TWI611808B - 於腦脊髓膜內遞送艾杜糖醛酸鹽（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ）-２-硫酸酯酶之方法及組合物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於經腦脊髓膜內投與溶酶體酵素來有效治療溶酶體貯積症。在一些實施例中，本發明提供用於IT遞送艾杜糖醛酸鹽(Iduronate)-2-硫酸酯酶之穩定調配物。

Description

於腦脊髓膜內遞送艾杜糖醛酸鹽(IDURONATE)-2-硫酸酯酶之方法及組合物

本申請案主張美國臨時專利申請案第61/358,857號(2010年6月25日申請)、第61/360,786號(2010年7月1日申請)、第61/387,862號(2010年9月29日申請)、第61/435,710號(2011年1月24日申請)、第61/442,115號(2011年2月11日申請)、第61/476,210號(2011年4月15日申請)及第61/495,268號(2011年6月9日申請)之優先權，每一案件之全文以引用方式併入本文中。

酵素替代療法(ERT)涉及向個體全身投與天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。經批准療法通常經靜脈內投與個體，且通常可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。由於經靜脈內投與之蛋白質及/或酵素不能充分地跨過血腦障壁(BBB)，故經靜脈內投與之蛋白質及/或酵素至中樞神經系統(CNS)細胞及組織中之分佈很有限，因而治療具有CNS病因之疾病一直尤其具有挑戰性。

血腦障壁(BBB)係由內皮細胞構成之結構系統，其藉由限制血流中之有害物質(例如細菌、大分子(例如，蛋白質)及其他親水性分子)擴散跨過BBB及擴散至下面的腦脊髓液(CSF)及中樞神經系統(CNS)中而起保護CNS遠離該等物質之功能。

全身物質(不管該物質為內源的抑或外源投與的)穿透BBB之能力取決於數個因素。該等因素包括(例如)該物質在BBB兩側之濃度、該物質之尺寸、該物質之親脂性以及該物質對特定活性載體結構之親和力。已經提出以有效遞送治療劑跨過BBB之策略包括受體介導之轉運，由此通過固有主動轉運系統使大分子主動轉運跨過BBB。亦已將BBB之高滲性開放視為能夠控制BBB以促進治療劑之遞送的技術。亦已將更多侵襲性技術(例如對流增強之治療劑遞送)視為藉由將該等治療劑直接輸注至CNS中而繞開BBB之方式。

儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與至脊髓周圍之腦脊髓膜內間隙中仍然為將治療劑直接投與跨過BBB並投與至下面的CSF中之最常見方式。(Kroin JS,Clin Pharmacokinet(1992) 22(5):319-326.)相對於可全身投與至個體之組合物體積，適於腦脊髓膜內投與之組合物體積通常係治療具有CNS病因之某些疾病之重大障礙。通常，對於可投與至個體之治療劑總劑量的該等限制會抑制在擬定作用位點達到治療劑之最佳治療濃度的能力。因此，該等限制可使腦脊髓膜內遞送途徑對於懷疑具有CNS病因之許多疾病而言不可行，尤其對於在受侵襲組織(例如，腦)中達到有效治療濃度需要較大劑量治療劑之疾病。

製備濃縮組合物不足以抵消與腦脊髓膜內投與治療劑及在受侵襲組織中達到有效治療濃度有關之限制。製備濃縮組合物通常可造成治療劑之聚集及/或沉澱。可利用之適於CNS投與之醫藥組合物有限進一步使該限制複雜化。因此，業內仍然需要能夠使治療劑增溶且適於將該等治療劑CNS投與至有需要之個體的穩定組合物。亦仍然需要能夠在CNS細胞及組織內達到治療濃度之醫藥組合物(例如，經腦脊髓膜內投與之醫藥組合物)。

本發明提供適於將治療有效量之治療劑遞送至個體CNS中之水性醫藥組合物以及與使用該等醫藥組合物有關之治療方法。由於可投與至中樞神經系統(CNS)中之治療劑的注射體積有限以及該房室中獨特的流體動力學、組成及代謝，預期僅特定組合物適於直接CNS投與以避免不良事件。本發明提供適於任何治療劑之CNS遞送的調配物設計空間(formulation design space)。另外，該調配物設計空間適於蛋白質治療劑之穩定性。

在一個態樣中，本發明提供用於腦脊髓膜內投與之穩定調配物，其包括艾杜糖醛酸鹽(iduronate)-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質、鹽及聚山梨醇酯表面活性劑。在一些實施例中，I2S蛋白質係以介於約1-300 mg/ml範圍內之濃度存在。在一些實施例中，I2S蛋白質係以選自2 mg/ml、10 mg/ml、30 mg/ml、50 mg/ml或100 mg/ml之濃度存在。

在一些實施例中，I2S蛋白質包含胺基酸序列SEQ ID NO:1。

在一些實施例中，鹽係NaCl。在一些實施例中，NaCl係以介於約0-300 mM範圍內之濃度存在。在一些實施例中，NaCl係以介於約137-154 mM範圍內之濃度存在。在一些實施例中，NaCl係以約154 mM之濃度存在。

在一些實施例中，聚山梨醇酯表面活性劑選自由下列組成之群：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。在一些實施例中，聚山梨醇酯表面活性劑係聚山梨醇酯20。在某些實施例中，聚山梨醇酯20係以介於約0-0.02%範圍內之濃度存在。在某些實施例中，聚山梨醇酯20係以約0.005%之濃度存在。

在一些實施例中，該調配物進一步包含緩衝劑。在某些實施例中，緩衝劑選自由下列組成之群：磷酸鹽、乙酸鹽、組胺酸、琥珀酸鹽、Tris及其組合。在一些實施例中，緩衝劑係磷酸鹽。在某些實施例中，磷酸鹽係以不大於50 mM之濃度存在。在一些實施例中，磷酸鹽係以不大於20 mM之濃度存在。

在一些實施例中，該調配物具有約3至8之pH。在一些實施例中，該調配物具有約5.5至6.5之pH。在某些實施例中，該調配物具有約6.0之pH。

在一些實施例中，該調配物係液體調配物。在一些實施例中，將該調配物調配成凍乾之乾燥粉末。

在另一態樣中，本發明提供用於腦脊髓膜內投與之穩定調配物，其包括介於約1-300 mg/ml範圍內之濃度的艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質、約154 mM濃度之NaCl、約0.005%濃度之聚山梨醇酯20，且其pH為約6.0。在一些實施例中，I2S蛋白質之濃度為約10 mg/ml。在一些實施例中，I2S蛋白質之濃度為約30 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml或300 mg/ml。

在再一態樣中，本發明提供包括本文所述穩定調配物之單一劑型的容器。

在一些實施例中，容器選自安瓿、小瓶、藥筒(cartridge)、二室注射器給藥系統(lyo-ject)或預填充注射器。在某些實施例中，容器係預填充注射器。在某些實施例中，容器係貯器。

在一些實施例中，預填充注射器選自有烤聚矽氧塗層之硼矽酸鹽玻璃注射器、有噴塗聚矽氧之硼矽酸鹽玻璃注射器或無聚矽氧之塑膠樹脂注射器。

在一些實施例中，該穩定調配物係以小於約5.0 mL之體積存在。在一些實施例中，該穩定調配物係以小於約3.0 mL之體積存在。

在另一態樣中，本發明提供治療亨特氏症候群(Hunters Syndrome)之方法，其包括向需要治療的個體經腦脊髓膜內投與本文所述調配物之步驟。

在又一態樣中，本發明提供治療亨特氏症候群之方法，其包含以下步驟：向需要治療的個體經腦脊髓膜內投與調配物，該調配物包含介於約1-300 mg/ml範圍內之濃度的艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質、約154 mM濃度之NaCl、約0.005%濃度之聚山梨醇酯20，且其pH為約6。

在一些實施例中，該腦脊髓膜內投與步驟不會在個體中引起實質不良效應。在某些實施例中，該腦脊髓膜內投與不會在個體中引起實質適應性T細胞介導之免疫反應。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物使得I2S蛋白質遞送至目標腦組織中。在某些實施例中，目標腦組織包含白質及/或灰質中之神經元。在某些實施例中，將I2S蛋白質遞送至神經元、神經膠質細胞、血管周細胞及/或腦脊髓膜細胞。在一些實施例中，將I2S蛋白質進一步遞送至脊髓中之神經元。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物進一步使得I2S蛋白質全身遞送於周圍目標組織中。在某些實施例中，周圍目標組織選自肝、腎及/或心臟。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物達成於腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之溶酶體定位。在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物使得腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之GAG貯積減少。在某些實施例中，GAG貯積與對照相比減少至少20%、40%、50%、60%、80%、90%、1倍(fold)、1.5倍或2倍。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物使得神經元中之空泡形成減少。在某些實施例中，神經元包含普爾欽細胞(Purkinje cell)。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物使得腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之I2S酵素活性提高。在某些實施例中，I2S酵素活性與對照相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在某些實施例中，提高的I2S酵素活性為至少約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg或600 nmol/hr/mg。

在一些實施例中，腰區中之I2S酵素活性提高。在某些實施例中，腰區中之提高的I2S酵素活性為至少約2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg或10,000 nmol/hr/mg。

在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與該調配物使得亨特氏症候群之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。在某些實施例中，亨特氏症候群之該至少一種症狀或特徵係認知損害；白質損傷；腦實質、神經節、胼胝體及/或腦幹中之血管周間隙擴大；萎縮；及/或腦室擴大。

在一些實施例中，腦脊髓膜內投與每兩週實施一次。在一些實施例中，腦脊髓膜內投與每月實施一次。在一些實施例中，腦脊髓膜內投與每兩個月實施一次。在某些實施例中，腦脊髓膜內投與和靜脈內投與連合使用。在某些實施例中，靜脈內投與頻率不多於每月一次。在某些實施例中，靜脈內投與頻率不多於每兩個月一次。在一些實施例中，如技術方案27至48中任一技術方案，其中腦脊髓膜內投與係在不實施靜脈內投與的情況下使用。

在一些實施例中，腦脊髓膜內投與係在無並存免疫抑制療法的情況下使用。

在另一態樣中，本發明提供用於腦脊髓膜內投與之系統，其包括輸液裝置；空心體，其具有與該輸液裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量孔；及用於該空心體緊固插入脊髓中之緊固機構(securing mechanism)。在一些實施例中，該緊固機構包含一或多個安裝於空心體表面上之球形頭及於該一或多個球形頭上可調整之縫合環。在一些實施例中，輸液裝置係可注射座(injectable port)。在一些實施例中，可注射座係可植入的。在一些實施例中，輸液裝置係幫浦。

圖式僅用於說明性目的而非限制性目的。

定義

本發明尤其提供基於緩衝劑、穩定劑、表面活性劑及/或其他賦形劑之蛋白質調配物。本發明調配物提供或增強儲存期間之蛋白質穩定性並提供適於直接遞送至中樞神經系統之調配物。

下文將首先定義某些術語以便更容易地理解本發明。以下術語及其他術語之其他定義陳述於說明書通篇中。

改善：本文所用之術語「改善」意指個體狀況之預防、減弱或緩解，或狀況之改良。改善包括(但不要求)病況(例如亨特氏症(Hunter's Disease))之完全恢復或完全預防。在一些實施例中，改善包括增加相關疾病組織中缺陷之相關蛋白質(例如艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之含量或提高其活性程度。

生物活性：本文所用之片語「生物活性」係指在生物系統中且尤其在生物體中具有活性之任一藥劑之特徵。例如，在投與生物體時對該生物體具有生物效應之藥劑視為具有生物活性。在特定實施例中，倘若蛋白質或多肽具有生物活性，則該蛋白質或多肽中共有蛋白質或多肽之至少一種生物活性的部分通常稱作「生物活性」部分。劑型：本文所用之術語「劑型」及「單位劑型」係指用於擬治療患者之治療性蛋白質(例如艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之物理離散單位。每一單位含有經計算以產生期望治療效果之預定量之活性物質。然而，應理解，組合物之總劑量應由主治醫師在合理的醫學判斷範圍內確定。

改良、增加或降低：本文所用之術語「改良」、「增加」或「降低」或語法等效詞表示相對於基線量測(例如相同個體在開始本文所述治療前之量測、或對照個體(或多個對照個體)在不存在本文所述治療時之量測)之值。「對照個體」係患有與所治療個體相同之溶酶體貯積症形式(例如，溶酶體貯積症)之個體，其與所治療個體之年齡大致相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當)。個體(individual,subject)、患者：本文所用之術語「個體(subject,individual)」或「患者」係指人類或非人類哺乳動物個體。所治療個體(individual)(亦稱作「患者」或「個體(subject)」)係罹患疾病(例如，亨特氏症)之個體(胎兒、幼兒、兒童、少年或成人)。

連接體：本文所用之術語「連接體」係指融合蛋白中不在天然蛋白質中特定位置出現且通常經設計以具有撓性或將結構(例如a-螺旋)插入兩個蛋白質部分之間的胺基酸序列。連接體亦稱作間隔體。多肽：一般而言，本文所用之「多肽」係至少兩個藉由肽鍵彼此附接之胺基酸之串。在一些實施例中，多肽可包括至少3至5個胺基酸，每一胺基酸藉助至少一個肽鍵附接至其他胺基酸。熟習此項技術者應瞭解，多肽有時視情況包括「非天然」胺基酸或仍然能整合至多肽鏈中之其他實體。

可溶的：本文所用之術語「可溶的」係指治療劑能夠形成均質溶液。在一些實施例中，治療劑於溶液中之溶解性足以容許將治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點，其中將治療劑投與該溶液中並藉由該溶液轉運至目標作用位點(例如，腦細胞及組織)。數個因素可影響治療劑之溶解性。例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基酸序列及存在其他輔助溶解劑(co-solubilizing agent)或鹽(例如鈣鹽)。在一些實施例中，該等醫藥組合物經調配而使該等組合物不包含鈣鹽。在一些實施例中，本發明治療劑可溶於其對應醫藥組合物中。應瞭解，儘管通常對於非經腸投與藥物而言等滲溶液係較佳的，但使用等滲溶液可能限制一些治療劑且尤其一些蛋白質及/或酵素之充分溶解。已證實輕微高滲溶液(例如，高達175 mM氯化鈉存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)及含糖溶液(例如，高達2%蔗糖存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)在猴子中具有良好耐受性。例如，最常見之經批准CNS團注調配組合物係鹽水(150 mM NaCl水溶液)。

穩定性：本文所用之術語「穩定的」係指治療劑(例如，重組酵素)能夠在較長時間內保持其治療功效(例如，其預期生物活性及/或生理化學完整性(physiochemical integrity)之全部或大部分)。可在較長時間內(例如，持續至少1個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、30個月、36個月或更長時間)評定治療劑之穩定性及醫藥組合物保持該治療劑之穩定性的能力。一般而言，本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定與其一起調配之一或多種治療劑(例如，重組蛋白質)，或另一選擇為減緩或阻止其降解。在調配物之情形下，穩定調配物係其中之治療劑在儲存後及在處理(例如冷凍/解凍、機械混合及凍乾)期間基本上保持其物理及/或化學完整性及生物活性者。對於蛋白質穩定性而言，其可藉由高分子量(HMW)聚集體之形成、酵素活性之損失、肽片段之產生及電荷曲線之移位來量測。

個體：本文所用之術語「個體」意指任何哺乳動物，包括人類。在本發明之某些實施例中，個體係成年、少年或幼兒。本發明亦涵蓋在子宮內投與該等醫藥組合物及/或實施該等治療方法。實質同源性：片語「實質同源性」在本文中用於指胺基酸或核酸序列之間之比較。如彼等熟習此項技術者所瞭解，兩個序列若在對應位置中含有同源殘基，則通常將其視為「實質上同源」。同源殘基可為相同殘基。或者，同源殘基可為具有合適的類似結構及/或功能特徵之不同殘基。例如，如彼等熟習此項技術者所熟知，通常將某些胺基酸歸類為「疏水性」或「親水性」胺基酸及/或具有「極性」或「非極性」側鏈。一種胺基酸取代為相同類型之另一種胺基酸通常可視為「同源」取代。

如業內所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式(例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位BLAST及PSI-BLAST)中獲得者。該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J. Mol. Biol.,215(3)：403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；及Misener等人(編輯)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press,1999。除鑑別同源序列外，上述程式通常亦指示同源性程度。在一些實施例中，若兩個序列在相關殘基延伸部分上有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的對應殘基同源，則將其視為實質上同源。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個或更多個殘基。

實質一致性：片語「實質一致性」在本文中用於指胺基酸或核酸序列之間之比較。如熟習此項技術者所瞭解，兩個序列若在對應位置中含有相同殘基，則通常將其視為「實質上一致」。如業內所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式(例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位BLAST及PSI-BLAST)中獲得者。該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool,J. Mol. Biol.,215(3): 403-410,1990；Altschul等人，Methods in Enzymology；Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997；Baxevanis等人，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；及Misener等人(編輯)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press,1999。除鑑別一致序列外，上述程式通常亦指示一致性程度。在一些實施例中，若兩個序列在相關殘基延伸部分上有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的對應殘基一致，則將其視為實質上一致。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500個或更多個殘基。

適於遞送至CNS中：當關於本發明醫藥組合物時，本文所用之片語「適於遞送至中樞神經系統中」或「適於遞送至CNS中」通常係指該等組合物之穩定性、耐受性及溶解性特性以及該等組合物將其中含有之有效量之治療劑遞送至目標遞送位點(例如，CSF或腦)的能力。在一些實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。在一些實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性且能夠溶解其中含有之治療劑，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。

治療性部分：本文所用之術語「治療性部分」係指分子中賦予分子之治療效果的部分。在一些實施例中，治療性部分係具有治療活性之多肽。例如，本發明治療性部分可為可取代天然Naglu蛋白質之多肽。在一些實施例中，本發明治療性部分可為可挽救一或多種與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶缺陷有關之表型的多肽。在一些實施例中，本發明治療性部分可治療亨特氏症患者之一或多種症狀。治療有效量：本文所用之術語「治療有效量」係指治療性蛋白質(例如艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)以適用於任一醫學治療之合理益處/風險比賦予所治療個體治療效果之量。治療效果可為客觀性(即可藉由某種測試或標記測量)或主觀性(即個體給予效果之指示或感覺)。「治療有效量」特別指治療性蛋白質或組合物藉由例如改善與疾病有關之症狀、預防或延遲疾病之發作、及/或亦降低疾病症狀之嚴重程度或頻率來有效治療、改善或預防期望疾病或病狀、或呈現可檢測之治療或預防效果的量。治療有效量通常以可包含多個單位劑量之給藥方案投與。對於任一特定治療性蛋白質而言，治療有效量(及/或在有效給藥方案內之適合單位劑量)可視例如投與途徑、與其他醫藥劑之組合而變化。此外，任一特定患者之特定治療有效量(及/或單位劑量)可視多種因素而定，包括所治療病症及該病症之嚴重程度；所用特定醫藥劑之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所用特定融合蛋白之投與時間、投與途徑及/或排泄或代謝速率；治療持續時間；及醫學技術內熟知之類似因素。可耐受的：本文所用之術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物在投與該組合物之個體中不引發不良反應或者在投與該組合物之個體中不引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中有良好耐受性。

治療(treatment)：本文所用之術語「治療(treatment)」(及treat或treating)係指任何投與治療性蛋白質(例如溶酶體酵素)以部分或完全地減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病症及/或病狀(例如亨特氏症)之一或多種症狀或特徵，延遲其發作，降低其嚴重程度及/或降低其發生率。該治療可針對不呈現相關疾病、病症及/或病狀之體徵之個體及/或針對僅呈現該疾病、病症及/或病狀之早期體徵之個體。或者或另外，該治療可針對呈現相關疾病、病症及/或病狀之一或多種確立體徵之個體。

本發明尤其係關於經腦脊髓膜內投與溶酶體酵素來有效治療溶酶體貯積症。在一些實施例中，本發明提供用於IT遞送艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之穩定調配物。在某些實施例中，本文所述醫藥組合物之特徵在於能夠將一或多種用於治療諸如溶酶體貯積症(例如，A型聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良)等疾病之治療劑(例如，以重組方式製備之酵素，例如乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶(iduronidase)、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶及/或半乳糖腦苷酶)有效遞送至特定目標細胞及組織(例如，以下中之一或多者：灰質、白質、大腦皮質、小腦、普爾欽細胞、小腦中之普爾欽細胞、少突膠質細胞、少突膠質細胞溶酶體以及CNS中之其他特定組織及細胞類型)。

在某些實施例中，該等醫藥組合物能夠使一或多種治療劑(例如，乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶及/或半乳糖腦苷酶)分佈至CNS之特定細胞及/或組織中，由此治療具有CNS後遺症、表現或病因之疾病(例如，亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群)。投與該等醫藥組合物可藉由(例如)調節與該疾病有關之病理來治療或解決該疾病，例如，藉由減少或減弱受溶酶體貯積症侵襲之個體CNS中之細胞空泡形成及/或斑馬細胞(zebra cell)的數量及/或尺寸。

該等醫藥組合物可包括一或多種治療劑及一或多種緩衝劑。在該等醫藥組合物之某些實施例中，治療劑可溶於該組合物中，該組合物係穩定的且該組合物在經腦脊髓膜內投與該個體時耐受。在一些實施例中，可將醫藥組合物凍乾。該等組合物包含一或多種治療劑、一或多種緩衝劑、一或多種表面活性劑及一或多種滲透壓調節劑。該等凍乾醫藥組合物可使用稀釋劑(例如，無菌水、注射用抑菌水及/或無菌鹽水溶液)加以復原(reconstituted)以使組合物適於投與至個體，且尤其適於將治療劑遞送至該個體之中樞神經系統。若治療劑可溶於某些實施例之水性及凍乾醫藥組合物中，組合物係穩定的且組合物在經腦脊髓膜內投與個體時耐受，則可認為該等組合物適於將治療劑遞送至該個體之中樞神經系統中。

在一些實施例中，水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)具有低pH及低磷酸鹽含量。例如，該組合物之pH可呈酸性或小於約7或8。在其他實施例中，該等水性及凍乾醫藥組合物具有小於約10 mM、小於約20 mM或小於約30 mM之磷酸鹽含量。水性及凍乾醫藥調配物中之預期治療劑包括蛋白質及/或酵素，其或者可以重組方式加以製備。適宜酵素包括溶酶體酵素(例如，α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A及半乳糖腦苷酶)。較佳地，該等酵素可溶於醫藥組合物中。在一些特定實施例中，該等蛋白質及/或酵素不包含修飾(例如，會使該蛋白質更穩定或促進該蛋白質通過BBB之修飾)。

某些實施例係關於適於將治療有效量之蛋白質或酵素(例如，α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、半乳糖腦苷酶或艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)經腦脊髓膜內遞送至個體中樞神經系統、且具體而言個體中樞神經系統內之某些細胞、組織或細胞器之水性及凍乾醫藥組合物。例如，某些實施例係關於包含艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、約154 mM氯化鈉及約0.005%之聚山梨醇酯20之低pH(例如，約6)組合物。在某些實施例中，該等水性醫藥組合物之特徵在於能夠分佈至個體之腦組織及/或細胞中。例如，本發明醫藥組合物能夠分佈至該個體之大腦皮質、尾狀核及豆狀核殼、丘腦、灰質、小腦、神經元及/或普爾欽細胞中。在其他實施例中，該等醫藥組合物促進其中包含之一或多種治療劑(例如，用於治療溶酶體貯積症之酵素)之細胞定位。例如，在某些實施例中，該等醫藥組合物促進或展示治療劑之細胞定位，由此該治療劑容易地分佈至患病或目標細胞(例如，患有諸如亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良等溶酶體貯積症之個體中的神經元及/或少突膠質細胞)中。在一些特定實施例中，該等水性醫藥組合物促進或促使其中含有之治療劑分佈至目標細胞或組織之一或多種特定細胞器(例如，溶酶體)中。在其他實施例中，該等醫藥組合物能夠客觀地改良、改變或調節一或多種疾病(例如溶酶體貯積症)之臨床病程。例如，在一些實施例中、該等醫藥組合物減少受侵襲個體(例如，患有亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良之個體)之腦組織中之細胞空泡形成。在其他實施例中，該等醫藥組合物減少受溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)侵襲之個體之腦組織中特有的柵狀片層體(palisaded lamellar body)或「斑馬體(zebra body)」的存在。

在某些實施例中，該等醫藥組合物引起或展示一或多種通常與溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良)有關之病理或生物標記之存在或積聚的減少(例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多減少)或完全消除。具體而言，該等醫藥組合物引起或展示CNS細胞及組織(例如，神經元及/或少突膠質細胞)中之病理或生物標記的減少或消除。例如，在一些實施例中，在投與個體後，該等醫藥組合物展示或達成個體CNS細胞及組織(例如，大腦皮質、白質及/或丘腦)中之生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)之積聚的減少。在一些實施例中，本發明係關於減少或消除一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之存在或積聚的方法。類似地，一些實施例係關於增加一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之降解(或降解速率)的方法。

在其他實施例中，水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)具有小於約30 mg/mL或介於約10-20 mg/mL之間之蛋白質濃度。該等醫藥組合物之劑量體積通常小於約5.0 mL且較佳小於約3.0 mL。

在某些實施例中，在投與醫藥組合物後，在目標細胞及組織(例如，腦組織或CSF)中檢測到治療濃度的其中含有之治療劑。例如，在投與後(例如，在經腦脊髓膜內投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，醫藥組合物在個體之CNS組織中達到至少30 μg/ml之濃度。在另一實施例中，醫藥組合物在個體之目標組織或細胞(例如，腦組織或神經元)中達到至少20 μg/ml、至少15 μg/ml、至少10 μg/ml、至少7.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少2.5 μg/ml、至少1 μg/ml或至少0.5 μg/ml之濃度。在一些涵蓋的實施例中，蛋白質在該醫藥組合物中穩定(例如在室溫下穩定至少十二個月)。本發明亦涵蓋水性(及在復原時之凍乾)醫藥組合物，其中緩衝劑係以足以使組合物之pH保持介於約5.0與約8.0之間的量存在。在某些實施例中，存在於水性醫藥組合物中之緩衝劑係磷酸鈉，且係以足以使組合物之pH保持約7.0的量存在。適宜緩衝劑之實例包括乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽及Tris。

水性醫藥組合物可進一步包含一或多種滲透壓調節劑，其可為鹽或糖(例如蔗糖、葡萄糖、甘露醇及氯化鈉)。在滲透壓調節劑係蔗糖之情形下，其可以小於約3.0%(w/v)之濃度存在。水性醫藥組合物可進一步包含一或多種表面活性劑(例如非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)。表面活性劑聚山梨醇酯20或80可以小於約0.04%(w/v)或小於約0.005%(w/v)之濃度存在於水性組合物及凍乾組合物中。在一些特定實施例中，水性及凍乾醫藥組合物包含磷酸鈉、聚山梨醇酯20及蔗糖以及重組蛋白質。

某些實施例之水性(及在復原時之凍乾)醫藥組合物較佳經調配使得治療劑不會自組合物沉澱出來。在某些實施例中，該等組合物不含鈣或其鹽。較佳係投與個體後隨時間不展示嚴重不良臨床體徵或反應之組合物。在一個較佳實施例中，該等水性醫藥組合物適於將治療劑遞送至個體之腦脊髓液及/或經腦脊髓膜內遞送，因此在投與該個體後治療劑分佈至該個體之腦組織(例如大腦皮質、小腦及/或大腦)中。因此，某些實施例之水性及凍乾醫藥組合物較佳係滅菌的且利用適當無菌技術投與個體。

本發明亦涵蓋治療患有特徵在於一或多種溶酶體酵素之含量降低之疾病(例如，亨特氏症候群、B型聖菲利波症候群或異染性腦白質營養不良)之個體的方法以及治療患有具有中樞神經系統病因或表現之疾病之個體的方法。在每一情形下，該等方法涵蓋投與本文所述之水性及凍乾醫藥組合物。該疾病可包括(例如)A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良。某些實施例係關於改良、治癒或調節疾病(例如溶酶體貯積症)之進展的方法。具體而言，該等實施例係關於治療被描述成具有一或多種CNS表現之疾病(例如，亨特氏症候群)的方法。例如，在某些實施例中，本發明所揭示方法係關於在向個體(例如，患有亨特氏症候群之個體)經腦脊髓膜內投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶後減少受侵襲個體腦組織中之細胞空泡形成。在另一實施例中，本發明所揭示方法係關於減少受溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群)侵襲之個體之腦組織中特有的柵狀片層體或「斑馬體」的存在。在一較佳實施例中，投與水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)之個體係人類。在另一實施例中，人類係新生兒。可直接將該等組合物投與至該個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內)。某些實施例亦包括調配適於將治療劑遞送至個體中樞神經系統中之醫藥組合物的方法。該等方法通常包含評定該治療劑於該醫藥組合物中之溶解性、評定該治療劑於該醫藥組合物中之穩定性及評定該醫藥組合物在經腦脊髓膜內投與個體後之耐受性。

本文所述組合物及方法尤其可用於治療一或多種溶酶體貯積症之神經及軀體後遺症。例如，一些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)以治療溶酶體貯積症(例如，A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良)之CNS或神經後遺症及表現的組合物及方法。某些實施例亦包括治療患有溶酶體貯積症之個體的方法，其中該等方法包含治療該溶酶體貯積症之CNS或神經後遺症及表現的步驟(例如，藉由將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中)及治療該溶酶體貯積症之軀體或全身後遺症及表現的步驟(例如，藉由將一或多種治療劑非經腸、經靜脈內、經口、局部或藉由吸入投與至個體)。例如，可將組合物經腦脊髓膜內投與至個體，由此將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中並治療神經後遺症，外加靜脈內投與一或多種治療劑以將該等治療劑遞送至全身循環之細胞及組織(例如，心臟、肺、肝、腎或淋巴結之細胞及組織)中，由此治療軀體後遺症。例如，可向患有溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)或受該疾病侵襲之個體每月一次經腦脊髓膜內投與包含一或多種治療劑(例如，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之醫藥組合物以治療神經後遺症，並且每週一次經靜脈內向該個體投與相同或不同治療劑以治療全身或軀體表現。

在一些實施例中，本發明提供治療具有CNS病因之溶酶體貯積症的方法，其藉由向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與治療有效量之重組溶酶體酵素來實施。在一些實施例中，本發明可用於治療選自以下疾病之溶酶體貯積症：異染性腦白質營養不良、A型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、黏多糖貯積症、B型聖菲利波症候群或球樣細胞性腦白質營養不良。在一些實施例中，適於本發明之溶酶體酵素選自芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶或半乳糖腦苷酶。

某些實施例至少部分係基於以下發現：本文所揭示醫藥組合物促進一或多種治療劑(例如，以重組方式製備之酵素)有效遞送及分佈至CNS之特定(例如，目標)組織、細胞及/或細胞器中。某些實施例之醫藥組合物及調配物能夠溶解高濃度之治療劑(例如，蛋白質或酵素)，且適於將該等治療劑遞送至個體之CNS中以治療具有CNS成份(component)及/或病因之疾病。本文所述組合物之特徵進一步在於投與需要其之個體之CNS(例如，經腦脊髓膜內)後具有改良之穩定性及改良之耐受性。

治療性蛋白質

適於本發明之治療性部分可為可取代天然存在之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質活性或挽救一或多種與I2S缺陷有關之表型或症狀的任一分子或分子之一部分。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係具有與成熟人類I2S蛋白質實質上類似或相同之N-末端及C-末端以及胺基酸序列之多肽。

通常，人類I2S之前體形式含有信號肽(全長前體之胺基酸殘基1-25)、前肽(全長前體之胺基酸殘基26-33)及可進一步加工成42 kDa鏈(全長前體之殘基34-455)及14 kDa鏈(全長前體之殘基446-550)的鏈(全長前體之殘基34-550)。通常，該前體形式亦稱為全長前體或全長I2S蛋白質，其含有550個胺基酸。典型野生型或天然存在人類I2S蛋白質之信號肽經移除之成熟形式(SEQ ID NO:1)以及全長前體(SEQ ID NO:2)的胺基酸序列顯示於表1中。

因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係成熟人類I2S蛋白質(SEQ ID NO:1)。在一些實施例中，適宜治療性部分可為成熟人類I2S蛋白質之同源物或類似物。例如，成熟人類I2S蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之I2S蛋白質(例如，SEQ ID NO:1)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入同時保持實質I2S蛋白質活性之經修飾成熟人類I2S蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟人類I2S蛋白質(SEQ ID NO:1)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟人類I2S蛋白質(SEQ ID NO:1)實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有成熟人類I2S蛋白質之片段或部分。

或者，適於本發明之治療性部分係全長I2S蛋白質。在一些實施例中，適宜治療性部分可為全長人類I2S蛋白質之同源物或類似物。例如，全長人類I2S蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之全長I2S蛋白質(例如，SEQ ID NO:2)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入同時保持實質I2S蛋白質活性之經修飾全長人類I2S蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與全長人類I2S蛋白質(SEQ ID NO:2)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與SEQ ID NO:2實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之肽基酸序列與SEQ ID NO:2至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有全長人類I2S蛋白質之片段或部分。本文所用之全長I2S蛋白質通常含有信號肽序列。

在一些實施例中，治療性蛋白質包括靶向部分(例如，溶酶體靶向序列)及/或膜穿透肽。在一些實施例中，靶向序列及/或膜穿透肽係治療性部分之固有部分(例如，經由化學連接、經由融合蛋白)。在一些實施例中，靶向序列含有甘露糖-6-磷酸鹽部分。在一些實施例中，靶向序列含有IGF-I部分。在一些實施例中，靶向序列含有IGF-II部分。

在一些實施例中，治療劑(例如，蛋白質及酵素)之特徵進一步在於未對其進行修飾以增強該等治療劑遞送或轉運跨過BBB及遞送或轉運至CNS中。例如，該等治療劑不依賴於利用主動轉運機制(例如受體介導之轉運)，由此大分子通過以固有主動轉運系統作為促進該等治療劑遞送跨過BBB之方式而被主動轉運跨過BBB。

調配物

傳統用於將治療劑遞送至個體之CNS中之水性醫藥溶液及組合物包括不含緩衝劑之等滲鹽水及Elliott's B溶液(其為人造CSF)。描述CSF相對於Elliott's B溶液之組成之比較包括於下表2中。如表2中所示，Elliot's B溶液之濃度接近等同於CSF之濃度。然而，Elliott's B溶液含有非常低之緩衝劑濃度，且因此可能不能提供穩定治療劑(例如，蛋白質)所需要之足夠緩衝能力，尤其在較長時間內(例如，在儲存條件期間)。此外，Elliott's B溶液含有某些可能與意欲遞送一些治療劑且尤其蛋白質或酵素之調配物不相容的鹽。例如，存在於Elliott's B溶液中之鈣鹽能夠介導蛋白質沉澱且由此降低調配物之穩定性。

本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定與其一起調配之一或多種治療劑(例如，重組蛋白質)，或另一選擇為減緩或阻止其降解。本文所用之術語「穩定的」係指治療劑(例如，重組酵素)能夠在較長時間內保持其治療功效(例如，其預期生物活性及/或生理化學完整性之全部或大部分)。可在較長時間內(例如，較佳持續至少1個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、30個月、36個月或更長時間)評定治療劑之穩定性及醫藥組合物保持該治療劑之穩定性的能力。在調配物之情形下，穩定調配物係其中之治療劑在儲存後及在處理(例如冷凍/解凍、機械混合及凍乾)期間基本上保持其物理及/或化學完整性及生物活性者。對於蛋白質穩定性而言，其可藉由高分子量(HMW)聚集體之形成、酵素活性之損失、肽片段之產生及電荷曲線之移位來量測。治療劑之穩定性對於保持使該治療劑起到其預期治療功能所需要之特定治療劑濃度範圍特別重要。可在較長時間內相對於治療劑之生物活性或生理化學完整性進一步評定治療劑之穩定性。例如，可對照早期時間點(例如，調配後第0天)之穩定性或對照未經調配治療劑比較給定時間點之穩定性，且該比較之結果以百分比表示。較佳地，本發明醫藥組合物在較長時間內保持治療劑生物活性或生理化學完整性之至少100%、至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%(例如，如在至少約6-12個月內於室溫下或在加速儲存條件下所量測)。

該等治療劑較佳可溶於本發明醫藥組合物中。當關於本發明治療劑時，術語「可溶的」係指該等治療劑能夠形成均質溶液。較佳地，治療劑於溶液中之溶解性足以容許將治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點，其中將治療劑投與至該溶液中並藉由該溶液轉運至目標作用位點(例如，腦細胞及組織)。數個因素可影響治療劑之溶解性。例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基酸序列及存在其他輔助溶解劑或鹽(例如鈣鹽)。在一些實施例中，該等醫藥組合物經調配而使該等組合物不包含鈣鹽。

適於凍乾之調配物可含有不同濃度之所關注治療劑。在一些實施例中，調配物可含有濃度在約1 mg/ml至100 mg/ml(例如，約1 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至60 mg/ml、1 mg/ml至70 mg/ml、1 mg/ml至80 mg/ml、1 mg/ml至90 mg/ml、1 mg/ml至100 mg/ml、25 mg/ml至100 mg/ml、50 mg/ml至100 mg/ml)範圍內之所關注蛋白質或治療劑。在一些實施例中，適於凍乾之調配物可含有濃度為約25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml及100 mg/ml之所關注蛋白質。

儘管通常對於非經腸投與藥物而言等滲溶液係較佳的，但使用等滲溶液可能限制一些治療劑且尤其一些蛋白質及/或酵素之充分溶解。已證實輕微高滲溶液(例如，高達175 mM氯化鈉存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)及含糖溶液(例如，高達2%蔗糖存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)在猴子中具有良好耐受性。最常見之經批准CNS團注調配組合物係鹽水(150 mM NaCl水溶液)。先前已測試數種組合物且展示較差之安全性特徵(safety profile)。(von Specht BU等人，Neurology(1979) 29:848-854；Grondin R等人，Brain(2002) 125:2191-2201；Gill SS等人，Nature Medicine(2003) 9(5):589-95；Hood DD等人，Anesthesiology(1995) 82(2): 331-43；Sakura SM等人，Anesthesiology(1997) 87(4):771-8；Bisenach JC等人，Pain(2002) 99:599-604；King H等人，Can J Anaesth(1993) 40(5):431-4；Rane K等人，Anesthesiology(1998) 89(5):1108-15；Steven RA等人，Anesthesiology(1993) 78(3):492-7；Dominiquez AR等人，Clin Transl Oncol(2005) 7(6): 232-8；Kim S等人，J. Clin. Oncology(1993) 11(11):2186-2193；Shulman M等人，Reg Anesth(1990)15(3):142-6；Shulman M等人，Reg Anesth Pain Med(1998)23(4):395-401)。

本發明醫藥組合物之特徵在於其耐受性。本文所用之術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物不在投與該組合物之個體中引發不良反應或另一選擇為不在投與該組合物之個體中引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中具有良好耐受性。許多治療劑且尤其本發明之蛋白質及酵素需要受控pH及特定賦形劑以在本發明醫藥組合物中保持其溶解性及穩定性。下表3給出認為可保持本發明蛋白質治療劑之溶解性及穩定性之蛋白質調配物的典型實例性態樣。

醫藥組合物之pH係能夠改變治療劑(例如，酵素或蛋白質)於水性醫藥組合物中之溶解性的另一因素，且因此本發明醫藥組合物較佳包含一或多種緩衝劑。在一些實施例中，水性醫藥組合物包含足以使該組合物之最佳pH保持介於約4.0-8.0之間、介於約5.0-7.5之間、介於約5.5-7.0之間、介於約6.0-7.0之間及介於約6.0-7.5之間的量之緩衝劑。在其他實施例中，緩衝劑包含約5-50 mM之磷酸鈉且足以使該水性醫藥組合物之最佳pH保持在約7.0。適宜緩衝劑包括(例如)乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸及叁(羥甲基)胺基甲烷(「Tris」)。本發明醫藥組合物之緩衝劑濃度及pH範圍在使於成年及幼年猴子中給藥時調配物耐受性最大化中係重要因素。緩衝劑濃度可為約1 mM至約30 mM或約3 mM至約20 mM，此端視(例如)緩衝劑及調配物之期望等滲性而定。在一些實施例中，適宜緩衝劑係以約1 mM、5 mM、10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM或50 mM之濃度存在。

在一些實施例中，調配物含有等滲劑以使調配物保持等滲。通常，所謂「等滲」意指所關注調配物具有與人類血液基本上相同之滲透壓。等滲調配物通常會具有約240 mOsm/kg至約350 mOsm/kg之滲透壓。等滲性可使用(例如)蒸氣壓或冰點型滲透壓計來量測。實例性等滲劑包括(但不限於)甘胺酸、山梨醇、甘露醇、氯化鈉及精胺酸。在一些實施例中，適宜等滲劑可以按重量計約0.01-5%(例如，0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%或5.0%)之濃度存在於預凍乾調配物中。在一些實施例中，用於凍乾之調配物含有等滲劑以使預凍乾調配物或復原調配物保持等滲。

在一些實施例中，調配物可含有穩定劑以保護蛋白質。通常，適宜穩定劑係非還原性糖，例如蔗糖、棉子糖、海藻糖或胺基酸(例如甘胺酸、精胺酸及甲硫胺酸)。凍乾調配物中穩定劑之量通常應使調配物等滲。然而，高滲復原調配物亦可適宜。另外，穩定劑之量不應過低而使治療劑發生不可接受之程度的降解/聚集。調配物中之實例性穩定劑濃度可介於約1 mM至約400 mM(例如，約30 mM至約300 mM及約50 mM至約100 mM)、或另一選擇為以重量計0.1%至15%(例如，1%至10%、5%至15%、5%至10%)之範圍內。在一些實施例中，穩定劑與治療劑之質量量之比率係約1:1。在其他實施例中，穩定劑與治療劑之質量量之比率可為約0.1:1、0.2:1、0.25:1、0.4:1、0.5:1、1:1、2:1、2.6:1、3:1、4:1、5:1、10:1或20:1。在一些實施例中，適於凍乾之穩定劑亦為凍乾保護劑。

儘管本發明醫藥組合物在投與個體時通常呈水性形式，但在一些實施例中本發明醫藥組合物係凍乾的。該等組合物在投與個體之前需藉由向其中添加一或多種稀釋劑加以復原。適宜稀釋劑包括(但不限於)無菌水、注射用抑菌水及無菌鹽水溶液。較佳地，在復原醫藥組合物後，其中含有之治療劑穩定，易溶解且在投與個體後展示耐受性。

在一些實施例中，適於凍乾之調配物可進一步包括一或多種增積劑。「增積劑」係增加凍乾混合物之體積並有助於凍乾餅之物理結構的化合物。例如，增積劑可改良凍乾餅之外觀(例如，基本上均勻之凍乾餅)。適宜增積劑包括(但不限於)氯化鈉、乳糖、甘露醇、甘胺酸、蔗糖、海藻糖、羥乙基澱粉。增積劑之實例性濃度係約1%至約10%(例如，1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%及10.0%)。

本發明之醫藥組合物、調配物及相關方法可用於將多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)及用於治療有關疾病。本發明醫藥組合物尤其可用於將蛋白質及酵素(例如，酵素替代療法)遞送至患有溶酶體貯積症之個體中。溶酶體貯積症係由溶酶體功能障礙引起之一類相對罕見之遺傳性代謝病症。溶酶體疾病之特徵在於溶酶體內積聚未消化之大分子，此導致該等溶酶體之尺寸及數量增加且最終導致細胞功能障礙及臨床異常。

在一些實施例中，期望將表面活性劑添加至調配物中。實例性表面活性劑包括非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20或80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸鈉(SDS)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂基-磺基甜菜鹼；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-或硬脂基-肌胺酸；亞油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基-甜菜鹼；月桂醯胺丙基-、椰油醯胺丙基-、亞油醯胺丙基-、肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚油醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-甜菜鹼(例如，月桂醯胺丙基甜菜鹼)；肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚油醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基-二甲胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或甲基油醯基牛磺酸鈉；及MONAQUAT^TM系列(Mona Industries公司，Paterson,N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物(例如，Pluronics、PF68等)。通常，所添加表面活性劑之量應可減少蛋白質之聚集並使微粒或起泡之形成最小化。例如，表面活性劑可以約0.001-0.5%(例如，約0.005-0.05%或0.005-0.01%)之濃度存在於調配物中。具體而言，表面活性劑可以約0.005%、0.01%、0.02%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%或0.5%等之濃度存在於調配物中。或者或另外，可將表面活性劑添加至凍乾調配物、預凍乾調配物及/或復原調配物中。

其他醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(例如闡述於Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中者)可包括於調配物(及/或凍乾調配物及/或復原調配物)中，前提為其不會不良地影響調配物之期望特徵。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)額外緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；螯合劑，例如EDTA；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；生物可降解聚合物，例如聚酯；及/或鹽形成抗衡離子，例如鈉。

本發明調配物可基於以下來評定：產品品質分析、復原時間(若凍乾)、復原品質(若凍乾)、高分子量、水分及玻璃轉變溫度。通常，蛋白質品質及產品分析包括產品降解速率分析，其係使用包括(但不限於)以下之方法來達成：尺寸排除HPLC(SE-HPLC)、陽離子交換-HPLC(CEX-HPLC)、X-射線繞射(XRD)、調幅式差示掃描量熱法(mDSC)、反相HPLC(RP-HPLC)、多角度光散射(MALS)、螢光、紫外線吸收、濁度測定法、毛細管電泳(CE)、SDS-PAGE及其組合。在一些實施例中，對本發明產品之評價可包括評價外觀(液體或餅外觀)之步驟。

通常，調配物(凍乾或水溶液)可在室溫下儲存較長時間。儲存溫度通常可介於0℃至45℃(例如，4℃、20℃、25℃、45℃等)之範圍內。調配物可儲存數月時間至數年時間。儲存時間通常可為24個月、12個月、6個月、4.5個月、3個月、2個月或1個月。調配物可直接儲存於用於投與之容器中，以省去轉移步驟。調配物可直接儲存於亦可用作復原器皿之凍乾容器(若凍乾)中，以省去轉移步驟。或者，凍乾產品調配物可量測成較小子樣(increment)以便儲存。儲存通常應避免導致蛋白質降解之環境，包括(但不限於)暴露於陽光、UV輻射、其他形式之電磁輻射、過熱或過冷、快速熱衝擊及機械衝擊。

亨特氏症候群及其他溶酶體貯積症之治療

溶酶體貯積症係由溶酶體功能障礙引起之一類相對罕見之遺傳性代謝病症。溶酶體疾病之特徵在於溶酶體內積聚未消化之大分子(包括酵素受質)(見表1)，此導致該等溶酶體之尺寸及數量增加且最終導致細胞功能障礙及臨床異常。

本文所述之本發明方法可有利地促進一或多種治療劑(例如，一或多種替代酵素)遞送至目標細胞器中。例如，由於溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)之特徵在於受侵襲細胞之溶酶體中積聚糖胺聚多糖(GAG)，故對於治療溶酶體貯積症而言溶酶體係期望的目標細胞器。本發明方法及本發明組合物尤其可用於治療具有CNS病因或成份之疾病。具有CNS病因或成份之溶酶體貯積症包括(例如且不限於)A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良。在本發明之前，傳統療法之侷限性在於其經靜脈內投與個體且通常僅可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。本發明組合物及方法可有利地直接投與至患有具有該CNS病因之疾病之個體的CNS中，由此在CNS之受侵襲細胞及組織(例如，腦)內達到治療濃度，從而克服與傳統的全身投與該等治療劑有關之限制。

在一些實施例中，本發明方法及本發明組合物可用於治療溶酶體貯積症之神經及軀體後遺症或症狀。例如，本發明之一些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)以治療溶酶體貯積症之CNS或神經後遺症及表現，同時亦治療該溶酶體貯積症之全身或軀體表現的組合物及方法。例如，可將一些本發明組合物經腦脊髓膜內投與至個體，由此將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中並治療神經後遺症，外加靜脈內投與一或多種治療劑以將該等治療劑遞送至全身循環之細胞及組織(例如，心臟、肺、肝、腎或淋巴結之細胞及組織)中，由此治療軀體後遺症。例如，可向患有溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)或受該疾病侵襲之個體至少每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次或更經常地經腦脊髓膜內投與包含一或多種治療劑(例如，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之醫藥組合物以治療神經後遺症，同時更頻繁地(例如，每天一次、每隔一天一次、每週三次或每週一次)經靜脈內向該個體投與不同治療劑以治療該疾病之全身或軀體表現。

亨特氏症候群或黏多糖貯積症II(MPS II)係由艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)缺陷引起之X-性聯遺傳性代謝病症。I2S定位於溶酶體內，且在糖胺聚多糖(GAG)乙醯肝素-及皮膚素-硫酸酯之分解代謝中起重要作用。在缺乏該酵素之情形下，該等受質積聚於細胞內，最終導致充滿，隨後細胞死亡及組織破壞。由於該酵素之廣泛表現，在MPS II患者中，多種細胞類型及器官系統遭受侵襲。此病症之定義性臨床特徵係中樞神經系統(CNS)變性，其導致認知損害(例如，IQ降低)。另外，受侵襲個體之MRI掃描已顯示白質損傷；腦實質、神經節、胼胝體及腦幹中之血管周間隙擴大；萎縮；及腦室擴大(Wang等人，Molecular Genetics and Metabolism，2009)。該疾病通常在生命頭幾年以器官巨大症及骨骼異常形式表現出來。一些受侵襲個體經歷認知功能之進行性損失，其中侵襲最嚴重之個體在十歲以內或十歲至二十歲時死於疾病相關併發症。

本發明組合物及方法可用於有效治療患有或易患亨特氏症候群之個體。本文所用之術語「治療(treat或treatment)」係指改善一或多種與疾病有關之症狀、預防或延遲疾病之一或多種症狀之發作及/或降低疾病之一或多種症狀之嚴重程度或頻率。在一些實施例中，治療係指在亨特氏症候群患者中部分或完全地緩和、改善、減緩、抑制神經損害、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或發生率。本文所用之術語「神經損害」包括與中樞神經系統(例如，腦及脊髓)之損害有關之各種症狀。神經損害之症狀可尤其包括(例如)認知損害；白質損傷；腦實質、神經節、胼胝體及/或腦幹中之血管周間隙擴大；萎縮；及/或腦室擴大。

在一些實施例中，治療係指各種組織中之溶酶體貯積(例如，GAG)減少。在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之溶酶體貯積減少。在某些實施例中，溶酶體貯積與對照相比減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，溶酶體貯積與對照相比減少至少1倍(fold)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些實施例中，溶酶體貯積係藉由溶酶體貯積顆粒(例如，具斑馬條紋形態)之存在來量測。溶酶體貯積顆粒之存在可藉由業內已知之各種方式(例如藉由組織學分析)來量測。

在一些實施例中，治療係指神經元(例如，含有普爾欽細胞之神經元)中之空泡形成減少。在某些實施例中，神經元中之空泡形成與對照相比減少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，空泡形成與對照相比減少至少1倍(fold)、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。空泡形成之存在及減少可藉由業內已知之各種方式(例如藉由組織學分析)來量測。

在一些實施例中，治療係指各種組織中之I2S酵素活性提高。在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之I2S酵素活性提高。在一些實施例中，I2S酵素活性與對照相比提高約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，I2S酵素活性與對照相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些實施例中，提高的I2S酵素活性為至少約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，腰區或腰區中之細胞中的I2S酵素活性提高。在一些實施例中，腰區中之提高的I2S酵素活性為至少約2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg、10,000 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，遠端脊髓或遠端脊髓之細胞中的I2S酵素活性提高。

在一些實施例中，治療係指認知能力損失之進展減慢。在某些實施例中，認知能力損失之進展與對照相比減慢約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，治療係指發育遲緩減輕。在某些實施例中，發育遲緩與對照相比減輕約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，治療係指存活(例如存活時間)延長。例如，治療可延長患者之預期壽命。在一些實施例中，本發明之治療可使患者之預期壽命與未經治療之患有類似疾病的一或多個對照個體之平均預期壽命相比延長超過約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約100%、約105%、約110%、約115%、約120%、約125%、約130%、約135%、約140%、約145%、約150%、約155%、約160%、約165%、約170%、約175%、約180%、約185%、約190%、約195%、約200%或更多。在一些實施例中，本發明之治療使患者之預期壽命與未經治療之患有類似疾病的一或多個對照個體之平均預期壽命相比延長超過約6個月、約7個月、約8個月、約9個月、約10個月、約11個月、約12個月、約2年、約3年、約4年、約5年、約6年、約7年、約8年、約9年、約10年或更長時間。在一些實施例中，本發明之治療使患者長期存活。本文所用之術語「長期存活」係指存活時間或預期壽命長於約40年、45年、50年、55年、60年或更長時間。

本文所用之術語「改良」、「增加」或「降低」表示相對於對照之值。在一些實施例中，適宜對照係基線量測，例如相同個體在開始本文所述治療前之量測、或對照個體(或多個對照個體)在不存在本文所述治療時之量測。「對照個體」係與所治療個體之年齡大致相同及/或性別相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當)之患有亨特氏症候群的個體。所治療個體(individual)(亦稱作「患者」或「個體(subject)」)係患有亨特氏症候群或具有罹患亨特氏症候群之可能的個體(胎兒、幼兒、兒童、少年或成人)。個體可具有殘留內源I2S表現及/或活性，或無可量測之活性。例如，患有亨特氏症候群之個體之I2S表現程度可為正常I2S表現程度的約30-50%以下、約25-30%以下、約20-25%以下、約15-20%以下、約10-15%以下、約5-10%以下、約0.1-5%以下。

在一些實施例中，該個體係最近診斷患有該疾病之個體。通常，早期治療(診斷後盡可能快地開始治療)對於使疾病之影響最小化及使治療之益處最大化而言係至關重要的。

投與

治療劑之腦脊髓膜內投與通常藉由腰椎穿刺術(即，緩慢團注)或經由座-導管(port-catheter)遞送系統(即，輸注或團注)來實施。使植入的導管連接至貯器(用於團注遞送)或輸注幫浦(植入或在外部)。導管最通常插入於腰椎板之間，且尖端向上穿過腦脊髓膜間隙至期望節段(通常為L3-L4)。儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與至脊髓周圍之腦脊髓膜內間隙中仍然為將治療劑直接且有效地遞送跨過BBB並遞送至下面的CSF中之最常見方式。(參見Kroin JS,Clin Pharmacokinet(1992) 22(5):319-326，其全部內容以引用方式併入本文中。)

相對於可經靜脈內投與至個體之體積，適於腦脊髓膜內投與之體積通常係治療具有CNS病因之某些疾病之特有障礙。治療劑之腦脊髓膜內遞送進一步受保持CSF組成之微妙平衡以及保持個體顱內壓所限制。例如，在人類中，治療劑之腦脊髓膜內團注遞送體積通常限於0.5-1 mL。(例如，參見Grouls RJE等人，General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery. Spinal Drug Delivery，第15章. Elsevier Science(Yaksh,TL編輯)1999，其全部內容以引用方式併入本文中。)此外，沒有自個體對應移除CSF，在人類中總腦脊髓膜內劑量體積限於小於3 mL。

本發明醫藥組合物亦可用於將治療劑經腦室內遞送至個體之CNS中(即，直接投與至腦室中)。腦室內遞送可經由Ommaya氏貯器或其他類似輸液座(access port)加以促進，該貯器或其他類似輸液座可植入於位於個體頭頂部在頭皮與骨膜之間之袋狀物中，其中導引導管直接放置於腦室中。(Nutts JG等人，Neurology(2003) 60:69-73.)本發明亦涵蓋將治療劑投與至小腦延髓池(cerebellomedullary cistern或cisterna magna)之CSF中，此方式可在(例如)動物物種中使用係由於與腦脊髓膜內或腦室內投與相比在小型齧齒類動物中使用此方式後勤方便。

本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)可藉由任一適當途徑投與。在一些實施例中，經靜脈內投與本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。熟習此項技術者應瞭解，腦脊髓膜內藥物遞送可由用於腦脊髓膜內遞送之許多機構組成。在一些實施例中，腦脊髓膜內藥物遞送可由腰椎注射組成。在一些實施例中，經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)經腦脊髓膜內投與本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。在一些實施例中，腦脊髓膜內藥物遞送可由與大腦室內(ICV)導管流體連通之微幫浦組成。在其他實施例中，腦脊髓膜內藥物遞送可由與導管流體連通之皮下輸液座組成。在此實施例中，經由具有大腦室內(ICV)導管之腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)經腦脊髓膜內投與本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。在此實施例中，輸液座與大腦室內(ICV)導管流體連通。在一些實施例中，經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)經腦脊髓膜內投與本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。若需要，可同時使用一種以上途徑。

本發明之水性醫藥組合物較佳以通常小於4.0 mL、小於3.0 mL、小於2.5 mL、小於2.0 mL、小於1.5 mL、小於1.0 mL、小於0.5 mL或小於0.25 mL劑量之體積投與個體。本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)係以治療有效量(即，在每隔一定時間投與時，藉由(例如)改善與疾病有關之症狀、預防該疾病或延遲其發作、及/或亦降低該疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病之劑量量，如上文所述)投與。本文所用之治療有效量亦稱作治療有效劑量或治療有效劑量量。對於疾病治療而言治療上有效的劑量將取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體內分析以有助於鑑別最佳劑量範圍。擬採用之準確劑量亦將取決於投與途徑及疾病之嚴重性，且應根據執業醫師之判斷及各患者之環境來確定。有效劑量可自得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推(例如，如由美國衛生及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services)食品與藥品管理局(Food and Drug Administration)及藥品評價與研究中心(Center for Drug Evaluation and Research)於「Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」,Pharmacology and Toxicology,2005年7月中所述，其全部內容以引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，治療有效量可為(例如)約0.01-25 mg/kg、約1-20 mg/kg、約4-20 mg/kg、約5-15 mg/kg、約5-10 mg/kg體重。

用於特定個體之有效劑量可端視個體需要隨時間而變化(例如，增加或降低)。例如，在身體性疾病或應力情況下，或若疾病症狀惡化，則可增加劑量量。

端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續投與治療有效量之本發明靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)。本文所用之以一「間隔」投與表示週期性投與治療有效量(與一次性劑量相區分)。該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在一些實施例中，本發明之靶向治療劑(或含有其之組合物或藥劑)係兩個月一次、每月一次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每日一次投與。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變化，此端視該個體之需要而定。例如，在身體性疾病或應力情況下，或若疾病症狀惡化時，則劑量間之間隔可縮短。

在投與某些實施例之醫藥組合物後，可在目標細胞及組織(例如，腦組織或CSF)中達到或檢測到其中含有之治療劑的治療濃度。在某些實施例中，在投與後(例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜內投與至個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，醫藥組合物在個體之CNS組織及細胞中達到至少30 μg/ml之濃度。

端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續投與治療有效量之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶。本文所用之以一「間隔」投與表示週期性投與治療有效量(與一次性劑量相區分)。該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在一些實施例中，治療劑係兩個月一次、每月一次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每日一次投與。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變化，此端視該個體之需要而定。例如，在身體性疾病或應力情況下，若抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則劑量間之間隔可縮短。

本文所用之術語「兩個月一次」意指每兩個月投與一次(即，每兩個月一次)；術語「每月一次」意指每月投與一次；術語「每三週一次」意指每三週投與一次(即，每三個週一次)；術語「每兩週一次」意指每兩週投與一次(即，每兩個週一次)；術語「每週一次」意指每週投與一次；且術語「每日一次」意指每天投與一次。

在某些實施例中，在投與個體後(例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜內投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，該等醫藥組合物在該個體之目標組織或細胞(例如，腦組織或神經元)中達到至少50 μg/ml、至少45 μg/ml、至少40 μg/ml、至少35 μg/ml、至少30 μg/ml、25 μg/ml、20 μg/ml、至少15 μg/ml、至少10 μg/ml、至少7.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少2.5 μg/ml、至少1.0 μg/ml或至少0.5 μg/ml之濃度。在某些實施例中，醫藥組合物中之治療劑之濃度為至少100 mg/mL、至少95 mg/mL、至少90 mg/mL、至少80 mg/mL、至少75 mg/mL、至少70 mg/mL、至少65 mg/mL、至少60 mg/mL、至少55 mg/mL、至少50 mg/mL、至少45 mg/mL、至少40 mg/mL、至少35 mg/mL、至少30 mg/mL、至少25 mg/mL、至少20 mg/mL、至少15 mg/mL、至少10 mg/mL、至少5 mg/mL、至少2.5 mg/mL、至少1 mg/mL或小於1 mg/mL。較佳地，該治療劑可溶於本發明醫藥組合物中。較佳地，本發明醫藥組合物在長時間內保持穩定(例如，在室溫下或另一選擇為在4-8℃之冷凍條件下穩定至少12個月)。

儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。

醫藥組合物係以治療有效量(即，在每隔一定時間投與時，藉由(例如)改善與疾病有關之症狀、預防該疾病或延遲其發作、及/或亦降低該疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病之劑量量，如上文所述)投與。本文所用之治療有效量亦稱作治療有效劑量或治療有效劑量量。對於疾病治療而言治療上有效的劑量將取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體內分析以有助於鑑別最佳劑量範圍，例如彼等在下文中例示者。擬採用之準確劑量亦將取決於投與途徑及疾病之嚴重性，且應根據執業醫師之判斷及各患者之環境來確定。例如，在一些實施例中，用於靜脈內投與之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶的治療有效量係用於腦脊髓膜內投與之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶的治療有效量的約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍、約10倍或更多倍。有效劑量可自得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推(例如，如由美國衛生及人類服務部(U.S. Department of Health and Human Services)食品與藥品管理局(Food and Drug Administration)及藥品評價與研究中心(Center for Drug Evaluation and Research)於「Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」,Pharmacology and Toxicology,2005年7月中所述，其全部內容以引用方式併入本文中)。

在一些實施例中，治療有效量可為(例如)大於約0.01 mg/kg體重、大於約0.05 mg/kg體重、大於約0.1 mg/kg體重、大於約0.5 mg/kg體重、大於約1.0 mg/kg體重、大於約1.5 mg/kg體重、大於約2.0 mg/kg體重、大於約2.5 mg/kg體重、大於約5.0 mg/kg體重、大於約7.5 mg/kg體重、大於約10 mg/kg體重、大於約12.5 mg/kg體重、大於約15 mg/kg體重、大於約17.5 mg/kg體重、大於約20 mg/kg體重、大於約22.5 mg/kg體重或大於約25 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效量可為約0.01-25 mg/kg體重、約0.01-20 mg/kg體重、約0.01-15m g/kg體重、約0.01-10 mg/kg體重、約0.01-7.5 mg/kg體重、約0.01-5 mg/kg體重、約0.01-4 mg/kg體重、約0.01-3 mg/kg體重、約0.01-2 mg/kg體重、約0.01-1.5 mg/kg體重、約0.01-1.0 mg/kg體重、約0.01-0.5 mg/kg體重、約0.01-0.1 mg/kg體重、約1-20 mg/kg體重、約4-20 mg/kg體重、約5-15 mg/kg體重、約5-10 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效量係約0.01 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重、約0.2 mg/kg體重、約0.3 mg/kg體重、約0.4 mg/kg體重、約0.5 mg/kg體重、約0.6 mg/kg體重、約0.7 mg/kg體重、約0.8 mg/kg體重、約0.9 mg/kg體重、約1.0 mg/kg體重、約1.1 mg/kg體重、約1.2 mg/kg體重、約1.3 mg/kg體重、約1.4 mg/kg體重、約1.5 mg/kg體重、約1.6 mg/kg體重、約1.7 mg/kg體重、約1.8 mg/kg體重、約1.9 mg/kg體重、約2.0 mg/kg體重、約2.5 mg/kg體重、約3.0 mg/kg體重、約4.0 mg/kg體重、約5.0 mg/kg體重、約6.0 mg/kg體重、約7.0 mg/kg體重、約8.0 mg/kg體重、約9.0 mg/kg體重、約10.0 mg/kg體重、約11.0 mg/kg體重、約12.0 mg/kg體重、約13.0 mg/kg體重、約14.0 mg/kg體重、約15.0 mg/kg體重、約16.0 mg/kg體重、約17.0 mg/kg體重、約18.0 mg/kg體重、約19.0 mg/kg體重、約20.0 mg/kg體重或更高。在一些實施例中，治療有效量不大於約30 mg/kg、不大於約20 mg/kg、不大於約15 mg/kg、不大於約10 mg/kg、不大於約7.5 mg/kg、不大於約5 mg/kg、不大於約4 mg/kg、不大於約3 mg/kg、不大於約2 mg/kg或不大於約1 mg/kg體重或更小。

用於特定個體之有效劑量可端視個體需要隨時間而變化(例如，增加或降低)。例如，在身體性疾病或應力情況下，或若抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則可增加劑量量。

在再一實例中，可在療程開始時給予負荷劑量(例如，初始較高劑量)之治療組合物，隨後投與降低之維持劑量(例如，後續較低劑量)之治療組合物。不期望受限於任何理論，預計負荷劑量會消除脂肪物質在組織中(例如，在肝中)之初始及(通常)大量積聚，且維持劑量可防止初始消除後脂肪物質之累積。

應瞭解，治療之負荷劑量及維持劑量量、間隔及持續時間可藉由任一可用方法來確定，例如本文中例示者及業內已知者。在一些實施例中，負荷劑量量為約0.01-1 mg/kg體重、約0.01-5 mg/kg體重、約0.01-10 mg/kg體重、約0.1-10 mg/kg體重、約0.1-20 mg/kg體重、約0.1-25 mg/kg體重、約0.1-30 mg/kg體重、約0.1-5 mg/kg體重、約0.1-2 mg/kg體重、約0.1-1 mg/kg體重或約0.1-0.5 mg/kg體重。在一些實施例中，維持劑量量為約0-10 mg/kg體重、約0-5 mg/kg體重、約0-2 mg/kg體重、約0-1 mg/kg體重、約0-0.5 mg/kg體重、約0-0.4 mg/kg體重、約0-0.3 mg/kg體重、約0-0.2 mg/kg體重、約0-0.1 mg/kg體重。在一些實施例中，在給定時間(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個月)內及/或以給定給藥次數(例如，給藥1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30次或更多次)每隔一定時間向個體投與負荷劑量，隨後投與維持劑量。在一些實施例中，維持劑量介於0-2 mg/kg體重、約0-1.5 mg/kg體重、約0-1.0 mg/kg體重、約0-0.75 mg/kg體重、約0-0.5 mg/kg體重、約0-0.4 mg/kg體重、約0-0.3mg/kg體重、約0-0.2 mg/kg體重或約0-0.1 mg/kg體重範圍內。在一些實施例中，維持劑量為約0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8或2.0 mg/kg體重。在一些實施例中，經1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個月投與維持劑量。在一些實施例中，經1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年投與維持劑量。在一些實施例中，無限期(例如，終生)投與維持劑量。

本文所用之術語「組合療法」係指在重疊方案中投與兩種或更多種不同醫藥劑從而使個體同時暴露於兩種藥劑之情形。可單獨或結合其他藥劑投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(或含有艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之組合物或藥劑)，該等藥劑係例如抗阻胺藥(例如，苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制劑(例如，考布他汀(combretastatin)A-4、黴酚酸、噴司他丁(pentostatin)、奈拉濱(nelarabine)或米托蒽醌(mitoxantrone))或抵抗抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體之其他免疫治療劑。

熟習此項技術者已知之任一免疫抑制劑可與本發明之組合療法一起使用。該等免疫抑制劑包括(但不限於)環孢菌素(cyclosporine)、FK506、雷帕黴素(rapamycin)、CTLA4-Ig、及諸如依那西普(etanercept)等抗TNF劑(例如，參見Moder,2000,Ann. Allergy Asthma Immunol. 84,280-284；Nevins,2000,Curr. Opin. Pediatr. 12,146-150；Kurlberg等人，2000,Scand. J. Immunol. 51,224-230；Ideguchi等人，2000,Neuroscience 95,217-226；Potter等人，1999,Ann. N.Y. Acad. Sci. 875,159-174；Slavik等人，1999,Immunol. Res. 19,1-24；Gaziev等人，1999,Bone Marrow Transplant. 25,689-696；Henry,1999,Clin. Transplant. 13,209-220；Gummert等人，1999,J. Am. Soc. Nephrol. 10,1366-1380；Qi等人，2000,Transplantation 69,1275-1283)。已證實在移植患者中有效之抗IL2受體(α亞單位)抗體達珠單抗(daclizumab)(例如賽尼哌(Zenapax).TM.)亦可用作免疫抑制劑(例如，參見Wiseman等人，1999,Drugs 58,1029-1042；Beniaminovitz等人，2000,N. Engl J. Med. 342,613-619；Ponticelli等人，1999,Drugs R. D. 1,55-60；Berard等人，1999,Pharmacotherapy 19,1127-1137；Eckhoff等人，2000,Transplantation 69,1867-1872；Ekberg等人，2000,Transpl. Int. 13,151-159)。其他免疫抑制劑包括(但不限於)抗CD2(Branco等人，1999,Transplantation 68,1588-1596；Przepiorka等人，1998,Blood 92,4066-4071)、抗CD4(Marinova-Mutafchieva等人，2000,Arthritis Rheum. 43,638-644；Fishwild等人，1999,Clin. Immunol. 92,138-152)、及抗CD40配體(Hong等人，2000,Semin. Nephrol. 20,108-125；Chirmule等人，2000,J. Virol. 74,3345-3352；Ito等人，2000,J. Immunol. 164,1230-1235)。

術語「與...結合」表示藥劑在艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(或含有艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之組合物)之前、大致同時或之後投與。例如，可將藥劑混合至含有艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之組合物中，且由此與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶同時投與；或者，可在不混合之情形下同時投與藥劑(例如，藉由在投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之靜脈管線上亦「附帶」遞送藥劑，或反之亦然)。在另一實例中，可單獨(例如，不混合)但在投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶後短時間範圍內(例如，在24小時內)投與藥劑。在一些實施例中，結合經設計以減小抗半乳糖腦苷酶(GalC)抗體之量或預防其產生之免疫抑制或免疫治療方案來投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(或含有艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之組合物)。例如，可使用與用於血友病患者中之方案(Nilsson等人(1988)N. Engl. J. Med.,318:947-50)類似之方案來減少抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體。此一方案可用於具有抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體或處於具有抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體之風險中的個體。在一些實施例中，免疫抑制或免疫治療方案開始於首次投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之前以將產生抗艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶抗體之可能性降至最低。熟習此項技術者已知之免疫抑制劑的任一組合皆可與本發明組合療法一起使用。

套組

本發明提供套組或其他製品，其含有本發明調配物並提供本發明調配物復原(若凍乾)及/或使用之說明。套組或其他製品可包括容器。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶及注射器。容器可自諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。容器容納調配物，且位於容器上或與其連接之標籤可指示對於復原及/或使用之說明。例如，標籤可指示將調配物復原至上述蛋白質濃度。標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於(例如)IT投與。容納調配物之容器可為多用途小瓶，該多用途小瓶容許重複投與(例如，投與2-6次)調配物。套組或其他製品可進一步包括含有適宜稀釋劑(例如，BWFI)之第二容器。將稀釋劑與調配物混合後，復原調配物中之最終蛋白質濃度通常為至少25 mg/ml(例如，至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml、至少100 mg/ml)。套組或其他製品可進一步包括自商業及使用者角度考慮合宜之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明之包裝插頁。藉由參照下列實例來更全面地理解本發明。然而，該等實例不應解釋為限制本發明之範圍。所有文獻引文皆以引用方式併入本文中。

儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞「一(a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的一或多個成員間包括「或」的技術方案或說明係適合表述該情形的、本發明包括其中恰好只有一個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。此外，應瞭解，除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等引入附屬於相同基礎技術方案(或任一其他相關技術方案)之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式(例如，以馬庫西群組(Markush group)或類似格式)給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之背景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。

實例

實例1：生物分佈

該研究之主要目的係確定重組人類I2S是否可藉由腦脊髓膜內-腰椎途徑遞送至成年MPS II小鼠之腦中。

材料及方法

動物：

將小鼠分群組圈養在處於12小時光暗循環下之聚居室(colony room)中，每個籠子中至多4隻小鼠。在實驗持續時間內隨意獲取齧齒類動物飼料(LabDiet-5001,StLouis,MO)及水(Lexington，MA市政水，藉由反滲透予以純化)。按照實驗室動物照護與使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(National Academy Press,Washington D.C.,1996)中闡述之導則來實施動物照護。自IKO異型接合突變之四隻雌性攜帶者小鼠建立當前的IKO繁殖群，該等小鼠係自Dr. Joseph Muenzer(University of North Carolina)獲得。使雌性攜帶者與C57BL/6背景品系之雄性小鼠(C57BL/6NTac,Taconic,Hudson,NY)交配，產生異型接合之雌性及半合子雄性基因敲除小鼠、以及野生型雄性及雌性同胎幼仔。藉由組織DNA之PCR分析對所有後代進行基因分型。該實驗中使用之所有小鼠均為8週齡至12週齡之鑒定為半合子IKO(-/0)或野生型(WT)同胎幼仔(+/0)的雄性小鼠。

艾杜硫酶：

將22 mL I2S[重組人類艾杜硫酶]在2L磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進行透析，更換4次PBS。隨後將I2S藉由Vivaspin管柱進行濃縮並再懸浮於PBS中(最終體積為1 mL)，然後使用0.2 μm過濾器實施過濾滅菌。最後濃度為51 mg/mL。

腦脊髓膜內-腰椎注射：

使用1.25% 2,2,2三溴乙醇(Avertin)以200-300 μL/10克體重(250-350 mg/kg)藉由腹膜內注射使成年小鼠麻醉。除去介於尾巴底部與肩胛骨之間的背部毛髮，並利用帕維酮(povidine)/聚維酮碘(betadine)隨後異丙醇擦洗來擦拭剃毛區域。在腰骶部脊柱上作一個中線皮膚小切口(1-2 cm)，並確定背部中線與回腸(複數形式ilea，單數形式ileum)翼狀物之頭側的交點。髂窩中之肌肉(臀中肌)係呈心臟形狀之肌肉，且「心臟」頂部兩側接近回腸翼狀物位置。插入附接至氣密性10-20 μL玻璃Hamilton注射器之32號針，直至感覺到來自下方骨骼之阻力。以約2 μL/20秒(10 μL/2分鐘)之速率注射10 μL測試物質。視需要使用創傷夾來縫合皮膚切口，並使動物在恢復室中恢復，隨後返回到合適的籠子中。

組織學程序：

在最後一次注射後1小時屠宰動物。採集腦及肝組織並固定於10%中性緩衝福馬林(formalin)中，隨後進行處理並包埋於石蠟中。製備5 μm切片以用於蘇木素/伊紅(H&E)及免疫組織化學(IHC)染色。

蘇木素及伊紅染色：

使用H&E將腦及肝切片染色。染色結果將核顯示為紫色且將細胞質顯示為粉色至紅色。使用H&E染色的載玻片來實施組織病理學形態評價。

免疫組織化學：實施I2S生物分佈評價時，將去石蠟且再水合之腦及肝切片與對抗重組人類I2S之小鼠單株抗體2C4-2B2(Maine Biotechnology Services,Portland,ME)一起培育過夜以檢測注射之I2S(或以無關小鼠IgG作為陰性對照抗體；Vector Laboratories,Burlingame,CA)。在2-8℃下培育過夜後，添加與辣根過氧化物酶結合之二級山羊抗小鼠IgG。在37℃下再培育30分鐘後，再經10分鐘添加酪胺醯胺-Alexa Fluor 488標記溶液(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)。使用含有1.5 μg/ml 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作為核對比染色劑之抗衰退封固介質(VectaShield；Vector Laboratories)給切片蓋上蓋玻片，並使用多通道Nikon螢光顯微鏡進行觀察。染色結果將I2S陽性細胞顯示為綠色，核顯示為藍色，且背景區域顯示為黑色。

實施功效分析時，使用大鼠抗LAMP-1(以溶酶體相關膜蛋白作為溶酶體標記)IgG(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California)作為一級抗體將腦及肝切片染色。使用無關大鼠IgG抗體作為陰性對照。使用ABC(抗生物素蛋白生物素複合物套組，來自Vector Labs，Burlingame，California)方法來擴增目標標記。

簡言之，將去石蠟之切片再水合，並與一級抗體一起培育。在2-8℃下培育過夜後，添加二級生物素化兔抗大鼠IgG(Vector Labs,Burlingame,California)，並在37℃下培育30分鐘，隨後將試樣洗滌並用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物(Vector Laboratories)處理30分鐘。顯色時，使用3,3'-二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)作為發色團。隨後使用蘇木素將切片對比染色並蓋上蓋玻片。染色結果將LAMP-1陽性細胞顯示為褐色且將核顯示為藍色。拍攝代表性照片，並使用Image-Pro Plus軟體(Media Cybernetics公司，Bethesda,MD)分析LAMP-1陽性細胞區域，並使用司徒登氏t-測試(student's t-test)實施比較統計學分析。

電子顯微鏡方法：

將經3次劑量之I2S治療之動物的腦組織在4℃下在存於0.1 M二甲基胂酸鈉緩衝液(pH 7.4)中之2.5% PFA/2.5%戊二醛中固定過夜。隨後，將試樣在二甲基胂酸鹽緩衝液(0.1 M,pH 7.4)中洗滌，並在四氧化鋨中後固定，在酒精及環氧丙烷中再水合，並包埋於Epon樹脂中。切割成100nm之超薄切片，使用檸檬酸鉛染色並在Tecnai^TM G² Spirit BioTWIN透射電子顯微鏡中進行檢查。

結果

在腦中，如藉由免疫組織化學(IHC)所測定，未在媒劑對照動物中發現I2S。相比之下，在注射I2S之動物中腦脊髓膜細胞、大腦及小腦之神經元呈現I2S陽性染色。投與3次劑量之動物中的染色信號較強(圖1)。

與野生型動物相比，在媒劑治療之IKO小鼠之腦組織中在整個腦中發現細胞空泡形成(溶酶體貯積症之組織病理學標誌)。在I2S治療之IKO小鼠中，與未治療小鼠相比，自表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦至白質，細胞空泡形成廣泛減少(圖2)。藉由溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP-1)染色(溶酶體活性及疾病狀態之指示)發現，與野生型動物相比，在媒劑治療之IKO小鼠之小神經膠質細胞、腦脊髓膜及血管周細胞中溶酶體活性異常高。經腦脊髓膜內投與I2S治療之小鼠之LAMP-1免疫染色顯著減弱。此減弱表現在LAMP-1陽性細胞之數量減少及染色較弱。在經2次劑量及3次劑量之I2S治療之動物中，此減弱可在自表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦至白質之整個腦中發現(圖3)。各個腦區之LAMP-1免疫染色的形態測定法分析證實，在評價之所有腦區域中LAMP-1陽性染色顯著減弱(圖4)。

媒劑治療之IKO小鼠中之腦細胞的電子顯微鏡檢查顯示，含有無定形顆粒貯積物質之空泡及片層狀包涵體以及斑馬體樣結構增大。在經腦脊髓膜內-腰椎注射I2S之小鼠中，溶酶體貯積之超微結構層面上之該等典型病理學特徵減少(圖5)。

在媒劑治療動物之肝中無I2S之陽性染色。在經腦脊髓膜內注射I2S之小鼠中，在竇狀隙細胞中清楚地發現大量注射之I2S(圖6)，此表明位於腦脊髓膜內間隙內之注射的I2S隨CSF循環且隨後吸收通過蛛網膜顆粒至循環系統中。

與WT小鼠相比，在媒劑治療之IKO小鼠的肝組織中發現嚴重細胞空泡形成及異常高之溶酶體活性，此由H&E染色及強LAMP-1免疫染色予以證實。在使用I2S經腦脊髓膜內治療後，發現肝中之細胞空泡形成及LAMP-1免疫染色顯著減少。H&E染色顯示細胞質內空泡形成幾乎完全消失，且肝細胞結構接近正常(圖7)。

在IKO小鼠中，將重組人類I2S藉由腦脊髓膜內-腰椎途徑遞送至腦中，且注射之I2S在多個腦區域中達成廣泛的組織病理學改良。

‧　在腦中之腦脊髓膜細胞及神經元中檢測到注射之I2S。

‧　在光學及電子顯微鏡檢查層面上整個腦中之細胞空泡形成減少。

‧　整個腦中之LAMP-1溶酶體標記減少。

‧　經腦脊髓膜內注射之I2S進入周圍循環中並改良肝形態及組織學標記。

實例2：毒理學

該實例展示在食蟹猴中每月一次經腦脊髓膜內腰椎團注給藥時與艾杜硫酶有關之臨床體徵。為達成此目的，將14只雄性食蟹猴如下表中所示隨機分配至五個治療群組中。

所有群組中之動物均以每月一次間隔在腰椎節段經IT給藥三次。使用0.3 ml PBS自導管系統沖洗1 ml劑量體積。在每次給藥之前一天至兩天，藉由IT脊髓穿刺在小腦延髓池位置採集約2 ml CSF。同時亦採集血液試樣(2 ml)。在給藥前、在給藥後在第一次給藥後0.5、1、2、4、8、24及48小時自群組5動物採集血液(2 ml)及CSF(0.1 ml)。每天記錄至少兩次臨床體徵。在第三次給藥後約24小時實施屍體剖檢，收穫所選組織並予以保存。

在第1天，群組4(150 mg)之所有三隻動物均在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度的趨向於後肢(hind quarters)，持續5-15分鐘；認為此體徵與測試物質有關。不存在認為與測試物質有關之體重、攝食量及神經/體格檢查參數方面的變化。

給出血清及CSF試樣之分析以及給藥溶液分析。在食蟹猴之不同組織中觀察到內源艾杜硫酶活性之變化；腦及脊髓與檢查之其他周圍器官(包括肝、心臟及腎)相比具有較高之內源活性。艾杜硫酶投與和各個腦區以及腦幹及脊髓中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關。IT遞送未導致右大腦半球與左大腦半球之分佈間具有可觀察到之差異。以下器官中之艾杜硫酶活性具有明顯的劑量依賴性增強：腦、肝、心臟及腎。腦中艾杜硫酶之免疫染色展示染色強度具有劑量依賴性增強。在3 mg群組中，觀察到腦脊髓膜細胞及腦脊髓膜下方有限的神經膠質細胞染色；在3 mg治療群組之動物中，神經元染色不明顯。當經IT投與艾杜硫酶時，脊髓中之艾杜硫酶染色呈陽性且具有劑量依賴性，且最高染色強度出現在腰區中。肝、腎及心臟中之艾杜硫酶染色強度具有劑量依賴性，且與該等器官中艾杜硫酶活性之增強一致。

總之，以最高150 mg之劑量以每月一次間隔經IT投與遞送艾杜硫酶不具有不良效應。因此，認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該研究中測試之最高劑量)。艾杜硫酶投與和CNS中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關，且使得肝、腎及心臟中具有全身I2S含量及活性。

測試物質艾杜硫酶係以存於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 5.3-6.1)中之給藥溶液來提供。所提供給藥溶液之標稱濃度為0、3、30或150 mg/ml。將測試物質儲存於-82℃至-79℃下之冷凍器中。使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.2)作為投與劑量後及連續CSF採集後之沖洗劑。PBS係自Gibco(Invitrogen公司)獲得。

測試物質給藥準備

對於每一時間間隔，在給藥之第1天，自-80℃臥式冷凍器取出每一濃度之一個小瓶，並在工作臺面上使其解凍至室溫。解凍後，給群組1、2及3之小瓶貼上標籤，稱重，並通過0.22 μm過濾器取出1 ml以用於安排給藥之每隻動物。投與所有劑量後，再次給小瓶稱重並放置於冰箱中。次日(動物003、群組4及群組5之給藥日期)，自冰箱取出用於群組1及4之給藥溶液，並放置於工作臺面上以使其達到室溫。達到室溫後，給群組1及4之小瓶稱重，給群組4小瓶貼上標籤，並通過過濾器取出1 ml以用於群組1及4中安排給藥之每隻動物。隨後藉由將合適量的群組4給藥溶液及群組1給藥溶液(媒劑)注射至無菌聚丙烯小瓶中來製備用於群組5之給藥溶液。記錄自群組1及4添加之量。藉由輕輕顛倒小瓶來混合溶液，並通過過濾器取出2-1 ml劑量用於群組5中之動物。給藥完成後再次給群組1及4之小瓶稱重，並將所有小瓶(群組1-5)放置於冷凍器中。如下表中所述將14隻動物隨機分配至治療群組中。

選擇IT投與途徑係由於該途徑係用於人類投與之擬定途徑。選擇經選擇用於該研究之艾杜硫酶劑量(3、30、100及150 mg/ml)來評定每月一次連續三個月IT腰椎團注後不同劑量量之酵素在非人類靈長類動物中樞神經系統(CNS)內之生物分佈。

臨 床觀察

臨床體徵之總發生率極低。群組1(對照)、群組2(3 mg)、群組3(30 mg)或群組5(100 mg)中沒有一隻動物在研究期間之任一時間具有被認為與測試物質有關之臨床體徵。

在第1天，群組4(150 mg)之所有三隻動物(012-014)均在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度的趨向於後肢，持續5-15分鐘。認為此體徵與測試物質有關，且未在任一較低劑量群組中觀察到。在第一次給藥後即刻或在投與測試物質後緊接數天無其他臨床體徵。對於群組4動物觀察到之唯一其他體徵係在第35天動物013發生了一次嘔吐。

當考慮到使用植入的藥物遞送裝置固有之變化時，以單次、每月一次腦脊髓膜內團注形式投與測試物質未引起任何不良的肉眼或顯微鏡下變化。包括對照群組在內之所有群組在腦脊髓膜中具有指示對藥物遞送系統之發炎反應的顯微鏡下變化。在接受30 mg及更大劑量之測試物質的動物中，腦脊髓膜中具有發生發炎反應以產生更明顯之嗜伊紅白血球成份的傾向。

由於對照與測試物質治療動物之間的差異非常微小，故認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該研究中測試之最高劑量)。

在所有群組(包括對照)中，腦脊髓膜中之總發炎反應相比於在猴子中實施此持續時間之腦脊髓膜內研究時通常遇到之發炎反應略微明顯。然而，認為此可能與媒劑之某一特徵或與給藥後24小時實施屍體剖檢有關。

除3 mg群組中之一隻動物外，在所有其他治療動物中腦艾杜硫酶染色均呈陽性，且在150 mg群組中觀察到最高染色強度(圖16、17、18及19)。在3 mg群組中，僅腦脊髓膜細胞及腦脊髓膜下方之少數神經膠質細胞呈陽性；在神經元中未檢測到注射之艾杜硫酶。在較高劑量群組(30、100及150 mg)中，大量大腦神經元以及腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞及血管周細胞對於艾杜硫酶染色呈強烈陽性。艾杜硫酶免疫染色顯示注射之艾杜硫酶在大腦神經元中自位於腦脊髓膜附近表面上之層I內之神經元至鄰近白質之較深層VI內之神經元廣泛分佈(圖20、21及22)。對於150 mg劑量群組亦觀察到顯著的神經元染色(圖23)。在所有動物(30 mg-150 mg劑量群組)中，發現腦之前部、中部及後部間神經元艾杜硫酶染色無顯著差異。

在所有動物之脊髓中艾杜硫酶染色均呈陽性，其中最高染色強度出現在腰區中(圖24及25)。艾杜硫酶免疫染色亦具有劑量依賴性。在150 mg群組中，神經元、腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞、血管周細胞以及神經纖維周圍之神經外膜/神經束膜/神經內膜(結締組織細胞)對於艾杜硫酶染色呈強烈陽性(圖26及27)。

發現所有動物之肝中的竇狀隙細胞(庫弗細胞(Kupffer cell)及內皮細胞)均呈陽性艾杜硫酶染色。然而，對於3 mg治療群組，未在肝細胞中檢測到艾杜硫酶(圖28)，而在較高劑量群組中發現肝細胞呈陽性艾杜硫酶染色，其中最大染色強度出現在150 mg治療群組中(圖29、30及31)。在3 mg治療群組之動物中不存在陽性艾杜硫酶染色(圖22)。相比之下，在30 mg、100 mg及150 mg群組中，間質細胞呈陽性艾杜硫酶染色，其中在150 mg群組中觀察到顯著染色-就陽性細胞數量及染色強度而言(圖33、34及35)。腎

在3 mg劑量群組之動物中檢測到很少或未檢測到注射之艾杜硫酶(圖36)。然而，發現30 mg及100 mg群組中之腎小球細胞及間質細胞呈陽性艾杜硫酶染色(圖37及38)。在150 mg群組中，艾杜硫酶免疫染色還顯示近端腎小管細胞之艾杜硫酶染色以及腎小球細胞及間質細胞之顯著染色(圖39)。

討論

不存在與測試物質有關之臨床體徵或對體重、攝食量、體格檢查發現及神經檢查發現之影響。在第1天，群組4(150 mg)動物在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度的趨向於後肢，持續5分鐘至15分鐘；斷定此體徵與測試物質有關。

艾杜硫酶投與和各個腦區以及腦幹及脊髓中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關。當經IT投與艾杜硫酶時，脊髓中之最高程度染色強度出現在腰區中。經IT投與艾杜硫酶亦使得全身暴露，且肝、腎及心臟中之染色強度具有劑量依賴性。接受30 mg及更大劑量之測試物質的動物之腦脊髓膜中具有發生發炎反應以產生更明顯之嗜伊紅白血球成份的傾向，但認為此差異在生物學上不顯著。以最高150 mg之劑量以每月一次間隔經IT投與遞送艾杜硫酶不具有不良效應。因此，認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該實例中測試之最高劑量)。艾杜硫酶投與和CNS中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關，且使得肝、腎及心臟中具有全身含量。

實例3：經IT遞送之I2S的PK(血清及CSF)

該實例提供針對測試物質(TA)濃度之血清及腦脊髓液(CSF)分析，其涉及在食蟹猴中經由每月一次腦脊髓膜內腰椎團注及每週一次靜脈內團注投與艾杜硫酶的6個月毒性研究。

實驗設計

該研究之目的係經6個月時間段自毒理學及安全藥理學角度評價艾杜硫酶(12s)之重複劑量腦脊髓膜內(IT)投與。研究設計顯示於表8中。

測試物質

身份：艾杜硫酶IV給藥-(2.0 mg/mL)

IT給藥-艾杜硫酶(0 mg/mL)

艾杜硫酶(3 mg/mL)

艾杜硫酶(30 mg/ml)

艾杜硫酶(100 mg/ml)

分析方法：

利用ELISA(酵素連結免疫吸附分析)實施分析以測定艾杜硫酶之濃度。在乘以稀釋因子之前檢測極限(LOD)為1.25 ng/mL。以1:50稀釋度篩選試樣，因此分析靈敏度為62.5 ng/mL。將落在校準曲線高端以外之試樣進一步稀釋，並在適當稀釋使數值在曲線範圍內之後再次進行測試。利用酵素活性分析再次分析所選試樣。在1:150之最低試樣稀釋度下，該分析之LOD係0.18 mU/mL。分別給予鹽水或媒劑之群組1及2中之動物在整個IV及IT給藥期間均具有介於138 ng/mL與小於62.5 ng/mL(或小於LOD)範圍內之血清艾杜硫酶含量。在所測試之來自群組1及2動物之200份CSF試樣中，62份試樣展示高於分析LOD之I2S含量。其中，7個數值較高(大於1,000 ng/mL)。在第3次IT給藥之前採集之另一份CSF試樣經測試高於1,000 ng/mL I2S。

隨後測試該等試樣之艾杜硫酶活性。在每一情形下，活性結果指示I2S之存在，且當基於活性程度計算I2S之近似濃度時，結果在藉由抗原ELISA獲得之數值之20%以內。(參見表9)亦利用酵素活性分析來測試抗原ELISA結果小於LOD之其他隨機選擇CSF試樣以排除任何非特異性活性。

在該研究中，分析血清及CSF試樣之艾杜硫酶濃度。按照以下時間表來採集血清試樣：IV給藥：給藥前及第1至10次給藥後2小時，給藥前及第11至23次給藥後4小時，及屍體剖檢時。IT給藥：給藥前及第1及2次給藥後2小時，給藥前及第3至6次給藥後4小時，及屍體剖檢時。按照以下時間表來採集CSF試樣：IV給藥：給藥前及第1次給藥後2小時，及第3及6次給藥後4小時。

IT給藥：給藥前及第1及2次給藥後2小時，給藥前及第3至6次給藥後4小時，及屍體剖檢時。通常，血清艾杜硫酶比CSF艾杜硫酶清除地更快速。在測試之所有時間點，分別給予鹽水或媒劑之群組1及2動物的血清艾杜硫酶含量均小於或等於138 ng/mL。一些動物具有低於分析檢測極限(LOD)之含量。較少來自群組1及2之CSF試樣高於分析LOD，其中7份試樣顯著例外，其具有較高含量(大於1,000 ng/mL)。在第3次IT給藥之前自動物採集之一份CSF試樣亦經測試高於1,000 ng/mL艾杜硫酶。

給出該等偏離趨勢之結果的試樣再次進行測試及證實。

另外，測試該等試樣之艾杜硫酶酵素活性。該等活性結果亦證實高艾杜硫酶含量在藉由艾杜硫酶質量分析所獲得之數值的20%以內(表9)。活性分析之特異性係在該試樣隊列內藉由隨機測試艾杜硫酶質量單位低於LOD之CSF試樣來驗證，且證實該等試樣中之艾杜硫酶含量實際上為LOD(數據未顯示)。

實例4：調配物

本實例概述實施醫藥研發研究以確定用於I/II期臨床試驗之艾杜硫酶-IT原料藥及成品藥調配物。由於適於CNS遞送之賦形劑之限制，用於腦脊髓膜內遞送艾杜硫酶之調配物的研發工作集中在降低磷酸鹽及聚山梨醇酯20之含量同時仍使穩定性保持等同於用於全身遞送之I2S調配物。

實施三項重要的篩選應力研究以檢查磷酸鹽及聚山梨醇酯含量之影響。該等應力研究包括冷凍解凍、振盪應力及熱應力。結果顯示，在低蛋白質濃度(2 mg/mL)下，鹽水調配物對冷凍解凍應力更穩定。在高蛋白質濃度(100 mg/mL)下，對於鹽水調配物及含有磷酸鹽之調配物，冷凍解凍應力均未造成不穩定性問題。振盪應力研究證實，0.005%聚山梨醇酯20保護蛋白質對抗振盪相關應力。熱穩定性研究顯示，鹽水調配物與含有磷酸鹽之調配物相比更穩定。另外，在2-8℃下，鹽水調配物之pH可保持在6.0達24個月。發現與蛋白質結合之殘留磷酸鹽的量以及增加之蛋白質濃度有助於最終調配物之pH穩定性。

方法

冷凍/解凍應力對鹽水及磷酸鹽調配物中之艾杜硫酶之穩定性的影響

為檢查冷凍/解凍對不同調配物中艾杜硫酶穩定性之影響，使用Centricon Plus將病毒SEC庫交換/濃縮至150 mM NaCl或含有20 mM磷酸鈉之137 mM NaCl(均為pH 6.0)中，實施四次。目標蛋白質濃度為2 mg/ml及100 mg/mL。將所有溶液過濾通過0.22微米PVDF過濾器。將溶液等分至2 mL硼矽酸鹽玻璃小瓶中，每份為1 mL。將小瓶放置於凍乾器腔之中間架子上，且周圍為無效對照小瓶。將試樣以程式化冷凍/解凍循環(在20℃下保持1小時且以1℃/min.冷凍至-50℃)冷凍。隨後，以0.03℃/min之速率經兩步驟自-50℃解凍至-25℃，在-25℃下保持24小時，並容許解凍至2-8℃。在兩個或三個冷凍/解凍循環後，藉由外觀及SEC-HPLC分析對試樣進行分析。

振盪/剪切應力對磷酸鹽及鹽水溶液中之艾杜硫酶的影響

在不同蛋白質濃度下對艾杜硫酶實施振盪研究。在2 mg/mL、8 mg/mL及90-100 mg/mL下於存於20 mM磷酸鹽中之137 mM NaCl(pH 6.0)及單獨154 mM NaCl(pH 6.0)存在下測試蛋白質濃度。為察看是否需要聚山梨醇酯，將各種量之PS-20摻加至測試條件中。將溶液等分至2 mL玻璃小瓶中，每份為1.2 mL，並隨後在環境條件下在定軌振盪器上以250 rpm振盪24小時。在基線及24小時，查看外觀，並取0.1 mL等分試樣於低於

-65℃下冷凍於0.5 mL聚丙烯管中，直至實施SEC-HPLC分析。

為首先證實聚山梨醇酯20含量之影響，利用3小時之卡車物質運輸、隨後1小時之航空測試在保證級別1下使用隨機測試選項實施模擬運輸研究(由Lansmont(Lansing,MI)實施)。針對微粒外觀及可溶性聚集體(藉由SEC-HPLC)對試樣進行分析。

為檢查攪拌應力對穩定性之影響，將1.3 mL鹽水調配物(50 mg/mL，154 mM NaCl及0.005% PS-20)填充於3 mL I型玻璃小瓶中，並使用13 mm塞子塞住，該玻璃小瓶含有塗有鐵氟龍(Teflon)之磁力攪拌棒(長度為8 mm且直徑為2 mm)。將小瓶放置於設置為速度設置6(所選設置6係不引起過多起泡之最大速度)之攪拌盤上。在0、2、24、48及72小時查看外觀。利用SEC-HPLC方法測試基線及72小時攪拌試樣。

先導調配物(Lead Formulation)之熱穩定性研究

比較六種先導調配物之熱穩定性。該等調配物係基於兩個參數來選擇。第一個參數係蛋白質濃度須在用於CNS遞送之治療範圍內。第二個參數係控制磷酸鹽濃度對穩定性之影響。使用Centricon Plus-80對病毒過濾之SEC庫實施緩衝液交換及濃縮。達到50 mg/mL及100 mg/mL之目標蛋白質濃度。給六種調配物摻加1%聚山梨醇酯20溶液，使得最終濃度為0.01% PS-20。將物質過濾通過0.22微米PVDF過濾器，並將0.5 mL添加至2 mL玻璃硼矽酸鹽小瓶中。將該等小瓶以倒置的位置放置以實施應力穩定性(40℃)、加速穩定性(25℃)及即時儲存(2-8℃)測試。藉由SEC-HPLC、OD320、SAX-HPLC、SDS-PAGE(Commassie)、pH及活性來測試各時間點試樣之穩定性。

瞭解鹽水調配物之pH控制

實施以下研究以瞭解鹽水調配物之pH保持情況。

測試鹽水調配物中之磷酸鹽殘留物

藉由使用Millipore TFF系統及Millipore Pellicon Biomax 30,50 cm²過濾器將病毒過濾之SEC庫(2 mg/mL艾杜硫酶、137 mM NaCl、20 mM磷酸鈉，pH 6.0)濃縮並透析過濾至150 mM NaCl中。測定在7X、10X及15X透析過濾至0.9%鹽水(在TK3製備)中之循環後試樣中與蛋白質結合之磷酸鹽的量。另外，亦測試10X透析過濾後之滲透物(來自過濾之不含蛋白質的貫流物質(flow through))及過濾步驟中使用之鹽水。

測定蛋白質濃度對pH之影響

實施蛋白質效應研究以更好地瞭解不存在緩衝劑(磷酸鹽)時pH之控制。為測定蛋白質對pH之影響，將物質於154 mM NaCl(鹽水)中稀釋至30 mg/mL、10 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.1 mg/mL、0.01 mg/mL及單獨鹽水。將物質等分至2 mL聚丙烯管中，每支管之填充體積為1 mL。將試樣在

-65℃下冷凍1小時，在環境中解凍30分鐘，且該循環重複三次。量測初始pH，並在3X冷凍/解凍循環後進行比較。亦在將試樣於環境中暴露24小時(藉由打開各管之蓋子)後量測pH以測定蛋白質濃度對pH改變可能具有之影響。

由於適於CNS遞送之賦形劑之限制，用於腦脊髓膜內遞送艾杜硫酶之調配物的研發工作集中在降低磷酸鹽及聚山梨醇酯20之含量同時仍使穩定性保持等同於調配用於全身投與之I2S。實施三項重要的篩選應力研究，包括冷凍解凍、振盪應力及熱應力。

冷凍/解凍對鹽水及磷酸鹽調配物中之艾杜硫酶的影響

如表10中所示，在2 mg/mL之低蛋白質濃度下，含有20 mM磷酸鹽之調配物在冷凍解凍應力後產生更多聚集體。鹽水調配物仍具有與基線相同之聚集體含量。在高蛋白質濃度(100 mg/mL)下，冷凍解凍應力似乎對任一調配物之穩定性均無影響(表11)。數據表明單獨鹽水調配物對冷凍解凍應力具有更佳穩定性。

振盪應力對溶液中之艾杜硫酶的影響

在2、8及100 mg/mL之三種蛋白質濃度值下實施振盪研究。數據顯示，在不含聚山梨醇酯20的情況下，在所有蛋白質濃度下均產生沉澱，且在2 mg/mL下觀察到高含量之可溶性聚集體(表12至表14)。然而，在非常低含量之P20(例如0.005%)存在下，沉澱及可溶性聚集體大部分被阻止。數據表明，需要低含量之聚山梨醇酯以保護蛋白質對抗振盪應力。

表12-14：實驗室模型中之振盪研究(在環境中以250 RPM旋轉24小時)

為進一步證實0.005%是否足以針對振盪保持穩定性，在100 mg/mL蛋白質下對含有不同含量之聚山梨醇酯20的鹽水調配物實施模擬運輸研究(其接近於實際運輸條件)。結果證實0.005%係足夠的(表15)。

使用磁力攪拌棒攪拌對含有50 mg/mL艾杜硫酶且含有0.005%聚山梨醇酯20之鹽水調配物之穩定性的影響概述於表16中。如表中所示，在72 hr內，蛋白質未受藉由使用磁力攪拌棒攪拌造成之應力所影響。結果證實0.005%亦足以對抗攪拌應力。

先導候選者之熱穩定性

經24個月針對穩定性測試來檢查六種重要的調配物。在該部分中討論該等測試之結果。

外 觀

所有調配物之外觀在對六種調配物實施測試之所有溫度及時間點下仍然呈略微乳白色且基本上無微粒。OD320為檢查濁度之可能增加，測定OD320值並概述於表17中。如表中所示，在冷凍儲存時，在儲存24個月後，所有調配物之OD320值仍然與基線相同。在2-8℃條件下，在24個月後鹽水調配物之OD320值仍然與基線相同，但含有磷酸鹽之調配物之OD320值的大小增加。在25℃之加速條件下，在3-6個月後鹽水調配物之OD320亦略微增加，但含有磷酸鹽之調配物顯示更顯著增加。該等結果表明鹽水調配物對熱應力更穩定。

SEC-HPLC藉由SEC-HPLC測試之所有調配物的數據概述列示於表中。在冷凍儲存條件下，在24個月後與基線相比無變化。在40℃之應力條件下，兩週後，所有調配物之可溶性聚集體的含量均增加。另外，含有磷酸鹽之調配物亦顯示「12 min」峰。然而，1個月後，在含有磷酸鹽之調配物中觀察到之「12 min」峰似乎消失。另外，對於所有調配物，與2週時間點相比，可溶性聚集體含量未進一步增加(圖8及表18)。

在25℃之加速條件下，對於所有調配物，與基線相比，在6個月後可溶性聚集體之含量增加得最少。然而，所有含有磷酸鹽之調配物均顯示「12 min」峰(圖9及表18)。在2-8℃之長期儲存條件下，24個月後，對於所有調配物，可溶性聚集體之增加亦在儲存24個月後最少。與所有條件一致，含有磷酸鹽之調配物亦具有「12 min峰」，其隨時間略微增加(圖10及表18)。該等結果表明，在所有儲存條件下，鹽水調配物與含有磷酸鹽之調配物相比具有較小變化。

SAX-HPLC

SAX-HPLC之數據概述列示於表19中。在應力/加速條件下^，鹽水調配物似乎具有略微較多變化(圖11及12)，但在長期儲存條件下，在24個月後所有調配物均無變化(表19及圖13)。此表明鹽水調配物在2-8℃下可穩定24個月。

pH

表20顯示在2-8℃下在24個月內所有調配物之pH均保持與基線相當。對於鹽水調配物，儘管不含緩衝劑，但在24個月內pH保持恆定為6.0。

酵素活性

與參考標準物相比，在2-8℃下24個月後所有調配物之比活性在分析變差(assay variation)內相當，此表明鹽水調配物中之艾杜硫酶在24個月內保持穩定(表21)。

與蛋白質結合之殘留磷酸鹽的檢測

利用製備鹽水調配物中最後的UF/DF步驟將蛋白質溶液自137 mM NaCl、20 mM磷酸鈉透析過濾至150 mM NaCl中。為檢查透析過濾循環次數如何影響最終產物中之殘留磷酸鹽濃度，使用原料藥(2 mg/mL艾杜硫酶、137 mM NaCl、20 mM磷酸鈉，pH 6.0)實施實驗室規模之研究。首先將原料藥濃縮至50 mg/mL艾杜硫酶，並隨後透析過濾至150 mM鹽水中。在7x、10x及15x透析過濾步驟獲取試樣，並藉由ICP測試磷酸鹽含量。測試結果概述於表22中。如表中所示，鹽水透析過濾溶液不含有任何磷酸鹽。7x DF後，蛋白質含有約0.22 mM磷酸鹽，此高於理論計算值。10x DF後，蛋白質滲餘物含有約0.16 mM磷酸鹽，而貫流物質僅含有約0.07 mM磷酸鹽，此表明磷酸鹽與蛋白質結合。15x DF後，磷酸鹽含量降低至約0.07 mM。

該研究之結果表明，約0.2 mM磷酸鹽殘留物留在原料藥中，其可能有助於使鹽水調配物之pH保持在6.0。

蛋白質濃度對保持調配物pH之影響

自磷酸鹽含量分析可以明顯看出，磷酸鹽與蛋白質結合。因此，預期高濃度蛋白質可結合更多磷酸鹽，此可更佳地保持pH。為檢驗該假設，將蛋白質存於鹽水中之溶液濃縮至不同含量，並測試不同處理條件後溶液之pH。結果概述於表23中。

如表中所示，溶液之初始pH保持在約6.0而與蛋白質濃度無關。然而，在暴露於環境24 hr或三個冷凍解凍循環後，含有0.1 mg/mL或更少蛋白質之溶液的pH並不保持在6.0左右之恆定pH。在高於1 mg/mL之蛋白質濃度下，溶液之pH保持在6.0左右。此證實蛋白質濃度在保持鹽水溶液之pH中係控制因素。

該研究之結果證實，鹽水調配物(50 mg/mL艾杜硫酶、0.005%聚山梨醇酯、150 mM NaCl，pH 6.0)中之艾杜硫酶在於2-8℃下儲存時可穩定至少24個月。該調配物與含有磷酸鹽之調配物相比似乎更穩定。選擇0.005%之聚山梨醇酯20足以保護蛋白質對抗振盪應力。另外，該研究亦表明，在2-8℃下，鹽水調配物之pH可穩定保持在6.0達24個月，此部分係由於最終調配物中之殘留磷酸鹽及高蛋白質濃度。

實例5.　生物分佈

已經成功地證實腦脊髓膜內投與係將I2S遞送至CNS組織中之有效方式，現實施另外研究以確定經IT投與之I2S是否能夠分佈至深層腦組織中以及確定是否存在經IT投與之I2S的細胞定位。製備重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)調配物，並調配於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 6.0)之媒劑中。

藉由植入式腦脊髓膜內座每月向非人類靈長類動物投與一次3 mg、30 mg或100 mg I2S，連續投與6個月。研究設計概述於下表24中。

每月一次持續6個月以測試之最高劑量向非人類靈長類動物重複投與I2S具有良好耐受性，且未引起任何顯著不良毒理學事件。在投與第六及最後I2S劑量後24小時，屠宰個體非人類靈長類動物，並檢查該等非人類靈長類動物之CNS組織。

如藉由免疫組織化學(IHC)所測定，在全部CNS細胞及組織中存在I2S之廣泛細胞沈積。藉由IHC在所有腦組織中檢測到I2S蛋白質，其中沈積梯度自大腦皮質至腦室白質。在灰質中，在所有群組之大腦、小腦、腦幹及脊髓之神經元中以劑量依賴性方式檢測到I2S。在較高劑量群組之表面灰質中，在表面皮質中大量大腦神經元對於I2S染色呈陽性(圖40A)。亦在丘腦(圖40B)、海馬(圖40C)、尾狀核(圖40D)及脊髓(圖40E)中之神經元中檢測到I2S。腦脊髓膜及血管周細胞對於I2S染色亦呈陽性(圖40F)。

如圖41及42中所繪示，顯然，經IT投與之I2S分佈至個體非人類靈長類動物之CNS組織中且尤其沈積於灰質、丘腦及大腦皮質中。此外，圖42及43展示經IT投與之I2S以劑量依賴性方式積聚於繪示的個體非人類靈長類動物之CNS組織中。共定位染色亦顯示I2S之IT投與涉及神經元及少突膠質細胞。經IT投與之I2S亦分佈及定位於個體非人類靈長類動物之整個大腦中，如圖44所顯示。具體而言，圖45展示經IT投與至非人類靈長類動物後I2S之神經元吸收及軸突結合，如藉由神經絲染色所證實。亦尤其令人感興趣的是，本研究闡釋I2S對於神經元細胞具有選擇性，且該等神經元細胞促進經腦脊髓膜內投與之I2S分佈至深層腦組織中且似乎與軸突結構結合，表明I2S係順向軸突轉運。

下表25給出單獨動物研究之各種投與途徑及劑量的藥物代謝動力學數據。

如下表26中所示，將經¹²⁴I標記之I2S投與至測試動物，且PET掃描結果顯示於圖62、圖63中。

本研究亦展示IT投與後經IT投與之I2S在個體非人類靈長類動物腦室附近之白質腦組織中之細胞鑒定。儘管白質中之I2S染色密度通常低於灰質，但在少突膠質細胞內檢測到I2S(圖46)。具體而言，圖46展示白質腦組織中I2S之細胞鑒定且進一步證實I2S似乎不與髓磷脂結合。

除證實經IT投與之I2S深層分佈至腦組織中以外，本研究亦證實I2S定位至目標細胞器中，且重要的是I2S定位至溶酶體中，溶酶體係溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)中之受侵襲細胞器。具體而言，I2S定位於溶酶體內，且亦在軸突內檢測到I2S。圖46展示經IT投與之I2S於個體非人類靈長類動物之少突膠質細胞之溶酶體內的定位，由此證實經IT投與之I2S能夠分佈至深層腦組織中且能夠細胞定位。

為辨別遞送之I2S是否保留生物活性，利用比活性分析來量測腦中I2S之活性程度。在最後一次給藥後24小時，3 mg IT群組之腦中之活性明顯不同於裝置對照及媒劑對照動物中之基礎活性程度。屍體剖檢時(給藥後24小時)，30 mg及100 mg IT給藥動物之腦中之酵素活性高於基線。

辨別IT遞送至腦中後I2S之生物分佈的其他動物測試顯示於圖60中，且試樣編號對應於下表27。

實例6. IT與ICV遞送

在上文實例中觀察到之I2S分佈模式亦在給予單次IT或ICV劑量之健康比格犬(Beagle dog)中重現。利用電腦產生之編號將雄性比格犬隨機分成兩個群組(群組1(ICV)，N=3；群組2(IT)，N=4)。所有比格犬均具有植入於腰椎處之蛛網膜下腔中或左側大腦腦室中(用於給藥)及小腦延髓池中(用於取樣)之導管。所有導管均終止於皮下鈦輸液座。使用另外一隻犬作為未給藥之手術對照。

經IT或ICV投與單次團注1 ml I2S(30 mg/ml，存於20 mM磷酸鈉(pH 6.0)；137 mM氯化鈉；0.02%聚山梨醇酯-20中)，隨後用0.3 ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.2)沖洗。監測臨床體徵，並在給藥後24小時進行屠宰。採集腦及脊髓組織試樣用於定量I2S分析(如藉由ELISA所測定)、I2S酵素活性及IHC，並在研究群組間進行比較。

如藉由IHC所測定，I2S廣泛分佈於IT及ICV群組之全部灰質中。如圖47(A及B)所展示，在IT及ICV群組之大腦皮質中，在自表面分子層至內部深層之所有六個神經元層中，神經元均呈I2S陽性。如圖47(C及D)所展示，在IT及ICV群組之小腦皮質中，在包括普爾欽細胞在內之神經元中檢測到I2S。如圖47(E及F)所展示，在IT及ICV群組中，海馬中之大量神經元呈I2S陽性。如圖47(G及H)中所展示，在兩個群組之丘腦及尾狀核中亦發現I2S陽性神經元。

因此，本研究證實經IT投與之酵素能夠分佈至深層腦細胞及組織中，且支持經IT投與之酵素(例如I2S)用於治療與溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)有關之CNS表現的效用。

實例7：艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶缺陷型小鼠模型

已經證實經IT投與之I2S能夠分佈至深層腦組織中及I2S之細胞定位，現實施進一步研究以測定經IT投與之I2S的治療功效。產生經基因改造的艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶基因敲除(IKO)之亨特氏症候群小鼠模型以研究經IT投與之I2S改變疾病進展之能力。利用I2S基因座之靶向破壞來產生I2S基因敲除小鼠模型，該I2S基因座之靶向破壞會導致糖胺聚多糖(GAG)積聚於組織及器官中。該IKO小鼠模型呈現許多在人類中看到之亨特氏症候群體格特徵，包括特徵性粗魯外貌及骨骼缺陷。另外，該IKO小鼠模型展示在尿及整個身體組織中糖胺聚多糖(GAG)含量升高以及在組織病理學方面觀察到之廣泛的細胞空泡形成。

在本研究中，將市售I2S(Elaprase

)濃縮並再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。將六個群組之雄性IKO小鼠(8-12週齡)用I2S(10 μl；26 mg/ml)進行治療。群組A及B(N=3)分別經腦脊髓膜內投與三次260 μg I2S劑量(在第1、8及15天)及兩次260 μg I2S劑量(在第1及8天)。群組D亦係在第1、8及15天用三次經腦脊髓膜內投與之260 μg劑量進行治療。群組C及E(N=3)係未經治療之對照群組且群組F(N=3)係未經治療之野生型對照。給對照小鼠投與不含I2S之媒劑。在最後一次注射後1小時後屠宰小鼠，隨後製備組織以用於免疫組織化學(IHC)及組織病理學分析。

第三次注射後，與媒劑治療小鼠相比，在I2S治療小鼠中表面大腦皮質、尾狀核、丘腦及小腦中之細胞空泡形成廣泛減少。亦發現IT治療後白質中之細胞空泡形成減少。IT投與後，I2S明顯分佈至IKO小鼠之腦組織中。

在IKO小鼠中每週一次連續三週經IT投與I2S亦展示在光學及電子顯微鏡層面上CNS細胞空泡形成顯著減少。經IT投與I2S後，相對於未經治療之IKO小鼠細胞空泡形成明顯減少，此表明經IT投與之I2S能夠改變疾病進展。如圖48中所展示，在經IT投與I2S後IKO小鼠之胼胝體及穹窿中的細胞空泡形成明顯減少。圖49展示經治療IKO小鼠之表面大腦皮質組織中之溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)(溶酶體疾病之病理學生物標記)的存在顯著減少。

另外，電子顯微鏡檢查展示灰質中之神經元中之貯積包涵體的存在減少以及白質中之少突膠質細胞中之空泡形成減少。具體而言，經IT投與I2S之IKO小鼠亦展示為某些溶酶體貯積症所特有之柵狀片層體(「斑馬體」)的減少。具體而言，圖5係電子顯微鏡掃描，其展示相對於未經治療之IKO小鼠投與I2S之IKO小鼠之神經元中的特有斑馬體減少。類似地，圖5展示胼胝體中之少突膠質細胞的電子顯微鏡掃描。

另外，經IT投與I2S至IKO小鼠中亦展示表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦及白質中之溶酶體疾病病理學生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)免疫染色(溶酶體活性及疾病狀態之指示)顯著減弱。如圖49A中所展示，相對於圖49B中展示之未經治療之IKO對照小鼠的表面大腦皮質組織，經治療IKO小鼠表面大腦皮質組織中LAMP1免疫染色之顯著減弱非常明顯，反映了疾病病理學之改良。

圖20在數量上展示及比較在μm²腦組織區域中量測之LAMP1的濃度。各個腦區之LAMP-1免疫染色的形態測定法分析證實評價之所有腦區域中之LAMP-1陽性染色均顯著減弱。如圖4中所示，在評價之每一腦組織區域(皮質、尾狀核及豆狀核殼(CP)、丘腦(TH)、小腦(CBL)及白質(WM))中，相對於未經治療之IKO對照小鼠，經治療IKO小鼠中之LAMP陽性區域減小，且接近野生型小鼠之LAMP陽性區域。尤其值得注意的是，延續治療持續時間時分析之每一腦組織區域中之LAMP陽性區域進一步減小。

異常高之溶酶體活性之降低與所有腦區域中之顯著形態改良相關。該等結果證實在經基因改造之IKO小鼠模型中經IT投與之I2S能夠改變溶酶體貯積症之進展，進一步證實經IT投與之酵素(例如I2S)能夠治療與溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)有關之CNS表現。

實例8：亨特氏症患者之治療

可利用通過(例如)IT遞送直接CNS投與來有效地治療亨特氏症患者。該實例闡釋一項多中心劑量遞增研究，其經設計以評價每隔一週(EOW)總共持續40週經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)向遲發性幼兒型亨特氏症患者投與多達3種劑量量之I2S的安全性。各種適於人類治療之實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置繪示於圖45-48中。

將招收至多20名患者：

隊列1：5名患者(最低劑量)

隊列2：5名患者(中等劑量)

隊列3：5名患者(最高劑量)

隨機選取5名患者不作治療。

基於以下入選標準來選擇用於該研究之患者：(1)在30月齡之前出現首發症狀；(2)篩選時能走動(界定為能夠獨自站起來及在一隻手有支撐的情況下向前走10步)；(3)篩選時存在神經病學體徵。通常，具有造血幹細胞移植病史之患者不包括在內。

測定在患有遲發性幼兒型亨特氏症之兒童中藉由IT注射投與遞增劑量之I2S達40週之安全性。另外，亦評定I2S對大肌肉運動功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。

端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續經腦脊髓膜內投與治療有效量之I2S。本文所用之以一「間隔」投與表示週期性投與治療有效量(與一次性劑量相區分)。該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在一些實施例中，I2S係約每隔一週經腦脊髓膜內投與一次。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變化，此端視該個體之需要而定。例如，在身體性疾病或應力情況下，若抗I2S抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則劑量間之間隔可縮短。

實例9-亨特氏症患者之治療

可利用通過(例如)IT遞送直接CNS投與來有效地治療亨特氏症患者。該實例闡釋一項多中心劑量遞增研究，其經設計以評價每月總共持續6個月經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)向遲發性幼兒型亨特氏症患者投與多達3種劑量量之I2S的安全性。適於人類治療之各種實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置繪示於圖45-48中，且試驗示意圖顯示於圖62中。

將招收至多16名患者：

隊列1：4名患者(最低劑量-10 mg)

隊列2：4名患者(中等劑量-30 mg)

隊列3：4名患者(最高劑量-100 mg)

隨機選取4名患者不作治療或使用裝置。

亨特氏症患者經常發生認知及神經發育損害，包括早期發育里程牌(例如，行走、語言、排便訓練)延遲；智力缺陷；活動過度；攻擊；聽力損害；癲癇及腦積水。所有該等適應症均可為試驗標準之一部分。基於以下入選標準來選擇用於研究之患者：(1)3-18週歲；(2)智商(intelligence quotient)低於77或在過去3年中IQ點下降15至30；(3)無CSF分流或控制不良之癲癇發作；及(4)無呈現麻醉及/或手術風險之並存病。

測定在患有遲發性幼兒型亨特氏症之兒童中藉由IT注射投與遞增劑量之I2S達6個月之安全性。另外，亦評定I2S對大肌肉運動功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。

本研究之目的係評價遞增劑量之I2S的安全性及耐受性以及IDDD之安全性、耐受性及長期效能。另外，亦評定單次及重複IT給藥後CSF及周圍血液中之I2S濃度以及I2S對CF生物標記及尿GAG之影響。其他評價包括I2S對諸如生理學及神經認知評定、神經功能及腦結構體積等臨床參數之影響。另外，可評價治療對日常生活之影響以及生物標記與症狀間之關係。

藉由IT遞送I2S來治療亨特氏症患者使得各種組織(例如，神經系統、心臟、肝、腎、膽囊及其他器官)中之髓硫酯積聚減少。

儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。

應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞「一(a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的一或多個成員間包括「或」的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有一個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。。此外，應瞭解，除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等引入附屬於相同基礎技術方案(或任一其他相關技術方案)之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式(例如，以馬庫西群組或類似格式)給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之背景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。

<110>　美商舒爾人類基因療法公司

<120>　於腦脊髓膜內遞送艾杜糖醛酸鹽(IDURONATE)-2-硫酸酯酶之方法及組合物

<130>　2006685-0024

<140>　100122531

<141>　2011-06-27

<150>　61/358,857

<151>　2010-06-25

<150>　61/360,786

<151>　2010-07-01

<150>　61/387,862

<151>　2010-09-29

<150>　61/435,710

<151>　2011-01-24

<150>　61/442,115

<151>　2011-02-11

<150>　61/476,210

<151>　2011-04-15

<150>　61/495,268

<151>　2011-06-09

<160>　2

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　525

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　1

<210>　2

<211>　550

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　2

圖1係實例性圖示，其顯示在腦脊髓膜內注射3次劑量之I2S後在大腦皮質及小腦皮質之神經元(箭號)中檢測到IT遞送之I2S(包括覆蓋腦表面之腦脊髓膜細胞層(箭頭)中之I2S)。在注射2次劑量之腦中，I2S IHC之染色較弱(照片未顯示)。在媒劑對照動物之腦中的任一類型細胞中均未觀察到陽性I2S染色。40X。

圖2係實例性圖示，其顯示在腦脊髓膜內-腰椎I2S注射後I2S基因敲除(IKO)小鼠之腦中的病變逆轉。在媒劑對照動物中，H&E染色之腦組織顯示多個細胞貯積空泡(箭號)。在注射2次劑量(照片未顯示)及3次劑量之兩種小鼠中，整個腦中之細胞空泡形成有所降低。在注射3次劑量之小鼠中發現顯著降低。40X。

圖3係實例性圖示，其顯示LAMP-1之免疫組織化學染色，其中在2次劑量(照片未顯示)及3次劑量之I2S治療後與媒劑對照小鼠相比腦中之溶酶體活性顯著降低。該降低之特徵在於，在整個腦之區域中LAMP-1陽性細胞之數量減少且染色強度變弱。40X。

圖4係實例性圖示，其顯示形態測定法結果，其中在野生型(WT)、媒劑未經治療及I2S(2次及3次劑量)小鼠之間比較大腦皮質(皮質)、尾狀核(CP)、丘腦(TH)、白質(WM)及小腦(CBL)中之平均LAMP-1陽性區域，從而證實在所評價腦之所有區域中LAMP-1陽性染色皆顯著降低。數據表示為平均值±s.d.。# P<0.05；*P<0.01；**P<0.001。

圖5繪示腦細胞之實例性電子顯微照片，其在超微結構層面上顯示病理學改良。媒劑治療小鼠之神經元具有片層狀包涵體、斑馬體樣結構及含有顆粒貯積物質之空泡(插圖)，其在注射I2S之小鼠中有所減少。媒劑治療小鼠之少突膠質細胞顯示大的電子透明貯積空泡(箭號)，而注射I2S之小鼠之少突膠質細胞具有最少空泡形成。比例尺：在神經元中，2 μm；在少突膠質細胞中，500 nm。

圖6繪示實例性免疫組織化學結果，其顯示在腦脊髓膜內注射3次劑量之I2S後在肝之竇狀隙細胞中檢測到I2S。在注射2次劑量之肝中，I2S IHC染色較弱(照片未顯示)。在媒劑對照動物之肝中無陽性I2S染色。40X。

圖7繪示肝中之實例性組織。H&E染色顯示嚴重細胞空泡形成及異常高之溶酶體活性，且與WT動物相比，在媒劑對照動物中發現強LAMP-1免疫染色。在用3次及2次(照片未顯示)腦脊髓膜內劑量之I2S治療後，發現細胞空泡形成及LAMP-1免疫染色顯著降低。H&E染色顯示細胞質內空泡形成幾乎完全消失，且肝細胞結構接近正常。H&E，40X；LAMP-1，20X。

圖8A-F展示實例性數據，其藉由SEC-HPLC比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之聚集：在

-65℃及40℃下1個月。

圖9展示實例性數據，其藉由SEC-HPLC方法比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之聚集：在

-65℃及25℃下6個月。

圖10A-F展示實例性數據，其藉由SEC-HPLC方法比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之聚集：在

-65℃及2至8℃下24個月。

圖11展示實例性數據，其藉由SAX-HPLC方法比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之電荷：基線與在40℃下1個月。

圖12展示實例性數據，其藉由SAX-HPLC方法比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之電荷：基線與在25℃下6個月。

圖13展示實例性數據，其藉由SAX-HPLC方法比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之電荷：基線與在2-8℃下24個月。

圖14展示實例性數據，其比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之SDS-PAGE、考馬斯染色(Coomassie staining)：基線及在40℃下1個月。

圖15A及B展示實例性數據，其比較鹽水與磷酸鹽調配物(所有調配物均含有0.01%聚山梨醇酯-20)之SDS-PAGE、考馬斯染色：在25℃下6個月及在2-8℃下16個月。

圖16繪示實例性組織，其顯示3 mg治療群組動物之大腦。腦脊髓膜細胞中呈陽性I2S染色。4X。

圖17繪示實例性組織，其顯示30 mg治療群組動物之大腦。神經元及腦脊髓膜細胞中呈陽性I2S染色。4X。

圖18繪示實例性組織，其顯示100 mg治療群組動物之大腦。神經元及腦脊髓膜細胞中之陽性I2S染色強於3 mg及30 mg治療動物。4X。

圖19繪示實例性組織，其顯示150 mg治療群組動物之大腦。大量神經元呈I2S陽性，且腦脊髓膜細胞呈強陽性。

圖20繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦之I層內顯示I2S陽性神經元及神經膠質細胞以及腦脊髓膜細胞。40X。

圖21繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦之III層內顯示I2S陽性神經元、神經膠質細胞以及血管周細胞。40X。

圖22繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦與白質相鄰之VI層內顯示I2S陽性神經元及神經膠質細胞。40X。

圖23繪示實例性組織，其在150 mg治療群組動物之神經元(大腦)中顯示強陽性I2S染色。100X。

圖24繪示實例性組織，其顯示150 mg治療群組中頸部脊髓之I2S免疫染色。4X。

圖25繪示實例性組織，其在150 mg治療群組動物之腰椎脊髓中顯示強I2S免疫染色。4X。

圖26繪示實例性組織，其顯示在150 mg治療群組動物之腰椎區段中發現腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞及神經外膜/神經束膜/神經內膜(結締組織細胞)呈強陽性I2S免疫染色。40X。

圖27：150 mg治療群組動物之腰椎脊髓中之神經元呈強I2S陽性。40X。

圖28繪示3 mg治療群組動物之肝的實例性結果。僅竇狀隙細胞呈I2S陽性。40X。

圖29繪示30 mg治療群組動物之肝的實例性結果。竇狀隙細胞及肝細胞呈I2S陽性。40X。

圖30繪示100 mg治療群組動物之肝的實例性結果。竇狀隙細胞及肝細胞中之I2S免疫染色更強。40X。

圖31繪示150 mg治療群組動物之肝的實例性結果。在竇狀隙細胞及肝細胞中鑑別出強陽性I2S染色。40X。

圖32繪示3 mg治療群組動物之心臟的實例性結果。I2S免疫染色呈陰性。40X。

圖33繪示30 mg治療群組動物之心臟的實例性結果。間質細胞呈I2S陽性。40X。

圖34繪示100 mg治療群組動物之心臟的實例性結果。間質細胞呈I2S陽性染色。40X。

圖35繪示150 mg治療群組動物之心臟的實例性結果。間質細胞呈強I2S陽性染色。40X。

圖36繪示3 mg治療群組動物之腎的實例性結果。I2S免疫染色呈陰性。40X。

圖37繪示30 mg治療群組動物之腎的實例性結果。腎小球細胞及間質細胞呈I2S陽性。

圖38繪示100 mg治療群組動物之腎的實例性結果。腎小球細胞及間質細胞之I2S染色增強。40X。

圖39繪示150 mg治療群組動物之腎的實例性結果。近端腎小管、腎小球細胞及間質細胞呈陽性I2S染色。40X。

圖40展示免疫組織化學(IHC)研究之結果，其評價每週投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)劑量之食蟹猴之CNS組織。如藉由(IHC)所測定，I2S在整個CNS中存在廣泛細胞沈積。在所有群組之灰質中，在大腦、小腦、腦幹及脊髓之神經元中以劑量依賴性方式檢測到I2S。在較高劑量群組之表面灰質中，在表面皮質中大量大腦神經元對於I2S染色呈陽性(圖40A)。在丘腦(圖40B)、海馬(圖40C)、尾狀核(圖40D)及脊髓(圖40E)之神經元中亦檢測到I2S。腦脊髓膜及血管周細胞亦呈I2S染色陽性(圖40F)。所標識比例尺對應於25 μm。

圖41藉由相對於投與後時間繪製顱池與脊髓池中之I2S量的曲線以圖示方式比較艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)在該等池中之清除率。

圖42展示經6個月腦脊髓膜內投與非人類靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之劑量依賴性灰質沈積。所展示染色強度與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶在丘腦中之積聚一致。在本圖42中，藉由DAPI對核進行對比染色且其表現為藍色，且蛋白質(I2S)表現為綠色。

圖43展示在單次注射後及在經6個月時間多次注射後，腦脊髓膜內投與非人類靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之劑量依賴性積聚。所展示染色強度與I2S蛋白質在大腦皮質中之積聚一致。

圖44顯示艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)在非人類靈長類動物整個大腦中之細胞定位。圖44A展示自非人類靈長類動物大腦提取之腦組織之橫截面圖，而圖44B展示該區中對應於圖44A中所標識截面中之三個白質組織區域(指定為W1、W2及W3)、腦室附近白質(VW)及表面灰質(SG)組織之具體區域。

圖45A-D展示在經6個月時間每月一次注射後，腦脊髓膜內投與非人類靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之神經元及少突膠質細胞吸收及軸突結合。具體而言，圖45A、圖45B、圖45C及圖45D展示腦脊髓膜內投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之非人類靈長類動物大腦組織之神經絲染色，且分別對應於圖44B中所標識之三個白質區域(W1、W2及W3)及表面灰質(SG)區域。圖45A展示腦脊髓膜內投與之I2S在白質(W1)組織中之少突膠質細胞吸收。圖45B及圖45C分別展示腦脊髓膜內投與之I2S在W2及W3白質組織中之少突膠質細胞吸收及軸突結合。圖45D展示腦脊髓膜內投與之I2S在表面灰質(SG)組織中之神經元吸收。

圖46展示艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶在非人類靈長類動物之腦室附近白質(VW)中之細胞鑒定。如疊置影像中所繪示，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶未與髓磷脂結合(紅色)。在本圖46中，藉由DAPI對核進行對比染色(左下圖)。蛋白質(I2S)在左上框中出現。

圖47展示對大腦室內(ICV)或腦脊髓膜內(IT)投與單次注射艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之健康比格犬組織之染色。如圖47A-47H中所繪示，I2S廣泛分佈在IT及ICV群組之整個灰質中，如藉由免疫組織化學(IHC)所測定。圖47A及47B展示，在IT及ICV群組之大腦皮質中，所有六個神經元層(自表面分子層至內部深層)中之神經元均呈I2S陽性。圖47C及47D展示，在IT及ICV群組之小腦皮質中，在神經元(包括普爾欽細胞)中檢測到I2S。類似地，圖47E及47F展示，在IT及ICV群組中，海馬中之大量神經元呈I2S陽性。最後，影像g及h顯示，在IT及ICV群組中，在丘腦及尾狀核中亦發現I2S陽性神經元。在本圖47中，用箭號指示I2S染色。

圖48以比較方式展示未經治療或腦脊髓膜內投與I2S之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶基因敲除(IKO)小鼠之胼胝體組織(縮寫V=空泡)。如圖所繪示，經治療IKO小鼠呈現，在I2S治療IKO小鼠之胼胝體及穹窿組織中，某些溶酶體貯積症之細胞空泡形成特徵減少。

圖49A在20X及40X放大倍數下展示，經治療IKO小鼠(圖49A)之表面大腦皮質組織中之溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)(溶酶體疾病之病理學生物標記)之存在相對於未經治療IKO對照小鼠(圖49B)顯著減少。

圖50繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)。

圖51繪示實例性PORT-A-CATH^®低型腦脊髓膜內植入式輸液系統(low profile intrathecal implantable access system)。

圖52繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)。

圖53繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)，其容許在家投與CNS酵素替代療法(ERT)。

圖54展示單次大腦內注射艾杜硫酶後對神經元(普爾欽細胞)中之空泡形成的實例性影響。

圖55展示按劑量及區域顯示之腦中之實例性I2S活性。

圖56展示在不同深度之大腦皮質對艾杜硫酶進行免疫組織化學定位之實例性數據。在腦之層I(圖A)、層III(圖B)及層VI(圖C)中發現I2S陽性神經元、神經膠質細胞及腦脊髓膜細胞。此動物在30mg劑量群組中。(40X放大倍數)

圖57展示在腦脊髓膜內給予艾杜硫酶後猴子脊髓中之實例性I2S活性。

圖58展示在腦脊髓膜內給予艾杜硫酶後猴子肝、心臟及腎中之實例性I2S活性。

圖59繪示遞增亨特-IT試驗計劃之實例性示意圖。

圖60展示在30 mg劑量後不同腦組織切片中I2S濃度之實例性量測。不同曲線對應於不同量測時間。

圖61展示在經一段時間經由不同投與途徑投與以達成不同產物濃度後I2S濃度之實例性量測。

圖62係在食蟹猴中IV、IT-L或ICV給藥後在t=5小時對¹²⁴I標記艾杜硫酶-IT之PET成像的實例性圖示。

圖63展示腦脊髓膜內藥物遞送裝置IDDD且為其實例性圖示。

圖64繪示位於個體體內(圖64A)及展示於平坦表面上(圖64B)之IDDD的各個特徵。

(無元件符號說明)

Claims (65)

1. 一種穩定調配物於製備供治療亨特氏症候群(Hunters Syndrome)的藥物之用途，其中該藥物係以腦脊髓膜內投與個體，且其中該調配物包含：濃度為5-300mg/ml之艾杜糖醛酸鹽(iduronate)-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質，及磷酸鹽，其中磷酸鹽濃度為至多50mM。
2. 如請求項1之用途，其中該腦脊髓膜內投與不會在該個體中引起實質不良效應。
3. 如請求項1之用途，其中該腦脊髓膜內投與不會在該個體中引起實質適應性T細胞介導之免疫反應。
4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與使得該I2S蛋白質遞送至目標腦組織中。
5. 如請求項4之用途，其中該投與使得該I2S蛋白質遞送至白質或灰質中之神經元。
6. 如請求項4之用途，其中該投與使得該I2S蛋白質遞送至白質及灰質中之神經元。
7. 如請求項4之用途，其中該I2S蛋白質係被送至神經元、神經膠質細胞、血管周圍細胞及/或腦脊髓膜細胞。
8. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該I2S蛋白質被進一步遞送至脊髓中之神經元。
9. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與進一步使得該I2S蛋白質全身遞送於周圍目標組織中。
10. 如請求項8之用途，其中該周圍目標組織係選自肝、腎及/或心臟。
11. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與使得腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之溶酶體定位。
12. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與使得該腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之糖胺聚多糖(GAG)貯積減少。
13. 如請求項12之用途，其中該GAG貯積與對照組相比減少至少20%、40%、50%、60%、80%、90%、1倍(fold)、1.5倍或2倍。
14. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與使得神經元中之空泡形成減少。
15. 如請求項14之用途，其中該神經元包含普爾欽細胞(Purkinje cells)。
16. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物之腦脊髓膜內投與使得該腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之I2S酵素活性提高。
17. 如請求項16之用途，其中該I2S酵素活性與對照組相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
18. 如請求項15之用途，其中該提高的I2S酵素活性為至少10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg或600nmol/hr/mg。
19. 如請求項16之用途，其中該I2S酵素活性之提高係在腰區中。
20. 如請求項18之用途，其中該腰區中提高的I2S酵素活性為至少2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000n-mol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg或10,000nmol/hr/mg。
21. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物之腦脊髓膜內投與使得該亨特氏症候群之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或發作延遲。
22. 如請求項21之用途，其中該亨特氏症候群之至少一種症狀或特徵係認知損害；白質損傷；腦實質、神經節、胼胝體及/或腦幹中之血管周圍間隙擴大；萎縮；及/或腦室擴大。
23. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與係每兩週實施一次。
24. 如請求項23之用途，其中該腦脊髓膜內投與係每月實施 一次。
25. 如請求項23之用途，其中該腦脊髓膜內投與係每兩個月實施一次。
26. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與係與靜脈內投與連合使用。
27. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該腦脊髓膜內投與係在無並行免疫抑制療法的情況下使用。
28. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該I2S蛋白質係以30mg/ml之濃度存在。
29. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該I2S蛋白質係以10mg/ml之濃度存在。
30. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該I2S蛋白質包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。
31. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物進一步包含鹽。
32. 如請求項31之用途，其中該鹽係NaCl。
33. 如請求項32之用途，其中該NaCl係以137mM至154mM範圍之濃度存在。
34. 如請求項32之用途，其中該NaCl係以154mM之濃度存在。
35. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物進一步包含表面活性劑。
36. 如請求項35之用途，其中該表面活性劑係選自由下列組 成之聚山梨醇酯表面活性劑：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
37. 如請求項36之用途，其中該聚山梨醇酯表面活性劑係聚山梨醇酯20。
38. 如請求項37之用途，其中該聚山梨醇酯20係以0%至0.02%範圍之濃度存在。
39. 如請求項37之用途，其中該聚山梨醇酯20係以0.005%之濃度存在。
40. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物具有3至8之pH。
41. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物具有5.5至6.5之pH。
42. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物具有6.0之pH。
43. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物係液體調配物。
44. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該調配物係調配成凍乾之乾燥粉末。
45. 一種醫藥組合物，其包含濃度為至少5mg/ml之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質，且其中該組合物包含0-50mM之磷酸鹽。
46. 如請求項45之組合物，其中該I2S蛋白質係以10mg/ml至300mg/ml範圍之濃度存在。
47. 如請求項45之組合物，其中該I2S蛋白質係以選自10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml或100mg/ml之濃度存在。
48. 如請求項45至47中任一項之組合物，其中該I2S蛋白質包含胺基酸序列SEQ ID NO：1。
49. 如請求項45至47中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含鹽。
50. 如請求項49之組合物，其中該鹽係NaCl。
51. 如請求項50之組合物，其中該NaCl係以137mM至154mM範圍之濃度存在。
52. 如請求項50之組合物，其中該NaCl係以154mM之濃度存在。
53. 如請求項45之組合物，其中該組合物進一步包含表面活性劑。
54. 如請求項53之組合物，其中該表面活性劑係選自由下列組成之聚山梨醇酯表面活性劑：聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80及其組合。
55. 如請求項54之組合物，其中該聚山梨醇酯表面活性劑係聚山梨醇酯20。
56. 如請求項55之組合物，其中該聚山梨醇酯20係以0%至0.02%範圍之濃度存在。
57. 如請求項55之組合物，其中該聚山梨醇酯20係以0.005%之濃度存在。
58. 如請求項45至47及53至57中任一項之組合物，其中該組 合物具有5.5至6.5之pH。
59. 如請求項45至47及53至57中任一項之組合物，其中該組合物具有6.0之pH。
60. 如請求項45至47及53至57中任一項之組合物，其中該組合物係液體組合物。
61. 如請求項45至47及53至57中任一項之組合物，其中該組合物係凍乾之乾燥粉末。
62. 一種醫藥組合物，其包含以10mg/ml之濃度存在之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)蛋白質，以154mM之濃度存在之NaCl，以0.005%之濃度存在之聚山梨醇酯20，以及具有6.0之pH。
63. 一種容器，其包含如請求項45至62中任一項之醫藥組合物之單一劑型，其中該容器係選自安瓿、小瓶、藥筒、二室注射器給藥系統(lyo-ject)或預填充注射器。
64. 如請求項63之容器，其中該醫藥組合物係以0.25至5.0mL之體積存在。
65. 如請求項63之容器，其中該醫藥組合物係以0.25至3.0mL之體積存在。