TW201212936A

TW201212936A - Methods and compositions for intrathecal delivery of Alpha N-acetyglucosaminidase

Info

Publication number: TW201212936A
Application number: TW100122529A
Authority: TW
Inventors: Michael F Concino; Pericles Calias; Jing Pan; Kevin Holmes; Paolo Martini; Alla Romashko; Muthuraman Meiyappan; Bohong Zhang; Andrea Iskenderian; Dianna Lundberg; Angela Norton; Bettina Strack-Logue; Yan Huang; Mary Alessandrini; Richard Pfeifer
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2012-04-01
Also published as: CN106139133A; CN105233277A; SI3626258T1; JP6285409B2; JP2023062114A; JP2024097029A; JP2016041755A; JP2016094451A; US20160158324A1; PT2588130T; JP2018002735A; SI3103469T1; PT3626257T; JP2021167340A; CL2017002488A1; TW201701899A; PL2588130T3; US20180085438A1; RU2017125281A; AR081679A1

Description

201212936 六、發明說明：本申請案主張美國臨時專利申請案第61/3 5 8,85 7號（2010 年6月25曰申請）、第61/3 60，786號（2010年7月1曰申請）、第 61/387,862號（2010年 9 月 29 日申請）、第 61/435,710號（2011 年1月24曰申請）、第61/442，115號（2011年2月11日申請）、第61/476,210號（2011年4月15曰申請）及第61/495,268號 (2011年6月9日申請）之優先權，每一案件之全文皆以引用方式併入本文中。【先前技術】酵素替代療法（ERT)涉及向個體全身投與天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。經批准療法通常經靜脈内投與個體’且通常可有效治療由酵素缺陷引起之躯體症狀。由於經靜脈内投與之蛋白質及/或酵素不能充分地跨過血腦障壁（BBB)，故經靜脈内投與之蛋白質及/或酵素至中樞神經系統（CNS)細胞及組織中之分佈很有限，因而治療具有CNS病因之疾病一直尤其具有挑戰性。血腦障壁（BBB)係由内皮細胞構成之結構系統，其藉由限制血流中之有害物質（例如細菌、大分子（例如，蛋白質）及其他親水性分子）擴散跨過BBB及擴散至下面的腦脊髓液（CSF)及中枢神經系統（(：]^!5)中而起保護CNS遠離該等物質之功能。全身物質（不管該物質為内源的抑或外源投與的）穿透 BBB之能力取決於數個因素。該等因素包括（例如）該物質在BBB兩側之濃度、該物質之尺寸、該物質之親脂性以及 157226.doc 201212936 該物質對特定活性載體結構之親和力。已經提出以有效遞送治療劑跨過BBB之策略包括受體介導之轉運，由此通過固有主動轉運系統使大分子主動轉運跨過BBB。亦已將 BBB之高滲性開放視為能夠控制BBB以促進治療劑之遞送的技術。亦已將更多侵襲性技術（例如對流增強之治療劑遞送）視為藉由將該等治療劑直接輸注至CNS中而繞開bbb 之方式。儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與至脊髓周圍之腦脊髓膜内間隙中仍然為將治療劑直接投與跨過ΒΒβ並投與至下面的CSF中之最常見方式。(Kr〇in Js，㈤⑽露論扣 (1992) 22(5):319-326.)相對於可全身投與至個體之組合物體積，適於腦脊髓膜内投與之組合物體積通常係治療具有 CNS病因之某些疾病之重大障礙。通常，對於可投與至個體之治療劑總劑量的該等限制會抑制在擬定作用位點達到治療劑之最佳治療濃度的能力。因此，該等限制可使腦脊髓膜内遞送途徑對於懷疑具有^^^病因之許多疾病而言不可行，尤其對於在受侵襲組織（例如，腦）中達到有效治療濃度需要較大劑量治療劑之疾病。製備濃縮組合物不足以抵消與腦脊髓膜内投與治療劑及在受侵襲組織中達到有效治療濃度有關之限制。製備濃縮組合物通常可造成治療劑之聚集及/或沉澱。可利用之適於CNS投與之醫藥組合物有限進一步使該限制複雜化。因此，業内仍然需要能夠使治療劑增溶且適於將該等治療劑 CNS投與至有需要之個體的穩定組合物。亦仍然需要能夠 157226.doc 201212936 在CNS細胞及組織内達到治療濃度之醫藥組合物（例如，經腦脊髓膜内投與之醫藥組合物）。【發明内容】在一個態樣中，本發明提供治療B型聖菲利波症候群 (Sanfilippo syndrome type B) (San B)病之方法，其包括向需要治療之個體經腦脊髓膜内投與重組α-Ν乙醯基葡萄糖胺酶（Naglu)蛋白質之步驟。在一些實施例中，重組Naglu 蛋白質係包含Naglu結構域及溶酶體靶向部分之融合蛋白。在一些實施例中，Naglu結構域包含與SEQ ID NO: 1(成熟人類Naglu蛋白質）至少80% —致之胺基酸序列。在一些實施例中，Naglu結構域包含與SEQ ID ΝΟ:1(成熟人類 Naglu蛋白質）至少95% —致之胺基酸序列。在一些實施例中，Naglu結構域包含與SEQ ID ΝΟ:1(成熟人類Naglu蛋白質）一致之胺基酸序列。在一些實施例中，溶酶體靶向部分係IGF-II部分。在一些實施例中，IGF-II部分包含與成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)至少70% —致之胺基酸序列。在一些實施例中， IGF-II部分包含與成熟人類IGF-II (SEQ ID N0:2)至少80% 一致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGF-II部分包含與成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)至少90% —致之胺基酸序列。在一些實施例中，IGF-II部分包含包括成熟人類IGF-II(SEQIDNO:2)之殘基8-67的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含Naglu結構域與 157226.doc 201212936 溶酶體靶向部分之間之連接體。在一些實施例中，連接體包含一或多個胺基酸序列GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO:3)。在一些實施例中，胺基酸序列GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO:3)係以串聯重複存在。在一些實施例中，連接體進一步包含一或多個GAP序列。在一些實施例中，連接體包含胺基酸序歹丨J GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAA GGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (SEQ ID NO:4)。在一些實施例中，溶酶體靶向部分直接或經由連接體融合至Naglu結構域之C-末端。在一些實施例中，溶酶體靶向部分直接或經由連接體融合至Naglu結構域之N-末端。在一些實施例中，重組蛋白質係自人類細胞產生。在二些實施例中，重組蛋白質係自CHO細胞產生。在一些實施例中，腦脊髓膜内投與使得Naglu蛋白質遞送於腦組織中。在一些實施例中，腦組織包含腦之實質及/ 或腦脊髓膜。在一些實施例中，腦脊髓膜内投與進一步使得Naglu蛋白質遞送至肝。在一些實施例中，Naglu蛋白質定位至腦及肝細胞之溶酶體。在一些實施例中，腦脊髓膜内投與使得腦及肝中之 GAG減少。在一些實施例中，腦脊髄膜内投與使得腦之大腦皮質及皮質下區域中之GAG減少。在一些實施例中，腦脊髓膜内投與使得San B病之至少一種症狀或特徵的強度、嚴重程度或頻率降低，或延遲其發作。在一些實施例中，San B病之至少一種症狀或特徵係聽力損失、語言發育遲緩、運動技能缺陷、活動過度、 157226.doc ⑧ 201212936 智力遲鈍、攻擊性及/或睡眠紊亂。在一些實施例中，Naglu融合蛋白係以約26 mg/ml之濃度投與。在另一態樣中，本發明提供治療性融合蛋白，其包括 Naglu結構域；溶酶體乾向部分，且其中一旦投與，治療性融合蛋白靶向溶酶體且具有活體内治療活性。在一些實施例中，Naglu結構域包含與SEQ ID ΝΟ:1(成熟人類Naglu 蛋白質）至少80% —致之胺基酸序列。在一些實施例中， Naglu結構域包含與SEQ ID NO: 1(成熟人類Naglu蛋白質）一致之胺基酸序列。在一些實施例中，溶酶體靶向部分係IGF-II部分。在一些實施例中，IGF-II部分包含與成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)至少70% —致之胺基酸序列。在一些實施例中， IGF-II部分包含包括成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)之殘基 8-67的胺基酸序列。在一些實施例中，融合蛋白進一步包含Naglu結構域與溶酶體靶向部分之間之連接體。在一些實施例中，連接體包含胺基 @曼序列 GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGG AAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP (SEQ ID NO:4)。在一些實施例中，溶酶體靶向部分直接或經由連接體融合至Naglu結構域之C-末端。在又一態樣中，本發明提供包括與SEQ ID NO:5(全長 Naglu-IGF-II融合蛋白）至少80%—致之胺基酸序列的治療性融合蛋白，其中一旦投與，治療性融合蛋白乾向溶酶體 157226.doc 201212936 且具有活體内治療活性。在另一態樣中，本發明提供用於腦脊髓媒内投與之系統，其包括輸液裝置；空心體，其具有與該輸液裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量孔；及用於該空心體緊固插入脊髓中之緊固機構。在一些實施例中’該緊固機構包含一或多個安裝於空心體表面上之球形頭及於該一或多個球形頭上可調整之縫合環。在一些實施例中’輸液裝置係可注射座（injectable port)。在一些實施例中，可注射座係可植入的。在一些實施例中，輸液裝置係幫浦。【實施方式】定義下文將首先定義某些術語以便更容易地理解本發明。以下術語及其他術語之其他定義陳述於說明書通篇中。改#.·本文所述術語「改善」意指狀況之預防、減弱或緩解、或個體狀況之改良《改善包括（但不要求）病況（例如，B型聖菲利波症候群）之完全恢復或完全預防。在一些實施例中，改善包括增加相關疾病組織缺陷之相關蛋白質之濃度或其活性（例如Naglu)。义#活尨.·本文所用之片語「生物活性」係指在生物系統中且尤其在生物體中具有活性之任一藥劑之特徵。例如’在投與生物體時對該生物體具有生物效應之藥劑視為具有生物活性。在特定實施例中，倘若蛋白f或多狀具有生物活性，則該蛋白質或多肽中共有蛋白質或多肽之至少 157226.doc 201212936 一種生物活性的部分通常稱作「生物活性」部分。 #/#.·本文所用之術語「劑型」及「單位劑型」係指用於擬治療患者之治療性蛋白質（例如Naglu)之物理離散單位。每一單位含有經計算以產生期望治療效果之預定量之活性材料。然而，應理解，組合物之總劑量應由主治醫師在合理的醫學判斷範圍内確定。逐彦、增> 4’綮泡/本文所用之術語「改良」、「增加」或「降低」或語法等效詞表示相對於基線量測（例如相同個體在開始本文所述治療前之量測、或對照個體（或多個對照個體）在不存在本文所述治療時之量測）之值。「對照個體」係患有與所治療個體相同之溶酶體貯積症之形式（例如，B型聖菲利波症候群）之個體，其與所治療個體之年齡大致相同（以確保所治療個體與對照個體之疾病階當）。匆邀、肩者.本文所用之術語「個體（subject，individual)」或「患者」係指人類或非人類哺乳動物彳固體。所治療個體（individual)(亦稱作「患者」戋體（subject)」）係患有疾病（例如B型聖菲利波症候^ 之個體（胎兒、幼兒、兒童、少年或成人）。料邀..本文所用之術語「連接體」係指融合蛋白中不在天然蛋白質中特^位置出現且通常經設計以具有挽性或構（例如α_螺旋）插入兩個蛋白質部分之間的胺基酸列。連接體亦稱作間隔體。多版般而言，本文所用之「多肽」係至少兩個藉由 157226.doc 201212936 肽鍵彼此附接之胺基酸之串。在一些實施例中，多肽可包括至少3至5個胺基酸，每一胺基酸藉助至少一個肽鍵附接至其他胺基酸。彼等熟習此項技術者應瞭解，多肽有時視情況包括「非天然」胺基酸或仍然能整合至多肽鏈中之其他實體。 T溶的··本文所用之術語「可溶的」係指治療劑能夠形成均質溶液》在一些實施例中，治療劑於藉以投與及運送至目標作用位點（例如腦細胞及組織）之溶液中之溶解性足以容許治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點。數個因素可影響治療劑之溶解性。例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基酸序列及存在其他辅助溶解劑（co-solubilizing agent)或鹽（例如鈣鹽）。在一些實施例中，該等醫藥組合物經調配而使該等組合物不包含鈣鹽。在一些實施例中，本發明治療劑可溶於其對應醫藥組2物中。應瞭解’儘管對於非經腸投與藥物而言等滲溶液通常較佳，但使用等滲溶液可能限制一些治療劑且尤其一些蛋白質及/或酵素之充分溶解。已證實輕微高滲溶液(例如多達⑺mM氣化納於5 mM磷酸納中，pH 7〇)及含糖溶液⑽ 如多達2%蔗糖於5 mM磷酸鈉中，pH 7 〇)在猴子十有良好耐受性。例如’最常見之經批准CNS團注A，調配：合物係鹽水（150 mM NaCl於水中）。射疼·.本文所用之術語「穩定的」係指治療劑（例如重組酵素）能夠在長時間内保持其治療功效（例如全邻或大部分之其預期生物活性及/或生理化學完整性(phy:〇_ 157226.doc •10· 201212936 ••a1 integrity))。可評估長時間内（例如至少i個月、3 個月' 6個月、12個月、18個月、24個月、％個月、36個 =或更長）治療劑之穩定性及醫藥組合物保持該治療劑穩定!·生的力。-般而言，本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定-起調配之-或多種治療劑（例如重組蛋白質），或者減緩或阻止其降解。在調配物中，穩定調配物係其中治療劑在儲存時及在處理（例#冷束/解康，機械混合及;東乾）期間基本上保持其物理及/或化學完整性及生物活性者。對於蛋白質穩定性而t，其可由高分子量（hmw)聚集體之形成、酵素活性之損失、肽片段之產生及電荷曲線之移位測量》窗邀.·本文所用之術語「個體」意指任何哺乳動物，包括人類。在本發明之某些實施例中，個體係成年、少年或幼兒。本發明亦涵蓋在子宮内投與該等醫藥組合物及/或實施該等治療方法。 ”尽源涅..片語「實質同源性」在本文中用於指胺基酸或核酸序列之間之比較。如彼等熟習此項技術者所瞭解’兩個序列若在對應位置中含有同源殘基，則通常將其視為「實質上同源」。同源殘基可為相同殘基。或者，同源殘基可為具有合適的類似結構及/或功能特徵之不同殘基。例如’如彼等熟習此項技術者所熟知，通常將某些胺基酸歸類為「疏水性」或「親水性」胺基酸及/或具有「極性」或「非極性」側鏈。一種胺基酸取代為相同類型之另一種胺基酸通常可視為「同源」取代。 157226.doc 201212936 如業内所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式（例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位 BLAST及PSI-BLAST)中獲得者。該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol.，215(3): 403-410，1990 ; Altschul等人，Methods in Enzymology ; Altschul等人，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 ; Baxevanis 等人，

Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley，1998 ;及Misener等人（編輯），Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第 132 卷），Humana Press, 1999。除鑑別同源序列外，上述程式通常亦指示同源性程度。在一些實施例中，若兩個序列在相關殘基延伸部分上有至少50%、55%、60%、65%、70%、 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94% ' 95% ' 96%、97%、98%、99%或更多的對應殘基同源，則將其視為實質上同源。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、 275 、 300 、 325 、 350 、 375 、 400 、 425 、 450 、 475 、 500或更多個殘基。實# 一衮艋.·片語「實質一致性」在本文中用於指胺基 157226.doc • 12- ⑤ 201212936 酸或核酸序列之間之比較。如彼等熟習此項技術者所瞭解，兩個序列若在對應位置中含有相同殘基，則通常將其視為「實質上一致」。如業内所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式（例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位BLAST及PSI-BLAST)中獲得者。該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990 ; Altschul等人，Methods in Enzymology ; Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402，1997 ; Baxevanis等人，Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998 ;及 Misener 等人（編輯），

Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第 132卷），Humana Press, 1999。除鑑別一致序列外，上述程式通常亦提供一致性程度之指示。在一些實施例中，若兩個序列之對應殘基的至少50%、55%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多在殘基之相關延伸部分上一致，則將其視為實質上一致。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少10、15、20、25、30、35、40、45、 50 、 55 、 60 、 65 、 70 、 75 、 80 、 85 、 90 、 95 、 100 、 125 、 150 、 175 、 200 、 225 、 250 、 275 、 300 、 325 、 350 、 375 、 400、425、450、475、500或更多個殘基。 157226.doc -13- 201212936 適於遞送至CMS尹·.當關於本發明醫藥組合物時，本文所用之片§吾「適於遞送至中樞神經系統中」或「適於遞送至CNS中」通常係指該等組合物之穩定性、耐受性及溶解 1眭特性以及該等組合物將其中含有之有效量之治療劑遞送至目標遞送位點（例如，CSF或腦）的能力。在一些實施例中，右本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性，則該等組 =»物適於遞送至個體之中拖神經系統中❹在一些實施例中，右本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性且能夠溶解其中含有之治療劑，則該等組合物適於遞送至個體之中柩神經系統中。浴#尨麥分·.本文所用之術語「治療性部分」係指分子中賦予刀子之冶療效果之部分。在一些實施例中治療性部分係具有治療活性之多肽。例如，本發明治療性部分可為可取代天然Naglu蛋白質之多肽。在一些實施例中本發明治療性部分可為可挽救一或多種與仏咖缺陷有關之 31的多肽在些實施例中，本發明治療性部分可治療 B型聖菲利波症候群患者之一或多種症狀。也###’本文所用之術語「治療有效量」係指治療性蛋白質（例如Naglu)以適用於任一醫學治療之合理益處/ 風險比賦㈣治療㈣治療效果之量。治療效果可為客觀性（即可藉由某種測試或標記測量）或主觀性（即個體給予效果之指示或感覺）。「治療有效量」特別係指治療性蛋白質或組合物藉由例如改善與疾病有關症狀、預防或延遲疾病發作、及/或亦減輕疾病症狀之嚴重程度或㈣而有效治

I57226.doc

201212936 療、改善或預防期望疾病或病況、或呈現可檢測之治療或預防效果之量。治療有效量通常以可包含多個單位劑量之給藥方案投與。對於任一特定治療性蛋白質而言，治療有效量（及/或在有效給藥方案内之適合單位劑量）可視例如投與途徑、與其他醫藥劑之組合而變化。此外，任一特定串者之特定治療有效量（及/或單位劑量）可視多種因素而定，包括所治療病症及該病症之嚴重程度；所用特定醫藥劑之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所用特定融合蛋白之投與時間、投與途徑及/或排泄或代謝速率；治療持續時間；及醫學技術内熟知之類似因素。 τ碌受的.·本文所用之術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物在投與該組合物之個體中不引發不良反應或者在投與該組合物之個體中不引發嚴重不良反鹿之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中有良好耐受性。治# (7>印加..本文所用之術語「治療（Treatment)」 (及treat或treating)係指任何投與治療性蛋白質（例如溶酶體酵素）以部分地或完全減輕、改善、緩解、抑制特定疾病、病症及/或病狀（例如B型聖菲利波症候群）之一或多種症狀或特徵，延遲其發作，降低其嚴重程度及/或降低其發生率。該治療可針對不呈現相關疾病、病症及/或病狀之體徵之個體及/或針對僅呈現該疾病、病症及/或病狀之早期體徵之個體。或者或另彳，該治療可針對呈現相關疾 157226.doc -15· 201212936 病、病症及/或病狀之一或多個確立體徵之個體。本發明尤其係關於腦脊髓膜内投與溶酶體酵素以有效治療溶酶體貯積症。在一些實施例中，本發明提供用於it遞送αΝ-乙醯基葡萄糖胺酶之穩定調配物。治療性蛋白質適於本發明之治療部分可為可取代天然Naglu蛋白質活性或挽救一或多種與Naglu-缺陷有關之表型或症狀的分子或一部分分子。在一些實施例中，適於本發明之治療部分係具有N-末端及C-末端且胺基酸序列與成熟人類Naglu蛋白質實質上類似或一致的多肽》人類Naglu通常係作為處理成成熟形式之前體分子產生。此處理通常藉由在蛋白質進入内質網時移除23胺基酸信號肽進行。前體形式通常亦稱作全長前體或全長Naglu 蛋白質，其含有743個胺基酸。當前體蛋白質進入内質網時，解離N-末端23個胺基酸，從而產生成熟形式。因此，預期Naglu蛋白質活性通常不需N-末端23個胺基酸。成熟形式之胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)及典型野生型或天然人類Naglu蛋白質之全長前體（SEQIDNO:2)示於表1中》表1.人類Naglu

成熟形式 DEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVSVERAL AAKPGLDTYSLGGGGAARVRVRGSTGVAAAAG LHRYLRDFCGCHVAWSGSQLRLPRPLPAVPGELT EATPNRYRYYQNVCTQSYSFVWWDWARWEREI DWMALNGINLALAWSGQEAIWQRVYLALGLTQ AEINEFFTGPAFLAWGRMGNLHTWDGPLPPSWH 157226.doc •16· ⑤ 201212936

IKQLYLQHRVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPEA VTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSYSCSFLLAPED PIFPIIGSLFLRELIKEFGTDfflYGADTFNEMQPPS SEPSYLAAATTAVYEAMTAVDTEAVWLLQGWLF QHQPQFWGPAQIRAVLGAVPRGRLLVLDLFAES QPVYTRTASFQGQPFIWCMLHNFGGNHGLFGAL EAYNGGPEAARLFPNSTMVGTGMAPEGISQNEV VYSLMAELGWRKDPVPDLAAWVTSFAARRYGV SHPDAGAAWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLV RRPSLQMNTSIWYNRSDVFEAWRLLLTSAPSLAT SPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLSK ELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGS WLEQARAAAVSEAEADFYEQNSRYQLTLWGPE GMLDYANKQLAGLVANYYTPRWRLFLEALVDS VAQGIPFQQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPSQ PRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVAGSW (SEQ ID NO:l) 全長前體 MEAVAVAAAVGVLLLAGAGGAAGDEAREAAAV RALVARLLGPGPAADFSVSVERALAAKPGLDTY SLGGGGAARVRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFC GCHVAWSGSQLRLPRPLPAVPGELTEATPNRYRY YQNVCTQSYSFVWWDWARWEREIDWMALNGI NLALAWSGQEAIWQRVYLALGLTQAEINEFFTG PAFLAWGRMGNLHTWDGPLPPSWHIKQLYLQH RVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPEAVTRVFPQV NVTKMGSWGHFNCSYSCSFLLAPEDPIFPIIGSLF LRELIKEFGTDfflYGADTFNEMQPPSSEPSYLAA ATTAVYEAMTAVDTEAVWLLQGWLFQHQPQFW GPAQIRAVLGAVPRGRLLVLDLFAESQPVYTRTA SFQGQPFIWCMLHNFGGNHGLFGALEAVNGGPE AARLFPNSTMVGTGMAPEGISONEVVYSLMAE 157226.doc -17- 201212936 LGWRKDPVPDLAAWVTSFAARRYGVSHPDAGA AWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLVRRPSLQM NTSIWYNRSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYD LLDLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLSKELASLLR AGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGSWLEQAR AAAVSEAEADFYEQNSRYQLTLWGPEGNILDYA NKQLAGLVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQGIPF QQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPSQPRGDTV DLAKKIFLKYYPRWVAGSW (SEQ ID NO:2) 因此，在一些實施例中，適於本發明之治療部分係成熟人類Naglu蛋白質（SEQ ID ΝΟ:1)。在一些實施例中，適於治療部分可為成熟人類Naglu蛋白質之同源物或類似物。例如，成熟人類Naglu蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然Naglu蛋白質（例如SEQ ID NO: 1)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入、同時保留實質Naglu蛋白質活性之經修飾成熟人類Naglu蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療部分與成熟人類Naglu蛋白質（SEQ ID NO: 1)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療部分具有與SEQ ID ΝΟ:1至少50%、55%、 60% ' 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93%、940/〇、95%、96%、97%、98%、99%或更大同源的 &基^曼序列。在一些實施例中，適於本發明之治療部分與成熟人類Naglu蛋白質（SEQ ID NO: 1)實質上一致。在一些實施^列中，適於本發明之治療部分具有與SEQ ID NO: 1至少 50%、55%、60% ' 65% ' 70%、75% > 80% > 85%、 157226.doc • 18 ⑧ 201212936 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94% > 95% ' 96% > 97% ' 98% ' 99%或更大一致之胺基酸序列。在一些實施例中，適於本發明之治療部分含有成熟人類Naglu蛋白質之片段或一部分。或者，適於本發明之治療部分係全長Naglu蛋白質。在一些實施例中，適宜治療部分可為全長人類Naglu蛋白質之同源物或類似物。例如，全長人類Naglu蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然全長Naglu蛋白質（例如 SEQ ID NO:2)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入、同時保留實質Naglu蛋白質活性之經修飾全長人類 Naglu蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療部分與全長人類Naglu蛋白質（SEQ ID NO:2)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療部分具有與SEQ ID NO:2至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或更大同源的胺基酸序列。在一些實施例中，適於本發明之治療部分與SEQ ID NO:2實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療部分具有與SEQ ID NO:2 至少 50%、55%、60%、65%、70〇/〇、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、980/〇、 99%或更大一致之胺基酸序列《在一些實施例中，適於本發明之治療部分含有全長人類Naglu蛋白質之片段或一部分。本文所用全長Naglu蛋白質通常含有信號肽序列。在一些實施例中，治療性蛋白質包括靶向部分（例如溶 157226.doc -19· 201212936 酶體乾向序列）及/或m穿透肽。纟-些實施例中，乾向序列及/或膜穿透狀係治療部分之固有部分（例如，經由化學連接，經由融合蛋白）^在一些實施例中，靶向序列含有甘露糖-6-磷酸鹽部分。在一些實施例令，靶向序列含有 IGF_I部分。在一些實施例中，靶向序列含有IGF-II部分。藉由騸脊髓膜内投與治療聖菲利波症候群聖菲利波症候群或黏多糖貯積症m (MPS ΙΠ)係特徵在於參與聚糖胺聚多糖（GAG)之降解的酵素缺陷的稀有遺傳病症。在不存在酵素時，部分降解之gAg分子不可自體内清除並在各種組織之溶酶體中積聚，從而導致進行性廣泛身區體功能障礙（Neufeld及Muenzer，2001)。已鑑別四種不同形式之MPS III，指定為MPS ΠΙΑ、B、 C及D。每一者代表參與硫酸乙醯肝素gag之降解的四種酵素中之一者的缺陷。所有形式包括相同臨床症狀（包括粗魯面部特徵、肝脾腫大、角膜混濁及骨骼變形）之不同程度。然而，最應注意的是認知能力之嚴重及進行性損失，其不僅與神經元中之硫酸乙醯肝素的積聚有關，而且亦與由主要GAG積聚造成之神經節苷脂GM2、GM3及GD2 的隨後升高有關（Walkley 1998)。 IIIB型黏多糖貯積症（MPS ΠΙΒ ; B型聖菲利波病）係特徵在於酵素α-Ν-乙醯基-葡萄糖胺酶（Naglu)之缺陷的體染色體隱性遺傳病症。在不存在此酵素時，硫酸乙酿肝素gag 在神經元及神經膠質細胞之溶酶體中積聚，且在腦外積聚較少。 157226.doc . 20 - ⑧ 201212936 此病症之定義性臨床特徵係中樞神經系統（CNS)變性，其導致損失或不能達成主要的發育里程碑。進行性認知衰退在癡呆及早死中達到極點。該疾病通常在幼兒中自身表現，且受侵襲個體之壽命通常不超過接近20歲至2〇歲出頭。本發明之組合物及方法可用於有效地治療患有或易患 SanB之個體。本文所用術語「治療」（「…以」或「treatment」）係指改善一或多種與疾病相關之症狀、預防或延遲疾病之一或多種症狀之發作、及/或減輕疾病之一或多種症狀的嚴重程度或頻率。在一些貫施例中，治療係指部分地或完全緩和、改善、減緩、抑制SanB患者中之神經損害，延遲其發作，降低其嚴重程度及/或發生率。本文所用術語「神經損害」包括與中樞神經系統（例如腦及脊髓）損害有關之各種症狀。神經損害之症狀可尤其包括（例如）發育遲緩、進行性認知損傷、聽力損失、語言發育受損、運動技能缺陷、活動過度、智力遲鈍、攻擊性及/或睡眠素亂。因此，在一些實施例中，治療係指各種組織中之溶酶體貯積（例如GAG之貯積）減少《在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊髓神經元、及/或周圍目標組織中之溶酶體貯積減少。在某些實施例中，溶酶體貯積與對照相比減少約 5%、10%、15%、20%、25%、3 0%、35%、40%、 450/〇、50〇/〇、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 90%、95%、100%或更多。在一些實施例中，溶酶體貯積 157226.doc -21- 201212936 與對照相比減少到至多1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、 1/7、1/8、1/9或1/10。在一些實施例中，藉由LAMP-1染色測定溶酶體貯積。在一些實施例中，治療係指神經元（例如，含有普爾欽 (Purkinje)細胞之神經元）中之空泡形成減少。在某些實施例中，神經元中之空泡形成與對照相比減少約5%、10%、 15% > 20% ' 25% ' 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% ' 55% ' 60%、65% ' 70%、75%、80%、85%、90%、95%、100% 或更多。在一些實施例中，空泡形成與對照相比減少到至多 1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或 1/10 » 在一些實施例中，治療係指各種組織中之Naglu酵素活性提高。在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之Naglu酵素活性提高*在一些實施例中，Naglu酵素活性與對照相比提高約5%、10%、 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、 60%、65% > 70%、75%、80%、85%、90%、95% ' 100% ' 200% ' 300% ' 400% ' 500% ' 600% ' 700% ' 800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，Naglu酵素活性與對照相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6 倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些實施例中，提高的 Naglu酵素活性為至少約 10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、 40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg 、 80 nmol/hr/mg 、 90 nmol/hr/mg 、 100 nmol/hr/mg 、 150 nmol/hr/mg 、200 nmol/hr/mg、250 157226.doc -22- Λ ⑧ 201212936 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、3 50 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、5 50 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，腰區中之Naglu酵素活性提高。在一些實施例中，腰區中提高之Naglu酵素活性為至少約2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg ' 7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg、10,000 nmol/hr/mg或更多。在某些實施例中，本發明之治療導致一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記之存在或另一選擇為積聚的減少（例如，約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、 50%、55%、60%、65% ' 70%、75%、80%、90% ' 95% ' 9 7 · 5 %、9 9 %或更多減少）或完全消除。該減少或消除在 CNS細胞及組織（例如，神經元及少突膠質細胞）中尤其明顯。例如’在一些實施例中，在投與個體後，本發明醫藥組合物展示或達成個體之CNS細胞及組織中（例如，大腦皮質、小腦、尾狀核及豆狀核殼、白質及/或丘腦中）生物標記溶酶體相關膜蛋白1 (LAMP1)積聚之減少。LAMP1係高度表現於溶酶體膜中之糖蛋白，且在許多患有溶酶體貯積症之患者中其存在提高。（Meikle等人，Clin Chem.(1997)43:1325-1335)。因此，在患有溶酶體貯積症之患者中存在或不存在 LAMP 1 (例如，如藉由LAMP染色所測定）可提供溶酶體活性之有用指示及用於診斷及監測溶酶體貯積症之標記。因此’本發明之一些實施例係關於減少或消除一或多種 157226.doc -23- 201212936 與疾病（例如，溶酶體貯積症）有關之病理或生物標記之存在或積聚的方法。類似地，本發明之一些實施例係關於增加一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記（例如，LAMP1)之降解（或降解速率）的方法。在一些實施例中，治療係指認知能力損失之進展減慢。在某些實施例中，認知能力損失之進展與對照相比減慢約 5% ' 10% > 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50% > 55% > 60% ' 65% ' 70% > 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 95%、100%或更多。在一些實施例中，治療係指發育遲缓減輕。在某些實施例中，發育遲緩與對照相比減輕約 5% ' 10% ' 15% ' 20% ' 25% ' 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% > 55% ' 60% ' 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 95%、100°/。或更多》在一些實施例中，治療係指存活（例如存活時間）延長。例如，治療可延長患者之預期壽命。在一些實施例中，本發明之治療可使患者之預期壽命與未經治療之患有類似疾病的一或多個對照個體之平均預期壽命相比延長超過約 5%、約 10%、約 15%、約 20%、約 25%、約 30%、約 35%、約 40%、約 45%、約 50%、約 55%、約 60%、約 65%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 95%、約 100%、約 105%、約 110%、約 115%、約 120%、約 125%、約 130%、約 135%、約 140%、約 145%、約 150%、約 155%、約 160%、約 165%、約 170%、約 175%、約 180%、約185%、約190%、約195%、約200%或更多。在一些實施 24- 157226.doc 201212936 例中’本發明之治療可使串者 … 縻了使患者之預期奇命與未經治療之串有類似疾病的一或多個對照個體之平均：超過約6個月、約7個月、_月、約9個月、㈣個Γ 約U個月 '約12^、約2年、約3年、約4年、約5年、約 6年、約7年、約8年、約9年、約1〇年或更長時間。在—些實施例中，本發明之治療使患者長㈣活。本文所用術二長期存活」係指存活時間或預期壽命長於約4〇年、Μ 年、50年、55年、60年或更長時間。本文所用術語「改良」、「增加」或「降低」指示相對於對照之值。在-些實施例中，適宜對照係基線量測，例如相同個體在開始本文所述治療前之量測、或對照個體（或多個對照個體）在不存在本文所述治療時之量測。「對照個體」係患有SanB之個體，其與所治療個體之年齡大致相、同及/或性別相同（以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當）。所治療個體（individual^亦稱作r患者」或「個體 (subject)」）係患有SanB或具有產生SanB之潛能的個體（胎兒、幼兒、兒童、少年或成人）。個體可具有殘餘内源 Naglu表現及/或活性，或無可量測之活性。例如，患有 SanB之個體iNaglu表現程度可為正常Naglu表現程度的約 30-50%以下、約 25-30%以下 '約 20-25°/。以下、約 15_2〇% 以下、約10-15°/。以下、約5-10%以下、約〇.ι_5。/。以下。在一些實施例中，該個體係最近診斷患有該疾病之個體。通常，早期治療（診斷後盡可能快地開始治療）對於使 157226.doc •25· 201212936 疾病之影響最小化及使治療之益處最大化而言係至關重要的。投與治療劑之腦脊髓膜内投與通常藉由腰椎穿刺術（即，緩慢團注）或經由座-導管（port-catheter)遞送系統（即，輸注或團注）來實施。使植入的導管連接至貯器（用於團注遞送）或輸注幫浦（植入或在外部）。導管最通常插入於腰椎板之間，且尖端向上穿過鞘間隙至期望節段（通常為L3-L4) » 儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與至脊髓周圍之腦脊髓膜内間隙中仍然為將治療劑直接且有效地遞送跨過BBB 並遞送至下面的CSF中之最常見方式。（參見Kroin JS，Clin Pharmacokinet (1992) 22(5):319-326，其全部内容皆以引用方式併入本文中。）相對於可經靜脈内投與至個體之體積，適於腦脊髓膜内投與之體積通常係治療具有CNS病因之某些疾病之特有障礙。治療劑之腦脊髓膜内遞送進一步受保持CSF組成之微妙平衡以及保持個體顱内壓所限制。例如，在人類中，治療劑之腦脊髓膜内團注遞送體積通常限於0.5-1 mL。（例如，參見 Grouls RJE 等人，General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery. Spinal Drug Delivery > 第 15章，Elsevier Science(Yaksh，TL編輯）1999，其全部内容皆以引用方式併入本文中。）此外，沒有自個體對應移除 CSF，在人類中總腦脊髓膜内劑量體積限於小於3 mL。本發明醫藥組合物亦可用於將治療劑經腦室内遞送至個 157226.doc •26· ⑧ 201212936 體之CNS中（即’直接投與至腦室中）。腦室内遞送可經由 Ommaya氏貝了器或其他類似輸液座（access p〇rt)加以促進，該貯器或其他類似輸液座可植入於位於個體頭頂部在頭皮與骨膜之間之袋狀物中，其中導引導管直接放置於腦室中。（Nutts JG等人，Neurology (2003) 60:69-73。）本發明亦涵蓋將/〇療劑投與至小腦延髓池（cerebeii〇ineduUary cistern或cisterna magna)之CSF中，此方式可在（例如）動物物種中使用係由於與腦脊髓膜内或腦室内投與相比在小型齧齒類動物中使用此方式後勤方便。本發明之把向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）可藉由任一適當途徑投與。在一些實施例中，經靜脈内投與本發明之乾向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。在一些實施例中，經腦脊髓膜内投與本發明之乾向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。熟習此項技術者應瞭解，腦脊髓膜内藥物遞送可由用於腦脊髓膜内遞送之許多機構組成。在一些實施例中’腦脊髓膜内藥物遞送可由腰椎注射組成。在一些實施例中，經由腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。在一些實施例中，腦·脊髓膜内藥物遞送可由與大腦室内（ICV)導管流體連通之微幫浦組成。在其他實施例中，腦脊髓膜内藥物遞送可由與導管流體連通之皮下流體輸液座組成。在此實施例中，經由具有大腦室内導管之腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。在此實施 157226.doc •27· 201212936 例中，流體輸液座與大腦室内（ICV)導管流體連通。在一些實施例中，經由腦脊趫膜内藥物遞送裝置（iddd)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。若需要，可同時使用一種以上途徑。本發明之水性醫藥組合物較佳以通常小於4 〇 mL、小於 3.0 mL、小於2.5 mL、小於2.0 mL、小於 h5 mL、小於！〇 mL、小於0.5 mL或小於0.25 mL劑量之體積投與至個體。本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）係以治療有效量（即，在每隔一定時間投與時，藉由（例如）改善與該疾病有關之症狀、預防或延遲該疾病發作、及/或亦減輕疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病的劑量量，如上文所述）投與。本文所用治療有效量亦稱作治療有效劑量或治療有效劑量量。可治療有效地治療疾病之劑量取決於疾病影響之性質及程度’且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體内分析以有助於鑑別最佳劑量範圍。擬採用之準確劑量亦視投與途徑、及疾病嚴重性而定，且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。有效劑量可自源自活體内或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推（例如，如由美國衛生和人類服務部 (U.S. Department of Health and Human Services)食品藥品管理局（Food and Drug Administration)及藥品評價與研究中心(Center for Drug Evaluation and Research)在「Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose 157226.doc -28- ⑧ 201212936 in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」，Pharmacology and T〇Xicology，2〇〇5年7月中所述’其全部内容以引用方式併入本文中）β 在一些實施例中，治療有效量可為（例如）約〇〇卜25 mg/kg、約 1-20 mg/kg、約 4-20 mg/kg、約 5·15 mg/kg、約 5-10 mg/kg體重。端視個體需要，用於特定個體之有效劑量可隨時間流逝而有所變化（例如，增加或降低p例如，在身體性疾病或應力情況下，或若疾病症狀惡化，則可增加劑量量。端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續投與治療有效量之本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。本文所用以一「間隔」投與指示週期性投與治療有效量（與一次性劑量相區分卜該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在一些實施例中，兩個月一次 '每月一次、一月兩次、三週一次、兩週一次、一週一次、一週兩次、一週三次、或每天一次投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變，端視該個體之需要而定。例如，在身體陡疾病或應力情況下或若疾病症狀有所惡化，則可降低劑量之間之間隔β 在投與某些實施例之醫藥組合物後，可在目標細胞及組織（例如，腦組織或CSF)中達到或檢測到其中含有之治療齊J的/α療濃度。在某些實施例中，在投與後（例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜内投與至個體後丄週、3天、小 157226.doc •29· 201212936 時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、 4广時、3小時、2小時、！小時、3〇分鐘或更短時間），醫藥組合物在個體之CNS組織及細胞中達到至少3〇 yg/mi之濃度。端視疾病影響之性質及程度，每隔—料間持續投與治療有效量之Naglu，#視疾病|響之性質及程度。本文所用以 Μ隔」投與指#週期性投與治療有效量（與一次性劑置相區分）°該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在 -些實施例中，治療劑係兩個月—次、每月_次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每日—次投與。單—個體之投與間隔不-定係固定間隔’且可隨時間而變，端視該個體之需要而定。例如’在身體性疾病或應力情況下’若抗nagl^體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則劑量之間之間隔可縮短。本文所用之術„。「兩個月一次」意指每兩個月投與一次 (即’每兩個月-次）；術語「每月一次」意指每月投與一久，術語「每三週一· 一人」意拓母三個週投與一次（即，每三個週一次）；術語「每兩週一次」意指每兩個週投與一次（即’每兩個週—次）；術語「每週-次」意指每週投與 -欠，且術語「每日_次」意指每天投與一次。在某些實施例中，在投與至個體後(例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜内投與至個體後1週、3天、48小時、36小時24小時18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3 】時2小時、1小時、3〇分鐘或更短時間卜該等醫藥組 157226.doc 201212936 合物在該個體之目標組織或細胞（例如，腦組織或神經元）中達到至少50 gg/ml、至少45 pg/ml、至少40 pg/ml、至少 35 pg/ml、至少 30 pg/ml、25 pg/ml 、20 pg/ml、至少 15

Pg/ml ' 至少 10 Mg/ml、至少 7.5 pg/ml、至少 5 pg/ml、至少2.5 pg/ml、至少i.o yg/mi或至少〇 5 μ§/ιη1之濃度。在某些貫施例中，醫藥組合物中之治療劑之濃度為至少1 〇〇 mg/mL、至少 95 mg/mL、至少 90 mg/mL、至少 80 mg/mL、至少 75 mg/mL、至少 70 mg/mL、至少 65 mg/mL、至少 60 mg/mL、至少 55 mg/mL、至少 50 mg/mL、至少 45 mg/mL、至少 40 mg/mL、至少 35 mg/mL、至少 30 mg/mL、至少 25 mg/mL、至少 20 mg/mL、至少 15 mg/mL、至少 10 mg/mL、至少 5 mg/mL、至少2·5 mg/mL、至少1 mg/mL或小於1 mg/mL。較佳地，該治療劑可溶於本發明醫藥組合物中。較佳地，本發明醫藥組合物在長時間内保持穩定（例如，在室溫下或另一選擇為在4°C至8°C之冷凍條件下穩定至少12個月）。儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。醫藥組合物係以治療有效量（即，在每隔一定時間投與時’藉由（例如）改善與疾病有關之症狀、預防或延遲該疾病發作、及/或亦降低疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病之劑量量，如上文所述）投與》本文所用治療有效量亦稱作治療有效劑量或治療有效劑量量◊可治療有 157226.doc •31· 201212936 效地治療疾病之劑量取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體内分析以有助於鑑別最佳劑量範圍，例如彼等在下文中例示者。擬採用之準確劑量亦視投與途徑、及疾病嚴重性而定，且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。例如，在一些實施例中，NAGLU之靜脈内投與治療有效量為NAGLU之腦脊髓膜内投與治療有效量的約1.5倍、約2 倍、約2.5倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5 倍、約5倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7.5 倍、約8倍、約8.5倍、約9倍、約9.5倍、約10倍或更多倍。有效劑量可自源自活體内或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推（例如，如由美國衛生和人類服務部食品藥品管理局及藥品評價與研究中心在「Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」，Pharmacology and Toxicology，2005年7月中所述，其全部内容以引用方式併入本文中）。在一些實施例中，治療有效量可為（例如）大於約〇·〇 1 mg/kg體重、大於約0.05 mg/kg體重、大於約0.1 mg/kg體重、大於約0.5 mg/kg體重、大於約1.0 mg/kg體重、大於約1.5 mg/kg體重、大於約2.0 mg/kg體重、大於約2.5 mg/kg體重、大於約5.0 mg/kg體重、大於約7.5 mg/kg體重、大於約10 mg/kg體重、大於約12.5 mg/kg體重、大於約15 mg/kg體重、大於約17.5 mg/kg體重、大於約20 157226.doc -32-

201212936 mg/kg體重、大於約22.5 mg/kg體重、或大於約25 mg/kg體重。在一些實施例中’治療有效量可為約0.〇 1 -25 mg/kg體重、約 0·(Η-20 mg/kg體重、約 0.01-15 mg/kg體重、約〇〇1_ 10 mg/kg體重、約0.01-7.5 mg/kg體重、約〇〇1_5 叫/“體重、約 0.01-4 mg/kg體重、約 0.01-3 mg/kg體重、約 0.01-2 mg/kg體重、約0.01-1.5 mg/kg體重、約〇 mg/kg體重、約0.01-0.5 mg/kg體重、約0.01-0.i mg/kg體重、約卜 20 mg/kg體重、約4-20 mg/kg體重、約 5-15 mg/kg體重、約5-10 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效量為約 0.01 mg/kg體重、約〇.〇5 mg/kg體重、約 mg/kg體重、約0.2 mg/kg體重、約〇3 mg/kg體重、約〇4 mg/kg體重、約0.5 mg/kg體重、約〇 6 mg/kg體重、約〇 7 mg/kg體重、約0.8 mg/kg體重、約〇9 mg/kg體重、約i 〇 mg/kg體重、約1.1 mg/kg體重、約12 mg/kg體重、約i 3邮心、約ι 4 mg/kg體重、約1>5 mg/kg體重、約i 6 mg/kg體重、約i 7 mg/kg體重、約i.8 mg/kg體重、約19體重、約 mg/kg體重、約2·5 mg/kg體重約3 〇吨㈣體重約（〇 mg/kg體重、約5 〇 mg/kg體重約6 〇體重約7 〇 mg/kg體重、約8.0 mg/kg體重、約 9.0 mg/kg體重、約 1〇.〇 gkg體重、約U·0 mg/kg體重、約12.0 mg/kg體重、約 13.0 mg/kg體重、約u 〇 mg/kg體重約15 〇體重、約 16·0 mg/kg體重、約 17.0 mg/kg體重、約 18.0 mg/kg體

重約19.0 mg/kg體重、約20.〇 mg/kg體重、或更高。一些實施例中，、、A /α療有效量不大於約3 0 mg/kg、不大於約 157226.doc •33- 201212936 20 mg/kg、不大於約15 mg/kg、不大於約1〇、不大於約7.5 mg/kg、不大於約5 mg/kg、不大於約4 mg/kg、不大於約3 mg/kg、不大於約2 mg/kg、或不大於約i mg/kg體重或更小。端視個體需要，用於特定個體之有效劑量可隨時間流逝而有所變化（例如，增加或降低p例如，在身體性疾病或應力情況下，或若抗NAGLU抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化’則可增加劑量量。在另一實例中，可在治療過程開始時給予負荷劑量（例如，初始較高劑量）之治療組合物，隨後投與降低之維持劑量（例如，後續較低劑量）之治療組合物。不期望受限於任何理論，預期負荷劑量會消除脂肪物質在組織中（例如，在肝中）之初始及（通常）大量積聚，且維持劑量可防止初始消除後脂肪物質之累積。應瞭解，治療之負荷劑量及維持劑量量、間隔、及持續時間可藉由任一可用方法來確定，例如彼等在本文中例示者及彼等在業内已知者。在一些實施例中，負荷劑量量為約 0.01-1 mg/kg體重、約 0.01_5 mg/kg體重、約〇〇11〇 mg/kg體重、約 o.mo mg/kg體重、約〇 12〇 mg/kg體重、約0.1-25 mg/kg體重、約(M-30 mg/kg體重、約〇 15叫〜體重、約(U-2 mg/kg體重、約ο」」mg/kg體重、或約〇卜 mg/kg體重。在-些實施例中，維持劑量量為約 mg/kg體重、約〇_5 mg/kg體重、約〇_2呵⑽體重約〇1 mg/kg體重、約0-0.5 mg/kg體重、約〇〇4 mg/kg體重約 -34- 157226.doc

201212936 0-0.3 mg/kg 體番、& Λ λ，重。在-g體重，〜㈣一實施例中，在給定時間（例如，丨、2、3 4 ::如8:9二:;27:更多個一心劑 ^ 5、6、7、8、9、 10、 15、 20、 25、3“更多劑量)下每隔一定時間向個體量，隨後投與維持劑量。在一些實施例中，維持劑量= 圍為0-2 mg/kg體重、約〇·15 m /k體重、約〇_1.〇〇1_體重、約0-0.75 mg/kg體重、約㈣5 mg/kg體重約Ο " mg/kg體重、約〇·〇.3 mg/kg體重、約〇〇2 mg%體重或約雄g體重。在一些實施例中，維持劑量為約 0.01、0.02、0.04、0.06、〇〇8、〇1、〇 2、〇 3、“、〇.5、〇.6、0·7、0.8、0.9、1〇、12、14、16 ι8 •、或 2.0 mg/kg體重。在一些實施例中’經卜2、3、4、5、6、 7、8、9、10、Π、12個月或更多個月投與維持劑量。在一些實施例中，經i、2、3、4、5、6、7、8、9、ι〇年或更多年投與維持劑量。在一些實施例中，無限期（例如，終生）投與維持劑量。本文所用之術語「組合療法」係指在重疊方案中投與兩種或更多種醫藥劑從而使個體同時暴露於兩種藥劑的彼等情形。可單獨、或結合其他藥劑投與NAGLU(或含有 NAGLU之組合物或藥劑），該等藥劑係（例如）抗阻胺藥（例如’苯海拉明（diphenhydramine))或免疫抑制劑（例如，考布他汀（combretastatin) A-4、黴酚酸、喷司他丁（pentostatin)、奈拉濱（nelarabine)或米托蒽醒（mitoxantrone))或抵抗抗 157226.doc •35· 201212936 NAGLU抗體之其他免疫治療劑。熟習此項技術者已知之任一免疫抑制藥劑可與本發明之組合療法一起使用。該等免疫抑制劑包括（但不限於）環孢素（cyclosporine)、FK506、雷帕黴素（rapamycin)、CTLA4-Ig、及抗TNF劑，例如依那西普（etanercept)(例如，參見 Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284 Nevins，2000，Curr. Opin. Pediatr. 12，146-150 ; Kurlberg等人，2000，Scand. J. Immunol. 51，224-230 ; Ideguchi等人， 2000，Neuroscience 95, 217-226 ; Potter等人，1999，Ann. Ν·Υ_ Acad. Sci. 875，159-174 ; Slavik等人，1999, Immunol. Res. 19, 1-24 ; Gaziev等人，1999，8〇!16厘&1*1>〇从1^113卩13111:.25，689-696 ; Henry，1999，Clin. Transplant. 13，209-220 ; Gummert等人，1999, J. Am. Soc· Nephrol. 10，1366-1380 ; Qi等人，2000, Transplantation 69, 1275-1283)。抗 IL2 受體（α 亞單位）抗體達克珠單抗（daclizumab)(例如赛尼 °底 TM. (Zenapax.TM.))已證實可有效用於移植患者中，其亦可用作免疫抑制藥劑 (例如，參見Wiseman等人，1999，Drugs 58，1029-1042 ; Beniaminovitz等人，2000，N. Engl J. Med. 342，613-619 ; Ponticelli等人，1999, Drugs R. D. 1，55-60 ; Berard等人，1999, Pharmacotherapy 19， 1127-1137 ; Eckhoff 等人，2000,

Transplantation 69，1867-1872 ; Ekberg等人，2000，1^118卩1.1111;· 13，151-159)。額外免疫抑制劑包括但不限於抗CD2(Branco 等人，1999，Transplantation 68，1588-1596 ; Przepiorka等人， 1998，Blood 92，4066-4071)、抗 CD4 (Marinova-Mutafchieva 等 157226.doc -36- ⑧ 201212936 人，2000，Arthritis Rheum· 43，638-644 ; Fishwild等人，1999, Clin. Immunol. 92，138-152)、及抗CD40配體(Hong等人，2000, Semin. Nephrol· 20，108-125 ; Chirmule等人，2000，J. Virol. 74, 3345_3352 ; Ito等人，2000, J. Immunol. 164, 1230-1235)。術語「結合」表示藥劑在NAGLU(或含有NAGLU之組合物）之前、大致同時、或之後投與。例如，可將藥劑混合至含有NAGLU之組合物中，且由此與NAGLU同時投與；另一選擇為，可在並不混合之情形下同時投與藥劑（例如，藉由在亦投與NAGLU之靜脈線上「借道」遞送藥劑，或反之亦然）。在另一實例中，可單獨（例如，並不混合）、但在投與NAGLU後短時間範圍内（例如，在24小時内）投與藥劑。在一些實施例中，結合經設計以減小抗 NAGLU抗體之量、或預防其產生之免疫抑制或免疫治療方案來投與NAGLU(或含有NAGLU之組合物）。例如’可使用與彼等用於血友病患者中之方案（Nilsson等人，（1988) N. Engl. J. Med.，318:947-50)類似之方案來減少抗NAGLU 抗體。此一方案可用於具有抗NAGLU抗體或處於具有抗 NAGLU抗體之風險中的個體中。在一些實施例中，免疫抑制或免疫治療方案開始於首次投與NAGLU之前以將產生抗NAGLU抗體之可能性降至最低。熟習此項技術者已知之免疫抑制藥劑的任一組合皆可與本發明組合療法一起使用。套組本發明提供套組或其他製品’其含有本發明調配物並提 157226.doc • 37- 201212936 供其復原（若凍乾）及/或使用之說明。套組或其他製品可包括容器。適宜谷器包括（例如）瓶子、小瓶、及注射器。容器可自諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。容器可容納調配物，且位於容器上、或與其連接之標籤可指示復原及/或使用之說明。例如，標籤可指示將調配物復原至上述蛋白質濃度。標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於（例如）it投與。容納調配物之容器可為多用途小瓶，該多用途小瓶容許重複投與（例如，投與2-6次）調配物。套組或其他製品可進一步包括含有適宜稀釋劑（例如，BWFI)之第二容器。將稀釋劑及調配物混合後，復原調配物中之最終蛋白質濃度通常為至少25 mg/ml (例如，至少25 mg/ml、至少50 mg/ml、至少75 mg/ml、至少1〇〇 mg/mi)。套組或其他製品可進一步包括自商業及使用者角度考慮合宜之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器、及具有使用說明之包裝插頁。藉由參照下列實例來更全面地理解本發明。然而，該等實例不應解釋為限制本發明範圍。所有文獻引文皆以引用方式併入本文中。儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞厂 (a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一 157226.doc -38- 201212936 個、-個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的—或夕個成員間包& 的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有-個群組成員存在於、用於…疋產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發月亦^括其中—個以上或所有的群組成員皆存在於、用於…定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。此外’應瞭解，除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將—或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等引人附屬於相同基礎技術方案（或任—其他相關技術方案）之另一技術方案中的所有變化組合及置換。如果、列表$式（例如，以馬庫西群組（Markush gr0Up)或類似格式）給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之者景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。實例 157226.doc -39· 201212936 實例1 : rhNaglu及Naglu融合蛋白之表現此實例展示意欲經由腦脊髓膜内注射直接投與至B型聖菲利波患者之中樞神經系統的重組人類Naglu蛋白質之研發。 B型聖菲利波係由α-Ν-乙醯基-葡萄糖胺酶（Naglu)缺陷造成之體染色體隱性遺傳病症。Naglu係在硫酸肝素降解途徑中自寡糖移除非還原末端之酵素。編碼Naglu之人類基因具有六個在染色體17q21.1上跨越8.2kb長之外顯子。人類Naglu在細胞中合成為含有信號肽之743胺基酸前體。 Naglu之全長胺基酸序列提供於下表1中：表1

MEAVAVAAAVGVLLLAGAGGAAGDEAREAAAVRALVARLLGP

GPAADFSVSVERALAAKPGLDTYSLGGGGAARVRVRGSTGVA

AAAGLHRYLRDFCGCHVAWSGSQLRLPRPLPAVPGELTEATPN

RYRYYQNVCTQSYSFVWWDWARWEREIDWMALNGINLALA

WSGQEAIWQRVYLALGLTQAEINEFFTGPAFLAWGRMGNLHT

WDGPLPPSWHIKQLYLQHRVLDQMRSFGMTPVLPAFAGHVPE

AVTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSYSCSFLLAPEDPIFPIIGSLF

LRELIKEFGTDHIYGADTFNEMQPPSSEPSYLAAATTAVYEAMT

AVDTEAVWLLQGWLFQHQPQFWGPAQIRAVLGAVPRGRLLVL

DLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCMLHNFGGNHGLFGALEAVN

GGPEAARLFPNSTMVGTGMAPEGISQNEVVYSLMAELGWRK

DPVPDLAAWVTSFAARRYGVSHPDAGAAWRLLLRSVYNCSGE

ACRGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWYNRSDVFEAWRLLLTSAPSL 157226.doc -40- ⑧ 201212936 ATSPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLYYEEARSAYLSKELASLLRA GGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGSWLEQARAAAVSEAEADF YEQNSRYQLTLWGPEGNILDYANKQLAGLVANYYTPRWRLFL EALVDSVAQGIPFQQHQFDKNVFQLEQAFVLSKQRYPSQPRGD TVDLAKKIFLKYYPRWVAGSW (SEQ ID NO:l) 在蛋白質進入内質網時移除23胺基酸信號肽。將所得成熟Naglu蛋白質分選至其中發生硫酸肝素之酵素降解之溶酶體或分泌至細胞外間隙中6成熟重組人類Naglu在未糖基化情況下之分子量係80.2 kDa且在糖基化之添加重量情況下為約93.4 kDa。胺基酸殘基1-23經解離之成熟Naglu蛋白質序列提供於下表2中。表2

DEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVSVERALAAKPGLDTYS

LGGGGAARVRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFCGCHVAWSGSQ

LRLPRPLPAVPGELTEATPNRYRYYQNVCTQSYSFVWWDWAR

WEREIDWMALNGINLALAWSGQEAIWQRVYLALGLTQAEINE

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RSFGMTPVLPAFAGHVPEAVTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCSY

SCSFLLAPEDPIFPIIGSLFLRELIKEFGTDHIYGADTFNEMQPPS

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AQIRAVLGAVPRGRLLVLDLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCML

HNFGGNHGLFGALEAVNGGPEAARLFPNSTMVGTGMAPEGIS

QNEVVYSLMAELGWRKDPVPDLAAWVTSFAARRYGVSHPDA

GAAWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWYN 157226.doc -41 - 201212936 RSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLYY EEARSAYLSKELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLLGS WLEQARAAAVSEAEADFYEQNSRYQLTLWGPEGNILDYANKQ LAGLVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQGIPFQQHQFDKNVFQLE QAFVLSKQRYPSQPRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVAGSW (SEQ ID NO:2) 為產生重組人類Naglu (rhNaglu)，將人類Naglu cDNA插入表現載體中並轉染至HT1080細胞系中。使用Naglu酵素活性分析篩選高表現HT1080純系。由表現Naglu之HT1080 細胞產生之分泌蛋白質係人類Naglu之成熟形式。由 HT1080細胞產生之重組人類Naglu經糖基化。rhNaglu對合成受質4-MU-N-乙醯基(X-D-胺基葡萄糖苷完全具有活性。

重組Naglu與分離自天然來源（例如尿、胎盤及肝）之 Naglu之間的最顯著差別係無甘露糖-6-磷酸鹽聚多糖 (M6P)。重組Naglu中無M6P已由若干研究者於源自CHO及 HEK 293細胞之rhNaglu的研究中報導。亦發現表現 rhNaglu之HT1080失去M6P聚多糖。重組Naglu中無M6P之機制尚未知。本發明者已研發若干融合蛋白及聚多糖修飾，試圖克服在重組Naglu中細胞遞送之M6P依賴（圖1-3)。 Naglu-TAT 將Naglu之融合蛋白及HIV之蛋白質轉導結構域命名為 Naglu-TAT。設計及產生、並純化Naglu-TAT。已顯示TAT 肽有利於蛋白質經過細胞膜轉導進入細胞質中。先前已展示，與溶酶體酵素β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS-TAT)融合之 157226.doc • 42· ⑧ 201212936 TAT肽在IV注射於MPS VII小鼠後在腎中產生比GUS更大之溶酶體貯積減少（Grubb JH 等人，Rejuvenation Research 13··2，2010)。單獨實驗展示與rhNaglu相比，B型聖菲利波患者成纖維細胞中之Naglu-TAT的細胞吸收得以改良（數據未顯示）。然而，活體内生物分佈研究指示在IT注射時， Naglu-TAT顯示與rhNaglu類似之生物分佈且僅輕微改良細胞吸收。在此研究中，大多數蛋白質留在腦脊髓膜中，極有限滲透至腦實質中。此結果指示TAT肽-介導之遞送不足以替代Naglu之受體介導之細胞吸收。

Naglu Kif

Naglu-Kif係藉由使用向培養基中添加幾夫鹼 (Kifunensine)之經修飾細胞培養方法來產生。提出並產生及純化Naglu-Kif。添加幾夫鹼改變了 rhNaglu之糖基化途徑以增強高甘露糖聚多糖之產生並阻抑複雜碳水化合物之添加。幾夫驗抑制Golgi α-甘露糖酶I活性，且由此抑制高甘露糖聚多糖之移除，從而導致阻抑複雜聚多糖之偶合。因此，Naglu-Kif主要含有高甘露糖聚多糖。使用源自巨噬細胞之細胞系的細胞吸收確認Naglu-Kif具有甘露糖受體依賴性吸收。然而，活體内實驗指示在經腦脊髓膜内注射於野生型插管大鼠之腦脊髓液中時，Naglu-Kif不能顯示比 rhNaglu改良之於腦實質中之分佈。可推斷Naglu-Kif之甘露糖受體介導之吸收並不會促進rhNaglu於CNS中之遞送。 Naglu-ApoE

ApoE(載脂蛋白E)之受體結合結構域融合至Naglu之C-末 157226.doc -43- 201212936 端以利用低密度脂蛋白受體（LDLR)用於Naglu之細胞吸收。此方法係基於支持在BBB處存在LDLR之研究（Begley DJ等人，Current Pharmaceutical Design, 2008，14，1566-1580)。初步小鼠活體内研究指示於B型聖菲利波小鼠中靜脈内投與Naglu-ApoE並不轉運至腦中， rhNaglu之IV投與實施活體内實驗以研究通過BBB轉運之rhNaglu及Naglu-IGFII。該研究指示rhNaglu及Naglu-IGFII IV投與至B型聖菲利波小鼠中在腦中不產生任何酵素，且未在經治療小鼠之腦中發現組織病理學改良。

Naglu-IGFII 藉由將一部分胰島素樣生長因子II序列（aa 8至67，8-67IGFII)與Naglu序列之C-末端融合來構造Naglu-IGFII。與全長IGFII分子相比，報導8-67IGFII以高2-10倍之親和力與M6P/IGF II受體結合，同時其結合IGF I受體之能力減少到 l/30(Hashimoto R，JBC 1995 270(30):18013-18018)。

Naglu-IGFII分子含有插在Naglu與8-67IGFII之間之連接體序列。此連接體序列由三個串聯重複「GGGGGAAAAGGGG」與側接每一端之兩個「GAP」序列及每一重複之間一個「GAP」序列組成。連接體之實際序列提供於下表3中：表3 :連接體序列

Naglu-GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGG AAAAGGGGGAP-IGFII (SEQ ID NO:3) 157226.doc ⑧ 201212936 為產生重組Naglu-IGFII融合，將cDNA插入表現載體 pXD071中並轉染至人類成纖維細胞系甲。重組Naglu-IGFII融合蛋白之蛋白質序列提供於下表4中：表4:重組Naglu-IGFII融合蛋白之蛋白質序列 DEAREAAAVRALVARLLGPGPAADFSVSVERALAAKPGLDT YSLGGGGAARVRVRGSTGVAAAAGLHRYLRDFCGCHVAWSGS QLRLPRPLPAVPGELTEATPNRYRYYQNVCTQSYSFVWWDWA RWEREIDWMALNGINLALAWSGQEAIWQRVYLALGLTQAEIN EFFTGPAFLAWGRMGNLHTWDGPLPPSWHIKQLYLQHRVLDQ MRSFGMTPVLPAFAGHVPEAVTRVFPQVNVTKMGSWGHFNCS YSCSFLLAPEDPIFPIIGSLFLRELIKEFGTDHIYGADTFNEMQPP SSEPSYLAAATTAVYEAMTAVDTEAVWLLQGWLFQHQPQFWG PAQIRAVLGAVPRGRLLVLDLFAESQPVYTRTASFQGQPFIWCM LHNFGGNHGLFGALEAVNGGPEAARLFPNSTMVGTGMAPEGI SQNEVVYSLMAELGWRKDPVPDLAAWVTSFAARRYGVSHPD AGAAWRLLLRSVYNCSGEACRGHNRSPLVRRPSLQMNTSIWY NRSDVFEAWRLLLTSAPSLATSPAFRYDLLDLTRQAVQELVSLY YEEARSAYLSKELASLLRAGGVLAYELLPALDEVLASDSRFLL GSWLEQARAAAVSEAEADFYEQNSRYQLTLWGPEGNILDYAN KQLAGLVANYYTPRWRLFLEALVDSVAQGIPFQQHQFDKNVF QLEQAFVLSKQRYPSQPRGDTVDLAKKIFLKYYPRWVAGSWG APGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGG GGGAAAAAGGGGGGAPLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPAS RVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE (SEQ ID NO:4) 157226.doc -45- 201212936 使用Naglu酵素活性分析篩選高表現HT1080純系。為進一步增加Naglu-IGFII之表現，再次用具有相同轉錄單元之另一表現質粒轉染所選細胞系。在單一轉染及雙重轉染細胞系二者中，所分泌Naglu-IGFII含有全長成熟Naglu序列及全長8-67IGFII » Naglu-IGFII融合蛋白顯示對相同合成受質4-MU-N-乙醯基α-D-胺基葡萄糖苷具有酵素活性。圖 4-6繪示使用雙重轉染Naglu-IGFII細胞系之實例性波產生試驗。提供於圖4中之此Naglu-IGFII細胞系之波產生達到 0.5 pcd(皮克/百萬細胞/天）Naglu-IGFII。 rhNaglu及 Naglu-IGFII之純化對 rhNaglu、Naglu-IGFII、Naglu-ApoE及 Naglu Kif施用類似純化方法《對Naglu-TAT施用經改良純化方法》下文概述rhNaglu及Naglu-IGFII蛋白質之純化。對於rhNaglu及Naglu-IGFII之純化而言，採用三步方法 (圖7) ^首先，使用超濾（UF)裝置濃縮條件化培養基《隨後將濃縮培養基依次施加至丁基瓊脂糖凝膠層析管柱（Butyl) 及Q瓊脂糖凝膠層析管柱（Qp將純化蛋白質之緩衝劑更換為PBS之調配物（11.9 mM磷酸鈉、2.7 mM磷酸鉀、137 mM 氯化納，於pH 7.4下）用於儲存。純化rhNaglu及Naglu-IGFII分別具有99°/。及95%之純度0，如由反相高壓液相層析所評價（數據未顯示）。 rhNaglu及Naglu-IGFII之生物化學性質所有 Naglu 變體、rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFII、 Naglu-Kif及Naglu-ApoE均呈現對合成受質4·曱基傘形酮 157226.doc • 46 · ⑧ 201212936 基-N-乙醯基-a-D-胺基葡萄糖苷類似之生物活性。所有變體均對於磷酸化糠基化呈陰性，如由經由高效陰離子交換層析之聚多糖分析及單糖分析所測定。以下章節僅概述rhNaglu及Naglu-IGFII之生物化學性質 (表5)。如表5中可見，rhNaglu與Naglu-IGFII之生物化學比較指示兩種蛋白質之間具有類似酵素活性及穩定性。針對 rhNaglu由差示掃描量熱法測定之熱穩定性的最佳pH係pH 5-pH 6.5，且針對Naglu-IGFII 係 pH 6 至 pH 6.5。此結果與需要溶酶體水解酶以呈現溶酶體在酸性環境中之最佳穩定性一致。表5: rhNaglu及Naglu-IGFII之生物化學比較表現系統 HT 1080細胞調配物(PBS) 11.9mM填酸納， 2.7 mM填酸卸 137 mM氣化納，於pH 7.4下溶解性限制 16.5 mg/mL ； rhNaglu 26 mg/mL ； Naglu-IGFII 酵素活性 Km =0.3 mM ； rhNaglu Km =0.2 mM ； Naglu-IGFII 熱穩定性之最佳pH 5- 6.5 ； rhNaglu 6- 6.5 ； Naglu-IGFII 天然締合狀態三聚體(MALS及AUC) (rhNaglu之晶體結構） M6P糖基化陰性

另外，成功地將Naglu-IGFII濃縮至如由Bradford蛋白質分析所測定之26 mg/ml，且在4°C下儲存高達3個月後無聚集或活性損失之跡象。亦針對Naglu-IGFII調配物測試5 mM 157226.doc -47- 201212936 磷酸鈉（pH 6.5)、150 mM氯化鈉、0.005%聚山梨醇酯20之調配物（例如，用於IT投與）。在PBS調配物及IT調配物中之Naglu-IGFII之間觀察到類似穩定性及溶解性（數據未顯示）。

Naglu之晶邀結構 rliNaglu之研發中之一個突破係由PEPR確定Naglu之晶體結構。此成就使得洞悉Naglu之結構，且幫助預測蛋白質穩定性及調配物需要。預期對B型聖菲利波患者在Naglu之 3D結構上之突變的對齊將為藥物研發提供啟示及工具。晶體（圖8)係自rhNaglu蛋白質獲得，該蛋白質係自經甘露糖酶-I抑制劑（即幾夫鹼）處理之培養基純化得^ Naglu Kif含有與rhNaglu —致之蛋白質序列，但糖基化模式不同。使獲得之NagluKif之晶體在pH=7·5下生長並以2.4A 解析度藉由X射線結晶學解析Naglu Kif之結構。Naglu結構（圖9)指定為具有三種不同結構域：N-末端結構域（結構域-I ’ aa 24-126)，之後含有催化性麩胺酸鹽之（α/β)8桶狀結構域（結構域-II ’ aa 127-467)及全螺旋狀C-末端結構域 (結構域-III，aa 468-743)另一葡糖苷水解酶家族·89蛋白質（cpGH89，其係Naglu之細菌同系物）觀察到類似結構域結構（Ficko-Blean E 等人，PNAS，2008 年 5 月 6 日，第 1〇5 卷’第18號，6560-6565)。活性位點係在結構域^與出之間之裂縫處且將催化性殘基指定為位於結構域II上之Μ16 及 E446 〇可在晶體結構中看到Naglu分子之密集堆積之對稱三聚 -48· 157226.doc ⑧ 201212936 體佈置（圖10)，其與自分析型超離心（AUC)及尺寸排除層析與在線多角度光散射（SEC-MALS)實驗觀察之天然締合狀態一致。結構域II中之疏水相互作用及氫鍵保持蛋白質之三聚體構象。在三聚合期間，H227似乎與毗鄰分子之 R297形成堆疊相互作用。另外，E302與K301形成分子間氫鍵結相互作用。

Naglu具有六個潛在N-糖基化位點（N261、N272、 N435、N503、N526及N532)且晶體結構中之所有六個位點均經糖基化。在2.4 A解析度下之電子密度圖中看到兩個附接至N272及N43 5中之每一者之NAG分子及一個各自附接至N261、N503、N526及N532之NAG分子的清晰電子密度。聚多糖結構之剩餘部分因溶劑暴露糖部分之撓性性質而在電子密度圖中不清晰可見。

Naglu之結構資訊有助於Naglu之穩定性分析及分子級表徵。Naglu中有八個半胱胺酸，其中之四個形成兩個二硫鍵（Cys273-Cys277及Cys504-Cys509)。即使在純化及結晶過程中未使用還原劑，另外四個C97、C99、C136及C405 亦作為晶體結構中之還原半胱胺酸出現。C97及C99彼此靠近且在表面附近部分暴露。然而，C136及C405係埋藏的且不可能形成基於該結構之分子間二硫鍵。預期基於目前獲得之結構資訊，B型聖菲利波患者突變之繪圖將為針對此疾病之未來藥物研發潛力（例如小分子伴侣蛋白之合理設計）提供線索。在晶體結構上繪示文獻 (Yogalingam 2001)中報告之嚴重San B突變。幾個突變簇 157226.doc -49· 201212936 可與结構或功能區有關’例如活性位點、結構域-ΠΙ中含有三個糖基化位點之路、及三個結構域之間之介面（圖 1〇)<>另外，可在Ν端結構域-I及C端螺旋束狀結構域-III中看到突變簇。發生突變之該等殘基的大多數係氫鍵結及其他非共價相互作用之部分且涉及NaSlu之結構穩定。實例2 : rhNaglu及Nag丨u-IGFII之活艘外研究使用B型聖菲利波患者成纖維細胞之兩種品系GM02391 (P359L)及GM 01426 (E153K)以及正常人類成纖維細胞系來研究Naglu變體中每一者之細胞吸收機制。由於M6P受體在細胞系上之表現，傳統上研究者使用成纖維細胞來研究溶酶體酵素細胞吸收。細胞吸收研究係藉由將成纖維細胞與rhNaglu或Naglu-IGFII在37°C下一起培育4小時來實施。在培育後洗滌並溶解細胞，並量測細胞溶解物中之Naglu酵素活性。將 rhNaglu與成纖維細胞一起培育在細胞内產生幾乎不可檢測量之酵素。相反，將Naglu-IGFII與成纖維細胞一起培育在細胞内產生大量酵素（圖11)。内在化Naglu-IGFII之量隨用於培育之酵素之量增加而達到飽和。劑量依賴性飽和吸收係受體介導之細胞吸收之典型發現。此外，Naglu-IGFII 之内在化並不受外源M6P抑制，但外源IGFII可完全抑制 (圖11)。此結果表明，將Naglu-IGFII内在化至成纖維細胞中以非糖基化依賴性方式依賴於M6P/IGFII受體》亦實施實驗來研究rhNaglu及Naglu-IGFII至溶酶體之運輸。使用B型聖菲利波患者成纖維細胞（GM01426)來進行 157226.doc -50- 201212936 該研究。藉由在首先將蛋白質與細胞一起培育後用抗人類 Naglu多株抗體將細胞染色來檢查對沌⑽&及Naglu_IGFn 之檢測。使用對LAMP-1 (溶酶體相關膜蛋白丨）之免疫螢光染色來檢測溶酶體。藉由共焦顯微術來 IGFII與溶酶體之共定位可視化（圖12)。在將蛋白質與細胞一起培育4小時後觀察到NaghdGFn 之廣泛内在化’從而證實了 Naglu-IGFII與溶酶體之共定位。反之，rhNaglu在相同時間範圍内未顯示内在化，且未觀察到與溶酶體共定位》此結果進一步證明，Nagiu_ IGFII内在化至細胞中並轉蓮至正確的細胞房室（即溶酶體）中。内在化Naglu-IGFII在B型聖菲利波患者成纖維細胞中之半衰期經測定為1.5天（數據未顯示）。實例3:在小鼠模型中之活趙内研究野生型（wt)插管大鼠除了 B型聖菲利波小鼠模型以外，亦使用…插管大鼠（非缺陷型動物模型）來進行活體内分子篩選。wt插管大鼠已在脊髓之腰上區及胸下區以手術方式植入插管，並經由插管單次注射35 μΐ至CSF中。使用此動物模型實施分子篩選所評定之標準係腦及脊髓之Naglu活性分析及免疫組織化學。 B型聖菲利波小鼠模型 B型聖菲利波小鼠模型（Naglu-/-小鼠，B型聖菲利波小鼠）係由E. Neufeld及同事產生（Li HH等人，PNAS 96(25): 14505-145 1 0 ; 1999)。小鼠 Naglu基因之外顯子 6 因 157226.doc •51- 201212936 插入選擇標記新黴素抗性基因而中斷。所得純合體Naglu_/_ 小鼠係完全Naglu缺陷（圖13)，且在肝及腎中具有完全gag 積聚。儘管Naglu完全缺陷，但該等小鼠通常健康且壽命為8 12個月。其他溶酶體酵素表現之變化發生在約5個月齡，該等變化包括卜半乳糖苷酶、α_葡糖苷酶、葡萄糖醛酸苷酶及β-己糖胺酶在肝及腦中之補償性增加，a_L_艾杜糖醛酸酶在肝而非腦中之增加，及神經胺酸酶在肝及腦中之減少。通常係因尿瀦留及尿垮感染而導致死亡。文獻中已廣泛研究B型聖菲利波小鼠模型以描述B型聖菲利波病理學變化。與Naglu_/·小鼠之CNS病理學相關之表型報導為在4.5個月齡時之活動減退，但在其他年齡亦觀察到活動過度。

Naglu-/-小鼠中之神經病理學變化闡述為在神經元、巨噬細胞及上皮細胞中藉由EM(電子顯微術）觀察到之空泡及包涵體。該等病理學變化通常在33日齡開始，且隨著動物變老而日益惡化。藉由組織病理學分析亦顯示激活星形細胞及小神經膠質細胞。兩種神經節苷脂GM2& GM3之生物化學分析顯示在腦中增加5倍及9倍。（由於GM2及GM3並非Naglu之直接受質，且可能難以證實其在ERT後短期時間内顯著降低’故不使用其作為p〇C之端點生物標記）。生物化學分析係藉由量測Naglu酵素活性及GAG含量來實施，組織學分析係藉由抗人類Naglu抗體、抗LAMp_ 1抗體、抗Iba-1抗體及抗GFAP抗體免疫組織化學來實施。用於此研究之抗人類Naglu抗體係不結合wq、鼠中之内源鼠 157226.doc ,52, ⑤ 201212936 類Naglu或B型聖菲利波小鼠中之突變Nagiu之小鼠單株抗體。LAMP-1免疫染色使用與溶酶體膜蛋白、溶酶體相關膜蛋白-1結合之抗體。Iba-l染色使用與對小神經膠質細胞及巨噬細胞具有特異性之離子化鈣結合轉接蛋白結合之抗體GFAP柒色使用結合對星形細胞具有特異性之神經膠質纖維酸性蛋白之抗體。藉由顱内（1C)注射至B型聖菲利波小鼠中進行之活體内生物活性篩選此研究之目的係評價Naglu酵素之活體内生物活性。在此研究中，經由1C注射將蛋白質投與至B型聖菲利波小鼠之腦中。研究用B型聖菲利波小鼠之年齡密切匹配為8週齡。1C注射途徑提供最佳狀況以評價分子之功效。藉由被吸收至神經元細胞中及減少溶酶體貯積之能力來評定

Naglu蛋白質。使用免疫組織化學來評定生物分佈。且使用LAMP-1免疫染色藉由陽性染色之數量及尺寸來表徵溶酶體貯積。 1(：注射係藉由經由B型聖菲利波小鼠之顱骨直接注射至右側大腦皮質中來實施。每只動物注射2微升或35 Naglu蛋白質。在注射後第7天屠宰動物。在先導研究中預先確定屠宰時間，其中在注射後3、7及14天屠宰動物。根據先導研究確定，注射後7天係進行免疫組織化學研究之最佳時間。橫向切割腦切片（圖14)，且實施]^叫111及1^〇11)_ 1免疫染色。在經rhNaglu及Naglu-IGFII治療之B型聖菲利波小氣中，藉由免疫組織化學使用抗人類Naglu抗體顯示 157226.doc -53- 201212936 細胞吸收至神經元及神經膠質細胞二者中（圖14_16)。觀察到在經rhNaglu與Naglu-IGFII治療之Β型聖菲利波小鼠之間，關於細胞吸收無顯著差異。另外，經rhNaglu&Nagh· IGFII治療之小鼠二者中腦組織之LAMp-丨免疫染色顯示溶酶體貯積顯著降低。在經rhNaglu及Naglu-IGFII治療之群組二者中，溶酶體貯積之降低量幾乎與正常wt小鼠之量相同。在 NaglU-TAT、Nagiu_KifAPerT_Naglu 測試之 B型聖菲利波小鼠中，在IC注射後亦觀察到溶酶體貯積之降低（數據未顯示）。此研究證實所有Nag丨u變體之活體内生物活性。在一單獨研究中，向Naglu缺陷型小鼠it投與媒劑或一次、兩次或三次每週劑量之存於PBS中之重組Naglu_IgF_I]t 融合蛋白構建物（Naglu)。未經治療之野生型群組小鼠用作未經治療之野生型對照且投與無Naglu媒劑。在最終注射後24小時屠宰小鼠，之後製備組織以供免疫組織化學 (IHC)及組織病理學分析。在IT投與重組Naglu後’ Naglu在Naglu缺陷型小鼠腦組織中之分佈很明顯。如圖17A所示，將重組Naglu IT投與 Naglu缺陷型小鼠可使白質組織中之細胞空泡形成相對於 IT投與媒劑之Nagiu缺陷型小鼠廣泛降低。類似地，且如圖1 7B中所示’形態測定分析揭示，在經治療小鼠白質組織中之LAMP1免疫染色相對於未經治療之Nagiu缺陷型小鼠顯著降低’由此反映疾病病理學之改良。如圖18 A-B中所示’在所評價腦組織之每一區域（皮質、 157226.doc -54-

201212936 尾狀核及豆狀核殼（CP)、丘腦（ΤΗ)、小腦（CBL)及白質 (WM))中，在經Naglu治療之小鼠中LAMP陽性區域相對於未經治療之Naglu缺陷型對照小鼠有所減小，且近似於野生型小鼠之LAMP陽性區域。尤其值得注意，在所分析腦組織之每一區域中，在IT投與兩次或三次劑量之Naglu後 (圖1 8B)，LAMP陽性區域相對於單次劑量（圖1 8A)進一步減小。該等結果亦確認，IT投與之Naglu能夠改變Naglu缺陷型小鼠模型中溶酶體貯積症（例如B型聖菲利波症候群）之進展，從而進一步確認IT投與之酵素（例如Naglu)治療與溶酶體貯積症（例如B型聖菲利波症候群）有關之CNS表現之能力。藉由腦脊髓膜内（IT)注射至wt插管大鼠中進行分子篩選此研究直接模擬用於藥物投與之座介導方法。Naglu蛋白質係經由IT注射投與wt插管大鼠以測定至腦實質中之生物分佈。該等動物中之插管係置於脊髓之高位腰部及低位胸部中 (圖19)。經由插管向動物注射35 μΐ或385 pg rhNaglu、 Naglu-TAT、Naglu-IGFII及PerT-Naglu(由於溶解性限制，僅以38.5 pg注射Naglu Kif，其係其餘Naglu之十分之一）。在注射後4 hr及24 hr進行屠宰。採集腦及脊髓組織並藉由Naglu活性分析進行量測。在經治療動物之腦中，經Naglu-TAT及Naglu-IGFII治療之動物呈現之活性高於經rhNaglu及所有其他Naglu變體治療之 157226.doc -55- 201212936 動物（圖20)。作為一般趨勢，對於所有經治療動物，Naglu 在脊髓中之活性皆顯著高於在腦中（數據未顯示）。此現象可表明，吸收位點距離IT注射位點愈近，蛋白質吸收愈強。免疫組織化學分析表明，在IT注射後24 hr，Naglu-IGFII治療群組在腦中之生物分佈比所有其他Naglu變體治療群組更廣泛（圖2 1及22)。在經rhNaglu治療之動物中，僅在腦之腦脊髓膜中觀察到該蛋白質。在脊髓切片中，IHC 顯示rhNaglu在灰質神經元中有一定細胞吸收，但吸收程度遠低於Naglu-IGFII在脊髓神經元中之吸收（數據未顯示）。在Naglu-TAT IT注射群組中，即使藉由生物化學分析在腦組織中觀察到最高Naglu活性，但IHC顯示除了保持在腦脊髓膜上以外，無任何Naglu-TAT滲透至腦實質中。除了 Naglu-IGFII，所有其他Naglu變體皆未顯示在腦脊髓膜以外之生物分佈，從而有力地證實了在IT注射後Naglu在腦中之細胞吸收對M6P/IGFII受體之依賴性。此研究意味著 Naglu-IGFII係用於B型聖菲利波之藥物研發之首要分子。實例4:使用Naglu-IGFII之概念性驗證研究實驗設計概念性驗證研究經設計以同時顯示在B型聖菲利波小鼠中在IT注射Naglu-IGFII後溶酶體貯積之生物分佈及逆轉。在此研究中，藉由IT注射Naglu-IGFII來治療3個群組之8週齡B型聖菲利波小鼠。每次IT注射具有10 μΐ體積或260 -56- 157226.doc ⑧ 201212936

Naglu-IGFII。有3個經治療群組，即lx注射群組、2x注射群組及3x注射群組。在lx注射群組中，在第〇天投與單次劑量之蛋白質。在注射後24 hr屠宰動物。在2x注射群組中’在第0天及第7天投與兩次IT注射，且在最後一次注射後24 hr署宰動物。在3x注射群組中，在第〇天、第7天及第 14天投與IT注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰動物。亦包括經媒劑治療小鼠之3個群組。在媒劑對照群組中，以與經治療群組相同之時間間隔向Β型聖菲利波小鼠注射媒劑並以與經治療群組相同之方式屠宰動物。應用生物化學及組織學分析二者來評價研究結果。生物化學分析包括Naglu活性分析以量測酵素在組織中之量，且包括總GAG分析以評價溶酶體貯積之降低。肝及腦係生物化學分析之兩個受試組織（圖23及24)。组織學分析包括組織之H&E染色以供形態評價（數據未顯示），且包括使用抗人類Naglu抗體、LAMP、Iba及GFAP之免疫組織化學染色（Iba及GFAP染色之數據未顯示）。用於此研究之抗人類Naglu抗體係不結合wt小鼠中之内源鼠類Naglu或B型聖菲利波小鼠中之突變Naglui小鼠單株抗體。LAMP-1免疫染色使用結合溶酶體相關膜蛋白之抗體Iba-1染色使用結合對小神經膠質細胞及巨嗟細胞具有特異性之離子化鈣結合轉接蛋白之抗體。GFAp染色使用結合對星形細胞具有特異性之神經膠質纖維酸性蛋白之抗體。

Naglu免疫螢光之代表性顯微照片展示於圖乃中。腦之 157226.doc •57· 201212936 實例性區域繪示於圖26中。即使檢測到Naglu-IGFII進入靠近腦脊髓膜之大腦皮質中，但在諸如尾狀核、丘腦及白質等皮質下區域中未發現Naglu-IGFII(數據未顯示p由於對相同皮質下區域之LAMP-1、Iba-1及GFAP免疫染色確實顯示溶酶體貯積逆轉’人們相信Naglu在深層腦區域中之陰性免疫染色可能係由於Naglu免疫螢光之靈敏性所致。

Lamp-Ι免疫染色之代表性顯微照片展示於圖27_31中。為顯示蛋白質分佈及功效之程度，選擇大腦皮質及皮質下區域（例如尾狀核、丘腦及白質）及小腦皮質進行免疫組織學分析。Iba-Ι及GFAP免疫染色（數據未顯示）之結果表明’在LAMP-1免疫染色中所觀察到者係小神經膠質細胞及星形細胞之變化之組合效應，據報導在B型聖菲利波小鼠模型中除神經元外該兩種細胞類型亦受影響（Li 2〇〇2, Ohmi 2002)。由於技術限制，LAMP-1免疫染色不能揭示神經元中之溶酶體貯積。為達成對神經元中溶酶體積聚 (例如空泡及包涵體）之最佳觀察，通常利用電子顯微術（當前研究中不包括EM)。應瞭解’細胞類型之鐘別僅限於神經元及神經膠質細胞。神經元通常係藉由相對較大且含有一或多個密集染色核仁之蒼白核以及通常可檢測之細胞質來鑑別。神經膠質細胞通常係藉由小密集核及不顯著之細胞質來鑑別。不同類型神經膠質細胞（例如星形細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞及少突膠質細胞）之間之區別通常最佳係藉由用細胞類型特異性標記染色來實施。 157226.doc

201212936 在大腦皮質、尾狀核、丘腦、白質及小腦中，在it注射 Naglu-IGFII後，除了藉由LAMP-1免疫染色呈現之溶酶體貯積降低以外，Iba-1免疫染色顯示小神經膠質細胞之細胞尺寸及突起（process)數量降低，且GFAP免疫染色顯示星形細胞之細胞尺寸及長度/突起數量降低（數據未顯示）。此外，藉由對與免疫組織化學檢查相同之區域中之腦組織進行H&E染色（蘇木素及伊紅）實施之組織病理學分析顯示，在3x IT注射Naglu-IGFII後，神經膠質細胞中之空泡減少。上文所提及之所有結果亦顯示IT注射Naglu-IGFII之劑量相關效應。在IT注射Naglu-IGFII後對B型聖菲利波小鼠進行之生物化學分析檢測腦及肝中之Naglu活性。藉由腦及肝中之總 GAG降低來顯示Naglu-IGFII之功效。免疫組織化學顯示 Naglu-IGFII在腦實質中之生物分佈。LAMP-1、Iba-Ι、 GFAP之免疫染色及使用h&E染色之組織病理學分析呈現，不僅在腦之大腦皮質區域中，且在腦之皮質下區域、白質及小腦皮質中，溶酶體貯積降低，小神經膠質細胞及星形細胞之尺寸減小且突起減少。結果尤其已證實，融合蛋白Naglu-IGFII對結構與Naglu之天然受質類似之受質呈現活體外酵素活性。活體外細胞吸收研究證實’該分子係藉由M6P/IGFII受體以獨立於M6P糖基化之方式吸收至細胞中。顯示内在化Naglu-IGFII可與溶酶體共定位。顯示Naglu-IGFII在1C注射至B型聖菲利波小 I57226.doc •59- 201212936 鼠中之後可在活體内減少溶酶體貯積。與rhNaglu及其他 Naglu融合物及修飾形式相比，Nagiu_iGFII在IT注射後滲透至wt插管大鼠之腦實質方面優於其全部。最後，IT注射至Β型聖菲利波小鼠中之Nagiu_IGFII融合物顯示遠超出腦脊髓膜外之廣泛分佈，且在大腦皮質中以及在皮質下區域中觀察到溶酶體貯積逆轉。總而言之，該等數據表明， Naglu-IGFII係治療B型聖菲利波疾病之候選藥物。實例5 : Naglu-IGFII之毒性、藥物代謝動力學（PK)及組織生物分佈研究小鼠中概念性驗證研究向3個Naglu (-/-)小鼠群組（η=3)注射1〇含有260 pg Naglu-IGFII之單次IT團注腰椎注射劑。260 pg劑量轉換為 52〇 mg/kg腦重量劑量（小鼠腦=〇〇〇〇5 kg)。1個群組係在第〇天注射且在注射後24 hr屠宰。第二個群組係在第〇及7天注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰《第三個群組係在第〇、7及14天注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰。每個給予Naglu-IGFII之群組皆與媒劑對照群組配對以控制年齡/疾病嚴重程度。在三個給予Naglu-IGFII之群組之間，NagIu在腦及肝中之酵素活性類似。對比rhNaglu在肝與腦中之酵素活性，發現在肝中rhNaglu之酵素活性大1〇倍。預期由於在大鼠及幼猴之關鍵毒性研究中，在1個月、3個月及6個月之給藥後，rhNAGLU在腦與肝中之酵素活性程度相當，故一部分給予Naglu (-/-)小鼠之rhNaglu劑量可能並非係汀遞送， 157226.doc -60- 201212936 而係全身性遞送。然而，在3次IT注射後，腦中之總GAG 含量顯示統計學顯著降低（p < 0.05)。在肝中觀察到總GAG 含量降低之劑量相關性趨勢，其在接受2次或3次劑量之群組中在統計學上顯著（p < 〇.〇5)。觀察到Naglu-IGFII在IT注射後之生物分佈遠超出腦脊髓膜外，進入腦實質中，但深層皮質下區域之抗Naglu抗體免疫染色呈陰性。藉由溶酶體相關膜蛋白（LAMP)免疫染色’僅在給予2次或3次劑量之群組中觀察到溶酶體活性降低。溶酶體活性降低之區域包括大腦皮質及尾狀核、丘腦及白質之深層皮質下區域。因此，各種免疫染色參數在給予Naglu-IGFII之動物中之降低表明，儘管不存在抗 NAGLU免疫染色’但可能存在治療量之NAGLU。僅在給予2次或3次劑量之群組中，星形細胞之神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP)免疫染色降低及小神經膠質細胞/巨噬細胞之離子化鈣結合轉接分子（Iba)染色降低證實發炎反應減弱。刀析£域包括大脂）皮質及尾狀核、丘腦及白質之深層皮質下區域。大良研究選擇S-D大鼠作為用於IT投與Naglu-IGFII之毒理學評價之齧齒類物種。因此，每4天以最高可能投與劑量（mfd) 以及以約％及％ MFD(分別係低及中等劑量量）給予i6 〇大鼠（每個性別8只）重組Naglu-IGFII，總計8次劑量。在S-D大鼠中實施單次劑量PK/生物分佈研究以分別測定在IT-L投與雄性及雌性動物後之cSF及血清濃度或組織分 157226.doc 201212936 佈。毒理學研究經設計以在雄性及雌性動物二者中自毒理學及安全藥理學（神經、呼吸及心血管安全性）角度評價 Naglu-IGFII之ΙΤ-L投與。該等研究中之毒理學評價包括臨床觀察、體重、攝食量、臨床病理學、適當安全藥理學評價（體格檢查或心電描記術）、肉眼組織及顯微鏡下評價。採集有限數量之CSF及血清試樣並分析Naglu-IGFII，且分析針對測試物質之抗體。分別藉由酵素活性分析及免疫組織化學對Naglu-IGFII組織分佈及亞細胞定位進行定量。另外，所選研究包括恢復期以評定所觀察到的任何顯著毒理學發現之可逆性或可能的延遲出現。狼子研究選擇食蟹猴作為用於IT投與Naglu-IGFII之毒理學評價之非齧齒類物種，此乃因其與人類具有遺傳學及解剖學類似性且因此被認為係更相關之物種。考慮到用於B型聖菲利波臨床試驗之計劃患者群係兒科患者，在幼年食蟹猴中實施長期6個月毒理學研究，其特徵為用腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)投與Naglu-IGFII。幼年食蟹猴在研究開始時通常小於1歲（約7-9個月齡）且在研究開始時體重介於900 g至 1，500 g之間。用自1個月重複劑量之幼年食蟹猴毒性研究獲得之數據來指導6個月幼猴研究之劑量量選擇及設計。重複劑量毒理學研究經設計以在1至6個月期間模擬預期臨床途徑（ΙΤ-L團注）及投與頻率（每隔一週；EOW)。如上所述，毒理學研究經設計以在雄性及雌性動物二者 157226.doc •62· 201212936 中自毒理學及安全藥理學（神經、呼吸及心血管安全性）角度評價Naglu-IGFII之ΙΤ-L投與。該等研究中之毒理學評價包括臨床觀察、體重、攝食量、臨床病理學、適當安全藥理學評價（體格檢查或心電描記術）、肉眼組織及顯微鏡下評價。採集有限數量之CSF及血清試樣並分析Naglu-IGFII，且分析針對測試物質之抗體。分別藉由酵素活性分析及免疫組織化學對Naglu-IGFII組織分佈及亞細胞定位進行定量。另外，所選研究包括恢復期以評定所觀察到的任何顯著毒理學發現之可逆性或可能的延遲出現。實例6 : Naglu-IGFII之EOW腦脊髓膜内投與此實例經設計以確定在Naglu -/-小鼠模型中在6次注射（3 個月之研究）中EOW IT-腰椎給藥之可行性》相對於每週給藥，此給藥方案可能在臨床上更適當。根據以下實驗設計對8週齡Naglu -/-雄性及雌性小鼠進行研究：表6:用於EOW IT遞送Naglu-IGFII之實驗設計群組 N 治療劑量頻率屠宰 A 3 媒劑 N/A 經3個月（總計6次注射)EOWIT注射最後一次注射後 24 h B 6 Naglu-IGFII 60 mg/kg腦重量 (3〇 μΕ) 經3個月（總計6次注射)EOWIT注射最後一次注射後 24 h 實施生理學研究，包括對肝、腦及血清之Naglu活性分析、對血清之抗Naglu抗體分析及對肝及腦之BCA分析。實施組織學研究，包括對腦、脊髓及肝之Naglu IHC，及對腦及脊趙之L amp染色。採集腦、脊髓及肝並在10% NBF中固定。製備5 μπι石蠟 157226.doc -63- 201212936 切片以供組織學染色。使用Naglu之免疫組織化學（ihc)染色來檢測注射蛋白質之細胞吸收。使用H&E染色來觀察形態變化。使用LAMP(溶酶體活性及疾病狀態之指示劑）、 GFAP及Iba-Ι(激活星形細胞及小神經膠質細胞之兩種cns 病理學標記）進行組織病理學改良評價。對經媒劑及Naglu-IGFII治療之小鼠之腦、脊髓及肝之 Naglu免疫染色顯示，在腦及脊髓中，僅藉由IHc在腦脊髓膜（M)中檢測到注射Naglu，且在任何其他區域皆未檢測到 Naglu陽性染色（圖32)。在肝中，竇狀隙細胞（S)呈Naglu陽性且在肝細胞（H)中未發現Naglu吸收。對經媒劑及Naglu-IGFII治療之小鼠中肝及脊趙之LAMP 免疫染色及Η & E染色顯示，與媒劑動物相比，LAMP染色在整個經Naglu治療之肝及脊髓中有所降低》H&E染色顯示’與媒劑治療動物相比，在治療群組中，細胞空泡形成在肝細胞中顯著降低（圖33及34)。對經媒劑及Naglu-IGFII治療小鼠之腦之Η & E染色顯示在經3個月6次每隔一週IT注射Naglu-IGFII後，腦中之形態改良。在經治療腦中，細胞空泡形成（箭號）在所有檢查區域中相對於媒劑群組有所降低（圖35)。在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之LAMP IHC 顯示，與媒劑治療群組相比，IT投與SFB小鼠之Naglu使溶酶體活性在所有檢查區域中降低，如LAMP免疫染色所揭示（圖35)。此降低之特徵在於LAMP陽性細胞之數量減少、細胞尺寸減小且染色變淡。在小腦及腦幹（其位於腦 157226.doc -64· ⑧ 201212936 中接近脊趙之尾狀部分中）中發現相對於其他腦區顯著降低。亦在包括白質、海馬及丘腦之深層腦區中發現顯著降低。在經3個月6次1T Naglu注射後，各腦區中之Iba IHC揭示小神經膠質細胞之激活（圖36)。與媒劑治療群組相比，在 Naglu治療群組中未觀察到陽性細胞數量及染色強度降低。然而’在所有檢查腦區中，與媒劑群組（插圖）中之較大且形成空泡之細胞相比，陽性小神經膠質細胞之細胞形態變化且細胞尺寸減小。在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之GFAP IHC揭不星形細胞激活（圖37)。與媒劑治療群組相比，GFAP陽性染色在小腦及腦幹中有所降低，且在其他檢查區域中略有降低。對於細胞吸收，該等數據顯示，在腦及脊髓中，僅在經 3個月6次每隔一週Naglu iGFn汀注射後在腦脊髓膜細胞中檢測到Naglu。藉由IHC在腦及脊髓之任何其他區域中皆檢測不到Naglu。在肝中，在竇狀隙細胞中發現Naglu陽性染色。在腦及脊髓中，在經3個月6次每隔一週IT注射Naglu-IGFII後，即使藉由IHC檢測不到注射Naglu，亦在整個腦及脊髓中觀察到組織病理學改良。H&E染色顯示細胞空泡形成在所有檢查腦區中皆有所降低。LAMP染色在整個經治療脊髓中及在所有評價腦區（包括白質、海馬及丘腦，其係深層腦區）中降低，且在Naglu-IGFII治療群組之小腦 157226.doc •65· 201212936 及腦幹中顯著降低。GFAP染色在星形細胞中之降低染色模式與LAMP染色一致，但並非如LAMP —般顯著降低。 Iba-1染色顯示在所有檢查腦區中，小神經膠質細胞之細胞尺寸減小。在肝中’ H&E染色顯示在Naglu治療群組中，細胞空泡形成降低且LAMP染色顯著降低。實例7 : B型聖菲利波患者之治療可使用經由（例如）IT遞送直接CNS投與來有效治療b型聖菲利波症候群（Β型聖菲利波）患者。此實例闡釋多中心劑量遞增研究’其經設計以評價經總計40週每隔一週（e〇w) 經由腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)將至多3種劑量量之 Naglu-IGFII及/或rhNaglu投與Β型聖菲利波症候群患者之安全性。各種適於人類治療之實例性腦脊髓膜内藥物遞送裝置繪示於圖38-41中。將招收至多20名患者：隊列1 : 5名患者（最低劑量）隊列2 : 5名患者（中等劑量）隊列3 : 5名患者（最高劑量）隨機選取5名患者不作治療。基於以下入選標準來選擇用於研究之患者：測定在患有San A之患者中經40週藉由it注射投與遞增劑量之Naglu之安全性。另外，評定Naglu-IGFII及/或 rhNaglu對認知功能之臨床活性，及單次及重複劑量在血清中之藥物代謝動力學，以及在腦脊髓液（CSF)中之濃度。 157226.doc -66 - 201212936 儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。應瞭解’在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞 (a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的一或多個成員間包括「或」的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有一個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中-個以上或所有的群組成員皆存在於、用 ;’-’口疋產物或過私或與給定產物或過程相關的實施例。此外，應瞭解’除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等以附屬於相同基礎技術方案（或任—其他相關技術方案）之另技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式（例如，以馬庫西群組（Markush gr卿）或類似格式）給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組t移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、㈣等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見’在本文中未以過多語言具 157226.doc •67- 201212936 體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範@ t明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之背景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。【圖式簡單說明】圖式僅用於說明性目的而非限制性目的。圖1 展示實例性 rhNaglu、Naglu-IGFII、Naglu-TAT 及 Naglu Kif及概念性驗證研究（P〇c)之結果。（no.〇f aa/ theod mw-胺基酸之編號及理論分子量）。圖 2展示實例性 perT_Naglu及 Naglu-ApoE。產生 rhNaglu 之該兩種修飾形式以檢查酵素通過BBB之轉運。圖3A展示實例性IGFII分子，其顯示作為與IGF II受體之、结合序列之胺基酸序列8-67(綠色）（自Hashimoto 1995, 20 改良之圖）。圖3B展示實例性M6P / IGF II受體及其15個結構域。結構域3及9(綠色）結合甘露糖-6-磷酸鹽，而結構域 5結合甘露糖-6-磷酸鹽二酯。結構域11(黃色）結合IGFII(自 Bohnsack 2009, 22改良之圖）。圖4展示Naglu-IGFII純系47dz2-15之實例性波產生。 Naglu-IGFII之平均產量係0.5 pcd(皮克/百萬細胞/天）。 GH :生長收穫物；H1至H8 :收穫物1至8。圖5展示來自圖2-5中之波產生的收穫物之實例性西方印跡分析。藉由培養基之體積對泳道加以正規化。圖6展示Naglu-IGFII在用PNGase F去糖基化之前及之後 157226.doc -68 - ⑧ 201212936 之實例性西方印跡分析。PNGase F消化之前之分散譜帶係溶酶體蛋白質在糖基化時之典型外觀。PNGase F—旦被消化，蛋白質譜帶變尖並經積聚，其外觀與均勻多肽鏈之外觀一致。利用抗人類Naglu及抗IGFII抗體之分析確認，僅 Naglu-IGFII之完整分子由純系47dz2-15表示。「·」指示 PNGaseF消化之前之收穫物質。「+」指示PNGase F消化之後之收穫物質。圖7展示Naglu-IGFII之實例性純化方案且SDS-PAGE凝膠展示自條件化培養基之Naglu-IGFII的逐步純化。圖8展示Naglu-Kif蛋白質之實例性晶體。圖9展示以卡通模型形式表示之Naglu的實例性晶體結構❶三個結構域指示為結構域I、結構域II及結構域III。聚多糖示為條狀物。催化性殘基係E316及E446。圖1 0展示Naglu之實例性三聚體結構。標記三個分子之活性位點。圖11展示使用來自正常人類之實例性一級成纖維細胞進行rhNaglu及Naglu-IGFII之細胞内在化研究。rhNaglu之細胞吸收極低’而Naglu-IGFII之細胞吸收非常顯著》Naglu-IGFII内在化之飽和曲線顯示受體介導吸收。此吸收受 IGFII抑制，但不受甘露糖-6-磷酸鹽抑制。圖12繪示使用B型聖菲利波患者之成纖維細胞 (GM01426)的實例性共聚焦顯微鏡研究。觀察到Naglu-IGFII之廣泛内在化，以及Naglu-IGFII與Lamp-1之共定位。 157226.doc 69· 201212936 圖13展示野生型（WT)、Naglu_/_ (κ〇)及雜合體\叫沁+/_ (Het)小鼠中之實例性Naglu活性。在Β型聖菲利波小鼠之腦、肝、腎及脾中觀察到Naglu完全缺陷。圖14繪示小鼠腦之俯視圖及側視圖以指示扣注射位點及用於組織學分析之切面。中間照片係以lx大小觀察之小鼠腦橫切片。加框區域指示底部照片中4X顯微影像之範圍。底部照片係組織學載玻片之4χ影像。框八指示圖15及圖16 中40χ顯微影像之範圍。圖15繪示在ic注射後7天時，β型聖菲利波小鼠中大腦皮質之貫例性免疫組織化學（40χ)。rhNaglu及Naglu-IGFII二者在神經元以及在神經膠質細胞中皆呈現廣泛細胞吸收，且兩種蛋白質之間之分佈及細胞吸收模式極為類似。（抗人類Naglu單株抗體）圖16繪示對大腦皮質之實例性LAMP-1免疫染色（4〇χ)。與野生型小鼠腦相比’在媒劑治療Β型聖菲利波小鼠腦中溶酶體貯積增加明顯，如增加之LAMP-1免疫染色陽性點所示。rhNalgu及Naglu-IGFII治療之Β型聖菲利波小鼠二者之腦呈現與wt小鼠極為類似之溶酶體貯積減少。圖17A展示在IT投與Naglu之Naglu缺陷型小鼠白質組織中’相對於投與媒劑之相同Naglu缺陷型小鼠，細胞空泡形成廣泛降低。圖17B展示在腦脊髓膜内投與Nagiu之 Naglu缺陷型小鼠白質組織中’相對於投與媒劑之相同 Naglu缺陷型小鼠，溶酶體相關膜蛋白i (Lampi)免疫染色顯著降低。 157226.doc • 70· ⑧ 201212936 圖18以定量方式展示並相對於野生型及投與媒劑之 Naglu缺陷型小鼠二者對比在投與Naglu之Naglu缺陷型小鼠大腦皮質、尾狀核及豆狀核殼（CP)、丘腦（TH)、小腦 (CBL)及白質（WM)中量測之LAMP濃度。在經7天時程腦脊髓膜内投與三種劑量之Naglu(圖18A)後，所分析腦組織每一區域中之LAMP陽性區域相對於經兩週時程投與兩種劑量之Naglu(圖18B)進一步減少。圖19展示在此圖中使用人類CNS之實例性正中矢狀位解剖學簡圖作為參照來顯示在wt插管大鼠中之IT注射位點。藍色箭號指示IT注射在脊髓中之大致解剖學位置，且紅色箭號指示大腦皮質區域，其中取組織用於免疫組織化學研究。圖20展示在IT注射後腦中之實例性Naglu活性。在注射 Naglu-TAT及Naglu-IGFII之wt大鼠中，Naglu活性顯著較南。圖21繪示在IT注射後24 hr對經rhNaglu、Naglu-TAT、 Naglu-IGFII、Naglu-kif及 PerT-Naglu 治療之 wt插管大鼠中大腦皮質之實例性Naglu免疫染色（20x)。Naglu-IGFII係唯一在腦實質中呈現充分廣泛分佈之蛋白質。在Naglu-IGFII 治療大鼠中，神經元及神經膠質細胞之細胞吸收亦顯著。另一方面，在 rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu kif 及 PerT-Naglu治療群組中，蛋白質僅留在腦脊髓膜（M) 中。圖22繪示圖21中所選載玻片之實例性高放大倍數圖。上圖顯示在rhNaglu治療wt插管大鼠中’ rhNaglu僅留在腦脊 157226.doc -71· 201212936 髓膜（Μ)處’在腦實質中未發現陽性染色。下圖顯示在 Naglu-IGFII治療wt插管大鼠中，在腦實質中觀察到良好廣泛分佈’且在神經元及神經膠質細胞中觀察到細胞吸收。圖23展示在最後IT注射後24 hr，實例性Naglu在腦及肝中之活性》在三個治療群組中，Naglu在腦中之活性未顯示顯著差異，Naglu在肝中之活性亦係如此。此結果表明，在腦及肝中檢測到之Naglu活性主要係由於最後注射所致’該最後注射係在屠宰前24 hr進行。此時關於Naglu 活性在肝中與腦中相比顯著更高之原因尚不清楚β IT注射後之徹底藥物代謝動力學研究可有助於解釋差異。圖24展示在IT注射Naglu-IGFII後，腦及肝中之實例性總 GAG含量《媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中之總gag呈現進行性增加’此反映隨B型聖菲利波小鼠衰老出現之積聚效應。在3x注射群組中觀察到腦中之Gag出現統計學上顯著之降低（p<0.05)。在2x及3x注射群組中亦觀察到肝中之 GAG出現統計學上顯著之降低（p<〇.〇5)。肝中GAG含量之變化快於且大於腦中’且在另一溶酶體貯積症小鼠模型 (例如亨特氏症候群（hunter syndrome))中觀察到此現象（内部連通）。圖25繪示在IT注射後，Naglu在B型聖菲利波小鼠腦中之實例性生物分佈。Naglu免疫螢光染色揭示腦脊髓膜（M)及腦實質上之Naglu-IGFII蛋白質。在2x及3x注射群組中觀察到細胞吸收。G :神經膠質細胞》圖26展示小鼠腦之實例性冠狀切片。框指示lAMP_i免 157226.doc -72- ⑧ 201212936 疫染色照）ί取自何處。為顯*蛋自f分佈及功效之程度，選擇大腦皮質及皮質下組織（例如尾狀核、丘腦及白質）進行LAMP1免疫染色》圖27繪示大腦皮質之實例性LAMp丨免疫染色（4〇χρ與野生型小鼠腦相比，在媒劑治療Β型聖菲利波小鼠腦中觀察到溶酶體貯積增加，如增加之LAMpi免疫染色陽性點所不。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2χ 注射治療之Β型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3χ注射治療之Β型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。圖28繪不尾狀核、即皮質下核之實例性ΕΑΜρ」免疫染色（4〇x)。與在大腦皮質中所觀察到者類似，在媒劑治療B 型聖菲利波小鼠腦中觀察到溶酶體貯積增加，如增加之 LAMP1免疫染色陽性點所示。在Nagiu IGFii IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2χ注射治療之β型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3χ注射治療之Β型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。圖29繪示丘腦、即間腦核之實例性LAMp^免疫染色 (40x)。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為 2x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3x注射治療之β型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。圖30繪示白質之實例性lampj免疫染色（4〇χ)。神經元轴突纖維之縱向軌跡可區分圖26·29中所示之白質與灰 157226.doc 73· 201212936 質。然而’與野生型小鼠相比，在媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中可觀察到相同模式之溶酶體貯積增加。在Nagiu_ IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2X及3x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點尺寸之降低及數量之減少〇圖3 1繪示小腦皮質之實例性LAMP-1免疫染色。在小腦皮質中與腦之其他區域中觀察到類似溶酶體貯積降低效應。小腦皮質之形態表現為密集聚集之顆粒神經元、細胞過少分子層及該顆粒神經元與該分子層之間之普爾欽神經元單層。藉由較大細胞質及少量突入分子層中之樹突來鑑別普爾欽神經元。圖32展示腦、脊髓及肝中之實例性Naglu染色。在腦及脊髓中，僅在腦脊髓膜（M)中藉由IHC檢測到注射Naglu，且在任何其他區域中皆未檢測到Naglu陽性染色。在肝中’竇狀隙細胞（S)呈Naglu陽性且在肝細胞（H)中未發現 Naglu吸收。圖33展示肝及脊髓之實例性LAMP免疫染色及Η & E染色。與媒劑動物相比，LAMP染色在整個經Naglu治療之肝及脊髓二者中皆有所降低。Η & E染色顯示，肝細胞中之細胞空泡形成在治療群組中相對於媒劑治療動物明顯降低。圖34 Α及Β展示腦之實例性Η & Ε染色，其顯示在經3個月6次每隔一週IT注射Naglu後’腦之形態改良。在經治療腦中，細胞空泡形成（箭號）在所有檢查區域中相對於媒劑 157226.doc - 74 - —^ ⑧ 201212936 群組皆有所降低。圖35 A及B展示在經3個月6次IT Naglu注射後，不同腦區中之實例性LAMP免疫染色。與媒劑治療群組相比，it 投與B型聖菲利波小鼠之Naglu可使溶酶體活性在LAMP免疫染色所揭示之所有檢查區域中降低。此降低之特徵在於 LAMP陽性細胞之數量減少、細胞尺寸減小且染色變淡。在小腦及腦幹（其位於腦中接近脊髓之尾狀部分中）令發現相對於其他腦區顯著降低。亦在包括白質、海馬及丘腦之深層腦區中發現顯著降低。圖36 A及B展示在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之實例性Iba IHC ’其揭示小神經膠質細胞之激活。與媒劑治療群組相比，在Naglu治療群組中未觀察到陽性細胞數量及染色強度降低。然而，在所有檢查腦區中，與媒劑群組（插圖）中之較大且形成空泡之細胞相比，陽性小神經膠質細胞之細胞形態變化且細胞尺寸減小。圖37 A及B展示在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之實例性GFAP IHC，其揭示星形細胞激活。與媒劑治療群組相比，GFAP陽性染色在小腦及腦幹中有所降低，且在其他檢查區域中略有降低。圖38繪示實例性腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)。圖39繪示實例性PORT-A-CATH®低型腦脊髓膜内植入式輸液系統（low profile intrathecal implantable access system)。圖40繪示實例性腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)。圖41繪示實例性腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD),其容 157226.doc •75· 201212936 許在家投與CNS酵素替代療法（ERT)。圖42展示具有緊固機構之腦脊髓膜内藥物遞送裝置 (IDDD)之實例性簡圖。圖43A繪示患者體内可放置IDDD之實例性位置；圖43B 繪示腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)之各個組件；且圖 43C繪示患者體内用於IT-腰椎注射之實例性插入位置。 157226.doc -76- ⑧ 201212936 序列表 <110>美商舒爾人類基因療法公司 <120>於腦脊髓膜内遞送αΝ·乙醯基葡萄糖胺酶之方法及組合物 <130> 2006685-0030 <140> 100122529 <141> 2011-06-27 <150〉 61/358,857 <151> 2010-06-25 <150> 61/360,786 <151> 2010-07-01 <150> 61/387,862 <151> 2010-09-29 <150> 61/435,710 <151> 2011-01-24 <150> 61/442,115 <151> 2011-02-11 <150> 61/476,210 <151> 2011-04-15 <150> 61/495,268 <151> 2011-06-09 <160> 7 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 720 <212> PRT <213>智人 <400> 1

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012 3 - · · 11 · 222Λζ < < V V 3 T人 74PR智 157226.doc 201212936 <400〉 2

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10 10201212936 <210> 5 <211> 51 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>合成連接體肽 <400> 5

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Claims

201212936 七、申請專利範圍： 1 · 一種治療B型聖菲利波症候群（Sanfilippo syndrome type B，San B)疾病之方法，其包含以下步驟：向需要治療之個體經腦脊髓膜内投與重組α_Ν乙醯基 . 葡萄糖胺酶（Naglu)蛋白質。月東項1之方法，其中該重組Naglu蛋白質係包含Naglu 結構域及溶酶體靶向部分之融合蛋白。 3·如明求項2之方法，其中結構域包含與SEQ m Ν〇·1(成熟人類1^^“蛋白質）至少80%—致之胺基酸序列。 4·如叫求項2之方法，其中該^^叫匕結構域包含與SEq m NO.1(成熟人類Naglu蛋白質）至少95% —致之胺基酸序列。 5. 如請求項2之方法’其中該^吨比結構域包含與SEq ID N〇:l(成熟人類^^叫匕蛋白質）一致之胺基酸序列α 6. 如凊求項2至5中任一項之方法，其中該溶酶體靶向部分係IGF-II部分。 7. 如s青求項ό之方法，其中該IGF n部分包含與成熟人類 IGF-II(SEQIDN0:2)至少70%—致之胺基酸序列。 I 8. 如清求項6之方法，其中該IGF-II部分包含與成熟人類 IGF-II (SEQ ID NO:2)至少80%—致之胺基酸序列。 9. 如晴求項6之方法，其中該IGF_n部分包含與成熟人類 IGF-II (SEQ ID NO:2)至少90%—致之胺基酸序列。 10. 如请求項6之方法，其中該1(31?_][1部分包含包括成熟人類 157226.doc 201212936 IGF-II (SEQ ID NO:2)之殘基8至67的胺基酸序列》 11. 如請求項2至10中任一項之方法，其中該融合蛋白進一步包含連接體在該Naglu結構域與該溶酶體靶向部分之間。 12. 如請求項11之方法，其中該連接體包含一或多個胺基酸序列 GGGGGAAAAGGGG (SEQ ID NO:3)。 13. 如請求項12之方法’其中該胺基酸序列GGGGGAAAA GGGG (SEQ ID NO:3)係以串聯重複（tandem repeats)存在。 14. 如請求項13之方法’其中該連接體進一步包含一或多個 GAP序列。 15·如請求項14之方法，其中該連接體包含胺基酸序列 GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGGGGGAPG GGGGAAAAGGGGGAP (SEQ ID NO:4)。 16. 如請求項2至15中任一項之方法，其中該溶酶體靶向部分直接或經由該連接體融合至該Naglu結構域之C端。 17. 如請求項2至15中任一項之方法，其中該溶酶體靶向部分直接或經由該連接體融合至該Naglu結構域之N端》 18. 如前述請求項中任一項之方法，其中該重組蛋白質係自人類細胞產生。 19. 如前述請求項中任一項之方法，其中該重組蛋白質係自 CHO細胞產生》 20. 如前述請求項中任一項之方法，其中該腦脊髓膜内投與使得該Naglu蛋白質遞送於腦組織中。 157226.doc ⑧ 201212936 21. 如請求項20之方法，其中該腦組織包含腦實質及/或腦膜。 22. 如請求項20或21之方法，其中該腦脊髓膜内投與進一步使得該Naglu蛋白質遞送至肝。 23. 如請求項20至22中任一項之方法，其中該Naglu蛋白質定位至腦及肝細胞之溶酶體。 24. 如前述請求項中任一項之方法，其中該腦脊髓膜内投與使得腦及肝中之GAG減少。 25·如請求項24之方法，其中該腦脊髓膜内投與使得腦之大腦皮質及皮質下區域中之GAG減少。 26.如前述請求項中任一項之方法，其中該腦脊髓膜内投與使得該San B病之至少一種症狀或特徵的強度、嚴重程度或頻率降低，或延遲發作。 27_如請求項26之方法，其中該8抓B病之至少一種症狀或特徵係聽力損失、語言發育遲緩 '運動技能缺陷、活動過度、智力遲純、攻擊性及/或睡眠紊亂。 28. 如前述請求項中任一項之方法，其中該Nag〗u融合蛋白係以約26 mg/ml之濃度投與。 29. —種治療性融合蛋白，其包含構域；溶酶體靶向部分，且一旦投與，其中該治療性融合蛋白靶向溶酶體且具有活體内治療活性。 3〇.如明求項29之治療性融合蛋白，其中該Naglu結構域包 3與SEQ ID ΝΟ:1(成熟人類Naglu蛋白質）至少80〇/〇—致 157226.doc 201212936 之胺基酸序列。 31.如請求項29之治療性融合蛋白，其中該Naglu結構域包含與SEQ ID ΝΟ:1(成熟人類Naglu蛋白質）一致之胺基酸序列。 3 2.如請求項29至3 1中任一項之治療性融合蛋白，其中該溶酶體靶向部分係IGF-II部分。 33. 如請求項32之治療性融合蛋白，其中該IGF-II部分包含與成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)至少70%—致之胺基酸序列。 34. 如請求項33之治療性融合蛋白，其中該IGF-II部分包含包括成熟人類IGF-II (SEQ ID NO:2)之殘基8至67的胺基酸序列。 3 5.如請求項29至34中任一項之治療性融合蛋白，其中該融合蛋白進一步包含連接體在該Naglu結構域與該溶酶體乾向部分之間。 36. 如請求項35之治療性融合蛋白，其中該連接體包含胺基酸序列 GAPGGGGGAAAAGGGGGAPGGGGGAAAAGG GGGAPGGGGGAAAAGGGGGAP(SEQ ID NO:4)。 37. 如請求項35或36之治療性融合蛋白，其中該溶酶體靶向部分直接或經由該連接體融合至該Naglu結構域之C端。 38. —種治療性融合蛋白，其包含與SEQ ID NO:5(全長 Naglu-IGF-II融合蛋白）至少80%—致之胺基酸序列，一旦投與，其中該治療性融合蛋白靶向溶酶體且具有活體内治療活性。 157226.doc 201212936 49· 一種用於腦脊髓膜内投與之系統，其包含輸液裝置；空心體’其具有與該輸液裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量孔；及用於該空心體緊固插入該脊髓中之緊固機構。 50. 如請求項49之系統，其中該緊固機構包含一或多個安裝於該空心體表面上之球形頭（n〇bs)及於該一或多個球形頭上可調整之缝合環。 51. 如請求項49或50之系統，其中該輸液裝置係可注射座 (injectable port) 〇 52. 如請求項5 1之系統，其中該可注射座係可植入的。 53. 如請求項49至52中任一項之系統，其中該輸液裴置係幫浦0 157226.doc