KR20220015506A

KR20220015506A - 이듀로네이트-2-설파타제의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들

Info

Publication number: KR20220015506A
Application number: KR1020227002252A
Authority: KR
Inventors: 가오종 주; 크리스 로웨; 자흐라 샤로크; 제임스 크리스티안; 릭 파너; 징 판; 테레사 레아 라이트; 페리클레스 칼리아스
Original assignee: 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크.
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-25
Publication date: 2022-02-08
Also published as: WO2011163649A3; IL284599B1; EP3626258A1; US20110318323A1; CY1122307T1; AU2019203515A1; KR102356192B1; US8545837B2; WO2011163649A2; IL284599B2; KR102603430B1; CN103179980B; KR20190008996A; IL268085A; IL268085B; MX2013000322A; LT2593131T; IL284599A; SI2593131T1; JP6045492B2

Abstract

본 발명은 무엇보다도 리소좀 축적병들 (lysosomal storage diseases)의 효과적인 치료를 위한 리소좀 효소들의 CNS 전달을 위한 조성물들 및 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 본 발명은 헌터 증후군의 치료를 위한 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 염, 및 폴리솔베이트 표면활성제를 포함하는 직접 CNS 경막내 투여를 위한 안정한 제형물을 포함한다.

Description

이듀로네이트-2-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들{METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF IDURONATE-2-SULFATASE}

관련 출원들에 관한 상호 참조

본 출원은 미국 가특허출원들 2010년 6월 25일자로 제출된 일련번호 제 61/358,857호; 2010년 7월 1일자로 제출된 제61/360,786호; 2010년 9월 29일자로 제출된 제 61/387,862호; 2011년 1월 24일자로 제출된 제 61/435,710호; 2011년 2월 11일자로 제출된 제 61/442,115호; 2011년 4월 15일자로 제출된 제 61/476,210호; 및 2011년 6월 9일자로 제출된 제 61/495,268호에 대한 우선권을 주장하고 있고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참조문헌으로 통합되어 있다.

본 출원은 동일한 날짜에 제출된 "치료제들의 CNS 전달(CNS Delivery of Therapeutic Agents)"; 동일한 날짜에 제출된 "헤파란 N-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Heparan N- Sulfatase)"; 동일한 날짜에 제출된 "아릴설파타제 A의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A)"; 동일한 날짜에 제출된 "β-갈락토세레브로시다제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of β-Galactocerebrosidase)";; 동일한 날짜에 제출된 "산필리포 증후군 B형의 치료 (Treatment of Sanfilippo Syndrome Type B)"라는 명칭을 가지는 미국 출원들에 관한 것이고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합되어 있다.

효소 대체 요법 (Enzyme replacement therapy, ERT)은 개체에게 천연 또는 재조합-유래 단백질들 및/또는 효소들의 전신적 투여가 관여한다. 승인된 요법들은 전형적으로 정맥내 투여되고 근간이 되는 효소 결핍의 신체적 증상들을 치료하는 데 일반적으로 효과적이다. 중추신경계 (CNS)의 세포들 및 조직들 내에 정맥내 투여된 단백질 및/또는 효소의 제한된 분배의 결과로서, CNS 병인학 (CNS etiology)을 가지는 질환들의 치료는 정맥내 투여된 단백질들 및/또는 효소들이 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier, BBB)을 적당하게 통과하지 못하기 때문에 특히 문제가 되어왔다.

혈액-뇌 장벽 (BBB)은 박테리아, 거대분자들 (예로, 단백질들) 및 기타 친수성 분자들과 같은 혈류에서 해로운 물질들로부터 중추신경계 (CNS)를 보호하도록 BBB를 거쳐서 근간이 되는 뇌척수액 (CSF) 및 CNS 내로 이러한 물질들의 확산을 제한하는 기능을 하는 내피세포들을 포함하는 구조적 체계이다.

조직 분포를 변경하는 직접적인 두개내 (intra-cranial) 주사, BBB의 일시적 투과화 (transient permeabilization), 및 활성을 가진 제제의 변형을 포함하는, 치료제의 뇌 전달을 증진하도록 BBB를 기만하는 여러 가지의 방식들이 존재한다. 뇌 조직 내로 치료제의 직접 주사는 혈관 구조 (vasculature)를 완전하게 우회하지만, 두개내 주사들 및 투여 부위로부터 적게 확산되는 활성을 가진 제제로 인해 발생되는 합병증들 (감염, 조직 손상, 면역 반응)의 위험을 주로 겪는다. 지금까지, 뇌 물질 내로 단백질들의 직접 투여는 확산 장벽들 및 투여가능한 치료제의 제한된 부피로 인해 유의한 치료 효과를 달성하지 못하였다. 전도-조력 (convection-assisted) 확산은 저속의 장기간 주입 (long-term infusions)을 사용하는 뇌 실질 (parenchyma)에 설치된 카테터들에 의해 연구되어 왔지만 (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), 현재 승인된 요법들은 본 장기 요법의 접근법을 전혀 사용하지 않고 있다. 또한, 뇌내 카테터들의 설치는 매우 침습적이고 임상적 대안으로서 별로 바람직하지 않다.

경막내 (IT) 주사, 또는 뇌척수액 (CSF)으로 단백질들의 투여도 역시 시도되어 왔지만, 치료적 성공은 아직 달성하지 못하였다. 본 치료의 대부분의 도전은 연속적인 확산을 방해하는 뇌실의 뇌실막 내층 (ependymal lining)과 매우 강하게 결합하는 활성을 가진 제제의 경향이 되어왔다. 현재로는, CSF로의 직접 투여에 의해 뇌의 유전적 질환을 치료하는 승인된 제품들이 전혀 없다.

사실상, 많은 사람들이 뇌의 표면에서는 확산에 대한 장벽, 뿐만 아니라 효과적이고 편리한 전달 방법들의 부족이 너무 큰 장애물이 되어 뇌 질환이라면 모두에서 적당한 치료적 효과를 달성할 수 없는 것으로 여겨왔다.

많은 리소좀 축적 장애들이 신경계에 영향을 주고 따라서 전통적인 요법들로 이들 질환들을 치료하는 데 독특한 문제점을 보여준다. 침범된 환자들의 뉴런들 및 뇌척수막에서 글리코아미노글리칸들 (glycosaminoglycans, GAGs)의 많은 생성이 종종 존재하고 다양한 형태들의 CNS 증상들의 유발시킨다. 지금까지, 리소좀 장애로부터 초래되는 CNS 증상들은 입수가능한 수단이라면 모두에 의해서 성공적으로 치료되지 못하였다.

따라서, 뇌에 치료제들을 효과적으로 전달해야 하는 강한 필요성이 있다. 보다 상세하게는, 리소좀 축적 장애들을 치료하기 위해 중추신경계로 활성을 가진 제제들의 더욱 효과적인 전달의 강한 필요성이 있다.

본 발명은 중추신경계 (CNS)로 치료제들의 직접적인 전달을 위한 효과적이고 덜 침습적인 접근법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로 리소좀 축적병 (lysosomal storage disease) (예로, 헌터 증후군)의 대체 효소 (예로, 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S))가 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (cerebrospinal fluid, CSF) 내로 높은 농도 (예로, 약 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml 이상)로 직접 도입될 수 있어 효소가 다양한 표면들을 거쳐서 효과적으로 또한 광범위하게 확산되고 깊은 뇌의 부위들을 포함하는 뇌를 거쳐서 다양한 부위들을 침투하는 예기치 않은 발견에 기초하고 있다. 보다 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 높은 농도의 단백질이 단순한 식염수 또는 완충용액-기초 제형물을 사용하여 그리고 개체에서 심각한 면역 반응과 같은 실질적인 역효과들을 유발하지 않고도 전달될 수 있는 점을 기술하였다. 따라서, 본 발명은 CNS 성분들을 가지는 다양한 질환들 및 장애들, 상세하게는 리소좀 축적병을 치료하기 위한, 매우 효율적이고, 임상적으로 바람직하며 환자-친근한 직접적인 CNS 전달 접근법을 제공한다. 본 발명은 CNS 표적 (CNS targeting) 및 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy)의 분야에서 중대한 진보를 보여주고 있다.

하기 자세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명자들은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질의 효과적인 경막내 (IT) 투여를 위한 안정한 제형물들을 성공적으로 개발하였다. 그러나, 본 명세서에서 기술된 다양한 안정한 제형물들은 일반적으로 다양한 다른 리소좀 효소들을 포함하는 치료제들의 CNS 전달에 적합한 점이 고려된다. 따라서, 본 발명에 따른 안정한 제형물들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질내, 뇌내, 대뇌 측실내 (ICV), 경막내 (예로, IT-요추, IT-대수공) 투여들을 포함하는 다양한 기법들 및 경로들 또한 CNS 및/또는 CSF로 직접 또는 간접적 주사를 위한 기타 다른 기법들 및 경로들을 통한 CNS 전달에 사용될 수 있다.

또한 본 명세서에서 기술된 다양한 안정한 제형물들은 일반적으로 리소좀 축적병들에 대한 다양한 대체 효소들을 포함하는 치료적 단백질들과 같은 기타 치료제들의 CNS 전달에 적합한 점이 고려된다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 합성, 재조합, 유전자-활성화 또는 천연 효소일 수 있다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 염 (salt), 및 폴리솔베이트 표면활성제 (polysorbate surfactant)를 포함하는 직접 CNS 경막내 투여를 위한 안정한 제형물을 제공한다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 대략 1-300 mg/ml (예로, 1-250 mg/ml, 1-200 mg/ml, 1-150 mg/ml, 1-100 mg/ml, 1-50 mg/ml)로부터 나온 범위의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml으로부터 선택되는 농도까지 존재한다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 I2S 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물을 포함한다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 서열번호 1과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 일치하는 아미노산 서열을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물은 염을 포함한다. 일정 구현예들에서, 염은 NaCl이다. 일정 구현예들에서, NaCl는 대략 0-300 mM (예로, 0-250 mM, 0-200 mM, 0-150 mM, 0-100 mM, 0-75 mM, 0-50 mM, 또는 0-30 mM)로부터 나온 범위의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, NaCl은 대략 137-154 mM 범위의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, NaCl는 대략 154 mM의 농도로 존재한다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 폴리솔베이트 표면활성제가 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60, 폴리솔베이트 80 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물을 포함한다. 일정 구현예들에서, 폴리솔베이트 표면활성제는 폴리솔베이트 20이다. 일정 구현예들에서, 폴리솔베이트 20은 대략 0-0.02% 범위의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, 폴리솔베이트 20은 대략 0.005%의 농도로 존재한다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 상기에 더하여 제형물이 완충제를 포함하는, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물을 포함한다. 일정 구현예들에서, 완충제는 포스페이트 (phosphate), 아세테이트(acetate), 히스티딘 (histidine), 숙시네이트 (succinate), 트리스 (Tris), 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 완충제는 포스페이트이다. 일정 구현예들에서, 포스페이트는 많아야 50 mM (예로, 많아야 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 또는 5 mM)의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, 포스페이트는 많아야 20 mM의 농도로 존재한다. 다양한 관점에서, 본 발명은 제형물이 대략 pH 3-8 (예로, 대략 4-7.5, 5-8, 5-7.5, 5-6.5, 5-7.0, 5.5-8.0, 5.5-7.7, 5.5-6.5, 6-7.5, 또는 6-7.0)를 가지는, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물을 포함한다. 일정 구현예들에서, 제형물은 대략 pH 5.5-6.5 (e.g., 5.5, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 또는 6.5)를 가진다. 일정 구현예들에서, 제형물은 대략 pH 6.0을 가진다.

다양한 구현예들에서, 본 발명은 제형물이 액상 제형물인, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물들을 포함한다. 다양한 구현예들에서, 본 발명은 제형물이 동결건조된 건조 파우더인, 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두의 안정한 제형물들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 본 발명은 대략 1 내지 300 mg/mL로부터 나온 범위의 농도로 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 대략 154 mM의 농도로 NaCl, 대략 0.005%의 농도로 폴리솔베이트 20, 및 대략 6.0의 pH를 포함하는 경막내 투여를 위한 안정한 제형물을 포함한다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 대략 10 mg/ml의 농도이다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 대략 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml의 농도이다.

다양한 관점들에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 다양한 구현예들에서의 안정한 제형물의 단일 투여 형태를 포함하는 용기 (container)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 용기는 앰풀 (ampule), 바이알 (vial), 병 (bottle), 카트리지 (cartridge), 저장조 (reservoir), 동결건조-용기 (lyo-ject), 또는 미리-충전된 주사기 (pre-filled syringe)로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 용기는 미리-충전된 주사기이다. 일정 구현예들에서, 미리-충전된 주사기는 구운 실리콘 코팅을 가진 보로실리케이트 유리 (borosilicate glass) 주사기들, 분사된 실리콘을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 또는 실리콘이 없는 플라스틱 레진 주사기들로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 안정한 제형물은 약 50 mL (예로, 45 ml, 40 ml, 35 ml, 30 ml, 25 ml, 20 ml, 15 ml, 10 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml) 이하의 부피로 존재한다. 일정 구현예들에서, 안정한 제형물은 약3.0 mL 이하의 부피로 존재한다.

다양한 관점들에서, 본 발명은 본 명세서에서 기술된 구현예들이라면 모두에 따른 제형물 치료의 필요가 있는 개체에게 경막내 투여하는 단계를 포함하는 헌터 증후군을 치료하는 방법을 포함한다.

일정 구현예들에서, 본 발명은 대략 1-300 mg/mL로부터 나온 범위의 농도로 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 대략 145 mM의 농도로 NaCl, 대략 0.005%의 농도로 폴리솔베이트 20, 및 대략 6.0의 pH를 포함하는 제형물 치료의 필요가 있는 개체에게 경막내 투여하는 단계를 포함하는 헌터 증후군을 치료하는 방법을 포함한다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 개체에게 실질적인 역효과들 (예로, 심각한 면역반응)을 전혀 유발하지 않는다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 개체에게 실질적인 적응적 T-세포-매개성 면역반응을전혀 유발하지 않는다.

일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 뇌, 척수, 및/또는 말초 기관들에서 다양한 표적 조직들에게로 I2S 단백질의 전달을 유도한다. 일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 표적 뇌 조직들에게로 I2S 단백질의 전달을 유도한다. 일정 구현예들에서, 뇌 표적 조직들은 백색질 및/또는 회색질에서의 뉴런들을 포함한다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 뉴런들 (neurons), 교아세포들 (glial cells), 혈관주위 세포들 (perivascular cells) 및/또는 뇌척수막 세포들 (meningeal cells)로 전달된다. 일정 구현예들에서, I2S 단백질은 좀 더 나아가 척수에 있는 뉴런들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 말초 표적 조직들로 I2S 단백질의 전신적 전달을 유도한다. 일정 구현예들에서, 말초 표적 조직들은 간, 신장, 비장 및/또는 심장으로부터 선택된다.

일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 세포성 리소좀 정착 (lysosomal localization)을 유도한다. 일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 GAG 축적의 감소를 유도한다. 일정의 구현예들에서, GAG 축적은 대조군 (예로, 개체에서 치료전 GAG 축적)과 대비하여 적어도 10%, 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 또는 2배로 감소된다. 일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 뉴런들에서 감소된 공포화 (vacuolization) 를 유도한다 (예로, 대조군과 대비하여 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 또는 2배). 일정 구현예들에서, 뉴런들은 퍼킨지 세포들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 증가된 I2S 효소 활성을 유도한다. 일정의 구현예들에서,

I2S 효소 활성은 대조군 (예로, 개체에서 치료전 내재적 효소 활성)과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가된다. 일정의 구현예들에서, 증가된 I2S 효소 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg이다.

일정 구현예들에서, I2S 효소 활성은 요추 부위 (lumbar region)에서 증가된다. 일정의 구현예들에서, 요추 부위에서 증가된 I2S 효소 활성은 적어도 대략 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg이다.

일정 구현예들에서, 제형물의 경막내 투여는 헌터 증후군의 적어도 하나의 증상 또는 특징의 감소된 강도, 중증도, 또는 빈도 또는 지연된 발병을 유도한다. 일정 구현예들에서, 헌터 증후군의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 인지 손상, 백색질 병변들, 뇌 실질, 신경절, 뇌들보 및/또는 뇌줄기에서의 확장된 혈관주위 공간들, 위축, 및/또는 뇌실비대증이다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 2주마다 한 번 시행된다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 매월 한 번 시행된다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 2개월마다 한 번 시행된다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매월 두 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매주 한 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매주 두 번 또는 여러 번이다. 일정 구현예들에서, 투여는 연속적인 관류 펌프를 통하는 것과 같이 연속적이다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 정맥내 투여와 조합하여 시행된다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매주 한 번인 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 2주마다 한 번인 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매월 한 번인 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 2개월마다 한 번인 빈도이다. 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 주당 두 번, 매주, 격주, 또는 매월 두 번과 같은 많아야 월간 투여의 빈도이다.

일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여는 동일한 날짜에 수행된다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 적어도 2일 이내, 적어도 3일 이내, 적어도 4일 이내, 적어도 5일 이내, 적어도 6일 이내, 적어도 7일 이내, 또는 적어도 한 주 이내와 같이 서로의 소정의 시간 간격 이내에서 수행되지 않는다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 매주 교대하는 투여들, 2주마다 교대로, 매월 두 번, 또는 매월과 같이 교대하는 스케쥴로 수행된다. 일정의 구현예들에서, 경막내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월, 정맥내 투여의 스케쥴과 같은 투여 스케쥴에서의 정맥내 투여를 대체하고, 본 스케쥴에서 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 투여는 정맥내 투여를 대신하여 경막내 투여로 대체될 수 있다.

일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 먼저 정맥내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) IT 투여들로 이어지는 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 것과 같이 순서적으로 수행된다. 일정 구현예들에서, 먼저 경막내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 정맥내 투여들로 이어진다 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여).

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 정맥내 투여의 부재 시 사용된다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 동시적인 면역억제 요법의 부재 시 사용된다.

도면들은 제한하려는 것이 아니라, 단지 도시 (illustration)의 목적들을 위한 것이다.
도 1은 I2S의 3번 용량의 경막내 주사들에 이어서 뇌의 표면을 감싸는 (화살표 머리) 뇌척수막 세포들의 층을 포함하는 대뇌 피질 및 소뇌 피질에 있는 뉴런들 (화살표)에서 검출되는 전달된 I2S를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 2번 용량 주사된 뇌들에서는 I2S IHC의 염색이 더 약하였다 (사진 미도시). 운반체 대조군 동물들의 뇌에 있는 세포 유형이라면 모두의 경우 양성 I2S 염색이 전혀 관찰되지 않았다. 40배.
도 2는 경막내-요추 I2S 주사들 이후 IKO마우스의 뇌에서 병리학의 역전을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. H&E 염색된 뇌 조직들은 운반체 대조군 동물들에서 수많은 세포성 축적 공포들 (화살표)을 보여주었다. 세포성 공포화 (cellular vacuolation)는 3번 용량 (사진 미도시) 및 3번 용량 주사된 마우스 둘 다에서 뇌 전체를 통하여 감소되었다. 현저한 감소가 3번 주사된 마우스에서 확인되었다. 40배
도 3은 LAMP-1의 면역조직화학적 염색을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 운반체 대조군 마우스와 대비하여, I2S 치료의 2번 용량들 (사진 미도시) 및 3번 용량들 이후 뇌들에서 리소좀 활성의 현저한 감소가 있다. 감소는 뇌 전체를 통한 부위들에서 LAMP-1 양성 세포들의 수 감소 및 더 옅은 염색 강도를 특징으로 한다. 40배.
도 4는 대뇌 피질 (Cortex), 미상엽핵 (CP), 시상 (TH), 백색질 (WM) 및 소뇌 (CBL)에 있는 야생형 (WT), 운반체 미치료 및 I2S (2 및 3번 용량들) 마우스 중의 평균 LAMP-1 양성 영역의 비교로부터 얻은 형태측정 결과들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서 유의한 감소가 있었던 점을 검증하였다. 데이타는 평균 ± s.d로서 나타낸다. # P<0.05; * P<0.01; ** P<0.001.
도 5는 초구조적 수준에서 병리학적 향상들을 보여주는 뇌 세포들의 대표적인 전자현미경 사진들을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 마우스의 뉴런들은 라멜라화된 봉입들, 얼룩무늬체-유사 구조들, 및 과립 축적 물질 (삽입)을 포함하는 공포들을 가졌고, 이는 I2S 주사된 마우스에서 감소되었다. 운반체 처리된 마우스의 희소돌기교아세포들은 큰 전자-발광 축적 공포들 (화살표)를 보여주었고 한편 I2S-주사된 마우스의 희소돌기교아세포들은 최소의 공포화를 가졌다. 척도 막대기: 뉴런들에서, 2um; 희소돌기교아세포들에서, 500 nm.
도 6은 I2S의 3번 용량들의 경막내 주사들에 이어서 간의 시누소이드 세포들에서 검출되는 I2S를 보여주는 대표적인 면역조직화학 결과들을 나타낸 것이다. 2번 용량 주사된 간들에서 2S IHC 염색은 더 약하였다 (사진 미도시). 운반체 조절된 동물들의 간에서는 양성 I2S 염색이 전혀 없음. 40배.
도 7은 간으로부터 얻은 대표적인 조직을 나타낸 것이다. 심하 세포성 공포화 및 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 H&E 염색에 의해 드러났고, 강한 LAMP-1 면역염색이 WT 마우스와 대비하여 운반체 조절된 동물들에서 확인되었다. 3 및 2번 (사진 미도시) 용량들의 I2S 처리로 경막내 치료 이후 세포성 공포화 및 LAMP-1 면역염색의 현저한 감소가 확인되었다. H&E 염색은 세포질내 공포화가 거의 정상적 간 세포 구조를 가지며 거의 완벽하게 사라지는 점을 드러냈다. H&E, 40배; LAMP-1, 20배.
도 8A 내지 도 8F는 SEC-HPLC에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: < 65℃ 및 40℃에서 1개월.
도 9는 SEC-HPLC방법에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: < 65℃ 및 25℃에서 6개월.
도 10A 내지 도 10F는 SEC-HPLC방법에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: < 65℃ 및 2 내지 8℃에서 24개월.
도 11은 SAX-HPLC방법에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: 기저선 대비 40℃에서 1개월.
도 12는 SAX-HPLC방법에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: 기저선 대비 25℃에서 6개월.
도 13은 SAX-HPLC방법에 의해 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 응집을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: 기저선 대비 2 내지 8℃에서 24개월.
도 14는 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 SDS-PAGE 쿠마시 염색을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: 40℃에서 기저선 및 1개월.
도 15A 및 도 15B는 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 SDS-PAGE 쿠마시 염색을 비교하는 대표적인 데이터를 나타낸 것이다: 25℃에서 6개월 및 16개월 동안 2 내지 8℃.
도 16은 3 mg 치료 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 뇌척수막 세포들에서 양성 I2S 염색. 4배.
도 17은 30 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 뉴런들 및 뇌척수막세포들에서의 양성 I2S 염색. 4배.
도 18은 100 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 뉴런들 및 뇌척수막세포들에서의 양성 I2S 염색이 3 및 30 mg 처리 동물들에서보다 더 강하였다. 4배.
도 19는 150 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 큰 뉴런들 집단이 강하게 양성인 뇌척수막 세포들과 함께 I2S 양성이었다. 4배.
도 20은 30 mg 처리 그룹 동물에서 대뇌의 층 I 안에 있는 I2S 양성 뉴런들 및 교아세포들을 뇌척수막 세포들과 함께 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 21은 30 mg 처리 그룹 동물에서 대뇌의 층 III 안에 있는 I2S 양성 뉴런들, 교아세포들을 혈관주위 세포들과 함께 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 22는 30 mg 처리 그룹 동물에서 백색질에 인접한 대뇌의 층 IV 안에 있는 I2S 양성 뉴런들 및 교아세포들을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 23은 150 mg 처리 그룹의 뉴런들 (대뇌)에서 강한 양성 I2S 염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 100배.
도 24는 150 mg 처리 그룹에서 경부 척수의 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 4배.
도 69는 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 척수에서 강한 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 4배.
도 26은 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 절편에서 뇌척수막 세포들, 교아세포들, 및 신경외/신경주위/신경내막 (연결 세포들)의 강한 양성 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 27은 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 척수에 있는 뉴런들이 강한 I2S 양성인 점을 나타낸 것이다. 4배.
도 28은 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 시누소이드 세포들만이 I2S 양성이었다. 40배.
도 29는 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 시누소이드 세포들 및 간세포들 (hepatocytes)이 I2S 양성이었다. 40배.
도 30은 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 시누소이드 세포들 및 간세포들에서 보다 더 강하였다. 40배.
도 31은 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 강한 양성 I2S 염색이 시누소이드 세포들 및 간세포들에서 확인되었다. 40배.
도 32는 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 음성이었다. 40배.
도 33은 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 간질 세포들은 I2S 양성이었다. 40배.
도 34는 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 양성 간질 세포 염색. 40배.
도 35는 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 강한 양성 간질 세포 염색이 관찰되었다. 40배.
도 36은 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 양성이었다. 40배.
도 37은 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 사구체 및 간질 세포들은 I2S 양성이었다.
도 38은 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 증가된 사구체 및 간질 세포 염색. 40배.
도 39는 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 근위세관, 사구체 및 간질 세포들의 양성 I2S 염색. 40배.
도 40은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 매주 용량들이 투여된 사이노몰 원숭이들의 CNS 조직들을 평가하는 면역조직화학 (IHC) 연구들의 결과들을 나타낸 것이다. (IHC)에 의해 결정된 바와 같이, CNS 전체를 통하여 I2S의 세포성 침전이 널리 퍼져있었다. 회색질에서, I2S 가 모든 그룹들의 대뇌, 소뇌, 뇌줄기, 및 척수의 뉴런들에서 용량-의존적 방식으로 검출되었다. 더 높은 용량 그룹들의 표면 회색질에서는, 많은 뇌 뉴런들이 피질 표면에서 I2S 염색에 대해 양성이었다 (도 40A). I2S는 시상 (도 40B), 해마 (도 40C), 미상엽핵 (도 40D) 및 척수 (도 40E)에 있는 뉴런들에서도 역시 검출되었다. 뇌척수막 및 혈관주위 세포들도 역시 I2S 염색 양성이었다 (도 40F). 확인된 크기 막대는 25um에 해당한다.
도 41은 두개골 및 척수 풀들에서 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 청소를 투여에 이어진 시간과 대비하여 이러한 풀들에서 I2S양을 좌표 표시하여 그래프로 비교한 것이다.
도 42는 6개월 동안 비인간 영장류들에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 용량 의존적 회색질 침전을 나타낸 것이다. 도시된 염색 강도는 시상에서 이듀로네이트-2-설파타제의 축적와 부합한다. 본 도 86에서, 핵은 DAPI에 의해 반대염색되어 청색으로 나타나고 단백질 (I2S) 은 녹색으로 나타난다.
도 43은 6개월 기간 동안 단일 주사에 이어서 또한 다중 주사들에 이어서 비인간 영장류들에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 용량 의존적 축적을 나타낸 것이다. 도시된 염색 강도는 대뇌 피질에서 I2S단백질의 축적와 부합한다. 도 44는 비-인간 영장류의 대뇌 전체를 통하여 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 세포성 정착을 나타낸 것이다.
도 44A는 비-인간 영장류의 대뇌로부터 추출된 뇌 조직의 교차-단면을 나타내는 한편, 도 44B는 도 44A에서 확인된 단면의 백색질 조직들의 세 가지 영역들 (W1, W2 및 W3라고 명명됨), 뇌실 근처의 백색질 (VW) 및 표면 회색질 (SG) 조직들에 해당하는 부위의 특정한 영역들을 도시한다.
도 45A 내지 도 45D는 6개월 기간 동안 매주 주사들에 이어서 비-인간 영장류에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 신경적 및 희소돌기아교세포 흡수 및 축삭 결합을 나타낸 것이다. 상세하게, 도 45A, 도 45B, 도 45C 및 도 45D는 비-인간 영장류 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 대뇌 조직들의 필라멘트 염색을 도시하고 또한 도 45B에서 확인된 백색질 조직들의 세 가지 영역들 (W1, W2 및 W3라고 명명됨) 및 표면 회색질 (SG) 부위들에 각각 해당한다. 도 45B 및 도 45C는 W2 및 W3 백색질 조직들에서 경막내 투여된 I2S의 희소돌기아교세포 흡수 및 축삭 연관성을 각각 도시한다. 도 45D는 표면 회색질 (SG) 조직들에서 경막내 투여된 I2S의 신경적 흡수를 도시한다.
도 46은 비인간 영장류의 뇌실 인접 백색질 (VW)에서 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 세포성 동정을 나타낸 것이다. 겹쳐진 그림에서 도시된 바와 같이, 이듀로네이트-2-설파타제는 미엘린과 연관되지 않는다. 본 도 90에서, 핵은 DAPI (왼쪽 아래)에 의해 반대염색되고 단백질 (I2S)은 왼쪽 위 박스에 나타난다.
도 47은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 단일 주사가 뇌실내 (ICV) 또는 경막내 (IT) 투여된 건강한 비글종 개들의 조직들에서의 염색을 나타낸 것이다. 도 47A 내지 도 47H에서 도시된 바와 같이, I2S는 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 바와 같이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다의 회색질 전체를 통하여 널리 분포되었다. 도 47A 및 도 47B는 대뇌 피질에서, 뉴런들이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 표면 분자층으로부터 깊은 내부 층까지 모두 6개의 뉴런 층들에서 I2S에 양성이었던 점을 도시한다. 도 47C 및 도 47D는 IT 및 ICV 그룹들의 대뇌 피질에서, I2S가 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들에서 검출되었던 점을 도시한다. 도 47E 및 도 47F는 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 해마에 있는 큰 집단의 뉴런들은 I2S에 양성이었던 점을 도시한다. 마지막으로, 도 47G 및 도 47H는 IT 및 ICV둘 다의 그룹들에서 I2S 양성 뉴런들이 시상 및 미상엽 핵에서도 역시 발견되었던 점을 도시한다. 본 도 47에서, I2S 염색은 화살표들로 표시된다.
도 48은 미치료 또는 I2S가 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 녹아웃 (IKO) 마우스의 뇌들보 조직들을 비교하여 나타낸 것이다. (약어 V = 공포 (vacuole)). 도시된 바와 같이, 치료된 IKO 마우스는 I2S-치료된 IKO 마우스의 뇌들보 및 뇌활 조직들에서 소정의 리소좀 축적병들의 특징적인 세포성 공포화의 감소를 보여주었다.
도 49는 치료된 IKO 마우스 (도 93A)의 표면 대뇌 피질 조직들에서 리소좀 질환 병리학적 바이오마커인 리소좀 연관 막 단백질 (LAMP1)의 존재에서의 현저한 감소를 미치료된 IKO 대조군 마우스 (도 93B)과 대비하여 20 배 및 40배 둘 다의 확대 하로 나타낸 것이다.
도 50은 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 51은 대표적인 PORT-A-CATH® 로우 프로파일 경막내 이식가능한 접근 시스템을 나타낸 것이다.
도 52는 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 53은 CNS 효소 대체 요법 (ERT)을 위한 가정용 투여를 허용하는 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 54는 뉴런들 (퍼킨지 세포들)에서 이듀설파제의 단일 뇌내 주사 이후에 대표적인 공포화 효과를 나타낸 것이다.
도 55는 뇌에서 용량 및 부위에 의한 I2S 활성을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 56은 대뇌 피질의 서로 다른 깊이들에서 이듀설파제의 대표적인 면역조직화학적 정착 데이타를 나타낸 것이다.
도 57은 이듀설파제로 경막내 투여에 이어지는 원숭이의 척수에서 대표적인 I2S 활성을 나타낸 것이다.
도 58은 이듀설파제로 경막내 투여에 이어지는 원숭이 간, 심장 및 신장에서 대표적인 I2S 활성을 나타낸 것이다.
도 59는 상승 헌터-IT 시험 프로그램을 위한 대표적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 60은 30 mg 용량 이후에 뇌 조직의 다양한 단면들에서 대표적인 I2S 농도들의 측정들을 나타낸 것이다. 서로 다른 좌표들은 서로 다른 측정 시간들에 해당한다.
도 56은 다양한 산물 농도들을 위한 다양한 투여 경로들에 의해 기간 동안 투여 이후 대표적인 I2S 농도들의 측정들을 나타낸 것이다.
도 62는 사이노몰 원숭이에서 IV, IT-L, 또는 ICV 투여에 이어서 t=5 시간에 ¹²⁴I-표지된 이듀설파제-IT의 PET 영상화의 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 63은 경막내 약물 전달 장치의 대표적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 64는 개체의 신체 안에 설치된 (도 64A) 또한 평면 위에 전시된 (도 64B) 둘 다의 IDDD의 다양한 특징들을 나타낸 것이다.

정의들

본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여, 소정의 용어들이 먼저 하기에 정의된다. 다음의 용어들 및 기타 다른 용어들에 대한 추가적인 정의들이 본 명세서 전체를 통하여 설명된다.

대략 (Approximately) 또는 약 (about): 본 명세서에서 사용되는 바, "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 수치들에 적용되는 바와 같이 진술된 기준 수치와 유사한 수치를 말한다. 소정의 구현예들에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 진술되지 않거나 달리 내용으로부터 분명하지 않는 둘 중 하나의 경우라면 (이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함) 진술된 기준 수치의 방향 (이상 또는 이하)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.

개선 (Amelioration): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개선"은 개체의 상태의 예방 (prevention), 감소 (reduction) 또는 완화 (palliation), 또는 상태의 향상 (improvement)을 의미한다. 개선은 질환 병폐의 완벽한 회복 또는 완벽한 예방을 포함하지만 이들을 요구하지는 않는다. 일정 구현예들에서, 개선은 적절한 질환 조직들에서 결핍되는적절한 단백질 또는 그의 활성의 증가된 수준들을 포함한다.

생물학적으로 활성을 가진 (Biologically active): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 (phrase) "생물학적으로 활성을 가진"은 생물학적 체계 (biological system)에서, 상세하게는 생물에서 활성을 가지는 제제라면 모두의 특징을 말한다. 예를 들어, 생물에게 투여될 때 본 생물에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성을 가지는 것으로 고려된다. 상세한 구현예들에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성을 가지는 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 적어도 하나를 공유하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 부분은 "생물학적으로 활성을 가진" 부분으로서 언급된다.

충전제 (Bulking agent): 본 명세서에서 사용되는 바, "충전제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 더하는 화합물을 말하고 동결건조된 케이크 (lyophilized cake)의 물리적 구조에 기여한다 (예로, 개방 공극 구조를 유지하는 필수적으로 일정한 동결건조된 케이크의 생산을 용이하게 함). 대표적인 충전제들로는 만니톨 (mannitol), 글리신 (glycine), 염화나트륨 (sodium chloride), 하이드록시에틸 전분 (hydroxyethyl starch), 락토스 (lactose), 슈크로스 (sucrose), 트레할로스 (trehalose), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol) 및 덱스트란 (dextran)을 포함한다.

양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (Cation-independent mannose-6-phosphate receptor, CI-MPR): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (CI-MPR)"는 리소좀에 운반될 골지체 (Golgi apparatus)에 있는 산 가수분해효소 전구체들 상에 만노스-6-포스페이트 (M6P) 태그들 (tags)을 결합시키는 세포성 수용체를 말한다. 만노스-6-포스페이트들에 추가하여, CI-MPR는 IGF-II를 포함하는 기타 다른 단백질도 역시 결합시킨다. CI-MPR는 "M6P/IGF-II 수용체," "CI-MPR/IGF-II 수용체," "IGF-II 수용체" 또는 "IGF2 수용체"라고도 역시 알려져 있다. 본 명세서에서 이들 용어들 및 그들의 약어들은 상호교환적으로 사용된다.

동시적인 면역억제 요법 (Concurrent immunosuppressant therapy): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "동시적인 면역억제 요법"은 전-치료, 전조정 또는 치료 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두를 포함한다.

희석제 (Diluent): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "희석제"는 재구성된 제형물의 제조에 유용한 약제학적으로 허용가능한 (예로, 인간에게 투여 시 안전하고 비-독성) 희석 물질 (diluting substance)을 말한다. 대표적인 희석제들은 무균수 (sterile water), 주사용 정균수 (bacteriostatic water for injection, BWFI), pH 완충용액 (예로, 인산염-완충 식염수), 무균 식염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.

용량 형태 (Dosage form): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용량 형태" 및 "단위 용량 형태 (unit dosage form)"는 치료될 환자를 위한 치료적 단백질의 물리적으로 명확한 단위를 말한다. 각 단위는 원하는 치료적 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 선결정된 정량 (predetermined quantity)을 포함한다. 그러나, 조성물의 전체 용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 참석한 의사가 결정하는 것으로 이해될 것이다.

효소 대체 요법 (효소 replacement therapy, ERT): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "효소 대체 요법 (ERT)"은 소실된 효소를 제공하여 효소 결핍을 교정하는 치료적 전략 (therapeutic strategy)이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 경막내 투여에 의해 제공된다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 혈류 내에 주입하여 제공된다. 일단 투여되면, 효소는 세포들에 의해 흡수되고 리소좀으로 운반되고, 여기에서 효소는 효소 결핍으로 인해 리소좀들에 축적되었던 물질을 제거하도록 작용한다. 전형적으로, 효과적인 리소좀 효소 대체 요법 (lysosomal 효소 replacement therapy)의 경우, 치료적 효소가 축적 결함이 나타나는 표적 조직들에서 적절한 세포들에 있는 리소좀들로 운반된다.

개선하다 (Improve), 증가하다 (increase) 또는 감소하다 (reduce): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적 동등물들은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인 (또는 다수의 대조군 개인들)에서의 측정과 같은 기저선 측정 (baseline measurement)과는 대비되는 수치들을 가르킨다. "대조군 개인 (control individual)"은 치료될 개인과 리소좀 축적병의 동일한 형태로 고생하고, (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 보장하는) 치료될 개인과 거의 동일한 연령인 개인이다.

개인 (Individua), 개체 (subject), 환자 (patien)t: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개체", "개인" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물 개체를 말한다. 치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라도도 말함)은 질환을 앓는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 성인 인간)이다.

경막내 투여 (Intrathecal administration): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "경막내 투여" 또는 "경막내 주사 (intrathecal injection)"는 척수관 (spinal canal) (척수 주위의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들 (techniques)이, 제한되지 않고 천두공 (burrhole) 또는 대수공 (cisternal) 또는 요추 (lumbar) 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사 (lateral cerebroventricular injection)를 포함하여 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달 (intrathecal delivery)"은 요추 IT 투여 또는 전달과 같은 요추 영역 또는 부위를 통한 IT 투여 또는 전달을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위(lumbar region)" 또는 "요추 영역 (lumbar area)"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 더욱 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위를 말한다.

링커 (Linker): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "링커"는 천연의 단백질에 서, 특정한 위치에서 나타나는 것이 아닌 아미노산 서열을 말하고 일반적으로 단백질 분체들 사이에서 유연하고 알파-나선과 같은 구조를 부여하도록 설계된다.

동결보호제 (Lyoprotectant): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "동결보호제"는 동결건조 (lyophilization) 및 연속적 보관 시 단백질 또는 기타 다른 물질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 예방하거나 감소시키는 분자를 말한다. 대표적인 동결보호제들로는 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 당류들; 모노소듐 글루타메이트 (monosodium glutamate) 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인 (betaine)과 같은 메틸아민; 마그네슘 설페이트와 같은 친액성 (lyotropic) 염; 삼수소 (trihydric) 또는 고차 당 알코올들, 예로 글리세린 (glycerin), 에리트리톨 (erythritol), 글리세롤 (glycerol), 아라비톨 (arabitol), 자일리톨 (xylitol), 소비톨 (sorbitol), 및 만니톨 (mannitol)과 같은 폴리올 (polyol); 프로필렌 글리콜 (propylene glycol); 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol); 플루로닉스 (Pluronics); 및 그들의 조합들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 동결보호제는 트레할로스 또는 슈크로스와 같은 비-환원성 당이다.

리소좀 효소 (Lysosomal 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 효소"는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있고 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다. 대표적인 리소좀 효소들은 표 1에 나열되어 있다.

리소좀 효소 결핍 (Lysosomal enzyme deficiency): 본 명세서에서 사용되는 바, "리소좀 효소 결핍"은 리소좀들에서 거대분자들 (예로, 효소 기질들)을 펩타이드들, 아미노산들, 모노사카라이드들, 핵산들 및 지방산들로 분해하는 데 요구되는 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 유전적 장애들의 그룹을 말한다. 그 결과, 리소좀 효소 결핍들을 앓고 있는 개인들은 다양한 조직들 (예로, CNS, 간, 비장, 장, 혈관 벽들 및 기타 다른 기관들)에서 축적된 물질들을 가지고 있다.

리소좀 축적병 (lysosomal storage disease): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 축적병"은 천연의 거대분자들을 대사하는 데 필요한 리소좀 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 질환이라면 모두를 말한다. 전형적으로, 이들 질환들은 리소좀들에서 분해도지 않은 분자들의 축적을 유도하여, 축적 과립들 (storage granules) (축적 소포들이라고도 명명함)의 수적 증가를 유도한다. 이들 질환들 및 다양한 예들이 보다 자세하게 하기에 기술된다.

폴리펩타이드 (Polypeptide): 본 명세서에서 사용되는 바, "폴리펩타이드"는 일반적으로 말하자면 펩타이드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 두 개의 아미노산들의 연결 (string)을 말한다. 일정 구현예들에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 펩타이드 결합에 의해 다른 것들에 각각 부착된 적어도 3 내지 5개의 아미노산들을 포함할 수 있다. 당업자라면 폴리펩타이드들이 그럼에도 불구하고 임의적으로 폴리펩타이드 사슬 내에 통합될 수 있는 "비-천연의 (non-natural)" 아미노산들 또는 기타 다른 실체들을 때로 포함할 수 있는 점을 인정할 것이다.

대체 효소 (Replacement 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "대체 효소"는 치료될 질환에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 용어 "대체 효소"는 치료될 리소좀 축적병에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있거나, 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다. 대체 효소는 재조합, 합성, 유전자-활성화 또는천연의 효소일 수 있다.

용해성 (Soluble): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용해성"은 균질한 용액을 형성하는 치료제의 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도 (solubility)는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 (co-solubilizing) 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 제제들은 해당하는 그의 약제학적 조성물에서 용해성이다. 일반적으로 등장액들이 비경구 투여 약물들을 위해 선호되는 한편, 등장액들 (isotonic solutions)의 사용은 일정의 치료제들, 상세하게는 일정의 단백질들 및/또는 효소들에 대한 적당한 용해도를 제한할 수 있는 점이 인정될 것이다. 약간 고장액들 (hypertonic solutions) (예로, 175mM까지의 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 2%까지의 슈크로스)는 원숭이들에서 잘 내성화되는 (tolerated) 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 공통적인 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수 (물에 녹인 150mM NaCl)이다.

안정도 (Stability): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한 (stable)"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, 재조합 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술된 약제학적 조성물들은 이로 제형화된 하나 이상의 치료제들 (예로, 재조합 단백질들)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들 (aggregates)의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.

개체 (Subject): 본 명세서에서 사용되는 바, "개체"는 인간을 포함하는 포유동물이라면 모두를 의미한다. 본 발명의 소정의 구현예들에서, 개체는 인간, 청소년 또는 유아이다. 또한 본 발명에 의해 약제학적 조성물들의 투여 및/또는 자궁내 (in-utero) 치료 방법의 성적이 참작된다.

실질적인 상동성 (Substantial homology): 본 발명에서 용어구 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 상동한 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 상동한 (substantially homologous)"인 것으로 고려된다. 상동한 잔기들은 일치하는 잔기들 (identical residues)일 수 있다. 임의적으로, 상동한 잔기들은 대략적으로 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징들을 가지는 비-일치하는 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 잘 숙지하고 있는 바와 같이, 전형적으로 소정의 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산들로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 것으로의 치환은 종종 "상동한" 치환이라고 고려될 수 있다.

당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 상동한 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 상동한 경우라면 실질적으로 상동한 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는500개 이상의 잔기들이다.

실질적인 일치도 (Substantial identity): 본 명세서에서 용어구 "실질적인 일치도"는 은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 일치하는 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 일치하는 (substantially identical)" 것으로 고려된다. 당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 일치하는 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 일치도의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 일치하는 경우라면 실질적으로 일치하는 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는500개 이상의 잔기들이다.

합성 CSF (Synthetic CSF): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "합성CSF"는 척수액과 합치되는 pH, 전해질 조성, 포도당 함량 및 삼투도를 가지는 용액을 말한다. 합성 CSF는 인공 CSF (artifical CSF)라고도 역시 말한다. 일정 구현예들에서, 합성 CSF는 엘리어트 B 용액 (Elliott? B solution)이다.

CNS 전달에 적합한 (Suitable for CNS delivery): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어구 본 발명의 약제학적 조성물들에 관한 "CNS 전달에 적합한" 또는 "경막내 전달에 적합한 (sui표 for intrathecal delivery)"은 일반적으로 이러한 조성물들의 안정도, 내성 (tolerability), 및 용해도 성질들 뿐만 아니라 이에 포함되는 치료제의 유효량을 전달의 표적 부위 (예로, CSF 또는 뇌)로 전달하는 이러한 조성물들의 능력을 말한다.

표적 조직들 (Target tissues): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 환자들에서 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 효소 기질의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상, 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직은 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.

치료적 분체 (Therapeutic moiety): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 분체"는 분자의 치료적 효과를 가져오는 분자의 일부를 말한다. 일정 구현예들에서, 치료적 분체는 치료적 활성을 가지는 폴리펩타이드이다.

치료적 유효량 (therapeutically effective amount): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 유효량"은 의학적 치료라면 모두에 적용가능한 합리적인 유익/위험 비율로 치료되는 개체에 미치는 치료적 효과를 부여하는 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)의 양을 말한다. 치료적 효과는 주관적 (예로, 일정의 테스트 또는 마커에 의해 측정가능) 또는 객관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 상세하게, "치료적 유효량"은 질환과 연관된 증상들을 개선하거나 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 것, 및/또는 질환의 증상들의 중증도 또는 빈도도 역시 감소시키는 것에 의해서와 같이 원하는 질환 또는 병폐를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 데, 또는 검출가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 효과적인 치료적 단백질 또는 조성물의 양을 말한다. 치료적 유효량은 공통적으로 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 용량 요법 (dosing regimen)으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 용량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 의존하여 변화될 수 있다. 또한, 특정한 환자를 위한 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 치료제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인들 등을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.

내성 (Tolerable): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성" 및 "내성도 (tolerability)"는 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 내성화된다.

치료 (Treatment): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료" (또한 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)")은 부분적으로 또는 완벽하게 특정한 질환, 장애, 및/또는 병폐 (예로, 헌터 증후군, 산필리포 B형 증후군)의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 완화시키고, 개선시키고, 안정시키고, 억제하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고 및/또는 이의 빈도를 감소시키는 치료적 단백질 (예로, 리소좀 효소)의 투여라면 모두를 말한다. 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 징후들을 발현하지 않는 개체 및/또는 단지 질환, 장애 및/또는 병폐의 초기 징후들만을 나타내는 개체에게 할 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 하나 이상의 확립된 징후들을 발현하는 개체에게 할 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 무엇보다도, 중추신경계 (CNS)로의 치료의 효과적인 직접 전달을 위한 개선된 방법들 및 조성물들을 제공한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 부분적으로 리소좀 축적병 (lysosomal storage disease) (예로, 헌터 증후군)의 대체 효소 (예로, I2S 단백질)가 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (CSF) 내로 높은 농도로 개체에서 실질적인 역효과들을 유발하지 않고도 직접 도입될 수 있는 점의 예기치 않은 발견에 기초하고 있다. 보다 놀랍게도, 본 발명자들은 합성 CSF를 사용하지 않고도 단순한 식염수 또는 완충용액-기초 제형물을 사용하여 전달될 수 있는 점을 발견하였다. 보다 더 예기치 않게도, 본 발명에 따른 경막내 전달은 개체에서 심각한 면역반응과 같은 실질적인 역효과들을 유발하지 않는다. 따라서, 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 동시적인 면역억제 요법의 부재 시 (예로, 전-치료 또는 전-조정에 의한 면역 내성의 유발 없음) 사용될 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 표면, 얕은 및/또는 깊은 뇌 부위들에 있는 다양한 표적 뇌 조직들에서 대체 효소의 효과적인 전달을 유도하여 다양한 뇌 조직들을 거친 효율적인 확산을 허용한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 말초 순환에 들어가는 충분량의 대체 효소들을 유도하였다. 그 결과, 일정 경우에서는, 본 발명에 따른 경막내 전달이 간, 심장, 비장 및 신장과 같은 말초 조직들에서 대체 효소의 전달을 유도하였다. 본 발견은 예측되지 않고 특히 CNS 및 말초 성분들 둘 다를 가지는 리소좀 축적병의 치료에 유용할 수 있고, 이는 전형적으로 규칙적인 경막내 투여 및 정맥내 투여 둘 다를 요구할 것이다. 본 발명에 따른 경막내 전달은 말초 증상들을 치료하는 것에서 치료적 효과들과 타협하지 않고도 감소된 용량 투여 및/또는 정맥내 (iv) 주사의 빈도를 허용할 수 있는 점을 보여준다.

본 발명은 다양한 뇌 표적 조직들로 대체 효소들의 효율적이고 편리한 전달을 허용하여CNS 표시들 (CNS indications)을 가지는 리소좀 축적병들의 효과적인 치료를 유도하는 다양한 예기치 못한 유익한 특징들을 제공한다.

본 발명의 다양한 관점들은 다음의 섹션들에서 상술되고 있다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하도록 의미하지는 않는다. 각 섹션은 본 발명의 각 관점에 적용될 수 있다. 본 명세서에서, 달리 진술되지 않는 경우라면 "또는 (or)"은 "및/또는 (and/or)" 을 의미한다.

대체 효소들

이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질

일정 구현예들에서, 본 발명에 의해 제공되는 발명적 방법들 및 조성물들은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질을 헌터 증후군의 치료를 위해 CNS에 전달하는 데 사용된다. 적합한 I2S 단백질은 자연적으로 발생하는 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질 활성을 대체하거나 I2S-결핍과 관련된 표현형들 또는 증상들 하나 이상을 복구할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분이라면 모두일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S 단백질과 실질적으로 유사하거나 일치하는 N-말단 및 C-말단 또한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드이다.

전형적으로, 인간 I2S 단백질은 전구체 형태로서 생산된다. 인간 I2S의 전구체 형태는 신호 펩타이드 (전장의 전구체의 1-25번 아미노산 잔기들), 전-펩타이드 (전장의 전구체의 26-33번 아미노산 잔기들), 또한 좀 더 나아가 42 kDa 사슬 (전장의 전구체의 34-455번 아미노산 잔기들) 및 14 kDa 사슬 (전장의 전구체의 446-550번 아미노산 잔기들)로 프로세싱될 수 있는 사슬을 포함한다. 전형적으로, 전구체 형태는 550개 아미노산 잔기들을 포함하는 전장의 전구체 또는 전장의 I2S 단백질이라고도 역시 말한다. 전형적인 야생형 또는 자연적으로-발생하는 인간 I2S 단백질의 제거되는 신호 펩타이드 및 전장의 전구체 (서열번호 2)를 가지는 성숙한 형태 (서열번호 1)의 아미노산 서열들이 표 1에 나타나 있다. 하기 표 1은 인간 이듀로네이트-2-설파타제를 나타낸 것이다.

따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S단백질 (서열번호 1)이다. 일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S 단백질의 상동체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 인간 I2S 단백질의 상동체 또는 유사체는 야생형 또는 자연적으로-발생하는I2S 단백질 (서열번호 1)과 대비하여 하나 이상 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는 삽입들을 포함하는 한편, 실질적인 I2S 단백질 활성을 보유하는 변형된 성숙한 인간 I2S 단백질일 수 있다. 따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S 단백질 (서열번호 1)과 실질적으로 상동적이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 서열번호 1과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동한 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S 단백질 (서열번호 1)과 실질적으로 일치한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 서열번호 1과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 성숙한 인간 I2S 단백질의 단편 또는 일부분을 포함한다.

임의적으로, 본 발명에 적합한 대체 효소는 전장의I2S 단백질이다. 일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 전장의 인간 I2S 단백질의 상동체 또는 유사체일 수 있다. 예를 들어, 전장의 인간 I2S 단백질의 상동체 또는 유사체는 야생형 또는 자연적으로-발생하는 전장의I2S 단백질 (서열번호 2)과 대비하여 하나 이상 아미노산 치환들, 결실들, 및/또는 삽입들을 포함하는 한편, 실질적인 I2S 단백질 활성을 보유하는 변형된 전장의 인간 I2S 단백질일 수 있다. 따라서 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 전장의 인간 I2S 단백질 (서열번호 2)과 실질적으로 상동적이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 서열번호 2와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 상동한 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 전장의 인간 I2S 단백질 (서열번호 2)과 실질적으로 일치한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 서열번호 2와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 일치하는 아미노산 서열을 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 전자의 인간 I2S 단백질의 단편 또는 일부분을 포함한다.

다른 리소좀 축적병들 및 대체 효소들

본 발명에 따른 방법들 및 조성물들은 다른 리소좀 축적병들, 상세하게는 이에 제한되는 것은 아니지만 아스파틸글루코사민 뇨증 (aspartylglucosaminuria), 콜레스테롤 에스테르 축적병 (cholesterol ester storage disease), 울만병 (Wolman disease), 시스틴증 (cystinosis), 다논병 (Danon disease), 파브리병 (Fabry disease), 파버 지질육아종증 (Farber lipogranulomatosis), 파버병 (Farber disease), 퓨코시드 축적증 (fucosidosis), 갈락토시알산증 (galactosialidosis) 제 I/II형, 가우셔병 (Gaucher disease) 제 I/II/III형, 구형세포 백색질장애 (globoid cell leukodystrophy), 크래브병 (Krabbe disease), 글리코겐 축적병 (glycogen storage disease) 제 II형, 폼프병 (Pompe disease), GM1-갱글리오사이드 축적증 (gangliosidosis) 제 I/II/III형, GM2- 갱글리오사이드 축적증 제 I형, 테이삭스병 (Tay Sachs disease), GM2- 갱글리오사이드 축적증 제 II형, 샌드호프병 (Sandhoff disease), GM2- 갱글리오사이드 축적증, α-만노사이드증 (mannosidosis) 제 I/II형, 베타-만노사이드증 (beta.-mannosidosis), 이염색성 백색질장애 (metachromatic leukodystrophy), 점액지질증 (mucolipidosis) 제 I형, 시알산증 제 I/II형, 점액지질증 제 II/III형, I-세포병 (I-cell disease), 점액지질증 제 IIIC형, 유사-헐러 다중장애 (pseudo-Hurler polydystrophy), 점액다당류증 (mucopolysaccharidosis) 제 I형, 점액다당류증 제 II형, 점액다당류증 제 IIIA형, 산필리포 증후군 (Sanfilippo syndrome), 점액다당류증 제 IIIB호, 점액다당류증 제 IIIC형, 점액다당류증 제 IIID형, 점액다당류증 제 IVA형, 모르퀴오 증후군 (Morquio syndrome), 점액다당류증 제 IVB형, 점액다당류증 제 VI형, 점액다당류증 제 VII형, 슬라이 증후군 (Sly syndrome), 점액다당류증 제 IX형, 다중 설파타제 결핍 (multiple sulfatase deficiency), 신경 세로이드 지질갈색소증 (neuronal ceroid lipofuscinosis), CLN1 바튼병 (Batten disease), CLN2 바튼병, 니만-피크병 (Niemann-Pick disease) A/B형, 니만-피크병 C1형, 니만-피크병 C2형, 피크노다이소스토 왜소증 (pycnodysostosis), 쉰들러병 제 I/II형, 가우셔병 및 시알산 축적병 (sialic acid storage disease)을 포함하는, CNS 병인학 및/또는 증상들을 가지는 이들 리소좀 축적병들을 치료하는 데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

리소좀 축적병들의 유전적 병인학, 임상적 소견들, 및 분자생물학의 자세한 리뷰들은 Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995)에 상술되고 있다. 따라서, 상기 질환들에서 결핍되는 효소는 당업자라면 숙지하고 있고, 이들의 일부는 하기 표 2에 예시되고 있다.

본 발명에 따른 발명적 방법들은 다양한 다른 대체 효소들을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 본 발명에 적합한 대체 효소들은 치료될 리소좀 축적병에서 결핍 또는 소실된 리소좀 효소의 적어도 부분적 활성을 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 리소좀들에서 축적된 물질을 감소시킬 수 있고 리소좀 축적병 증상들을 하나 이상 회복시키거나 개선시킬 수 있다.

일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 치료될 리소좀 축적병과 연관되는 것으로 알려진 리소좀 효소라면 모두일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 상기 표 2에 나열된 효소로부터 선택된 효소이다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열을 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열과 실질적인 상동성 또는 일치도를 가지는 변형된 서열을 가질 수 있다 (예로, 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 서열 일치도).

본 발명에 적합한 대체 효소는 사용가능한 수단이라면 모두에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 대체 효소들은 대체 효소-인코딩 핵산을 발현하도록 조작된 숙주세포 시스템을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 대체 효소들은 화학적 합성에 의해 부분적으로 또는 전적으로 제조될 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 대체 효소들은 또한 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다.

효소들이 재조합적으로 생산되는 경우, 발현 시스템이라면 모두가 사용될 수 있다. 몇 가지의 예들을 제시하면, 기지의 발현 시스템들은 예를 들어 계란, 배큘로바이러스, 식물, 효모, 또는 포유동물 세포들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 효소들은 포유동물 세포들에서 생산된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포들의 비-제한적인 예들로는 BALB/c 마우스 마이엘로마 세포주 (NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간 망막모세포들 (PER.C6, CruCell, Leiden, 네델란드); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 계대배양된 293 또는 293 세포들, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); 인간 섬유육종 세포주 (예로, HT1080); 새끼 햄스터 신장세포들 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포들 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); 원숭이 신장세포들 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포들 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁암종 세포들 (HeLa, ATCC CCL 2); 고양이 신장세포들 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포들 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포들 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포들 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방세포들 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포들; FS4 cells; 및 인간 간암세포들 (Hep G2)을 포함한다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법들은 인간 세포들로부터 생산된 대체 효소들을 전달하는 데 사용된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법들은 CHO 세포들로부터 생산된 대체 효소들을 전달하는 데 사용된다.

일정 구현예들에서, 본 발명의 방법을 사용하여 전달된 대체 효소들은 세포성 흡수 및/또는 리소좀 표적화를 용이하게 하도록 뇌 세포들의 표면 상의 수용체에 결합하는 분체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 수용체는 만노스-6-포스페이트 (M6P) 잔기들을 결합시키는 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (CI-MPR)일 수 있다. 추가적으로, CI-MPR도 역시 IGF-II를 포함하는 기타 다른 단백질들을 결합시킨다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 단백질의 표면 상에 M6P 잔기들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 CI-MPR에 더 높은 결합 친화도를 가지는 비스-인산화 올리고사카라이드들 (bis-phosphorylated oligosaccharides)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 적어도 20%까지의 비스-인산화 올리고사카라이드들 를 포함한다. 다른 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%의 비스-인산화 올리고사카라이드들을 포함할 수 있다. 이러한 비스-인산화 올리고사카라이드들은 효소 상에 자연적으로 존재할 수 있으면서도, 효소들은 이러한 올리고사카라이드들을 소유하도록 변형될 수 있는 점을 주목해야 한다. 예를 들어, 적합한 대체 효소들은 리소좀 효소들 상에서 UDP-GlcNAc 로부터 α-1,2-연결된 만노스들의 6' 위치로 N-아세틸글루코사민-L-포스페이트의 이동을 촉매할 수 있는 소정의 효소들에 의해 변형될 수 있다. 이러한 효소들을 생산하고 사용하는 방법들 및 조성물들은, 예를 들어 캔필드 등 (Canfield et al.)에 의해 미국 특허 제 6,537,785호 및 미국 특허 제 6,534,300호에서 기술되고 있고, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에서 사용되는 대체 효소들은 뇌 세포들의 표면 상의 수용체에 결합할 수 있는 리소좀 표적화 분체와 결합하거나 융합될 수 있다. 적합한 표적화 분체는 IGF-I, IGF-II, RAP, p97, 및 변이체들 (variants), 상동물들 (homologues) 또는 그들의 단편들 (예로, 야생형 성숙한 인간 IGF-I, IGF-II, RAP, p97 펩타이드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%일치하는 서열을 가지는 이들 펩타이드를 포함함)일 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 대체 효소들은 BBB를 거쳐서 또한 CNS 내로 이러한 제제들의 전달 또는 이동을 증진하도록 변형되지 않았다.

일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 표적 분체 (예로, 리소좀 표적 서열) 및/또는 막-침투 펩타이드를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열 및/또는 막-침투 펩타이드는 치료적 분체의 내재 부분 (예로, 화학적 결합에 의해, 융합 단백질에 의해)이다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 만노스-6-포스페이트 분체를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 IGF-I 분체를 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 서열은 IGF-II 분체를 포함한다.

제형물들

일정 구현예들에서, 원하는 효소는 경막내 전달을 위해 안정 제형물들로 전달된다. 본 발명의 소정의 구현예들은 적어도 부분적으로는 본 명세서에서 기재된 다양한 제형물들이 CNS의 표적된 조직들, 세포들 및/또는 소기관들로 하나 이상의 치료제들 (예로, I2S효소)의 효과적인 전달 및 분배를 용이하게 하는 점의 발견을 기초로 한다. 무엇보다도, 본 명세서에서 기술된 제형물들은 치료제들 (예로, I2S 효소)의 높은 농도들을 용해화할 수 있고 CNS 성분 및/또는 병인학 (예로, 헌터 증후군)을 가지는 질환들의 치료를 위해 개체들의 CNS로 이러한 치료제들의 전달에 적합하다. 본 명세서에서 기술된 조성물들은 좀 더 나아가 그의 필요가 있는 개체의 CNS로 (예로, 경막내) 투여될 때 향상된 안정도 및 향상된 내성도를 특징으로 한다.

본 발명 이전에, 통상적인 비완충된 등장성 식염수 및 인공 CSF인 엘리어트 B 용액이 전형적으로 경막내 전달에 사용되었다. 엘리어트 B 용액에 대비하여 CSF의 조성들을 보여주는 비교가 하기 표 3에 포함되어 있다. 표 3에서 나타난 바와 같이, 엘리어트 B 용액의 농도는 CSF의 농도와 매우 유사하다. 그러나 엘리어트 B 용액은 매우 낮은 완충액 농도를 포함하고 따라서 특히 연장된 기간 동안 (예로, 축적 조건들 동안) 치료제들 (예로, 단백질들)을 안정화하는 데 필요한 적당한 완충화 능력을 제공할 수 없다. 또한, 엘리어트 B 용액은 일정 치료제들, 상게하게는 단백질들 또는 효소들을 전달하도록 의도된 제형물들과 부적합할 수 있는 소정의 염들을 포함한다. 예를 들어, 엘리어트 B 용액에 존재하는 칼슘 염들은 단백질 침전을 매개할 수 있고 이에 의해 제형물의 안정도를 감소시킬 수 있다.

따라서, 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 CNS 전달에 적합한 제형물들은 합성 또는 인공 CSF가 아니다.

일정 구현예들에서, CNS 전달용 제형물들은 이로 제형화된 치료제 (예로, I2S 효소)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, I2S 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.

치료제의 안정도는 특히 중요하다. 치료제의 안정도는 좀 더 나아가 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성과 대비하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 주어진 시점에서의 안정도는 이전 시점 (예로, 제형화0일)에서의 안정도와 대비하여 또는 비제형화된 치료제 및 백분율로서 표시되는 본 비교의 결과들과 대비하여 비교될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약제학적 조성물들은 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성의 적어도 100%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 또는 적어도 50%를 유지한다 (예로, 적어도 약 6 내지 12개월 동안 상온에서 또는 가속된 보관 조건들 하에서 측정된 바와 같음).

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 원하는 효소들)은 본 발명의 제형물들에서 용해가능하다. 용어 "용해성 (soluble)"은 이것이 본 발명의 치료제들에 관한 바 균질한 용액을 형성하는 이러한 치료제들의 능력을 말한다. 바람직하게, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다.

수성, 전-동결건조, 동결건조 또는 재구성된 형태의 적합한 제형물들은 다양한 농도들로 관심있는 치료제 (예로, 효소)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 제형물들은 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml (예로, 약 0.1 mg/ml 내지 80 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 60 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 40 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 30 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 60 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 40 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 30 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 25 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 15 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 약 0.1 mg/ml 내지 5 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 약 1 mg/ml 내지 40 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 100 mg/ml, 약 5 mg/ml 내지 50 mg/ml, 또는 약 5 mg/ml 내지 25 mg/ml) 범위의 농도로 관심있는 단백질 또는 치료제를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 적합한 제형물들은 대략 1 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 또는 100 mg/ml, 의 농도로 관심있는 단백질 또는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달에 적합한 제형물들은 대략 1 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml 또는 300 mg/ml의 농도로 치료제를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형물들은 수성 용액들 또는 재구성 동결건조 용액들로서 그들의 내성도를 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성 (tolerable)" 및 "내성도 (tolerability)"는 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 잘 내성화된다.

많은 치료제들, 상세하게 본 발명의 단백질들 및 효소들은 본 발명의 약제학적 조성물들에서 그들의 용해도 및 안정도를 유지하도록 조절된 pH 및 특이적 운반체들을 요구한다. 표 4는 본 발명의 단백질 치료제들의 용해도 및 안정도를 유지하는 데 고려되는 단백질 제형물들의 전형적인 대표적인 관점들을 확인시켜주고 있다.

완충액들

제형물의pH는 수성의 제형물에서 또는 전-동결건조 제형물의 경우 치료제 (예로, 효소 또는 단백질)의 용해도를 변경시킬 수 있는 추가적인 요인이다. 따라서 본 발명의 제형물들은 바람직하게 하나 이상의 완충액들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 수성의 제형물들은 상기 조성물의 최적의 pH를 약 4.0 내지 8.0 사이 (예로, 약 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.2, 6.4, 6.5, 6.6, 6.8, 7.0, 7.5, 또는 8.0)로 유지하도록 충분한 양의 완충액을 포함한다. 일정 구현예들에서 제형물의 pH는 약 5.0 내지 7.5 사이, 약 5.5 내지 7.0 사이, 약 6.0 내지 7.0 사이, 및 약 6.0 내지 7.5 사이이다. 예를 들어, 적합한 완충액들로는 아세테이트 (acetate), 숙시네이트 (succinate), 시트레이트 (citrate), 히스티딘 (histidine), 포스페이트 (phosphate), 숙시네이트 (succinate), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 ("트리스 (Tris)") 및 기타 다른 유기산들을 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물들의 완충액 농도 및 pH 범위는 제형물의 내성도를 조절하거나 조정하는 요인들이다. 일정 구현예들에서, 완충제는 약 1 mM 내지 약 150 mM 사이, 약 10 mM 내지 약 50 mM 사이, 약 15 mM 내지 약 50 mM 사이, 약 20 mM 내지 약 50 mM 사이, 또는 약 25 mM 내지 약 50 mM 사이 범위의 농도로 존재한다. 일정 구현예들에서, 적합한 완충제는 대략 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM 또는 150 mM의 농도로 존재한다.

긴장도

일정 구현예들에서, 수성, 전-동결건조, 동결건조 또는 재구성 형태로의 제형물들은 등장성으로 제형물들을 유지하도록 등장성 제제 (isotonicity agent)를 포함한다. 전형적으로, "등장성"에 의하여 관심있는 제형물이 필수적으로 인간 혈액과 동일한 삼투압을 가지는 것을 의미한다. 일반적으로, 등장성 제형물들은 약 240 mOsm/kg 으로부터 약 350 mOsm/kg까지의 삼투도를 가질 것이다. 등장도는, 예를 들어 증기압 또는 동결점 유형의 삼투 측정기들 (osmometers)을 사용하여 측정될 수 있다. 대표적인 등장성 제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 글리신, 소비톨, 만니톨, 염화나트륨 및 아르기닌을 포함한다. 일정 구현예들에서, 적합한 등장성 제제들은 무게로 약 0.01 내지 5 % (예로, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 또는 5.0%)로부터 나온 농도로 수성 및/또는 전-동결건조 제형물들에 존재할 수 있다. 일정 구현예들에서, 동결건조를 위한 제형물들은 전-동결건조 제형물들 또는 재구성된 제형물들을 등장성으로 유지하도록 등장성 제제를 포함한다.

일반적으로 등장성 용액들이 비경구적으로 투여되는 약물들의 경우에 선호되는 한편, 등장성 용액들의 사용은 일정 치료제들 및 상세하게는 일정 단백질 및/또는 효소들의 용해도를 변화시킬 수 있다. 약간 고장성 용액들 (예로, pH 7.0에서 5 mM 소듐 포스페이드에 녹은 175 mM까지의 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, pH 7.0에서 5 mM 소듐 포스페이드에 녹은 2%까지의 슈크로스)가 잘 내성화되는 것으로 기술되어 왔다. 가장 보편적인 승인된 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수이다 (물에 녹은 약 150 mM NaCl).

안정화제들

일정 구현예들에서, 제형물들은 단백질을 보호하도록 안정화제 또는 동결보호제 (lyoprotectant)를 포함할 수 있다. 전형적으로, 적합한 안정화제는 당 또는 비-환원 당 및/또는 아미노산이다. 대표적인 당들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 덱스트란, 락토스, 만니톨, 만노스, 소비톨, 라피노스, 슈크로스, 및 트레할로스를 포함한다. 대표적인 아미노산들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 아르기닌, 글리신 및 메티오닌을 포함한다. 추가적인 안정화제들은 염화나트륨, 하이드록시에틸 전분 및 폴리비닐피롤리돈을 포함할 수 있다. 일반적으로 동결건조 제형물에서 안정화제의 양은 제형물이 등장성이 될 양이다. 그러나, 고장성 재구성된 제형물들도 역시 적합할 수 있다. 또한, 안정화제의 양은 너무 낮아서 치료제의 분해/응집이 허용가능하지 않은 양으로 발생해서는 안된다. 제형물에서 대표적인 안정화제 농도들은 약 1 mM 로부터 약 400 mM까지 (예로, 약 30 mM 로부터 약 300 mM까지, 및 약 50 mM 로부터 약 100 mM까지)의 범위, 또는 임의적으로 무게로 0.1% 로부터 15%까지 (예로, 1% 로부터 10%까지, 5% 로부터 15%까지, 5% 로부터 10%까지)의 범위일 수 있다. 일정 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 1:1이다. 다른 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 0.1:1, 0.2:1, 0.25:1, 0.4:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 2.6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1, 또는 20:1이다. 일정 구현예들에서, 동결건조에 적합한 안정화제는 역시 동결보호제들 (lyoprotectants)이다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 액상 제형물들은 무정형 물질들이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 액상 제형물들은 실질적인 양의 무정형 물질들을 포함한다 (예로, 슈크로스-기초 제형물들). 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 액상 제형물들은 부분적으로 결정/부분적으로 무정형 물질들을 포함한다.

충전제들

일정 구현예들에서, 동결건조에 적합한 제형물들은 좀 더 나아가 하나 이상의 충전제들을 포함할 수 있다. "충전제 (bulking agents)"는 동결건조된 혼합물에 질량을 첨가하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여한다. 예를 들어, 충전제는 동결건조된 케이크 (예로, 필수적으로 일정한 동결건조된 케이크)의 모양을 개선시킬 수 있다. 적합한 충전제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 염화나트륨, 락토스, 만니톨, 글리신, 슈크로스, 트레할로스, 하이드록시에틸 전분을 포함한다. 대표적인 충전제들의 농도들은 약 1% 로부터 약 10%까지 (예로, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 및 10.0%)이다.

표면활성제들

일정 구현예들에서, 제형물들에 표면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 대표적인 표면활성제들로는 폴리솔베이트들 (Polysorbates) (예로, 폴리솔베이트 20 또는 80); 폴록사머들 (poloxamers) (예로, 폴록사머 188); 트리톤 (Triton); 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥실 글리코사이드; 로릴-, 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-설포베타인 (sulfobetaine); 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-사르코신 (sarcosine); 리노레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필 (lauroamidopropyl)-, 코크아미도프로필 (cocamidopropyl)-, 리노레아미도프로필 (linoleamidopropyl)-, 미리스트아미도프로필 (myristamidopropyl)-, 팔미도프로필 (palmidopropyl)-, 또는 이소스테아르아미도프로필 (isostearamidopropyl)-베타인 (예로, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 오페일-타우레이트; 또한 MONAQUAT^TM 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체들 (예로, 플루로닉스 (Pluronics), PF68 등)와 같은 비이온성 표면활성제들을 포함한다. 전형적으로, 첨가된 표면활성제의 양은 이것이 단백질의 응집을 감소시키고 미립자들 또는 포기들 (effervescences)의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 표면활성제는 약 0.001 내지 0.5% (예로, 약 0.005 내지 0.05%, 또는 0.005 내지 0.01%)로부터 나온 농도로 제형물에 존재할 수 있다. 상세하게, 표면활성제는 대략 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% 등의 농도로 제형물에 존재할 수 있다. 임의적으로, 또는 추가적으로, 표면활성제가 동결건조 제형물, 전-동결건조 제형물 및/또는 재구성된 제형물에 첨가될 수 있다.

일정 구현예들에서, 레밍턴의 약제학적 과학들 제 16판, Osol, A. 출판사 (1980)에 기술된 것들과 같은 기타 다른 약제학적으로 허용가능한 담체들, 운반체들 또는 안정화제들을 그들이 제형물의 원하는 특성들에 역효과를 주지 않는 경우라면 제형물 (및/또는 동결건조 제형물 및/또는 재구성된 제형물)에 포함될 수 있다. 허용가능한 담체들, 운반체들 또는 안정화제들은 적용되는 해당 용량들 및 농도들에서 수여자들에게 비독성이고, 또한 이에 제한되는 것은 아니지만 추가적인 완충제들; 보존제들; 공-용매들; 아스코브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제들; EDTA와 같은 킬레이팅제들; 금속 복합체들 (예로, Zn-단백질 복합체들); 폴리에스테르들과 같은 생분해성 중합체들; 및/또는 소듐과 같은 염-형성 반대이온들을 포함한다.

수성, 전-동결건조, 동결건조 또는 재구성된 형태로의 본 발명에 따른 제형물들은 제품 품질 분석, 재구성 시간 (동결건조된 경우), 재구성의 품질 (동결건조된 경우), 고분자량, 수분, 및 유리 전이 온도를 기초로 하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 단백질 품질 및 제품 분석은, 이에 제한되는 것은 아니지만 크기 배제 HPLC (SE-HPLC), 양이온 교환-HPLC (CEX-HPLC), X-선 회절 (XRD), 조정된 차별 스캐닝 열량측정법 (modulated differential scanning calorimetry, mDSC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 다각도 광 분산 (MALS), 형광, 자외선 흡수, 혼탁측정법 (nephelometry), 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis, CE), SDS-PAGE, 및 그들의 조합을 포함하는 방법들을 사용하는 제품 분해율 분석을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 제품의 평가는 모양 (액체 또는 케이크 모양)을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.

일반적으로, (동결건조된 또는 수성의) 제형물들은 상온에서 연장된 기간들 동안 보관될 수 있다. 보관 온도는 전형적으로 0 ℃로부터 45 ℃까지의 범위 (예로, 4℃, 20 ℃, 25 ℃, 45 ℃ 등)일 수 있다. 제형물들은 개월 단위 기간 내지 연 단위 기간 동안 보관될 수 있다. 일반적으로 보관 시간은 24개월, 12개월, 6개월, 4.5개월, 3개월, 2개월 또는 1개월일 것이다. 제형물들은 이동 단계들을 없애려고 투여에 사용되는 용기에 직접 보관될 수 있다.

제형물들은 운반 단계들을 없애려고 재구성 관 (reconstitution vessel)로서도 역시 기능할 수 있는 동결건조 용기에 직접 보관될 수 있다. 임의적으로, 동결건조된 제품 제형물들은 보관을 위해 더 작은 증분들 (increments) 내로 측정될 수 있다. 일반적으로 보관은 단백질의 분해를 유발하는, 이에 제한되는 것은 아니지만 태양광 노출, UV 조사, 다른 형태들의 전자기 조사, 과도한 열 또는 추위, 급속한 열적 충격, 및 기계적인 충격을 포함하는 환경들을 피해야 한다.

동결건조

본 발명에 따른 발명적 방법들은 물질들이라면 모두, 상세하게는 치료제들을 동결건조하는 데 사용될 수 있다. 전형적으로, 전-동결건조 (pre-lyophilization) 제형물은 좀 더 나아가 관심있는 화합물을 냉동-건조 및 보관 기간 동안 분해되지 않도록 안정화제들 (stabilizers), 완충제들 (buffering agents), 충전제들 (bulking agents), 및 표면활성제들 (surfactants)과 같은 운반체들 또는 기타 다른 성분들의 적절한 선택을 포함한다. 동결건조를 위한 제형물은 동결보호제들 (lyoprotectants) 또는 안정화제들, 완충액들, 충전제들, 등장성 제제들 및 표면활성제들을 포함하는 하나 이상의 추가적인 성분들을 포함할 수 있다.

관심있는 물질 및 추가적인 성분들이 다함께 혼합된 이후, 제형물은 동결건조된다. 일반적으로, 동결건조는 세 가지 단계: 냉동, 일차 건조 및 이차 건조를 포함한다. 냉동은 물을 얼음으로 또는 일정 무정형 제형물 성분들을 결정 형태로 전환하는 데 필요하다. 일차 건조는 얼음이 낮은 압력 및 온도에서 직접적인 승화에 의해 냉동된 산물로부터 제거되는 공정 단계이다. 이차 건조는 남아있는 물의 증발 표면으로의 확산을 이용하여 부착된 물을 산물 기질로부터 제거하는 공정 단계이다. 이차 건조 동안 산물 온도는 정상적으로 일차 건조 동안보다 더 높다. Tang X. et al. (2004) "Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: Practical advice," Pharm. Res., 21:191-200; Nail S.L. et al. (2002) "Fundamentals of freeze-drying," in Development and manufacture of protein pharmaceuticals. Nail S.L. editor New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers, pp 281-353; Wang et al. (2000) "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals," Int. J. Pharm., 203:1-60; Williams N.A. et al. (1984) "The lyophilization of pharmaceuticals; A literature review." J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59을 참고하라. 일반적으로, 동결건조 공정이라면 모두가 본 발명과 연결하여 사용될 수 있다.

일정 구현예들에서, 아닐링 (annealing) 단계가 산물의 초기 냉동기간 동안 도입될 수 있다. 아닐링 단계는 전반적인 순환 시간을 감소시킬 수 있다. 이론이라면 모두에 칩착하려고 않더라도, 아닐링 단계는 초저온화 (supercooling) 동안 형성되는 작은 결정들의 결정화로 인해 운반체 결정화 및 더 큰 얼음 결정들의 형성을 촉진시키도록 도울 수 있고, 이는 다음으로 재구성을 개선시킨다. 전형적으로, 아닐링 단계는 냉동기간 동안 온도에서 간격 또는 진동을 포함한다. 예를 들어, 냉동 온도는 -40 ℃일 수 있고, 아닐링 단계는 온도를, 예를 들어 -10 ℃로 증가시키고 본 온도를 설정 기간 동안 유지할 것이다. 아닐링 단계는 0.5시간부터 8시간 (예로, 0.5, 1.0 1.5, 2.0, 2.5, 3, 4, 6, 및 8시간)까지의 범위일 수 있다. 아닐링 온도는 냉동 온도 및 0 ℃사이의 범위일 수 있다.

동결건조는 튜브, 백, 병, 선반, 바이알 (예로, 유리 바이알), 주사기, 또는 기타 적합한 용기들과 같은 용기 내에서 수행될 수 있다. 용기들은 일회용일 수 있다. 동결건조는 대규모 또는 소규모로도 역시 수행될 수 있다. 예를 들어, 운반 단계를 피하도록 단백질의 재구성이 수행될 용기에서 단백질 제형물을 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 본 경우에, 용기는 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알일 수 있다.

본 목적으로, 헐 파일럿 스케일 건조기 (Hull pilot scale dryer, SP Industries, USA), 제네시스 (Genesis, SP Industries) 연구실 동결건조기들 또는 주어진 동결건조공정 변수들을 조절할 수 있는 냉동-건조기들이라면 모두와 같은 많은 서로 다른 동결건조기들이 사용가능하다. 냉동-건조는 제형물을 냉동시키고 연속하여 일차 건조에 적합한 온도에서 냉동된 내용물로부터 얼음을 승화시켜서 달성된다. 초기 냉동은 제형물을 전형적으로 단지 약 4시간 (예로, 단지 약 3시간, 단지 약 2.5시간, 단지 약 2시간)에 약 -20 ℃ (예로, -50 ℃, -45 ℃, -40 ℃, -35 ℃, -30 ℃, -25 ℃ 등) 미만 온도로 도달시킨다. 본 조건 하에서, 산물 온도는 전형적으로 제형물의 공융점 (eutectic point) 또는 붕괴 온도 미만이다. 전형적으로, 일차 건조를 위한 보관 온도는 전형적으로 약 20부터 250 mTorr까지 범위의 적합한 압력에서 약 -30부터 25 ℃까지 (일차 건조 동안 용융점 미만으로 남아있는 경우)의 범위일 것이다. 제형물, 시료를 담는 용기의 크기 및 유형 (예로, 유리 바이알) 또한 액체 부피는 주로 건조에 요구되는 시간을 진술할 것이고, 이는 수 시간부터 여러 날까지의 범위일 수 있다. 이차 건조 단계는 먼저 용기의 유형 및 크기 또한 적용되는 치료 단백질의 유형에 의존하여, 약 0-60℃에서 수행된다. 다시, 액체 부피는 주로 건조에 요구되는 시간을 진술할 것이고, 이는 수 시간부터 여러 날까지의 범위일 수 있다.

일반적인 제안으로서, 동결건조는 그의 수분 함량이 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하, 및 약 0.5% 이하인 동결건조된 제형물을 만들 것이다.

재구성

본 발명의 약제학적 조성물들이 개체에게 투여 시 일반적으로 수성의 형태인 한편, 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 동결건조된다. 이러한 조성물들은 개체에게 투여 이전에 이에 하나 이상의 희석제들을 첨가하여 재구성되어야 한다. 원하는 단계에서, 전형적으로 환자에게 투여 이전 적절한 시간에, 동결건조된 제형물은 재구성된 제형물에서 단백질 농도가 바람직할 수 있도록 희석제를 사용하여 재구성될 수 있다.

다양한 희석제들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 재구성에 적합한 희석제는 물이다. 희석제로 사용되는 물은 역삼투 (reverse osmosis), 증류 (distillation), 탈이온화 (deionization), 여과들 (filtrations) (예로, 활성화 탄소, 미세여과, 나노여과) 및 이들 처리 방법들의 조합들을 포함하는 다양한 방식들로 처리될 수 있다. 일반적으로, 물은, 이에 제한되는 것은 아니지만 주사용 무균수 또는 정균수 (bacteriostatic water)를 포함하여 주사에 적합해야 한다.

추가적인 대표적 희석제들로는 pH 완충된 용액 (예로 포스페이트-완충 식염수), 무균 식염수 용액, 엘리어트 용액 (Elliot's solution), 링거액 (Ringer's solution) 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 적합한 희석제들은 임의적으로 보존제를 포함할 수 있다. 대표적인 보존제들은 벤질 또는 페닐 알코올과 같은 방향족 알코올들을 포함한다. 적용되는 보존제의 양은 단백질 및 보존제 효능 시험과 합치되는 서로 다른 보존제 농도들을 조사하여 결정된다. 예를 들어, 보존제가 방향족 알코올 (벤질 알코올과 같음)인 경우라면, 약 0.1-2.0%로부터, 약 0.5-1.5%로부터, 또는 약 1.0-1.2%로부터 나온 양으로 존재할 수 있다.

본 발명에 적합한 희석제들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 pH 완충제들 (예로, 트리스, 히스티딘), 염들 (예로, 염화나트륨), 및 상기에 기술된 것들 (예로, 안정화제들, 등장성 제제들)을 포함하는 기타 다른 첨가제들 (예로, 슈크로스)를 포함하는 다양한 첨가제들을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 동결건조된 물질 (예로, 단백질)은 적어도 25 mg/ml (예로, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml)의 농도로 재구성될 수 있다. 일정 구현예들에서, 동결건조된 물질 (예로, 단백질)은 약 1 mg/ml부터 100 mg/ml까지 (예로, 약 1 mg/ml부터 50 mg/ml까지, 약 1 mg/ml부터 100 mg/ml까지, 약 1 mg/ml부터 5 mg/ml까지, 약 1 mg/ml부터 10 mg/ml까지, 약 1 mg/ml부터 25 mg/ml까지, 약 1 mg/ml부터 75 mg/ml까지, 약 10 mg/ml부터 30 mg/ml까지, 약 10 mg/ml부터 50 mg/ml까지, 약 10 mg/ml부터 75 mg/ml까지, 약 10 mg/ml부터 100 mg/ml까지, 약 25 mg/ml부터 50 mg/ml까지, 약 25 mg/ml부터 75 mg/ml까지, 약 25 mg/ml부터 100 mg/ml까지, 약 50 mg/ml부터 75 mg/ml까지, 약 50 mg/ml부터 100 mg/ml까지)의 농도로 재구성될 수 있다. 일정 구현예들에서, 재구성된 제형물에서 단백질의 농도는 전-동결건조 제형물에서의 농도보다 더 높을 수 있다. 재구성된 제형물에서의 높은 단백질 농도들은 특히 재구성된 제형물의 피하 또는 근육내 전달이 의도되는 곳에서 유용한 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 재구성된 제형물에서 단백질의 농도는 전-동결건조 제형물의 약 2-50배 (예로, 약 2-20배, 약 2-10배, 또는 약 2-5배)일 수 있다. 일정 구현예들에서, 재구성된 제형물에서 단백질의 농도는 전-동결건조 제형물의 적어도 약 2배 (예로, 적어도 약 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 40배)일 수 있다.

본 발명에 따른 재구성은 용기라면 모두에서 수행될 수 있다. 본 발명에 적합한 대표적인 용기들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 튜브들, 바이알들, 주사기들 (예로, 단일-체임버 또는 이중-체임버), 백들, 병들, 및 선반들을 포함한다. 적합한 용기들은 유리, 플라스틱, 금속과 같은 물질들이라면 모두로 만들어질 수 있다. 용기들은 일회용이거나 재사용가능할 수 있다. 재구성은 대규모 또는 소규모로도 역시 수행될 수 있다.

일정 경우들에서, 운반 단계를 피하도록 단백질의 재구성이 수행될 용기에서 단백질 제형물을 동결건조하는 것이 바람직할 수 있다. 본 경우에, 용기는 예를 들어 3, 4, 5, 10, 20, 50 또는 100 cc 바이알알 수 있다. 일정 구현예들에서, 동결건조 및 재구성에 적합한 용기는 이중 체임버 주사기 (예로, Lyo-Ject,® (Vetter) 주사기들)이다. 예를 들어, 이중 체임버 주사기는 동결건조 물질 및 희석제 둘 다를 정지기 (stopper)로 분리된 각각 별도의 체임버에 포함할 수 있다 (실시예 5 참조). 재구성하기 위하여, 플런저 (plunger)가 희석제 측면에서 정지기에 부착될 수 있고 눌러서 희석제를 산물 체임버 내로 이동시키며, 결과적으로 희석제는 냉동건조 물질과 접촉할 수 있고 재구성이 본 명세성에서 기술된 바와 같이 일어날 수 있다 (실시예 5 참조).

본 발명의 약제학적 조성물들, 제형물들 및 관련 방법들은 개체의 CNS로 (예로, 경막내, 뇌실내 또는 대수공내) 다양한 치료제들을 전달하는 데 또한 연관된 질환들의 치료에 유용하다. 본 발명의 약제학적 조성물은 특히 리소좀 축적병들을 앓고 있는 개체들에게 단백질들 및 효소들을 전달하는 데 (예로, 효소 대체 요법) 유용하다. 리소좀 축적병들은 리소좀 기능의 결함들로부터 유발되는 비교적 희귀한 유전되는 대사 장애들의 그룹을 말한다. 리소좀 질환들은 리소좀들 내에 미소화된 거대분자들의 축적을 특징으로 하고, 이러한 리소좀들의 크기 및 수의 증가 또한 궁극적으로는 세포성 기능장애 및 임상적 이상들을 유발한다.

CNS 전달

본 명세서에서 기술된 다양한 안정한 제형물들은 일반적으로 치료제들의 CNS 전달에 적합한 것으로 참작된다. 본 발명에 따른 안정한 제형물들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질내, 대뇌내, 대뇌 측실내 (ICV), 경막내 (예로, IT-요추, IT-대수공) 투여들을 포함하는 다양한 기법들 및 경로들 또한 CNS 및/또는 CSF로 직접 또는 간접 주사하는 기타 다른 기법들 및 경로들에 의한 CNS 전달에 사용될 수 있다.

경막내 전달

일정 구현예들에서, 대체 효소는 본 명세서에서 기술된 제형물에 넣어 CNS로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 치료를 필요로 하는 개체의 뇌척수액 (CSF) 내로 투여되어 CNS로 전달된다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 원하는 대체 효소 (예로, I2S 단백질)을 CSF 내로 전달하는 데 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 경막내 투여 (경막내 주사라고도 말함)은 척수관 (척수 주위의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들이, 제한되지 않고 천두공 또는 대수공 또는 요추 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사를 포함하여 사용될 수 있다. 대표적인 방법들은 Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 and Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179에 기술되어 있고, 그의 내용들은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

본 발명에 따르면, 효소는 척수관을 감싸는 부위라면 모두에 주사될 수 있다. 일정 구현예들에서, 효소는 요추 영역 또는 대수공 내로 또는 대뇌 측실 공간 내에 뇌측내 주사된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위" 또는 "요추 영역"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위를 말한다. 전형적으로, 요추 부위 또는 요추 영역을 통한 경막내 주사는 "요추 IT 전달" 또는 "요추 IT 투여"라고도 말한다. 용어 "대수공"은 두개골 및 척수의 첨단 사이의 구멍을 통한 소뇌 주변 또는 아래의 공간을 말한다. 전형적으로, 대수공을 통한 경막내 주사는 "대수공 전달"이라고도 말한다. 용어 "대뇌 측실"은 척수의 중앙관과 연속되는 뇌에서의 공동들을 말한다. 전형적으로, 대뇌 측실 공동들을 통한 주사들은 대뇌 측실내 (ICV) 전달이라고 말한다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달"은 요추 IT 투여 또는 전달, 예를 들어 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이, 보다 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위로 전달되는 것을 말한다. 요추 IT 투여 또는 전달는 우리 발명에 따른 요추 IT 투여 또는 전달이 말단 척수관으로 더 나은 더욱 효과적인 전달을 제공하는 한편, 대수공 전달은 무엇보다도 전형적으로 말단 척수관으로 잘 전달되지 못하는 점에서 대수공 전달과는 차별되는 것으로 고려된다.

경막내 전달을 위한 장치

다양한 장치들이 본 발명에 따른 경막내 전달에 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여장치는 체액 유입 포트; 체액 유입 포트와 액체 소통하는 첫 번째 유동 입구 및 척수 내로의 삽입을 위해 형성된 두 번째 유동 입구를 가지는 공동체; 또한 척수에서 공동체의 삽입을 보장하는 안전 기작:을 포함한다. 도 62에 나타난 비-제한적인 예로서, 적합한 안전 기작은 공동체가 척수로부터 벗어나는 것을 막도록 공동체의 표면 위에 올려진 하나 이상의 돌기들 및 하나 이상의 돌기들 위로 조절가능한 연결된 고리를 포함한다. 다양한 구현예들에서, 체액 유입 포트는 저장조를 포함한다. 일정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 기계적인 펌프 (예로, 주입 펌프)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 이식된 카테터는 저장조 (예로, 일시 주사용), 또는 주입 펌프 둘 중 하나로 연결된다. 액체 유입 포트는 이식되어 있거나 외부에 있을 수 있다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 요추 천자 (예로, 저속 볼루스)에 의해 또는 포트-카테터 전달 시스템 (예로, 주입 또는 볼루스)를 통해 수행될 수 있다. 일정 구현예들에서, 카테터는 요추 판들 (laminae) 사이에 삽입되고 말단은 원하는 수준 (일반적으로 L3-L4)까지 경막 공간 위로 올려진다 (threaded up) (도 63).

전형적으로 정맥내 투여와 대비하여, 경막내 투여에 적합한 단일 용량 부피는 적다. 전형적으로, 본 발명에 따른 경막내 전달은 CSF조성물의 균형뿐만 아니라 개체의 구개골내 압력을 유지시킨다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달은 개체로부터 해당하는 CSF 제거 없이 수행된다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량은, 예로 약 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1.5 ml, 1 ml, 또는 0.5 ml일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량 부피는 약 0.5-5 ml, 0.5-4 ml, 0.5-3 ml, 0.5-2 ml, 0.5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1.5-3 ml, 1-4 ml, 또는 0.5-1.5 ml일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 투여는 먼저 원하는 양의 CSF를 제거하는 단계가 관여한다. 일정 구현예들에서, 약 10 ml 이하 (예로, 약 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml 이하)의 CSF가 IT 투여 이전에 먼저 제거된다. 이들 경우들에서, 적합한 단일 용량 부피는, 예로 약 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 또는 20 ml 이상이다.

다양한 다른 장치들이 치료적 조성물의 경막내 투여에 효과를 주도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 효소들을 포함하는 제형물들이 수막성 암종증 (meningeal carcinomatosis)을 위한 약물들을 경막내 투여하는 데 공통적으로 사용되는 오마야 저장조 (Ommaya reservoir)를 사용하여 주어질 수 있다 (Lancet 2: 983-84, 1963). 보다 상세하게, 본 방법에서는 뇌실 튜브가 전방각 (anterior horn)에 형성되는 구멍을 통해 삽입되고 두피 하에 설치된 오마야 저장조로 연결되며, 저장조는 들어있는 특정한 효소를 경막내 전달하도록 피하적으로 천자된다. 개인에게 치료적 조성물들 또는 제형물들의 경막내 투여를 위한 다른 장치들이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허 제 6,217,552호에 기술되어 있다. 임의적으로, 약물은 예를 들어 단일 주사 또는 연속식 주입에 의해 경막내로 주어질 수 있다. 투여량 치료 (dosage treatment)는 단일 용량 투여 또는 다중 용량들의 형태일 수 있다.

주사의 경우, 본 발명의 제형물들은 액체 용액들로 제형화될 수 있다. 또한, 효소는 고형으로 제형화되어 사용 바로 직전에 재-용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태들도 역시 포함된다. 예를 들어, 주사는 효소의 일시 주사 또는 연속식 주입 (예로, 주입 펌프들을 사용함)의 형태일 수 있다.

본 발명의 한 가지 구현예에서, 효소는 개체의 뇌 내로 측뇌실 주사 (lateral cerebro ventricular injection)에 의해 투여된다. 예를 들어, 주사는 개체의 두개골 내에 만들어진 천두공을 통하여 이루어진다. 또 다른 구현예들에서, 효소 및/또는 다른 약제학적 제형물은 개체의 뇌실 내로 외과적으로 삽입된 지름길 (shunt)을 통하여 투여된다. 예를 들어, 주사는 더 큰 뇌실들 내로 이루어진다. 일정 구현예들에서, 세 번째 및 네 번째로 작은 뇌실들 내로의 주사도 역시 이루어진다.

보다 또 다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물은 개체의 대수공 또는 요추 영역 내로의 주사에 의해 투여된다.

본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 제형물은 지속적인 전달, 예로 본 발명에 사용되는 효소 또는 다른 약제학적 조성물의 "저속 방출 (slow release)"을 개체에게 약제학적으로 허용가능한 제형물이 개체에게 투여된 이후 적어도 1, 2, 3, 4주 이상의 기간 동안 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "지속적인 전달 (sustained delivery)"은 투여에 이어지는 초과기간, 바람직하게 적어도 수 일, 한 주 또는 수 주 동안 생체내 (in vivo)에서 본 발명의 약제학적 제형물의 연속적인 전달을 말한다. 조성물의 지속적인 전달은 예를 들어 초과기간 동안 효소의 계속되는 치료적 효과에 의해 확인될 수 있다 (예로, 효소의 지속적인 전달은 개체에서 축적 과립들의 계속적인 감소량에 의해 확인될 수 있다). 임의적으로, 효소의 지속적인 전달은 초과기간 동안 생체내 효소의 존재를 검출하여 확인될 수 있다.

표적 조직들로의 전달

상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 놀랍고도 중요한 특징들의 하나는 치료제들, 상세하게는 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물을 사용하여 투여된 대체 효소들이 뇌 표면을 거쳐서 효과적으로 또는 광범위하게 확산되고 깊은 뇌의 부위들을 포함하는 뇌의 다양한 층들 또는 부위들을 침투하는 점이다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 치료제들 (예로, I2S 효소)을 ICV 주사와 같은 기존의 CNS 전달 방법들에 의해 표적하는 것이 어려운 다양한 조직들, 뉴런들 또는 요추 부위를 포함하는 뇌척수의 세포들로 효과적으로 전달시킨다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 혈류 및 다양한 말초 기관들 및 조직들로 충분량의 치료제들 (예로, I2S 효소)을 전달시킨다.

따라서, 일정 구현예들에서, 치료적 단백질 (예로, I2S 효소)은 개체의 중추신경계로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질 (예로, I2S 효소)은 뇌, 척수 및/또는 말초 기관들의 하나 이상의 표적 조직들로 전달된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들 (target tissues)"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 앓거나 이에 취약한 환자들에서 효소 기질, 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 것의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직인 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.

뇌 표적 조직들

일반적으로, 뇌는 서로 다른 부위들, 층들 및 조직들로 구분될 수 있다. 예를 들어, 뇌척수막 조직은 뇌를 포함하는 중추신경계를 감싸는 막들의 시스템이다. 뇌척수막들은 경질막, 거미막 및 연질막을 포함하는 세 가지의 층들을 포함한다. 일반적으로, 뇌척수막 및 뇌척수액의 일차적인 기능은 중추신경계를 보호하는 것이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질은 뇌척수막들의 하나 이상의 층들로 전달된다.

뇌는 대뇌 (cerebrum), 소뇌 (cerebellum), 및 뇌줄기 (brain stem)를 포함하는 세 가지의 일차 소구분들을 가진다. 대뇌 반구들 (cerebral hemispheres)는 대부분의 뇌 구조들의 위에 위치하고 피질층 (cortical layer)으로 덮여있다. 뇌줄기는 대뇌가 부착되는 줄기와 유사하고 대뇌 아래에 놓여있다. 뇌의 후반구에는, 소뇌가 대뇌 아래 및 뇌줄기 뒤에 있다.

뇌의 중간선 근처에 또한 중뇌 (mesencephalon) 위에 위치하는 간뇌 (diencephalon)는 시상 (thalamus), 시상 후부 (metathalamus), 시상 하부 (hypothalamus), 시상 상부 (epithalamus), 시상 전부 (prethalamus), 및 덮개 전부 (pretectum)를 포함한다. 중간뇌라고도 불리는 중뇌는 덮개 (tectum), 뒷판 (tegumentum), 뇌실 중배강 (ventricular mesocoelia), 및 대뇌다리 (cerebral peduncels), 적색핵, 및 뇌신경 the red nucleus, III 핵을 포함한다. 중뇌는 시각, 청각, 운동 조절, 수면/기상, 각성 및 온도 조절과 연관되어 있다.

뇌를 포함하는 중추신경계의 조직들의 부위들은 조직의 깊이를 기초로 하여 특징지어진다. 예를 들어, CNS (예로, 뇌) 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어진다.

본 발명에 따르면, 치료제 (예로, 대체 효소)는 개체에서 치료될 특정한 질환과 연관된 적절한 뇌 표적 조직(들)이라면 모두로 전달될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제 (예로, 대체 효소)는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 중간-깊이 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직, 중간-깊이 뇌 표적 조직, 및/또는 깊은 뇌 표적 조직의 조합으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 뇌의 외부 표면 아래로 (또는 내부로) 적어도 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm 이상의 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 대뇌의 표면 또는 얕은 조직들의 하나 이상으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 연질막 조직들, 대뇌 피질 리본 조직들, 해마, 버코우 로빈 공간 (Virchow Robin space), VR 공간 내의 혈관들, 해마, 뇌의 하부 표면 상의 시상하부의 일부들, 시신경들 및 관들, 후각 망울 및 돌출부들, 또한 그들의 조합으로부터 선택된다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 하나 이상의 대뇌의 깊은 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면 아래로 (또는 내부로) 4 mm (예로, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm)에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 대뇌 피질 리본을 포함한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 하나 이상의 간뇌 (예로, 시상하부, 시상, 시상 전부, 시상 아래부 등), 후뇌, 렌즈핵 (lentiform nuclei), 기저 신경절 (basal ganglia), 미상엽 (caudate), 조가비핵 (putamen), 편도핵 (amygdale), 창백핵 (globus pallidus), 및 그들의 조합을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 소뇌의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 소정의 구현예들에서, 소뇌의 표적된 하나 이상의 조직들은 분자층 의 조직들, 퍼킨지 세포층 (Purkinje cell layer), 과립 세포층 (granular cell layer)의 조직들, 대뇌다리, 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 퍼킨지 세포층의 조직들, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직 (예로, 과립 세포층에 대비하여 깊음), 및 깊은 소뇌 핵 조직을 포함하는 소뇌의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 뇌줄기의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 뇌줄기의 표적된 하나 이상의 조직들은 뇌 줄기 백색질 조직 및/또는 뇌줄기 핵 조직을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 회색질, 백색질, 뇌실주위 영역들, 연질-거미막, 뇌척수막, 신생피질 (neocortex), 소뇌, 대뇌 피질에서의 깊은 조직들, 분자층, 미상엽/조가비핵 부위, 중간뇌, 교뇌 (pons) 또는 연수 (medulla)의 깊은 부위들, 및 그들의 조합을 포함하는 다양한 뇌 조직들로 전달된다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 뉴런들. 아교세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들을 포함하는 다양한 세포들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 깊은 백색질의 희소돌기아교세포들 (oligodendrocytes)로 전달된다.

척수

일반적으로, 척수의 부위들 또는 조직들은 조직들의 깊이를 기초로 하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 척수 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어질 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 하나 이상의 표면 또는 얕은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 연질막 및/또는 백색질의 관들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 내부에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수 회색질 및/또는 뇌실막 세포들을 포함한다.

일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 뉴런들로 전달된다.

말초 표적 조직들

본 명세서에서 사용되는 바, 말초 기관들 또는 조직들은 중추신경계 (CNS)의 일부가 아닌 기관들 또는 조직들이라면 모두를 말한다. 말초 표적 조직들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 간, 신장, 및/또는 심장, 내피세포, 골수 및 세포들로부터 유래한 골수, 비장, 폐, 림프절, 뼈 및 연골, 난소 및 정소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)는 하나 이상의 말초 표적 조직들로 전달된다.

생체분배 및 생물 유용성

다양한 구현예들에서, 일단 표적 조직으로 전달되면 치료제 (예로, I2S 효소)는 세포내에 정착된다. 예를 들어, 치료제 (예로, 효소)는 표적 세포 (예로, 퍼킨지 세포들과 같은 뉴런들)의 엑손들, 축삭들, 리소좀들, 미토콘드리아 또는 소포들에 정착될 수 있다. 예를 들어, 일정 구현예들에서 경막내-투여된 효소들은 전위 역학 (translocation dynamics)을 나타내어 효소는 혈관 주위 공간 내에서 움직인다 (예로, 박동성 전도 기작들 (pulsation-assisted convective mechanisms)에 의함). 또한, 투여된 단백질 또는 효소의 신경섬유 (neurofilaments)와 연결과 관련된 활동성 축삭 전달기작들도 역시 중축신경계의 심부 조직들 내로 경막내-투여된 단백질들 또는 효소들의 분배에 기여하거나 다른 경우라면 이를 용이하게 할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달된 치료제 (예로, I2S 효소)는 본 명세서에서 기술된 다양한 표적 조직들에서 치료적 또는 임상적 유효 수준들 또는 활성들을 달성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 치료적 효과를 부여하는 데 충분한 수준 또는 활성이다. 치료적 효과는 객관적 (예로, 일정 테스트 또는 마커에 의해 측정가능함) 또는 주관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 예를 들어, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 질환과 연관된 증상들 (예로, GAG 축적)을 개선시키는 데 충분한 효소적 수준 또는 활성일 수 있다

일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 표적 조직에서 해당하는 리소좀 효소의 정상적인 수준 또는 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%가 되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 대조군 (예로, 치료가 없는 내인성 수준들 또는 활성들)과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 표적 조직에서 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 상세하게 요추 부위를 표적하는 데 유용하다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 요추 부위에서 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 CSF 또한 뇌, 척수, 및 말초 기관들의 표적 조직들에서 충분하게 긴 반감기를 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 적어도 대략 30분, 45분, 60분, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 3일까지, 7일까지, 14일까지, 21일까지 또는 한 달까지의 반감기를 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 투여에 이어서12시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 78시간, 84시간, 90시간, 96시간, 102시간 또는 한 주 이후에 CSF 또는 혈류에서 검출가능한 수준 또는 활성을 보유할 수 있다. 검출가능한 수준 또는 활성은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.

소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 CNS 조직들 및 세포들에서 적어도 30ug/ml의 농도를 달성하고 있다. 소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 이러한 개체로의 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 표적된 조직들 또는 세포들 (예로, 뇌 조직들 또는 뉴런들)에서 적어도 20ug/ml, 적어도 15ug/ml, 적어도 10ug/ml, 적어도 7.5ug/ml, 적어도 5ug/ml, 적어도 2.5ug/ml, 적어도 1.0ug/ml, 또는 적어도0.5ug/ml의 농도를 달성하고 있다.

헌터 증후군 및 다른 리소좀 축적병들의 치료

리소좀 축적병은 리소좀 기능에서의 결함들로부터 발생하는 비교적 희귀한 유전되는 대사 장애들의 그룹을 대표한다. 리소좀 질환들은 리소좀들 내에 이들 효소 기질들을 포함하는 미소화된 (undigested) 거대분자들의 축적을 특징으로 하고 (표 1 참조), 이는 이러한 리소좀들의 크기 및 숫자에서 증가를 또한 궁극적으로 세포성 기능이상 및 임상적 이상들을 가져온다.

유익하게, 본 명세서에서 기술된 발명적 방법들은 표적된 소기관들에게로 하나 이상의 치료제들 (예로, 하나 이상의 대체 효소들)의 전달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병은 침범된 세포들의 리소좀들에서 글리코사미노글리칸 (GAG)의 축적을 특징으로 하고, 리소좀들은 리소좀 축적병들의 치료를 위한 원하는 표적 소기관을 대표한다.

상세하게, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 CNS 병인학 또는 성분을 가지는 이들 질환들을 치료하는 데 유용하다. CNS 병인학 또는 성분을 가지는 리소좀 축적병들은 예를 들어 제한 없이 산필리포 증후군 A형, 산필리포 증후군 B형, 헌터 증후군, 이염색성 백색질 장애 빛 구형세포 백색질 장애를 포함한다. 본 발명의 이전에, 통상적인 요법들은 개체들에게 정맥내로 투여하는 것에 제한되고, 일반적으로 내재된 효소 결합의 신체 증상들을 치료하는데만 효과적이다. 유익하게, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 이러한 CNS 병인학을 가지는 질환을 앓고 있는 개체의 CNS 내로 직접 투여되 고 이에 의해 CNS (예로, 뇌)의 침범된 세포들 및 조직들 내에서 치료적 농도를 달성할 수 있고, 따라서 이러한 치료제들의 통상적인 전신적 투여와 연관된 문제점들을 극복할 수 있다.

일정 구현예들에서, 본 발명의 발명적 조성물들은 리소좀 축적병들의 신경적 및 신체적 후유증 또는 증상들 둘 다를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 일정 구현예들은 리소좀 축적병의 CNS 또는 신경적 후유증 및 소견들의 치료를 위해 개체의 CNS에 하나 이상의 치료제들을 (예로, 경막내, 뇌실내 또는 대수공내로) 전달하는 한편 본 리소좀 축적병의 전신적 또는 신체적 소견들을 치료하는 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일정 조성물들은 개체에게 경막내로 투여되고, 이에 의해 개체의 CNS 로 치료제들을 전달하고 신경학적 후유증을 치료할 수 있으며, 이러한 치료제들을 전신적 순환의 세포들 및 조직들 (예로, 심장, 폐들, 간, 신장 또는 림프절들의 세포들 및 조직들) 둘 다로 전달하여 신체적 후유증을 치료하도록 하나 이상의 치료제들의 정맥내 투여와 결합될 수 있다. 예를 들어, 리소좀 축적병 (예로, 헌터 증후군)을 가지거나 이에 의해 침범된 개체에게 신경학적 후유증을 치료하도록 하나 이상의 치료제들 (예로, 이듀로네이트-2-설파타제)을 포함하는 약제학적 조성물이 적어도 매주, 격주, 매월, 2개월마다 또는 그 이상마다 한 번 투여될 수 있고, 한편 서로 다른 치료제가 개체에게 질환의 전신적 또는 신체적 소견들을 치료하도록 더 빈번하게 (예로, 매일, 격일, 매주 세 번 또는 매주) 정맥내 투여된다.

헌터 증후군, 또는 점액다당류증 제 II형 (MPS II)은 효소 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 결핍으로부터 유발되는 X-연관 유전가능한 대사 장애이다. I2S는 리소좀으로 정착하고 글리코사미노글리칸들 (GAGs) 헤파란- 및 더마탄-설페이트의 이화작용에서 중요한 역할을 한다. 효소의 부재 시, 이들 기질들은 세포들 내에 축적되고, 궁극적으로 충혈을 초래하여 세포 사망 및 조직 파괴로 이어진다. 효소의 광범위한 발현으로 인해서도, MPS II 환자들에서 다수의 세포 유형들 및 기관계들이 영향을 받는다.

본 장애의 정확한 임상적 특징은 인지 손상 (예로, IQ의 감소)을 유발하는 중추 신경계 (CNS) 퇴화이다. 추가적으로, 침범된 개인들의 MRI 스캔은 백색질 병변들, 뇌 실질, 신경절, 뇌들보 및 뇌줄기에서의 확장된 혈관주위 공간들, 위축증, 및 뇌실비대증을 나타내었다 (Wang et al., Molecular Genetics and Metabolism, 2009). 전형적으로, 질환은 기관비대 및 골격 이상들로 생애 첫 해에 그의 소견을 나타낸다. 일정 침범된 개인들은 인지 기능의 진행성 상실을 겪고 가장 심한 개인들은 십대 또는 이십대에 질환-연관 합병증들로 죽는다.

본 발명의 조성물들 및 방법들은 헌터 증후군을 앓고 있거나 이에 취약한 개인들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 용어들 "치료하다" 또는 "치료"는 질환과 연관된 하나 이상의 증상들의 개선, 질환의 하나 이상 증상들의 발병의 예방 또는 지연, 및/또는 질환의 하나 이상 증상들의 중증도 또는 빈도의 감소를 말한다.

일정 구현예들에서, 헌터 증후군 환자에서 신경학적 손상의 부분적 또는 완벽한 완화, 개선, 안정, 억제, 발병의 지연, 중증도 및/또는 발생의 감소를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "신경학적 손상 (neurological impairment)"은 중추신경계 (예로, 뇌 및 척수)의 손상과 연관된 다양한 증상들을 포함한다. 예를 들어, 신경학적 손상의 증상들은 백색질 병변들, 뇌 실질, 신경절, 및/또는 뇌들보 및/또는 뇌줄기에서의 확장된 혈관주위 공간들, 위축증, 및 뇌실비대증을 포함할 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료는 다양한 조직들에서 감소된 리소좀 축적 (예로, GAG)을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들, 및/또는 말단 표적 조직들에서 감소된 리소좀 축적을 말한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 리소좀 축적 과립들 (예로, 얼룩무늬 모양)의 존재에 의해 측정된다. 리소좀 축적 과립들의 존재는 조직학적 분석과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료는 뉴런들 (예로, 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들)에서 감소된 공포화 (vacuolization)를 말한다. 소정의 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다. 공포화의 존재 및 그의 감소는 조직학적 분석과 같은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 수단에 의해 측정될 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료는 다양한 조직들에서 증가된 I2S 효소 활성을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 증가된 I2S 활성을 말한다. 일정 구현예들에서, I2S 효소 활성은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 이상으로 증가된다. 일정 구현예들에서, I2S 효소 활성은 대조군과 대비하여 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 증가된다. 일정 구현예들에서, 증가된 I2S 효소 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg 이상이다. 일정 구현예들에서, I2S 효소 활성은 요추 부위에서 또는 요추 부위에 있는 세포들에서 증가된다. 일정 구현예들에서, 요추 부위에서 증가된 I2S 효소 활성은 적어도 대략 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg 또는 10,000 nmol/hr/mg 이상이다. 일정 구현예들에서, I2S 효소 활성은 말단 척수에서 또는 말단 척수의 세포들에서 증가된다.

일정 구현예들에서, 치료는 인지 능력 상실의 진행 감소를 말한다. 소정의 구현예들에서, 인지 능력 상실의 진행은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 치료는 감소된 발달 지연을 말한다. 소정의 구현예들에서, 발달 지연은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다.

일정 구현예들에서, 치료는 증가된 생존 (예로, 생존 시간)을 말한다. 예를 들어, 치료는 환자의 증가된 수명 기대치를 가져올 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 105%, 약 110%, 약 115%, 약 120%, 약 125%, 약 130%, 약 135%, 약 140%, 약 145%, 약 150%, 약 155%, 약 160%, 약 165%, 약 170%, 약 175%, 약 180%, 약 185%, 약 190%, 약 195%, 또는 약 200% 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 또는 약 10년 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 환자의 강기 생존을 가져온다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "장기 생존 (long term survival)"은 40년, 45년, 50년, 55년, 또는 60년 이상보다 긴 수명 기대치의 생존 시간을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다"는 대조군과 대비한 수치들을 가르킨다. 일정 구현예들에서, 적합한 대조군은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인에서의 측정과 같은 기저선 측정이다. "대조군 개인 (control individual)"은 (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 입증하도록) 치료될 개인과 거의 동일한 연령 및/또는 성별인 헌터 증후군을 앓고 있는 개인이다.

치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라고도 말함)은 헌터 증후군을 가지거나 헌터 증후군이 생길 잠재력을 가지는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 어른 인간)이다. 개인은 남아있는 내인성 I2S 발현 및/또는 활성을 가지거나, 측정가능한 활성을 전혀 가지지 않을 수 있다. 예를 들어, 헌터 증후군을 가지는 개인은 정상적인 I2S 발현 수준들의 약 30 내지 50% 이하, 약 25 내지 50% 이하, 약 20 내지 25% 이하, 약 15 내지 20% 이하, 약 10 내지 15% 이하, 약 5 내지 10% 이하, 약 0.1 내지 5% 이하인 I2S 발현을 가질 수 있다.

일정 구현예들에서, 개인은 최근에 질환으로 진단되었던 개인이다. 전형적으로, 조기 치료 (진단 이후 가능한 신속하게 시작한 치료)가 질환의 효과들을 최소화하고 치료의 유익들을 극대화하는 데 중요하다.

면역 내성

일반적으로, 본 발명에 따른 치료제 (예로, 대체 효소)의 경막내 투여는 개체에서 심각한 역효과들을 유발하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바, 심각한 역효과들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질적인 면역 반응, 독성, 또는 사망을 유도한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "실질적인 면역 반응 (substantial immune response)"은 적응성 T-세포 면역 반응과 같은 중증 또는 심각한 면역 반응들을 말한다.

따라서, 많은 구현예들에서 본 발명에 따른 발명적 방법들은 동시적인 면역억제 요법 (예로, 전-치료/전-조정 또는 본 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두)이 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 치료될 개인에서 면역 내성 유도가 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 T-세포 면역억제제를 사용하는 개체의 전-치료 또는 전조정이 관여하지 않는다.

일정 구현예들에서, 치료제들의 경막내 투여는 이들 제제들에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 따라서, 일정 구현예들에서, 개체가 효소 대체 요법에 내성을 가지는 대체 효소를 수여하도록 하는 것이 유용할 수 있다. 면역 내성은 당해 기술분야에서 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 사이클로스포린 A (CsA)와 같은 T-세포 면역억제제 또한 아자티오프린 (azathioprine, Aza)와 같은 항증식제의 초기 30 내지 60일 섭생이 원하는 대체 효소의 저용량들의 매주 경막내 주입들과 조합하여 사용될 수 있다.

당업자라면 숙지하고 있는 면역억제제라면 모두가 본 발명의 조합 요법과 함께 적용될 수 있다. 이러한 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 사이클로스포린 (cyclosporine), FK506, 라파마이신 (rapamycin), CTLA4-Ig, 및 에타너셉트 (etanercept)와 같은 항-TNF 제제들 (예로, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283 참조)를 포함한다. 이식 환자들에서 효과적인 것으로 확인되었던 항-IL2 수용체 (알파-단위체) 항체 다크리주마브 (daclizumab) (예로, 제나팍스 TM (Zenapax.TM.))도 역시 면역억제제로서 사용될 수 있다 (예로, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1, 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159 참조). 추가적인 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152), 및 항-CD40 리간드 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235)를 포함한다.

투여

본 발명의 발명적 방법들은 본 명세서에서 기술된 치료제들 (예로, 대체 효소)의 치료적 유효량의 단일 뿐만 아니라 다중 투여들을 고려하고 있다. 치료제들 (예로, 대체 효소들)은 개체의 병폐 (예로, 리소좀 축적병)의 성질, 중증도 및 정도에 의존하여 규칙적인 간격들로 투여될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 치료제들 (예로, 대체 효소들)의 치료적 유효량은 규칙적인 간격들 (예로, 매년 한 번, 6개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 격월 (2개월마다 한 번), 매월 (매월 한 번), 격주 (2주마다 한 번), 매주, 매일 또는 연속적으로 경막내 투여될 수 있다.

일정 구현예들에서, 경막내 투여는 다른 투여 경로들과 결합하여 사용될 수 있다 (예로, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 경피적, 또는 경점막 (예로, 경구적 또는 비강내)). 일정 구현예들에서, 이들 다른 투여 경로들 (예로, 정맥내 투여)는 많아야 격주, 매월, 2개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 4개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 6개월마다 한 번, 매년의 투여의 빈도로 수행될 수 있다. 일정 구현예에서, 방법은 좀 더 나아가 개체에게 I2S 대체 효소를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매주 투여 (예로, 많아야 격주, 매월, 2개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 4개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 또는 6개월마다 한 번)의 빈도이다. 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 매주 두 번, 매주, 격주, 또는 매월 두 번과 같이 매월 투여 이상의 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여는 동일한 날짜에 수행될 수 있다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 적어도 2일 이내, 적어도 3일 이내, 적어도 4일 이내, 적어도 5일 이내, 적어도 6일 이내, 적어도 7일 이내, 또는 적어도 한 주 이내와 같이 서로 소정의 시간 간격 이내에서 수행되지 않는다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 매주 교대하는 투여들, 2주마다 교대로, 매월 두 번, 또는 매월과 같이 교대하는 스케쥴로 수행된다. 일정의 구현예들에서, 경막내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 정맥내 투여의 스케쥴에서 본 스케쥴의 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 투여가 정맥내 투여를 대신하여 경막내 투여로 대체될 수 있는 것과 같이 투여 스케쥴에서 정맥내 투여를 대체한다. 일정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 경막내 투여의 스케쥴에서 본 스케쥴의 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 투여가 경막내 투여를 대신하여 정맥내 투여로 대체될 수 있는 것과 같이 투여 스케쥴에서 경막내 투여를 대체한다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 먼저 정맥내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 경막내 투여들로 이어지는 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 것과 같이 순서적으로 수행된다. 일정 구현예들에서, 먼저 경막내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 정맥내 투여들로 이어진다 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여).

일정 구현예들에서, 헌터 증후군은 말초적 증상들과 연관되어 있고 방법은 대체 효소를 개체에게 경막내로 투여하는 것을 포함하지만 대체 효소를 정맥내로 투여하는 것은 포함하지 않는다. 소정의 구현예들에서, I2S효소의 경막내 투여는 개체의 I2S 결핍과 연관된 말초적 증상들의 하나 이상을 개선하거나 감소시킨다.

본 명세서에서 사용되는 바, "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 주로 본 발명의 약제학적 조성물들에 포함되는 치료제의 전체량을 기초로 하여 결정된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 개체에게 의미있는 유익을 주는 데 (예로, 내재된 질환 또는 병폐를 치료하고, 조정하고, 치유하고, 예방하고 및/또는 개선하는 데) 충분하다. 예를 들어, 치료적 유효량은 리소좀 효소 수용체들 또는 그들의 활성을 조정하여 이러한 리소좀 축적병 또는 그의 증상들을 치료 (예로, 개체에게 본 발명의 조성물들의 투여에 이어지는 "얼룩무늬체들 (zebra bodies)"의 존재 또는 출현 또는 세포성 공포화에서의 감소 또는 이의 제거)하는 데 충분량과 같은 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 달성하는 데 충분량일 수 있다. 일반적으로, 필요로 하는 개체에게 투여되는 치료제 (예로, 재조합 리소좀 효소)의 양은 개체의 특징들에 의존할 것이다. 이러한 특징들은 개체의 병폐, 질환의 중증도, 일반적인 건강, 연령, 성별 및 체중을 포함한다. 당업자라면 이들 및 기타 다른 관련 요인들에 의존하여 적절한 용량들을 바로 결정할 것이다. 또한, 임의적으로 객관적 및 주관적인 검정법들 둘 다가 최적의 용량 범위들을 확인하도록 적용될 수 있다.

공통적으로 치료적 유효량은 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 투여량 요법으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 투여량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로, 다른 약제학적 제제들과의 조합에 의존하여 다양해질 수 있다. 또한, 특정한 환자라면 모두를 위한 특이적 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약제학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 적용되는 특이적 융합 단백질의 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 대사율; 치료의 지속기간; 등의 의학적 기술분야들에 잘 알려져 있는 바와 같은 요인들을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 500 mg/kg 뇌 무게까지의 범위, 예로, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 400 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 300 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 200 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 100 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 90 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 80 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 70 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 60 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 50 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 40 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 30 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 25 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 20 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 15 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 10 mg/kg 뇌 무게까지의 범위이다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.1 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 0.5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 1.0 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 3 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 10 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 15 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 20 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 30 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 40 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 60 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 70 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 80 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 90 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 100 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 150 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 200 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 250 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 300 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 350 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 400 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 450 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 500 mg/kg 뇌 무게 이상이다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량도 역시 mg/kg 체중으로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들은 교정될 수 있다. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights," Ann Neurol 1978; 4:345-56. 따라서, 일정 구현예들에서, 투여량은 표 5에 나타난 바와 같이 전환될 수 있다.

일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 또한 mg/15 cc CSF로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들을 기초로 하는 치료적 유효 용량은 mg/15 cc CSF로 전환될 수 있다. 예를 들어, 어른 인간들에서 CSF의 부피는 대략 150 mL이다 (Johanson CE, et al. "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease," Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14;5:10). 따라서, 어른들에게 0.1 mg 내지 50 mg 단백질의 단일 용량 주사들은 어른들에서 대략 0.01 mg/15 cc CSF (0.1 mg) 내지 5.0 mg/15 cc CSF (50 mg) 용량들일 것이다.

좀 더 나아가, 특정한 개체라면 모두를 위해 특이적 투여량 요법들이 필요한 개인 및 투여하고 효소 대체 요법의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 조절되어야 하고 또한 본 명세서에서 설명된 투여량 범위들이 대표적인 것일뿐이고 청구된 발명의 범위 또는 관행을 제한하도록 의도하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

키트들

본 발명은 좀 더 나아가 본 발명의 제형물을 포함하는 키트들 또는 기타 다른 제조 물품들을 제공하고 그의 재구성 (동결건조된 경우) 및/또는 사용을 위한 지침들을 제공한다. 키트들 또는 기타 다른 제조 물품들은 용기, IDDD, 카테터 및 기타 다른 물품들, 경막간 (interthecal) 투여 및 연관된 수술에 유용한 장치들 또는 장비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용기들은 병들, 바이알들, 주사기들 (예로, 미리-충전된 주사기들), 앰풀들, 카트리지들, 저장조들, 또는 동결건조-용기 (lyo-jects)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질들로 만들어질 수 있다. 적합한 미리-충전된 주사기들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 구운 실리콘 코팅을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 분사된 실리콘을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 또는 실리콘이 없는 플라스틱 레진 주사기들을 포함한다.

전형적으로, 용기들은 제형물을 보유할 수 있고, 재구성 및/또는 사용을 위한 안내들을 표시할 수 있는 라벨이 용기 위에 연결되어 있다. 예를 들어, 라벨은 제형물이 상기에 기술된 바와 같이 단백질 농도들로 재구성되는 것을 표시할 수 있다. 좀 더 나아가 라벨은 제형물이 예를 들어 IT 투여에 유용하거나 이를 의도하는 점을 표시할 수 있다. 일정 구현예들에서, 용기는 치료제 (예로, 대체 효소)를 포함하는 안정한 제형물의 단일 용량을 포함할 수 있다. 다양한 구현예들에서, 안정한 제형물의 단일 용량은 약 15 ml, 10 ml, 5.0 ml, 4.0 ml, 3.5 ml, 3.0 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml 이하의 부피로 존재한다. 임의적으로, 제형물을 보유하는 용기는 제형물의 반복적 투여들 (예로, 2 내지 6회 투여들로부터)을 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 적합한 희석제 (예로, BWFI, 식염수, 완충된 식염수)를 포함하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 희석제 및 제형물의 혼합 시, 일반적으로 재구성된 제형물에서 최종 단백질 농도는 적어도 1 mg/ml (예로, 적어도 5 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml)일 것이다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 시판 및 사용자의 관점으로부터 바람직한, 다른 완충액들, 희석제들, 필터들, 바늘들, IDDD들, 카테터들, 주사기들 및 사용 시 지침들을 가진 포장 삽입물들을 포함하는 기타 다른 물질들을 포함할 수 있다.

본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 보다 완벽하게 이해될 것이다. 그러나, 그들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다. 모든 인용 문헌들은 참고문헌으로 통합되어 있다.

실시예들

실시예 1: 생체분배

본 연구의 주요 목적은 재조합 인간 I2S가 경막내-요추 경로에 의해 어른 MPS II 마우스의 뇌로 전달되는지 여부를 결정하는 것이었다. 하기 표 6는 8 내지 12주령의 수컷 마우스의 6가지 그룹들이 처리된 것을 나타낸다

주사 계획: 동물들은 경막내-요추 경로를 통한 3번까지의 이듀설파제 (10 uL) 주사들을 맞았다:

o 그룹들A & D: 1, 8 및 15일에 3번의 I2S의 투여 용량

*

*o 그룹 B: 1 및 8일에 2번의 I2S의 투여 용량

o 그룹들 C & E: 미처리 대조군 (IKO) 마우스

o 그룹 F: 미처리 야생형 대조군 마우스

재료들 및 방법들

동물들:

마우스는 상자 당 4마리까지의 그룹들로 사육실 (colony room)에서 12시간 명암 순환 하에 가두었다. 설치류식 (LabDiet-5001, St Louis, MO) 및 물 (Lexington, MA 역삼투에 의해 정제된 수돗물)이 실험기간 동안 자유롭게 사용가능하였다. 동물들의 보호는 연구실 동물들의 보호 및 이용을 위한 가이드 (National Academy Press, Washington D.C., 1996)에 기술된 지침들에 따라 시행되었다. 최신 IKO 사육집단은 조세프 뮤엔저 박사 (Joseph Muenzer, University of North Carolina)로부터 입수한 IKO 돌연변이에 대해 이종유래인 네마리의 보균자 암컷 마우스로부터 확립되었다. 보균자 암컷들은 C57BL/6 배경 품종의 수컷 마우스 (C57BL/6NTac, Taconic, Hudson, NY)와 교배되어 이종유래 암컷들 및 반수유래 (hemizygous) 수컷 녹아웃 마우스, 뿐만 아니라 야생형 수컷 및 암컷 마우스 한배 새끼들을 생산하였다. 모든 자손은 DNA 조직의 PCR 분석에 의해 유전형 분석되었다. 본 실험에 사용된 모든 마우스는 8 및 12주 령 사이의 반수유래 IKO (-/0) 또한 야생형 (WT) 한배새끼들 (+/0) 마우스 둘 중 하나로 확인되었다.

이듀설파제

22 mL I2S [재조합 인간 듀로설파제]가 2L 포스페이트 완충 식염수 (PBS)의 네 번 변화들로 투석되었다. 다음으로 I2S는 비바스핀 (Vivaspin) 컬럼에 의해 농축되었고, 최종 1 mL PBS 부피로 재현탁되었으며, 0.2 um 필터를 사용한 필터 무균화가 이어졌다. 최종 농도는 51 mg/mL이었다.

경막내-요추 주사들:

어른 마우스는 200-300 uL/10그램 체중 (250-350 mg/kg)으로 1.25% 2,2,2 트리브로모에탄올 (Avertin)을 사용한 복강내 주사에 의해 마취되었다. 등의 털은 꼬리 기저부 및 어깨 사이가 제거되었고 면도된 영역은 포비딘/베타딘 스크럽으로 소독되었고 이소프로필 알코올이 이어졌다. 작은 중앙선 피부 절개 (1-2 cm)가 허리엉치 척수 위로 만들어졌고, 등 중앙선과 회장 (단일 회장) 날개들의 두개골 면의 교차가 확인되었다. 장골와 (iliac fossa, (gluteus medius))에서의 근육은 심장 모양의 근육이고 "심장"의 첨단의 두 면들은 대략 회장의 날개들의 위치에 온다. 기체가 채워진 10-20 uL 유리 해밀턴 주사기에 부착된 32게이지 바늘은 내재하는 뼈로부터 저항이 느껴질 때까지 삽입되었다. 테스트 항목의 10 uL 주사가 2 uL/20초 (10 uL/2분)의 대략적인 속도로 수행되었다. 피부 절개는 적절한 상처 클립을 사용하여 닫혔고 동물들은 적절한 사육상자로 복귀하기 이전에 회복실에서 회복하도록 허용되었다.

조직학 절차들:

동물들은 최종 주사 한 시간 이후에 희생되었다.

뇌 및 간 조직들이 수집되었고 10% 중성의 완충 포르말린으로 고정된 다음 파라핀에 가공되고 포매되었다. 5um 절편들이 헤마톡실린/에오신 (H&E) 및 면역조직화학 (IHC) 염색을 위해 준비되었다.

헤마톡실린 및 에오신 염색:

뇌 및 간 절편들은 H&E로 염색되었다. 염색 결과들은 핵을 보라색으로 세포질은 분홍색과 적색으로 보여주었다. H&E 염색된 슬라이드들은 조직병리학적 형태 평가를 위해 사용되었다.

면역조직화학:

I2S 생물분포 평가를 위하여, 탈파라핀화되고 재수화된 뇌 및 간 절편들이 재조합 인간 I2S에 대한 마우스 모노클론 항체 2C4-2B2 (Maine Biotechnology Services, Portland, ME) (또는 음성 대조군 항체로서 부적절한 마우스 IgG; Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 주사된 I2S를 검출하도록 하룻밤 배양되었다. 2-8℃에서 밤샘 배양에 이어서, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 결합된 이차 염소 항-마우스 IgG conjugated with 가 첨가되었다. 추가적으로 37℃에서 30분의 배양 이후에, 티라아미드-알렉사 형광 488 (Tyramide-Alexa Fluor 488) 표지화 용액 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)이 추가 10분 동안 첨가되었다. 절편들은 1.5 ug/ml 의 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 핵 반대염색으로서 포함하는 항소멸 마운팅 배지 (VectaShield; Vector Laboratories)를 사용하여 커버를 덮었고, 다중 채널의 니콘 형광현미경으로 관찰되었다. 염색 결과들은 핵은 청색 또한 배경 영역은 검은색이면서 I2S 양성 세포들은 녹색으로 보여주었다.

효능 분석을 위해, 뇌 및 간 절편들은 일차 항체로서 래트 항-LAMP-1 (리소좀 마커로서 리소좀 연관 막 단백질) IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)로 염색되었다. 부적절한 항체로서 래트 IgG가 음성 대조군으로서 사용되었다. ABC (Vector Labs로부터 시판되는 아비딘 바이오틴 복합 키트들, Burlingame, California) 방법이 표적된 마커를 중폭하는 데 사용되었다.

간략하게, 탈파라핀화된 절편들이 재수화되고 일차 항체와 배양되었다. 2-8℃에서 하룻밤 배양에 이어서, 이차 바이오틴화 토끼 항-래트 IgG (Vector Labs, Burlingame, California)가 첨가되었고 37℃에서 30분 동안 배양된 다음 시료들은 세척되었으며 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 복합체 (Vector Laboratories)로 처리되었다. 색상 현상을 위해, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB)가 색소원 (chromagen)으로서 사용되었다. 다음으로 절편들은 헤마톡실린으로 반대염색 되었고 커버를 덮었다. 염색 결과들은 LAMP-1 양성 세포들은 갈색으로 핵은 청색으로 보여주었다.

대표적인 사진들을 찍어두었고 LAMP-1 양성 세포들의 영역은 이미지-프로 플러스 소프트웨어 (Image-Pro Plus software (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD)로 분석되었으며 또한 비교 통계학들이 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행되었다.

전자현미경 방법:

3번 용량의 I2S 처리된 동물들로부터 뇌 조직들이 4℃에서0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액 pH 7.4 에 넣은 2.5% PFA/2.5% 글루타르알데하이드로 고정되었다. 다음으로 시료들은 카코딜레이트 완충액 (0.1M, pH7.4)으로 세척되었고 오스뮴 테트옥사이드로 후-고정되어 알코올 및 프로필렌 옥사이드로 재수화되고 에폰 (Epon) 레진에 침지되었다. 초박 절편들이 100nm로 절단되었고 납 시트레이트로 염색되었으며 Tecnai™ G² Spirit BioTWIN 투과 전자현미경으로 조사되었다.

결과들

뇌에서 면역조직화학 (IHC)에 의해 조사된 바와 같이, I2S는 운반체 대조군 동물들에서 전혀 발견되지 않았다. 대조적으로, 뇌척수막 세포들 대뇌 및 소뇌의 뉴런들은 I2S 주사된 동물들에서 I2S에 대해 양성 염색되었다. 염색 신호는 3번 투여된 동물들에서 더 강하였다 (도 31).

운반체-처리된 IKO 마우스의 뇌 조직들에서, 리소좀 축적병의 조직병리학적 표식인 세포성 공포화가 야생형 동물들과 대비하여 뇌들 전체를 통하여 발견되었다. I2S 처리된 IKO 마우스에서는, 미처리된 것들과 대비하여, 표면 대뇌 피질, 미상엽핵, 시상, 소뇌로부터 백색질까지 세포성 공포화의 광범위한 감소가 존재하였다 (도 2). 야생형 동물들과 대비할 때 운반체-처리된 IKO 마우스의 미세교아, 뇌촉수 및 혈관주위 세포들에서 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자로서 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 리소좀-연관 막 단백질-1 (LAMP-1) 염색에 의해 확인되었다. I2S 경막내 처리된 마우스는 LAMP-1 면역염색에서 현저한 감소를 가졌다. 본 감소는 LAMP-1 양성 세포들의 수 및 밝은 염색에서 감소를 특징으로 하였다. 감소는 I2S 처리된 동물들의 2 및 3번 용량들 둘 다에서 표면 대뇌 피질, 미상엽핵, 시상, 소뇌로부터 백색질까지 뇌 전체를 통하여 발견되었다 (도 3). 다양한 뇌 부위들의 LAMP-1 면역염색의 형태측정 분석 (morphometrical analysis)은 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서의 유의한 감소들이 존재하는 점을 검증하였다 (도 4).

운반체-처리된 IKO 마우스에서 뇌 세포들의 전자현미경 조사는 무정형의 과립 축적물질 및 라멜라화된 얼룩무늬체-유사 구조들을 가지는 봉입물들을 포함하는 확대된 소포들을 밝혀주었다. 초구조적 수준에서 리소좀 축적의 이들 전형적인 병리학적 특징들은 I2S 경막내-요추 주사된 마우스에서 감소되었다 (도 57).

간에서, 운반체 처리된 동물들에서 I2S의 양성 염색은 존재하지 않았다. I2S 경막내 주사된 마우스에서, 주사된 I2S의 많은 양이 시누소이드 세포들에서 분명하게 발견되었고 (도 6), 이는 경막내 공간 내에 주사된 I2S가 CSF 와 함께 순환하고 다음으로 거미막 과립화를 통하여 순환계 내로 흡수되는 점을 가리켰다.

운반체-처리된 IKO 마우스의 간 조직들에서, H&E 염색 및 강한 LAMP-1 면역염색에 의해 나타나는 심한 세포성 공포화 및 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 WT 마우스와 대비하여 드러났다. 간들에서 세포성 공포화 및 LAMP-1 면역염색의 현저한 감소는 I2S로의 경막내 치료 이후에 확인되었다. H&E 염색은 거의 정상적 간 세포 구조를 가지고 세포질내 공포화가 거의 완벽하게 사라진 것을 드러냈다 (도 7).

IKO 마우스에서, 재조합 인간 I2S가 경막내-요추 경로에 의해 뇌로 전달되었고 주사된 I2S는 뇌에 있는 다양한 부위들에서 광범위한 조직병리학적 향상을 유도하고 있다.

주사된 I2S는 뇌에 있는 뇌척수막 세포들 및 뉴런들에서 검출되었다.

뇌 전체를 통하여 광학 및 전자현미경 수준들에서 감소된 세포성 공포화.

뇌 전체를 통하여 감소된 LAMP-1 리소좀 마커 경막내 주사된 I2S는 말초 순환으로 들어갔고 간의 형태 및 조직학적 마커를 향상시켰다.

실시예 2: 독성학

본 실시예는 사이노몰 원숭이들에서 매월 볼루스 경막내 요추 투여를 통한 이듀설파제와 연관된 임상적 징후들을 설명하고 있다. 이것을 달성하기 위하여, 14마리의 수컷 사이노몰 원숭이들이 다음의 표 21에서 나타난 바와 같이 5가지 치료 그룹들로 무작위 배정되었다. 표 7은 실험적 설계를 나타낸다.

모든 그룹들에서 동물들은 요추 수준에서 매주 간격들 IT로 세 번 투여되었다. 1 ml 투여량이 0.3 ml의 PBS와 함께 카테터 시스템으로부터 흘려졌다. 각 투여 1 내지 2일 이전에, 대략 2 ml의 CSF가 대수공 수준에서 IT 척수 탭으로부터 채취되었다. 혈액 시료들 (2 ml)도 본 시간에 역시 채취되었다. 첫 번째 투여 이후에 혈액 (2 ml) 및 CSF (0.1 ml) 가 투여전, 투여 이후 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 및 48시간의 그룹 5 동물들로부터 채취되었다. 임상적 징후들이 매일 적어도 두 번 기록되었다. 세 번째 투여 이후 24시간에서 부검이 수행되었고 선택된 조직들이 수확되어 사용되었다.

1일째, 모두 3마리의 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 향한 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었다. 테스트 항목과 관련되는 것으로 고려되는 체중, 먹이 소비 및 신경학적/신체 검사 변수들에서는 변화들이 전혀 없었다

혈청 및 CSF 시료들의 분석 및 투여 용액 분석들이 설명되었다. 내인성 이듀설파제 활성에서 다양성들이 사이노몰 원숭이로부터 나온 서로 다른 조직들에서 관찰되었고; 뇌 및 척수는 간, 심장 및 신장을 포함하는 조사된 기타 말초 기관들보다 더 큰 내인성 활성을 가졌다. 이듀설파제 투여는 다양한 뇌 부위들 뿐만 아니라 뇌줄기 및 척수에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었다. IT 전달은 좌우 대뇌 반구들 사이에 분포에서 관찰가능한 차이를 가져오지 않았다. 다음의 기관들에서 이듀설파제 활성에서 분명한 용량-의존적 증가가 존재하였다: 뇌, 간, 심장, 및 신장. 뇌에서 이듀설파제의 면역염색은 염색 강도에서 용량-의존적 증가를 보여주었다. 3 mg 그룹에서는, 뇌척수막 아래에 뇌척수막 세포들 및 제한된 교아세포들이 관찰되었고; 뉴런 염색은 3 mg 처리 그룹으로부터 나온 동물들에서 분명하지 않았다. 이듀설파제 염색은 이듀설파제의 IT 투여가 일어나는 요추 부위에서 최고의 염색 강도를 가지면서 척수에서 양성 및 용량 의존적이었다. 간, 신장 및 심장에서 이듀설파제 염색 강도는 용량-의존적이고 이들 기관들에서 증가된 이듀설파제 활성과 부합되었다.

결론적으로, 150 mg까지 매주 간격들로 전달된 이듀설파제의 IT 투여는 역효과들을 전혀 가지지 않았다. 따라서, 관찰된 역효과 수준 (NOAEL)이 본 연구에서 테스트된 최고의 용량인 150 mg인 것으로 해석되지 않았다. 이듀설파제 투여는 CNS에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었고, 간, 신장, 및 심장에서 전신적 I2S 수준들 및 활성을 유도하였다.

테스트 항목인 이듀설파제는 154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20, pH 5.3 - 6.1에 녹은 투여액들로서 공급되었다. 공급된 투여액들의 명목상 농도들은 0, 3, 30 는150 mg/ml이었다. 테스트 항목은 -82 내지 -79 ℃로 냉동고에서 보관되었다. . 포스페이트 완충 식염수 (PBS), pH 7.2가 용량들이 투여된 이후 또한 일련의 CSF 채취 이후에 세척제 (flushing agent)로서 사용되었다. PBS는 집코사 (Gibco, Invitrogen Corporation)로부터 입수되었다,

테스트 항목 투여 조제물

각 시간 간격의 첫째 투여일에, 각 농도의 한 개 바이알이 -80℃ 냉동고로부터 분리되었고 상온까지 탁자 (countertop) 위에서 해동되도록 하였다. 일단 해동되면, 그룹들 1, 2, 및 3의 바이알들은 라벨되고 무게를 달고 1 ml은 투여 계획된 각 동물을 위해 0.22 um 필터를 통해 주어졌다. 모든 용량들이 투여된 이후에, 바이알들은 다시 무게를 달아 냉장고에 놓아두었다.

다음날 (동물 003, 그룹 4, 및 그룹 5에게 투여일) 그룹들 1 및 4를 위한 투여액들은 냉장고로부터 분리되어 상온에 도달하도록 탁자 위에 놓아두었다. 일단 상온으로 되면, 그룹들 1 및 4를 위한 바이알들은 무게를 달고, 그룹 4 바이알은 라벨되었으며 1 ml은 그룹들 1 및 4에서 투여 계획된 각 동물을 위해 0.22um 필터를 통해 주어졌다. 다음으로 그룹 5를 위한 투여액이 적절한 양의 그룹 4 투여액 및 그룹 1 (운반체)을 무균의 폴리프로필렌 바이알 내에 주사하여 준비되었다. 그룹 1 및 4로부터 첨가된 양이 기록되었다. 용액은 바이알을 가만히 역전시키면서 혼합되었고 2-1 ml 용량들이 그룹 5의 동물들을 위해 필터를 통해 주어졌다. 그룹 1 및 4를 위한 바이알들은 투여 종결 시 다시 무게를 달았고 모든 바이알들 (그룹 1-5)는 냉동고에 놓아두었다.

다음의 표에 기술된 바와 같이, 14마리 동물들이 치료 그룹들로 무작위 배정되었다.

IT 투여 경로는 이것이 인간 투여를 위해 의도된 경로이기 때문에 선택되었다. 본 연구에 선택된 이듀설파제의 용량들 (3, 30, 100, 및 150 mg/ml)이 세 번의 연속적 매주 볼루스 IT 요추 주사들 이후에 비-인간 영장류 중추신경계 (CNS) 내에 효소의 다양한 용량 수준들의 생체분배를 평가하도록 선택되었다.

임상적 관찰들

임상적 징후들의 전반적인 빈도는 최소이었다. 그룹 1(대조군), 그룹2 (3 mg), 그룹 3 (30 mg), 또는 그룹 5 (100 mg)에서 동물들은 연구 기간 동안 어떤 시간대에서도 테스트 항목과 관련되는 것으로 고려되는 임상적 징후들을 전혀 가지지 않았다.

1일째, 모두 세 마리의 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었고 더 저용량 그룹들이라면 모두에서 관찰되지 않았다. 첫 번째 용량 이후에 또는 테스트 항목 투여에 이어서 바로 해당일에는 기타 다른 임상적 징후들이 없었다. 그룹 4 동물들의 경우 관찰되는 기타 증후는 단지 35일째 동물 013의 경우에 단일 구토이었다.

단일 매월 경막내 볼루스로서 테스트 항목의 투여는 이식된 약물 전달 장치를 사용한 본질적인 변화들을 고려할 때 해로운 총 (gross) 또는 현미경적 변화라면 모두와 연관되지는 않았다. 대조군을 포함한 모든 그룹들이 약물 전달 시스템에 염증성 반응들을 가리키는 뇌척수막에서 현미경적 변화들을 가졌다. 30 mg이상의 테스트 항목의 투여를 받은 동물들은 뇌척수막에서 염증성 반응이 더 현저한 호산구 성분을 가지는 경향이 있었다.

대조군 및 테스트 항목 처리된 동물들 사이에 차이들이 매우 약하기 때문에, 관찰된 역효과 수준 (NOAEL) 이 본 연구에서 테스트된 최고 용량이 150 mg인 것으로 해석되지는 않았다.

모든 그룹들 (대조군들 포함)에서 뇌척수막의 전반적인 염증 반응이 원숭이들에서 본 기간의 경막내 연구에서 일반적으로 알려진 것보다 약간 더 현저하였다. 그러나, 이것은 운반체의 일정 특징 또는 부검 24시간 이전에 투여 행위와 관련될 수 있는 것으로 고려되었다.

뇌 이듀설파제 염색은 150 mg 그룹 (도 16, 17, 18 및 19)에서 확인되는 최고의 염색 강도를 가지면서 3 mg 그룹에서 한 마리 동물을 제외하고 모든 치료된 동물들에서 양성이었다. 3 mg 그룹에서는, 단지 뇌척수막 아래에서 뇌척수막 세포들 및 소수의 교아세포들이 양성이었고; 주사된 이듀설파제는 뉴런들에서 전혀 검출되지 않았다. 더 높은 용량 그룹들 (30, 100 및 150 mg)에서, 큰 집단의 뇌 뉴런들이 뇌척수막 세포들, 교아세포들 및 혈관주위 세포들과 함께 이듀설파제 염색에 강한 양성이었다. 이듀설파제 면역염색은 뇌척수막 근처 표면에 I층 안에 뉴런들로부터, 백색질 에 인접한 더 깊은 VI층 안에 뉴런들까지 뇌 뉴런들에서 주사된 이듀설파제의 넓은 분포를 드러냈다 (도 20, 21 및 22). 또한 현저한 뉴런들의 염색도 150 mg 용량 그룹의 경우 관찰되었다 (도 23). 모든 동물들에서 (30 -150 mg로부터 나온 용량 그룹), 뉴런성 이듀설파제 염색에서의 현저한 차이가 뇌의 전반부, 중간부, 및 후반부 절편들 사이에서 전혀 발견되지 않았다.

이듀설파제 염색은 요추 부위에서 최고의 염색 강도를 가지면서 모든 동물들의 척수들에서 양성이었다 (도 24 및 25). 이듀설파제 면역염색은 역시 용량 의존적이다. 뉴런들, 뇌척수막 세포들, 교아세포들, 혈관주위 세포들 및 신경 섬유들을 감싸는 신경외/주위 내막 (epi/peri/endoneurium) (연결 세포들)은 150 mg 그룹에서 이듀설파제에 강한 양성이었다 (도 26 및 27).

간에서, 이듀설파제의 양성 염색이 모든 동물들의 시누소이드 세포들 (컵퍼 (Kupffer) 세포들 및 내막세포들)에서 발견되었다. 그러나, 이듀설파제가 3 mg 치료 그룹의 경우 간세포들 (hepatocytes)에서 검출되지 않았던 한편 (도 28), 더 높은 용량 그룹들에서는 150 mg 치료 그룹에서 최고의 염색 강도를 가지면서 양성 이듀설파제 염색이 간세포들에서 발견되었다 (도 29, 30 및 31).

3 mg 치료 그룹으로부터 나온 동물들에서는 이듀설파제의 양성 염색이 없었다 (도 22). 대조적으로, 간질 세포들 (interstitial cells)은 30, 100 및 150 mg 그룹들에서 이듀설파제에 양성적으로 염색되었고, 현저한 염색은 150 mg 그룹에서 관찰되었다 - 양성 세포수 및 염색 강도 (도 33, 34 및 35).

신장

3 mg 용량 그룹으로부터 나온 동물들은 주사된 이듀설파제가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다 (도 36). 그러나, 양성 이듀설파제 염색이 30 및 100 mg 그룹들에 있는 사구체 세포들 및 간질 세포들에서는 발견되지 않았다 (도 37 및 38). 150 mg 그룹에서, 추가적으로 이듀설파제 면역염색이 사구체 및 간질 세포들의 현저한 염색과 함께 인접뇨관 세포들의 이듀설파제 염색이 드러났다 (도 39).

논의

체중, 먹이 소비, 신체 검사 결과들 및 신경학적 검사 결과들에 미치는 테스트 항목-관련 임상적 징후들 또는 효과들은 전혀 없었다. 1일째, 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었다.

이듀설파제 투여는 다양한 뇌 부위들, 뿐만 아니라 뇌줄기 및 척수에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었다. 척수에서 염색 강도의 최고 수준은 이듀설파제의 IT 투여가 일어나는 요추 부위에서 있었다. 이듀설파제의 IT 투여는 간, 신장 및 심장에서 용량-의존적 염색 강도를 가지고 전신적 노출도 가져왔다. 30 mg이상으로 테스트 항목 용량을 받은 동물들은 뇌척수막에서 염증성 반응이 더 현저한 호산구 성분을 가지는 경향이 있었지만, 본 차이들은 생물학적으로 유의한 것으로 고려되지 않았다.

매월 간격으로 150 mg까지로 이듀설파제의 IT 투여는 전혀 역효과들을 가지지 않았다. 관찰된 역효과 수준 (NOAEL) 이 본 실시예에서 테스트된 최고 용량이 150 mg인 것으로 해석되지는 않았다. 이듀설파제 투여는 CNS에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었고 간, 신장 및 심장에서 전신적 수준들을 가져왔다.

실시예 3: IT 전달된 I2S의 PK (혈청 및 CSF)

본 실시예는 테스트 항목 (TA) 농도에 대해 사이노몰 원숭이들에서 매월 볼루스 경막내 요추 주사들 및 매주 정맥내 주사들을 통해 투여된 이듀설파제의 6개월 독성 연구와 연관된 혈청 및 뇌척수액 (CSF) 분석을 제공한다.

실험 설계

본 연구의 목적은 6개월 기간 동안 독성학 및 안전성 약제학 전망으로부터 이듀설파제 (12s)의 반복 용량 경막내 (IT) 투여를 평가하는 것이었다. 본 연구 설계는 표 8에 나타나 있다. 하기 표 8는 연구 설계를 나타낸다.

테스트 항목

*확인: 이듀설파제 IV 투여 - (2.0 mg/mL)

IT 투여 - 이듀설파제 (0 mg/mL)

이듀설파제 (3 mg/mL)

이듀설파제 (30 mg/ml)

이듀설파제 (100mg/ml)

검정 방법들:

분석들은 이듀설파제 농도를 결정하기 위한 ELlSA (효소 결합 면역흡착 검정법)를 사용하여 시행되었다. 희석 팩터에 의해 배가하기 이전에 검출의 한계 (LOD) = 1.25 ng/mL. 시료들은 1:50 희석에서 검색되었고, 따라서 검정 민감도는 62.5 ng/mL이다. 산정 곡선의 고점을 초과하는 시료들은 좀 더 희석되었고 곡선의 범위 이내의 수치가 되도록 적절한 희석으로 다시 테스트되었다. 선택된 시료들은 효소 활성 검정법을 사용하여 추가적으로 분석되었다. 본 검정의 LOD는 1:150의 최소 시료 희석에서 0.18 mU/mL이다.

식염수 또는 운반체로 각각 투여된 그룹 1 및 2에서의 동물들은 모두 IV 및 IT 투여 기간을 통하여 138 ng/mL 및 <62.5 ng/mL (또는 <LOD) 사이 범위인 혈청 이듀설파제 수준들을 가졌다. 그룹 1 및 2 동물들로부터 테스트된 200개 CSF 시료들 중에서, 62개가 LOD 검정을 초과하는 I2S 수준들을 나타냈다. 이들 중에서, 7개 수치들이 높았다 (>1,000 ng/mL). 상기 테스트된 IT 투여 이전 3번으로부터 수집된 또 다른 CSF 시료는 1,000 ng/mL 초과의 I2S로 테스트되었다.

다음으로 시료들은 이듀설파제 활성에 대해 테스트되었다. 각 경우에, 활성 결과들은 I2S의 존재를 가리켰고, I2S의 대략적 농도가 활성 수준들을 기초로 하여 계산될 때 결과들은 항체 ELISA에 의해 획득되는 것들의 20% 이내이었다 (표 9 참조). 항원 ELISA 결과들 <LOD를 가지는 추가적으로 무작위 선택된 CSF도 역시 비특이적 활성이라면 모두 배제하도록 효소 활성 검정을 사용하여 테스트되었다. 하기 표 23은 CSF 시료들로부터 나온 연구 결과들을 나타낸다.

본 연구에서, 혈청 및 CSF 시료들은 이듀설파제 농도에 대해 분석되었다. 혈청 시료들은 다음의 스케쥴에 따라 수집되었다:

IV 용량들: 투여이전 및 투여 이후 2시간 1 내지 10, 투여이전 및 투여 이후 4시간 11 내지 23, 또한 부검 시.

IT 용량들: 투여이전 및 투여 이후 2시간 1 내지 2, 투여이전 및 투여 이후 4시간 3 내지 6, 또한 부검 시.

CSF 시료들은 다음의 스케쥴에 따라 수집되었다:

IV 용량들: 투여이전 및 투여 이후 2시간 1, 또한 투여 이후 4시간 3 내지 6.

IT 용량들: 투여이전 및 투여 이후 2시간 1 및 2, 투여이전 및 투여 이후 4시간 3 내지 6, 또한 부검 시.

일반적으로, 혈청 이듀설파제는 CSF 이듀설파제. 혈청 이듀설파제보다 더 신속하게 청소되었다.

각각 식염수 또는 운반체로 투여된 그룹 1 및 2 동물들에서 혈청 이듀설파제 수준들은 테스트된 모든 시간대에서 138 ng/mL 이하이거나 이와 동등하였다. 일정 동물들은 검출의 검정 한계 (LOD) 미만의 수준들을 가졌다.

그룹 1 및 2로부터 나온 극히 적은 CSF 시료들이 높은 (>1,000 ng/mL) 수준들을 유도하는 주목가능한 7개는 예외로 하고 검정 LOD를 초과하였다. IT 투여이전 3 동물로부터 수집한 하나의 CSF 시료도 역시 1,000 ng/mL 이듀설파제 초과로 테스트되었다.

이들 경향을 벗어난 결과들을 주는 시료들은 다시 테스트되어 검증되었다. 또한, 이들 시료들은 이듀설파제 효소 활성에 대해 테스트되었다. 이들 활성 결과들도 역시 이듀설파제 질량 검정법에 의해 획득된 것들의 20% 이내의 높은 이듀설파제 수준들을 입증하였다 (표 9).

활성 검정의 특이도가 본 시료 집단 안에서 LOD 미만의 이듀설파제 질량 유닛으로 CSF 시료들을 무작위 테스트하여 확인되었고 이들 시료들에서 이듀설파제 수준들이 LOD인 것을 검증하였다 (결과 미도시).

실시예 4. 제형화

본 실시예는 제 I/II 상 임상 시험들을 위한 이듀설파제-IT 약물 물질 및 약물 제품의 제형화를 확립하도록 수행되는 약제학적 개발 연구들을 요약하고 있다.

CNS 전달에 적합한 운반체들의 한계로 인해, 이듀설파제의 경막내 전달을 위한 제형물 개발의 노력은 전신적 전달을 위한 I2S 제형물과 동등한 안정도를 여전히 유지하면서도 포스페이트 및 폴리솔베이트 20 수준을 감소시키는 데 초점을 맞추었다.

포스페이트 및 폴리솔베이트 수준의 효과를 조사하도록 세 가지 핵심적인 스트레스를 검색하는 연구들이 시행되었다. 이들은 냉동 해동, 진탕 스트레스, 및 열적 스트레스들을 포함하였다. 결과들은 식염수 제형물이 낮은 단백질 농도 (2 mg/mL)에서 냉동 해동 스트레스에 대항하여 더 안정한 점을 보여주었다. 높은 단백질 농도 (100 mg/mL)에서는, 냉동 해동 스트레스가 식염수 및 포스페이트를 포함하는 제형물들 둘 다의 경우 불안정도 문제를 초래하지 않았다. 진탕 스트레스 연구는 0.005% 폴리솔베이트 20이 진탕 관련 스트레스에 대항하여 단백질을 보호하는 점을 입증하였다. 열적 안정도 연구들은 식염수 제형물이 포스페이트를 포함하는 제형물들과 대비하여 더 안정한 점을 보여주었다. 또한, 식염수 제형물의 pH는 2-8℃에서 24개월 동안 6.0으로 유지될 수 있다. 단백질과 연관된 잔여 포스페이트의 양뿐만 아니라 증가된 단백질 농도는 최종 제형물에서 pH 안정도에 기여하는 것이 확인되었다.

방법들

*

*식염수 및 포스페이트 제형물들에서 이듀설파제의 안정도에 미치는 냉동/해동 스트레스의 효과

서로 다른 제형물들에서 이듀설파제 안정도에 미치는 냉도/해동의 효과를 조사하기 위하여, 바이러스 SEC 풀이 센트리콘 플러스 (Centricon Plus)를 사용하여 20 mM 소듐 포스페이트를 가진 150mM NaCl 또는 137 mM NaCl (둘 다 pH 6.0) 내로 4번 교환/농축되었다. 단백질 농도들은 2 mg/ml 및 100 mg/mL을 목표로 하였다. 모든 용액들은 0.22 마이크론 PVDF 필터를 통하여 여과되었다. 용액들은 1 mL씩 2 mL 보로실리케이트 유리 바이알들 내로 각각 분량되었다. 바이알들은 동결건조기 체임버의 중간 선반 위에 두었고 위약 (placebo) 바이알들에 의해 둘러싸였다. 시료들은 프로그램화된 냉동/해동 순환으로 냉동되었고 (20℃로 1시간 동안 유지 또한 1℃/분씩 -50℃로 냉동), 다음으로 0.03℃/분의 속도로 -50℃부터 -25℃까지 -25℃로 24시간 동안 유지하고, 2-8℃로 해동하도록 허용하는 두 단계들로 해동되었다. 두 번 또는 세 번의 냉동/해동 순환들 이후에, 시료들은 모양 관찰 및 SEC-HPLC 검정법들에 의해 분석되었다.

포스페이트 및 식염수 용액들에서 이듀설파제에 미치는 진탕/절단 스트레스의 효과

진탕 연구들은 서로 다른 농도들로의 이듀설파제 상에서 수행되었다. 단백질 농도들은 20mM 포스페이트에 있는 137mM NaCl (pH 6.0) 및 단독 154mM NaCl (pH 6.0)의 존재 시 2mg/mL, 8 mg/mL, 및90-100 mg/mL로 테스트되었다. 폴리솔베이트 가 필요한지 여부를 관찰하기 위하여, 다양한 PS-20양들이 테스트 조건 내로 첨가되었다. 용액들은 1.2 mL씩 2 mL 유리 바이알들 내로 각각 분량되었고 다음으로 상온 조건들 하에서 24시간 동안 250 rpm로 궤도 진탕기 상에서 진탕되었다. 기저선 및 24시간에 외양이 관찰되었고, 0.1 mL 분량들이 0.5 mL 폴리프로필렌 튜브들에 넣어 시료 채취되었고 ≤-65℃ 미만에서 SEC-HPLC에 의한 분석까지 냉동되었다.

먼저 폴리솔베이트 20 수준의 효과를 입증하기 위하여, 가상의 운송 연구가 물질의 3시간 트럭 운송 (truck shipment)을 사용하여 시행되었고 1시간 비행기 테스트가 무작위 테스트 옵션들을 사용하는 보험 수준 1로 (란스몬트사 (Lansmont, Lansing, MI)에 의해 시행됨) 이어졌다. 시료들은 SEC-HPLC에 의해 입자들의 모양 및 용해성 응집물들에 대해 분석되었다.

안정도에 미치는 교반 스트레스의 효과를 조사하기 위하여, 식염수 제형물 (50 mg/mL, 154mM NaCl, 및 0.005% PS-20) 1.3 mL이3 mL 제 I형 유리 바이알 안에 채워졌고 테프론 코팅된 자기 교반 막대 (길이 8 mm, 직경 2 mm)를 포함시켜서 13 mm 마개로 막았다. 바이알들은 속도 설정 6으로 교반 플레이트 상에 두었다 (설정 6의 선택은 과다한 거품 형성이 없는 최대 속도이었음). 외양은 0, 2, 24, 48, 및 72시간에 결정되었다. 기저선 및 72시간 교반된 시료들은 SEC-HPLC 방법들로 테스트되었다.

선도적 제형물들에 대한 열적 안정도 연구들

여섯 가지의 선도적 제형물들이 열적 안정도에 대해 비교되었다. 이들 제형물들은 두 가지 변수들을 기초로 하여 선택되었다. 첫 번째 변수는 단백질 농도가 CNS 전달을 위한 치료적 범위들 이내인 것이 필요하다는 점이었다. 두 번째 변수는 안정도에 미치는 포스페이트 농도의 효과를 조절하는 것이었다. 바이러스 여과된 SEC 풀이 완충되어 교환되었고 센트리콘 플러스-80을 사용하여 농축되었다. 50 및 100 mg/mL 단백질 농도들의 목표 농도들이 달성되었다. 여섯 가지의 제형물들은 0.01% PS-20의 최종 농도를 위해 폴리솔베이트 20용액이 첨가되었다. 물질은 0.22 마이크론 PVDF 필터를 통하여 여과되었고 0.5 mL이 2 mL 유리 보로실리케이트 바이알들에 첨가되었다. 이들 바이알들은 역전된 위치로 압박된 안정도 (40℃), 가속된 안정도 (25℃), 및 실시간 보관 (2-8℃) 상에 나두었다. 이들 안정도 시료들은 각 시간대에 SEC-HPLC, OD320, SAX-HPLC, SDS-PAGE (쿠마시), pH, 및 활성에 의해 테스트되었다.

식염수 제형물에서 pH 조절의 이해

식염수 제형물에서 pH가 유지되는 방식을 이해하기 위하여, 다음의 연구들이 시행되었다.

식염수 제형물들에서 포스페이트 잔기의 테스트

바이러스 여과된 SEC 풀 (2 mg/mL 이듀설파제, 137 mM NaCl, 20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0)은 농축되었고 밀리포어 TFF 시스템 및 밀리포어 펠리콘 바이오맥스 30 (Pellicon Biomax 30), 50cm² 필터를 사용하여 150 mM NaCl 내로 투석되었다. 시료들은 0.9% 식염수 (TK3에서 제조됨) 내로 투석의 7X, 10X 및 15X 순환들 이후에 단백질과 연관된 포스페이트의 양을 측정하였다. 또한, 10X 투석 이후의 투과물 (여과로부터 통과한 유동물을 포함하는 비-단백질) 및 여과 단계에서 사용된 식염수도 역시 테스트되었다.

pH에 미치는 단백질 농도의 효과의 결정

완충액 (포스페이트)의 존재 없이도 pH의 조절을 더 잘 이해하기 위하여, 단백질 효과 연구들이 시행되었다. pH에 미치는 단백질의 기여도를 결정하기 위하여, 물질은 154mM NaCl (식염수)에서 30 mg/mL, 10 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.01 mg/mL 및 식염수 단독으로 희석되었다. 물질은 튜브 당 1 mL의 충전 부피로 2mL 폴리프로필렌 튜브 내로 분량되었다. 시료들은 ≤ -65℃에서 1시간 동안 냉동되었고 상온에서 30분 동안 해동되었으며, 순환은 세 번 반복되었다. 초기 pH가 측정되었고 3X 냉동/해동 순환들 이후에 비교되었다. pH는 시료들의 24시간 상온 노출 (튜브의 마개를 개봉함) 이후에도 단백질 농도가 pH 이동 상에서 가질 수 있는 효과를 결정하도록 역시 측정되었다.

CNS 전달에 적합한 운반체들의 한계로 인해, 이듀설파제의 경막내 전달을 위한 제형물 개발의 노력은 전신적 투여를 위해 제형화된 I2S와 동등한 안정도를 여전히 유지하면서도 포스페이트 및 폴리솔베이트 20 수준을 감소시키는 데 초점을 맞추었다. 냉동 해동, 진탕 스트레스, 및 열적 스트레스들을 포함하는 세 가지 핵심적인 스트레스를 검색하는 연구들이 시행되었다.

식염수 및 포스페이트 제형물들에서 이듀설파제에 미치는 냉동/해동의 효과

표 10에서 나타난 바와 같이, 2 mg/mL의 낮은 단백질 농도에서는, 20 mM 포스페이트를 포함하는 제형물이 냉동 해동 스트레스 이후에 더 많은 응집물들을 생성하였다. 식염수 제형물은 기저선과 동일한 수준의 응집물들이 남았다. 높은 단백질 농도 (100 mg/mL)에서는, 냉동 해동 스트레스가 제형물들 모두에서 안정도에 미치는 효과를 전혀 가지지 않는 것으로 보였다 (도 11). 결과는 식염수 단독 제형물이 냉동 해동 스트레스에 대하여 더 나은 안정도를 가지는 점을 가리켰다. 하기 표 10은 낮은 단백질 농도에서 용해성 응집을 나타낸다.

하기 표 11은 높은 단백질 농도에서 용해성 응집을 결정하는 SEC 프로파일을 나타낸다.

* NaCl의 양은 제형물이 비교가능한 긴장도를 유지하도록 20 mM 포스페이트를 포함하는 곳에서 137 mM으로 조절되었다.

용액에서 이듀설파제에 미치는 진탕 스트레스의 효과

진탕 연구들은 2, 8, 및 100 mg/mL의 세 가지 단백질 농도 수준들에서 시행되었다. 결과는 폴리솔베이트 20 없이, 침전물들이 모든 단백질 농도에서 발생하고 또한 높은 수준의 용해성 응집물들도 2 mg/mL에서 관찰되었다 (표 13 내지 표 14). 그러나, 0.005%와 같은 매우 낮은 P20 수준의 존재 시, 침전물들 및 용해성 응집물들이 대부분 예방되었다. 결과들은 낮은 수준의 폴리솔베이트가 진탕 스트레스에 대항하여 단백질 보호하도록 요구되는 점을 가리켰다. 하기 표 12 내지 표 14는 연구실 모델에서 진탕 연구 (상온에서 24시간 동안 250 RPM으로 회전)을 나타내고, 하기 표 12는 137mM NaCl 및 20mM 포스페이트, pH 6에서 ~ 2mg/ml, 하기 표 13은 137mM NaCl 및 20mM 포스페이트, pH 6에서 ~ 8mg/ml, 또한 하기 표 14는 식염수 제형물에서 90-100 mg/ml을 나타낸다.

진탕에 대항한 안정도를 위해 0.005%가 충분한지 여부를 좀 더 검증하기 위하여, 실제 운반 조건에 가까운 가상의 운반 연구가 서로 다른 수준의 폴리솔베이트 20을 가진 100 mg/mL 단백질의 식염수 제형물 상에서 시행되었다. 결과들은 0.005%가 충분한 점을 검증하였다 (표 15). 하기 표 15는 가상의 운반 연구 이후에 외양 관찰 및 100 mg/mL의 용해성 응집물들이 미치는 폴리솔베이트 20의 효과를 나타낸다.

0.005% 폴리솔베이트 20와 함께 50 mg/mL 이듀설파제를 포함하는 식염수 제형물의 안정도에 미치는 자기 교반 막대를 사용한 교반의 효과가 표 16에 정리되어 있다. 나타난 바와 같이, 단백질은 자기 교반 박대를 사용한 교반에 의해 초래된 압박에 72시간 동안 취약하지 않다. 결과는 마찬가지로 교반에 대해 0.005%가 충분한 점을 검증하였다. 하기 표 16은 격렬한 교반 시 53 mg/ml 이듀설파제 안정도에 미치는 폴리솔베이트 20의 효과를 나타낸다.

선도적 후보물들에 대한 열적 안정도

여섯 가지의 핵심 제형물들이 안정도 시험을 위해 24시간 동안 조사되었다. 이들 테스트들의 결과들은 본 섹션에서 논의된다.

외양 관찰

모든 제형물들의 외양은 약간 유색광이 남아있었고, 여섯 가지의 제형물들에 대해 테스트된 모든 온도들 및 시간대들 하에서 본질적으로 입자가 없었다.

OD320

혼탁도에서 잠재적 증가를 조사하기 위하여. OD320 수치들이 결정되었고 표 17에 정리되어 있다. 나타난 바와 같이, 냉동 보관 시 모든 제형물들의 OD320 수치들은 24시간 보관 이후에 기저선과 동일하게 유지되었다. 2-8℃ 조건에서, 식염수 제형물들은 24시간 보관 이후에 기저선과 동일하게 유지되었지만 포스페이트를 포함하는 제형물들은 OD320 수치들에서 증가된 수준을 가졌다. 25℃의 가속된 조건에서, 식염수 제형물들도 3-6시간 이후 OD320에서 약간의 증가를 역시 가졌지만, 포스페이트를 포함하는 제형물들은 더욱 유의한 증가를 보여주었다. 이들 결과들은 식염수 제형물이 열적 스트레스에 대해 더 안정한 점을 제시하고 있다. 하기 표 17은 식염수 및 포스페이트 제형물들*에 대한 OD320을 비교하여 나타낸다. * 모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 포함한다.

SEC-HPLC

SEC-HPLC에 의해 테스트된 모든 제형물들의 데이터 요약이 표에 나열되어 있다. 냉동 보관 조건들에서는, 기저선과 대비하여 24이후에 변화가 전혀 없었다.

40℃의 압박 조건에서 두 주 이후에, 모든 제형물들은 용해성 응집물들의 증가된 수준들을 가졌다. 또한, 포스페이트를 포함하는 제형물들도 역시 "12분" 피크를 보여주었다. 그러나 1개월 이후에 포스페이트를 포함하는 제형물들에서 관찰된 "12분" 피크는 사라지는 것 같았다. 또한, 용해성 응집물 수준은 2주 시간대와 대비하여 모든 제형물들의 경우 좀 더 증가하지 않았다 (도 8 및 표 18).

25℃의 가속된 조건에서는, 기저선과 대비하여 모든 제형물들에서, 용해성 응집물들의 증가된 수준이 6개월 이후에 최소이었다. 그러나, 포스페이트를 포함하는 제형물들 모두는 "12분" 피크를 보여주었다 (도 9 및 표 18).

2-8℃의 장기간 보관 조건에서는, 24시간 이후에, 포스페이트를 포함하는 제형물들의 경우 용해성 응집물들의 증가된 수준이 24개월 이후에 최소이었다. 모든 조건들과 일치하게 포스페이트를 포함하는 제형물들도 시간에 따라 약간 증가하는 "12분" 피크를 역시 가졌다 (도 10 및 표 18).

이들 결과들은 식염수 제형물들이 모든 보관 조건에서 포스페이트를 포함하는 제형물들과 대비하여 가장 적은 변화들을 가졌던 점을 가리켰다. 하기 표 18은 식염수 및 포스페이트 제형물*에서 SEC-HPLC에 의한 응집을 비교하여 나타낸다. * 모든 제형물들은 0.01% 폴리솔베이트 20를 포함한다. ^a: 수치들은 현재 SEC HPLC 방법에서 "12분 피크"라고도 말하는 ~12분을 용출하는 고분자량 종을 나타낸다. 본 피크는 제형물들에서 포스페이트의 존재와 강하게 연관된 것으로 사료된다.

SAX-HPLC

SAX-HPLC의 데이터 요약은 표 19에 나열되어 있다. 압박/가속 조건들에서, 식염수 제형물들은 약간 더 많은 변화를 가지는 것으로 보였지만 (도 11 및 도 12) 장기간 보관 조건들에서는 모든 제형물들의 경우 24시간 이후에도 변화가 전혀 없었다 (표 19 및 도 13). 이것은 식염수 제형물들이 2-8℃에서 24시간 동안 안정한 점을 가르킨다. 하기 표 19는 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 경우 24시간 동안 SAX-HPLC 방법에 의한 전하에서의 변화들을 비교하여 나타낸다.

pH

표 20은 모든 제형물들의 pH가 2-8℃에서 24시간 동안 기저선과 비교가능하게 남아있었던 점을 기술하고 있다. 식염수 제형물들의 경우 완충액이 없더라도 pH는 6.0에서 24 개월 동안 일정하게 유지되었다. 하기 표 20은 식염수 및 포스페이트 제형물들 (모두 0.01% 폴리솔베이트 20을 가짐)의 경우 2-8℃에서 24시간 동안 pH를 비교하여 나타낸다.

효소 활성

기준되는 표준과 대비하여, 2-8℃에서 24시간 이후 모든 제형물들의 특이 활성은 검정의 편차 이내에서 동등하였고, 이는 이듀설파제가 식염수 제형물에서 24시간 동안 안정하게 유지되는 점을 제시하고 있다 (표 21). 하기 표 21은 식염수 및 포스페이트 제형물들에서 24시간 이후 실시간 안정도 (2-8℃)의 이온 교환 크로마토그래피에 의한 활성 결과를 나타낸다. *기준 표준의 특이 활성은 24개월 시료들을 테스트하는 동안 56 U/mg이었다.

단백질과 연관된 잔여 포스페이트의 검출

식염수 제형물을 준비하는 최종 UF/DF 단계가 단백질 용액을 137 mM NaCl, 20 mM 소듐 포스페이트로부터 150 mM NaCl까지로 투석하는 데 사용되었다. 투석 순환의 수가 최종 산물의 잔여 포스페이트 농도에 영향을 주는 방식을 조사하기 위하여, 연구실 규모의 연구가 약물 물질 (2 mg/mL 이듀설파제, 137 mM NaCl, 20 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0)을 사용하여 시행되었다. 약물 물질은 먼저 50 mg/mL 이듀설파제로 농축되었고 다음으로 150 mM 식염수 내로 투석되었다. 시료들은 7x, 10x, 및 15x 투석 단계로 착수되었고 포스페이트 함량에 대해 ICP로 테스트되었다. 테스트 결과들은 표 22에 요약되어 있다. 나타난 바와 같이, 식염수 투석 용액은 포스페이트를 전혀 포함하지 않는다. 7 x DF 이후에, 단백질은 0.22 mM 포스페이트를 포함하였고, 이는 이론적으로 계산된 수치보다 더 높았다. 10x DF 이후에, 단백질 보유물은 약 0.16 mM 포스페이트를 포함하였던 한편 투과된 유동물은 단지 약 0.07 mM 포스페이트이었으며, 이는 포스페이트가 단백질에 결합한 점을 가리켰다. 15x DF 이후에, 포스페이트 수준은 약 0.07 mM로 떨어졌다.

연구로부터 나온 결과들은 약 0.2 mM 포스페이트 잔기가 약물 물질에 남았고, 이는 식염수 제형물의 경우 pH 6.0을 유지하는 데 기여한 것 같다. 하기 표 22는 다수의 투석 단계들 이후 단백질과 함께 남은 소듐 포스페이트를 나타낸다. * 시작 식염수 완충액이 테스트되었고 검출가능한 포스페이트는 전혀 검출되지 않았다.

포스페이트 함량 분석으로부터, 외관상으로 포스페이트는 단백질에 결합한다. 따라서, 높은 단백질은 더 많은 포스페이트에 결합할 수 있고, pH를 더 잘 유지할 수 있을 것으로 예상된다. 이론을 조사하기 위하여 식염수 용액에 넣은 단백질이 서로 다른 수준들로 농축되었고 용액들의 pH가 서로 다른 처리 조건들 이후에 테스트되었다. 결과들은 표 23에 요약되어 있다.

나타난 바와 같이, 용액들의 초기 pH는 단백질 농도에 비의존적으로 약 6.0으로 유지되었다. 그러나, 24시간 동안 상온 노출 또는 세 번의 냉동 해동 순환들 이후에, 0.1 mg/mL 이하의 단백질을 포함하는 용액들의 pH는 6.0 주변의 일정한 pH를 유지하지 못하였다. 이것은 단백질 농도가 식염수 용액들의 pH를 유지하는 데 조절인자인 점을 입증하였다. 하기 표 23은 비완충된 식염수 제형물들의 pH에 미치는 단백질 농도의 효과를 나타낸 것이다. * 시료들은 ≤-65℃에서 적어도 1시간 동안 보관되었고 상온에서 0.5시간 동안 해동되었으며, 본 순환은 세 번 반복되었다.

본 연구로부터 얻은 결과들은 식염수 제형물에 있는 이듀설파제 (50 mg/mL 이듀설파제, 0.005% 폴리솔베이트, 150 mM NaCl, pH 6.0)가 2-8℃에 보관될 때 적어도 24시간 동안 안정한 점을 보여주었다. 본 제형물은 포스페이트를 포함하는 제형물과 대비하여 더욱 안정한 것으로 관찰되었다. 0.005% 폴리솔베이트 20의 선택은 진탕 압박에 대항하여 단백질을 보호하는 데 충분하였다. 또한, 연구는 식염수의 pH가 부분적으로 최종 제형물에서 잔여 포스페이트 및 높은 단백질 농도로 인해, 2-8℃에서 24개월 동안 6.0으로 안정하게 유지될 수 있는 점도 역시 가리켰다.

실시예 5: 생체분배

경막내 투여가 CNS 조직들에 I2S를 전달하는 효능을 가진 방식이라는 점을 성공적으로 보여주면서, 추가적인 연구들이 IT-투여된 I2S가 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있는지 여부 및 IT-투여된 I2S의 세포내 정착이 존재하는지 여부를 결정하도록 시행되었다. 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 제형물이 제조되고 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트20 의 운반체로 pH 6.0에서 제형화되었다.

비-인간 영장류들에게 매월을 기초로 3mg, 30mg, 또는 100mg의 I2S가 이식된 경막내 포트를 통해 연속 6개월 동안 투여되었다. 연구의 설계는 하기 표 24에 정리되어 있다.

비-인간 영장류에게 6개월 동안 I2S의 매월 반복 투여는 테스트된 최고 용량에서 잘 내성화되었고 유의한 독성의 역작용들이 연관되지 않았다. I2S의 6번 및 최종 용량의 투여에 이어서 24시간에, 비-인간 영장류들 개체가 희생되었고 이러한 비-인간 영장류의 CNS 조직들이 조사되었다.

면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 바와 같이, CNS의 세포들 및 조직들 전체를 통하여 I2S의 광범위한 세포 침전이 존재하였다. I2S 단백질은 IHC에 의해 대뇌 피질로부터 뇌실 백색질까지 침전 구배를 가지면서, 뇌의 모든 조직들에서 검출되었다. 회색질에서는, I2S 가 모든 그룹들의 대뇌, 소뇌, 뇌줄기, 및 척수의 뉴런들에서 용량-의존적 방식으로 검출되었다. 더 높은 용량 그룹들의 표면 회색질에서는, 많은 뇌 뉴런들이 표면 피질에서 I2S 염색에 양성이었다 (도 40A). I2S는 역시 시상 (도 40B), 해마 (도 40C), 미상엽핵 (도 40D) 및 척수 (도 40E) 에 있는 뉴런들에서도 검출되었다. 뇌척수막 및 혈관주위 세포들도 또한 I2S 염색에 양성이었다 (도 40F).

도 41 및 도 42에서 나타난 바와 같이, IT-투여된 I2S의 CNS 의 조직들 내로 배분, 상세하게는 비-인간 영장류들 개체의 회색질, 시상 및 뇌 피질에서 침전은 분명하다. 또한, 도 42 및 도 43는 IT-투여된 I2S가 비-인간 영장류들 개체의 나타난 CNS 조직들에서 용량 의존적 방식으로 축적되는 점을 도시하고 있다. 공동-정착 염색 (co-localization staining)도 역시 I2S의 IT 투여가 뉴런들 및 희소돌기아교세포들과 연관되는 점을 드러냈다. IT-투여된 I2S도 역시 도 44에서 입증된 바와 같이 비-인간 영장류들 개체 전체를 통하여 분포하고 정착하는 점을 드러냈다. 상세하게, 도 45는 필라멘트 염색에 의해 보여지는 바와 같이 비-인간 영장류들에게 IT-투여에 이어서 뉴런 흡수 및 I2S의 축삭 결합을 도시하고 있다. 또한 특히 흥미롭게도, 본 연구들은 I2S가 뉴런성 세포들에 선택적이고 이러한 뉴런성 세포들은 뇌의 깊은 조직들 내로 경막내-투여된 I2S의 배분을 용이하게 하고, I2S의 축삭 전달을 가르키며 축삭 구조들과 연관되는 것으로 보이는 점을 도시하고 있다.

하기 표 25는 개별적 동물 연구를 위한 다양한 투여 경로들 및 용량들의 약물역학적 데이타를 표현하고 있다.

¹²⁴I-표지된 I2S는 하기 표 26에 나타난 바와 같이 테스트 동물들에게 투여되었고 PET 스캔 결과들이 도 63에 나타나 있다.

또한 본 연구들은 IT 투여에 이어서 비-인간 영장류들 개체의 뇌실 근처 백색질 뇌 조직에서 IT-투여된 I2S의 세포존재 확인 (identification)을 보여주었다. 백색질에서 I2S 염색 강도가 일반적으로 회색질보다 더 낮은 한편, I2S는 희소돌기아교세포들 내에서 검출되었다 (도 46). 상세하게, 도 46은 백색질 뇌 조직들에서 I2S의 세포존재 확인을 도시하고 있고, 좀 더 나아가 I2S가 미엘린과 연관되는 것으로 보이지 않는 점을 나타내었다.

뇌의 조직들 내로 깊은 IT-투여된 I2S의 배분을 보여주는 것에 추가하여, 본 연구들은 표적 소기관들 내로 I2S의 정착, 중요하게는 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들에서 침범된 소기관들인 리소좀들 내로의 I2S의 정착을 입증하였다. 상세하게, I2S는 리소좀들 내에 위치하였고 또한 축삭들 내에서도 검출되었다. 도 46은 비-인간 영장류 인간의 희소돌기아교세포의 리소좀들 내로 IT-투여된 I2S의 정착을 도시하고 있고, 이에 의해 IT-투여된 I2S가 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있고 세포성 정착을 할 수 있는 점을 입증하였다.

전달된 I2S가 생물학적 활성을 보유하는지 여부를 분간하기 위하여, 뇌에서 I2S의 수준들이 특이적 활성 검정을 사용하여 측정되었다. 마지막 투여 24시간 이후의 3 mg IT 그룹의 뇌에서 활성은 장치 대조군 및 운반체 대조군 동물들에서의 기저 수준들과 명백하게 서로 다르지는 않았다. 30 mg 및 100 mg IT투여된 동물들의 뇌에서의 효소 활성은 부검 시 기저선 초과이었다 (투여 이후 24시간).

뇌로의 IT 전달에 이어서I2S의 생체분배를 분간하는 좀 더 나아간 동물 테스트들은 하기 도60에 나타나 있고 시료 번호들은 하기 표 27에 해당한다. 하기 표 23은 시료들의 위치를 나타낸다.

실시예 6. IT 대비 ICV 전달

상기 실시예에서 관찰된 I2S 배분 양상들이 단일 IC 또는 ICV 투여가 주어진 건강한 비글종 개들에서 역시 재현되었다. 수컷 비글종 개들은 컴퓨터-생성된 숫자들을 사용하여 두 가지 그룹들로 무작위화되었다 (그룹 1 (ICV), N=3; 그룹 2 (IT); N=4). 모두는 요추에 있는 거미막 하부 공간 또는 죄측 뇌실 (투여용) 및 대수공에 이식된 카테터들을 가졌다. 모든 카테터들은 피하의 티타늄 접근 포트에 종결되었다. 추가적인 개들이 미투여된 수술 대조군으로서 사용되었다.

I2S (20 mM 소듐 페스페이트, pH 6.0; 137 mM 염화나트륨; 0.02% 폴리솔베이트-20에서 30 mg/ml)의 단일 일시 주사가 IT 또는 ICV 투여되었고, 포스페이트 완충 식염수 (PBS; pH 7.2)의 3 ml 세척이 이어졌다. 임상적인 징후들이 감시되었고 투여에 이어서 24시간에 희생되었다. 뇌 및 척수 조직 시료들이 ELISA, I2S 효소 활성 및 IHC에 의해 결정된 바와 같이 정량적 I2S 분석들을 위해 수집되었고 연구 그룹 간 비교되었다.

I2S는 IHC에 의해 결정된 바와 같이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다의 회색질 전체를 통하여 널리 분포되었다. 대뇌 피질에서, 도 47 (A 및 B)에 의해 도시된 바와 같이 뉴런들은 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 표면 분자층으로부터 깊은 내부 층까지 모두 6개의 뉴런 층들에서 I2S에 양성이었다. IT 및 ICV 그룹들의 대뇌 피질에서, I2S가 도 47 (C 및 D)에 의해 도시된 바와 같이 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들에서 검출되었다. IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 해마에 있는 큰 집단의 뉴런들은 도 47 (E 및 F)에 의해 도시된 바와 같이, I2S에 양성이었다. 도 47 (G 및 F)에 의해 도시된 바와 같이, 둘 다의 그룹들에서 I2S 양성 뉴런들은 역시 시상 및 미상엽 핵에서도 발견되었다.

따라서, 본 연구들은 뇌의 깊은 세포들 및 조직들 내로 배분되는 IT-투여된 효소들의 능력을 입증하고 있고 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들의 치료를 위한 I2S와 같은 IT-투여된 효소들의 유용성을 지지한다.

실시예 7. 이듀로네이트-2-설파타제 결핍 마우스 모델

IT-투여된 I2S 는 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있고 I2S의 세포성 정착을 설명하였고, 심화 연구들이 IT-투여된 I2S 의 치료적 효능을 결정하도록 시행되었다. 헌터 증후군의 유전적으로-조작된 이듀로네이트-2-설파타제 녹-아웃 (IKO) 마우스 모델이 질환 진행을 변경하는 IT-투여된 I2S 의 능력을 연구하도록 개발되었다. I2S 녹-아웃 마우스 모델이 조직들 및 기관들에서 글리코사미노글리칸 (GAG)의 축적을 유도하는 I2S 좌위의 표적된 파괴를 사용하여 개발되었다. IKO 마우스 모델은 특유의 거친 특징들 및 골격 결함들을 포함하는, 인간들에서 관찰되는 헌터 증후군의 많은 신체적 특징들을 나타낸다. 또한 IKO 마우스 모델은 소변 및 신체 전체를 통한 조직들에서 올라간 글리코사미노글리칸 (GAG) 수준들, 뿐만 아니라 조직병리학적으로 관찰되는 광범위한 세포성 공포화를 보여주고 있다.

본 연구에서, 시판되는 I2S (Elaprase®)가 농축되어 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 재현탁되었다. 8-12주령의 수컷 IKO 마우스의 6개 그룹들이 I2S (10ul; 26 mg/ml)로 처리되었다. 그룹들 A 및 B (N=3)는 각각 I2S의 260ug 용량 세 번 (1, 8, 및 15일) 또한 260ug 용량 두 번 (1 및 8일)이 경막내 투여되었다. 그룹 D도 역시 세 번의 경막내 투여된 260ug 용량들로 1, 8, 및 15일에 처리되었다. 그룹 C 및 E (N=3)는 미처리된 대조군 그룹들이었고, 그룹 F (N=3)는 미처리된 야생형 대조군이었다. 대조군 마우스는 I2S 없는 운반체로 투여되었다. 마우스는 최종 주사에 이어서 1시간 이후에 희생되었고, 면역조직화학 (IHC) 및 조직병리학적 분석을 위한 조직 준비가 이어졌다.

세 번째 주사에 이어서, 운반체-처리된 마우스와 대비하여 I2S-처리된 마우스에서는 표면 대뇌 피질, 미상엽 핵, 시강 및 소뇌에서 세포성 공포화의 광범위한 감소가 존재하였다. 세포성 공포화의 감소는 역시 IT 치료 이후에 백색질에서도 발견되었다. IKO 마우스의 뇌 조직들로 I2S의 배분은 IT-투여에 이어서 분명하였다.

IKO 마우스에서 I2S의 매주 세 번IT 투여는 또한 광학 및 전자현미경적 수준들에서 CNS 세포성 공포화에서 현저한 감소를 보여주었다. I2S의 IT 투여에 이어서, 세포성 공포화의 감소가 미처리된 IKO 마우스와 대비하여 분명하였고 IT-투여된 I2S 가 질환 진행을 변경할 수 있는 점을 제시하였다. 도 48에 도시된 바와 같이, I2S의 IT 투여에 이어서 세포성 공포화의 감소가 IKO 마우스의 뇌들보 (corpous callosum) 및 뇌활 (fornix)에서 분명하였다. 도 49는 치료된 IKO 마우스의 표면 대뇌 피질 조직들에서 리소좀 질환 병리학적 바이오마커인 리소좀 연관 막 단백질 (LAMP1)의 존재에서의 현저한 감소를 도시한다.

추가적으로, 전자현미경법은 회색질에 있는 뉴런들에서 축적 봉입들의 존재 감소 및 백색질에 있는 희소돌기교아세포들에서 공포화를 보여주었다. 상세하게, IT 투여된 I2S IKO 마우스는 소정의 리소좀 축적병들에 특징적인 라멜라체 (palisaded lamellar bodies) ("얼룩무늬체들") ("zebra bodies")에서 감소를 보여주었다. 상세하게, 도 5는 미처리된 IKO 마우스와 대비하여 I2S 투여된 IKO 마우스의 뉴런들에서 특징적인 얼룩무늬체들의 감소를 도시하는 전자현미경 스캔을 나타낸다. 유사하게, 도 5는 뇌들보에서 희소돌기교아세포들의 전자현미경 스캔을 도시하고 있다.

또한, IKO 마우스로 I2S의 IT 투여는 표면 대뇌 피질, 미상엽 핵, 시상, 소뇌 및 백색질에서 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자로서 리소좀 질환 병리학적 바이오마커 리소좀-연관 막 단백질-1 (LAMP-1) 면역염색에서 현저한 감소를 보여주었다. 도 49A에 도시된 바와 같이, LAMP1 면역염색에서 현저한 감소는 도 49B에도시된 미처리된 IKO 대조군 마우스 표면 대뇌 피질 조직과 대비하여 처리된 IKO 마우스 표면 대뇌 피질 조직에서 분명하고, 질환 병리학의 향상을 반영하고 있다.

도 20은 뇌 조직의 um² 영역들에서 측정된 LAMP1의 농도를 도시하여 비교하고 있다. 다양한 뇌 부위들의 LAMP-1 면역염색의 형태측정 분석은 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서 유의한 감소가 존재하는 것을 입증하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 평가된 뇌 조직의 각 영역 (피질, 미상엽 핵 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM))에서 LAMP-양성 영역이 미처리된 IKO 대조군 마우스와 대비하여 처리된 IKO 마우스에서 감소되었다. 상세하게, 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들은 계속된 치료 기간으로 좀 더 감소되었던 점은 명백하다.

비정상적으로 높은 리소좀 활성의 감소는 뇌의 모든 영역들에서 극적인 형태학적 향상들과 상호관련되었다. 이들 결과들은 IT-투여된 I2S가 유전적으로-조작된 IKO 마우스 모델에서 리소좀 축적병들의 진행을 변경시킬 수 있는 점을 입증하고 있고, 좀 더 나아가 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들을 치료하는 I2S와 같은 IT-투여된 효소의 능력을 입증한다.

실시예 8. 헌터병 환자들의 치료

예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 헌터병 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 만기 소아 헌터병을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 I2S의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 (multicenter dose escalation) 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 845-48에 나타나 있다.

20명까지의 환자들이 참가할 것이다:

집단1: 5명 환자들 (최저 용량)

집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)

집단3: 5 명 환자들 (최고 용량)

5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.

환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다: (1) 연령 30개월 이전에 첫 번째 증상들의 출현; (2) 검색 시 보행가능 (혼자 서고 한 손을 잡고 10걸음 앞으로 걷는 능력으로서 정의됨); (3) 검색 시 신경학적 징후들의 존재. 전형적으로, 조혈줄기세포 이식 이력의 환자는 배제된다.

만기 소아 헌터병을 가진 어린이에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 I2S의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 I2S의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.

I2S의 치료적 유효량이 질환의 효과들의 성질 및 정도에 또한 기존의 기초에 의존하여 규칙적인 간격으로 경막내 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "간격 (interval)"으로 투여는 치료적 유효량을 정기적으로 투여하는 것을 (한 번 투여와는 구별됨) 가르킨다. 간격은 표준 임상적 기법들에 의해 결정될 수 있다. 일정 구현예들에서, I2S는 대략 격주로 경막내 투여된다. 단일 개인을 위한 투여 간격은 고정된 간격일 필요가 없지만, 개인의 필요들에 의존하여 시간에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 신체적인 병 또는 스트레스의 시기에, 항-I2S 항체들이 생기거나 증가하는 경우, 또는 질환 증상들이 악화되는 경우라면, 용량들 간 간격이 감소될 수 있다.

실시예 9. 헌터병 환자들의 치료

예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 헌터병 (Hunter's disease) 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 만기 소아 헌터병을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 I2S의 전부 6개월 동안 매월 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 45-48에 나타나있다.

16명까지의 환자들이 참가할 것이다:

집단1: 4명 환자들 (최저 용량 - 10 mg)

집단 2: 4 명 환자들 (중간 용량 - 30 mg)

집단3: 4 명 환자들 (최고 용량 - 100 mg)

4명 환자들이 무작위로 미치료 또는 장치 사용이 될 것이다.

헌터병 환자들은 무엇보다도 초기 발달 지표들 (예로, 걷기, 말하기, 배변 훈련)의 지연, 지능적 결함, 과다 활동성, 공격성, 난청, 간질 및 수두증을 포함하는 인지 및 신경발달 손상을 빈번하게 발생시킨다. 모든 지표들은 임상시험들을 위한 판단기준의 일부가 될 수 있다. 환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다: (1) 3 - 18세의 연령; (2) 77이하의 지능 지수 또는 과거 3년 동안 15 내지 30의 IQ 강하; (3) CSF 무차단 또는 거의 조절되지 않는 발작 장애; 또한 (4) 무감각 및/또는 수술적 위험들을 나타내는 동반이환 없음.

만기 소아 헌터병을 가진 아동들에서 6개월 동안 IT 주사에 의해 투여된 I2S의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일 및 반복-용량 약물역학에 미치는 I2S의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.

본 연구의 목적은 I2S의 상승하는 용량들의 안정도 및 내성도뿐만 아니라 IDDD의 안전성, 내성도 및 장기간 개방성을 평가하는 것이 될 것이다. 추가적으로, CSF 및 말초 혈액 둘 다에서 단일 및 반복 IT 용량들 이후에 I2S의 농도뿐만 아니라 CF 바이오마커들 및 뇨 GAG에 미치는 I2S의 효과들이 평가될 것이다. 심화 평가는 생리학적 및 신경인지 평가들, 신경 기능 및 뇌 구조 부피들과 같은 임상적 변수들에 미치는 I2S의 효과들을 포함할 것이다. 추가적으로, 매일의 생활에 미치는 치료의 효과들 및 바이오마커들 및 증상들 간의 관련성들이 평가될 수 있다.

I2S의 IT 전달에 의한 헌터병 환자들의 치료는 다양한 조직들 (예로, 신경계, 심장, 간, 신장들, 방광, 및 기타 다른 기관들)에서 설파타이드 축적의 감소를 가져온다.

본 명세서에서 기술된 소정의 화합물들, 조성물들 및 방법들이 소정의 구현예들에 따른 특이성을 가지고 기술되어 왔으며, 다음의 실시예들은 본 발명의 화합물을 단지 기술하기 위해서만 제공되고 이들을 제한하려고 의도하지 않는다.

여기에서 사용되는 바, 용어 표현들 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 본 명세서에서, 및 청구항들에서 복수의 형태들을 포함하도록 분명하게 반대로 가르키지 않는 경우라면 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 간 "또는"을 포함하는 청구항들 또는 기술내용들은, 하나, 하나 이상, 또는 모두가 존재하거나 적용되는 경우, 또는 달리 정반대로 표시되지 않는다면 주어진 산물 또는 방법에 적절한 경우, 또는 달리 문맥으로부터 명백한 경우라면 만족되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확히 그룹의 한 구성원이 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들을 포함한다. 또한 본 발명은 그룹의 하나 이상 또는 구성원 전부가 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들도 포함한다. 또한, 본 발명은 달리 표시되지 않는 경우 또는 반박이나 불일치가 나올 수 있는 기술분야의 당업자에게 자명한 경우라면 나열된 청구항들로부터 나온 하나 이상의 제한들, 요소들, 조항들, 기술적 용어들 등이 동일한 기초 청구항 (또는 적절한 다른 청구항)에 의존하는 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형들, 조합들, 및 순열들을 포괄하는 것으로 이해된다. 요소들이 리스트로서 표현되는 곳에서는 (예로, 마쿠쉬 (Markush) 그룹 또는 유사한 형식), 요소들의 각 소그룹도 역시 기재되고 또한 요소(들)이라면 모두가 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 관점은 특정한 요소들, 특징들 등을 포함하는 것으로서 언급되는 곳에서는, 본 발명의 소정의 구현예들 또는 본 발명의 관점들은 이러한 요소들, 특징들 등으로 구성되거나 이들로 필수적으로 구성되는 것으로 이해되어야 한다. 간략하게 기술하기 위해, 이들 구현예들은 모든 경우에 본 명세서에서 매우 많은 단어들로 상세하게 설명되지 않았다. 또한 본 발명의 구현예 또는 관점이라면 모두는 상세한 배제가 본 명세서에 재인용되는지 여부와는 상관없이, 청구항들로부터 명확하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본 명세서에서 참조된 출판물들, 웹사이트들, 및 기타 다른 참고물들은 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다.

SEQUENCE LISTING <110> Shire Human Genetic Therapies, Inc. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF IDURONATE-2-SULFATASE <130> 2006685-0024 <140> PCT/US2011/041925 <141> 2011-06-25 <150> 61/358,857 <151> 2010-06-25 <150> 61/360,786 <151> 2010-07-01 <150> 61/387,862 <151> 2010-09-29 <150> 61/435,710 <151> 2011-01-24 <150> 61/442,115 <151> 2011-02-11 <150> 61/476,210 <151> 2011-04-15 <150> 61/495,268 <151> 2011-06-09 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 525 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu 1 5 10 15 Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu 35 40 45 Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val 50 55 60 Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln 85 90 95 Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe 100 105 110 His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp 115 120 125 Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys 130 135 140 Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro 145 150 155 160 Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser 165 170 175 Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser 180 185 190 Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg 195 200 205 Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu 210 215 220 Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn 225 230 235 240 Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile 245 250 255 Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg 260 265 270 Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg 275 280 285 Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile 290 295 300 Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp 305 310 315 320 Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe 325 330 335 Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu 340 345 350 Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro 355 360 365 Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr 370 375 380 Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro 385 390 395 400 Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His 405 410 415 Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro 420 425 430 Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro 435 440 445 Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly 450 455 460 Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe 465 470 475 480 Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu 485 490 495 Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn 500 505 510 Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro 515 520 525 <210> 2 <211> 550 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser 20 25 30 Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg 35 40 45 Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile 50 55 60 Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln 65 70 75 80 Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg 85 90 95 Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His 100 105 110 Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr 115 120 125 Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn 130 135 140 His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro 145 150 155 160 Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly 165 170 175 Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro 180 185 190 Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu 195 200 205 Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly 210 215 220 Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro 245 250 255 Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln 260 265 270 Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile 275 280 285 Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp 305 310 315 320 Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly 325 330 335 Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp 340 345 350 Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550

Claims

5-150 mg/ml 범위 농도로 존재하는 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 및 0-10 mM 농도의 인산염을 포함하고, 5.5-7.0의 pH를 가지는, 헌터 증후군 치료에 유용한 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, I2S 단백질은 10 mg/ml, 30 mg/ml, 50 mg/ml, 또는 100 mg/ml에서 선택된 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, I2S 단백질은 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 제형물은 염을 추가로 포함하는, 안정한 제형물.
청구항 4에 있어서, 염은 0 초과 300 mM 이하 범위의 농도로 존재하는 NaCl인, 안정한 제형물.
청구항 5에 있어서, NaCl은 137-154 mM 범위의 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 5에 있어서, NaCl은 154 mM의 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 상기 제형물은 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60, 폴리솔베이트 80 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리솔베이트 표면활성제를 추가로 포함하는, 안정한 제형물.
청구항 8에 있어서, 폴리솔베이트 표면활성제는 폴리솔베이트 20인, 안정한 제형물.
청구항 9에 있어서, 폴리솔베이트 20은 0 초과 0.02% 이하 범위의 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 10에 있어서, 폴리솔베이트 20은 0.005%의 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 인산염은 5 mM 이하의 농도로 존재하는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 제형물은 6.0의 pH를 가지는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 제형물은 액상 제형물인, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 상기 제형물은 동결건조된 건조 파우더로서 제형화되는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 상기 제형물은 경막내 투여용으로 제형화되는, 안정한 제형물.
청구항 1에 있어서, 상기 제형물은 뇌실내 투여용으로 제형화되는, 안정한 제형물.
5 내지 150 mg/mL 범위 농도의 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질, 154 mM 농도의 NaCl, 및 0.005% 농도의 폴리솔베이트 20를 포함하며, 그리고 pH 6.0인, 헌트 증후군을 치료하기 위한 안정한 제형물.
청구항 16에 있어서, I2S 단백질은 10 mg/ml 농도인, 안정한 제형물.
청구항 16에 있어서, I2S 단백질은 30 mg/mL, 50 mg/mL, 또는 100 mg/mL의 농도인, 안정한 제형물.
청구항 16에 있어서, 상기 제형물은 경막내 투여용으로 제형화되는, 안정한 제형물.
청구항 16에 있어서, 상기 제형물은 뇌실내 투여용으로 제형화되는, 안정한 제형물.
청구항 1-22 중 어느 한 항의 안정한 제형물의 단일 투여 형태를 포함하는 용기.
청구항 23에 있어서, 용기는 앰풀, 바이알, 카트리지, 저장조, 동결건조-용기 (lyo-ject), 또는 미리-충전된 주사기로부터 선택되는, 용기.
청구항 24에 있어서, 용기는 미리-충전된 주사기인, 용기.
청구항 25에 있어서, 미리-충전된 주사기는 구운 실리콘 코팅을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 분사된 실리콘을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 또는 실리콘이 없는 플라스틱 레진 주사기들로부터 선택되는, 용기.
청구항 23에 있어서, 안정한 제형물은 5.0 mL 미만의 부피로 존재하는, 용기.
청구항 23에 있어서, 안정한 제형물은 3.0 mL 미만의 부피로 존재하는, 용기.