012033205A2 (pt) uso de uma composição compreendendo agentes terapêuticos para liberação ao sistema nervoso central