TWI602573B - 溶酶體酵素之腦脊髓膜內遞送及其醫療用途 - Google Patents

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Description

溶酶體酵素之腦脊髓膜內遞送及其醫療用途
本申請案主張美國臨時專利申請案第61/358,857號(2010年6月25日申請)、第61/360,786號(2010年7月1日申請)、第61/387,862號(2010年9月29日申請)、第61/435,710號(2011年1月24日申請)、第61/442,115號(2011年2月11日申請)、第61/476,210號(2011年4月15日申請)及第61/495,268號(2011年6月9日申請)之優先權，每一案件之全文以引用方式併入本文中。
酵素替代療法(ERT)涉及向個體全身投與天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。經批准療法通常經靜脈內投與個體，且通常可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。由於經靜脈內投與之蛋白質及/或酵素不能充分地跨過血腦障壁(BBB)，故經靜脈內投與之蛋白質及/或酵素至中樞神經系統(CNS)細胞及組織中之分佈很有限，因而治療具有CNS病因之疾病一直尤其具有挑戰性。
血腦障壁(BBB)係由內皮細胞構成之結構系統，其藉由限制血流中之有害物質(例如細菌、大分子(例如，蛋白質)及其他親水性分子)擴散跨過BBB及擴散至下面的腦脊髓液(CSF)及中樞神經系統(CNS)中而起保護CNS遠離該等物質之功能。
有數種繞開BBB以增強治療劑之腦遞送的方式，包括直接顱內注射、BBB之短暫通透化及對活性劑進行修飾以改變組織分佈。將治療劑直接注射至腦組織中可完全繞過脈管系統，但主要會遭受由顱內注射及活性劑自投與位點之擴散較差引起之併發症風險(感染、組織損傷、免疫反應)。迄今，由於擴散障壁及可投與之治療劑體積有限，將蛋白質直接投與至腦實質中尚未達成顯著治療效果。已經由放置於腦實質中之導管利用緩慢長期輸注來研究對流輔助之擴散(Bobo等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91,2076-2080(1994)；Nguyen等人，J. Neurosurg. 98,584-590(2003))，但目前沒有一種批准的療法使用該途徑來實施長期療法。另外，放置大腦內導管非常具有侵入性且不期望作為臨床選擇方案。
亦已嘗試腦脊髓膜內(IT)注射或將蛋白質投與至腦脊髓液(CSF)中，但尚未獲得治療成功。該治療之主要挑戰一直為活性劑結合腦室之室管膜內層的傾向非常強烈，從而阻止隨後的擴散。目前，沒有一種批准的產品藉由直接投與至CSF中來治療腦遺傳性疾病。
事實上，很多人認為腦表面之擴散障壁以及缺乏有效且方便之遞送方法的障礙太大以致於無法在腦中對任何疾病達成足夠的治療效果。
許多溶酶體貯積症侵襲神經系統，且因此在利用傳統療法治療該等疾病時展示獨特挑戰。通常在受侵襲個體之神經元及腦脊髓膜中累積大量糖胺聚多糖(GAG)，從而導致各種形式之CNS症狀。迄今，尚無一種由溶酶體病症引起之CNS症狀成功地藉由任一可利用之方式得以治療。
因此，仍強烈需要將治療劑有效遞送至腦中。更具體而言，強烈需要將活性劑更有效地遞送至中樞神經系統中以治療溶酶體貯積症。
在一個態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體經腦脊髓膜內投與以大於約5 mg/ml之濃度包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物。在一些實施例中，溶酶體酵素之替代酵素的濃度大於約10 mg/ml。
在一些實施例中，該組合物進一步包含以下物質中的一或多者：(i)緩衝劑，(ii)表面活性劑，或(iii)滲透壓調節劑。在一些實施例中，該組合物具有約5.0至7.0之pH。
在一些實施例中，該組合物係以小於約5 mL之單次劑量體積投與。在一些實施例中，該組合物係以小於約3 mL之單次劑量體積投與。
在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與組合物不會在個體中引起實質不良效應。在某些實施例中，經腦脊髓膜內投與組合物不會引起適應性T細胞介導之免疫反應。
在再一態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體經腦脊髓膜內投與於非合成CSF之調配物中包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物。在一些實施例中，替代酵素之濃度大於約5 mg/ml。
在另一態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體投與包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物，該投與涉及在無並存免疫抑制療法的情況下經腦脊髓膜內投與該組合物。在一些實施例中，該方法不涉及在所治療個體中實施免疫耐受誘導。在一些實施例中，該方法不涉及使用T細胞免疫抑制劑對個體進行預治療或預調節。
在再一態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體以治療有效劑量及一定投與間隔經腦脊髓膜內投與包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物，由此在一或多種腦、脊髓及周圍器官組織中達到溶酶體酵素之正常含量或活性的至少10%。在一些實施例中，一或多種腦組織包含腦膜組織。
在一些實施例中，腦脊髓膜組織選自由軟膜、硬膜及蛛網膜組織組成之群。在一些實施例中，一或多種腦組織包含大腦組織。在一些實施例中，大腦組織係大腦之表面或淺層組織。在一些實施例中，大腦之表面或淺層組織選自由下列組成之群：軟膜組織、大腦皮質帶(cerebral cortical ribbon)組織、距大腦表面4 mm以內之組織及其組合。在一些實施例中，大腦組織係大腦之深層組織。在某些實施例中，大腦之深層組織選自由下列組成之群：大腦皮質帶以下之組織、距大腦表面4 mm以下之組織、距大腦表面6 mm以下之組織、距大腦表面10 mm以下之組織及其組合。
在一些實施例中，一或多種腦組織包含小腦組織。在一些實施例中，小腦組織選自由下列組成之群：分子層組織、普爾欽細胞(Purkinje cell)層組織、顆粒細胞層組織及其組合。在一些實施例中，小腦組織係小腦之深層組織。在某些實施例中，小腦之深層組織選自由下列組成之群：普爾欽細胞層組織、顆粒細胞層組織、深層小腦白質組織及深層小腦核組織。
在一些實施例中，一或多種腦組織包含腦幹組織。在某些實施例中，腦幹組織選自由腦幹白質組織及/或腦幹核組織組成之群。
在一些實施例中，一或多種脊髓組織係脊髓之表面或淺層組織。在一些實施例中，脊髓之表面或淺層組織選自由下列組成之群：軟膜、白質纖維束及距脊髓表面4 mm以內之組織。在一些實施例中，一或多種脊髓組織係脊髓之深層組織。在某些實施例中，脊髓之深層組織選自由下列組成之群：脊髓灰質及室管膜細胞、以及距脊髓表面4 mm以下之組織。
在一些實施例中，一或多種腦組織包含表面或淺層組織。在某些實施例中，表面或淺層組織選自由下列組成之群：腦脊髓膜之軟膜、硬膜及蛛網膜組織、軟膜組織、大腦皮質帶組織、距大腦表面4 mm以內之組織及其組合。
在一些實施例中，該等組織包含深層組織。在某些實施例中，深層腦組織選自大腦深層白質、脊髓深層灰質、胼胝體、腦室周圍組織、丘腦、海馬傘、大腦皮質帶以下之組織、距大腦表面4 mm以下之組織、距大腦表面6 mm以下之組織、距大腦表面10 mm以下之組織、普爾欽細胞層、顆粒細胞層組織、深層小腦白質組織、及深層小腦核組織及其組合。
在一些實施例中，治療有效劑量介於0.005 mg/kg腦重量至100 mg/kg腦重量範圍內。在一些實施例中，治療有效劑量大於1 mg/kg腦重量。在一些實施例中，治療有效劑量大於10 mg/kg腦重量。在一些實施例中，治療有效劑量大於30 mg/kg腦重量。
在一些實施例中，投與間隔係每兩週一次。在一些實施例中，投與間隔係每月一次。在一些實施例中，投與間隔係每兩個月一次。
在另一態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體投與包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物，該投與涉及經腦脊髓膜內投與該組合物以將替代酵素遞送至外表面以下至少5 mm之深層腦組織。在一些實施例中，將替代酵素遞送至外表面以下至少10 mm之深層腦組織。在一些實施例中，將替代酵素特定遞送至深層腦組織之溶酶體。在某些實施例中，深層腦組織選自大腦深層白質、脊髓深層灰質、胼胝體、腦室周圍組織、丘腦、海馬傘、大腦皮質帶以下之組織、距大腦表面4 mm以下之組織、距大腦表面6 mm以下之組織、距大腦表面10 mm以下之組織、普爾欽細胞層、顆粒細胞層組織、深層小腦白質組織、及深層小腦核組織及其組合。
在又一態樣中，本發明提供包括以下步驟之方法：向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體經腦脊髓膜內投與包含溶酶體酵素之自人類細胞產生之替代酵素的組合物。在一些實施例中，溶酶體貯積症選自由下列組成之群：天冬胺醯葡萄糖胺尿症、膽固醇酯貯積症、沃爾曼病(Wolman disease)、胱胺酸貯積症、唐農病(Danon disease)、法布裏病(Fabry disease)、法伯脂肪肉芽腫病(Farber lipogranulomatosis)、法伯病(Farber disease)、岩藻糖苷貯積症、I/II型半乳糖唾液酸貯積症、I/II/III型戈謝病(Gaucher disease)、球樣細胞性腦白質營養不良、克拉伯病(Krabbe disease)、II型糖原貯積症、龐皮病(Pompe disease)、I/II/III型GM1-神經節苷脂貯積症、I型GM2-神經節苷脂貯積症、泰-薩克斯病(Tay Sachs disease)、II型GM2-神經節苷脂貯積症、桑德霍夫病(Sandhoff disease)、GM2-神經節苷脂貯積症、I/II型α-甘露糖苷貯積症、β-甘露糖苷貯積症、異染性腦白質營養不良、I型黏脂貯積症、I/II型唾液酸貯積症、II/III型黏脂貯積症、I-細胞病、IIIC型黏脂貯積症、假性胡爾勒多種營養不良(pseudo-Hurler polydystrophy)、I型黏多糖貯積症、II型黏多糖貯積症、亨特氏症候群(Hunter syndrome)、IIIA型黏多糖貯積症、A型、B型或C型聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)、IIIB型黏多糖貯積症、IIIC型黏多糖貯積症、IIID型黏多糖貯積症、IVA型黏多糖貯積症、莫爾基奧症候群(Morquio syndrome)、IVB型黏多糖貯積症、VI型黏多糖貯積症、VII型黏多糖貯積症、斯萊症候群(Sly syndrome)、IX型黏多糖貯積症、多發性硫酸酯酶缺陷、神經元蠟樣脂褐質貯積症、CLN1貝登氏症(CLN1 Batten disease)、CLN2貝登氏症、A/B型尼曼皮克病(Niemann-Pick disease)、C1型尼曼皮克病、C2型尼曼皮克病、緻密性成骨不全症、I/II型辛德勒病(Schindler disease)、戈謝病及唾液酸貯積症。在某些實施例中，溶酶體貯積症選自由下列組成之群：亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良(MLD)病、A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群及球樣細胞性腦白質營養不良(GLD)病。
在一些實施例中，替代酵素選自由下列組成之群：重組艾杜糖醛酸鹽(iduronate)-2-硫酸酯酶(I2S)、芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙醯肝素N-硫酸酯酶(HNS)、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶(Naglu)及β-半乳糖苷酶(GLC)。在某些實施例中，替代酵素含有甘露糖-6-磷酸鹽(M6P)殘基。在某些實施例中，替代酵素係包含溶酶體靶向部分之融合蛋白。
在一些實施例中，將替代酵素遞送至神經元、神經膠質細胞、血管周細胞及/或腦脊髓膜細胞。在一些實施例中，將替代酵素進一步遞送至脊髓中之神經元。在一些實施例中，腦脊髓膜內投與進一步使得替代酵素全身遞送於周圍目標組織中。在一些實施例中，周圍目標組織選自肝、腎、脾及/或心臟。
在一些實施例中，腦脊髓膜內投與達成替代酵素於腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之溶酶體定位。在某些實施例中，腦脊髓膜內投與使得腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之GAG貯積減少。在一些實施例中，GAG貯積與對照相比減少至少20%、40%、50%、60%、80%、90%、1倍(fold)、1.5倍或2倍。
在一些實施例中，腦脊髓膜內投與使得神經元中之空泡形成減少。在某些實施例中，神經元包含普爾欽細胞。
在一些實施例中，腦脊髓膜內投與使得腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中替代酵素之酵素活性提高。在某些實施例中，酵素活性與對照相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在某些實施例中，提高的酵素活性為至少約10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg、80 nmol/hr/mg、90 nmol/hr/mg、100 nmol/hr/mg、150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg或600 nmol/hr/mg。
在一些實施例中，腰區中之酵素活性提高。在某些實施例中，腰區中提高的酵素活性為至少約500 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg、700 nmol/hr/mg、800 nmol/hr/mg、900 nmol/hr/mg、1000 nmol/hr/mg、1500 nmol/hr/mg、2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg或10,000 nmol/hr/mg。
在一些實施例中，溶酶體貯積症另外伴隨非CNS症狀，且該方法進一步包含向個體經靜脈內投與替代酵素。在某些實施例中，靜脈內投與頻率不多於每月一次投與。
在另一態樣中，本發明提供治療亨特氏症候群之方法，其包括以下步驟：以治療有效劑量及一定投與間隔向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與重組艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)，以使亨特氏症候群之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。在一些實施例中，亨特氏症候群之該至少一種症狀或特徵係認知損害；白質損傷；腦實質、神經節、胼胝體及/或腦幹中之血管周間隙擴大；萎縮；及/或腦室擴大。
在再一態樣中，本發明提供治療異染性腦白質營養不良(MLD)病之方法，其包括以下步驟：以治療有效劑量及一定投與間隔向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與重組芳基硫酸酯酶A(ASA)，以使MLD病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。在一些實施例中，MLD病之該至少一種症狀或特徵係顱內壓增高、腦外積水、中樞及周圍神經系統中之髓鞘以及內臟器官中硫酸化糖脂積聚、CNS及PNS內進行性脫髓鞘及軸突損失、及/或運動及認知功能障礙。
在又一實施例中，本發明提供治療A型聖菲利波症候群(SanA)疾病之方法，其包括以下步驟：以治療有效劑量及一定投與間隔向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與重組乙醯肝素N-硫酸酯酶(HNS)，以使SanA病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。
在另一態樣中，本發明提供治療B型聖菲利波症候群(San B)疾病之方法，其包括以下步驟：以治療有效劑量及一定投與間隔向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與重組α-N-乙醯基葡萄糖胺酶(Naglu)，以使San B病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。在一些實施例中，San A或San B病之該至少一種症狀或特徵係聽力損失、語言發育遲緩、運動技能缺陷、活動過度、智力遲鈍、攻擊性及/或睡眠紊亂。在某些實施例中，重組Naglu酵素係包含Naglu及溶酶體靶向部分之融合蛋白。在一些實施例中，溶酶體靶向部分係IGF-II。
在另一態樣中，本發明提供治療球樣細胞性腦白質營養不良(GLD)病之方法，其包含以下步驟：以治療有效劑量及一定投與間隔向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與重組β-半乳糖苷酶(GLC)，以使GLD病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使發作延遲。在一些實施例中，GLD病之該至少一種症狀或特徵係易怒、抽搐、精神衰退、耳聾、失明、肌陣攣發作、肌肉張力過大、發育遲緩、發育技能減退、過敏、震顫、共濟失調、痙攣狀態、發作性劇吐、腦白質營養不良、大腦萎縮、產生球樣細胞及/或脫髓鞘。
在另一態樣中，本發明提供用於腦脊髓膜內投與之系統，其包括輸液裝置；空心體，其具有與該輸液裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量孔；及用於該空心體緊固插入脊髓中之緊固機構(securing mechanism)。在一些實施例中，該緊固機構包含一或多個安裝於空心體表面上之球形頭及於該一或多個球形頭上可調整之縫合環。在一些實施例中，輸液裝置係可注射座(injectable port)。在一些實施例中，可注射座係可植入的。在某些實施例中，輸液裝置係幫浦。
本申請案中所用之術語「約(about及approximately)」係以等效詞使用。本申請案中所用之任何數字帶有或不帶有約(about/approximately)均意欲涵蓋熟習相關技術者所瞭解之任何正常波動。
本發明之其他特徵、目標及優點在下文詳細說明中明示。然而，應瞭解，詳細說明儘管簡述本發明之實施例，但僅出於說明目的給出而非限制本發明。熟習此項技術者根據詳細說明會明瞭本發明範圍內之各種變化形式及修改形式。
圖式僅用於說明性目的而非限制性目的。
本發明提供適於將治療有效量之治療劑遞送至個體CNS中之醫藥組合物以及與使用該等醫藥組合物有關之治療方法。由於可投與至中樞神經系統(CNS)中之治療劑的注射體積有限以及該房室中獨特的流體動力學、組成及代謝，預期僅特定組合物適於直接CNS投與以避免不良事件。本發明提供適於任何治療劑之CNS遞送的調配物設計空間(formulation design space)。另外，該調配物設計空間適於蛋白質治療劑之穩定性。
在某些實施例中，本文所述醫藥組合物之特徵在於能夠將一或多種用於治療諸如溶酶體貯積症(例如，A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良)等疾病之治療劑(例如，以重組方式製備之酵素，例如乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶及/或半乳糖腦苷酶)有效遞送至特定目標細胞及組織(例如，以下中之一或多者：灰質、白質、大腦皮質、小腦、普爾欽細胞、小腦中之普爾欽細胞、少突膠質細胞、少突膠質細胞溶酶體以及CNS中之其他特定組織及細胞類型)。
在某些實施例中，該等醫藥組合物能夠使一或多種治療劑(例如，乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶及/或半乳糖腦苷酶)分佈至CNS之特定細胞及/或組織中，由此治療具有CNS後遺症、表現或病因之疾病(例如，亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群)。投與該等醫藥組合物可藉由(例如)調節與該疾病有關之病理來治療或解決該疾病，例如，藉由減少或減弱受溶酶體貯積症侵襲之個體CNS中之細胞空泡形成及/或斑馬細胞的數量及/或尺寸。
該等醫藥組合物可包括一或多種治療劑及一或多種緩衝劑。在該等醫藥組合物之某些實施例中，治療劑可溶於該組合物中，該組合物係穩定的且該組合物在經腦脊髓膜內投與至該個體時耐受。
在一替代實施例中，可將醫藥組合物凍乾。該等組合物包含一或多種治療劑、一或多種緩衝劑、一或多種表面活性劑及一或多種滲透壓調節劑。該等凍乾醫藥組合物可使用稀釋劑(例如，無菌水、注射用抑菌水及/或無菌鹽水溶液)加以復原以使組合物適於投與至個體，且尤其適於將治療劑遞送至該個體之中樞神經系統。
若治療劑可溶於某些實施例之水性及凍乾醫藥組合物中，組合物係穩定的且組合物在經腦脊髓膜內投與至個體時耐受，則可認為該等組合物適於將治療劑遞送至該個體之中樞神經系統中。
在一些實施例中，水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)具有低pH及低磷酸鹽含量。例如，該組合物之pH可呈酸性或小於約7或8。在其他實施例中，該等水性及凍乾醫藥組合物具有小於約10 mM、小於約20 mM或小於約30 mM之磷酸鹽含量。
水性及凍乾醫藥調配物中之預期治療劑包括蛋白質及/或酵素，其或者可以重組方式加以製備。適宜酵素包括溶酶體酵素(例如，α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A及半乳糖腦苷酶)。較佳地，該等酵素可溶於醫藥組合物中。在一些特定實施例中，該等蛋白質及/或酵素不包含修飾(例如，會使該蛋白質更穩定或促進該蛋白質通過BBB之修飾)。
某些實施例係關於適於將治療有效量之蛋白質或酵素(例如，α-N-乙醯基葡萄糖胺酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、半乳糖腦苷酶或艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)經腦脊髓膜內遞送至個體中樞神經系統、且具體而言個體中樞神經系統內之某些細胞、組織或細胞器之水性及凍乾醫藥組合物。例如，某些實施例係關於包含艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、約154 mM氯化鈉及約0.005%之聚山梨醇酯20之低pH(例如，約6)組合物。
在某些實施例中，該等水性醫藥組合物之特徵在於能夠分佈至個體之腦組織及/或細胞中。例如，本發明醫藥組合物能夠分佈至該個體之大腦皮質、尾狀核及豆狀核殼、丘腦、灰質、小腦、神經元及/或普爾欽細胞中。
在其他實施例中，該等醫藥組合物促進其中包含之一或多種治療劑(例如，用於治療溶酶體貯積症之酵素)之細胞定位。例如，在某些實施例中，該等醫藥組合物促進或展示治療劑之細胞定位，由此該治療劑容易地分佈至患病或目標細胞(例如，患有諸如亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良等溶酶體貯積症之個體中的神經元及/或少突膠質細胞)中。在一些特定實施例中，該等水性醫藥組合物促進或促使其中含有之治療劑分佈至目標細胞或組織之一或多種特定細胞器(例如，溶酶體)中。在其他實施例中，該等醫藥組合物能夠客觀地改良、改變或調節一或多種疾病(例如溶酶體貯積症)之臨床病程。例如，在一些實施例中，該等醫藥組合物減少受侵襲個體(例如，患有亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良之個體)之腦組織中之細胞空泡形成。在其他實施例中，該等醫藥組合物減少受溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)侵襲之個體之腦組織中特有的柵狀片層體(palisaded lamellar body)或「斑馬體(zebra body)」的存在。
在某些實施例中，該等醫藥組合物引起或展示一或多種通常與溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群或異染性腦白質營養不良)有關之病理或生物標記之存在或積聚的減少(例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多減少)或完全消除。具體而言，該等醫藥組合物引起或展示CNS細胞及組織(例如，神經元及/或少突膠質細胞)中之病理或生物標記的減少或消除。例如，在一些實施例中，在投與至個體後，該等醫藥組合物展示或達成個體CNS細胞及組織(例如，大腦皮質、白質及/或丘腦)中之生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)之積聚的減少。
在一些實施例中，本發明係關於減少或消除一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之存在或積聚的方法。類似地，一些實施例係關於增加一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之降解(或降解速率)的方法。
在其他實施例中，水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)具有小於約30 mg/mL或介於約10-20 mg/mL之間之蛋白質濃度。該等醫藥組合物之劑量體積通常小於約5.0 mL且較佳小於約3.0 mL。
在某些實施例中，在投與醫藥組合物後，在目標細胞及組織(例如，腦組織或CSF)中檢測到治療濃度的其中含有之治療劑。例如，在投與後(例如，在經腦脊髓膜內投與至個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，醫藥組合物在個體之CNS組織中達到至少30 μg/ml之濃度。在另一實施例中，醫藥組合物在個體之目標組織或細胞(例如，腦組織或神經元)中達到至少20 μg/ml、至少15 μg/ml、至少10 μg/ml、至少7.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少2.5 μg/ml、至少1 μg/ml或至少0.5 μg/ml之濃度。
在一些涵蓋的實施例中，蛋白質在該醫藥組合物中穩定(例如，在室溫下穩定至少十二個月)。本發明亦涵蓋緩衝劑係以足以使組合物之pH保持介於約5.0與約8.0之間的量存在之水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)。在某些實施例中，存在於水性醫藥組合物中之緩衝劑係磷酸鈉，且係以足以使組合物之pH保持約7.0的量存在。適宜緩衝劑之實例包括乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽及Tris。
水性醫藥組合物可進一步包含一或多種滲透壓調節劑，該等滲透壓調節劑可為鹽或糖(例如，蔗糖、葡萄糖、甘露醇及氯化鈉)。在滲透壓調節劑係蔗糖之情形下，其可以小於約3.0%(w/v)之濃度存在。水性醫藥組合物可進一步包含一或多種表面活性劑(例如，非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)。表面活性劑聚山梨醇酯20或80可以小於約0.04%(w/v)或小於約0.005%(w/v)之濃度存在於水性組合物及凍乾組合物中。在一些特定實施例中，水性及凍乾醫藥組合物包含磷酸鈉、聚山梨醇酯20及蔗糖以及重組蛋白質。
某些實施例之水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)較佳經調配使得治療劑不會自組合物沉澱出來。在某些實施例中，該等組合物不含有鈣或其鹽。
較佳者係投與至個體後隨時間推移不展示嚴重不良臨床體徵或反應之組合物。在一較佳實施例中，該等水性醫藥組合物適於將治療劑遞送至個體之腦脊髓液及/或經腦脊髓膜內遞送，由此在投與至該個體後治療劑分佈至該個體之腦組織(例如，大腦皮質、小腦及/或大腦)中。因此，某些實施例之水性及凍乾醫藥組合物較佳係無菌的且利用適當無菌技術投與至個體。
本發明亦涵蓋治療患有特徵在於一或多種溶酶體酵素之含量降低之疾病(例如，亨特氏症候群、B型聖菲利波症候群或異染性腦白質營養不良)之個體的方法以及治療患有具有中樞神經系統病因或表現之疾病之個體的方法。在每一情形下，該等方法涵蓋投與本文所述之水性及凍乾醫藥組合物。該疾病可包括(例如)A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良。某些實施例係關於改良、治癒或調節疾病(例如溶酶體貯積症)之進展的方法。具體而言，該等實施例係關於治療被描述成具有一或多種CNS表現之疾病(例如，亨特氏症候群)的方法。例如，在某些實施例中，本發明所揭示方法係關於在向個體(例如，患有亨特氏症候群之個體)經腦脊髓膜內投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶後減少受侵襲個體腦組織中之細胞空泡形成。在另一實施例中，本發明所揭示方法係關於減少受溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群)侵襲之個體之腦組織中特有的柵狀片層體或「斑馬體」的存在。在一較佳實施例中，投與水性醫藥組合物(及在復原時之凍乾醫藥組合物)之個體係人類。在另一實施例中，人類係新生兒。可直接將該等組合物投與至該個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內)。
某些實施例亦包括調配適於將治療劑遞送至個體中樞神經系統中之醫藥組合物的方法。該等方法通常包含評定該治療劑於該醫藥組合物中之溶解性、評定該治療劑於該醫藥組合物中之穩定性及評定該醫藥組合物在經腦脊髓膜內投與至個體後之耐受性。
本文所述組合物及方法可用於治療一或多種溶酶體貯積症之神經及軀體後遺症。例如，一些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)以治療溶酶體貯積症(例如，A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良)之CNS或神經後遺症及表現的組合物及方法。某些實施例亦包括治療患有溶酶體貯積症之個體的方法，其中該等方法包含治療該溶酶體貯積症之CNS或神經後遺症及表現的步驟(例如，藉由將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中)及治療該溶酶體貯積症之軀體或全身後遺症及表現的步驟(例如，藉由將一或多種治療劑非經腸、經靜脈內、經口、局部或藉由吸入投與至個體)。例如，可將組合物經腦脊髓膜內投與至個體，由此將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中並治療神經後遺症，外加靜脈內投與一或多種治療劑以將該等治療劑遞送至全身循環之細胞及組織(例如，心臟、肺、肝、腎或淋巴結之細胞及組織)中，由此治療軀體後遺症。例如，可向患有溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)或受該疾病侵襲之個體每月一次經腦脊髓膜內投與包含一或多種治療劑(例如，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之醫藥組合物以治療神經後遺症，並且每週一次經靜脈內向該個體投與相同或不同治療劑以治療全身或軀體表現。
在一些實施例中，本發明提供治療具有CNS病因之溶酶體貯積症的方法，其藉由向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與治療有效量之重組溶酶體酵素來實施。在一些實施例中，本發明可用於治療選自以下疾病之溶酶體貯積症：異染性腦白質營養不良、A型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、黏多糖貯積症、B型聖菲利波症候群或球樣細胞性腦白質營養不良。在一些實施例中，適於本發明之溶酶體酵素選自芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶或半乳糖腦苷酶。
在一些實施例中，本發明提供治療異染性腦白質營養不良之方法，其藉由向需要治療之個體經腦脊髓膜內投與治療有效量之重組ASA來實施。在一些實施例中，治療有效量大於約1 mg/kg腦重量。在一些實施例中，治療有效量大於約10 mg/kg腦重量。在一些實施例中，治療有效量介於約10 mg/kg腦重量至100 mg/kg腦重量範圍內。在一些實施例中，每隔一個月經腦脊髓膜內投與一次重組ASA。在一些實施例中，每月經腦脊髓膜內投與一次重組ASA。在一些實施例中，每兩週經腦脊髓膜內投與一次重組ASA。在一些實施例中，本發明方法進一步包含向個體經靜脈內投與重組ASA之步驟。在一些實施例中，適於本發明之重組ASA係重組人類ASA。
某些實施例至少部分係基於以下發現：本文所揭示醫藥組合物促進一或多種治療劑(例如，以重組方式製備之酵素)有效遞送及分佈至CNS之特定(例如，目標)組織、細胞及/或細胞器中。某些實施例之醫藥組合物及調配物能夠溶解高濃度之治療劑(例如，蛋白質或酵素)，且適於將該等治療劑遞送至個體之CNS中以治療具有CNS成份(component)及/或病因之疾病。本文所述組合物之特徵進一步在於投與至需要其之個體之CNS(例如，經腦脊髓膜內)後具有改良之穩定性及改良之耐受性。
如上文所討論，BBB係限制物質擴散跨過BBB及擴散至下面的CNS中之結構系統。在全身遞送大的大分子(例如外源治療性蛋白質及酵素)後，大多未成功地在CNS之細胞及組織內達到治療劑之治療濃度。例如，嘗試僅全身投與酵素來治療泰-薩克斯病具有有限之治療價值，此乃因該等酵素至CNS之細胞及組織中之分佈較差以及該等酵素以全身方式清除及降解。(von Specht BU等人，Neurology(1979) 29:848-854.)因此，將大分子治療劑遞送跨過BBB並隨後在CSF及CNS組織(例如，腦)中達到及/或保持該等治療劑之有效治療濃度係治療具有特定CNS成份及/或病因之疾病的特定挑戰。具體而言，除非酵素可被有效地遞送至需要的作用位點(例如，腦組織，例如大腦皮質、小腦及/或大腦)，否則酵素替代療法(ERT)對於治療與CNS組織中一或多種酵素病理性缺陷有關之疾病(例如，溶酶體貯積症)的功用及功效仍然有限。
由於BBB之障壁特性及與全身投與治療性蛋白質及/或酵素有關之侷限性，較佳將本文所述醫藥組合物直接投與至個體之CNS中。本發明醫藥組合物之較佳投與途徑包括(例如)腦脊髓膜內、腦室內、大腦室內及腦池內遞送。
治療劑之腦脊髓膜內投與通常藉由腰椎穿刺術(即，緩慢團注)或經由座-導管(port-catheter)遞送系統(即，輸注或團注)來實施。使植入的導管連接至貯液器(用於團注遞送)或輸注幫浦(植入或在外部)。導管最通常插入於腰椎板之間，且尖端向上穿過腦脊髓膜間隙至期望節段(通常為L3-L4)。儘管認為具有侵入性，但將治療劑投與至脊髓周圍之腦脊髓膜內間隙中仍然為將治療劑直接且有效地遞送跨過BBB並遞送至下面的CSF中之最常見方式。(參見Kroin JS,Clin Pharmacokinet(1992) 22(5):319-326，其全部內容以引用方式併入本文中。)
相對於可經靜脈內投與至個體之體積，適於腦脊髓膜內投與之體積通常係治療具有CNS病因之某些疾病之特有障礙。治療劑之腦脊髓膜內遞送進一步受保持CSF組成之微妙平衡以及保持個體顱內壓所限制。例如，在人類中，治療劑之腦脊髓膜內團注遞送體積通常限於0.5-1 mL。(例如，參見Grouls RJE等人，General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery. Spinal Drug Delivery，第15章. Elsevier Science(Yaksh,TL編輯)1999，其全部內容以引用方式併入本文中。)此外，在不自個體對應移除CSF的情況下，在人類中總腦脊髓膜內劑量體積限於小於3 mL。
本發明醫藥組合物亦可用於將治療劑經腦室內遞送至個體之CNS中(即，直接投與至腦室中)。腦室內遞送可經由Ommaya氏貯液器或其他類似輸液座(access port)加以促進，該貯液器或其他類似輸液座可植入於位於個體頭頂部在頭皮與骨膜之間之袋狀物中，其中導引導管直接放置於腦室中。(Nutts JG等人，Neurology(2003) 60:69-73.)本發明亦涵蓋將治療劑投與至小腦延髓池(cerebellomedullary cistern或cisterna magna)之CSF中，此方式可在(例如)動物物種中使用係由於與腦脊髓膜內或腦室內投與相比在小型齧齒類動物中使用此方式後勤方便。
本發明之水性醫藥組合物較佳以通常小於4.0 mL、小於3.0 mL、小於2.5 mL、小於2.0 mL、小於1.5 mL、小於1.0 mL、小於0.5 mL或小於0.25 mL劑量之體積投與至個體。
傳統用於將治療劑遞送至個體之CNS中之水性醫藥溶液及組合物包括不含緩衝劑之等滲鹽水及Elliott's B溶液(其為人造CSF)。描述CSF相對於Elliott's B溶液之組成之比較包括於下表1中。如表1中所示，Elliot's B溶液之濃度接近等同於CSF之濃度。然而，Elliott's B溶液含有非常低之緩衝劑濃度，且因此可能不能提供穩定治療劑(例如，蛋白質)所需要之足夠緩衝能力，尤其在較長時間內(例如，在儲存條件期間)。此外，Elliott's B溶液含有某些可能與意欲遞送一些治療劑且尤其蛋白質或酵素之調配物不相容的鹽。例如，存在於Elliott's B溶液中之鈣鹽能夠介導蛋白質沉澱且由此降低調配物之穩定性。
本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定與其一起調配之一或多種治療劑(例如重組蛋白質)，或者減緩或阻止其降解。本文所用之術語「穩定的」係指治療劑(例如重組酵素)能夠在較長時間內保持其治療功效(例如，其預期生物活性及/或生理化學完整性(physiochemical integrity)之全部或大部分)。可在較長時間內(例如，較佳持續至少1個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、30個月、36個月或更長時間)評定治療劑之穩定性及醫藥組合物保持該治療劑之穩定性的能力。
治療劑之穩定性對於保持使該治療劑起到其預期治療功能所需要之特定治療劑濃度範圍特別重要。可在較長時間內相對於治療劑之生物活性或生理化學完整性進一步評定治療劑之穩定性。例如，可對照早期時間點(例如，調配後第0天)之穩定性或對照未經調配治療劑比較給定時間點之穩定性，且該比較之結果以百分比表示。較佳地，本發明醫藥組合物在較長時間內保持治療劑生物活性或生理化學完整性之至少100%、至少99%、至少98%、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%(例如，如在至少約6至12個月內於室溫下或在加速儲存條件下所量測)。
該等治療劑較佳可溶於本發明醫藥組合物中。當關於本發明治療劑時，術語「可溶的」係指該等治療劑能夠形成均質溶液。較佳地，治療劑於溶液中之溶解性足以容許將治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點，其中將治療劑投與至該溶液中並藉由該溶液轉運至目標作用位點(例如，腦細胞及組織)。數個因素可影響治療劑之溶解性。例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基酸序列及存在其他輔助溶解劑(co-solubilizing agent)或鹽(例如鈣鹽)。在一些實施例中，該等醫藥組合物經調配而使該等組合物不包含鈣鹽。
儘管通常對於非經腸投與藥物而言等滲溶液係較佳的，但使用等滲溶液可能限制一些治療劑且尤其一些蛋白質及/或酵素之充分溶解。已證實輕微高滲溶液(例如，高達175 mM氯化鈉存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)及含糖溶液(例如，高達2%蔗糖存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)在猴子中具有良好耐受性。最常見之經批准CNS團注調配組合物係鹽水(150 mM NaCl水溶液)。
先前已測試數種組合物且展示較差之安全性特徵(safety profile)。(von Specht BU等人，Neurology(1979) 29:848-854；Grondin R等人，Brain(2002) 125:2191-2201；Gill SS等人，Nature Medicine(2003) 9(5):589-95；Hood DD等人，Anesthesiology(1995) 82(2): 331-43；Sakura SM等人，Anesthesiology(1997) 87(4):771-8；Eisenach JC等人，Pain(2002) 99:599-604；King H等人，Can J Anaesth(1993) 40(5):431-4；Rane K等人，Anesthesiology(1998) 89(5):1108-15；Steven RA等人，Anesthesiology(1993) 78(3):492-7；Dominiquez AR等人，Clin Transl Oncol(2005) 7(6):232-8；Kim S等人，J. Clin. Oncology(1993) 11(11):2186-2193；Shulman M等人，Reg Anesth(1990) 15(3):142-6；Shulman M等人，Reg Anesth Pain Med (1998) 23(4):395-401)。
本發明醫藥組合物之特徵在於其耐受性。本文所用之術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物不在投與該組合物之個體中引發不良反應或另一選擇為不在投與該組合物之個體中引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中具有良好耐受性。
許多治療劑且尤其本發明之蛋白質及酵素需要受控pH及特定賦形劑以在本發明醫藥組合物中保持其溶解性及穩定性。下表2給出認為可保持本發明蛋白質治療劑之溶解性及穩定性之蛋白質調配物的典型實例性態樣。
醫藥組合物之pH係能夠改變治療劑(例如，酵素或蛋白質)於水性醫藥組合物中之溶解性的另一因素，且因此本發明醫藥組合物較佳包含一或多種緩衝劑。在一些實施例中，水性醫藥組合物包含足以使該組合物之最佳pH保持介於約4.0-8.0之間、介於約5.0-7.5之間、介於約5.5-7.0之間、介於約6.0-7.0之間及介於約6.0-7.5之間的量之緩衝劑。在其他實施例中，緩衝劑包含約5-50 mM之磷酸鈉且足以使該水性醫藥組合物之最佳pH保持在約7.0。適宜緩衝劑包括(例如)乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽及Tris。本發明醫藥組合物之緩衝劑濃度及pH範圍在使於成年及幼年猴子中給藥時調配物耐受性最大化中係重要因素。
在一些實施例中，治療劑(例如，蛋白質及酵素)之特徵進一步在於未對其進行修飾以增強該等治療劑遞送或轉運跨過BBB及遞送或轉運至CNS中。例如，該等治療劑不依賴於利用主動轉運機制(例如受體介導之轉運)，由此大分子通過以固有主動轉運系統作為促進該等治療劑遞送跨過BBB之方式而被主動轉運跨過BBB。
儘管本發明醫藥組合物在投與個體時通常呈水性形式，但在一些實施例中本發明醫藥組合物係凍乾的。該等組合物在投與個體之前需藉由向其中添加一或多種稀釋劑加以復原。適宜稀釋劑包括(但不限於)無菌水、注射用抑菌水及無菌鹽水溶液。較佳地，在復原醫藥組合物後，其中含有之治療劑穩定，易溶解且在投與個體後展示耐受性。
本發明之醫藥組合物、調配物及相關方法可用於將多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)及用於治療有關疾病。本發明醫藥組合物尤其可用於將蛋白質及酵素(例如，酵素替代療法)遞送至患有溶酶體貯積症之個體中。溶酶體貯積症係由溶酶體功能障礙引起之一類相對罕見之遺傳性代謝病症。溶酶體疾病之特徵在於溶酶體內積聚未消化之大分子，此導致該等溶酶體之尺寸及數量增加且最終導致細胞功能障礙及臨床異常。
儘管對於溶酶體貯積症之軀體症狀的治療已經取得了一些進展，但對於伴隨該等疾病之通常具有破壞性的神經後遺症尚未取得類似的療法發展。例如，嚴重的亨特氏症候群在受侵襲患者之腦中呈現組織學變化，此可包括萎縮、皮質神經元腫脹、大腦白質減少、血管周間隙擴大及普爾欽細胞樹突腫脹。磁共振成像/光譜研究已顯示，與不患有認知損害者相比，在患有認知損害之患者中涉及白質之嚴重彌漫性損傷、腦萎縮及腦積水較常見。(Vedolin,L.等人，AJNR Am J Neuroradiol(2007) 28,1029-1033)。甚至不患有諸如智力遲鈍或發育遲緩等極度神經後遺症的患者也顯示具有腦異常，包括萎縮、腦室擴大及血管周間隙擴大。(Matheus,MG等人，Neuroradiology(2004) 46,666-672.)
因此，某些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至CNS細胞之一或多種細胞器(例如，溶酶體)中以治療該等溶酶體貯積症且尤其治療該等溶酶體貯積症之神經後遺症的方法。例如，某些實施例係關於向受亨特氏症候群侵襲之個體之中樞神經系統中投與(例如，經腦脊髓膜內)包含治療有效量之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶之醫藥組合物，其中該醫藥組合物使得艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶分佈及/或積聚至一或多種受侵襲細胞器(例如溶酶體或粒線體)中。某些實施例係關於治療一或多種溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群)之方法，其藉由減少或消除個體溶酶體內未消化大分子之積聚或另一選擇為減小該等溶酶體之尺寸及數量由此減少或改善細胞功能障礙及其他有關臨床異常來實施。因此，本發明之方法及醫藥組合物可減弱、治癒或改善溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)之CNS表現。可藉由該等方法及組合物治療之其他溶酶體貯積症種類可為熟習此項技術者例行獲知且例行獲得。(參見例如，Kolodny等人，「Storage Diseases of the Reticuloendothelial System」，Nathan and Oski's Hematology of Infancy and Childhood,(1998)第5版，第2卷，David G. Nathan及Stuart H. Orkin編輯，W. B. Saunders公司，第1461-1507頁，其內容以引用方式併入本文中。)
可使用本發明方法及組合物治療之溶酶體貯積症包括具有CNS病因或成份之疾病。具有CNS病因或成份之溶酶體貯積症包括(例如且不限於)A型聖菲利波症候群、B型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良。經批准療法之侷限性在於其經靜脈內投與個體且通常僅可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。本發明組合物及方法可有利地直接投與至患有具有該CNS病因之疾病之個體的CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)，由此在CNS之受侵襲細胞及組織(例如，腦)內達到治療濃度，從而克服與傳統的全身投與該等治療劑有關之限制。
某些實施例之醫藥組合物亦可被描述成能夠有效地分佈至CNS細胞及組織中，由此將一或多種治療劑(例如，以重組方式製備之用於治療溶酶體貯積症的酵素)遞送至目標細胞及組織中(或使該一或多種治療劑與目標細胞及組織接觸)。在一些實施例中，該等醫藥組合物能夠促進一或多種治療劑分佈至CNS細胞及組織(例如，神經元)中，由此治療具有CNS表現之疾病(例如，亨特氏症候群)。在某些實施例中，目標組織可包括CSF及/或腦(例如，白質、灰質、大腦皮質、小腦、大腦、穹窿及/或胼胝體)。在某些實施例中，該等醫藥組合物(例如，經腦脊髓膜內投與之I2S)可促進治療劑於一或多種目標細胞(例如，神經元、外顯子、軸突、少突膠質細胞及/或普爾欽細胞)中之細胞定位。在某些實施例中，該等醫藥組合物(例如，經腦脊髓膜內投與之溶酶體酵素)可促進治療劑於目標組織或目標細胞之一或多種細胞器(例如，溶酶體、粒線體或空泡)中之定位。
在一些實施例中，本發明組合物及方法可經腦脊髓膜內投與，且展示在腦之深層細胞、組織及細胞器中達到缺陷蛋白質或酵素之治療濃度的能力。例如，在一些實施例中，經腦脊髓膜內投與之酵素展示易位動力學，由此酵素在血管周間隙內移動(例如，藉由脈動輔助之對流機制)。另外，與所投與蛋白質或酵素與神經絲之結合有關之主動軸突轉運機制亦可有助於或促進經腦脊髓膜內投與之蛋白質或酵素分佈至中樞神經系統之深層組織中。
本文所述醫藥組合物可有利地促進一或多種治療劑遞送至目標細胞器中。例如，由於溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)之特徵在於受侵襲細胞之溶酶體中積聚糖胺聚多糖(GAG)，故對於治療溶酶體貯積症而言溶酶體係有吸引力的目標細胞器。因此，在某些實施例中，該等醫藥組合物使得或促進其中含有之治療劑分佈至目標細胞且尤其該等目標細胞內之細胞器(例如溶酶體)中。
在某些實施例中，本發明醫藥組合物引起或展示一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記之存在或另一選擇為積聚的減少(例如，約5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%、95%、97.5%、99%或更多減少)或完全消除。該減少或消除在CNS細胞及組織(例如，神經元及少突膠質細胞)中尤其明顯。例如，在一些實施例中，在投與個體後，本發明醫藥組合物展示或達成個體之CNS細胞及組織中(例如，大腦皮質、小腦、尾狀核及豆狀核殼、白質及/或丘腦中)生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)積聚之減少。LAMP1係高度表現於溶酶體膜中之糖蛋白，且在許多患有溶酶體貯積症之患者中其存在提高。(Meikle等人，Clin Chem.(1997) 43:1325-1335.)因此，在患有溶酶體貯積症之患者中存在或不存在LAMP1(例如，如藉由LAMP染色所測定)可提供溶酶體活性之有用指示及用於診斷及監測溶酶體貯積症之標記。
因此，本發明之一些實施例係關於減少或消除一或多種與疾病(例如，溶酶體貯積症)有關之病理或生物標記之存在或積聚的方法。類似地，本發明之一些實施例係關於增加一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記(例如，LAMP1)之降解(或降解速率)的方法。
本發明組合物及方法亦可用於治療溶酶體貯積症之神經及軀體後遺症。例如，本發明之一些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中(例如，經腦脊髓膜內、經腦室內或經腦池內)以治療溶酶體貯積症之CNS或神經後遺症及表現，同時亦治療該溶酶體貯積症之全身或軀體表現的組合物及方法。例如，可將一些本發明組合物經腦脊髓膜內投與至個體，由此將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中並治療神經後遺症，外加靜脈內投與一或多種治療劑以將該等治療劑遞送至全身循環之細胞及組織(例如，心臟、肺、肝、腎或淋巴結之細胞及組織)中，由此治療軀體後遺症。例如，可向患有溶酶體貯積症(例如，亨特氏症候群)或受該疾病侵襲之個體至少每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次或更經常地經腦脊髓膜內投與包含一或多種治療劑(例如，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶)之醫藥組合物以治療神經後遺症，同時更頻繁地(例如，每天一次、每隔一天一次、每週三次或每週一次)經靜脈內向該個體投與不同治療劑以治療該疾病之全身或軀體表現。
當關於本發明醫藥組合物時，本文所用之片語「適於遞送至中樞神經系統中」通常係指該等組合物之穩定性、耐受性及溶解性特性以及該等組合物將其中含有之有效量之治療劑遞送至目標遞送位點(例如，CSF或腦)的能力。在一些實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。在一些實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性且能夠溶解其中含有之治療劑，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。
本發明組合物及方法通常適用於許多治療劑。在一些實施例中，本發明醫藥組合物及方法包含蛋白質及/或酵素作為治療劑。在本發明一些實施例中，治療劑可為天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。在一些實施例中，治療劑係可用於治療疾病(例如，溶酶體貯積症)之天然或重組酵素。例如，在某些實施例中，本發明醫藥組合物包含重組酵素乙醯肝素N-硫酸酯酶、艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶A、α-N-乙醯基葡萄糖胺酶或半乳糖腦苷酶中之一或多者。
本發明方法涵蓋單次以及多次投與有效量之本文所述醫藥組合物。該等醫藥組合物可每隔一定時間投與，此端視個體病狀(例如，溶酶體貯積症)之性質、嚴重程度(severity)及範圍(extent)而定。在一些實施例中，可每隔一定時間週期性地投與有效量之本發明醫藥組合物(例如，一年一次、一年四次、兩個月一次、一月一次、兩週一次、一週一次、一週兩次、一週三次、每天一次、一天兩次、一天三次或四次或更頻繁)。
在某些實施例中，本發明醫藥組合物係無菌的且利用適當無菌技術投與至個體。
本文所用之術語「個體」意指任何哺乳動物，包括人類。在本發明之某些實施例中，個體係成年、少年或幼兒。本發明亦涵蓋在子宮內投與該等醫藥組合物及/或實施該等治療方法。
本文所用之術語「有效量」主要係基於本發明醫藥組合物中所含有治療劑之總量來確定。通常，有效量足以對個體達成有意義的益處(例如，治療、調節、治癒、預防及/或改善潛在疾病或病狀)。例如，本發明醫藥組合物之有效量可為足以達成期望治療及/或預防效果的量，例如足以調節溶酶體酵素受體或其活性由此治療該溶酶體貯積症或其症狀(例如，在將本發明組合物投與個體後減少或消除「斑馬體」或細胞空泡形成的存在或發生)的量。通常，投與至有需要之個體的治療劑(例如，重組溶酶體酵素)的量應端視個體特徵而定。該等特徵包括個體之病狀、疾病嚴重程度、總體健康狀況、年齡、性別及體重。熟習此項技術者可容易地能夠端視該等及其他相關因素來確定合適劑量。另外，可視情況利用客觀及主觀分析來確定最佳劑量範圍。
確定治療個體所需要之治療劑的有效量在研發本發明醫藥組合物時係尤其重要的考慮因素。可經腦脊髓膜內投與至個體之有限體積可影響醫藥組合物中治療劑之濃度。在某些實施例中，醫藥組合物中治療劑之濃度足以在受侵襲之CNS細胞及組織(例如，腦)中達到該治療劑之治療濃度。
例如，在投與某些實施例之醫藥組合物後，可在目標細胞及組織(例如，腦組織或CSF)中達到或檢測到其中含有之治療劑的治療濃度。在某些實施例中，在投與後(例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜內投與至個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，醫藥組合物在個體之CNS組織及細胞中達到至少30 μg/ml之濃度。在某些實施例中，在投與至個體後(例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜內投與至個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間)，該等醫藥組合物在該個體之目標組織或細胞(例如，腦組織或神經元)中達到至少20 μg/ml、至少15 μg/ml、至少10 μg/ml、至少7.5 μg/ml、至少5 μg/ml、至少2.5 μg/ml、至少1.0 μg/ml或至少0.5 μg/ml之濃度。
在某些實施例中，醫藥組合物中治療劑之濃度係至少50 mg/mL、至少45 mg/mL、至少40 mg/mL、至少35 mg/mL、至少30 mg/mL、至少25 mg/mL、至少20 mg/mL、至少15 mg/mL、至少10 mg/mL、至少5 mg/mL、至少2.5 mg/mL、至少1 mg/mL或小於1 mg/mL。較佳地，該治療劑可溶於本發明醫藥組合物中。較佳地，本發明醫藥組合物在長時間內保持穩定(例如，在室溫下或另一選擇為在36-46℉之冷凍條件下穩定至少12個月)。
儘管已根據某些實施例具體地闡述本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用以闡釋本發明化合物且並不意欲對其加以限制。
應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞「一(a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的一或多個成員間包括「或」的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有一個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。此外，應瞭解，除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等引入附屬於相同基礎技術方案(或任一其他相關技術方案)之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式(例如，以馬庫西群組(Markush group)或類似格式)給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之背景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。
實例 IT遞送GalC蛋白質之實例 實例1：用於腦脊髓膜內遞送之GALC調配物的生理化學表徵
本實例闡述GalC之生理化學表徵以瞭解其在蛋白質之腦脊髓膜內(IT)遞送期間在不同溶液條件下之狀況及穩定性。
本實例尤其闡述對於GalC之成功IT遞送甚為重要之GalC調配物。在一些實施例中，該調配物包括5 mM磷酸鈉+150 mM NaCl，pH 6.0+0.005%聚山梨醇酯20。在一些實施例中，該調配物包括<5 mM、<10 mM、<15 mM及<20 mM磷酸鈉。在一些實施例中，該調配物包括150 mM NaCl，pH5.5且pH7.0。
在成年食蟹猴中測試具有不同磷酸鹽體積莫耳濃度及pH之PBS遞送媒劑(圖3)。在猴子中，5 mM磷酸鹽pH介於5.5-7.0範圍內未顯示不良效應，而20 mM磷酸鹽pH介於7.0-7.5之間及10-20 mM磷酸鹽pH介於7.5-8.0之間顯示不良效應(圖3)。研究hGalC(1 mg/ml)在含有50 mM NaCl之3 mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑中之熱穩定性隨pH(在pH 5.0-8.0範圍內)之變化(圖4)。在基線(20-25℃)及在40℃下2週時量測hGalC比活性，其中在pH 6.0-6.5下保持最高比活性(圖4)。另外，在5℃下3個月時量測hGalC比活性，其中在pH 6.0-6.5下保持最高比活性(圖5)。量測hGalc之熔化溫度隨pH之變化(表1)，並且在不同調配物中獨立地進行量測(表2)。
亦評價hGalC之熱穩定性隨鹽濃度之變化(圖6)，如藉由在5℃下約3週時及在40℃下2週時hGalC比活性之保留所測定。結果顯示，在pH 6.5下在介於5 mM磷酸鹽+50 mM NaCl(本文中縮寫為5+50)至50 mM磷酸鹽+150 mM NaCl(本文中縮寫為50+150)範圍內之多種鹽濃度下，在5℃下3週後hGalC保留較高比活性(圖6)。
hGalC之沉降分析
沉降速度係量測分子響應離心機中所產生之離心力移動之速率的分析型超速離心(AUC)方法，且為用於測定溶液中蛋白質締合狀態之有用技術。第一沉降速度實驗係人類GalC在含有150 mM NaCl之5 mM磷酸鈉(pH 6.0)中之稀釋系列(圖7)，以針對自締合及/或非理想狀態對試樣進行評定。以每一濃度下之正規化g(s*)曲線(g(s*)對s*)對稀釋系列作圖。稀釋後曲線通常移位至較低s值表明發生解離，且此為快速可逆之自締合系統。比較不同離子強度(圖7A、B及C)，很明顯，提高離子強度後各組曲線移位至較低s值，此表明在締合過程中亦涉及離子相互作用且在較高鹽濃度下自締合減少。
亦同時在150 mM NaCl下測試小鼠GalC以與hGalC進行比較。比較對應離子強度(150 mM NaCl)，很明顯，mGalC之自締合自由能小於hGalC。將圖7中之曲線截止在約20S以更清楚地顯示解離；然而，當使用寬分佈分析(WDA)來分析該等實驗且以對數尺度對結果作圖時，可清楚地看到較高聚集體(s*>20S)。在pH 6.0下，聚集成較高低聚體(圖8)在50 mM NaCl下尤其明顯，在10 mM NaCl下稍微減少且在500 mM NaCl下顯著減少(但仍存在)。每一離子強度下最高濃度之WDA曲線繪製於圖8中。
pH 6.0下通用緩衝劑中之自締合
如在圖9中所見，在該等條件下於通用緩衝劑中，自締合似乎與在磷酸鹽緩衝劑(pH 6.0)中處於大致相同的數量級。亦研究pH對通用緩衝劑中hGalC自締合之能量學的影響。在pH 4.5、5.0、6.0、6.5、7.0及7.5下實施稀釋系列實驗。試樣在pH 4.5及5.0下不溶解，基本上100%的hGalC沉澱出來使得上清液中未留下可量測之試樣。
pH之影響清楚地顯示於圖10中，其中在pH 7.5下觀察到最少量之自締合且在pH 6.0下觀察到相當多之自締合。此趨勢與較高pH下離子強度變化時所見之趨勢類似。在最高濃度(全部約1.0 mg/mL)下，提高離子強度及pH使平衡偏移得有利於較小低聚體。藉由1/3系列稀釋來降低濃度(參見圖7)使得平衡偏移朝向最小物質，其似乎具有約5.2S之沉降係數。在約10-13S處出現之峰可能為5S物質之四聚體。將該等數據擬合至自締合模型之努力迄今未獲得成功，且此可能係因為由糖基化程度可變而造成之固有的微觀不均一性。
pH 6.0下通用緩衝劑中之自締合
在稀釋系列實驗中比較存於5 mM磷酸鈉(pH 6.0)以及150 mM NaCl中之應力(stressed)及基線GalC試樣(紅色→藍色→綠色→黑色)。最低濃度(黑色)約0.03 mg/mL之結果已經平滑，因此該曲線看起來具有較少雜訊。在應力試樣中，在ln(s*)=3.0(約20S)附近存在聚集體，相比於基線試樣其在較高濃度下存在。其佔試樣之份額近乎恆定，如藉由稀釋後正規化圖示中其持久性所證實(圖11、圖12、圖13)。因此，其為不可逆之聚集體，且莫耳質量為至少500 kg/mol。
hGalC與牛磺膽酸鈉溶液
在牛磺膽酸鈉(NaTC)(1%)中，自締合顯著減少。主邊界(main boundary)移位至較低s值且較高之低聚反應得以抑制(圖14)。
hGalC與5%右旋糖
向存於5 mM磷酸鈉(pH 6.0)中之GalC中添加5%右旋糖導致形成大的聚集體(圖15)。18S處的峰對應於約440 kDa之最小莫耳質量且56S處的峰對應於2.4 MDa之最小莫耳質量，而延伸超過150S之尾部則對應於大於10.0 MDa之莫耳質量。自1.0 mg/mL稀釋至0.3 mg/mL後該圖案之變化非常小，此表明該等低聚體在沉降實驗之時標上(為期5至6小時)大部分不可逆。
hGalC固有螢光
實施hGalC之固有螢光研究(使用23 Trp)以評價pH及鹽濃度對分子相互作用之作用(圖16及圖17)。在500 mM NaCl或1% NaTC下分子相互作用最小(最高相對螢光出現於330 nm-350 nm)(圖16)。觀察到隨pH變化二級結構有較小變化。在pH 4.5及5.0下觀察到沉澱(圖17)。
概述
利用聚乙二醇(PEG)誘導之固相途徑(Middaugh等人，J.Biol. Chem. 1979,254,367-370)來評價hGalC及mGalC之相對溶解度。該途徑容許以可計量方式來量測蛋白質之相對溶解度。藉由將各GalC之緩衝溶液(5 mM磷酸鈉與150 mM NaCl，pH 6.0)引入不同濃度之PEG(10 kDa)中來實施溶解度量測。以log蛋白質溶解度對PEG濃度作圖產生線性趨勢。將表觀溶解度外推至零PEG濃度以獲得各蛋白質之相對溶解度。mGalC對hGalC之相對溶解度未顯示任何差異。在hGalC之溶解度實驗中，在2-8℃下3週後未觀察到沉澱或活性損失(在5 mM磷酸鈉與不同鹽濃度下，pH 6.0-6.5)。使用調配物5 mM磷酸鈉+150 mM NaCl(pH 6.0)達到約30 mg/mL之溶解度，且在2-8℃下50天後未觀察到沉澱。
AUC數據表明，GalC之「天然」狀態以濃度依賴方式可逆締合成較高級低聚體(higher order oligomer)。生物物理數據表明，較高級低聚體可能具有功能及結構重要性。如藉由AUC所測定，在較高pH值下，保留較少活性，具有較低Tm值且系統更均質。在5 mM磷酸鈉與150 mM NaCl(pH 6.0)下，可能在單體、四聚體與其他較高級物質間達成平衡。此外，在6.5-7.5之pH範圍內pH並未顯著影響AUC曲線。總之，該GalC系統在所測試緩衝劑中係快速可逆之高度自締合系統。
實例2：在單次腦脊髓膜內給予或單次靜脈內團注 125 I-HGALC後SPRAGUE-DAWLEY大鼠中放射性之藥物代謝動力學及組織分佈
本實例繪示實例性結果，其展示單次腦脊髓膜內給藥或單次靜脈內團注後雄性Sprague-Dawley大鼠中125I-hGALC之藥物代謝動力學及組織分佈。量測全血、血清、紅血球、腦脊髓液(CSF)及組織中放射性之濃度及含量，並對所得數據實施非房室藥物代謝動力學分析。選擇腦脊髓膜內及靜脈內途徑，此乃因其為人類之擬定投與途徑。基於潛在之人類暴露、現有毒性及藥物代謝動力學數據及測試物質所施加之任何限制來選擇劑量量。選擇大鼠來實施研究，此乃因大鼠係公認的用於藥物代謝動力學及組織分佈研究之物種。該研究中所用動物之數目係充分評定每一時間點之預期變化及達到實驗目的所需要之最小值。
材料及方法
測試系統
2009年4月15日，自Charles River Canada公司(St. Constant,Quebec,Canada)接收82只雄性Sprague-Dawley大鼠(褐家鼠(Rattus norvegicus))。治療開始時，動物為約10-11週齡。2009年4月28日，自Charles River Canada接收另外9只雄性大鼠；該等動物在到達時約9週齡且需要該等動物來確保足量插管動物可以利用以完成給藥研究。
治療開始時，雄性大鼠之體重介於342 g至453 g範圍內。除一隻雄性大鼠外，實施給藥時所有其他雄性大鼠之體重均高於方案中所規定之範圍(250-350 g)，然而並不認為此微小偏離會影響研究或所獲得之數據，因為該等動物健康且使用實際體重來實施劑量投與。
動物管控
到達PCS-MTL後，由有資格的獸醫人員成員對所有動物進行全面的體格檢查。在接收的動物中未檢測到顯著異常。將動物單獨圈養在具有金屬絲網底板及自動注水閥之不銹鋼籠子中。按照合適的SOP來實施環境豐富化程序。每只籠子使用指明研究、群組、動物編號及性別之色彩代碼籠卡清楚地加以標注。使用紋身系統來唯一地標識每只動物。研究進行期間之環境條件控制在目標溫度及目標相對濕度，分別為19℃至25℃及30%至70%。除因預定活動而中斷外，光週期為12小時光及12小時暗。
飼料
除指定程序期間以外，所有動物自由獲取標準經鑒定的丸狀市售實驗室飼料(經PMI鑒定之齧齒類動物飼料(PMI Certified Rodent Diet) 5002: PMI Nutrition International公司)。控制飼料中污染物(例如，重金屬、黃曲毒素(aflatoxin)、有機磷酸鹽、氯化烴、PCB)之最大允許濃度，並由製造商定期進行分析。除指定程序期間以外，動物隨意獲取適於人類消耗之市政自來水(通過0.5 μm抑菌性聚碳酸酯過濾器加以過濾)。吾人認為在飼料材料中不存在可能干擾研究目的之習知污染物。
適應環境及隨機化
接收動物與實施手術以放置腦脊髓膜內插管之間間隔至少6天(對於在2009年4月15日接收之動物)或3天(對於在2009年4月28日接收之另外9只動物)以容許動物適應身體及環境條件。在適應環境期間，給所有動物稱重並使用基於電腦之隨機化程序實施隨機化。隨機化係在使用體重作為參數分層之後實施。體重為體重範圍端點之動物不分配至群組中。
如下將動物分配至研究群組中：
群組1及2中之每只大鼠接受約3 μCi/動物之標稱放射化學劑量。群組3中之每只大鼠接受約6 μCi/動物之標稱放射化學劑量。
腦脊髓膜內劑量調配物
腦脊髓膜內劑量調配物係在第一次投與腦脊髓膜內劑量當天製備。量出足量125I-hGALC溶液，並添加至量出的足量未經標記hGALC溶液中。添加量出的一定體積的媒劑並整體輕輕混合。製備目標放射性含量為約150 μCi/mL之3 mg/mL濃度之溶液。將所得調配物通過低蛋白質結合過濾器(0.22 μm GV PVDF過濾器單元)過濾至無菌容器中，並在用於給藥之前冷凍(2-8℃)避光保存。
靜脈內劑量調配物
靜脈內劑量調配物係在第一次投與靜脈內劑量當天製備。量出足量125I-hGALC溶液，並添加至量出的足量未經標記hGALC溶液中。添加量出的一定體積的媒劑並整體輕輕混合。製備目標放射性含量為約3 μCi/mL之0.3 mg/mL濃度之溶液。將所得調配物通過低蛋白質結合過濾器(0.22 μm GV PVDF過濾器單元)過濾至無菌容器中，並在用於給藥之前冷凍(2-8℃)避光保存。
劑量調配物之分析
在PCS-MTL在每一給藥之日藉由液體閃爍光譜來分析每一經放射標記的劑量調配物以測定治療之前及之後的放射性濃度。藉由在媒劑中製備劑量調配物之合適稀釋物來測定放射性濃度，並對每一稀釋之兩份相同等分試樣進行分析。完成分析(包括重複分析)後，棄除剩餘的劑量調配物。
計算測試物質之比活性
劑量調配物中測試物質之比活性係自量測之平均放射性含量(在給藥之前及之後)及劑量調配物中測試物質之總質量(基於提供之濃度)來計算。
臨床觀察
在整個適應環境及研究階段，除到達及研究結束之日外(在到達及研究結束之日僅檢查動物一次)，每天針對死亡率及不健康體徵以及治療反應檢查所有動物兩次。每週實施一次詳細檢查。
體重
在適應環境期間、手術之前及劑量投與前一天量測一次個體體重。僅報告劑量投與前一天記錄之體重。
手術
接收動物與實施手術之間間隔最少6天(或對於另外9只動物為3天)以容許動物適應實驗室環境條件。在手術當天及再次在手術後兩天，所有動物(包括備用動物)接受單次肌內注射苄星青黴素G(Benzathine Penicillin G)加上普魯卡因青黴素G(Procaine Penicillin G)抗生素。通常，在手術之前及第一次投與後約8小時以及此後認為需要時經皮下投與0.05 mg/kg丁丙諾啡(Buprenorphine)。對於一些動物，丁丙諾啡係在第一次投與後約6小時而非8-12小時投與。考慮到丁丙諾啡在大鼠中之半衰期，此與方案之偏離並不影響該等動物之健康狀況，且因此不會影響研究之有效性或研究中獲得之數據。
藉由自顱骨至頸之胸背區給動物剃毛為手術作準備。在手術之前將動物用異氟醚/氧氣麻醉，且在整個手術程序期間保持在異氟醚氣體麻醉下。在手術之前及在手術程序結束時，同時在麻醉下，向每一隻眼睛投與溫和的潤滑性眼用藥劑(ophthalmic agent)。在手術之前及在第一次投與後間隔約24小時之另外兩個時間，每只動物經皮下注射接受消炎藥(5 mg/kg卡洛芬(Carprofen))。
將動物放置於立體定位桌(stereotaxic table)內。自顱骨之後部邊緣至頸作一約2 cm之皮膚切口。將背部頸肌分開以暴露環枕膜。使用牽開器以有助於接近該膜。切開環枕膜，並緩慢地朝向尾部插入腦脊髓膜內導管，直至導管位於腰區中。使用棉頭拭子移除過量的流體，並乾燥環枕膜。隨後立即使用黏合劑將導管球囊(catheter bulb)錨定在膜上。在膠乾燥且導管穩固地錨定後，移除牽開器。用導管在顱骨上作一小迴路，並使用由不能吸收材料製成之縫線附接上球囊。在穩固導管後，使其通過背部胸區，背部胸區中有切口以放置輸液座。使用不能吸收的材料原位縫合。
在縫合頸肌之前，用2 mL溫鹽水(即約37.5℃)沖洗傷口。使用可吸收材料利用單純間斷縫合來縫合肌肉。用2 mL溫鹽水沖洗輸液座位點，並使用可吸收縫合材料利用連續皮內縫合來縫合皮膚。在手術後向手術位點投與局部抗生素軟膏，且此後每天投與一次直至認為不需要。
在手術時測定導管及輸液座之死體積。在治療前階段期間在手術之日與治療之日之間實施一次開放性檢查(patency check)。
治療
導管/輸液座植入手術與開始治療之間間隔至少7天以容許充分恢復。在腦脊髓膜內給藥之前，將輸液座位點剃毛(若需要)。使用葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine gluconate)及水清洗穿刺位點，並使用無菌水浸泡紗布擦拭位點，隨後使10%聚維酮碘(povidone iodine)通過3次。用連接至給藥注射器之針穿刺輸液座，並緩慢投與測試物質。給藥後，用碘擦拭該位點以限制污染。
在研究第1天，向群組1動物投與調配之125I-hGALC，其藉由經腦脊髓膜內緩慢團注至皮下腰部輸液座，隨後用0.04 mL鹽水沖洗來遞送60 μg/動物之目標劑量量及約3 μCi/動物之放射性劑量。
在研究第2天，向群組3動物投與調配之125I-hGALC，其藉由經腦脊髓膜內緩慢團注至皮下腰部輸液座，隨後用0.04 mL鹽水沖洗來遞送60 μg/動物之目標劑量量及約3 μCi/動物之放射性劑量。在經腦脊髓膜內緩慢團注後5分鐘內，群組3動物亦接受靜脈內注射，其經由靜脈內導管注射至尾部靜脈中(3.33 mL/kg)，隨後用0.6 mL鹽水沖洗以遞送1 mg/kg之目標劑量量與3 μCi/動物之合適放射性含量。
在研究第3天，向群組2動物投與調配之125I-hGALC，其藉由經由靜脈內導管靜脈內注射至尾部靜脈中(3.33 mL/kg)，隨後用0.6 mL鹽水沖洗以遞送1 mg/kg動物之目標劑量量及約3 μCi/動物之放射性劑量。
投與體積係基於每只動物最近之實際體重。記錄裝滿調配之125I-hGALC及遞送至動物後騰空之注射器的重量。基於自注射器排出之劑量調配物之淨重量及量測之調配劑量中的放射性濃度來計算遞送至每只動物之劑量。
給藥期間，使用紗布來吸收任何少量劑量調配物回流，並按照項目特定程序藉由液體閃爍計數來計算測試物質損失。保留用於投與調配之測試物質的注射器及靜脈內導管。按照項目特定程序針對放射性含量來分析靜脈內導管及選擇之腦脊髓膜內輸液座/導管。
試樣採集
血液/血清及組織
對於群組1至3，在給藥後10分鐘、30分鐘及1 h、3 h、6 h、24 h、48 h及96 h每個時間點自3只動物採集終末血液試樣(最大可能體積)。在群組3中，腦脊髓膜內投與在靜脈內投與之前，且終末血液試樣之時間安排係基於靜脈內投與之時間。自在異氟醚麻醉下無痛致死之大鼠(群組1、2及3，及3只備用動物)的腹主動脈採集終末血液試樣，此藉由給腹主動脈放血來實施。將約3 mL血液(群組1、2及3)轉移至含有K3-EDTA之適宜管中以提供全血試樣，並在處理之前保持於濕冰上。對於群組2及3以及備用動物，將額外1.5 mL血液轉移至含有檸檬酸鈉之管中以分析凝血酶原時間(PTT)、激活部分促凝血酶原激酶時間(APTT)及纖維蛋白原。將血液試樣儲存於濕冰上，隨後在2700 RPM下於4℃下離心15分鐘。將血漿試樣在約-80℃下冷凍儲存，隨後運輸及在申請人指定之實驗室進行分析。備用動物之血漿用作PTT、APTT及纖維蛋白原分析之空白試樣。當獲得之血液體積不足以實施所有分析(群組1、2及3)時，則血液優先用於放射性分析。
將剩餘血液(群組1、2及3以及3只備用動物)轉移至含有凝血激活劑之管中以產生血清，並容許在室溫下經約30分鐘凝血，隨後離心。使用自備用動物採集之試樣來評定未治療動物之血液試樣之凝血。
放血後，如所示，每個時間點自群組1至3之3只動物採集以下組織：脂肪組織(腎脂)、腎上腺、骨(股骨)、腦、眼睛、心臟、腎、大腸、大腸內容物、肝、肺、肌肉(骨骼肌)、坐骨神經、小腸、小腸內容物、脊髓(腰部、胸部、頸部)、脾、胃、胃內容物、甲狀腺/副甲狀腺、膀胱內容物。
採集後，給組織稱重，並隨後進行處理及分析總放射性。亦自備用動物採集上文提及之所有組織以及終末血液及血清，且用以測定背景放射性含量。將剩餘屠體冷凍保存(-10℃至-20℃)在指定冷凍器中以容許在作為生物廢物丟棄之前放射性衰變。自冷凍器取回群組1及3之每一時間點第一隻動物之屠體，解凍並取出輸液座及導管，用水沖洗並驗證殘留放射性。
腦脊髓液
在無痛致死之前即刻屍體剖檢時自所有動物採集腦脊髓液(CSF)試樣。對於群組1至3，在給藥後10分鐘、30分鐘及1 h、3 h、6 h、24 h、48 h及96 h，每一時間點將三隻動物無痛致死。經由小腦延髓池取出CSF試樣(最大可能體積)，需要使用立體定位桌來使頭部成一直線。將CSF轉移至光管(plain tube)中，並放置於濕冰上。對一部分(約20 μL)進行處理並分析總放射性含量。亦自備用動物採集CSF，且用以測定背景放射性含量。
背景放射性含量之測定
使用自備用動物採集之血液、血清及組織來測定群組1、2及3中之動物血液、血清及組織之背景放射性含量。使用自備用動物採集之CSF來測定CSF之背景放射性含量。
處理試樣以量測放射性
採集後給所有試樣稱重，血液、血漿、血清及CSF除外。對於所有群組，取兩份相同的在K3-EDTA上採集之100 μL稱重全血等分試樣以分析放射性。如下使用三氯乙酸(TCA)實施全血之蛋白質沉澱：將等體積之15% TCA水溶液添加至兩份相同的100 μL稱重全血等分試樣中。藉由渦流來混合試樣(100 μL全血+100 μL TCA)，且隨後在4℃下於10000 rpm下離心約15分鐘，並將上清液輕輕倒至單獨管中。分析上清液及糰粒之放射性含量。
將用於血清採集之血液在室溫下保持約30分鐘以容許凝血，隨後在4℃下於2700 rpm(1250 rcf)下離心約10分鐘以分離出血清。然後將血清試樣保存於濕冰上，直到將其分成等份用於放射性分析為止(2 x 100 μL，經稱重等分試樣)。將濃縮紅血球(packed red blood cell)(在血清分離後獲得)保存於濕冰上，直到進行處理以用於放射性分析為止。其餘血清冷凍儲存(-10℃至-20℃)。將全血及紅血球之兩份相同的100 μL稱重等分試樣(在血清分離後獲得，與等體積之去離子水(w/v)混合並用Polytron乳化器均質化)溶解於Soluene-350中，用過氧化氫(30% w/v)脫色，並與液體閃爍液混合以分析放射性。
將TCA血液沉澱糰粒溶解於35%氫氧化四乙銨(TEAH)中，用過氧化氫(30% w/v)脫色，並與液體閃爍液混合以量測放射性。將膀胱內容物、TCA血液上清液、劑量調配物之兩份相同的稱重等分試樣(稀釋)及血清直接與液體閃爍液混合以量測放射性。將兩份相同的CSF稱重等分試樣(約10 μL/等分試樣)溶解於35% TEAH中，隨後與液體閃爍液混合以量測放射性。
將組織試樣完全溶解於35% TEAH中。隨後使兩份相同的等分試樣與液體閃爍液混合，之後量測放射性。在已知體積的水中使大腸內容物均質化。將大腸內容物(LINC)勻漿、胃內容物(STC)及小腸內容物(SINC)之兩份相同的稱重等分試樣溶解於35% TEAH中，並與液體閃爍液混合以量測放射性。
放射性量測
藉由液體閃爍光譜按照標準操作程序(SOP)來實施放射性量測。每份試樣計數5分鐘或計數至0.1%之2σ誤差(two-sigma error)，哪一個均可先發生。藉由自動淬滅校正基於光譜向外標之移位將所有計數轉化成絕對放射性(DPM)。自所有試樣DPM值減去合適的背景DPM值。背景減除後，對於所有隨後操作，呈現小於或等於背景值之放射性的試樣均視為零。
數據分析
放射性濃度
將所有放射性量測值輸入標準電腦數據庫程序(Debra第5.2版)中以計算試樣中之放射性濃度(dpm/g及質量eq/g)及投與放射性百分比。血液、血清、組織及CSF之放射性濃度(dpm/g及質量eq/g)係基於量測之劑量溶液中經放射標記之測試物質的比活性(dpm/mg或合適的質量單位)來計算。基於大鼠血液之密度將血液試樣中之放射性濃度轉化成質量eq/mL。針對總器官重量來計算總組織含量。
藥物代謝動力學
血液、血清、CSF及組織中總放射性之藥物代謝動力學(PK)曲線係藉由使用有效的電腦軟體(WinNonlin，第3.2版，Pharsight公司，Mountain View，California，USA)對濃度與時間數據進行非房室分析來表徵。基於靜脈內及血管外投與途徑來選擇模型。報告為不可檢測或計量之濃度值未進行估計；將其以不存在試樣處理。在每一時間點自不同動物獲得濃度數據，且使用平均值來產生複合的藥物代謝動力學曲線。群組1(動物編號1001、1002、1003)及群組2(動物編號2001、2002、2003)之10分鐘取樣以及群組1(動物編號1019、1020)之48小時取樣偏離標稱時間點大於10%或6分鐘。此與方案之偏離並不影響研究之有效性或獲得之數據，此乃因在藥物代謝動力學分析中計算及使用平均時間。
使用線性梯形方法(線性內插法)來計算放射性濃度與時間曲線(AUC)下之面積。實際上，基於最佳擬合線(R2)使用至少最後三個觀測濃度值來確定PK曲線之終末排出相。使用對數線性回歸使用未加權之濃度數據來計算終末排出相之斜率。若測定係數(R2)小於0.8，或若將AUC外推至無限佔總面積之大於20%，則依賴於測定kel之參數不予報告。
結論
給藥調配物之分析(表4)
在每一給藥之日，在向所有群組投與劑量之前及之後藉由液體閃爍光譜對每一調配物之等分試樣進行分析，並根據該等分析來計算測試物質之比活性。用於腦脊髓膜內投與之調配物中之總平均放射性濃度(±S.D.)係345.4 x 106±4.92 x 106 dpm/g(155.60 μCi/g)(群組1)及334.4 x 106±5.87 x 106 dpm/g(150.62 μCi/g)(群組3)。用於靜脈內投與之調配物中之總平均放射性濃度係4.4 x 106±4.22 x 105 dpm/g(1.97 μCi/g)(群組2)及4.7 x 106±2.31 x 105 dpm/g(2.11 μCi/g)(群組3)。腦脊髓膜內調配物中測試物質之比活性計算為51.16 μCi/mg(群組1劑量)及49.53 μCi/mg(群組3劑量)。靜脈內調配物中測試物質之比活性計算為6.53 μCi/mg(群組2劑量)及6.99 μCi/mg(群組3劑量)。
動物體重及投與劑量(表5)
在給藥前一天群組1、2及3中大鼠之平均體重分別為405 g(介於373 g至452 g範圍內)、410 g(介於367 g至453 g範圍內)及395 g(介於342 g至444 g範圍內)。經腦脊髓膜內投與至群組1動物之125I-hGALC的計算平均劑量係41±0.014 μg/動物，此等效於2.12±0.72 μCi/動物之放射化學劑量。藉由靜脈內途徑投與至群組2動物之125I-hGALC的平均劑量為1.00±0.02 mg/kg(2.69±0.14 μCi/動物)。對於群組3，經腦脊髓膜內及靜脈內投與之125I-hGALC的計算平均劑量為1.08±0.04 mg/kg(5.72±0.31 μCi/動物)。
投與至群組1中大鼠之平均化學劑量及放射化學劑量較目標劑量量為低(分別為約32%及29%)，且此為與該方案之偏離。然而，由於在整個計算過程中使用投與至動物之實際劑量，故認為該等較低值不影響研究之有效性或獲得之數據。
臨床觀察
在經腦脊髓膜內以60 μg/動物及/或經靜脈內以1 mg/kg投與125I-hGALC後，在任一大鼠中均未觀察到治療相關臨床體徵。
凝血評定
在早期時間點(給藥後10分鐘至6小時)，注意到，自治療動物採集之血液在留出之30分鐘內未完全凝結。然而，自3只未治療備用大鼠採集之血液容易地凝結，此表明測試物質對凝血過程有些干擾。凝血時間短於或長於30分鐘係與該方案之偏離。然而，一些試樣需要較長之凝血時間以提供一些分析用血清。察看獲得之結果顯示，在血清中獲得之濃度值與血液凝結所花費之時間長度間沒有聯繫。因此，此延長或縮短之凝血時間並不影響研究之有效性或獲得之數據。
血液、血清、紅血球、CSF及組織中總放射性之藥物代謝動力學
血液、血清及紅血球中之總放射性濃度(表6、表7、表8、圖18-21)
表6中給出腦脊髓膜內及/或靜脈內給予125I-hGALC後雄性大鼠之血清中經放射標記之物質的平均濃度。表7中給出全血及紅血球中經放射標記之物質的平均濃度。圖18中以圖示形式給出平均值數據。表8中給出TCA沉澱後在血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比。
群組1(腦脊髓膜內平均劑量為41 μg/動物)
在腦脊髓膜內給藥後，在給藥後3小時觀測到血清及血液中經放射標記之物質的最高平均濃度(Cmax)(分別為0.108±0.026 μg eq/g及0.093±0.023 μg eq/g)。在給藥後3小時與6小時之間，血液中之放射性含量保持相對恆定，而血清中之放射性含量略微下降。此後，血清及血液中之放射性濃度下降，且到給藥後48小時低於定量極限(LOQ)。對於紅血球，在給藥後6小時觀測到Cmax且為0.089±0.024 μg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降且到給藥後48小時低於LOQ。在整個研究階段中，腦脊髓膜內給藥後平均血液與血清比小於1(介於0.7至0.9範圍內)，此表明經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。紅血球與血清之比值(介於0.8至0.9範圍內)亦證實放射性物質未與血球實質結合。使用標準血液體積/體重(即64.0 mL/kg)來估計血液中發現之劑量百分比。tmax(出現最高放射性濃度之時間)時，約6%之投與劑量與血液結合。
群組2(靜脈內平均劑量為1.00 mg/kg)
靜脈內投與後，在給藥後10分鐘(即分析之第一時間點)觀測到血清(14.864±0.853 μg eq/g)及血液(10.228±0.447 μg eq/g)中經放射標記之物質的最高平均濃度(Cmax)。此後，血清及血液中之放射性濃度緩慢下降，但在給藥後96小時仍可檢測到(血清：0.088±0.006 μg eq/g，佔Cmax之0.59%；血液：0.051±0.002 μg eq/g，佔Cmax之0.50%)，且估計之血液中劑量百分比自68.4%降低至0.3%。對於紅血球，在給藥後10分鐘觀測到Cmax，為5.136±1.529 μg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降，且到給藥後96小時低於LOQ。在整個研究階段中，靜脈內給藥後平均血液與血清比小於1(介於0.6至0.8範圍內)，此表明經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。紅血球與血清之比值(介於0.4至0.6範圍內)亦證實放射性物質未與血球實質結合。
群組3(腦脊髓膜內給藥後接著靜脈內給藥：1.08 mg/kg(組合劑量))
在腦脊髓膜內給藥(目標為60 μg/動物)及靜脈內給藥(1 mg/kg)後，在給藥後10分鐘(即分析之第一時間點)觀測到血清(14.675±0.810 μg eq/g)及血液(9.974±0.558 μg eq/g)中經放射標記之物質的最高平均濃度(Cmax)。此後，血清及血液中之放射性濃度緩慢下降，但在給藥後96小時仍可檢測到(血清：0.077±0.010 μg eq/g，佔Cmax之0.52%；血液：0.037±0.033 μg eq/g，佔Cmax之0.37%)，且外推之血液中劑量百分比自32.6%降低至0.1%。對於紅血球，在給藥後10分鐘觀測到Cmax，為6.113±1.748 μg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降，且到給藥後96小時低於定量極限。如平均血液與血清比及紅血球與血清比小於1(分別介於0.7至0.8及0.4至0.7範圍內)所示，經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。
表6a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性濃度的群組平均值
表6b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性濃度的群組平均值
表6c-在單次腦脊髓膜內及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性濃度的群組平均值
表7a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值
表7b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值
表7c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值
表7d-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值
表7e-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值
表7f-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值
表8a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後在雄性Sprague-Dawley大鼠之血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比
表8b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後在雄性Sprague-Dawley大鼠之血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比
表8c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後在雄性Sprague-Dawley大鼠之血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比
(表8)
對於群組1、2及3，在藉由三氯乙酸(TCA)於全血中沉澱後糰粒及上清液中回收之放射性的平均值概述於表8中。當使用15% TCA水溶液使全血中之蛋白質沉澱時，主要在血液糰粒中回收到放射性(在群組1中介於100%至67%範圍內；在群組2中介於100%至91%範圍內；在群組3中介於100%至88%範圍內)，此表明大部分循環放射性與蛋白質結合且因此不反映游離125碘。
組織及腦脊髓液(CSF)中之放射性濃度
(表9、表10、表11、圖19-30)
表9中給出在單次腦脊髓膜內及/或靜脈內給予125I-hGALC後大鼠組織及CSF中放射性之平均濃度。圖19-30中以圖示形式給出平均值數據。表10中給出平均組織與血清比，且表11中給出組織、CSF及胃腸道以及膀胱內容物中投與劑量之回收。
表9a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液中放射性濃度之群組平均值
表9b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液中放射性濃度之群組平均值
表9c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液中放射性濃度
表10a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值
表10b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值
表10c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值
表11a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液、胃腸道及膀胱內容物中放射性含量的群組平均值
表11b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液、胃腸道及膀胱內容物中放射性含量的群組平均值
表11c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液、胃腸道及膀胱內容物中放射性含量的群組平均值
群組1(腦脊髓膜內平均劑量為41 μg/動物)
在腦脊髓膜內給藥後，125I標記之物質普遍分佈至所檢查之所有組織中，然而，CSF中之放射性含量低於LOQ。在給藥後48小時在甲狀腺/副甲狀腺(4.127±1.635 μg eq/g)中及在給藥後3小時在胃(0.203±0.101 μg eq/g)、腎(0.096±0.014 μg eq/g)及肺(0.058±0.014 μg eq/g)中觀測到雄性大鼠組織中125I標記之物質的最高平均濃度。其他組織中之含量較低，且通常在給藥後3小時與6小時之間觀測到tmax值。在腦(0.005±0.001 μg eq/g)及腎脂(0.006±0.000 μg eq/g)中觀測到最低Cmax值。到給藥後48小時及96小時，大部分組織中之放射性含量低於檢測極限，甲狀腺/副甲狀腺、腎及胃除外。在給藥後96小時，在甲狀腺/副甲狀腺中觀測到最高平均濃度(1.927±1.585 μgeq/g，Cmax為46.7%)，腎(0.005±0.001 μg eq/g，Cmax為5.2%)及胃(0.002±0.001 μg eq/g，Cmax為1%)次之。
一直到腦脊髓膜內給藥後24小時，對於該等組織，組織與血清比通常小於1。甲狀腺/副甲狀腺、腎及胃除外。到目前為止，在甲狀腺/副甲狀腺中觀測到最高比。到給藥後48小時及96小時，由於血清濃度低於LOQ而無法計算組織與血清比。
在給藥後3小時，所有組織中回收之放射性含量皆小於投與劑量之1%，且在肝(0.91%)中觀測到最高比例。在給藥後1小時，僅發現胃內容物(1.8%)中比例大於投與劑量之1%。到給藥後3小時，在小腸內容物(2.6%)、胃內容物(5.0%)及膀胱內容物(1.2%)中檢測到比例大於投與劑量之1%。在給藥後6小時，在小腸內容物(1.7%)及胃內容物(4.0%)中發現比例大於投與劑量之1%。到給藥後96小時，在腎、甲狀腺/副甲狀腺、胃及膀胱內容物中仍然回收到少量125I-hGALC衍生放射性(小於0.1%)，且在甲狀腺/副甲狀腺(0.09%)中觀測到最高回收率。
群組2(靜脈內平均劑量為1.00 mg/kg)
在靜脈內投與後，在甲狀腺/副甲狀腺(294.521±52.953 μg eq/g；在給藥後48小時)、次之肺(20.629±2.125 μg eq/g；在給藥後30分鐘)、肝(11.335±1.436 μg eq/g；在給藥後10分鐘)、腎上腺(8.827±2.435 μg eq/g；在給藥後10分鐘)、脾(6.595±0.625 μg eq/g；在給藥後10分鐘)及腎(3.027±0.330 μg eq/g；10分鐘)中觀測到群組2大鼠之組織中經放射標記之物質的最高平均濃度(Cmax)。除甲狀腺/副甲狀腺(在給藥後48小時)外，組織之tmax值均出現在給藥後10分鐘與3小時之間。在腎脂(0.158±0.019 μg eq/g)、CSF(0.210±0.363 μg eq/g)、腦(0.252±0.041 μg eq/g)、骨骼肌(0.275±0.025 μg eq/g)及脊髓(0.293±0.028 μg eq/g)中觀測到最低平均放射性Cmax值。到給藥後96小時，在所分析18種組織中之7種組織中仍然檢測到放射性，其中在甲狀腺/副甲狀腺(218.917±45.098 μg eq/g，Cmax為74.3%)中檢測到最高平均濃度，肝(0.126±0.014 μg eq/g，Cmax為1.1%)、脾(0.111±0.009 μg eq/g，Cmax為1.7%)及腎(0.099±0.010 μg eq/g，Cmax為3.3%)次之。
在給藥後10分鐘，對於分析之所有組織，平均組織與血清比均小於1。到給藥後30分鐘及1小時，對於肺及甲狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於1。在給藥後3小時及6小時，對於肝、肺及甲狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於1。在給藥後24小時及48小時，肝、肺、脾及甲狀腺/副甲狀腺之平均組織與血清比大於1。在給藥後96小時，對於腎、肝、脾及甲狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於1。在甲狀腺/副甲狀腺(2485，在96小時)、肺(6.5，在24小時)及肝(2.2，在24小時)中觀測到最高組織與血清比。
就佔所投與放射性之比例而言，在肝(41.7%，在給藥後10分鐘)、肺(7.0%，在30分鐘)、腎(2.2%，在10分鐘)、小腸(1.5%，在1小時)及甲狀腺/副甲狀腺(1.4%，在48小時)中觀測到組織中之最高平均值。在胃腸道內容物中，最高平均值係胃內容物(在給藥後3小時)中劑量之10.3%、小腸內容物(在給藥後3小時)中5.4%及大腸內容物(6小時)中1.1%。到給藥後96小時，在甲狀腺/副甲狀腺(1.0%)、肝(0.5%)及腎(0.1%)中檢測到投與劑量之最高比例。在給藥後之此時間點，投與劑量之小於0.01%仍然留在胃及膀胱內容物中。
群組3(腦脊髓膜內給藥後接著靜脈內給藥：1.08 mg/kg(組合劑量))
在腦脊髓膜內及靜脈內給藥後，在甲狀腺/副甲狀腺(296.957±57.793 μg eq/g；在給藥後24小時)、次之肝(10.181±0.600 μg eq/g；在給藥後10分鐘)、腎上腺(9.567±1.678μg eq/g；在給藥後10分鐘)、肺(5.305±0.194 μg eq/g；在給藥後1小時)、脾(5.042±0.902 μg eq/g；在給藥後10分鐘)、胃(4.454±1.455 μg eq/g；在給藥後3小時)、腎(3.390±0.183 μg eq/g；1小時)及CSF(2.087±2.912 μg eq/g；10分鐘)中觀測到群組3大鼠之組織中經放射標記之物質的最高平均濃度(Cmax)。除大腸(在給藥後6小時)及甲狀腺/副甲狀腺(在給藥後24小時)外，組織之tmax值均出現在給藥後10分鐘與3小時之間。在腎脂(0.188±0.020 μg eq/g)、腦(0.283±0.062 μg eq/g)、脊髓(0.327±0.062 μg eq/g)及骨骼肌(0.411±0.009 μg eq/g)中觀測到最低平均放射性Cmax值。到給藥後96小時，在所分析18種組織中之8種組織中仍然檢測到放射性，其中在甲狀腺/副甲狀腺(43.962±23.164 μg eq/g，Cmax為14.8%)中檢測到最高平均濃度，肝(0.137±0.018 μg eq/g，Cmax為1.3%)、腎(0.124±0.005 μg eq/g，Cmax為3.7%)、脾(0.083±0.009 μg eq/g，Cmax為1.6%)及腎上腺(0.069±0.016 μg eq/g，Cmax為0.7%)次之。
在給藥後10分鐘，對於分析之所有組織，平均組織與血清比均小於1。到給藥後30分鐘及1小時，對於甲狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於1。在給藥後3小時及6小時，對於胃及甲狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於1。在給藥後24小時，肝及甲狀腺/副甲狀腺之平均組織與血清比大於1。在給藥後48小時及96小時，對於腎、肝及甲狀腺/副甲狀腺且對於脾(96小時)，平均組織與血清比大於1。在甲狀腺/副甲狀腺(854，在48小時)、肝(1.8，在48小時)及腎(1.6，在96小時)中觀測到最高組織與血清比。
就佔所投與放射性之比例而言，在肝(19.0%，在給藥後10分鐘)、腎(1.2%，在1小時)及小腸(1.2，在3小時)中觀測到組織中之最高平均值。在胃腸道內容物中，最高平均值係胃內容物(在給藥後3小時)中劑量之8.8%、小腸內容物(在給藥後3小時)中4.3%及大腸內容物(6小時)中1.0%。到給藥後96小時，在肝(0.3%)、甲狀腺/副甲狀腺(0.1%)及腎(0.05%)中檢測到投與劑量之最高比例。在給藥後之此時間點，投與劑量之小於0.01%仍然留在腎上腺、心臟、肺、脾、胃及膀胱內容物中。
血液、血清、紅血球、CSF及組織中放射性之藥物代謝動力學
(表12及表13)
表12及表13中給出單次腦脊髓膜內及/或靜脈內給予125I-hGALC後大鼠血液、血清、紅血球、CSF及組織中放射性之平均藥物代謝動力學參數。
表12：在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中總放射性之處置動力學(Disposition Kinetics)
表12b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中總放射性之處置動力學
表12c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中總放射性之處置動力學
表13a-在單次腦脊髓膜內給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織及腦脊髓液中總放射性之處置動力學
表13b-在單次靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織及腦脊髓液中總放射性之處置動力學
表13c-在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織及腦脊髓液中總放射性之處置動力學
血液、血清及紅血球
在腦脊髓膜內給藥(群組1：41 μg/動物)後，對於血清、全血及紅血球，自時間零至最後可量測時間點放射性濃度與時間曲線下之平均計算面積(AUC0-tlast)分別為1.48 μg eq‧h/g、1.33 μg eq‧h/g及1.24 μg eq‧h/g。報告的血清、全血及紅血球中放射性之表觀終末t1/2值分別為5.34、5.02及4.08小時。血清、全血及紅血球中之排出速率常數k經計算分別為0.130 h-1、0.138 h-1及0.170 h-1。血清、全血及紅血球中之AUC0-inf經計算分別為1.54 μg eq‧h/g、1.37 μg eq‧h/g及1.25 μg eq‧h/g。放射性自血清、全血及紅血球之排出相非常明確，如計算AUC0-inf所必需之外推百分比值非常低(分別為4.0%、3.2%及1.4%)所證實。
在靜脈內給藥(群組2：1.00 mg/kg)後，對於血清、全血及紅血球，平均AUC0-tlast值分別為71.1 μg eq‧h/g、51.2 μg eq‧h/g及33.9 μg eq‧h/g，且表觀終末t1/2值分別為30.7、27.1及10.9小時。血清、全血及紅血球中之k值經計算分別為0.0226 h-1、0.0256 h-1及0.0635 h-1。放射性自血清、全血及紅血球之排出相非常明確，且血清、全血及紅血球中之AUC0-inf經計算分別為75.0 μg eq‧h/g(外推5.21%)、53.2 μg eq‧h/g(外推3.75%)及35.7 μg eq‧h/g(外推4.94%)。全血(735 mL/kg)中之表觀分佈體積(Vz)最大，血清(591 mL/kg)及紅血球(441 mL/kg)次之。測試物質之清除率估計為13.3 mL/h/kg(自血清)及18.8 mL/h/kg(對於全血)。
在給群組3動物腦脊髓膜內給藥及靜脈內給藥(組合劑量為1.08 mg/kg)後，對於血清、全血及紅血球，平均AUC0-tlast值分別為89.8 μg eq‧h/g、66.9 μg eq‧h/g及49.2 μg eq‧h/g。報告的血清、全血及紅血球中放射性之表觀終末t1/2值分別為25.5、20.9及9.61小時，且k為0.0272 h-1、0.0332 h-1及0.0721 h-1。再次，對於所有三種基質，排出相非常明確，且血清、全血及紅血球中之AUC0-inf經計算分別為92.6 μg eq‧h/g、68.0 μg eq‧h/g及51.0 μg eq‧h/g(外推3.06%、1.64%及3.69%)。全血(478 mL/kg)中之Vz較大，血清(429 mL/kg)及紅血球(293 mL/kg)次之。清除率值為15.9 mL/h/kg(對於全血)及11.7 mL/h/kg(對於血清)。
組織
在腦脊髓膜內給予125I-hGALC(群組1：41 μg/動物)後，在甲狀腺/副甲狀腺(313 μg eq‧h/g)中觀測到大鼠組織中之最高AUC0-tlast值，胃(2.60 μg eq‧h/g)及腎(1.84 μg eq‧h/g)次之。對於數種組織，不能估計k或衍生自k之任何參數(即t1/2及AUC0-inf)，此乃因將AUC外推至無限之百分比大於20%或者缺少終末相之數據。對於可估計k之組織(眼睛、心臟、腎、大腸、肺、小腸及胃)，k介於0.01 h-1至0.17 h-1範圍內，且t1/2通常介於4 h至6 h範圍內，腎(58.6 h)及胃(39.1 h)除外。
在靜脈內給藥(群組2：1.00 mg/kg)後，在甲狀腺/副甲狀腺(24989 μg eq‧h/g)中觀測到最高AUC0-tlast值，肺(165 μg eq‧h/g)、肝(100 μg eq‧h/g)、脾(56.1 μg eq‧h/g)、腎上腺(43.1 μg eq‧h/g)及腎(40.7 μg eq‧h/g)次之。在腎脂(0.617μg eq‧h/g)及腦(0.735 μg eq‧h/g)中觀測到最低AUC0-tlast值。對於排出相不甚明確之組織(甲狀腺/副甲狀腺及CSF)或外推至AUC0-inf大於20%之組織(腎脂及腦)，不報告衍生自k之參數。僅肝及肺之AUC0-inf值大於血清之AUC0-inf值(75 μg eq‧h/g)。據報告，肺具有最高AUC0-inf值(167 μg eq‧h/g；外推0.832%)，次之為肝(105 μg eq‧h/g；外推4.15%)、脾(61.2 μg eq‧h/g；外推8.33%)、腎上腺(46.8 μg eq‧h/g；外推7.89%)及腎(46.7 μg eq‧h/g；外推12.7%)。
經計算，脊髓(2.51μg eq‧h/g；外推4.87%)具有最低AUC0-inf報告值，肌肉(2.69 μg eq‧h/g；外推1.93%)及眼睛(5.64μg eq‧h/g；外推5.19%)次之。組織中之最長可計算t1/2係41.6小時(腎)，次之為34.6小時(腎上腺)及31.8小時(脾)。報告之最短t1/2係4.18小時(坐骨神經)。
對於群組3，在腦脊髓膜內及靜脈內給藥(組合劑量為1.08 mg/kg)後，在甲狀腺/副甲狀腺(16776 μg eq‧h/g)中觀測到最高AUC0-tlast值，肝(96.5μg eq‧h/g)、胃(72.1 μg eq‧h/g)、腎(57.9 μg eq‧h/g)、脾(46.9 μg eq‧h/g)、肺(44.1 μg eq‧h/g)及腎上腺(43.9 μg eq‧h/g)次之。在腎脂(0.954 μg eq‧h/g)及腦(1.03 μg eq‧h/g)中觀測到最低AUC0-tlast值。對於外推至AUC0-inf大於20%之組織(腎脂及腦)或R2小於0.8(CSF)之組織，不報告衍生自k之參數。僅甲狀腺/副甲狀腺及肝之AUC0-inf值大於血清之AUC0-inf值(92.6 μg eq‧h/g)。據報告，甲狀腺/副甲狀腺具有最高AUC0-inf值(18390 μg eq‧h/g；外推8.78%)，次之為肝(102 μg eq‧h/g；外推5.0%)、胃(72.6 μg eq‧h/g；外推0.766%)、腎(64.4 μg eq‧h/g；外推10.1%)、脾(49.3 μg eq‧h/g；外推4.85%)、腎上腺(45.8 μg eq‧h/g；外推4.25%)及肺(45.4 μg eq‧h/g；外推2.88%)。經計算，脊髓(3.77 μg eq‧h/g；外推6.55%)具有最低AUC0-inf報告值，肌肉(4.66 μg eq‧h/g；外推6.25%)次之。組織中之最長可計算t1/2係36.4小時(腎)，次之為27.5小時(肺)、25.7小時(肝)及25.4小時(甲狀腺/副甲狀腺)。報告之最短t1/2係4.71小時(坐骨神經)。
討論
在腦脊髓膜內投與後，在給藥後3小時觀測到血清及全血中放射性之最高平均濃度，此表明劑量相關物質相對快速地分佈至全身循環中。在靜脈內投與後，在量測之第一時間點觀測到血清及全血中放射性之最高平均濃度。血清中之濃度始終高於全血中之濃度，如血液與血清比小於1所反映。此表明，劑量相關物質在給藥後之任一時間均未很大程度地與任一群組之血球結合。在血液蛋白質之TCA沉澱後，主要在糰粒中回收到放射性，此表明大部分循環放射性與蛋白質結合，表明觀測到之放射性分佈在很大程度上不反映游離125碘之佈置。
當比較群組2(靜脈內劑量為1.00 mg/kg)與群組3(腦脊髓膜內與靜脈內組合劑量為1.08 mg/kg)時，群組3血清及全血中之濃度似乎通常與群組2類似。兩個群組之兩種基質中放射性之下降亦非常類似，如藉由血液與血清比所評定。比較群組2與群組3血清及血液之AUC0-tlast及AUC0-inf，表明群組3動物於劑量相關物質中之暴露略微較高。
在群組1中，CSF中之放射性含量非常低，此發現似乎與將測試物質直接投與至腦脊髓膜內間隙中不符合，儘管在腦中觀測到非常低含量。然而，在給藥後不久在全身循環及全身組織中觀測到放射性，此表明劑量相關物質在投與後相當快速地自腦脊髓膜內間隙分佈出去。胃及腸內容物中之較高含量表明，劑量相關物質經由糞便排泄，但在該研究中未在排泄物中實施直接量測。另外，膀胱內容物中之高含量亦表明經由尿排泄。除甲狀腺/副甲狀腺中之高含量(認為其反映碘標記之損失及該標記在該組織中之持久性而非測試物質本身之分佈/持久性)以外，亦在肝、肺、腎上腺、脾及腎中觀測到高放射性含量；該等組織可能與測試物質之代謝及/或排泄有關。
在群組2及3中到給藥後之第一時間點放射性普遍且廣泛分佈。最高濃度通常涉及肝、肺、腎、脾、腎上腺，且尤其甲狀腺/副甲狀腺。因此，放射性在所有三個群組之組織中之分佈模式非常類似。再次，在所有動物之甲狀腺/副甲狀腺中觀測到高放射性含量，尤其考慮到隨著給藥後之時間延長濃度顯著增加，可能表示碘標記之損失及該標記在該組織中之持久性而非測試物質本身之分佈/持久性。與群組1相比，在給藥後之早期時間點，該等群組中之CSF含量較高，表明經放射標記之物質能夠跨越血腦障壁。與群組2相比，再次在給藥後之早期時間點，在群組3之該基質中觀測到略微較高之含量，表明該濃度係由靜脈內劑量分佈之測試物質相關物質及直接注射至腦脊髓膜內間隙中之物質而引起。因此，觀測到群組1低於LOQ值可能為極小試樣體積中之極低濃度低於該分析方法可定量的結果。
到給藥後96小時，所有群組之大多數組織中之組織與血清比通常小於1，表明劑量相關物質分佈至組織中，而且與血清相比，通常更容易自組織中清除。對於所有群組，大多數組織暴露於劑量相關物質(如藉由AUC0-tlast評估)小於血清。
結論
在向雄性大鼠投與單次腦脊髓膜內125I-hGALC劑量(標稱60 ug/動物)及/或靜脈內125I-hGALC團注劑量(標稱濃度1 mg/kg)後，測定血液、血清、紅血球、CSF及組織中之放射性濃度。
在腦脊髓膜內投與後在給藥後3小時或在靜脈內給藥後在給藥後之第一時間點(10分鐘)，在血清及全血中觀測到最高放射性濃度，此表明相對快速地分佈至全身循環中。血清中之濃度高於血液中之濃度，此表明測試物質相關物質未很大程度地與血球結合。到給藥後之早期時間點放射性普遍且廣泛地分佈至組織中，且通常，所有三個群組之組織分佈模式類似。對於所有群組，大多數組織於劑量相關物質中之暴露(如藉由AUC0-tlast所評定)小於血清。認為所有三個群組之甲狀腺/副甲狀腺中之高濃度表示碘標記之損失而非劑量相關物質在該組織中之分佈及持久性。到靜脈內給藥後96小時，仍然在數個所檢查組織中檢測到放射性。
實例3：ICV及ICV/IP RMGALC注射之臨床前研究及顫搐型小鼠(TWITCHER MICE)之存活期延長
本實例展示臨床前研究之一個實施例，其闡釋每週IP注射一次rmGALC之顫搐型小鼠的存活期延長。在本實施例中，在坐骨神經中觀測到髓鞘生成之改良以及鞘胺醇半乳糖苷含量降低及大肌肉運動功能(即，步態)改良。在一些實施例中，經單次ICV或ICV/IP rmGALC注射治療之顫搐型小鼠呈現存活期延長及腦鞘胺醇半乳糖苷含量之高達63%降低。在單次ICV投與rmGALC後重要端點(即，存活期、腦鞘胺醇半乳糖苷含量)之陽性結果以及在增加全身投與(ICV/IP)後該等端點之極小程度改良表明，僅CNS方案係治療GLD之可行臨床選擇方案。
引言
球樣細胞性腦白質營養不良(GLD)係一種體染色體隱性遺傳溶酶體貯積症，其發病率為約1:100,000名新生兒(在斯堪的納維亞國家(Scandinavian couhtries)為1.9:100,000名新生兒)。GLD係一種進行性周圍(PNS)及中樞(CNS)神經系統病症，其係導致降解受質脂質[即，半乳糖苷基神經醯胺降解成半乳糖及神經醯胺；半乳糖苷基鞘胺醇(鞘胺醇半乳糖苷)降解成半乳糖及鞘胺醇]之半乳糖腦苷酶(GALC)酵素活性缺陷之基因突變的結果。該病症之特徵在於完全損失少突膠質細胞及髓磷脂以及存在充斥著半乳糖苷基神經醯胺之巨噬細胞(「球樣」細胞)。
該疾病之臨床特徵以兩種形式存在：幼兒型及遲髮型。幼兒型GLD(亦稱為克拉伯病)在90%的診斷為GALC缺陷之所有患者中發生，且通常在出生後3-6個月內觀察到症狀；有在早至2-3週齡表現症狀之報導(Wenger,D.A.等人，2001，Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy(Krabbe Disease)，The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,C.R. Scriver,Beaudet,A. L.,Sly,W.S.及Valle,D編輯，2001，McGraw-Hill.，第3669-3687頁；以引用方式併入本文中)。該疾病之遲髮型變體在臨床上通常到10週歲呈現，然而，曾報導在40週歲時診斷患有該疾病之患者(Wenger,D.A.等人，2001，Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease)，The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,C.R. Scriver,Beaudet,A. L.,Sly,W.S. 及Valle,D編輯，2001，McGraw-Hill.，第3669-3687頁；以引用方式併入本文中)。遲髮型患者經數年時間功能逐漸衰退。
全身酵素替代療法(ERT)已經為患有溶酶體貯積症(LSD)(例如戈謝病、法布裏病及亨特氏症候群)之患者提供益處(Wenger,D.A.等人，2001，Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy(Krabbe Disease)，The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease,C.R. Scriver,Beaudet,A. L.,Sly,W.S.及Valle,D編輯，2001,McGraw-Hill.，第3669-3687頁；Neufeld,E.F.,2004,Enzyme Replacement therapy. Lysosomal disorders of the Brain，F.M.a.W. Platt,S.V.編輯，2004: Oxford University Press. 327-338；Desnick,R.J.,2004. J. Inherit. Metab. Dis.,27(3)：第385-410頁；所有該等文獻均以引用方式併入本文中)。ERT用於GLD未曾嚴格推行，或許因為該疾病侵襲PNS及CNS。當前用於GLD患者之治療包括造血細胞移植(HCT)，然而，該程序由於具有顯著不良事件(即，30%的治療相關死亡率、終生免疫抑制療法)及僅在症狀發生前患者中具有功效而具有其侷限性。
顫搐型小鼠係用於研究GLD之最常見的實驗動物模型，且係該疾病實驗工作之主體(Wenger,D.A.,2000,Mol. Med. Today,6(11)：第449-451頁；以引用方式併入本文中)，但存在其他天然存在之表徵程度有所差異的GLD動物模型。自發突變存在於西高地白梗(West Highland White Terrier)/凱恩梗(Cairn Terrier)(Kobayashi T.等人，1980,Brain Res.,202:479-83；以引用方式併入本文中)、無角多賽特綿羊(Dorset Sheep)(Pritchard D.等人，1980,Vet. Pathol.,17:399-405)、家貓(Johnson K.,1970，J. Am. Vet. Med. Assoc.,157:2057-64；以引用方式併入本文中)及非人類靈長類動物恒河獼猴(Rhesus macaque)(Baskin G.等人，1998,Lab Anim. Sci.,48:476-82；以引用方式併入本文中)。
最初之神經同種異體移植研究顯示，改良顫搐型小鼠許旺細胞(Schwann cell)之周圍神經功能之能力係由同種異體移植顫搐型小鼠細胞中之原位酵素替代來介導，而且受損傷之顫搐型小鼠之周圍髓鞘生成細胞可長期恢復。然而，該技術不能歸納為顫搐型小鼠之總療法(Baskin G.等人，1998,Lab Anim. Sci.,48:476-82；以引用方式併入本文中)。在受侵襲小鼠中，HCT顯示受侵襲動物之壽命及體重增加明顯改良，然而，觀察到功效變化不定，其中記載之生存能力介於44天至大於100天之間(在接受髓鞘減少調節之小鼠中)(Lin,D.等人，2007,Mol. Ther.,15(1):第44-52頁；Hoogerbrugge,P.M.等人，1998,J. Clin. Invest.,81(6):第1790-4頁；兩篇文獻均以引用方式併入本文中)。該等研究中未治療小鼠之典型壽命為約40天。
在該等及其他研究中，相比於未治療對照，治療小鼠中之髓鞘再生速率及現有腦病變均未得到改良(Yeager A.等人，1984,Science,225:1052-4；Toyoshima,E.等人，1986,J. Neurol. Sci.,74(2-3)，第307-18頁；兩篇文獻均以引用方式併入本文中)。使用L-環絲胺酸(單獨或與HCT組合)靶向鞘胺醇合成實施受質抑制可延長顫搐型小鼠之壽命(LeVine S.等人，2000,J. Neurosci. Res.,60:231-6；Biswas S.等人，2003,Neurosci. Lett.,p347：33-6；兩篇文獻均以引用方式併入本文中)。L-環絲胺酸與適於治療焦慮症之其對映異構體D-環絲胺酸不同，其毒性太大以致於不能用於人類。基因療法實驗(單一療法或與HCT組合)已顯示在轉染細胞中產生酵素及延長顫搐型小鼠壽命之能力(Lin,D.等人，2007,Mol. Ther.,15(1)：第44-52頁；以引用方式併入本文中)。當用於症狀發生前動物時，受質減少、HCT及基因療法皆提供最顯著功效，而在具有症狀之動物中其對疾病無影響或影響有限。因此，ERT可在GLD之治療中提供可行的選擇方案，尤其在給予症狀發生前患者時。
結論
當與媒劑治療動物相比較時，使用衍生自HEK 293之鼠類GALC(rmGALC；5 mg/kg)(以多次腹膜內(IP)注射形式周圍給予)實施全身投與之酵素替代療法可延長顫搐型小鼠之壽命及減少鞘胺醇半乳糖苷積聚達15%(表14、圖31)。
與未治療或媒劑治療動物相比，經IP投與rmGALC治療之小鼠在步態測試中表現較好，且坐骨神經組織病理學得以改良。周圍(IP)投與之rmGALC最低程度地遞送至腦中，使得腦鞘胺醇半乳糖苷略微減少。然而，腦組織病理學似乎無任何變化。因此，在經每週一次重複全身投與(IP) rmGALC(5 mg/kg)治療之顫搐型小鼠中觀察到之結果係存活益處、腦鞘胺醇半乳糖苷含量略微降低及大肌肉運動功能改良。
在顫搐型小鼠中單次ICV及ICV/IP組合投與rmGALC
結果顯示，高劑量ICV/IP治療群組平均存活50天(120 μg/5 mpk)，而媒劑治療動物僅存活36天(圖32)。僅用ICV rmGALC治療之小鼠顯示劑量反應性平均存活時間，為42天(40 μg)及48天(120 μg)。單次ICV注射120 μg rmGALC可降低腦鞘胺醇半乳糖苷含量(63%)，而單次ICV注射40 μg rmGALC使鞘胺醇半乳糖苷減少39%(圖33)。儘管ICV/IP投與和單獨ICV相比在鞘胺醇半乳糖苷減少方面未提供任何額外益處，但使用組合方案時觀測到鞘胺醇半乳糖苷含量降低48%，顯著低於使用每週一次單獨IP治療時所觀測到的(15%)。另外，使用ICV以40 μg含量實施治療時觀察到距離注射位點較遠之位點處腦組織學之改良(圖34)。該等結果證實在直接ICV注射後rmGALC於腦中之活性及生物分佈。然而，僅經ICVrmGALC治療之小鼠不能顯示坐骨神經纖維形態或髓鞘生成之恢復，且大肌肉運動功能(例如，步態分析)僅略微改良。在單次ICV投與rmGALC後重要端點(即，存活期、腦鞘胺醇半乳糖苷含量)之顯著改良表明在全身循環中缺乏足夠酵素濃度。
臨床給與參數：顫搐型小鼠中之鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率
在顫搐型小鼠模型中實施以下研究以確定合適的臨床劑量範圍：
-　在出生後第19天(PND19)單次ICV注射後顫搐型小鼠中之腦鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率。
-　在顫搐型小鼠中使用腹膜內(IP)+大腦室內(ICV)組合rmGALC注射實施劑量發現研究。
為評定中樞神經系統中之鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率，在PND19使用單次ICV注射12 μg或40 μg rmGALC來治療顫搐型小鼠。在注射後24 hr(PND20)且隨後每三天屠宰小鼠群組(n=3)。取出腦組織並實施鞘胺醇半乳糖苷分析、組織病理學及酵素活性分析。監測動物亞群之存活情況(n=8)，並在PND40分析運動功能(步態分析)。
經由質譜(LCMS有限公司，North Carolina)分析單次ICV注射後腦勻漿中之鞘胺醇半乳糖苷含量，且表明在投與rmGALC後24 hr內鞘胺醇半乳糖苷快速減少(圖35)。鞘胺醇半乳糖苷之減少趨勢在酵素投與後保持24天。另外，與媒劑治療動物相比，鞘胺醇半乳糖苷濃度之降低在該時間段內呈現劑量依賴性：媒劑治療(平均：4.5 ng/ml鞘胺醇半乳糖苷)對12 μg rmGALC(平均：2.5 mg/ml鞘胺醇半乳糖苷)對40 μg/ml rmGALC(平均：1.6 ng/ml鞘胺醇半乳糖苷)。令人感興趣的是，研究結束時(在治療後28-32天)在兩個劑量群組中觀測到之鞘胺醇半乳糖苷含量增加表明若每月投與一次ERT可能不成功。可能需要更頻繁之給藥時間表。由於每一取樣時間點時動物之數量較少，故結果之變化很明顯。然而，基於該等結果，顯而易見，鞘胺醇半乳糖苷再積聚約以4週(28天)時間表發生。
當分析存活時間時，結果顯示12 μg/mL及40 μg/mL rmGALC治療群組具有48天(12 μg/mL)及50.5天(40 μg/mL)之中值存活期，而媒劑治療動物存活40天(圖36)。出人意料地，相比於媒劑治療動物存活40天，經40 μg人類GALC(rhGALC)治療之小鼠顯示僅存活42天之存活益處。rhGALC之該較低功效的原因尚不瞭解，但將在隨後部分中進行討論。然而，自該研究之結果可以明顯地看出，即使較低劑量之rmGALC仍然在顫搐型小鼠模型中有效而顯示存活益處。
臨床給藥參數：顫搐型小鼠中之rmGALC及rhGALC劑量 範圍研究
先前結果顯示，使用ICV/IP rmGALC(120 μg及5 mpk)治療之顫搐型小鼠比媒劑治療動物多存活14天。然而，僅使用直接CNS注射治療之顫搐型小鼠顯示劑量反應性改良，平均存活期為12天(120 μg ICV)及6天(40 μg ICV)。鼠類腦中之120 μg劑量在患者中轉變成300 mg/kg腦之劑量；因此，研究較低劑量之rmGALC的功效非常重要。另外，在顫搐型小鼠中檢測先前一批rhGALC之功效。從PND 10開始每週一次IP注射(5 mg/kg) rmGALC加上在PND19單次ICV注射12 μg(30 mg/kg腦重量)或26 μg(60 mg/kg腦重量)之rmGALC或rhGALC來治療小鼠群組。在PND39時，屠宰小鼠亞群(n=3/群組)以收穫組織(腦、坐骨神經、肝、血清)。對腦組織實施鞘胺醇半乳糖苷分析、組織病理學及酵素活性定量。監測其餘存活動物(n=8)之存活情況及步態分析。
討論
該劑量發現研究之結果顯示rmGALC投與之存活益處具有劑量依賴性趨勢(圖37)。12 μg/5 mpk及26 μg/5 mpk組合劑量之rmGALC分別使顫搐型小鼠之平均壽命延長至44.5天及45.5天，相比之下，媒劑治療動物之壽命為40.5天。12 μg/5 mpk(38天)及26 μg/5 mpk(39.5天)劑量之rhGALC無存活益處。26 μg/5 mpk rhGALC劑量使受侵襲顫搐型小鼠之壽命延長1.5天，然而任何劑量之rhGALC均未達到媒劑治療動物之存活天數(圖37)。如先前在使用rmGALC全身治療(IP)之動物中所觀察到的，對於接受組合ICV/IP投與rmGALC之所有動物，觀察到步態分析之改良，然而使用單次ICV注射治療之動物顯示較少運動功能益處(圖38)。如對於壽命益處所觀察到的，在使用rhGALC治療之小鼠中未觀察到步態分析之益處。然而，發現rhGALC之比活性為rmGALC活體外活性之約33%(表15)。因此，該等當前結果表明，即使使用較低劑量之rmGALC，亦存在存活及運動功能之益處，由此增加了ERT用於治療GLD之機會。顯而易見，鞘胺醇半乳糖苷再積聚約以4週(28天)時間表發生。
預期rmGALC及rhGALC具有抗原性，因為顫搐型小鼠係裸模型(null model)[即，其呈交叉反應免疫物質(CRIM)-陰性]。總之，rhGALC治療小鼠(ICV/IP方案)中之最大血清抗體效價顯著高於使用相對照ICV/IP rmGALC方案治療之小鼠(圖39)。儘管經直接CNS注射治療之小鼠中亦存在抗體，但最大效價為接受ICV/IP治療之動物的幾分之一。可能已產生中和抗體。
開始使用GALC缺陷型犬實施研究以表徵rhGALC之抗原性。在該研究中，每週一次IV投與2 mg/kg人類GALC及/或IT投與2.25 mg(30 mg/kg腦重量)人類GALC或單獨媒劑來治療受侵襲動物(出生後6週)。在8週時且在剩餘研究時間內每月一次投與額外治療(直至出生後約16週)。取出CSF，隨後無痛致死，並分析抗體形成及鞘胺醇半乳糖苷含量(圖40)。
在MPSIIIA之牧羊犬(Huntaway dog)模型中使用重組人類肝素N-硫酸酯酶之先前研究顯示對外源酵素之顯著抗體反應，使得需要在該研究中使動物免疫耐受。然而，檢測天然及rhGALC治療犬之CSF的初步結果顯示，與未治療對照相比鞘胺醇半乳糖苷含量明顯降低(圖40)。
實例4：經IT注射之GALC在小鼠中之腦及肝組織學/標記
本實例闡述在小鼠中經IT注射之hGalC及mGalC以及GalC抗體在各個組織中之對應檢測及定位的一個實施例。
實驗設計
組織採集及組織學染色
僅分別來自群組B及C之三隻動物可用於組織學分析。將腦及肝試樣固定於10%中性緩衝福馬林(formalin)中以便隨後實施石蠟包埋。製備5 μm石蠟切片用於I2S之免疫組織化學(IHC)以檢測注射之蛋白質。使用三種抗GalC抗體來實施GalCA之IHC染色。
1.　小鼠單株抗體(由Dr. Eckman實驗室產生)
2.　兔多株抗體(由群組1產生)
3.　兔多株抗體(由群組2產生)
使用高靈敏度的ABC+酪胺醯胺(Tyramide)螢光擴增方法來標記目標蛋白質。染色結果將GalC陽性細胞顯示為綠色，核顯示為DAPI藍色對比染色，且背景區域顯示為黑色。
結論
群組1多株抗體與小鼠腦中之內源蛋白質具有強烈交叉反應。即使在媒劑對照腦中，所有CNS細胞皆強烈陽性染色。在該強烈背景下未識別出注射之蛋白質(圖41)。群組2多株抗體與小鼠腦中之內源蛋白質具有較弱交叉反應，但媒劑對照腦中之CNS細胞仍然呈陽性。在該背景上未檢測到注射之蛋白質(圖42)。小鼠單株抗體具有可接受之特異性，在媒劑對照腦中具有遠遠較低之信號(數據未顯示)。IT注射後，所有蛋白質均在腦表面上之腦脊髓膜中檢測到。群組1及群組2之hGalC均在位於腦脊髓膜下方之區域中之CNS細胞(神經元及神經膠質細胞)中檢測到，其中群組1治療動物之hGalC信號相對較強。未在mGalC治療之腦中檢測到陽性神經元及神經膠質細胞(圖43)。在小腦中，hGalC在腦脊髓膜中及在顆粒區表面上產生染色，而mGalC未如此(圖44)。小鼠單株抗體在小鼠腦中有效，但在肝中顯示與竇狀隙細胞之強烈交叉反應性，因而不能用於評定肝中經IT注射之蛋白質之細胞吸收(圖45)。群組2多株抗體在肝組織中顯示特異性，而在媒劑對照腦中信號遠遠較低。治療後，在肝中之竇狀隙細胞及肝細胞中均可檢測到所有經IT注射之蛋白質，而群組1治療動物具有較少hGalC陽性細胞且hGalC信號較弱(圖46)。儘管在任一治療群組中均未發現較高GalC活性，但在腦脊髓膜中及在周圍區域中之CNS細胞中發現陽性染色，表明IHC在檢測注射之蛋白質(已在細胞層面上被吸收)方面靈敏(圖47)。在肝中，mGalC顯示較高活性，然而，經由群組2 Ab之IHC在mGalC與hGalC之間檢測到非常小差異(圖48)。使用群組1 Ab時hGalC之可檢測活性較低與觀測到之IHC含量較低一致。
概述
IT注射後，經由IHC可在大腦之腦脊髓膜中檢測到所有注射之蛋白質。在CNS細胞(神經元及神經膠質細胞)中檢測到群組l及群組2之注射hGalC的細胞吸收，而群組1治療腦中之hGalC信號相對較強。未在mGalC治療腦中檢測到陽性神經元及神經膠質細胞。在小腦中，除腦脊髓膜中有陽性信號以外，亦在顆粒區表面上之細胞層中發現群組1及群組2之注射hGalC。在所有治療群組之肝中，在竇狀隙細胞及肝細胞中檢測到注射之蛋白質，此表明腦脊髓膜內I2S最終吸收至循環系統中。群組2之mGalC及hGalC與群組1之hGalC具有近似強烈的染色信號。
實例5：經IT注射之GALC在犬中之腦組織學/標記
本實例闡述在犬中經IT注射之GalC以及GalC抗體在腦中之對應檢測及定位的一個實施例。在該實施例中，在腦脊髓膜及腦脊髓膜下方之表面皮質區域中檢測到經IT注射之蛋白質。在腦室周圍區域中發現經ICV注射之蛋白質(圖49)。IT注射後，GalC IHC顯示在皮質中有擴散的細胞外染色圖案，而神經元呈現陰性信號(以圓圈圈出)(圖50)。在ICV注射之腦室周圍區域及IT注射之皮質中觀察到呈陽性Iba染色之激活的小神經膠質細胞有限的減少(圖51)。在媒劑群組中，使用LFB/PAS在皮質中未發現形態變化(球樣細胞)，且各群組間未觀察到差異。ICV治療後在腦室周圍區域之4個有限區域中經Iba染色標記之球樣細胞(箭號)減少(圖52)。
IT遞送I2S蛋白質之實例 實例6：經IT遞送之I2S的生物分佈
該研究之主要目的係確定重組人類I2S是否可藉由腦脊髓膜內-腰椎途徑遞送至成年MPS II小鼠之腦中。
材料及方法 動物：
將小鼠分群組圈養在處於12小時光暗循環下之聚居室(colony room)中，每個籠子中至多4只小鼠。在實驗持續時間內隨意獲取齧齒類動物飼料(LabDiet-5001,St Louis,MO)及水(Lexington，MA市政水，藉由反滲透予以純化)。按照實驗室動物照護與使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(National Academy Press,Washington D.C.,1996)中闡述之導則來實施動物照護。自IKO異型接合突變之四隻雌性攜帶者小鼠建立當前的IKO繁殖群，該等小鼠係自Dr. Joseph Muenzer(University of North Carolina)獲得。使雌性攜帶者與C57BL/6背景品系之雄性小鼠(C57BL/6NTac,Taconic,Hudson,NY)交配，產生異型接合之雌性及半合子雄性基因敲除小鼠、以及野生型雄性及雌性同胎幼仔。藉由組織DNA之PCR分析對所有後代進行基因分型。該實驗中使用之所有小鼠均為8週齡至12週齡之鑒定為半合子IKO(-/0)或野生型(WT)同胎幼仔(+/0)的雄性小鼠。
艾杜硫酶：
將22 mL I2S[重組人類艾杜硫酶]在2L磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進行透析，更換4次PBS。隨後將I2S藉由Vivaspin管柱進行濃縮並再懸浮於PBS中(最終體積為1 mL)，然後使用0.2 μm過濾器實施過濾滅菌。最後濃度為51 mg/mL。
腦脊髓膜內-腰椎注射：
使用1.25% 2,2,2三溴乙醇(Avertin)以200-300 μL/10克體重(250-350 mg/kg)藉由腹膜內注射使成年小鼠麻醉。除去介於尾巴底部與肩胛骨之間的背部毛髮，並利用帕維酮(povidine)/聚維酮碘(betadine)隨後異丙醇擦洗來擦拭剃毛區域。在腰骶部脊柱上作一個中線皮膚小切口(1-2 cm)，並確定背部中線與回腸(複數形式ilea，單數形式ileum)翼狀物之頭側的交點。髂窩中之肌肉(臀中肌)係呈心臟形狀之肌肉，且「心臟」頂部兩側接近回腸翼狀物位置。插入附接至氣密性10-20 μL玻璃Hamilton注射器之32號針，直至感覺到來自下方骨骼之阻力。以約2 μL/20秒(10 μL/2分鐘)之速率注射10 μL測試物質。視需要使用創傷夾來縫合皮膚切口，並使動物在恢復室中恢復，隨後返回到合適的籠子中。
組織學程序：
在最後一次注射後1小時屠宰動物。
採集腦及肝組織並固定於10%中性緩衝福馬林中，隨後進行處理並包埋於石蠟中。製備5 μm切片以用於蘇木素/伊紅(H&E)及免疫組織化學(IHC)染色。
蘇木素及伊紅染色：
使用H&E將腦及肝切片染色。染色結果將核顯示為紫色且將細胞質顯示為粉色至紅色。使用H&E染色的載玻片來實施組織病理學形態評價。
免疫組織化學：
實施I2S生物分佈評價時，將去石蠟且再水合之腦及肝切片與對抗重組人類I2S之小鼠單株抗體2C4-2B2(Maine Biotechnology Services,Portland,ME)一起培育過夜以檢測注射之I2S(或以無關小鼠IgG作為陰性對照抗體；Vector Laboratories,Burlingame,CA)。在2-8℃下培育過夜後，添加與辣根過氧化物酶結合之二級山羊抗小鼠IgG。在37℃下再培育30分鐘後，再經10分鐘添加酪胺醯胺-Alexa Fluor 488標記溶液(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)。使用含有1.5 μg/ml 4'-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)作為核對比染色劑之抗衰退封固介質(VectaShield;Vector Laboratories)給切片蓋上蓋玻片，並使用多通道Nikon螢光顯微鏡進行觀察。染色結果將I2S陽性細胞顯示為綠色，核顯示為藍色，且背景區域顯示為黑色。
實施功效分析時，使用大鼠抗LAMP-1(以溶酶體相關膜蛋白作為溶酶體標記)IgG(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,California)作為一級抗體將腦及肝切片染色。使用無關大鼠IgG抗體作為陰性對照。使用ABC(抗生物素蛋白生物素複合物套組，來自Vector Labs，Burlingame，California)方法來擴增目標標記。
簡言之，將去石蠟之切片再水合，並與一級抗體一起培育。在2-8℃下培育過夜後，添加二級生物素化兔抗大鼠IgG(Vector Labs,Burlingame,California)，並在37℃下培育30分鐘，隨後將試樣洗滌並用抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶複合物(Vector Laboratories)處理30分鐘。顯色時，使用3,3 ' -二胺基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)作為發色團。隨後使用蘇木素將切片對比染色並蓋上蓋玻片。染色結果將LAMP-1陽性細胞顯示為褐色且將核顯示為藍色。
拍攝代表性照片，並使用Image-Pro Plus軟體(Media Cybernetics公司，Bethesda,MD)分析LAMP-1陽性細胞區域，並使用司徒登氏t-測試(student's t-test)實施比較統計學分析。
電子顯微鏡方法：
將經3次劑量之I2S治療之動物的腦組織在4℃下在存於0.1 M二甲基胂酸鈉緩衝劑(pH 7.4)中之2.5% PFA/2.5%戊二醛中固定過夜。隨後，將試樣在二甲基胂酸鹽緩衝劑(0.1 M,pH 7.4)中洗滌，並在四氧化鋨中後固定，在酒精及環氧丙烷中再水合，並包埋於Epon樹脂中。切割成100 nm之超薄切片，使用檸檬酸鉛染色並在TecnaiTM G2 Spirit BioTWIN透射電子顯微鏡中進行檢查。
結論
在腦中，如藉由免疫組織化學(IHC)所測定，未在媒劑對照動物中發現I2S。相比之下，在注射I2S之動物中腦脊髓膜細胞、大腦及小腦之神經元呈現I2S陽性染色。投與3次劑量之動物中的染色信號較強(圖53)。
與野生型動物相比，在媒劑治療之IKO小鼠之腦組織中在整個腦中發現細胞空泡形成(溶酶體貯積症之組織病理學標誌)。在I2S治療之IKO小鼠中，與未治療小鼠相比，自表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦至白質，細胞空泡形成廣泛減少(圖54)。藉由溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP-1)染色(溶酶體活性及疾病狀態之指示)發現，與野生型動物相比，在媒劑治療之IKO小鼠之小神經膠質細胞、腦脊髓膜及血管周細胞中溶酶體活性異常高(圖55)。經腦脊髓膜內投與I2S治療之小鼠之LAMP-1免疫染色顯著減弱。此減弱之特徵在於LAMP-1陽性細胞之數量減少及染色較淺。在經2次劑量及3次劑量之I2S治療之動物中，此減弱可在自表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦至白質之整個腦中發現(圖56)。各個腦區之LAMP-1免疫染色的形態測定法分析證實，在評價之所有腦區域中LAMP-1陽性染色顯著減弱(圖56)。
媒劑治療之IkO小鼠中之腦細胞的電子顯微鏡檢查顯示，含有無定形顆粒貯積物質之空泡及片層狀包涵體以及斑馬體樣結構增大。在經腦脊髓膜內-腰椎注射I2S之小鼠中，溶酶體貯積之超微結構層面上之該等典型病理學特徵減少(圖57)。
在媒劑治療動物之肝中無I2S之陽性染色。在經腦脊髓膜內注射I2S之小鼠中，在竇狀隙細胞中清楚地發現大量注射之I2S(圖58)，此表明位於腦脊髓膜內間隙內之注射的I2S隨CSF循環且隨後吸收通過蛛網膜顆粒至循環系統中。
與WT小鼠相比，在媒劑治療之IKO小鼠的肝組織中發現嚴重細胞空泡形成及異常高之溶酶體活性，此由H&E染色及強LAMP-1免疫染色予以證實。在使用I2S經腦脊髓膜內治療後，發現肝中之細胞空泡形成及LAMP-1免疫染色顯著減少。H&E染色表明細胞質內空泡形成幾乎完全消失且肝細胞結構接近正常(圖59)。
在IKO小鼠中，將重組人類I2S藉由腦脊髓膜內-腰椎途徑遞送至腦中，且注射之I2S在多個腦區域中達成廣泛的組織病理學改良。
‧　在腦中之腦脊髓膜細胞及神經元中檢測到注射之I2S。
‧　在光學及電子顯微鏡檢查層面上整個腦中之細胞空泡形成減少。
‧　整個腦中之LAMP-1溶酶體標記減少。
‧　經腦脊髓膜內注射之I2S進入周圍循環中並改良肝形態及組織學標記。
實例7：I2S之IT遞送的毒理學
該實例展示在食蟹猴中每月一次經腦脊髓膜內腰椎團注給藥時與艾杜硫酶有關之臨床體徵。為達成此目的，將14只雄性食蟹猴如下表17中所示隨機分配至五個治療群組中。
所有群組中之動物均以每月一次間隔在腰椎節段經IT給藥三次。使用0.3 ml PBS自導管系統沖洗1 ml劑量體積。在每次給藥之前一天至兩天，藉由IT脊髓穿刺在小腦延髓池位置採集約2 ml CSF。同時亦採集血液試樣(2 ml)。在給藥前、在給藥後在第一次給藥後0.5、1、2、4、8、24及48小時自群組5動物採集血液(2 ml)及CSF(0.1 ml)。每天記錄至少兩次臨床體徵。在第三次給藥後約24小時實施屍體剖檢，收穫所選組織並予以保存。
在第1天，群組4(150 mg)之所有三隻動物均在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度趨向於後肢(hind quarters)，持續5-15分鐘；認為此體徵與測試物質有關。不存在認為與測試物質有關之體重、攝食量及神經/體格檢查參數方面的變化。
給出血清及CSF試樣之分析以及給藥溶液分析。在食蟹猴之不同組織中觀察到內源艾杜硫酶活性之變化；腦及脊髓與檢查之其他周圍器官(包括肝、心臟及腎)相比具有較高之內源活性。艾杜硫酶投與和各個腦區以及腦幹及脊髓中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關。IT遞送未導致右大腦半球與左大腦半球之分佈間具有可觀察到之差異。以下器官中之艾杜硫酶活性具有明顯的劑量依賴性增強：腦、肝、心臟及腎。腦中艾杜硫酶之免疫染色展示染色強度具有劑量依賴性增強。在3 mg群組中，觀察到腦脊髓膜細胞及腦脊髓膜下方有限的神經膠質細胞染色；在3 mg治療群組之動物中，神經元染色不明顯。當經IT投與艾杜硫酶時，脊髓中之艾杜硫酶染色呈陽性且具有劑量依賴性，且最高染色強度出現在腰區中。肝、腎及心臟中之艾杜硫酶染色強度具有劑量依賴性，且與該等器官中艾杜硫酶活性之增強一致。
總之，以最高150 mg之劑量以每月一次間隔經IT投與遞送艾杜硫酶不具有不良效應。因此，認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該研究中測試之最高劑量)。艾杜硫酶投與和CNS中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關，且使得肝、腎及心臟中具有全身含量。
測試物質艾杜硫酶係以存於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 5.3-6.1)中之給藥溶液來提供。所提供給藥溶液之標稱濃度為0、3、30或150 mg/ml。將測試物質儲存於-82℃至-79℃下之冷凍器中。使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.2)作為投與劑量後及連續CSF採集後之沖洗劑。PBS係自Gibco(Invitrogen公司)獲得。
測試物質給藥準備
對於每一時間間隔，在給藥之第1天，自-80℃臥式冷凍器取出每一濃度之一個小瓶，並在工作臺面上使其解凍至室溫。解凍後，給群組1、2及3之小瓶貼上標籤，稱重，並通過0.22 μm過濾器取出1 ml以用於安排給藥之每只動物。投與所有劑量後，再次給小瓶稱重並放置於冰箱中。
次日(動物003、群組4及群組5之給藥日期)，自冰箱取出用於群組1及4之給藥溶液，並放置於工作臺面上以使其達到室溫。達到室溫後，給群組1及4之小瓶稱重，給群組4小瓶貼上標籤，並通過過濾器取出1 ml以用於群組1及4中安排給藥之每只動物。隨後藉由將合適量的群組4給藥溶液及群組1給藥溶液(媒劑)注射至無菌聚丙烯小瓶中來製備用於群組5之給藥溶液。記錄自群組1及4添加之量。藉由輕輕顛倒小瓶來混合溶液，並通過過濾器取出2-1 ml劑量用於群組5中之動物。給藥完成後再次給群組1及4之小瓶稱重，並將所有小瓶(群組1-5)放置於冷凍器中。
如表17中所述將14只動物隨機分配至治療群組中。
選擇IT投與途徑係由於該途徑係用於人類投與之擬定途徑。選擇經選擇用於該研究之艾杜硫酶劑量(3、30、100及150 mg/ml)來評定每月一次連續三個月IT腰椎團注後不同劑量量之酵素在非人類靈長類動物中樞神經系統(CNS)內之生物分佈。
臨床觀察
臨床體徵之總發生率極低。群組1(對照)、群組2(3 mg)、群組3(30 mg)或群組5(100 mg)中沒有一隻動物在研究期間之任一時間具有被認為與測試物質有關之臨床體徵。
在第1天，群組4(150 mg)之所有三隻動物(012-014)均在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度的趨向於後肢，持續5-15分鐘。認為此體徵與測試物質有關，且未在任一較低劑量群組中觀察到。在第一次給藥後即刻或在投與測試物質後緊接數天無其他臨床體徵。對於群組4動物觀察到之唯一其他體徵係在第35天動物013發生了一次嘔吐。
當考慮到使用植入的藥物遞送裝置固有之變化時，以單次、每月一次腦脊髓膜內團注形式投與測試物質未引起任何不良的肉眼或顯微鏡下變化。包括對照群組在內之所有群組在腦脊髓膜中具有指示對藥物遞送系統之發炎反應的顯微鏡下變化。在接受30 mg及更大劑量之測試物質的動物中，在腦脊髓膜中具有發生發炎反應以產生更明顯之嗜伊紅白血球成份的傾向，但認為此差異在生物學上不顯著。
由於對照與測試物質治療動物之間的差異非常微小，故認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該研究中測試之最高劑量)。
在所有群組(包括對照)中，腦脊髓膜中之總發炎反應相比於在猴子中實施此持續時間之腦脊髓膜內研究時通常遇到之發炎反應略微明顯。然而，認為此可能與媒劑之某一特徵或與給藥後24小時實施屍體剖檢有關。
除3 mg群組中之一只動物外，在所有其他治療動物中腦艾杜硫酶染色均呈陽性，且在150 mg群組中觀察到最高染色強度(圖60、61、62及63)。在3 mg群組中，僅腦脊髓膜細胞及腦脊髓膜下方之少數神經膠質細胞呈陽性；在神經元中未檢測到注射之艾杜硫酶。在較高劑量群組(30、100及150 mg)中，大量大腦神經元以及腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞及血管周細胞對於艾杜硫酶染色呈強烈陽性。艾杜硫酶免疫染色顯示注射之艾杜硫酶在大腦神經元中自位於腦脊髓膜附近表面上之層I內之神經元至鄰近白質之較深層VI內之神經元廣泛分佈(圖64、65及66)。對於150 mg劑量群組亦觀察到顯著的神經元染色(圖67)。在所有動物(30 mg-150 mg劑量群組)中，發現腦之前部、中部及後部間神經元艾杜硫酶染色無顯著差異。
在所有動物之脊髓中艾杜硫酶染色均呈陽性，其中最高染色強度出現在腰區中(圖68及69)。艾杜硫酶免疫染色亦具有劑量依賴性。在150 mg群組中，神經元、腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞、血管周細胞以及神經纖維周圍之神經外膜/神經束膜/神經內膜(結締組織細胞)對於艾杜硫酶染色呈強烈陽性(圖70及71)。
發現所有動物之肝中的竇狀隙細胞(庫弗細胞及內皮細胞)均呈陽性艾杜硫酶染色。然而，對於3 mg治療群組，未在肝細胞中檢測到艾杜硫酶(圖72)，而在較高劑量群組中發現肝細胞呈陽性艾杜硫酶染色，其中最大染色強度出現在150 mg治療群組中(圖73、74及75)。
在3 mg治療群組之動物中不存在陽性艾杜硫酶染色(圖76)。相比之下，在30 mg、100 mg及150 mg群組中，間質細胞呈陽性艾杜硫酶染色，其中在150 mg群組中觀察到顯著染色-就陽性細胞數量及染色強度而言(圖77、78及79)。
腎
在3 mg劑量群組之動物中檢測到很少或未檢測到注射之艾杜硫酶(圖80)。然而，發現30 mg及100 mg群組中之腎小球細胞及間質細胞呈陽性艾杜硫酶染色(圖81及82)。在150 mg群組中，艾杜硫酶免疫染色還顯示近端腎小管細胞之艾杜硫酶染色以及腎小球細胞及間質細胞之顯著染色(圖83)。
討論
不存在與測試物質有關之臨床體徵或對體重、攝食量、體格檢查發現及神經檢查發現之影響。在第1天，群組4(150 mg)動物在給藥後3-12分鐘內呈現最小程度的趨向於後肢，持續5分鐘至15分鐘；斷定此體徵與測試物質有關。
艾杜硫酶投與和各個腦區以及腦幹及脊髓中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關。當經IT投與艾杜硫酶時，脊髓中之最高程度染色強度出現在腰區中。經IT投與艾杜硫酶亦使得全身暴露，且肝、腎及心臟中之染色強度具有劑量依賴性。接受30 mg及更大劑量之測試物質的動物之腦脊髓膜中具有發生發炎反應以產生更明顯之嗜伊紅白血球成份的傾向。
以最高150 mg之劑量以每月一次間隔經IT投與遞送艾杜硫酶不具有不良效應。因此，認為無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為150 mg(該實例中測試之最高劑量)。艾杜硫酶投與和CNS中之艾杜硫酶活性劑量依賴性增強有關，且使得肝、腎及心臟中具有全身含量。
實例8：經IT遞送之I2S的PK(血清及CSF)
該實例提供針對測試物質(TA)濃度之血清及腦脊髓液(CSF)分析，其涉及在食蟹猴中經由每月一次腦脊髓膜內腰椎團注及每週一次靜脈內團注投與艾杜硫酶的6個月毒性研究。
實驗設計
其目的係經6個月時間段自毒理學及安全藥理學角度評價艾杜硫酶(I2S)之重複劑量腦脊髓膜內(IT)投與。研究設計顯示於表18中。
測試物質
身份：艾杜硫酶IV給藥-批號為FDC06-001(2.0 mg/mL)
IT給藥-艾杜硫酶(0 mg/mL)
艾杜硫酶(3 mg/mL)
艾杜硫酶(30 mg/ml)
艾杜硫酶(100 mg/ml)
分析方法：
利用ELISA(酵素連結免疫吸附分析)實施分析以測定艾杜硫酶之濃度。在乘以稀釋因子之前檢測極限(LOD)為1.25 ng/mL。以1:50稀釋度篩選試樣，因此分析靈敏度為62.5 ng/mL。將落在校準曲線高端以外之試樣進一步稀釋，並在適當稀釋使數值在曲線範圍內之後再次進行測試。利用酵素活性分析再次分析所選試樣。在1:150之最低試樣稀釋度下，該分析之LOD係0.18 mU/mL。
分別給予鹽水或媒劑之群組1及2中之動物在整個IV及IT給藥期間均具有介於138 ng/mL與小於62.5 ng/mL(或小於LOD)範圍內之血清艾杜硫酶含量。在所測試之來自群組1及2動物之200份CSF試樣中，62份試樣展示高於分析LOD之I2S含量。其中，7個數值較高(大於1,000 ng/mL)。在第3次IT給藥之前採集之另一份CSF試樣經測試高於1,000 ng/mL I2S。隨後測試該等試樣之艾杜硫酶活性。在每一情形下，活性結果指示I2S之存在，且當基於活性程度計算I2S之近似濃度時，結果在藉由抗原ELISA獲得之數值之20%以內。(參見表19)亦利用酵素活性分析來測試抗原ELISA結果小於LOD之其他隨機選擇CSF試樣以排除任何非特異性活性。
在該研究中，分析血清及CSF試樣之艾杜硫酶濃度。按照以下時間表來採集血清試樣：
IV給藥：給藥前及第1至10次給藥後2小時，給藥前及第11至23次給藥後4小時，及屍體剖檢時。
IT給藥：給藥前及第1及2次給藥後2小時，給藥前及第3至6次給藥後4小時，及屍體剖檢時。
按照以下時間表來採集CSF試樣：
IV給藥：給藥前及第1次給藥後2小時，及第3及6次給藥後4小時。
IT給藥：給藥前及第1及2次給藥後2小時，給藥前及第3至6次給藥後4小時，及屍體剖檢時。
通常，血清艾杜硫酶似乎比CSF艾杜硫酶清除地更快速。在測試之所有時間點，分別給予鹽水或媒劑之群組1及2動物的血清艾杜硫酶含量均小於或等於138 ng/mL。一些動物具有低於分析檢測極限(LOD)之含量。
較少來自群組1及2之CSF試樣高於分析LOD，其中7份試樣顯著例外，其具有較高含量(大於1,000 ng/mL)。在第3次IT給藥之前自動物採集之一份CSF試樣亦經測試高於1,000 ng/mL艾杜硫酶。
給出該等偏離趨勢之結果的試樣再次進行測試及證實。另外，測試該等試樣之艾杜硫酶酵素活性。該等活性結果亦證實高艾杜硫酶含量在藉由艾杜硫酶質量分析所獲得之數值的20%以內(表19)。
活性分析之特異性係在該試樣隊列內藉由隨機測試艾杜硫酶質量單位低於LOD之CSF試樣來驗證，且證實該等試樣中之艾杜硫酶含量實際上為LOD(數據未顯示)。
實例9.　經IT遞送之I2S的生物分佈
已經成功地證實腦脊髓膜內投與係將I2S遞送至CNS組織中之有效方式，現實施另外研究以確定經IT投與之I2S是否能夠分佈至深層腦組織中以及確定是否存在經IT投與之I2S的細胞定位。製備重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)調配物，並調配於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 6.0)之媒劑中。
藉由植入式腦脊髓膜內座每月向非人類靈長類動物投與一次3 mg、30 mg或100 mg I2S，連續投與6個月。研究設計概述於下表20中。
每月一次持續6個月以測試之最高劑量向非人類靈長類動物重複投與I2S具有良好耐受性，且未引起任何顯著不良毒理學事件。在投與第六及最後I2S劑量後24小時，屠宰個體非人類靈長類動物，並檢查該等非人類靈長類動物之CNS組織。
如藉由免疫組織化學(IHC)所測定，在全部CNS細胞及組織中存在I2S之廣泛細胞沈積。藉由IHC在所有腦組織中檢測到I2S蛋白質，其中沈積梯度自大腦皮質至腦室白質。在灰質中，在所有群組之大腦、小腦、腦幹及脊髓之神經元中以劑量依賴性方式檢測到I2S。在較高劑量群組之表面灰質中，在表面皮質中大量大腦神經元對於I2S染色呈陽性(圖84A)。亦在丘腦(圖84B)、海馬(圖84C)、尾狀核(圖84D)及脊髓(圖84E)中之神經元中檢測到I2S。腦脊髓膜及血管周細胞對於I2S染色亦呈陽性(圖84F)。
如圖85及圖86中所繪示，顯然，經IT投與之I2S分佈至個體非人類靈長類動物之CNS組織中且尤其沈積於灰質、丘腦及大腦皮質中。此外，圖86及圖87繪示經IT投與之I2S以劑量依賴性方式積聚於繪示的個體非人類靈長類動物之CNS組織中。共定位染色亦顯示I2S之IT投與涉及神經元及少突膠質細胞。經IT投與之I2S亦分佈及定位於個體非人類靈長類動物之整個大腦中，如圖88所顯示。具體而言，圖89A-D繪示經IT投與至非人類靈長類動物後I2S之神經元吸收及軸突結合，如藉由神經絲染色所證實。亦尤其令人感興趣的是，本研究闡釋I2S對於神經元細胞具有選擇性，且該等神經元細胞促進經腦脊髓膜內投與之I2S分佈至深層腦組織中且似乎與軸突結構結合，表明I2S係順向軸突轉運。
下表21給出單獨動物研究之各種投與途徑及劑量的藥物代謝動力學數據。
如下表22中所示，將經124I標記之I2S投與至測試動物，且PET掃描結果顯示於圖106中。
本研究亦展示IT投與後經IT投與之I2S在個體非人類靈長類動物腦室附近之白質腦組織中之細胞鑒定。儘管白質中之I2S染色密度通常低於灰質，但在少突膠質細胞內檢測到I2S(圖90)。具體而言，圖90繪示白質腦組織中I2S之細胞鑒定且進一步證實I2S似乎不與髓磷脂結合。
除證實經IT投與之I2S深層分佈至腦組織中以外，本研究亦證實I2S定位至目標細胞器中，且重要的是I2S定位至溶酶體中，溶酶體係溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)中之受侵襲細胞器。具體而言，I2S定位於溶酶體內，且亦在軸突內檢測到I2S。圖90繪示經IT投與之I2S於個體非人類靈長類動物之少突膠質細胞之溶酶體內的定位，由此證實經IT投與之I2S能夠分佈至深層腦組織中且能夠細胞定位。
為辨別遞送之I2S是否保留生物活性，利用比活性分析來量測腦中I2S之活性程度。在最後一次給藥後24小時，3 mg IT群組之腦中之活性明顯不同於裝置對照及媒劑對照動物中之基礎活性程度。屍體剖檢時(給藥後24小時)，30mg及100 mg IT給藥動物之腦中之酵素活性高於基線。
辨別I2S遞送至腦中之位置的其他動物測試顯示於圖104及下表23中。
實例10.IT遞送在比格犬(BEAGLE DOG)中之生物分佈
在上文實例中觀察到之I2S分佈模式亦在給予單次IT或ICV劑量之健康比格犬中重現。利用電腦產生之編號將雄性比格犬隨機分成兩個群組(群組1(ICV)，N=3；群組2(IT)，N=4)。所有比格犬均具有植入於腰椎處之蛛網膜下腔中或左側大腦腦室中(用於給藥)及小腦延髓池中(用於取樣)之導管。所有導管均終止於皮下鈦輸液座。使用另外一隻犬作為未給藥之手術對照。
經IT或ICV投與單次團注1 ml I2S(30 mg/ml，存於20 mM磷酸鈉(pH 6.0)；137 mM氯化鈉；0.02%聚山梨醇酯-20中)，隨後用0.3 ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；pH 7.2)沖洗。監測臨床體徵，並在給藥後24小時進行屠宰。採集腦及脊髓組織試樣用於定量I2S分析(如藉由ELISA所測定)、I2S酵素活性及IHC，並在研究群組間進行比較。
如藉由IHC所測定，I2S廣泛分佈於IT及ICV群組之全部灰質中。如圖91(影像a及c)所繪示，在IT及ICV群組之大腦皮質中，在自表面分子層至內部深層之所有六個神經元層中，神經元均呈I2S陽性。如圖91(影像c及d)所繪示，在IT及ICV群組之小腦皮質中，在包括普爾欽細胞在內之神經元中檢測到I2S。如圖91(影像e及f)所展示，在IT及ICV群組中，海馬中之大量神經元呈I2S陽性。如圖91(影像g及h)中所繪示，在兩個群組之丘腦及尾狀核中亦發現I2S陽性神經元。
因此，本研究證實經IT投與之酵素能夠分佈至深層腦細胞及組織中，且支持經IT投與之酵素(例如I2S)用於治療與溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)有關之CNS表現的效用。
實例11.　經IT遞送之I2S的活體內功效 艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶缺陷型小鼠模型
已經證實經IT投與之I2S能夠分佈至深層腦組織中及I2S之細胞定位，現實施進一步研究以測定經IT投與之I2S的治療功效。產生經基因改造的艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶基因敲除(IKO)之亨特氏症候群小鼠模型以研究經IT投與之I2S改變疾病進展之能力。利用I2S基因座之靶向破壞來產生I2S基因敲除小鼠模型，該I2S基因座之靶向破壞會導致糖胺聚多糖(GAG)積聚於組織及器官中。該IKO小鼠模型呈現許多在人類中看到之亨特氏症候群體格特徵，包括特徵性粗魯外貌及骨骼缺陷。另外，該IKO小鼠模型展示在尿及整個身體組織中糖胺聚多糖(GAG)含量升高以及在組織病理學方面觀察到之廣泛的細胞空泡形成。
在本研究中，將市售I2S(Elaprase)濃縮並再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。將六個群組之雄性IKO小鼠(8-12週齡)用I2S(10 μl；26 mg/ml)進行治療。群組A及B(N=3)分別經腦脊髓膜內投與三次260 μg I2S劑量(在第1、8及15天)及兩次260 μg I2S劑量(在第1及8天)。群組D亦係在第1、8及15天用三次經腦脊髓膜內投與之260 μg劑量進行治療。群組C及E(N=3)係未經治療之對照群組且群組F(N=3)係未經治療之野生型對照。給對照小鼠投與不含I2S之媒劑。在最後一次注射後1小時後屠宰小鼠，隨後製備組織以用於免疫組織化學(IHC)及組織病理學分析。
第三次注射後，與媒劑治療小鼠相比，在I2S治療小鼠中表面大腦皮質、尾狀核、丘腦及小腦中之細胞空泡形成廣泛減少。亦發現IT治療後白質中之細胞空泡形成減少。IT投與後，I2S明顯分佈至IKO小鼠之腦組織中。
在IKO小鼠中每週一次連續三週經IT投與I2S亦展示在光學及電子顯微鏡層面上CNS細胞空泡形成顯著減少。經IT投與I2S後，相對於未經治療之IKO小鼠細胞空泡形成明顯減少，此表明經IT投與之I2S能夠改變疾病進展。如圖92中所繪示，在經IT投與I2S後IKO小鼠之胼胝體及穹窿中的細胞空泡形成明顯減少。
另外，電子顯微鏡檢查展示灰質中之神經元中之貯積包涵體的存在減少以及白質中之少突膠質細胞中之空泡形成減少。具體而言，經IT投與I2S之IKO小鼠亦展示為某些溶酶體貯積症所特有之柵狀片層體(「斑馬體」)的減少。具體而言，圖57係電子顯微鏡掃描，其繪示相對於未經治療之IKO小鼠投與I2S之IKO小鼠之神經元中的特有斑馬體減少。類似地，圖57繪示胼胝體中之少突膠質細胞的電子顯微鏡掃描。
另外，經IT投與I2S至IKO小鼠中亦展示表面大腦皮質、尾狀核、丘腦、小腦及白質中之溶酶體疾病病理學生物標記溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)免疫染色(溶酶體活性及疾病狀態之指示)顯著減弱。如圖93A中所繪示，相對於圖93B中繪示之未經治療之IKO對照小鼠表面大腦皮質組織，經治療IKO小鼠表面大腦皮質組織中LAMP1免疫染色之顯著減弱非常明顯，反映了疾病病理學之改良。
圖56在數量上繪示及比較在μm2腦組織區域中量測之LAMP1的濃度。各個腦區之LAMP-1免疫染色的形態測定法分析證實評價之所有腦區域中之LAMP-1陽性染色均顯著減弱。如圖56中所示，在評價之每一腦組織區域(皮質、尾狀核及豆狀核殼(CP)、丘腦(TH)、小腦(CBL)及白質(WM))中，相對於未經治療之IKO對照小鼠，經治療IKO小鼠中之LAMP陽性區域減小，且接近野生型小鼠之LAMP陽性區域。尤其值得注意的是，延續治療持續時間時分析之每一腦組織區域中之LAMP陽性區域進一步減小。
異常高之溶酶體活性之降低與所有腦區域中之顯著形態改良相關。該等結果證實在經基因改造之IKO小鼠模型中經IT投與之I2S能夠改變溶酶體貯積症之進展，進一步證實經IT投與之酵素(例如I2S)能夠治療與溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)有關之CNS表現。
實例12-亨特氏症患者之治療
可利用通過(例如)IT遞送直接CNS投與來有效地治療亨特氏症患者。該實例闡釋一項多中心劑量遞增研究，其經設計以評價每隔一週(EOW)總共持續40週經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)向遲發性幼兒型亨特氏症患者投與多達3種劑量量之I2S的安全性。圖89-圖92中繪示適於人類治療之各種實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置。
招收至多20名患者：
隊列1：5名患者(最低劑量)
隊列2：5名患者(中等劑量)
隊列3：5名患者(最高劑量)
隨機選擇5名患者不進行治療。
基於以下入選標準來選擇用於該研究之患者：(1)在30月齡之前出現首發症狀；(2)篩選時能走動(界定為能夠獨自站起來及在一隻手有支撐的情況下向前走10步)；(3)篩選時存在神經病學體徵。通常，具有造血幹細胞移植病史之患者不包括在內。
測定在患有遲發性幼兒型亨特氏症之兒童中藉由IT注射投與遞增劑量之I2S達40週之安全性。另外，亦評定I2S對大肌肉運動功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。
rhASA蛋白質之IT遞送 實例13：經IT遞送之重組ASA的毒理學研究
為評定經腦脊髓膜內投與之其他重組酵素分佈至CNS細胞及組織中的能力，實施GLP研究以自毒理學及安全藥理學角度評價在幼年(小於12月齡)食蟹猴中經1個月時間重複劑量腦脊髓膜內(IT)投與以重組方式製備之人類芳基硫酸酯酶A(rhASA)。製備rhASA調配物，並調配於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 6.0)之媒劑中。
為達成此目的，如下表24中所示，將9只雄性及9只雌性幼年食蟹猴根據體重隨機分配至三個治療群組之一中。動物(劑量1之1只雄性動物除外)每隔一週接受0.6 mL之0、3或31 mg/mL rhASA短期IT輸注(總劑量為0、1.8或18.6 mg)，每只動物總共給藥三次。監測體重、臨床觀察、神經及體格檢查、臨床病理學、眼科檢查及毒理動力學取樣。在第29、30或31天(最後一次IT劑量後約24小時)，對所有動物進行屍體剖檢。收穫所選組織，保存並用顯微鏡進行檢查。
藉由ELISA分析食蟹猴之CNS組織中檢測到之rhASA的濃度，並與正常人類rhASA濃度(對應於約2.5 ng/mg組織)之10%的治療目標進行比較。自食蟹猴之不同腦區域提取組織試樣或鑽孔，並進一步分析rhASA之存在。圖133-圖138繪示提取鑽孔之組織。鑽孔之組織試樣反映rhASA之濃度增加，如圖139A-G中所反映，其中沈積梯度自大腦皮質至深層白質及深層灰質。
圖140A-B中繪示經IT及ICV投與途徑向6只猴子投與18.6 mg劑量之rhASA時使用相同鑽孔所檢測到之rhASA濃度。在經腦脊髓膜內(IT)或經大腦室內(ICV)投與rhASA之成年及幼年食蟹猴之深層白質(圖140A)及深層灰質(圖140B)腦組織中檢測到之rhASA濃度相當。
隨後分析自成年及幼年食蟹猴之腦提取之鑽孔組織試樣以測定沈積於所提取組織試樣中之rhASA的濃度，並將該等濃度與每mg蛋白質2.5 ng rhASA(對應於健康個體中之正常rhASA濃度之10%)之目標治療濃度進行比較。如圖141A中所繪示，在分析之每一組織試樣鑽孔中，經IT投與18.6mg劑量之rhASA達成之rhASA濃度超過2.5 ng/mg蛋白質之目標治療濃度。類似地，當向幼年食蟹猴經IT投與1.8 mg劑量之rhASA時，分析之每一組織試樣鑽孔展示不超過或超過2.5 ng/mg蛋白質之治療濃度的rhASA濃度，且中值rhASA濃度高於測試之所有組織鑽孔之治療目標(圖141B)。
為確定經IT投與之rhASA是否分佈至相關細胞中，對來自經IT投與1.8 mg rhASA之食蟹猴的深層白質來自圖142A中所繪示區域之組織進行分析。如圖142B所繪示，深層白質組織之免疫染色表明rhASA分佈於食蟹猴之少突膠質細胞中。類似地，圖142C繪示經IT投與之rhASA展示共定位於食蟹猴之深層白質組織中。具體而言，在染色狀態下，目標細胞器(例如溶酶體)中之共定位非常明顯(圖142C)，此支持經IT投與之rhASA能夠分佈至相關CNS細胞、組織及細胞器(包括少突膠質細胞之溶酶體)中之結論。
實例14.ICV投與對IT投與
製備經正電子發射體124I標記之rhASA，並調配於154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20(pH 6.0)之媒劑中。將等效於3 mg rhASA(對應於約38 mg/kg腦)之一定體積的調配物經由大腦室內(ICV)及腦脊髓膜內(IT)投與途徑投與至成年食蟹猴中。對食蟹猴進行高解析度PET掃描成像研究(microPET P4)以測定投與之124I標記rhASA之分佈。
PET成像數據(圖143)繪示經ICV及IT投與之124I標記rhASA均有效地分佈至CNS組織中，且特定言之，通過IT-腰椎導管投與之124I標記rhASA立即且均一地散佈於整個脊柱長度之腦脊髓液(CSF)中。具體而言，如圖143中所繪示，在ICV及IT投與後，在個體食蟹猴之CNS組織(包括腦、脊髓及CSF)中檢測到治療濃度之124I標記rhASA。該等CNS組織中且尤其腦組織中檢測到之rhASA濃度超過2.5 ng/mg蛋白質之目標治療濃度。
雖然經由IT及ICV投與途徑時rhASA蛋白質之分佈相當，但ICV使得脊柱內之沈積顯著較少，如圖143所顯示。
在投與調配物後24小時，經ICV及IT投與之124I標記rhASA均有效地分佈至CNS組織中。具體而言，在IT投與後24小時，12.4%的投與劑量位於顱區中，相比之下，16.7%的ICV投與劑量位於顱區中。因此，經IT投與rhASA時在該等CNS組織且尤其腦組織中檢測到之rhASA濃度與經ICV投與相同劑量後檢測到之濃度接近。
如圖144中所繪示，經ICV注射124I標記rhASA使得注射體積立即轉移至小腦延髓池、橋池、腳間池及脊柱近端中。同樣如圖144中所繪示，在2-5hr內，IT投與將124I標記rhASA遞送至與對於ICV投與所顯示相同之初始房室(池及脊柱近端)中。如圖145中所繪示，在ICV及IT投與後24小時，池及脊柱近端區域中之124I標記rhASA分佈相當。
該等結果證實可利用侵入性較弱之IT投與途徑將rhASA遞送至個體中且由此在目標細胞及組織中達成治療濃度。
溶酶體貯積症係由酵素缺乏或酵素有缺陷導致異常受質積聚而引起之一類遺傳病症。雖然與數種該等疾病有關之周圍症狀可藉由靜脈內投與重組酵素有效地予以減輕，但預期靜脈內投與該等重組酵素不會顯著地影響與大多數溶酶體貯積症有關之CNS表現。例如，重組人類艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(艾杜硫酶，Elaprase；Shire Human Genetic Therapies公司，Lexington，MA)已經批准用於治療亨特氏症候群之軀體症狀，但對於亨特氏症候群之神經病學表現(可包括發育遲緩及進行性精神損害)之治療目前尚無藥理學療法。此部分係由於I2S之性質，I2S係較大的分子量為約76kD之高度糖基化酵素，且在靜脈內投與後不能越過血腦障壁。
因此，本發明者已承接項目以研究重組人類酵素之腦脊髓膜內調配物之腦脊髓膜內(IT)遞送，該等重組人類酵素係例如艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)、芳基硫酸酯酶A(rhASA)及α-N-乙醯基葡萄糖胺酶(Naglu)。本文提供之結果最先證實經IT-腰椎投與重組溶酶體蛋白質可使相當大份額之所投與蛋白質遞送至腦中，且尤其使該等蛋白質廣泛沈積於食蟹猴及犬之腦及脊髓之神經元中。CNS組織之免疫組織化學分析證實該蛋白質靶向於溶酶體，溶酶體係溶酶體貯積症中之病理學糖胺聚多糖積聚位點。此外，亨特氏症候群之IKO小鼠模型、B型聖菲利波症候群之Naglu-缺陷小鼠模型以及異染性腦白質營養不良(MLD)之ASA基因敲除小鼠模型中展示之形態改良對經IT投與之酵素分佈至合適組織中且轉運至合適細胞房室及細胞器中的觀察作了補充。
觀察到經IT-腰椎及ICV投與I2S後檢測到之腦分佈模式類似，此表明CSF之總體流動(bulk flow)及有效再混合。因此，在臨床環境中，IT及ICV投與途徑均潛在可行，然而，IT投與後在脊髓中觀察到I2S沈積，此在解決溶酶體貯積症(例如亨特氏症候群)之脊髓後遺症及成份方面提供明顯優點。而且，脊髓注射座之侵入性較弱，且預期更適於長期使用，尤其在兒童個體中。
藉由上文PET成像研究觀察到之血管周細胞染色及蛋白質易位動力學證據表明，酵素在血管周間隙內移動，推測此係藉由脈動輔助之對流機制。觀察到I2S與神經絲結合(其指示主動軸突轉運)表明另一轉運機制。推測後者開始於蛋白質與神經元甘露糖-6-磷酸鹽(M6P)受體之相互作用，該等受體廣泛表現於脊髓及腦之細胞中，且在直接投與至腦實質後可能使I2S酵素容易地被目標細胞吸收。(Begley等人，Curr Pharm Des(2008) 14: 1566-1580)。
雖然活體內間接方法及活體外成像先前已暗示溶酶體酵素之軸突轉運，但本研究提供經由CSF遞送之非病毒或表現酵素之軸突轉運的最早直接證據。因此，自CSF至腦表面及深入至腦組織中之蛋白質遞送似乎依賴於主動轉移過程，沒有一種過程先前被闡述或闡明用於將蛋白質或酵素遞送至腦細胞、組織及細胞器中。
與實質間質及CSF之流動動力學會阻止經IT-腰椎投與之蛋白質分佈至腦白質中的普遍觀點相反，本研究明確證實經IT遞送溶酶體酵素使得蛋白質分佈及積聚於所有腦組織中且沈積於目標細胞之溶酶體房室(其為病理學糖胺聚多糖積聚位點)中。(參見例如Fenstermacher等人，Ann N Y Acad Sci(1988) 531:29-39；及DiChiro等人，Neurology(1976) 26:1-8.)加上IT-腰椎遞送之侵入性較弱的性質，該途徑提供將生物治療劑遞送至腦中(尤其在兒童中)之臨床相關手段。
實例15-毒理學
該實例自毒理學及安全藥理學角度闡釋經6個月時間段rhASA之重複劑量腦脊髓膜內(IT)投與。用於該研究之IT測試物質係rhASA。將36只雄性及36只雌性食蟹猴隨機分配至5個治療群組中。群組1中之動物係未經治療之植入裝置對照(座及導管)，且未給予媒劑或測試物質；然而，以與測試物質給藥時間表匹配之時間表給予該等動物0.6 mL PBS。群組2-5中之動物每隔一週(即總共給藥12次)經IT輸注接受0.6 mL 0、3、10或31 mg/mL之rhASA(總劑量為0、1.8、6.0或18.6 mg)。在6個月時(最後一次IT劑量後24小時)對動物進行屍體剖檢，且其餘4只動物/性別/群組在為期4週之恢復期結束時進行屍體剖檢。收穫所選組織，保存並用顯微鏡進行檢查。
通常，可將測試物質相關變化分成兩種主要類型，且在所有劑量量(1.8、6.0及18.6 mg/劑量)下均存在。腦脊髓膜、腦實質、脊髓實質、三叉神經節及有時候脊神經根/神經節(或該等結構周圍之神經外膜)中之浸潤增加(白血球浸潤，通常具有突出的嗜伊紅白血球成份)。將此增加解釋為由於在腦脊髓膜內間隙及神經系統組織中存在測試物質(蛋白質)。在有些動物中，脊髓及腦中之小神經膠質細胞略微病灶性增加(在任何高劑量動物中均未觀察到小神經膠質細胞增生)。將兩種類型之形態變化解釋為對存在測試物質之反應。在任何動物中均不存在神經元壞死的證據。沒有一種測試物質相關變化與腦、脊髓、脊神經根或神經節中之任何生物不良反應有關。具體而言，不存在神經元壞死或生物學上重要之神經膠質反應的證據。在非神經系統組織中不存在測試物質相關損傷。
為期1個月之恢復期(停藥期)後，測試物質相關變化已完全消退或限於與存在測試物質有關之先前增加之發炎反應的殘餘。在恢復後動物中不存在不良形態影響。基於指定半定量染色評分之盲法顯微鏡檢查，在終點屠宰時，對於所有測試物質治療群組，在腦及脊髓中之各種細胞類型(神經元除外)中，芳基硫酸酯酶A(rhASA；測試物質)之免疫組織化學染色均增強。在肝之庫弗細胞中此增強亦非常明顯。為期1個月之恢復期後，測試物質治療動物(所有劑量群組)之rhASA染色已回到對照(裝置及/或媒劑對照)程度。在一隻低劑量恢復雄性動物中，大腦皮質中存在多處星形細胞增生及神經元損失病灶，表明多個區域先前缺血。儘管該動物中該等損傷之確切發病機制尚不明確，但在任何其他測試物質治療動物(包括接受10X劑量之高劑量動物)中不存在類似損傷表明該等損傷與測試物質無關。
用於該研究之IT測試物質係rhASA。將36只雄性及36只雌性食蟹猴隨機分配至5個治療群組中。群組1中之動物係未經治療之植入裝置對照(座及導管)，且未給予媒劑或測試物質；然而，以與測試物質給藥時間表匹配之時間表給予該等動物0.6 mL PBS。群組2-5中之動物每隔一週(即總共給藥12次)經IT輸注接受0.6 mL 0、3、10或31 mg/mL之rhASA(總劑量為0、1.8、6.0或18.6 mg)。在6個月時(最後一次IT劑量後24小時)對動物進行屍體剖檢，且其餘4只動物/性別/群組在為期4週之恢復期結束時進行屍體剖檢。收穫所選組織，保存並用顯微鏡進行檢查。下表反映與該研究之病理學態樣有關之研究設計。
屠宰時，在腦模具(brain matrix)中將腦切成約3 mm厚度之冠狀薄片。將第一薄片及之後每隔一個薄片固定於福馬林中以用於組織病理學評價及免疫組織化學分析。將腦處理成全冠狀切片。該等切片最少包括以下腦區。
‧新皮質(包括額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質及枕葉皮質)：腦切片1至8(及薄片9，存在時)
‧舊皮質(嗅球及/或梨狀葉)：腦切片1至3
‧基底神經節(包括尾狀核及豆狀核殼)：腦切片3及4
‧邊緣系統(包括海馬及扣帶回)：腦切片4及5
‧丘腦/下丘腦及中腦區(包括黑質)：腦切片4及5
‧小腦、腦橋及延髓：腦切片6至8(及薄片9，存在時)。
該等腦切片以切片1至8/9(切片9係由測試機構針對一些動物提供)列示於數據表中。各動物之切片略微有變化。上文提供之腦切片(1至8/9)係各個解剖學區域之近似位置。該等腦切片以個別切片列示於數據表中，且附有與該切片有關之診斷以方便將來可能再審查載玻片(若需要)。在數據解釋期間，比較各腦解剖學位點(如上文所列示)以鑒定任何獨特的測試物質影響(即為特定腦區所特有)。在TPS，將所有動物之所有腦切片包埋於石蠟中，以5微米切片，用蘇木素及伊紅(H&E)染色並用顯微鏡檢查。另外，將對照及高劑量動物之腦用Fluoro-Jade B(此染色劑使對腦之神經元變性之評價靈敏性增強)及Bielschowsky銀染色劑染色(此程序使得能夠直接看見軸突、樹突及神經元絲)，並進行檢查。
將脊髓(頸部、胸部及腰部)切成1釐米切片。將第一薄片及之後每隔一個薄片固定於福馬林中以用於組織病理學評價及免疫組織化學分析。將所有動物之脊髓區段(頸部、胸部(包括導管尖端)及腰部)以約5微米切片，用H&E染色並進行檢查，其中在每一節段取橫切片及斜切片。將來自對照及高劑量群組之連續脊髓切片另外用Bielschowsky銀染色劑及抗GFAP(一種免疫組織化學染色劑，其使得能夠直接看見星形細胞及其突起)染色。
將背部脊神經根及神經節(在中頸部(mid-cervical)、胸正中(mid-thoracic)及中腰部(mid-lumbar)取樣)包埋於石蠟中，其中連續切片用H&E染色。另外，將來自對照及高劑量群組之連續切片用Bielschowsky銀染色劑染色。
對於所有動物之坐骨神經、脛神經及腓腸神經切片：將各神經之縱切片包埋於石蠟中，以約5微米切片並用H&E染色。將各神經之橫切片後固定於鋨中，包埋於Spurr樹脂中，以約1至2微米切片並用甲苯胺藍(toluidine blue)染色。鋨後固定及樹脂包埋可更好地保存周圍神經中之髓磷脂，且因此可更詳細地對神經進行檢查。
亦將屍體剖檢時自所有動物採集之所有組織以及收穫之肉眼損傷包埋於石蠟中，用H&E染色，並用顯微鏡檢查。藉由TPS實施組織病理學處理及評價以及免疫組織化學分析。
方法：芳基硫酸酯酶A(rhASA)染色
由研究發起者提供陽性對照載玻片。該等載玻片係注射rhASA之小鼠的肝切片。所有該等陽性對照載玻片均顯示在肝中之庫弗細胞(竇狀隙巨噬細胞)中存在rhASA之充足證據。將該等陽性對照載玻片與該研究之其他載玻片一起儲存。對rhASA染色切片之所有評價最初均在不瞭解動物治療群組下實施。藉由以下來實施此項內容：由病理學家最初觀察rhASA染色載玻片，此時標籤上之動物編號被隱藏起來(由瞭解所評價實際動物之助手隱藏)，在評價期間口述評分(嚴重程度等級)，並由同一助手立即將該染色評分(嚴重程度等級)記錄至數據表中。隨後由該研究之神經病理學家及助手核實動物ID以確保輸入數據準確。實施此程序之目的在於在判斷免疫組織化學染色劑之總染色強度以檢測細胞內rhASA時不引入任何偏見。將所有腦及脊髓切片中神經元、腦脊髓膜巨噬細胞、血管周巨噬細胞及神經膠質細胞(星形細胞及小神經膠質細胞，但可能主要為小神經膠質細胞)之相對染色程度分級。將各群組之各腦及脊髓層面上之平均嚴重程度評分加和(按群組)，並以總和記錄在標題腦(總體情況、rhASA染色)及脊髓(總體情況、rhASA染色)之組織下。
通常，腦神經元中之rhASA染色係大腦皮質及腦中其他核區域中之神經元的量度。腦脊髓膜巨噬細胞中之rhASA染色係腦脊髓膜巨噬細胞吸收測試物質及/或腦脊髓膜巨噬細胞中之內源rhASA的證據。血管周巨噬細胞之rhASA染色係腦/脊髓中之巨噬細胞吸收rhASA(或內源rhASA)之量度，但是應注意腦及脊髓中之血管周間隙(Virchow-Robins間隙)與腦脊髓膜相連。通常，神經膠質細胞中rhASA染色之等級主要係測試物質被吸收至/測試物質透入尤其大腦皮質之灰質及/或白質(放射冠係大腦皮質下方之白質)中之量度。白質中之rhASA染色似乎在星形細胞及小神經膠質細胞中。
使用以下分級方案來給各種細胞類型(神經元、神經膠質細胞、巨噬細胞)之rhASA染色程度評分。
等級解釋(佔可染色細胞之%)
1小於10%
2大於10%至25%
3大於25%至50%
4大於50%至75%
5大於75%
應注意，該方案並非嚴格定量。將其用作有效的半定量方法來評定腦及脊髓之rhASA染色程度。該研究之神經病理學家注意到，並非所有神經元區域均具有同等之rhASA染色。還注意到，在一些對照動物中存在內源神經元染色，而且即使在對照動物中脈絡叢細胞及背根神經節之神經元亦往往具有強烈rhASA染色。未給脈絡叢及背根神經節之染色分級，但該研究之神經病理學家將其記錄為突出，即使在對照動物中亦如此。
注：所有劑量群組：低劑量=1.8 mg/劑量；中等劑量=6.0 mg/劑量；高劑量=18.6 mg/劑量。除所有劑量群組(雄性及雌性；見下文)之肝中之rhASA染色增強以外，在非神經系統組織中不存在測試物質相關損傷。
終點屠宰動物(每隔一週給藥持續6個月)：rhASA染色切片
以下組織/細胞類型中之rhASA染色增強。當考慮測試物質對特定劑量群組中之特定細胞類型之rhASA染色程度的影響時，並存的媒劑對照及裝置對照(與恢復後屠宰動物一起屠宰)中之染色程度視為對照。
腦、腦脊髓膜、巨噬細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
‧腦、血管周、巨噬細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
‧腦、神經膠質細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
‧脊髓、腦脊髓膜、巨噬細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
‧脊髓、血管周、巨噬細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
‧脊髓、神經膠質細胞(中等劑量及高劑量，雄性及雌性)
‧肝、庫弗細胞(所有劑量群組，雄性及雌性)
由於存在內源染色，故腦及脊髓之神經元之ARSA染色程度最難以明確界定。rhASA染色證實腦脊髓膜及腦/脊髓血管周巨噬細胞以及神經膠質細胞中之rhASA含量始終增加。對照與測試物質治療動物之神經元rhASA染色間不存在可檢測到之差異。
恢復後屠宰動物(每隔一週給藥持續6個月，隨後為期1個月之停藥期)
通常，在屍體剖檢之前給予為期1個月之停藥期的動物中測試物質相關變化完全消退或顯著減少。存在以下顯微鏡下變化，其發生率及/或嚴重程度表明可能與測試物質有關。
與測試物質相關之顯微鏡下變化(恢復後動物)
‧腦、腦脊髓膜、浸潤(中等劑量及高劑量群組，兩種性別)(圖111及圖112)
‧腦、腦脊髓膜、浸潤、嗜伊紅白血球%(中等劑量雄性；高劑量雌性)
‧腦、血管周、浸潤(中等劑量雄性；高劑量雌性)(圖113)
‧腦、血管周、浸潤、嗜伊紅白血球%(中等劑量雄性；高劑量雌性)
‧腦、灰質、浸潤(所有劑量群組，兩種性別)
‧腦、灰質、浸潤、嗜伊紅白血球%(低劑量雄性)
‧腦、灰質、嗜伊紅白血球、壞死(低劑量雄性)
‧脊髓、腦脊髓膜、浸潤(中等劑量及高劑量雄性；低劑量及高劑量雌性)
‧脊髓、腦脊髓膜、浸潤、嗜伊紅白血球%(中等劑量雄性；低劑量雌性)
‧脊髓、灰質、浸潤(低劑量雌性)
‧脊髓、灰質、浸潤、嗜伊紅白血球%(低劑量雌性)
‧背根神經節及根、神經外膜、浸潤(中等劑量雌性)
‧脊神經根及神經節、浸潤、嗜伊紅白血球(中等劑量及高劑量雄性；所有劑量，雌性)
‧三叉神經節、浸潤、嗜伊紅白血球(中等劑量雄性及雌性)
將所有該等變化均解釋成係在終點屠宰動物中觀察到之增加之發炎變化的殘餘。與在終點屠宰動物中一樣，沒有證據表明在一些恢復後動物中仍然存在之發炎細胞浸潤增加係正造成任何不良效應之形態變化。在非神經系統組織中不存在測試物質相關損傷。
恢復後屠宰動物(每隔一週給藥持續6個月，隨後為期1個月之停藥期)：ARSA染色
與裝置及/或媒劑對照相比，在恢復雄性或雌性動物中無rhASA染色增強之證據。在低劑量、中等劑量及高劑量恢復雄性動物之腦中，與裝置及/或媒劑對照相比，實際上存在一些細胞類型之rhASA染色減弱的證據(此在各治療群組間有變化)。造成此現象之原因(包括此現象是否為實際效應)尚不明確。一種可能之解釋為投與外源rhASA可能造成內源rhASA之產生一定程度地降低。在雄性動物之脊髓中不存在類似發現。在恢復後雄性及雌性動物中，肝中之染色與在對照中所觀察到之類似。
通常，可將測試物質相關變化分成兩種主要類型，且在所有劑量量(1.8、6.0及18.6 mg/劑量)下均存在。
腦脊髓膜、腦實質、脊髓實質、三叉神經節及有時候脊神經根/神經節(或該等結構周圍之神經外膜)中之浸潤增加(白血球浸潤，通常具有突出的嗜伊紅白血球成份)。將此增加解釋為由於在腦脊髓膜內間隙及神經系統組織中存在測試物質(蛋白質)。
在有些動物中，脊髓及腦中之小神經膠質細胞略微病灶性增加(在任何高劑量動物中均未觀察到小神經膠質細胞增生)。將兩種類型之形態變化解釋為對存在測試物質之反應。在任何動物中均不存在神經元壞死的證據。對rhASA染色切片之評價截止於書寫該臨時報告時。沒有一種測試物質相關變化與腦、脊髓、脊神經根或神經節中之任何生物不良反應有關。具體而言，不存在神經元壞死或生物學上重要之神經膠質反應的證據。在非神經系統組織中不存在測試物質相關損傷。為期1個月之恢復期(停藥期)後，測試物質相關變化已完全消退或限於與存在測試物質有關之先前增加之發炎反應的殘餘。在恢復後動物中不存在不良形態影響。
基於指定半定量染色評分之盲法顯微鏡檢查，對於所有測試物質治療群組，在腦及脊髓中之各種細胞類型(神經元除外)中，芳基硫酸酯酶A(rhASA；測試物質)之免疫組織化學染色均增強。在肝之庫弗細胞中此增強亦非常明顯。為期1個月之恢復期後，測試物質治療動物(所有劑量群組)之rhASA染色已回到對照(裝置及/或媒劑對照)程度。在一隻低劑量恢復雄性動物中，大腦皮質中存在多處星形細胞增生及神經元損失病灶，表明多個區域先前缺血。儘管該動物中該等損傷之確切發病機制尚不明確，但在任何其他測試物質治療動物(包括接受10X劑量之高劑量動物)中不存在類似損傷表明該等損傷與測試物質無關。在該初步報告發佈之時，嚴格基於該研究中之肉眼及顯微鏡下發現(針對經石蠟包埋、蘇木素及伊紅染色之切片)，無可觀察到之不良效應的量(NOAEL)為18.6 mg。
實例16-藥物代謝動力學數據 6個月動物數據
該實例提供rhASA及抗rhASA血清抗體(來自Northern Biomedical Research公司)之血清及CSF濃度的解釋性分析。
該實例之目的係自毒理學及安全藥理學角度評價幼年(小於12月齡)食蟹猴中rhASA之重複劑量腦脊髓膜內(IT)投與。在6個月時間段內總共給藥12次。在最後一次給藥後24小時或1個月對動物進行屍體剖檢。研究設計顯示於表25中。
分析方法 -抗體分析
使用經驗證之方法來實施食蟹猴血清及CSF中抗rhASA抗體之定量。簡言之，分析時先封阻MSD抗生蛋白鏈菌素塗敷板，隨後與生物素標記之rhASA一起培育。洗滌步驟後，將稀釋試樣、校準物質及QC添加至板中並進行培育。再次洗滌步驟後，添加SULFO TAG標記之藥物並進行培育。實施最後的洗滌步驟，並添加MSD讀取緩衝劑(read buffer)。立即續取板。使用SOFTMax Pro模板來分析以相對發光單位(RLU)計之信號數據。
血清及CSF濃度
使用經驗證之方法來實施食蟹猴血清及CSF中rhASA之定量。該方法係基於酵素連結免疫吸附分析(ELISA)技術。簡言之，給微量滴定板塗敷上抗重組人類芳基硫酸酯酶A(rhASA)之兔多株抗體(SH040)。與rhASA參考標準物及測試試樣一起培育後，藉由結合辣根過氧化物酶(HRP)之抗ASA單株抗體(純系19-16-3)來檢測結合rhASA之蛋白質。隨後將該板與HRP之受質TMB一起培育。藉由添加2 N硫酸(H2SO4)來終止該酵素-受質反應，並在450 nm吸收波長及655 nm參考波長下量測每孔之吸光度。利用相同板中之rhASA校準曲線來計算試樣中rhASA之濃度。
表26中給出rhASA之血清濃度的概述。
表27中給出rhASA之CSF濃度的概述。
表28中給出抗rhASA血清抗體濃度之概述。
表29中給出抗rhASACSF抗體濃度之概述。
表32中給出按群組及性別劃分之抗體存在率。
食蟹猴血清中rhASA之定量極限係39.1 ng/mL，且來自群組1及2之所有血清試樣均低於定量極限(BQL)，見表26。在第2、4、6、8、10及12次給藥之前及第2、4、6、8、10及12次給藥後24小時(6個月屍體剖檢)、恢復期中間及恢復後屍體剖檢之前，測試rhASA之血清含量。在第2、4、6、8、10及12次給藥之前、第12次給藥之後、恢復期中間及恢復後屍體剖檢之前，在群組3(1.8 mg/劑量)、群組4(6.0 mg/劑量)及群組5(18.6 mg/劑量)中不能檢測到rhASA含量。在第2次給藥之後，血清中之rhASA含量與劑量相關。在第4次給藥(群組3)、第6次給藥(群組3及4)以及第8次及第10次給藥(群組3及4及群組5雄性)之後，不能檢測到rhASA含量。在第4次給藥之後在群組4(6.0 mg/劑量)中及在第4次及第6次給藥之後在群組5(18.6 mg/劑量)雄性動物中及在第4、6、8及10次給藥之後在群組5雌性動物中，rhASA之血清含量降低。血清rhASA含量之此明顯降低可能與抗rhASA抗體之濃度增加有關。給定該研究中之試樣可變性及小群組數量，rhASA之血清含量無明顯性別差異。
食蟹猴CSF中rhASA之定量極限係19.5 ng/mL，且來自群組1及2之所有CSF試樣均為BQL，見表27。在第2、4、6、8、10及12次給藥之前及第2、4、6、8、10及12次給藥之後(6個月屍體剖檢)在所有給藥群組之CSF中均可檢測到rhASA。在給藥後(在給藥後約24小時)含量較高，且與劑量相關。CSF中之含量遠遠高於血清中之含量。給定該研究中之試樣可變性及小群組數量，rhASA之CSF含量無明顯性別差異。在所有給藥群組中在恢復期中間及恢復後屍體剖檢之前不能檢測到rhASA。對於rhASA治療群組，劑量12時(屍體剖檢)採集物之CSF含量低於劑量8及11之後的含量。屍體剖檢時rhASA含量較低之可能原因包括相比於以存活期間(in-life)給藥間隔取樣(在給藥之前或之後獲取最多0.5 mL用於測定rhASA濃度)屍體剖檢時獲取之體積較大(總共約2.25 mL，用於細胞計數、化學、rhASA及抗RHASA抗體分析)。另外，一些動物在屍體剖檢時導管未開放，且經由CM分接頭(tap)而非經由導管來獲取試樣。與經由導管取樣相比，該途徑始終得到較低之rhASA濃度。此可能係由於首尾方向之CSF總體流動有限，此現象公認地在諸如猴子及人類等豎直站立動物中存在(例如，熟習此項技術者已熟知，CSF之組成成份在整個個體壽命期間呈現明顯首尾梯度)。
在某一時間點在用RHASA治療之每一動物之血清中檢測到抗rhASA抗體，見表28。若抗rhASA抗體之含量高於定量極限(78.1 ng/mL)，則將動物界定為呈抗rhASA抗體陽性。在血清轉化後，動物仍然呈抗rhASA抗體陽性。在第2次給藥之前時間點，沒有動物呈抗rhASA抗體陽性。除編號為026之雄性動物(群組4；6.0 mg/劑量)外，所有rhASA動物在第4次給藥之前時間點均呈血清抗rhASA抗體陽性。編號為026之雄性動物在第6次給藥之前時間點呈血清抗體陽性。在群組5(18.6 mg/kg)中，屍體剖檢抗體試樣具有較低之抗體含量。此明顯降低可能係由於存在干擾分析之rhASA。中等劑量及高劑量群組(6.0及18.6 mg/劑量)中之效價通常高於低劑量動物(1.8 mg/劑量)。存在抗rhASA抗體係使用重組人類蛋白質治療食蟹猴之預期結果i。給定該等結果之可變性，不存在明顯性別差異。
在CSF中可檢測到抗rhASA抗體之所有動物在血清中亦可檢測到rhASA抗體，編號為049(群組3；1.8 mg/劑量)及057(群組4；6.0 mg/劑量)之雌性動物除外。抗體濃度及存在率之可變性使得不能測定劑量反應。若抗rhASA抗體之含量高於定量極限(78.1 ng/mL)，則將動物界定為呈抗RHASA抗體陽性。
血清及CSF RHASA及抗RHASA抗體含量之雄性及雌性組合值顯示於表30及表31中。組合雄性及雌性結果與上文討論之個別性別類似。
實例17-功效
在該實例中，將11只野生型對照(mASA +/+ hASA -/-)小鼠分配至群組A中且未接受治療。將三十四(34)只hASAC69S/ASA -/-小鼠分配至5個劑量群組中之每一群組中，且在第1、9、15/16及22天接受媒劑(群組B)或20 mg/kg(靜脈內[IV]；群組C)或0.04、0.12及0.21 mg(分別為群組D、E及F)劑量之rhASA。所有IV劑量均經由尾部靜脈投與。所有腦脊髓膜內(IT)劑量均以輸注形式以12 μL體積以2 μL/20秒之大致範圍投與(表33)。
ASA基因敲除小鼠hASAC69S/ASA(-/-)係公認的MLD模型，且已用於測試適於該疾病之潛在治療。腦脊髓膜內途徑係人類之擬定投與途徑。已在MLD小鼠中針對該化合物及類似化合物對靜脈內投與途徑進行測試。增加靜脈內對照群組作為預期在周圍器官中出現之組織學變化之陽性對照。動物接受100、300或520 mg/kg腦重量(分別為0.04、0.12、0.21 mg)之rhASA。選擇用於該研究之正規化至腦重量之劑量量對應於計劃在人類中使用或已在毒理學研究中或在先前溶酶體貯積症功效模型中使用之劑量。預期該等劑量不會具有任何毒性。
接收
物種　小鼠(小家鼠(Mus　musculus))
品系　hASAC69S/ASA(-/-)小鼠及野生型對照
年齡　到達時約14-17個月
群組數量　6個
動物數量　34只ASA基因敲除小鼠+11只野生型對照
到達後，檢查每只動物以評定健康狀況。
圈養
將動物分群組圈養在帶有CareFresh紙墊料及水瓶之高溫聚碳酸酯濾蓋飼養籠中。每只籠子使用指明項目、群組及動物編號以及性別之籠卡清楚地加以標注。使用打耳號系統(ear punch system)來唯一地標識每只動物。
動物居室環境及光週期之目標條件如下：
溫度　22℃±3℃
濕度　50%±20%
光照循環　12小時光及12小時暗
將獲得之所有野生型動物(11只)分配至群組A中，且編號為35至45。在適應環境期間，在將ASA(-/-)hASA(+/-)動物自籠子中取出時分配以連續編號(1至34)，稱重並打耳號。隨後在2011年1月3日使用Research Randomizer(www.randomizer.org)將動物分配至治療群組中。前9個編號分配至群組B，接下來的5個分配至群組C，接下來的5個分配至群組D，接下來的5個分配至群組E，且最後10個分配至群組F。如下對動物進行分配：
測試物質及媒劑 測試物質
身份　rhASA
說明　人類重組芳基硫酸酯酶A(ARSA)
儲存條件　約4℃
媒劑
身份　rhASA媒劑(154 mM　NaCl、0.005%聚山梨醇酯20，pH約為6.0)
儲存條件　約4℃
媒劑之製備
按提供狀態使用媒劑。在實驗台(bench top)上使媒劑升溫(環境溫度)。媒劑升溫後，藉由輕輕旋動及顛倒使物質混合。未使瓶子形成渦流或予以振盪。在獲取物質之前使瓶子乾燥。將任何剩餘媒劑返回到冰箱(1℃-8℃)中。
劑量調配物之製備
將rhASA用媒劑稀釋以達到需要的濃度。在實驗臺上使測試物質升溫(環境溫度)。測試物質升溫後，藉由輕輕旋動及顛倒使物質混合。未使瓶子形成渦流或予以振盪。
注射液示蹤染料：
使用紅外染料(例如IRDye,LI-COR Biosciences,Lincoln,NE)來示蹤注射液。已在腦脊髓膜內注射中使用諸如該染料等染料作為腦脊髓膜內投與後之存活程序(survival procedure)。在投與之前將染料與測試物質混合；將1 μL 1奈莫耳染料添加至測試物質中。除紅外染料外，還使用1 μL FD&C藍色1號(0.25%)來示蹤注射液。該藍色染料係常見之食物添加劑，且通常認為安全無毒性。
rhASA或媒劑之腰骶部IT注射
群組B、D、E及F中之動物在第1、9、15或16及22天接受腦脊髓膜內注射。
使用1.25% 2,2,2三溴乙醇(Avertin)以200-300 μL/10克體重(250-350 mg/kg)藉由腹膜內注射使成年小鼠麻醉。使用剪刀除去介於尾巴底部與肩胛骨之間的背部毛髮。利用帕維酮/聚維酮碘隨後異丙醇擦洗來清洗剃毛區域。在腰骶部脊柱上作一個中線皮膚小切口(1-2 cm)，並確定背部中線與回腸(複數形式ilea，單數形式ileum)翼狀物之頭側的交點。髂窩中之肌肉(臀中肌)係呈心臟形狀之肌肉。「心臟」頂部兩側接近回腸翼狀物位置。插入附接至氣密性10-20 μL玻璃Hamilton注射器之32號針，直至感覺到來自下方骨骼之阻力。以約2 μL/20秒(12 μL/2分鐘)之速率注射10 μL測試物質、1 μL紅外染料及1 μL FD&C藍色#1(總注射體積為12 μL)。使用創傷夾來閉合皮膚切口。藉由成像以確定紅外染料以及可見藍色染料是否分佈遍及CNS來判斷注射是否成功。成像後，使動物在恢復室中恢復。
rhASA之靜脈內注射
群組C中之動物在第1、9、15及22天接受靜脈內注射。
IV注射時，使用異氟醚將動物麻醉(若需要)，並放置於保定器(restrainer)中。藉由用手指輕輕拍打尾部使其升溫來使尾部靜脈擴張。隨後使用70%乙醇擦拭注射位點。或者，將動物放置於暖室(40℃)中待1-1.5分鐘。使用28至30號針來注射測試物質。注射體積為5-10 mL/kg。
在第四次給藥後約24小時，將群組B-F中之動物無痛致死。如下文所詳述對動物實施不同的組織採集程序。群組A中之動物未進行治療；然而，在2011年1月27日或28日將其無痛致死，並如下文所詳述實施組織採集程序。
血清(所有動物)
經由在異氟醚麻醉下眶後穿刺自所有動物(群組A-F)採集終末血液試樣(約0.5 mL)。將玻璃管放置於眼眶中，輕輕穿透眼睛後面之區域且由此破壞位於眼睛後面之靜脈引流。藉由毛細管作用及/或重力流動來採集血液。採集血液後，向眼眶施壓以終止出血。
將全血試樣處理成血清並在低於-80℃下冷凍。將血清儲存於-80℃下並針對抗體進行分析。
用於光學顯微鏡檢查研究之組織(群組A-F；每個群組5只小鼠)
採集血液後，經由CO2窒息將動物無痛致死。在灌注及冷凍之前，採集自尾巴剪下的片段以用於可能的基因分型。暴露圍心腔。用冰冷冷藏之肝素化鹽水溶液(1 U/mL肝素鈉存於0.9% NaCl中，無菌過濾)且隨後用約4℃之4%低聚甲醛穿心灌注每個群組之三隻(3)小鼠。取出腦，並將腹部切開以進一步暴露內臟。除自尾巴剪下的片段予以冷凍外，將腦及屠體放置於低聚甲醛中。
用於脂質分析之組織(群組A、B及F；分別為6只、4只及5只動物)
採集血液後，經由CO2窒息將動物無痛致死。在灌注及冷凍之前，採集自尾巴剪下的片段以用於可能的基因分型。暴露圍心腔。脂質分析時，用冰冷冷藏之肝素化鹽水溶液(1 U/mL肝素鈉存於0.9% NaCl中，無菌過濾)穿心灌注每個群組之4至6只小鼠。
採集後，將組織稱重並隨後冷凍(在乾冰上或藉由放置於-80℃冷凍器中)。將腦分成左半球及右半球。右半球用於藉由MS實施脂質分析。針對可能的N-乙醯基-L-天冬胺酸鹽(NAA)分析對左半球進行分析。將組織儲存於-80℃下直至分析。
rhASA使MLD小鼠脊髓中(尤其白質中)之髓硫酯貯積減少(圖114)。脊髓之形態測定法分析證實給予rhASA後艾爾遜藍(alcian blue)染色之光密度統計學顯著降低(圖115)。rhASA治療之MLD小鼠之腦中亦呈現降低之溶酶體活性(圖116)。與媒劑治療動物相比，在高劑量群組(0.21 mg-520 mg/kg腦重量)中，此降低在統計學上係顯著的(圖117)。
大於1週歲之免疫耐受性MLD小鼠(hASAC69S/ASA(-/-))接受rhASA之腦脊髓膜內-腰椎投與，每週一次，持續4週(總共給藥4次)。劑量係媒劑(154 mM NaCl、0.005%聚山梨醇酯20，pH約為6.0)、0.04、0.12、0.21 mg/劑量(正規化劑量分別為100、300及520 mg/kg腦重量)。在終末時間點，藉由對腦及脊髓內之髓硫酯清除率以及溶酶體活性實施免疫組織化學評定來評價功效。使用靶向組織中之髓硫酯的艾爾遜藍染色劑將脊髓及腦切片染色。亦針對溶酶體相關膜蛋白(LAMP)之存在(溶酶體過程之指示)將腦切片染色。另外，對脊髓(頸部、胸部及腰部)及腦之艾爾遜藍及LAMP染色切片實施形態測定法分析。
該等初步結果證實rhASA之腦脊髓膜內腰椎投與的功效。與媒劑對照小鼠相比，rhASA治療之MLD小鼠呈現疾病組織學標記改良之證據，例如腦中之髓硫酯貯積減少(藉由艾爾遜藍染色觀察到)以及溶酶體活性降低。在投與位點(脊髓之腰區)附近、在遠端脊髓中以及在腦之遠端部分中觀察到該等組織病理學變化。
實例18-生物分佈2 概述
在該研究中，將36只雄性及36只雌性幼年食蟹猴(開始時小於12個月)分配至5個劑量群組中之每一群組中，並每隔一週以0(裝置對照；給予動物0.6 mL PBS)、0(媒劑對照)、1.8、6.0或18.6 mg(分別為群組1、2、3、4及5)劑量接受rhASA，持續6個月，總共給藥12次。所有劑量均以輸注形式以0.6 mL體積投與，隨後經約10分鐘用0.5 mL PBS沖洗(表37)。
材料及方法 組織採集
在腦模具中將腦切成3 mm厚度之冠狀薄片。將各腦切成全冠狀薄片，包括：新皮質(包括額葉皮質、頂葉皮質、顳葉皮質及枕葉皮質)；舊皮質(嗅球及/或梨狀葉)；基底神經節(包括尾狀核及豆狀核殼)；邊緣系統(包括海馬及扣帶回)；丘腦/下丘腦、中腦區(包括黑質)；小腦、腦橋及延髓。獲得各組織試樣(經由4 mm活檢鑽孔器)之位置顯示於圖133-138中。圖 133-138中之影像係自University of Wisconsin and Michigan State Comparative Mammalian Brain Collections(亦稱為National Museum of Health and Medicine)獲得。鑽孔編號22未採集，因為該結構在屍體剖檢期間不存在。在利用酵素連結免疫吸附分析實施rhASA分析之前，將所有腦試樣冷凍並儲存於-60℃或更低溫度下。
將第一腦薄片及之後每隔一個薄片固定於福馬林中以用於組織病理學評價及免疫組織化學分析。將第二腦薄片及之後每隔一個薄片冷凍以用於測試物質濃度分析。在冷凍之前，自偶數編號之測試物質分析腦薄片之右側部分取腦試樣以用於生物分佈分析。屍體剖檢時給腦試樣之位置拍照，並記錄腦薄片編號。使用4 mm圓形鑽孔器或解剖刀切割來獲得該等試樣以使所採集白質的量最佳化。將所有鑽孔冷凍並儲存於-60℃或更低溫度下以用於測試物質分析。將其餘腦薄片冷凍並儲存於-60℃或更低溫度下以用於可能的測試物質分析。
將脊髓(頸部、胸部及腰部)切成1釐米切片。將第一薄片及此後每隔一個薄片固定於福馬林中以用於組織病理學及免疫組織化學分析。將第二脊髓薄片及之後每隔一個薄片冷凍並儲存於-60℃或更低溫度下以用於測試物質分析。調整薄片之分佈以將含有腦脊髓膜內導管之尖端之薄片(薄片0)固定在福馬林中並進行組織病理學分析。
腦、肝及脊髓提取物之製備以及rhASA濃度之測定
腦鑽孔、脊髓及肝試樣係利用符合美國食品與藥品管理局(United States Food and Drug Administration)(FDA)良好實驗室規範(Good Laboratory Practice)(GLP)條例21 CFR(第58部分)及可適用的中西部生物研究標準操作程序之經驗證方法來進行分析。將組織試樣在裂解緩衝劑中均質化，離心以除去任何組織碎片，並儲存於-80℃下直至進行分析。勻漿之可溶性部分中的rhASA濃度係使用多株兔抗體SH040作為俘獲抗體及結合HRP(辣根過氧化物酶)之抗ASA單株抗體19-16-3作為檢測抗體藉由ELISA來測定。在洗滌步驟以除去未結合之物質後，四甲基聯苯胺(TMB)受質溶液在結合HRP之抗體存在下與過氧化物反應而產生與初始步驟中由抗ASA抗體結合之rhASA的量成比例之比色信號。自標準曲線內推各組織勻漿中所得rhASA的量。
亦藉由二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定分析來分析試樣以獲得試樣中蛋白質之濃度。各試樣之蛋白質濃度係藉由內推白蛋白標準曲線來測定。隨後將rhASA濃度結果正規化成組織提取物中之總蛋白質，如藉由二喹啉甲酸分析所測定。
對於媒劑、1.8 mg/劑量、6.0 mg/劑量及18.6 mg/劑量群組而言，所有鑽孔之rhASA含量分別顯示於圖118、圖119、圖120及圖121中。對於裝置對照、媒劑、1.8 mg/劑量、6.0 mg/劑量及18.6 mg/劑量群組而言，恢復後動物之所有鑽孔之rhASA含量分別顯示於圖122、圖123、圖124、圖125及圖126中。
在腦表面(腦脊髓膜)附近獲得之所選鑽孔之rhASA含量顯示於圖127中。認為所含物質大部分為深層腦白質之所選鑽孔之rhASA含量顯示於圖128中。白質係由有髓鞘神經細胞突起(或軸突)之纖維束構成。所含物質大部分來自深層腦灰質之所選鑽孔顯示於圖129中。與白質相比，灰質含有神經細胞體。對於各劑量群組，來自表面、深層白質及深層灰質之所選鑽孔之rhASA值顯示於圖130中。
脊髓濃度數據顯示於圖131中。
肝濃度數據顯示於圖132中。
在一些情形下，裝置對照群組及給予媒劑之對照群組之肝、脊髓及腦中之rhASA濃度值可以量測。肝及脊髓中之含量低於任一rhASA治療群組。在裝置對照及給予媒劑之動物中量測之rhASA含量體現用於ELISA之抗rhASA抗體與天然食蟹猴蛋白質間之交叉反應性。裝置對照及媒劑組織中之報告值不代表組織中食蟹猴rhASA之定量值，此乃因抗體與食蟹猴ASA間之交叉反應性程度未知以及分析標準物使用rhASA之事實。然而，不同組織及解剖學區域中食蟹猴rhASA之相對量展示可變性可以解釋裝置對照與給予媒劑之組織中檢測到之rhASA含量的變化。
對於1.8、6.0及18.6 mg/劑量群組，脊髓薄片中之rhASA含量分別介於160-2352、1081-6607及1893-9252 ng/mg蛋白質(雄性)以及0-3151、669-6637及1404-16424 ng/mg蛋白質(雌性)範圍內(圖127)。腰區脊柱中之rhASA含量高於頸區。在rhASA治療群組中，在肝中檢測到之rhASA蛋白質的含量具有劑量反應性，且在媒劑群組中此含量非常低。對於1.8、6.0及18.6 mg/劑量群組，平均rhASA含量分別為88、674及2424(雄性)以及140、462及1996 ng/mg蛋白質(雌性)(圖128)。
總之，自給予rhASA之群組之脊髓薄片及肝製備的試樣中之rhASA含量似乎與劑量相關。所測試腦區中之許多腦區展示rhASA含量與rhASA投與間之明確的劑量關係，而其他腦區較不確定。通常，腦中之rhASA含量隨rhASA劑量增加而增加。
實例19：經IT與IV投與之rhASA的藥物代謝動力學(PK)及生物分佈
本研究之目的係評價在腦脊髓膜內(IT)及靜脈內(IV)投與至食蟹猴後各種治療性替代酵素之藥物代謝動力學(PK)及生物分佈。
在該研究中，將帶有腦脊髓膜內-腰椎(IT-L)導管之總共12只雄性及12只雌性食蟹猴按體重隨機分配至四個治療群組中以用於1a期(I2S投與)及1b期(rhASA投與)研究。
對於該兩期研究，在給藥後以指定間隔採集血液及CSF(自IT-CM導管採集)。在自1a期採集最後試樣後，在開始1b期之前允許動物有7天的清除期。
在自1b期採集最後試樣後，在開始2期之前允許動物有7天的清除期。將來自1b期之總共12只雄性及12只雌性食蟹猴按體重隨機分配至12個治療群組中：I2S(群組1a-6a)及rhASA(群組1b-6b)。
IT-L投與後血清中rhASA之絕對生物利用度為約30-40%。相比之下，在CSF中僅0.5%之IV劑量可被生物利用。
IT-L投與後，血清中rhASA之暴露量以超比例方式增加。
IT-L投與後，CSF中rhASA之暴露量以低於比例之方式隨劑量增加而增加。
IT-L投與後血清中rhASA之生物利用度為約30-40%。相比之下，在CSF中僅0.5%的藉由IV途徑投與之劑量可被生物利用。
實例20-MLD患者之治療
可利用通過(例如)IT遞送直接CNS投與來有效地治療MLD患者。該實例闡釋一項多中心劑量遞增研究，其經設計以評價每隔一週(EOW)總共持續40週經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)向遲發性幼兒型MLD患者投與多達3種劑量量之rhASA的安全性。圖94、圖95、圖96及圖97中繪示適於人類治療之各種實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置。
招收至多20名患者：
隊列1：5名患者(最低劑量)
隊列2：5名患者(中等劑量)
隊列3：5名患者(最高劑量)
隨機選擇5名患者不進行治療。
基於以下入選標準來選擇用於該研究之患者：(1)在30月齡之前出現首發症狀；(2)篩選時能走動(界定為能夠獨自站起來及在一隻手有支撐的情況下向前走10步)；(3)篩選時存在神經病學體徵。通常，具有造血幹細胞移植病史之患者不包括在內。
測定在患有遲發性幼兒型MLD之兒童中藉由IT注射投與遞增劑量之rhASA達40週之安全性。另外，亦評定rhASA對大肌肉運動功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。
IT遞送HNS之實例 實例21：乙醯肝素N-硫酸酯酶之長期腦脊髓膜內投與
此實例顯示，可使用腦脊髓膜內投與來將溶酶體酵素(例如重組人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(rhHNS))有效遞送至腦組織中，以治療黏多糖貯積症IIIA(MPS IIIA；A型聖菲利波症候群)之神經症狀，即該病症之定義性臨床特徵。此實例中所述之實驗顯示，長期IT投與rhHNS具有良好耐受，且在腦、脊髓及肝中可檢測到劑量相關酵素活性。
總之，已研發出重組人類乙醯肝素N-硫酸酯酶(HNS)之腦脊髓膜內(IT)調配物用於治療黏多糖貯積症IIIA(MPS IIIA；A型聖菲利波症候群)之神經症狀，即該病症之定義性臨床特徵。由於MPS IIIA患者之平均年齡係4.5歲，故對HNS之關鍵毒理學研究是在幼年食蟹猴中進行，以評價對發育中腦之效應。將腦脊髓膜內(IT)-腰椎藥物遞送裝置植入猴子且每隔一週藉由短期輸注給藥(1.5、4.5或8.3 mg/劑量HNS，持續6個月；12次劑量)，其中裝置及媒劑對照分別接受磷酸鹽緩衝鹽水或媒劑。在第3及6個月對每群組8個動物(4只/性別)進行屍體剖檢(在第3個月進行裝置-對照群組屍體剖檢)，且在最終IT劑量後1個月對8只媒劑群組動物及3只HNS給藥群組動物進行屍體剖檢。未觀察到HNS相關臨床體徵或肉眼中樞神經系統損傷。與對照相比，在腦/脊髓周圍之腦脊髓膜/神經束膜中存在平均嚴重程度為輕度至最低度之細胞浸潤，此與腦脊髓液(CSF)白血球(主要係嗜伊紅白血球)之短暫增加有關，其在最終劑量後1個月時基本消退。該等變化與腦或脊髓之任何不良形態變化無關。在腦、脊髓及肝中似乎存在趨向較高平均CSF HNS含量之劑量相關性趨勢，且組織中之HNS活性程度似乎存在劑量相關性趨勢。無可觀察到之不良效應的量係每隔一週給予8.3 mg/劑量，即所投與之最高劑量，從而表明可以不同濃度(包括高於8.3 mg/劑量之濃度)安全地腦脊髓膜內投與HNS。
A型聖菲利波症候群
黏多糖貯積症型IIIA(MPS IIIA；A型聖菲利波症候群)係罕見的溶酶體貯積症，其影響世界人口之約十萬分之一，其係由於不存在乙醯肝素N-硫酸酯酶(HNS)或該酵素之功能缺陷所致(Neufeld EF等人，The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(2001)，第3421-3452頁)，該酵素係硫酸乙醯肝素糖胺聚多糖(GAG)之溶酶體分解代謝中涉及之外硫酸酯酶。在不存在此酵素時，硫酸乙醯肝素GAG在神經元及神經膠質細胞之溶酶體中積聚，且在腦外積聚較少。此病症之定義性臨床特徵係中樞神經系統(CNS)變性，其導致損失或不能達成主要的發育里程碑。進行性認知衰退在癡呆及早死中達到極點。
rhHNS之IT遞送
由於MPSIIIA患者之平均年齡係4.5歲，故對HNS之關鍵毒理學研究係在幼年食蟹猴(基於與人類之遺傳及解剖相似性來選擇物種)中進行，以評價對發育中腦之效應。文獻中所引用之猴子與人類之年齡等價性介於以下範圍內：7.6個月至12.1個月對應於30至40個月齡之兒童(Hood RD,Developmental and Reproductive Toxicology: A practical approach(2006)，第276頁)。作為此努力之一部分，在幼年食蟹猴中進行6個月之毒理學研究以評價HNS之IT腰椎投與。根據先前之1個月的幼年食蟹猴毒性研究中獲得之數據來指導6個月之重複劑量幼猴研究之劑量量選擇及設計。據吾人所知，此係涉及在幼年非人靈長類動物中長期IT投與ERT之首次研究。
在此研究中使用56只雄性及56只雌性幼年食蟹猴(長尾獼猴(Macaca fascicularis))，其係約6至9個月齡且重0.82至1.81 kg。每天餵給猴子15塊經PMI鑒定的靈長類動物飼料5048(Richmond,IN)。水可經由過濾自動水系統隨意獲得且在尿液採集期間不給水。在猴子到達後，將猴子在不銹鋼籠中分組圈養(每籠兩隻)2至4週，但將3個月齡之猴子單獨圈養在不銹鋼籠中。在研究期間，將所有猴子圈養在溫度及濕度受控且具有12小時光及12小時暗之循環之室內的單獨不銹鋼籠中。
在研究開始前，為所有猴子手術植入SC座及IT導管。在手術前投與潑尼松龍琥珀酸鈉(Prednisolone sodium succinate)(IV，30 mg/kg)及氟尼辛葡甲胺(flunixin meglumine)(肌內[IM]，2 mg/kg)。用SC硫酸阿托品(atropine sulfate)(0.04 mg/kg)對猴子進行預處理，用IM氯胺酮HCl(ketamine HCl)(8 mg/kg)鎮靜，插管，且維持在約1 L/min之氧及2.0%異氟醚下。在腰椎(L4、L5或L6)之背突上進行切口並實施半椎板切除術以在L3、L4或L5處插入錐形聚胺基甲酸酯導管(長25 cm，0.9 mm外徑x 0.5 mm內徑，具有6個直徑0.33 mm之側孔)。經由小硬膜切口插入導管且向前進入約10 cm到達胸腰連接區域。將鈦SC座附接至IT導管並植入SC組織中。使用Isovue-300(0.8 ml；Bracco Diagnostics公司，Princeton,NJ)藉由脊髓攝影檢查來確認導管之適當放置。在自手術恢復後，猴子接受酒石酸丁啡喃(butorphanol tartrate)(IM,0.05 mg/kg)及頭孢噻呋鈉(ceftiofur sodium)(IM,5.0 mg/kg，每天兩次，2天)。
在此實例中，在包括5 mM磷酸鈉、145 mM氯化鈉及0.005%聚山梨醇酯20(pH 7.0)之IT調配物媒劑中提供HNS。以短期輸注形式經約11分鐘投與HNS之EOW劑量：0.6 mL(4分鐘)，之後用0.5 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗(7分鐘)。媒劑對照群組之猴子僅接受IT調配物；DC猴子IT接受PBS(pH 7.2)。
發病率及死亡率
未發生HNS相關死亡或提前屠宰。在給藥時或在每天的觀察期間未觀察到HNS相關臨床體徵。在給藥期間及給藥後觀察到之錯位、瘙癢、震顫及共濟失調在數分鐘至約4小時之投與內消退，且可將其視為體積相關性反應而非對HNS或媒劑之反應。在給藥期間觀察到及在給藥後立即觀察到之臨床體徵在對照群組(給予DC及/或給予媒劑之群組)中亦可以相當發生率觀察到；無證據顯示劑量反應。通常，在給藥時，臨床體徵隨每一後續劑量而降低。體重、攝食量以及身體及神經發現無HNS相關變化，或ECG或眼科檢查無變化。
臨床病理學
在任一間隔中，血液學、血清化學、凝結物或尿液分析參數皆無視為與HNS相關之變化。
CSF細胞計數及化學
在給藥後24小時，所有群組(包括DC及0 mg/劑量群組)之平均CSF白血球計數皆出現劑量相關性增加。投與每一劑量時白血球計數皆普遍增加。在給藥前自約一半之猴子採集之CSF顯示，該等效應在前一劑量後2週內減輕。在第5次給藥後，除了白血球增加以外，觀察到在4.5及8.3 mg/劑量群組中，給予HNS之雄性動物相對於給藥前平均值(相對於DC及0 mg/劑量群組，P0.05)具有較高群組平均CSF總蛋白及白蛋白(最高4至5倍)；在給予HNS之雌性動物群組中，趨勢顯然較弱。
HNS濃度及抗體分析
通常，所有測試群組在所有時間點之血清平均HNS含量皆小於檢測極限(LOD)。在給予DC及給予媒劑之對照群組中，猴子CSF中之HNS濃度一般低於定量極限(LOQ)。儘管未實施統計學分析，但在1.5、4.5及8.3 mg/劑量群組中似乎存在趨向較高平均CSF HNS含量之劑量相關性趨勢。給藥前CSF平均HNS含量顯著低於給藥後CSF含量。在研究結束時(主要及恢復後屍體剖檢)，6個月隊列(兩種性別)之平均HNS濃度概述於表42中。在給定劑量量下，不論抗HNS抗體在血清及CSF中之含量如何(其在整個研究期間持續升高)，HNS在CSF中之平均濃度似乎維持在相同範圍內(圖146A)。
在6個月/恢復後隊列中，在裝置對照群組(僅PBS)或彼等給予媒劑之群組中，在所測試任一時間點，所有猴子皆未在血清或CSF中產生抗HNS抗體。在1.5、4.5及8.3 mg/劑量群組中，在研究前(CSF)及在第2次給藥之前所採集之血清及CSF試樣中，所有猴子之抗HNS抗體皆測試為陰性(<LOD)。截止到研究結束時，所有猴子之血清中抗HNS抗體皆測試為陽性。
在一或多個時間點，1.5 mg/劑量及8.3 mg/劑量群組中之所有猴子及4.5 mg/劑量群組8只猴子中6只猴子之CSF抗HNS抗體測試為陽性。由於4.5 mg群組中有兩隻猴子在任一時間點(包括屍體剖檢)皆未採集試樣，故該等結果似乎可表明，所有給予HNS之猴子皆產生抗體反應。
在所有三種劑量量下，在第2次給藥後檢測血清中之抗HNS抗體濃度，且含量在第4次給藥後顯著增加。儘管未實施統計學分析，但似乎存在趨向較高血清抗體濃度之劑量相關性趨勢；截止到研究結束時，在3個HNS給藥群組中之含量相當(圖146B)。在此研究之時程期間，血清中之抗HNS抗體含量始終高於CSF(血清/CSF抗體濃度為9至236倍)；在8.3 mg劑量量下，在較早給藥過程中(6及10週)，觀察到血清對CSF濃度之最高比率(98及236倍)。
在給藥早期(第6週至第14週)，在1.5 mg、4.5 mg及8.3 mg/劑量量下，血清中之抗HNS抗體濃度分別增加9倍、16倍及16倍。在相同時期中，在1.5 mg、4.5 mg及8.3 mg/劑量量下，CSF抗體濃度分別增加30倍、41倍及52倍(圖146B)；在1個月之無給藥恢復期後，仍有大量抗體存留(表43)。
抗HNS抗體在CSF中之出現晚於血清(圖146C)。未觀察到血清或CSF中之抗體濃度存在表觀劑量相關性差異(由於樣本數較小，未實施統計學分析)；在雄性與雌性之間，抗體反應無可觀察到之差異。
在CSF中之抗HNS抗體存在下，HNS在CSF中之平均濃度似乎維持不變，從而表明抗HNS抗體在血清及CSF中之存在不改變IT給予之HNS之濃度量。對6個月重複劑量投與HNS之6個月/恢復後隊列分析表明，3個月之中間隊列與6個月屠宰之猴子隊列之抗HNS抗體濃度相當(圖146C)。
肉眼及組織病理學發現
在所有劑量量下(雖然並非在所有屠宰間隔中，無性別特異性，且並非以劑量相關方式)，在腦實質(主要係灰質)、脊髓(灰質及白質)、背部脊神經根/神經節及三叉神經節(僅中等劑量的雄性動物)(圖147B-D)中皆存在嗜伊紅白血球浸潤(圖147A)。該等浸潤可解釋為繼發於腦脊髓膜/神經束膜浸潤及/或組織實質內HNS之存在(滲透)之浸潤。儘管出現多種發炎型變化，但猴子似乎可耐受HNS之投與且認為該等浸潤皆無關於或皆不引起神經系統實質中之不良形態變化。具體而言，無神經元壞死/變性之證據且無與HNS投與相關之神經膠質反應。
腦及脊髓灰質中之小神經膠質細胞增生與細胞浸潤(主要係嗜伊紅白血球浸潤)有關，其在先前實施之1個月幼猴毒性研究中相對常見；該等變化在6個月研究中截止到3個月中間屠宰時相對少見，但在6個月隊列中仍可觀察到此一反應之殘餘證據(圖147F)。在對一些(通常以蛋白質為主)中樞性投與(或中樞反應性)測試物質之反應中，小神經膠質細胞反應往往係相對較早之事件。在給予HNS之猴子中，嗜伊紅白血球浸潤與嗜伊紅白血球數量在CSF中之增加有關，但該等細胞所存在之數量不足以引發不良反應。
在大多數給予HNS之群組中(與性別無關)，在所有劑量量下，皆在背部脊神經根/神經節中觀察到嗜伊紅白血球浸潤。該等在不同神經系統組織中之浸潤可解釋為繼發於腦脊髓膜/神經束膜浸潤及/或組織實質內HNS之存在(滲透)之浸潤。在恢復後屠宰猴子中，HNS相關效應通常不存在或降低至對照程度。在恢復期後，一些變化(例如脊髓中之小神經膠質細胞增生)完全消退。似乎HNS相關變化皆與腦或脊髓中之任何不良結構性顯微鏡下變化無關。在腦、脊髓或神經節中未觀察到神經元壞死。
HNS酵素活性
在6個月/恢復後隊列中，給予媒劑之群組的脊髓及腦中之HNS酵素活性(0.0-0.154 nmol/hr/mg蛋白質)類似於3個月之中間隊列之組織中所示活性程度(0.0-0.0.154 nmol/hr/mg蛋白質)。脊柱中之酵素活性程度高於在腦或肝中所量測之程度(在腰椎中高約一個數量級)，4.5 mg及8.3 mg/劑量群組具有類似活性程度。對於1.5、4.5及8.3 mg/劑量群組，脊髓薄片中之HNS酵素活性分別在以下範圍內：3.9-18.6、13.1-67.1及3.6-69.2 nmol/hr/mg蛋白質(雄性，圖148A)，以及1.8-16.2、4.5-61.2及21.1-66.0 nmol/hr/mg蛋白質(雌性，圖148B)。在脊髓組織中，在1個月之恢復期後，酵素活性程度回到與媒劑對照值一致之程度。
對於1.5、4.5及8.3 mg/劑量群組，腦薄片中之HNS酵素活性分別在以下範圍內：0.03-16.0、0.30-55.7及0.15-21.2 nmol/hr/mg蛋白質(雄性，圖148C)，以及0.04-5.1、0.0-14.4及0.9-33.2 nmol/hr/mg蛋白質(雌性，圖148D)。在腦組織中，在恢復後，酵素活性程度回到與對照值一致之程度。
不同腦區域中之活性相對於內源性程度(DC群組)之倍數變化展示於圖149A中。儘管在表面試樣中觀察到趨向增加分佈之趨勢，但顯示腰椎-IT投與之HNS可滲透至腦之腦室周圍區域。
對於1.5、4.5及8.3 mg/劑量群組，在6個月隊列/恢復後隊列中，肝中之平均活性程度分別為0.50、2.41及6.65 nmol/hr/mg蛋白質(雄性)以及1.04、4.15及7.62 nmol/hr/mg蛋白質(雌性)(圖149B)。媒劑對照猴子中之活性程度為0.089 nmol/hr/mg蛋白質(雄性)及0.083 nmol/hr/mg蛋白質(雌性)。在恢復期後，對於所有給藥群組而言，肝中之HNS活性程度與基線對照程度相當。
免疫組織化學
在3個月之中間隊列及6個月/恢復後隊列中，經由IT團注將HNS遞送至CNS使得將免疫反應性測試物質遞送至脊髓及腦之軟膜蛛網膜組織中。在接受IT HNS之猴子中，免疫反應性物質恆定地存在於腦脊髓膜及血管周巨噬細胞(腦/脊髓)中且可變地存在於相鄰神經膠質及神經元細胞群中。在給予媒劑之對照猴子中缺少染色(圖150A)表明抗體對人類HNS之特異性。通常，免疫反應性具有劑量相關性(即，使用半定量分級量表，可觀察到免疫組織化學染色以一般劑量依賴性方式增加)。經由IT團注將HNS遞送至CNS使得在大腦皮質及小腦中達成陽性免疫染色(圖150B-D)；然而，在尾狀/豆狀核殼區域、中腦或腦橋或髓質之較深層區域中，免疫反應性並非始終顯著。免疫反應性在所有投與HNS之猴子之肝(在竇內皮細胞中，包括庫弗細胞，但並非肝細胞)中顯著。在一個雌性提前屠宰動物(4.5 mg/劑量群組)中，免疫反應性因導管洩漏且無法修復而不顯著。
在1.5 mg/劑量群組中，顯然已基本上完全恢復，但肝以及腦及脊髓之腦脊髓膜除外，其中一些殘餘免疫反應性仍然顯著。在較高劑量(4.5及8.3 mg/劑量)下，免疫反應性之強度及發生率低於給藥結束時。在1個月之恢復期後，在所有劑量量下，HNS在脊髓、腦及肝中之含量近似於彼等在給予媒劑之對照中所觀察到者。
在此研究中，經6個月EOW遞送IT投與之HNS通常具有良好耐受性。未觀察到體重、臨床狀態、眼科/神經/體格檢查、ECG、器官重量或肉眼器官外觀出現顯著變化。發現僅限於CSF臨床病理學之短暫變化，其伴隨輕度至低度腦脊髓膜浸潤及硬膜發炎，且在恢復期後在除最高劑量群組以外之所有群組中，該等變化幾乎完全逆轉。觀察到HNS在整個腦及脊髓中廣泛分佈。
EOW IT投與HNS引發發炎反應，其特徵在於在給藥後24小時及屍體剖檢時觀察到殘餘白血球浸潤及白蛋白滲漏。不期望受限於任何具體理論，此可能反映與導管尖端附近之緊密連接的變化有關之短暫、局部且不完全之BBB開放，從而導致白血球及血漿蛋白質進入CSF(Simard JM等人，Lancet Neurol.(2007) 6,258-268；Stamatovic SM等人，Curr. Neuropharmacol.(2008) 6,179-192)。此可係兩個因素之結果：一者與劑量投與程序或體積相關，另一者與蛋白質之IT投與相關。
BBB滲透性之短暫變化(在給藥後24小時在主要屍體剖檢時，在給藥群組與對照之間無顯著差異)不伴隨任何臨床體徵。
對於較高平均CSF HNS含量似乎存在劑量相關性趨勢；在給定劑量量下，儘管血清及CSF中之抗HNS抗體含量逐漸增加，HNS在CSF中之平均濃度似乎維持在相同範圍內。
在給予HNS之幼猴之腦及脊髓中觀察到平均嚴重程度為輕度至最低度之腦脊髓膜細胞浸潤。在給予媒劑之對照中亦觀察到此顯微鏡下變化，表明一些反應與IT導管放置以及針對外源蛋白質之非特異性發炎反應有關。將生物質/蛋白質引入IT空間中(尤其可滲透CNS者)幾乎總是引發一定程度之發炎反應(Hovland DN等人，Toxicol. Pathol.(2007) 35,1013-1029；Butt MT,Toxicol. Pathol.(2011)39,213-219)，若其存在之數量損害相鄰組織，則其代表不良作用。然而，在當前研究中，該等細胞(主要係嗜伊紅白血球)似乎代表組織反應/滲透之標記且發現其數量不足以定性為不良作用。似乎HNS相關變化皆與腦或脊髓中之任何不良結構性顯微鏡下變化無關。在腦、脊髓或神經節中未觀察到神經元壞死。
評價抗測試物質抗體係毒性研究之一重要態樣，此乃因中和或結合抗體對測試物質之清除率或生物分佈具有潛在影響(Ponce RP等人，Regul. Toxicol. Pharmacol.(2009) 54,164-182)。在此研究中，由於在3個月之中間隊列及6個月隊列之腦及脊髓中觀察到劑量相關且數量上類似之HNS酵素活性程度，且儘管血清及CSF中之抗HNS抗體含量逐漸增加，但HNS在CSF中之平均濃度似乎維持在相同範圍內，故表明無中和活性。
在脊髓、腦及肝中似乎存在趨向較高HNS酵素活性程度之劑量相關性趨勢，該活性程度在脊髓腰區中之注射位點附近最高且在腦中均勻，其在頭端至尾端以及在右半球與左半球之間無顯著差異。與3個月之中間隊列相比，在6個月隊列之腦及脊髓組織中未觀察到HNS積聚之證據。儘管在表面試樣中觀察到趨向增加分佈之趨勢，但腰椎-IT投與之HNS滲透至腦之深層腦室周圍區域中。肝中之HNS酵素活性表明HNS在IT遞送後全身性重分佈；在關鍵毒性研究中評價臨床及解剖學病理學參數後，在肝中未觀察到HNS相關性不良作用。
通常，由於在脊髓及腦軟膜蛛網膜腦脊髓膜中及在緊鄰腦脊髓膜之神經組織(神經元、神經膠質細胞)中觀察到劑量相關之免疫反應性，故免疫組織化學結果確證組織酵素活性。在IT團注或短期IT輸注後，在大腦及小腦中出現良好灰質滲透。儘管免疫反應性在較深層結構(例如基底神經節或丘腦/下丘腦之中心區域、中腦或腦橋/髓質)中不明顯，故酵素活性結果表明，腰椎-IT投與之HNS滲透至腦之深層腦室周圍區域中。因此，對於檢測測試物質之生物分佈，免疫組織化學可能係靈敏性較差之技術。免疫反應性在肝之庫弗細胞及內皮細胞(能進行吞噬作用之細胞)中顯著，但在實質細胞(肝細胞)中不顯著。
在幼猴中進行之6個月重複劑量IT毒性研究中之6個月/恢復後隊列分析表明，在3個月之中間隊列及6個月之屠宰猴子中，HNS相關變化相當，包括存活期間參數、臨床及解剖學病理學、HNS及抗HNS抗體在CSF及血清中之濃度以及HNS在脊髓、腦及肝中之分佈/亞細胞定位。在恢復後屠宰猴子中，HNS效應不存在或顯著降低。因此，在6個月之幼猴研究中，無可觀察到之不良效應的量係8.3 mg/劑量，即所投與之最高劑量。
監測CSF細胞構成及蛋白質濃度之變化似乎與在組織病理學評價中觀察到之形態變化可靠相關，且可用於經HNS IT治療之患者；可將該等變化視為對IT投與之蛋白質之預期反應且其在恢復期後基本消退。該等來自動物模型之數據為業內追求IT療法作為溶酶體貯積症之神經表現之治療策略建立信心。此幼年非人類靈長類動物毒理學研究證實了經由IT腰椎藥物遞送裝置向兒科患者投與HNS之可行性及耐受性。無害CNS病理學及不良臨床體徵之缺乏支持近期研究性醫藥產品之文件批准且表明，IT投與之HNS可安全有效地治療A型聖菲利波症候群之CNS症狀。
材料及方法
下文提供用於此實例中所述之各種實驗之實例性材料及方法。
研究設計及HNS給藥
將猴子隨機化至5個治療群組中；群組1未經治療(植入裝置對照[DC]，座及導管)且未給予媒劑或測試物質。群組2至5 EOW接受0.6 mL之0、2.5、7.5或13.8 mg/mL HNS IT(即，總劑量為0、1.5、4.5或8.3 mg)。在3個月時(中間屍體剖檢；在第六劑量後24小時)對4只猴子/性別/群組進行屍體剖檢，在6個月之給藥時(主要屍體剖檢；在第12劑量後24小時)對4只猴子/性別/群組(除DC群組外，其係在3個月時進行屍體剖檢)進行屍體剖檢，且在1個月之恢復期結束時對剩餘4只猴子/性別/群組進行屍體剖檢。在屍體剖檢時，收穫、處理並用顯微鏡檢查所選組織。
HNS係在由5 mM磷酸鈉、145 mM氯化鈉及0.005%聚山梨醇酯20(pH 7.0)組成之IT調配物媒劑中提供。HNS之每隔一週劑量係以短期輸注形式經約11分鐘來投與：0.6 mL(4分鐘)，之後用0.5 mL磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗(7分鐘)。媒劑對照群組中之猴子僅接受IT調配物；DC猴子接受PBS(pH 7.2)IT。
臨床評價
自第一劑量開始每天至少兩次記錄臨床體徵及發病率及死亡率之觀察結果。在手術前、在手術當天、在研究期間每週及在屍體剖檢時量測體重。在手術前開始每天監測攝食量。在研究開始前、在研究期間每個月及在屍體剖檢前實施體格檢查(心率、呼吸、體溫、聽診、步態、性情、腹診、淋巴結及全身狀態)及神經檢查(意識能級、追蹤)。亦評定運動功能、大腦反射(瞳孔、眨眼及角膜反射)及脊髓反射(感覺足部、膝跳反射、皮膚、本體感受性及尾反射)。在HNS第一劑量之前及在中間(3個月)或主要(6個月)屍體剖檢前一週內完成心電圖(ECG；導程I、II及III)及眼科檢查。藉由間接檢眼鏡來實施眼科檢查，用氯胺酮HCl(IM,8 mg/kg)使猴子鎮靜且用1%托吡卡胺擴張眼睛。
臨床病理學
在研究開始前、在第1、3、5、7、9及11次IT給藥後、恢復期中間及在屍體剖檢時自禁食猴子採集血液試樣以供血液學及血清化學分析。在給藥前、在給藥及恢復期期間每月一次以及在屍體剖檢前經由集取盤採集尿樣。在手術時、在第1、3、5、7、9、11次IT給藥後24小時、恢復期中間以及在屍體剖檢時經由腰椎導管採集CSF試樣以供總細胞計數及化學分析；有時因局部導管阻塞而採集不到試樣。因觀察到高於預期之CSF白血球計數，在給藥前自每個群組中一半猴子採集3個月劑量之5個CSF試樣，且在給藥後24小時自剩餘猴子採集。在給藥前至少1天採集給藥前試樣以在即將給藥前不顯著改變CSF體積。對於6個月及恢復猴子，在給藥前自每個群組中之一半猴子採集CSF以供總細胞計數及化學分析，且在給藥後24小時自剩餘猴子採集。若猴子之導管因阻塞而無法採樣，則在屍體剖檢時實施脊髓穿刺(小腦延髓池)。
HNS分析
在第2、4、6、8、10、12次IT給藥之前及之後24小時；在恢復期中間及在屍體剖檢時自周圍靜脈採集血液試樣以供HNS分析。在第2、4、6、8、10、12次IT給藥之前及之後24小時、在恢復期中間及在屍體剖檢時經由腰椎導管採集CSF試樣。藉由酵素連結免疫吸附分析來測定HNS濃度。俘獲抗體係多株兔抗HNS IgG，且檢測抗體係同一兔抗HNS IgG之辣根過氧化物酶偶聯物。LOD係0.22 ng/mL；因此，LOQ計算為0.66 ng/mL。一式兩份以1:100及1:5稀釋度篩選血清及CSF試樣；進一步稀釋超過校準曲線最高點之試樣並再次測試。
抗HNS抗體分析
在第2、4、6、8、10、12次IT給藥之前約1週；在恢復期中間及在屍體剖檢時自周圍靜脈採集血液以供抗體分析。在手術時採集CSF試樣以供抗體分析，且在第2、4、6、8、10、12次IT給藥之前約1週；在恢復期中間；及在屍體剖檢時經由腰椎導管來採集。使用Meso Scale Discovery()技術電化學發光橋測試來檢測抗HNS抗體。該分析係自任何物種及所有免疫球蛋白同種型篩選抗HNS抗體之通用且靈敏之方法。LOD係5 ng/mL，且一式兩份以1:20稀釋度篩選試樣，從而獲得100 ng/mL之有效分析靈敏度。進一步稀釋超過校準曲線最高點之試樣並再次測試。
屍體剖檢及組織製備
在最終IT劑量後24小時(主要屍體剖檢)或在1個月之恢復期結束時(恢復後屍體剖檢)對猴子進行全面屍體剖檢。用氯胺酮HCl(IM,8 mg/kg)使所有猴子鎮靜，將其維持在異氟醚/氧混合物中，且接受IV團注之肝素鈉(200 IU/kg)。經12 min以200 ml/min之速率(約2400 ml)經由左心室向猴子灌注室溫之存於鹽水中之0.001%亞硝酸鈉。在採集後，將組織試樣固定在10%中性緩衝之福馬林中以供組織病理學檢查/免疫組織化學分析，或在乾冰上冷凍並儲存在-60℃或更低溫度下以供HNS活性分析。
在腦模具(MBM-2000C,ASI Instruments公司，Warren,MI)中以3 mm之冠狀薄片厚度切割腦。將薄片編號，最頭端薄片指定為薄片1。處理薄片1、4、7、10、13及16以供組織病理學分析，且處理薄片2、5、8、11、14及17(若可用)以供免疫組織化學分析。冷凍薄片3、6、9、12及15以供HNS活性分析。將脊髓(頸部、胸部及腰部部分)切成1 cm切片。處理第一薄片及之後每隔兩個薄片以供組織病理學評價，且處理第二薄片及之後每隔兩個薄片以供免疫組織化學分析。將第三薄片及之後每隔兩個薄片冷凍以供HNS分析。調整薄片之分佈以將含有腦脊髓膜內導管之尖端之薄片(薄片0)固定在福馬林中並進行組織病理學分析。自兩個單獨葉取約5 g肝之一式兩份試樣並將其冷凍用於HNS分析，且固定約5 g之另一試樣以供免疫組織化學分析。
組織病理學
在屍體剖檢時自所有猴子收穫腦、脊髓、背部脊神經根/神經節、坐骨神經、脛神經及腓腸神經、完整組織列表(通常用於在此物種中此持續時間之臨床前藥物安全性研究)及任何肉眼損傷。將組織切片包埋於石蠟中並用蘇木素及伊紅染色(除下文所述之任何專用染色/包埋程序外)以供綜合顯微鏡下評價。
用Fluoro-Jade B(提高評價神經元變性之靈敏度之染色劑)及Bielschowsky銀(此程序使得能夠直接看見軸突、樹突及神經元絲)對裝置及媒劑對照群組以及高劑量猴子之來自所製備石蠟塊之腦切片進行染色。在螢光照明下使用異硫氰酸螢光素濾色塊來檢查Fluoro-Jade B染色載玻片。
將脊髓連續切片，其中在頸部、胸部及腰區取橫切片及斜切片(在每一節段檢查一個薄片)，包括導管尖端之切片；自馬尾區取另一橫切片。處理並檢查背脊根及神經節(中頸部、胸正中及中腰部)。將周圍神經(坐骨神經、脛神經及腓腸神經)縱向切片，包埋於石蠟中，並用蘇木素及伊紅(H&E)染色。將橫切片後固定在鋨中，包埋在Spurr樹脂中，切片(2 μm)，並用甲苯胺藍染色。用Bielschowsky銀對來自裝置及媒劑對照群組及高劑量群組之連續脊髓切片以及背脊神經根及神經節進行染色。該等群組之脊髓切片亦使用抗神經膠質纖維酸性蛋白染色，其係能夠直接呈現星形細胞及其突起之免疫組織化學染色劑。
製備組織提取物以供定量分析
藉由分離左右半球來解剖冷凍腦薄片3、6、9、12及15。藉由測量距表面4 mm來取得表面組織，且各半球中之剩餘組織視為深層組織。若存在(例如薄片6及9)，則自冠狀薄片切下另一腦室周圍試樣。由於僅處理一半腦(右側)(左側保持冷凍)，故各薄片之切片獲得兩個至三個試樣：右側表面、右側深層及(若存在)右側腦室周圍(即腦室深層；V深層)。若存在小腦及腦幹組織，則在分離半球前將其分離並獨立處理。以類似方式製備脊髓切片，稱重並均質化。
組織試樣使用TeenA溶胞基質A管或圓錐形聚丙烯管在與10 mM Tris、5 mM乙二胺四乙酸、補充α蛋白酶完全抑制劑小錠劑(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN)之0.1% Igepal一起調配之溶胞緩衝劑(1 ml/0.25 g組織)中均質化。試樣在Fastprep-24自動化均質器(MP Biomedicals,Solon,OH)或PowerGen 125型動力均質器(Omni International,Kennesaw,GA)中處理40秒。在均質化後，試樣使用乙醇/乾冰浴及37℃水浴進行5個冷凍-解凍循環，且隨後在4℃離心以沉澱組織碎屑；上清液儲存在-80℃至分析之時。使用特異性受質(4-甲基傘形酮基(umbelliferyl)-α-D-N-磺基胺基葡糖苷)利用兩步式螢光分析來測定HNS活性。
組織處理及染色以供免疫組織化學
將來自每只猴子之6個福馬林固定之3 mm厚冠狀腦薄片(薄片編號2、5、8、11、14及17)自頭端至尾端編號為1至6。通常，薄片1至4含有基底核/丘腦/中腦及大腦，且尾端兩個薄片含有小腦及腦幹(延髓)組織。將腦、脊髓及肝切片(來自與用於H&E及各種專用染色之彼等相同之石蠟塊)免疫組織化學染色以供HNS分析。使用特異性小鼠單株抗體(純系2C7；Maine Biotech,Portland,ME)來檢測IT投與之HNS之細胞內吸收；此試劑顯示與內源食蟹猴HNS無交叉反應性。使用無關小鼠IgG實施陰性對照。將去石蠟載玻片與一級小鼠抗HNS抗體在2至8℃下一起培育過夜。添加二級山羊抗小鼠生物素化免疫球蛋白G並在37℃下培育30分鐘。添加抗生物素蛋白/生物素化辣根過氧化物酶複合物並培育30分鐘。將載玻片在過氧化物酶受質二胺基聯苯胺溶液中培育直至產生期望染色強度。用蘇木素對核進行對比染色。
統計學分析
藉由單向方差分析及使用鄧奈特(Dunnett)測試比較裝置及媒劑對照群組與每一給予HNS之群組來分析體重、體重變化、攝食量、呼吸速率、體溫、心率、CSF細胞計數、CSF化學、臨床病理學數據、尿液數據以及絕對及相對器官重量。另外，統計學分析將兩個對照群組彼此比較。分析係用於5%及1%顯著水準之雙尾分析。所有數據皆表示為平均值±標準偏差。
實例22：乙醯肝素N-硫酸酯酶生物分佈及藥物代謝動力學研究
此實例中之實驗經設計以測定在單次靜脈內或腦脊髓膜內劑量(1或10 mg/kg)之HNS後，HNS在大鼠中之組織分佈。例如，該等實驗之目的尤其係使用正電子發射斷層攝影術(PET)來表徵HNS在大鼠中之生物分佈(BD)特性；比較HNS在以不同途徑(IV或IT)及不同劑量(1或10 mg/kg)給予時之分佈模式；以及測定在該等給藥方案中，HNS在每一所關注器官中之藥物代謝動力學特性。
藉由在大鼠中在單次靜脈內(IV)或腦脊髓膜內(IT)投與1或10 mg/kg 124I-HNS後實施組織PET成像來研究124I-磺醯胺酶(HNS)之藥物代謝動力學(PK)及生物分佈(BD)曲線。自IV或IT給藥後最初20 min內之動態影像及在0.05(僅對於IT投與)、1、2、4、8、24、48、96及192小時之靜態影像獲得所關注區域中之放射性-時間數據。
在此研究中使用4個群組(1 mg/kg IV、1 mg/kg IT、10 mg/kg IV及10 mg/kg IT)中每一群組中之4只大鼠。在IT投與後，在頭部、腦(包括腦脊髓液，CSF)、脊柱及肝區域中量測放射性-時間數據；且在IV投與後，在血液、腦(包括CSF)、肝、腎、心臟(包括肺)及皮膚中量測。藉由124-碘之衰變半衰期(100.2小時)來校正數據，表示為所關注區域之注射劑量百分比(%ID)或成像組織之%ID/克(%ID/g)，且隨後針對200克體重進行正規化。根據對應%ID或%ID/g數據來計算所給予蛋白質在所關注區域中之總量(μg)或濃度(μg/g)。
在1及10 mg/kg下，在IT給藥後之最初20 min內，HNS在頭部區域中之總量以0.002/min-0.011/min(λz)之恆定速率降低。在此報告中，清除率及分佈容積不用於兩種劑量及兩種投與途徑之間之藥物代謝動力學比較(更多資訊參見結果部分)。在兩種測試劑量下，自腦消除之恆定速率基本上相同(λz：對於1及 10 mg/kg，分別為0.016/hr與0.014/hr)，且具有約2天之類似半衰期，如藉由在IT給藥後至多192小時之靜態成像所測定。Cmax值及AUC值(0-最後一個可測定濃度(0-last)或0-無窮大)與所投與劑量成比例。在該等IT單次給藥方案中給予之1至10 mg/kg之劑量範圍內指明線性PK特徵。在兩種劑量量下，自脊柱之近端至遠端部分觀察到濃度梯度。
在IT給藥後，在1 mg/kg HNS下至多96小時，且在10 mg/kg HNS下至多192小時，肝中之HNS蛋白質係可量測的。在1 mg/kg下第2小時及在10 mg/kg下第7小時，肝中之濃度達到峰值。在1 mg/kg下消除為0.030±0.011/hr(平均λz)，其與在10 mg/kg下無顯著不同(λz 0.017±0/hr)(p=0.10)，且具有對應t1/2(在1及10 mg/kg劑量下，分別為28小時與42小時)。
在1及10 mg/kg下，在IV給藥後，在肝、腎、心臟及皮膚中之消除半衰期分別為47±10及38±13小時(肝)、54±25及29±16小時(腎)、36±15及42±19小時(心臟)以及40±21及31±13小時(皮膚)；而腦中之半衰期為71±23及60±53小時。在1 mg/kg下，Cmax在肝、皮膚、腎、心臟及腦中之平均值係9.6、0.30、0.25、0.22及0.08 μg/g；且在10 mg/kg下係132、7.9、3.9、3.7及1.8 μg/g。在個別動物之Cmax值針對劑量正規化後，在所有該等器官中在10 mg/kg下之Cmax/劑量值顯著高於在1 mg/kg下(大多數p值<0.05，在肝中p=0.06)。在1 mg/kg下，AUClast在肝、皮膚、腎、心臟及腦中之值係525、16、14、9及7 hr.μg/g；且在10 mg/kg下係6747、276、183、201及86 hr.μg/g。在正規化後，在10 mg/kg下之AUClast/劑量值在皮膚中顯著高於在1 mg/kg下(p<0.01)，在心臟中略有不同(p=0.06)，且在肝、腦及腎中無顯著不同(所有p值>0.34)。
在注射相同劑量之HNS時，腦脊髓膜內投與所產生之腦暴露比靜脈內投與大3 log。腦中之消除半衰期係2天(IT投與)及3天(IV投與)。然而，在相同劑量之HNS下，在IT給藥後之肝臟暴露與在IV給藥後類似。藉由IT/IV投與1 mg/kg及10 mg/kg之肝暴露(Cmax及AUClast)在0.4-1.2範圍內。
實驗設計
中樞神經系統(CNS)在大多數溶酶體貯積症中易受損且在一些類型之該等疾病(例如A型或B型聖菲利波症候群(黏多糖貯積症III)、異染性腦白質營養不良(MLD)及亨特氏症候群)中嚴重受損。如本文所述，由於在周圍投與時穿過血腦障壁之滲透較差，故預期將酶性蛋白質直接投與至CNS中可提高其在中樞神經組織中之濃度並進一步增強其治療效果。在此研究中，研究腦脊髓膜內(IT，或小腦延髓池)投與並在不同劑量量下將其與IV投與進行比較。
PET係非侵入性、可重複之定量技術，其提供在所關注器官中藥物濃度隨時間之動態變化。來自目標器官(活性位點，而非在血液循環中)之動態濃度-時間數據係有價值的，且與所給予藥物之生物活性直接相關。此外，可使用來自動物PET研究之關於組織暴露之資訊來指導人類中第一劑量之選擇。
材料及方法 測試物質
肝素N-硫酸酯酶(HNS)係在pH 7.0下以20 mg/mL HNS之濃度在5 mM磷酸鈉緩衝劑中與145 mM氯化鈉一起調配。藉由RP-HPLC純化該材料且其含有98.7%之肝素N-硫酸酯酶，其中99.9%係二聚體。用124碘標記HNS。
試樣來源
在以1及10 mg/kg IV及IT給予124I-H-N-硫酸酯酶後，自大鼠獲得放射性影像。
動物
16只雄性Sprague-Dawley大鼠購自Charles River Laboratories(190±60 g,n=16)，且將其分為4個群組(n=4)。在該等大鼠之每個群組中(總計4個群組)以兩種不同劑量(1 mg/kg及10 mg/kg)單一IV或IT注射。基於每只動物的體重將劑量及注射體積個別化。在兩個IV治療群組中，藉由以35 mg/kg劑量IV注射戊巴比妥鈉來誘導鎮靜狀態。經由尾靜脈團注注射靜脈內劑量。在兩個IT治療群組之，藉由以50 mg/kg劑量腹膜內投與戊巴比妥鈉來麻醉動物。腦脊髓膜內劑量係經1 min在小腦延髓池層面上經由環枕膜投與。實際投與之放射性係藉由PET來量測，且用作注射劑量。
實驗及/或分析方法
在IV注射後，在最初20分鐘內在心臟(包括肺)、肝及腎區域中獲得動態影像(每2 min)；且在IT投與兩種劑量後，在頭部區域中獲得動態影像。在IV治療群組中，靜態成像係在包括腦(包括腦脊髓液，CSF)、肝、腎、心臟(包括肺)、肌肉、皮膚及骨在內之區域中獲得；且在IT治療動物中，係在0.05(僅適用於IT群組)、1、2、4、8、24、48、96及192小時給藥後在頭部、腦(包括CSF)及肝區域中獲得。重建該等影像並將三個體層融合至一個影像中。
數據分析
PET數據表示為奈居裏(nCi)/mL(流體)或奈居裏(nCi)/克(組織)。在靜態影像中獲得腦、肝、腎、骨骼肌、胃、心臟(及肺)及皮膚區域之相對活性。對於接受IT注射之動物，獲得完整頭部或腦區域中之絕對活性。在IT注射動物中，在所選三個區段處測定每毫米脊柱之放射性：近端(頸部)、中間(抵靠肝之上邊緣)及遠端(距離含蛋白質房室之遠端1 cm)脊柱。
藉由124I之衰變半衰期(100.2小時)來校正所有數據且基於利用124I源及外部量測活性校準來正規化以記錄功效。然後將數據表示為完整區域(頭部及腦)之注射劑量百分比(%ID)或組織之%ID/克(%ID/g)，且隨後針對200克體重進行正規化[數據正規化：(%ID或%ID/g)/動物體重x 200]。由於每個群組中僅使用4只動物，故採用正規化來減少數據可變性。
在此實例中，HNS蛋白質濃度或數量係使用每只動物之注射蛋白質劑量來計算：蛋白質濃度(μg/g)=(%ID/g) x (注射劑量之mg/kg x 1000 x 0.2)；所給予蛋白質在所關注區域中之總量(μg)=%ID x(注射劑量之mg/kg x 1000 x 0.2)，此處注射劑量係1 mg/kg或10 mg/kg，且0.2係體重之正規化因子。每一PK參數之群組平均值及標準偏差係基於四個群組中每一者之個別非房室數據來計算。實施司徒登氏t-測試以比較兩個測試劑量及兩種投與途徑之間之λz、t1/2、Cmax及AUC值。統計顯著性定義為p值小於0.05(p<0.05)。
結果
以下表格、圖及PK分析中之HNS數量(μg)或濃度(μg/g)係藉由將注射蛋白質劑量(1 mg/kg或10 mg/kg)乘以%ID或%ID/g之對應值來計算。
以1及10 mg/kg劑量使用124I-HNS之腦脊髓膜內治療
在圖151中，將動態影像中所給予蛋白質(μg)在頭部區域中之數量繪製為時間函數。在圖152中，將靜態影像中腦區中之濃度(μg/g)繪製為時間函數。在圖153及圖154中，將靜態影像中注射蛋白質(μg)在腦及頭部區域中之總量分別對時間作圖。脊柱近端、中間及遠端之濃度-時間曲線(μg/mm)展示於圖155至圖157中。圖158展示在以1及10 mg/kg IT投與124I-HNS後，肝中HNS濃度(μg/g)隨時間之變化。
藉由非房室模型(WinNonlin 5.2,Pharsight,Mountain View,CA)來分析總量-時間(μg)或濃度-時間(μg/g)數據。PK參數(例如恆定消除速率(λz)、峰值濃度(Cmax)、終末半衰期(t1/2)、曲線下面積(AUClast及AUC0-inf)及其他參數)係根據每一個別動物之數據來估計。
估計清除率及分佈容積，然而，其在此報告中不用於兩個劑量及兩種投與途徑之間之PK比較，原因有二：(1)此研究集中於HNS在實體組織中之生物分佈而非血液PK；及(2)　腦區中之放射性係彼等來自腦組織(固體)及CSF(液體)者之總和，其在研究中無法相互分離。評價λz並用於比較，此乃因其指示每時間單位中消除之注射劑量百分比。
計算並比較兩種測試劑量之群組平均值及標準偏差(SD)。將該等PK參數製為下表44。
在給藥後之最初20 min內，HNS在頭部區域中之總量(μg)以0.002-0.011/min(λz,0.005±0.004/min)(在1 mg/kg下)及0.003-0.010/min(0.007±0.003/min)(在10 mg/kg下)之恆定速率降低。該等恆定消除速率在該兩種劑量量下無顯著不同(p=0.57，圖151)。
腦之濃度-時間曲線(μg/g，自0.05至192小時)顯示二相性特徵(圖152)。早期持續約2小時。末期遵循一級動力學。自腦消除之恆定速率在兩個測試劑量下極為類似(每小時0.0016±0.003及0.014±0.001)且具有約2天之類似半衰期(在1及10 mg/kg下分別為45±7及49±4小時)。在劑量自1 mg/kg增加至10 mg/kg時，峰值濃度值(257±90及2628±265 μg/g)及AUClast(在1及10 mg/kg下分別為8393±2457及83962±10083 hr.μg/g)提高約10倍。該等觀察顯示在該等IT單次給藥方案中在1至10 mg/kg劑量範圍內之線性PK特徵。在IT給藥後3 min(Tmax)，腦中出現峰值濃度。
在腦及頭部區域中，總量-時間曲線(μg，0.05至192小時)遵循與腦中之濃度-時間曲線(μg/g)所顯示者相同之二相性模式(圖153及圖154)。腦區中之Cmax值顯著低於頭部區域(在1 mg/kg下係69±8對200±0，p<0.01；且在10 mg/kg下係836±117對1844±314 μg，p<0.01)。在1及10 mg/kg下，腦中之恆定消除速率分別係0.017±0.002/hr及0.014±0.001/hr，且頭部區域分別係0.016±0.002及0.010±0.001/hr。在1及10 mg/kg下，腦中之平均殘餘時間值分別係42±5小時對51±5小時(p=0.048)，且頭部分別係45±7小時對70±9小時(p<0.01)。該等觀察表明，在較低劑量下所給予蛋白質自兩個區域中之消除快於在較高劑量下。在IT給予1 mg/kg及10 mg/kg之HNS後，該等區域中之平均半衰期在42至70小時範圍內。
在兩種劑量量下，自脊柱之近端至中間及至遠端區段觀察到濃度梯度(數據未顯示)。在IT給藥後，在30 min左右(0至1小時)(近端區段)、1至4小時(中間區段，除1只大鼠係24小時以外)及1至8小時(遠端區段)觀察到峰值濃度(脊柱之μg/mm)。該等區段中之半衰期可變(平均t1/2：在1 mg/kg及10 mg/kg下分別為32±13及45±18小時(脊柱之近端區段)，39±16及約50小時(中間區段)，以及30±12及約123小時(遠端區段))。在1及10 mg/kg之124I-HNS下，該三個區段中每一者之峰值濃度平均值與劑量大致成比例(在脊柱之近端、中間及遠端區段分別為0.5對6.0、0.2對0.9及0.1對0.5 μg/mm)。AUClast之平均值遵循與在峰值濃度中觀察到者相同之成比例模式(在近端、中間及遠端區段分別為9.5對83、6.8對35及2對38 hr.μg/mm)。
即使HNS在大多數周圍器官中不可檢測，在IT給藥後自早至1小時(給藥後之第一成像時間點)至96小時(4只動物中之3只)(1 mg/kg)及至192小時(所有4只大鼠)(10 mg/kg)，其在肝中亦可量測(圖158)。在IT給予1 mg/kg後2小時及在IT給予10 mg/kg後7小時，肝中之濃度達到峰值，之後係具有一級動力學之消除期。恆定消除速率在1 mg/kg下(λz 0.030±0.011/hr)快於在10 mg/kg下(λz 0.017±0/hr)(p=0.10)，且具有對應之較短t1/2(在1及10 mg/kg劑量下分別為28±16對42±1小時，p=0.76)。在1 mg/kg下之AUClast值相對於在10 mg/kg下降低約40倍(分別為204±50對7987±3276 μg/g)。
以1及10 mg/kg劑量使用 124 I-HNS之靜脈內治療
將腦、肝、腎、心臟(包括肺組織)及皮膚中之濃度繪製為在IV給予1及10 mg/kg HNS之後之時間函數，分別如圖159至圖163中所示。由於該等器官之第一靜態成像時間點係給藥後1小時，故在此研究中無法觀察到該等濃度-時間曲線之初期。肝、腎、心臟及皮膚之濃度-時間曲線在IV給藥後1至8小時顯示平坦期。在腦中，此平坦期在給藥後持續24小時，表明腦吸收IV給予之蛋白質慢於周圍器官。其餘數據顯示大致具有一級動力學之終末消除期。
在1及10 mg/kg下，肝、腎、心臟及皮膚中之消除半衰期分別係47±10及38±13小時(肝)、54±25及29±16小時(腎)、36±15及42±19小時(心臟)以及40±21及31±13小時(皮膚)；而在1及10 mg/kg下，腦中之半衰期分別係71±23及60±53小時(因數據不足以測定t1/2而排除10 mg/kg群組中之大鼠3)。在該等器官中，未觀察到1 mg/kg與10 mg/kg之間之半衰期具有統計差異，但在腎中除外，p值<0.03。
肝、皮膚、腎、心臟及腦之Cmax平均值係9.6、0.3、0.25、0.22及0.08 μg/g(1 mg/kg)以及132、7.9、3.9、3.7及1.8 μg/g(10 mg/kg)。對於該等器官，在10 mg/kg下之Cmax與在1 mg/kg下之對應值之比係14、26、16、17及23。在將個別動物之Cmax值針對劑量進行正規化後，在所有該等器官中，在10 mg/kg下之Cmax/劑量值顯著高於在1 mg/kg下(大多數p值<0.05，肝中p=0.06)。肝、皮膚、腎、心臟及腦中之AUClast值在1 mg/kg下係525、16、14、9.3及7 hr.μg/g；且在10 mg/kg下係6747、276、183、201及86 hr.μg/g。對於該等器官，在10 mg/kg下之AUClast值與在1 mg/kg下之對應AUClast值之比分別係13、17、13、22及12。在正規化後，在10 mg/kg下之AUClast/劑量值在皮膚中顯著高於在1 mg/kg下(p<0.01)，在心臟中略有不同(p=0.06)，且在肝、腦及腎中無顯著不同(所有p值>0.34)。
該等觀察表明：(1)大多數器官中之半衰期係約2天，但在腦中除外(約3天)；(2)在肝中每克之暴露大於在皮膚、心臟及腎中，後者又大於腦中；(3)劑量增加10倍(10/1 mg/kg)，在10 mg/kg下所測試所有器官之Cmax值皆比在1 mg/kg下增加超過10倍。
在IV給藥後1-24小時(Tmax)，在腦中達到峰值濃度。
IV與IT治療之比較
在圖164及圖165中分別比較在以1及10 mg/kg IV及IT投與後腦及肝中之濃度-時間曲線。在腦中，在1及10 mg/kg下，IT/IV之Cmax之比分別係3212及1501。該等AUC0-192hr之比係1136及978。該等觀察表明，在注射相同劑量之HNS時，腦脊髓膜內投與產生之腦暴露比靜脈內投與大約3 log。在兩種劑量量下，腦中之消除半衰期係2天(在1及10 mg/kg下係45及49小時，IT投與)及3天(在1及10 mg/kg下係71及60小時，IV投與)。
然而，在相同劑量之HNS下，在IT給藥後之肝臟暴露與在IV給藥後類似。在肝中，在1 mg/kg及10 mg/kg下，IT/IV之Cmax之比分別係0.5及0.8，且AUClast之比分別係0.4及1.2。
結論
藉由在單次靜脈內或腦脊髓膜內投與1或10 mg/kg之124I-磺醯胺酶後，大鼠中之組織PET影像來研究124I-磺醯胺酶(HNS)之藥物代謝動力學及生物分佈曲線。以動態方式(最初20 min)及靜態方式(在給藥後0.05、1、2、4、8、24、48、96及192小時)來獲得所關注區域中之濃度-時間數據。藉由在IT給藥後動態成像，HNS在頭部區域中之總量在最初20 min內以0.005/min-0.007/min(平均λz)之類似恆定速率降低。藉由靜態成像，自腦中消除之速率在兩個測試劑量下基本相同(λz：對於1及10 mg/kg分別係0.016/hr與0.014/hr)，且具有約2天之類似半衰期。
Cmax及AUClast值與投與劑量成比例，且在該等IT單次給藥方案中給予之1至10 mg/kg之劑量範圍內顯示線性PK特徵。
在兩種劑量量下自脊柱近端至遠端觀察到濃度梯度。
在IT給藥後，在近端區段係在約20 min時，在中間區段係在1至4小時時，且在遠端區段係在1至8小時時觀察到峰值濃度。在脊柱不同區段中亦顯示線性PK特徵。
在IT給藥後，HNS蛋白質在肝中自極早時間至至多96小時(1 mg/kg)及192小時(10 mg/kg)係可量測的在1 mg/kg下消除速率(λz 0.030/hr)快於在10 mg/kg下(λz 0.017/hr)，且在較低劑量下具有對應較短t1/2(在1及10 mg/kg劑量下分別為28±16與42±1小時)。
在IV給藥後，在1及10 mg/kg下，肝、腎、心臟及皮膚中之消除半衰期分別係47±10及38±13小時(肝)、54±25及29±16小時(腎)、36±15及42±19小時(心臟)以及40±21及31±13小時(皮膚)；而腦中之半衰期係71±23及60±53小時。肝、皮膚、腎、心臟及腦之Cmax平均值係9.6、0.30、0.25、0.22及0.08 μg/g(1 mg/kg)以及132、7.9、3.9、3.7及1.8 μg/g(10 mg/kg)。在將個別動物之Cmax值針對劑量進行正規化後，在所有該等器官中，在10 mg/kg下之Cmax/劑量值顯著高於在1 mg/kg下(大多數p值<0.05，肝之p=0.06)。肝、皮膚、腎、心臟及腦之AUClast值係525、16、14、9.3及7 hr.μg/g(1 mg/kg)；以及6747、276、183、201及86 hr.μg/g(10 mg/kg)。在正規化後，在10 mg/kg下之AUClast/劑量值在皮膚中顯著高於在1 mg/kg下(p<0.01)，在心臟中略有不同(p=0.06)，且在肝、腦及腎中無顯著不同(所有p值>0.34)。
實例23：A型聖菲利波症候群(Sanfilippo A)患者使用HNS之治療
可使用經由(例如)IT遞送直接CNS投與來有效治療A型聖菲利波患者。此實例闡釋多中心劑量遞增研究，其經設計以評價在總計40週內每隔一週(EOW)經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)將多達3種劑量量之rhHNS投與A型聖菲利波患者之安全性。各種適於人類治療之實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置繪示於圖94-97中。
招收至多20名患者：
隊列1：5名患者(最低劑量)
隊列2：5名患者(中等劑量)
隊列3：5名患者(最高劑量)
隨機選取5名患者不進行治療。
基於以下入選標準來選擇用於研究之患者：
測定在A型聖菲利波患者中經40週藉由IT注射投與遞增劑量之HNS之安全性。另外，評定HNS對認知功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。
IT遞送NAGLU-IGFII之實例 實例24：rhNaglu及Naglu-IGFII之活體外研究
使用B型聖菲利波患者成纖維細胞之兩種品系GM02391(P359L)及GM 01426(E153K)以及正常人類成纖維細胞系來研究Naglu變體中每一者之細胞吸收機制。由於M6P受體在細胞系上之表現，傳統上研究者使用成纖維細胞來研究溶酶體酵素細胞吸收。
細胞吸收研究係藉由將成纖維細胞與rhNaglu或Naglu-IGFII在37℃下一起培育4小時來實施。在培育後洗滌並溶解細胞，並量測細胞溶解物中之Naglu酵素活性。將rhNaglu與成纖維細胞一起培育在細胞內產生幾乎不可檢測量之酵素。相反，將Naglu-IGFII與成纖維細胞一起培育在細胞內產生大量酵素(圖166)。內在化Naglu-IGFII之量隨用於培育之酵素之量增加而達到飽和。劑量依賴性飽和吸收係受體介導之細胞吸收之典型發現。此外，Naglu-IGFII之內在化並不受外源M6P抑制，但外源IGFII可完全抑制(圖166)。此結果表明，將Naglu-IGFII內在化至成纖維細胞中以非糖基化依賴性方式依賴於M6P/IGFII受體。
亦實施實驗來研究rhNaglu及Naglu-IGFII至溶酶體之運輸。使用B型聖菲利波患者成纖維細胞(GM01426)來進行該研究。藉由在首先將蛋白質與細胞一起培育後用抗人類Naglu多株抗體將細胞染色來檢查對rhNaglu及Naglu-IGFII之檢測。使用對LAMP-1(溶酶體相關膜蛋白1)之免疫螢光染色來檢測溶酶體。藉由共焦顯微術來使rhNaglu及Naglu-IGFII與溶酶體之共定位可視化(圖167)。
在將蛋白質與細胞一起培育4小時後觀察到Naglu-IGFII之廣泛內在化，從而證實了Naglu-IGFII與溶酶體之共定位。反之，rhNaglu在相同時間範圍內未顯示內在化，且未觀察到與溶酶體共定位。此結果進一步證明，Naglu-IGFII內在化至細胞中並轉運至正確的細胞房室(即溶酶體)中。內在化Naglu-IGFII在B型聖菲利波患者成纖維細胞中之半衰期經測定為1.5天(數據未顯示)。
實例25：在小鼠模型中之活體內研究 野生型(wt)插管大鼠
除了B型聖菲利波小鼠模型以外，亦使用wt插管大鼠(非缺陷型動物模型)來進行活體內分子篩選。wt插管大鼠已在脊髓之腰上區及胸下區以手術方式植入插管，並經由插管單次注射35 μl至CSF中。使用此動物模型實施分子篩選所評定之標準係腦及脊髓之Naglu活性分析及免疫組織化學。
B型聖菲利波症候群小鼠模型
B型聖菲利波症候群之小鼠模型(Naglu-/-小鼠，B型聖菲利波小鼠)係由E. Neufeld及同事產生(Li HH等人，PNAS 96(25):14505-14510；1999)。小鼠Naglu基因之外顯子6因插入選擇標記新黴素抗性基因而中斷。所得純合體Naglu-/-小鼠係完全Naglu缺陷(圖168)，且在肝及腎中具有完全GAG積聚。儘管Naglu完全缺陷，但該等小鼠通常健康且壽命為8-12個月。其他溶酶體酵素表現之變化發生在約5個月齡，該等變化包括β-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶及β-己糖胺酶在肝及腦中之補償性增加，α-L-艾杜糖醛酸酶在肝而非腦中之增加，及神經胺酸酶在肝及腦中之減少。通常係因尿瀦留及尿路感染而導致死亡。文獻中已廣泛研究B型聖菲利波小鼠模型以描述B型聖菲利波病理學變化。與Naglu-/-小鼠之CNS病理學相關之表型報導為在4.5個月齡時之活動減退，但在其他年齡亦觀察到活動過度。
Naglu-/-小鼠中之神經病理學變化闡述為在神經元、巨噬細胞及上皮細胞中藉由EM(電子顯微術)觀察到之空泡及包涵體。該等病理學變化通常在33日齡開始，且隨著動物變老而日益惡化。藉由組織病理學分析亦顯示激活星形細胞及小神經膠質細胞。兩種神經節苷脂GM2及GM3之生物化學分析顯示在腦中增加5倍及9倍。(由於GM2及GM3並非Naglu之直接受質，且可能難以證實其在ERT後短期時間內顯著降低，故不使用其作為POC之端點生物標記)。
生物化學分析係藉由量測Naglu酵素活性及GAG含量來實施，組織學分析係藉由抗人類Naglu抗體、抗LAMP-1抗體、抗Iba-1抗體及抗GFAP抗體免疫組織化學來實施。用於此研究之抗人類Naglu抗體係不結合wt小鼠中之內源鼠類Naglu或B型聖菲利波小鼠中之突變Naglu之小鼠單株抗體。LAMP-1免疫染色使用與溶酶體膜蛋白、溶酶體相關膜蛋白-1結合之抗體。Iba-1染色使用與對小神經膠質細胞及巨噬細胞具有特異性之離子化鈣結合轉接蛋白結合之抗體。GFAP染色使用與對星形細胞具有特異性之神經膠質纖維酸性蛋白結合之抗體。
藉由顱內(IC)注射至B型聖菲利波小鼠中進行之活體內生物活性篩選
此研究之目的係評價Naglu酵素之活體內生物活性。在此研究中，經由IC注射將蛋白質投與至B型聖菲利波小鼠之腦中。研究用B型聖菲利波小鼠之年齡密切匹配為8週齡。IC注射途徑提供最佳狀況以評價分子之功效。藉由被吸收至神經元細胞中及減少溶酶體貯積之能力來評定Naglu蛋白質。使用免疫組織化學來評定生物分佈。且使用LAMP-1免疫染色藉由陽性染色之數量及尺寸來表徵溶酶體貯積。
IC注射係藉由經由B型聖菲利波小鼠之顱骨直接注射至右側大腦皮質中來實施。每只動物注射2微升或35 μg Naglu蛋白質。在注射後第7天屠宰動物。在先導研究中預先確定屠宰時間，其中在注射後3、7及14天屠宰動物。根據先導研究確定，注射後7天係進行免疫組織化學研究之最佳時間。橫向切割腦切片(圖169)，且實施Naglu及Lamp-1免疫染色。在經rhNaglu及Naglu-IGFII治療之B型聖菲利波小鼠中，藉由免疫組織化學使用抗人類Naglu抗體顯示細胞吸收至神經元及神經膠質細胞二者中(圖170及圖171)。觀察到在經rhNaglu與Naglu-IGFII治療之B型聖菲利波小鼠之間，關於細胞吸收無顯著差異。另外，經rhNaglu及Naglu-IGFII治療之小鼠二者中腦組織之LAMP-1免疫染色顯示溶酶體貯積顯著降低。在經rhNaglu及Naglu-IGFII治療之群組二者中，溶酶體貯積之降低量幾乎與正常wt小鼠之量相同。
在Naglu-TAT、Naglu-Kif及PerT-Naglu測試之B型聖菲利波小鼠中，在IC注射後亦觀察到溶酶體貯積之降低(數據未顯示)。此研究證實所有Naglu變體之活體內生物活性。
在一單獨研究中，向Naglu缺陷型小鼠IT投與媒劑或一次、兩次或三次每週劑量之存於PBS中之重組Naglu-IgF-II融合蛋白構建物(Naglu)。未經治療之野生型群組小鼠用作未經治療之野生型對照且投與無Naglu媒劑。在最終注射後24小時屠宰小鼠，之後製備組織以供免疫組織化學(IHC)及組織病理學分析。
在IT-投與重組Naglu後，Naglu在Naglu缺陷型小鼠腦組織中之分佈很明顯。如圖172A所示，將重組Naglu IT投與Naglu缺陷型小鼠可使白質組織中之細胞空泡形成相對於IT投與媒劑之Naglu缺陷型小鼠廣泛降低。類似地，且如圖172B中所示，形態測定分析揭示，在經治療小鼠白質組織中之LAMP1免疫染色相對於未經治療之Naglu缺陷型小鼠顯著降低，由此反映疾病病理學之改良。
如圖173A-B中所示，在所評價腦組織之每一區域(皮質、尾狀核及豆狀核殼(CP)、丘腦(TH)、小腦(CBL)及白質(WM))中，在經Naglu治療之小鼠中LAMP陽性區域相對於未經治療之Naglu缺陷型對照小鼠有所減小，且近似於野生型小鼠之LAMP陽性區域。尤其值得注意，在所分析腦組織之每一區域中，在IT-投與兩次或三次劑量之Naglu後(圖173B)，LAMP陽性區域相對於單次劑量(圖173A)進一步減小。
該等結果確認，IT投與之Naglu能夠改變Naglu缺陷型小鼠模型中溶酶體貯積症(例如B型聖菲利波症候群)之進展，從而進一步確認IT投與之酵素(例如Naglu)治療與溶酶體貯積症(例如B型聖菲利波症候群)有關之CNS表現之能力。
藉由腦脊髓膜內(IT)注射至wt插管大鼠中進行分子篩選
此研究直接模擬用於藥物投與之座介導方法。Naglu蛋白質係經由IT注射投與wt插管大鼠以測定至腦實質中之生物分佈。
該等動物中之插管係置於脊髓之高位腰部及低位胸部中(圖174)。經由插管向動物注射35 μl或385 μg rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFII及PerT-Naglu(由於溶解性限制，僅以38.5 μg注射Naglu Kif，其係其餘Naglu之十分之一)。在注射後4 hr及24 hr進行屠宰。
採集腦及脊髓組織並藉由Naglu活性分析進行量測。在經治療動物之腦中，經Naglu-TAT及Naglu-IGFII治療之動物呈現之活性高於經rhNaglu及所有其他Naglu變體治療之動物(圖175)。作為一般趨勢，對於所有經治療動物，Naglu在脊髓中之活性皆顯著高於在腦中(數據未顯示)。此現象可表明，吸收位點距離IT注射位點愈近，蛋白質吸收愈強。
免疫組織化學分析表明，在IT注射後24 hr，Naglu-IGFII治療群組在腦中之生物分佈比所有其他Naglu變體治療群組更廣泛(圖176及圖177)。在經rhNaglu治療之動物中，僅在腦之腦脊髓膜中觀察到該蛋白質。在脊髓切片中，IHC顯示rhNaglu在灰質神經元中有一定細胞吸收，但吸收程度遠低於Naglu-IGFII在脊髓神經元中之吸收(數據未顯示)。
在Naglu-TAT IT注射群組中，即使藉由生物化學分析在腦組織中觀察到最高Naglu活性，但IHC顯示除了保持在腦脊髓膜上以外，無任何Naglu-TAT滲透至腦實質中。除了Naglu-IGFII，所有其他Naglu變體皆未顯示在腦脊髓膜以外之生物分佈，從而有力地證實了在IT注射後Naglu在腦中之細胞吸收對M6P/IGFII受體之依賴性。此研究意味著Naglu-IGFII係用於B型聖菲利波之藥物研發之首要分子。
實例26：使用NAGLU-IGFII之概念性驗證研究 實驗設計
概念性驗證研究經設計以同時顯示在B型聖菲利波小鼠中在IT注射Naglu-IGFII後溶酶體貯積之生物分佈及逆轉。在此研究中，藉由IT注射Naglu-IGFII來治療3個群組之8週齡B型聖菲利波小鼠。每次IT注射具有10 μl體積或260 μg Naglu-IGFII。有3個經治療群組，即1x注射群組、2x注射群組及3x注射群組。在1x注射群組中，在第0天投與單次劑量之蛋白質。在注射後24 hr屠宰動物。在2x注射群組中，在第0天及第7天投與兩次IT注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰動物。在3x注射群組中，在第0天、第7天及第14天投與IT注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰動物。亦包括經媒劑治療小鼠之3個群組。在媒劑對照群組中，以與經治療群組相同之時間間隔向B型聖菲利波小鼠注射媒劑並以與經治療群組相同之方式屠宰動物。
應用生物化學及組織學分析二者來評價研究結果。生物化學分析包括Naglu活性分析以量測酵素在組織中之量，且包括總GAG分析以評價溶酶體貯積之降低。肝及腦係生物化學分析之兩個受試組織(圖178及圖179)。組織學分析包括組織之H&E染色以供形態評價(數據未顯示)，且包括使用抗人類Naglu抗體、LAMP、Iba及GFAP之免疫組織化學染色(Iba及GFAP染色之數據未顯示)。
用於此研究之抗人類Naglu抗體係不結合wt小鼠中之內源鼠類Naglu或B型聖菲利波小鼠中之突變Naglu之小鼠單株抗體。LAMP-1免疫染色使用結合溶酶體相關膜蛋白之抗體。Iba-1染色使用結合對小神經膠質細胞及巨噬細胞具有特異性之離子化鈣結合轉接蛋白之抗體。GFAP染色使用結合對星形細胞具有特異性之神經膠質纖維酸性蛋白之抗體。
Naglu免疫螢光之代表性顯微照片展示於圖180中。圖181展示腦之代表性切片示意圖。即使檢測到Naglu-IGFII進入靠近腦脊髓膜之大腦皮質中，但在諸如尾狀核、丘腦及白質等皮質下區域中未發現Naglu-IGFII(數據未顯示)。由於對相同皮質下區域之LAMP-1、Iba-1及GFAP免疫染色確實顯示溶酶體貯積逆轉，人們相信Naglu在深層腦區域中之陰性免疫染色可能係由於Naglu免疫螢光之靈敏性所致。
Lamp-1免疫染色之代表性顯微照片展示於圖182至圖186中。為顯示蛋白質分佈及功效之程度，選擇大腦皮質及皮質下區域(例如尾狀核、丘腦及白質)及小腦皮質進行免疫組織學分析。Iba-1及GFAP免疫染色(數據未顯示)之結果表明，在LAMP-1免疫染色中所觀察到者係小神經膠質細胞及星形細胞之變化之組合效應，據報導在B型聖菲利波小鼠模型中除神經元外該兩種細胞類型亦受影響(Li 2002,Ohmi 2002)。由於技術限制，LAMP-1免疫染色不能揭示神經元中之溶酶體貯積。為達成對神經元中溶酶體積聚(例如空泡及包涵體)之最佳觀察，通常利用電子顯微術(當前研究中不包括EM)。
應瞭解，細胞類型之鑑別僅限於神經元及神經膠質細胞。神經元通常係藉由相對較大且含有一或多個密集染色核仁之蒼白核以及通常可檢測之細胞質來鑑別。神經膠質細胞通常係藉由小密集核及不顯著之細胞質來鑑別。不同類型神經膠質細胞(例如星形細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞及少突膠質細胞)之間之區別通常最佳係藉由用細胞類型特異性標記染色來實施。
在大腦皮質、尾狀核、丘腦、白質及小腦中，在IT注射Naglu-IGFII後，除了藉由LAMP-1免疫染色呈現之溶酶體貯積降低以外，Iba-1免疫染色顯示小神經膠質細胞之細胞尺寸及突起(process)數量降低，且GFAP免疫染色顯示星形細胞之細胞尺寸及長度/突起數量降低(數據未顯示)。此外，藉由對與免疫組織化學檢查相同之區域中之腦組織進行H&E染色(蘇木素及伊紅)實施之組織病理學分析顯示，在3x IT注射Naglu-IGFII後，神經膠質細胞中之空泡減少。上文所提及之所有結果亦顯示IT注射Naglu-IGFII之劑量相關效應。
在IT注射Naglu-IGFII後對B型聖菲利波小鼠進行之生物化學分析檢測腦及肝中之Naglu活性。藉由腦及肝中之總GAG降低來顯示Naglu-IGFII之功效。免疫組織化學顯示Naglu-IGFII在腦實質中之生物分佈。LAMP-1、Iba-1、GFAP之免疫染色及使用H&E染色之組織病理學分析顯示，不僅在腦之大腦皮質區域中，且在腦之皮質下區域、白質及小腦皮質中，溶酶體貯積降低，小神經膠質細胞及星形細胞之尺寸減小且突起減少。
結論
尤其已證實，融合蛋白Naglu-IGFII對結構與Naglu之天然受質類似之受質呈現活體外酵素活性。活體外細胞吸收研究證實，該分子係藉由M6P/IGFII受體以獨立於M6P糖基化之方式吸收至細胞中。顯示內在化Naglu-IGFII可與溶酶體共定位。顯示Naglu-IGFII在IC注射至B型聖菲利波小鼠中之後可在活體內減少溶酶體貯積。與rhNaglu及其他Naglu融合物及修飾形式相比，Naglu-IGFII在IT注射後滲透至wt插管大鼠之腦實質方面優於其全部。最後，IT注射至B型聖菲利波小鼠中之Naglu-IGFII顯示遠超出腦脊髓膜外之廣泛分佈，且在大腦皮質中以及在皮質下區域中觀察到溶酶體貯積逆轉。總而言之，該等數據表明，Naglu-IGFII係治療B型聖菲利波疾病之候選藥物。
實例27：IT遞送NAGLU-IGFII之毒性、藥物代謝動力學(PK)及組織生物分佈研究 小鼠中之概念性驗證研究
向3個Naglu(-/-)小鼠群組(n=3)注射10 μL含有260 μg Naglu-IGFII之單次IT團注腰椎注射劑。260 μg劑量轉換為520 mg/kg腦重量劑量(小鼠腦=0.0005 kg)。1個群組係在第0天注射且在注射後24 hr屠宰。第二個群組係在第0及7天注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰。第三個群組係在第0、7及14天注射，且在最後一次注射後24 hr屠宰。每個給予Naglu-IGFII之群組皆與媒劑對照群組配對以控制年齡/疾病嚴重程度。
在三個給予Naglu-IGFII之群組之間，Naglu在腦及肝中之酵素活性類似。比較rhNaglu在肝與腦中之酵素活性，發現在肝中rhNaglu之酵素活性大10倍。預期由於在大鼠及幼猴之關鍵毒性研究中，在1個月、3個月及6個月之給藥後，rhHNS在腦與肝中之酵素活性程度相當，故一部分給予Naglu(-/-)小鼠之rhNaglu劑量可能並非係IT遞送，而係全身性遞送。然而，在3次IT注射後，腦中之總GAG含量顯示統計學顯著降低(p<0.05)。在肝中觀察到總GAG含量降低之劑量相關性趨勢，其在接受2次或3次劑量之群組中在統計學上顯著(p<0.05)。
觀察到Naglu-IGFII在IT注射後之生物分佈遠超出腦脊髓膜外，進入腦實質中，但深層皮質下區域之抗Naglu抗體免疫染色呈陰性。藉由溶酶體相關膜蛋白(LAMP)免疫染色，僅在給予2次或3次劑量之群組中觀察到溶酶體活性降低。溶酶體活性降低之區域包括大腦皮質及尾狀核、丘腦及白質之深層皮質下區域。因此，各種免疫染色參數在給予Naglu-IGFII之動物中之降低表明，儘管不存在抗NAGLU免疫染色，但可能存在治療量之NAGLU。僅在給予2次或3次劑量之群組中，星形細胞之神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫染色降低及小神經膠質細胞/巨噬細胞之離子化鈣結合轉接分子(Iba)染色降低證實發炎反應減弱。分析區域包括大腦皮質及尾狀核、丘腦及白質之深層皮質下區域。
大鼠研究
選擇S-D大鼠作為用於IT投與Naglu-IGFII之毒理學評價之齧齒類物種。因此，每4天以最高可能投與劑量(MFD)以及以約及 MFD(分別係低及中等劑量量)給予16只大鼠(每個性別8只)重組Naglu-IGFII，總計8次劑量。
在S-D大鼠中實施單次劑量PK/生物分佈研究以分別測定在IT-L投與雄性及雌性動物後之CSF及血清濃度或組織分佈。
毒理學研究經設計以在雄性及雌性動物二者中自毒理學及安全藥理學(神經、呼吸及心血管安全性)角度評價Naglu-IGFII之IT-L投與。該等研究中之毒理學評價包括臨床觀察、體重、攝食量、臨床病理學、適當安全藥理學評價(體格檢查或心電描記術)、肉眼組織及顯微鏡下評價。採集有限數量之CSF及血清試樣並分析Naglu-IGFII，且分析針對測試物質之抗體。分別藉由酵素活性分析及免疫組織化學對Naglu-IGFII組織分佈及亞細胞定位進行定量。另外，所選研究包括恢復期以評定所觀察到的任何顯著毒理學發現之可逆性或可能的延遲出現。
猴子研究
選擇食蟹猴作為用於IT投與Naglu-IGFII之毒理學評價之非齧齒類物種，此乃因其與人類具有遺傳學及解剖學相似性且因此被認為係更相關之物種。考慮到用於B型聖菲利波症候群臨床試驗之計劃患者群係兒科患者，在幼年食蟹猴中實施長期6個月毒理學研究，其特徵為用腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)投與Naglu-IGFII。幼年食蟹猴在研究開始時通常小於1歲(約7-9個月齡)且在研究開始時體重介於900 g至1,500 g之間。用自1個月重複劑量之幼年食蟹猴毒性研究獲得之數據來指導6個月幼猴研究之劑量量選擇及設計。重複劑量毒理學研究經設計以在1至6個月期間模擬預期臨床途徑(IT-L團注)及投與頻率(每隔一週；EOW)。
如上所述，毒理學研究經設計以在雄性及雌性動物二者中自毒理學及安全藥理學(神經、呼吸及心血管安全性)角度評價Naglu-IGFII之IT-L投與。該等研究中之毒理學評價包括臨床觀察、體重、攝食量、臨床病理學、適當安全藥理學評價(體格檢查或心電描記術)、肉眼組織及顯微鏡下評價。採集有限數量之CSF及血清試樣並分析Naglu-IGFII，且分析針對測試物質之抗體。分別藉由酵素活性分析及免疫組織化學對Naglu-IGFII組織分佈及亞細胞定位進行定量。另外，所選研究包括恢復期以評定所觀察到的任何顯著毒理學發現之可逆性或可能的延遲出現。
實例28：NAGLU-IGFII之EOW腦脊髓膜內投與
此實例經設計以確定在Naglu -/-小鼠模型中在6次注射(3個月之研究)中EOWIT-腰椎給藥之可行性。相對於每週給藥，此給藥方案可能在臨床上更適當。
根據以下實驗設計對8週齡Naglu -/-雄性及雌性小鼠進行研究：
實施生理學研究，包括對肝、腦及血清之Naglu活性分析、對血清之抗Naglu抗體分析及對肝及腦之BCA分析。實施組織學研究，包括對腦、脊髓及肝之Naglu IHC，及對腦及脊髓之Lamp染色。
採集腦、脊髓及肝並在10% NBF中固定。製備5 μm石蠟切片以供組織學染色。使用Naglu之免疫組織化學(IHC)染色來檢測注射蛋白質之細胞吸收。使用H&E染色來觀察形態變化。使用LAMP(溶酶體活性及疾病狀態之指示劑)、GFAP及Iba-1(激活星形細胞及小神經膠質細胞之兩種CNS病理學標記)進行組織病理學改良評價。
對經媒劑及Naglu-IGFII治療之小鼠中腦、脊髓及肝之Naglu免疫染色顯示，在腦及脊髓中，僅藉由IHC在腦脊髓膜(M)中檢測到注射Naglu，且在任何其他區域皆未檢測到Naglu陽性染色(圖187)。在肝中，竇狀隙細胞(S)係Naglu陽性且在肝細胞(H)中未發現Naglu吸收。
對經媒劑及Naglu-IGFII治療之小鼠中肝及脊髓之LAMP 免疫染色及H&E染色顯示，與媒劑動物相比，LAMP染色在整個經Naglu治療之肝及脊髓中有所降低。H&E染色顯示，與媒劑治療動物相比，在治療群組中，細胞空泡形成在肝細胞中顯著降低(圖188及圖189)。
對經媒劑及Naglu-IGFII治療之小鼠中腦之H&E染色顯示在經3個月6次每隔一週IT注射Naglu-IGFII後，腦中之形態改良。在經治療腦中，細胞空泡形成(箭號)在所有檢查區域中相對於媒劑群組有所降低(圖190)。
在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之LAMP IHC顯示，與媒劑治療群組相比，IT投與SFB小鼠之Naglu使溶酶體活性在所有檢查區域中降低，如LAMP免疫染色所揭示(圖190)。此降低之特徵在於LAMP陽性細胞之數量減少、細胞尺寸減小且染色變淡。在小腦及腦幹(其位於腦中接近脊髓之尾狀部分中)中發現相對於其他腦區顯著降低。亦在包括白質、海馬及丘腦之深層腦區中發現顯著降低。
在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之Iba IHC揭示小神經膠質細胞之激活(圖191)。與媒劑治療群組相比，在Naglu治療群組中未觀察到陽性細胞數量及染色強度降低。然而，在所有檢查腦區中，與媒劑群組(插圖)中之較大且形成空泡之細胞相比，陽性小神經膠質細胞之細胞形態變化且細胞尺寸減小。
在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之GFAP IHC揭示星形細胞激活(圖192)。與媒劑治療群組相比，GFAP陽性染色在小腦及腦幹中有所降低，且在其他檢查區域中略有降低。
對於細胞吸收，該等數據顯示，在腦及脊髓中，僅在經3個月6次每隔一週Naglu IGFII IT注射後在腦脊髓膜細胞中檢測到Naglu。藉由IHC在腦及脊髓之任何其他區域中皆檢測不到Naglu。在肝中，在竇狀隙細胞中發現Naglu陽性染色。
在腦及脊髓中，在經3個月6次每隔一週IT注射Naglu-IGFII後，即使藉由IHC檢測不到注射Naglu，亦在整個腦及脊髓中觀察到組織病理學改良。H&E染色顯示細胞空泡形成在所有檢查腦區中皆有所降低。LAMP染色在整個經治療脊髓中及在所有評價腦區(包括白質、海馬及丘腦，其係深層腦區)中降低，且在Naglu-IGFII治療群組之小腦及腦幹中顯著降低。GFAP染色在星形細胞中之降低染色模式與LAMP染色一致，但並非如LAMP一般顯著降低。Iba-1染色顯示在所有檢查腦區中，小神經膠質細胞之細胞尺寸減小。在肝中，H&E染色顯示在Naglu治療群組中，細胞空泡形成降低且LAMP染色顯著降低。
實例29：B型聖菲利波患者之治療
可使用經由(例如)IT遞送直接CNS投與來有效治療B型聖菲利波症候群(B型聖菲利波)患者。此實例闡釋多中心劑量遞增研究，其經設計以評價經總計40週每隔一週(EOW)經由腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)將多達3種劑量量之Naglu-IGFII及/或rhNaglu投與B型聖菲利波症候群患者之安全性。各種適於人類治療之實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置繪示於圖94-97中。
招收至多20名患者：
隊列1：5名患者(最低劑量)
隊列2：5名患者(中等劑量)
隊列3：5名患者(最高劑量)
隨機選取5名患者不進行治療。
基於以下入選標準來選擇用於研究之患者：
測定在B型聖菲利波患者中經40週藉由IT注射投與遞增劑量之Naglu-IGFII之安全性。另外，評定Naglu-IGFII及/或rhNaglu對認知功能之臨床活性、及單次及重複劑量在血清及腦脊髓液(CSF)中之藥物代謝動力學及濃度。
通常，端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續腦脊髓膜內投與治療有效量之Naglu-IGFII及/或rhNaglu。本文所用以一「間隔」投與指示週期性投與治療有效量(與一次性劑量相區分)。該間隔可藉由標準臨床技術來確定。在一些實施例中，Naglu-IGFII及/或rhNaglu係兩個月一次、每月一次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每日一次腦脊髓膜內投與。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變，此端視該個體之需要而定。例如，在身體性疾病或應力情況下，若抗Naglu抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則劑量間之間隔可縮短。
儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。
應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞「一(a及an)」除非明確指示相反情形否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的一或多個成員間包括「或」的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有一個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。此外，應瞭解，除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明性術語等引入附屬於相同基礎技術方案(或任一其他相關技術方案)之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。如果以列表形式(例如，以馬庫西群組或類似格式)給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，如果稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之背景及提供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。
圖1展示具有緊固機構之腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)之實例性簡圖。
圖2A繪示患者體內可放置IDDD之實例性位置；圖2B繪示腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)之各個組件；且圖2C繪示患者體內用於IT-腰椎注射之實例性插入位置。
圖3繪示實例性結果，其概述在成年猴子中測試之媒劑。
圖4繪示實例性結果，其展示hGalC在hGalC隨pH而變之熱篩選中之穩定性。(存於含有50mM NaCl之3mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑中之1mg/mL GalC)
圖5繪示實例性結果，其展示hGalC隨pH而變之比活性。(存於含有50mM NaCl之3mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑中之1mg/mL GalC)
圖6繪示實例性結果，其展示hGalC隨鹽濃度而變之熱篩選。
圖7繪示實例性結果，其展示GalC之沉降速度實驗，該實驗比較在5mM磷酸鈉(pH 6.0)緩衝劑中之不同離子強度。圖7A繪示使用50mM NaCl及hGalC之實例性結果。圖7B繪示實例性結果，其展示150mM NaCl及hGalC。圖7C繪示實例性結果，其展示500mM NaCl及hGalC。圖7D繪示實例性結果，其展示150mM NaCl及小鼠GalC。
圖8繪示實例性結果，其展示GalC隨鹽濃度而變之AUC 曲線(1mg/mL GalC，5mM磷酸鈉，pH 6.0)(Y軸=s*g(s*)；X軸=s*)。
圖9繪示實例性結果，其展示hGalC在通用緩衝劑(pH 6.0)中之稀釋系列(Y軸=<g(s*)/C0>(1/斯韋德貝裏(svedberg))；X軸=s*(斯韋德貝裏))。
圖10繪示實例性結果，其展示GalC隨pH而變之AUC曲線(1mg/mL，3mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑，含有50mM NaCl)。
圖11繪示實例性結果，其展示在最高濃度及pH 6.0(5mM磷酸鈉及150mM NaCl)下，WDA分析之基線讀數。
圖12繪示實例性結果，其展示在最高濃度及pH 6.0(5mM磷酸鈉及150mM NaCl)下，WDA分析之應力讀數。
圖13以圖示方式比較並重疊基線及應力GalC試樣。
圖14繪示實例性結果，其展示hGalC在1% NaTC存在下之稀釋系列。
圖15繪示實例性結果，其展示hGalC在1% NaTC存在下之稀釋系列(1.0mg/mL及0.3mg/mL)。
圖16繪示實例性結果，其展示hGalC(1mg/mL)在不同緩衝劑及pH中之固有螢光。
圖17繪示實例性結果，其展示hGalC隨pH而變之圓二色性。(存於含有50mM NaCl之3mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑中之1mg/mL GalC)
圖18繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中放射性之群組平均濃度。(群組1：在41μg/動物之平均劑量下)
圖19繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予 125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、心臟、腎、肝、肺、脾中放射性之群組平均濃度。(群組1：在41μg/動物之平均劑量下)
圖20繪示實例性結果，其展示在單次靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、心臟、腎、肝、肺、脾中放射性之群組平均濃度。(群組2：在1.00mg/kg之平均劑量下)
圖21繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、心臟、腎、肝、肺、脾中放射性之群組平均濃度。(群組3：在1.08mg/kg之平均劑量下)
圖22繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及不同組織(脂肪組織(腎脂)、腎上腺、骨(股骨)、肌肉(骨骼肌)、坐骨神經)中放射性之平均濃度。(群組1：在41μg/動物之平均劑量下)
圖23繪示實例性結果，其展示在單次靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及不同組織(脂肪組織(腎脂)、腎上腺、骨(股骨)、肌肉(骨骼肌)、坐骨神經)中放射性之平均濃度。(群組2：在1.00mg/kg之平均劑量下)
圖24繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織(脂肪組織(腎脂)、腎上腺、骨(股骨)、肌肉(骨骼肌)、坐骨神經)中放射性之平均濃度。(群組3：在1.08mg/kg之平均劑量下)
圖25繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予 125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、腦脊髓液及各種其他組織中放射性之平均濃度。(群組1：在41μg/動物之平均劑量下)
圖26繪示實例性結果，其展示在單次靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠血清、腦脊髓液及各種其他組織中放射性之平均濃度。(群組2：在1.00mg/kg之平均劑量下)
圖27繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、腦脊髓液及組織中放射性之平均濃度。(群組3：在1.08mg/kg之平均劑量下)
圖28繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。(群組1：在41μg/動物之平均劑量下)
圖29繪示實例性結果，其展示在單次靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。(群組2：在1.00mg/kg之平均劑量下)
圖30繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜內給予及靜脈內團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。(群組3：在1.08mg/kg之平均劑量下)
圖31繪示實例性結果，其展示IP投與rmGalC可降低顫搐型小鼠中腦之鞘胺醇半乳糖苷含量。數據代表每個治療群組中n=4只小鼠之平均值±SEM。(PND32)
圖32繪示實例性結果，其展示僅使用ICV及使用ICV/IP之rmGalC療法可延長存活期。
圖33繪示實例性結果，其展示在顫搐型小鼠中，在ICV 及ICV/IP注射rmGalC後，腦鞘胺醇半乳糖苷顯著減少。
圖34繪示實例性結果，其展示在經40μg rmGalC治療之顫搐型小鼠中觀察到組織學標記有所改良。使用神經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)作為星形細胞標記。使用Iba 1作為小神經膠質細胞/巨噬細胞標記。使用溶酶體相關膜蛋白-1(LAMP-1)作為溶酶體標記。
圖35繪示實例性結果，其展示在單次ICV注射rmGalC或媒劑後，鞘胺醇半乳糖苷再積聚。
圖36繪示實例性結果，其展示在PND19/20時經單次ICV注射rmGalC治療之顫搐型小鼠之存活百分比。數據代表每個群組n=8。(存活期中值：媒劑=40天；12μg=48天；40μg=50.5天；40μg hGalC=42天)
圖37繪示實例性結果，其展示經ICV/IP rmGalC及rhGalC治療之小鼠之存活百分比。
圖38繪示實例性結果，其展示對經單次ICV注射rmGalC及rhGalC治療之小鼠之步態分析。
圖39繪示實例性結果，其展示在顫搐型小鼠中對rmGalC或rhGalC之抗原反應。(抗GALC抗體含量)
圖40繪示實例性結果，其展示幼稚(naïve)GLD犬及經rhGalC治療之GLD犬之CSF中鞘胺醇半乳糖苷之含量。(克拉伯犬模型：CSF中之鞘胺醇半乳糖苷含量(ng/ml))
圖41繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用群組1多株抗體之IHC染色。
圖42繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用群組2抗體之IHC染色。
圖43繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用小鼠單株抗體之IHC染色。
圖44繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用小鼠單株抗體之IHC染色。
圖45繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在肝中使用小鼠單株抗體之IHC染色。
圖46繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在肝中使用群組2多株抗體之IHC染色。
圖47繪示實例性結果，其展示腦中之平均GalC活性。
圖48繪示實例性結果，其展示肝中之平均GalC活性。
圖49繪示實例性結果，其以10X展示腦中之GalC免疫染色。
圖50繪示實例性結果，其以40X展示腦中之GalC免疫染色。
圖51繪示實例性結果，其以40X展示對激活小神經膠質細胞之Iba染色。
圖52繪示實例性結果，其以10X展示腦中之LFB/PAS染色。
圖53展示實例性I2S IHC，其顯示在腦脊髓膜內注射3次劑量之I2S後，在大腦及小腦皮質(包括覆蓋腦表面之腦脊髓膜細胞層(箭頭))之神經元(箭號)中檢測到I2S。在注射2次劑量之腦中，I2S IHC之染色較弱(照片未顯示)。在媒劑對照動物腦中任一類型之細胞中，未觀察到陽性I2S染色。40X。
圖54繪示在腦脊髓膜內-腰椎I2S注射後，IKO小鼠腦中病變之實例性逆轉。在媒劑對照動物中，H&E染色之腦組織顯示多個細胞貯積空泡(箭號)。在注射2次劑量(照片未顯示)及3次劑量之兩種小鼠中，整個腦中之細胞空泡形成有所降低。在注射3次劑量之小鼠中發現顯著降低。40X。
圖55繪示LAMP-1之實例性免疫組織化學染色，在2次劑量(照片未顯示)及3次劑量之I2S治療後，與媒劑對照小鼠相比，腦中之溶酶體活性顯著降低。該降低之特徵在於，在整個腦之區域中，LAMP-1陽性細胞之數量減少且染色強度變弱。40X。
圖56展示實例性形態測定法結果，其中在野生型(WT)、媒劑未經治療及I2S(2次及3次劑量)小鼠之間比較大腦皮質(皮質)、尾狀核(CP)、丘腦(TH)、白質(WM)及小腦(CBL)中之平均LAMP-1陽性區域，從而確認LAMP-1陽性染色在所評價腦之所有區域中皆顯著降低。數據表示為平均值±s.d。#=P<0.05；*=P<0.01；**=P<0.001。
圖57繪示腦細胞之實例性電子顯微照片，其在超微結構層面上顯示病理學改良。媒劑治療小鼠之神經元具有片層狀包涵體、斑馬體樣結構及含有顆粒貯積物質之空泡(插圖)，其在注射I2S之小鼠中有所減少。媒劑治療小鼠之少突膠質細胞顯示大的電子透明貯積空泡(箭號)，而注射I2S之小鼠之少突膠質細胞具有最少空泡形成。比例尺：在神經元中，2 μm；在少突膠質細胞中，500 nm。
圖58繪示實例性免疫組織化學結果，其顯示在腦脊髓膜內注射3次劑量之I2S後，在肝之竇狀隙細胞中檢測到I2S。在注射2次劑量之肝中，2S IHC染色較弱(照片未顯示)。在媒劑對照動物之肝中，未觀察到陽性I2S染色。40X。
圖59繪示肝中之實例性組織。H&E染色揭示嚴重細胞空泡形成及異常高之溶酶體活性，且與WT動物相比，在媒劑對照動物中發現強LAMP-1免疫染色。在用3次及2次(照片未顯示)腦脊髓膜內劑量之I2S治療後，發現細胞空泡形成及LAMP-1免疫染色顯著降低。H&E染色表明細胞質內空泡形成幾乎完全消失，且肝細胞結構接近正常。H&E，40X；LAMP-1，20X。
圖60繪示實例性組織，其顯示3 mg治療群組動物之大腦。在腦脊髓膜細胞中觀察到陽性I2S染色。4X。
圖61繪示實例性組織，其顯示30 mg治療群組動物之大腦。在神經元及腦脊髓膜細胞中觀察到陽性I2S染色。4X。
圖62繪示實例性組織，其顯示100 mg治療群組動物之大腦。神經元及腦脊髓膜細胞中之陽性I2S染色強於3 mg及30 mg治療動物。4X。
圖63繪示實例性組織，其顯示150 mg治療群組動物之大腦。觀察到大群神經元係I2S陽性，以及強陽性腦脊髓膜細胞。
圖64繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦之I層內顯示I2S陽性神經元及神經膠質細胞，以及腦脊髓膜細胞。40X。
圖65繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦之III層內顯示I2S陽性神經元、神經膠質細胞以及血管周細胞。40X。
圖66繪示實例性組織，其在30 mg治療群組動物大腦與白質相鄰之VI層內顯示I2S陽性神經元及神經膠質細胞。40X。
圖67繪示實例性組織，其在150 mg治療群組動物之神經元(大腦)中顯示強陽性I2S染色。100X。
圖68繪示實例性組織，其在150 mg治療群組中顯示頸部脊髓之I2S免疫染色。4X。
圖69繪示實例性組織，其在150 mg治療群組動物之腰椎脊髓中顯示強I2S免疫染色。4X。
圖70繪示實例性組織，其顯示在150 mg治療群組動物之腰椎區段中腦脊髓膜細胞、神經膠質細胞及神經外膜/神經束膜/神經內膜(結締組織細胞)之強陽性I2S免疫染色。40X。
圖71繪示影像，其顯示150 mg治療群組動物之腰椎脊髓中之神經元呈強I2S陽性。40X。
圖72繪示3 mg治療群組動物肝之實例性結果。僅竇狀隙細胞呈I2S陽性。40X。
圖73繪示30 mg治療群組動物肝之實例性結果。竇狀隙細胞及肝細胞呈I2S陽性。40X。
圖74繪示100 mg治療群組動物肝之實例性結果。I2S免疫染色在竇狀隙細胞及肝細胞中較強。40X。
圖75繪示150 mg治療群組動物肝之實例性結果。在竇狀隙細胞及肝細胞中鑑別出強陽性I2S染色。40X。
圖76繪示3 mg治療群組動物心臟之實例性結果。I2S免疫染色呈陰性。40X。
圖77繪示30 mg治療群組動物心臟之實例性結果。間質細胞呈I2S陽性。40X。
圖78繪示100 mg治療群組動物心臟之實例性結果。觀察到I2S之陽性間質細胞染色。40X。
圖79繪示150 mg治療群組動物心臟之實例性結果。觀察到I2S之強陽性間質細胞染色。40X。
圖80繪示3 mg治療群組動物腎之實例性結果。I2S免疫染色係陰性。40X。
圖81繪示30 mg治療群組動物腎之實例性結果。腎小球細胞及間質細胞呈I2S陽性。
圖82繪示100 mg治療群組動物腎之實例性結果。觀察到增強之腎小球細胞及間質細胞I2S染色。40X。
圖83繪示150 mg治療群組動物腎之實例性結果。觀察到近端腎小管、腎小球細胞及間質細胞之陽性I2S染色。40X。
圖84展示免疫組織化學(IHC)研究之結果，其評價每週投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)劑量之食蟹猴之CNS組織。如藉由(IHC)所測定，在整個CNS中存在I2S之細胞沈積。在所有群組之灰質中，在大腦、小腦、腦幹及脊髓之神經元中以劑量依賴性方式檢測到I2S。在較高劑量群組之表面灰質中，在表面皮質中大量大腦神經元對於I2S染色呈陽性(圖84A)。在丘腦(圖84B)、海馬(圖84C)、尾狀核(圖84D)及脊髓(圖84E)之神經元中亦檢測到I2S。腦脊髓膜及血管周細胞亦呈I2S染色陽性(圖84F)。所標識比例尺對應於25 μm。
圖85藉由相對於投與後時間繪製I2S在顱池與脊髓池中之量之曲線，以圖示方式比較艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)在該等池中之清除率。
圖86展示經6個月腦脊髓膜內投與非人類靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之劑量依賴性灰質沈積。所示染色強度與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶在丘腦中之積聚一致。在本圖86中，藉由DAPI對核進行對比染色且其表現為藍色，且蛋白質(I2S)表現為綠色。
圖87展示在單次注射後及在經6個月時間多次注射後，腦脊髓膜內投與非人類靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之劑量依賴性積聚。所示染色強度與I2S蛋白質在大腦皮質中之積聚一致。
圖88顯示艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)在靈長類動物整個大腦中之細胞定位。圖88A展示自靈長類動物大腦提取之腦組織之橫截面圖，而圖88B展示該區中對應於圖88A中所標識截面中之三個白質組織區域(指定為W1、W2及W3)、腦室附近白質(VW)及表面灰質(SG)組織之具體區域。
圖89A-D展示在經6個月時間每月一次注射後，腦脊髓膜內投與靈長類動物之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之神經元及少突膠質細胞吸收及軸突結合。具體而言，圖89A、圖89B、圖89C及圖89D展示腦脊髓膜內投與艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之靈長類動物大腦組織中之神經絲染色，且分別對應於圖87B中所標識之三個白質區域(W1、W2及W3)及表面灰質(SG)區域。圖89A展示腦脊髓膜內投與之I2S在白質(W1)組織中之少突膠質細胞吸收。圖89B及圖89C分別展示腦脊髓膜內投與之I2S在W2及W3白質組織中之少突膠質細胞吸收及軸突結合。圖89D展示腦脊髓膜內投與之I2S在表面灰質(SG)組織中之神經元吸收。
圖90展示艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶在非人類靈長類動物腦室附近白質(VW)中之細胞鑒定(左上圖中之箭號)。如疊置影像中所繪示(右下圖中之箭號)，艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶未與髓磷脂結合(右上圖)。在本圖90中，藉由DAPI對核進行對比染色(左下圖)。在左上框中表現蛋白質(I2S)。
圖91展示對大腦室內(ICV)或腦脊髓膜內(IT)投與單次注射艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶(I2S)之健康比格犬組織之染色。如影像a-h中所繪示，I2S廣泛分佈在IT及ICV群組二者之整個灰質中，如藉由免疫組織化學(IHC)所測定。影像a及b展示，在IT及ICV群組二者之大腦皮質中，所有6個神經元層(自表面分子層至內部深層)中之神經元皆呈I2S陽性。影像c及d展示，在IT及ICV群組之小腦皮質中，在神經元(包括普爾欽細胞)中檢測到I2S。類似地，影像e及f展示，在IT及ICV群組二者中，海馬中之大群神經元呈I2S陽性。最後，影像g及h顯示，在IT及ICV群組二者中，在丘腦及尾狀核中亦發現I2S陽性神經元。在本圖91中，用箭號指示I2S染色。
圖92以比較方式展示未經治療或腦脊髓膜內投與I2S之艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶基因敲除(IKO)小鼠之胼胝體組織。如圖所示，經治療IKO小鼠顯示，在I2S治療IKO小鼠之胼胝體及穹窿組織中，某些溶酶體貯積症之細胞空泡形成特徵降低。
圖93A在20X及40X放大倍數下展示，溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)(溶酶體疾病病理學生物標記)之存在在經治療IKO小鼠(圖93A)之表面大腦皮質組織中相對於未經治療IKO對照小鼠(圖93B)顯著減少。
圖94繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)。
圖95繪示實例性PORT-A-CATH®低型腦脊髓膜內植入式輸液系統(low profile intrathecal implantable access system)。
圖96繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)。
圖97繪示實例性腦脊髓膜內藥物遞送裝置(IDDD)，其容許在家投與CNS酵素替代療法(ERT)。
圖98係實例性圖解，其顯示在神經元(普爾欽細胞)中單次大腦內注射艾杜硫酶後空泡形成之影響。
圖99係實例性圖解，其藉由劑量及區域來顯示I2S在腦中之活性。
圖100係實例性圖解，其顯示在不同深度之大腦皮質對艾杜硫酶進行免疫組織化學定位之數據。(在腦之層I(圖A)、層III(圖B)及層VI(圖C)中發現I2S陽性神經元、神經膠質細胞及腦脊髓膜細胞。此動物在30mg劑量群組中。(40X放大倍數))(30mg劑量群組。原放大倍數=40X。)
圖101係實例性圖解，其顯示在腦脊髓膜內給予艾杜硫酶後I2S在猴子脊髓中之活性。
圖102係實例性圖解，其顯示在腦脊髓膜內給予艾杜硫酶後I2S在猴子肝、心臟及腎中之活性。
圖103繪示遞增亨特-IT試驗計劃之實例性示意圖。
圖104係實例性圖解，其顯示在30mg劑量後在不同腦組織切片中對I2S濃度之量測。不同曲線對應於不同量測時間。
圖105係實例性圖解，其顯示在經一段時間經由不同投與途徑投與以達成不同產物濃度後，對I2S濃度之量測。
圖106繪示在食蟹猴中IV、IT-L或ICV給藥後，在t=5小時，對124I標記艾杜硫酶-IT之PET成像。
圖107係實例性圖解，其顯示在靜脈內投與後血清中之ASA濃度數據。
圖108係實例性圖解，其顯示在IT-腰椎投與後血清中之ASA濃度數據。
圖109係實例性圖解，其顯示在IV投與後CSF中之ASA濃度。
圖110係實例性圖解，其顯示在IT-腰椎投與後CSF中之ASA濃度。
圖111繪示治療後腦組織、腦脊髓膜、浸潤(中及高劑量群組，兩種性別)之實例性顯微照片。
圖112繪示治療後腦組織、腦脊髓膜、浸潤(中及高劑量群組，兩種性別)之另一實例性顯微照片。
圖113繪示治療後腦組織、血管周、浸潤(中等劑量雄性；高劑量雌性)之實例性顯微照片。
圖114繪示對經rhASA1治療之免疫耐受性MLD小鼠脊髓之實例性艾爾遜藍染色，且結果展示髓硫酯減少，如對動 物頸部脊髓之艾爾遜藍染色所測定，該動物在第1、8、15及22天以520mg/kg腦重量之劑量接受腦脊髓膜內注射之rhASA或接受媒劑對照。如圖所示，使用腦脊髓膜內注射rhASA來治療可使脊髓(包括在脊髓之頸部區域中)中之髓硫酯積聚降低。(WT=野生型，IT治療小鼠接受4次520mg/kg腦重量之每週劑量之rhASA(0.21mg)，4X放大倍數。)
圖115展示對來自經rhASA1治療之免疫耐受性MLD小鼠之艾爾遜藍染色脊髓切片的實例性形態測定法分析，且結果展示艾爾遜藍在總脊髓(T-脊髓)、總灰質(T-GM)、腰部灰質(L-GM)、頸部灰質(C-GM)、總白質(T-WM)、腰部白質(L-WM)及頸部白質(C-WM)中之光學密度，如形態測定法分析所測定。如圖所示，與媒劑對照相比，在經rhASA治療之動物中觀察到艾爾遜藍染色之統計學顯著性降低。(**P<0.001；*P<0.05；T-脊髓=總脊髓；T-GM=總灰質；L-GM=腰部灰質；C-GM=頸部灰質；T-WM=總白質；L-WM=腰部白質；C-WM=頸部白質)
圖116繪示LAMP染色在經rhASA1治療之免疫耐受性MLD小鼠白質(海馬傘)中之實例性降低，其繪示實例性結果，其展示LAMP-1在海馬傘中之含量，如免疫組織化學所測定。放大倍數=20X。如圖所示，使用腦脊髓膜內注射rhASA治療可使大腦白質中之LAMP-1減少。(WT=野生型，IT治療小鼠接受4次520mg/kg腦重量之每週劑量之HGT-1110(0.21mg)，20X放大倍數。)
圖117展示對經rhASA1治療之免疫耐受性MLD小鼠腦中LAMP染色之實例性形態測定法分析，且結果展示在經20mg/kg靜脈內rhASA、300mg/kg腦重量腦脊髓膜內rhASA、520 mg/kg腦重量靜脈內rhASA或媒劑對照治療之動物胼胝體(CC)、海馬傘(F)、小腦白質(CB-WM)及腦幹(BS)中之LAMP-1染色強度。
圖118係實例性圖解，其顯示在每隔一週(EOW) IT給藥持續6個月(主要屍體剖檢)後，ASA在給予媒劑之幼年食蟹猴之腦鑽孔(punch)中之濃度。
圖119係實例性圖解，其顯示在以1.8 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，ASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖120係實例性圖解，其顯示在以6.0 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，ASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖121係實例性圖解，其顯示在以18.6 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖122係實例性圖解，其顯示在EOW IT給予(PBS-對照)持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖123係實例性圖解，其顯示在EOW IT給予媒劑持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖124係實例性圖解，其顯示在以1.8 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖125係實例性圖解，其顯示在以6.0 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖126係實例性圖解，其顯示在以18.6 mg/劑量EOW IT給予rhASA1持續6個月(主要屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴腦鑽孔中之濃度。
圖127係實例性圖解，其顯示對於裝置對照、媒劑、1.8 mg、6.0 mg及18.6 mg治療動物，rhASA在來自腦表面之所選鑽孔中之濃度。(雄性及雌性分開，裝置對照數據來自恢復後屍體剖檢，所有其他數據來自主要屍體剖檢)
圖128係實例性圖解，其顯示對於裝置對照、媒劑、1.8 mg、6.0 mg及18.6 mg治療動物，rhASA在來自腦深層白質區域之所選鑽孔中之濃度。(雄性及雌性分開，裝置對照數據來自恢復後屍體剖檢，所有其他數據來自主要屍體剖檢)
圖129係實例性圖解，其顯示對於裝置對照、媒劑、1.8 mg、6.0 mg及18.6 mg治療動物，rhASA在來自腦深層灰質區域之所選鑽孔中之濃度。(雄性及雌性分開，裝置對照數據來自恢復後屍體剖檢，所有其他數據來自主要屍體剖檢)
圖130係實例性圖解，其顯示rhASA在來自裝置對照、媒劑、1.8 mg、6.0 mg及18.6 mg治療動物中不同區域之所選鑽孔中之濃度。(雄性及雌性組合，裝置對照數據來自恢復後屍體剖檢，所有其他數據來自主要屍體剖檢)
圖131係實例性圖解，其顯示在EOW IT給藥持續6個月(恢復後屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴脊髓切片中之濃度。
圖132係實例性圖解，其顯示在EOW IT給藥持續6個月(047-021)(恢復後屍體剖檢)後，rhASA在幼年食蟹猴肝中之濃度。
圖133係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在皮質下WM、腦室周圍WM(及深層白質)及皮質下WM中之解剖學位置。
圖134係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在胼胝體及胼胝體周皮質下WM、內囊-GPi、內囊-尾狀核、深層白質、皮質下WM及皮質、豆狀核殼以及顳葉皮質下WM及皮質中之解剖學位置。
圖135係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在深層灰質、深層WM(前腦室周圍及皮質下)及皮質下白質及皮質-淺表矢狀位中之解剖學位置。
圖136係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在胼胝體及胼胝體周皮質下WM、深層皮質下WM、深層灰質、腦室周圍WM、皮質下WM及海馬中之解剖學位置。
圖137係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在胼胝體及深層WM中之解剖學位置。
圖138係實例性圖解，其顯示腦鑽孔在皮質下WM-枕葉及小腦白質(包括齒狀核)(WM)中之解剖學位置。
圖139A-G展示重組人類芳基硫酸酯酶A(ASA)在自投與媒劑、1.8 mg rhASA或18.6mg rhASA之成年及幼年食蟹猴之腦組織所提取組織之鑽孔中之濃度。圖139A-G中之每一者對應於圖134中所繪示腦組織之區域。
圖140A及圖140B係實例性圖解，其顯示在腦脊髓膜內(IT)或大腦室內(ICV)投與rhASA之成年及幼年食蟹猴之深層白質(圖140A)或深層灰質(圖140B)腦組織中檢測到之重組人類芳基硫酸酯酶A(ASA)之濃度比較。
圖141A係實例性圖解，其顯示在得自IT投與18.6 mg或1.8 mg劑量之重組人類芳基硫酸酯酶A(rhASA)之幼年(<12個月齡)食蟹猴之若干個組織鑽孔中檢測到之ASA濃度。如圖140A-B二者中所示，遞送至該等組織之ASA之濃度在2.5 ng/mg rhASA之目標治療濃度以內或超過該目標治療濃度。腦組織中對應於圖140A及圖140B中所繪示每一鑽孔編號之解剖學區域係：皮質下白質(1)；腦室周圍白質及深層白質(2)；皮質下白質(3)；皮質下白質(4)；內囊(5)；內囊尾狀核(6)；深層白質(7)；皮質下白質及皮質(8)；豆狀核殼(9)；顳葉皮質下白質及皮質(10)；深層灰質(11)；深層灰質(12)；前腦室周圍及皮質下(13)；皮質下白質，皮質淺表鐮旁(14)；胼胝體及胼胝體周皮質下白質(15)；深層皮質下白質(16)；深層灰質(17)；深層灰質(18)；腦室周圍白質(19)；深層皮質下白質(20)；海馬(21)；胼胝體(22)；深層白質(23)；皮質下白質，枕葉(24)；及小腦白質(25)。
圖142A展示自IT投與1.8 mg ASA之食蟹猴提取之深層白質組織區域。圖142B展示深層白質組織之免疫染色及ASA在相關細胞中之分佈。在圖142B中，蛋白質(ASA)展示於右下框中。圖142C展示IT投與之ASA在食蟹猴之深層白質組織中且具體而言在溶酶體中顯示細胞器共定位。在圖142C中，ASA免疫染色展示於左上框中。
圖143在將124I標記芳基硫酸酯酶A(ASA) IT-或ICV-投與食蟹猴後24小時使用PET掃描比較該經標記ASA。
圖144展示124I標記ASA在剛ICV投與食蟹猴後之分佈，且比較IT投與之124I標記ASA在2-5小時內之分佈。如圖所示，IT投與將124I標記ASA遞送至與ICV投與所示相同之初始房室(池及脊柱近端)中。
圖145繪示小鼠模型中之實例性ICV及IT投與。
圖146A繪示實例性結果，其展示在6個月之給藥後，在1.5、4.5及8.3 mg劑量下HNS隨時間而變之CSF濃度。圖146B詳述實例性結果，其展示在猴子中在經6個月IT投與1.5、4.5及8.3 mg劑量後，抗HNS抗體在CSF中之濃度。顯示組合之雄性及雌性之數據。圖146C詳述實例性結果，其展示在猴子中在6個月之給藥後，在經6個月IT投與1.5、4.5及8.3 mg劑量後，抗HNS抗體在CSF中之濃度。顯示組合之雄性及雌性之數據。自曲線中排除8.3 mg HNS之IT第6次給藥後之兩個最高濃度(32,205 ng/mL及15,467 ng/mL)，此乃因在第6次給藥之前未取CSF試樣。
圖147繪示實例性結果，其展示來自經蘇木素及伊紅染色腦脊髓膜及腦實質之組織切片之代表性影像。圖147A繪示實例性結果，其展示在DC猴中侷限於IT導管之嗜中性浸潤之低放大率視圖。圖147B繪示實例性結果，其展示在高劑量(8.3 mg/劑量)猴子腦脊髓膜中嗜伊紅白血球浸潤之高放大率視圖；浸潤之總體嚴重程度與中等劑量(4.5 mg/劑量)群組(未顯示)類似。圖147C繪示展示低劑量(1.5 mg/劑量)猴子之高放大率視圖之實例性結果，其顯示血管周間隙(腦實質)中之嗜伊紅白血球。圖147D繪示展示低劑量猴子(1.5 mg/劑量)之實例性結果，其顯示血管周間隙及鄰接實質中之嗜伊紅白血球。圖147E繪示實例性結果，其展示低劑量群組動物脊髓實質中之嗜伊紅白血球(藉由箭號來指示)；該區域中之神經元正常。圖147F繪示實例性結果，其展示低劑量(1.5 mg/劑量)猴子之嗜伊紅白血球及小神經膠質細胞增生區域(箭號指示嗜伊紅白血球；框指示小神經膠質細胞增生區域)。該區域中存在若干較大神經元，其皆正常。比例尺為200 μm。
圖148繪示實例性結果，其展示HNS在猴脊髓及腦中之酵素活性。圖148A/B繪示實例性結果，其展示在(A)雄性及(B)雌性猴子脊髓中之活性。薄片-3=腰椎，薄片3、6=胸部，且薄片9=頸部；0=導管尖端。圖148C/D繪示實例性結果，其展示HNS在(C)雄性及(D)雌性猴子腦中之活性。將薄片自頭端至尾端進行編號(3至15)。所有組織試樣皆係在最後劑量後約24小時或在最後劑量後4週(對於恢復後動物)採集。DC，裝置對照。數據代表每個治療群組中n=4只猴子之平均值±SEM。
圖149繪示實例性結果，其展示在猴腦及肝中之酵素活性。圖149A繪示實例性結果，其展示HNS活性在高劑量(8.3 mg/劑量)群組猴腦中之分佈。顯示腦表面、深層及極深層(腦室周圍)區域之活性倍數變化與內源性程度(DC群組)之比較。所有組織試樣皆係在最後劑量後約24小時或在最後劑量後4週(對於恢復後動物)採集。數據代表n=6只猴子(兩種性別)中腦薄片6及9之平均值±SEM。有兩隻猴子之數據未包括，此乃因在屍體剖檢時發現導管未開放。圖149B顯示HNS在猴肝中之活性。所有組織試樣皆係在最後劑量後約24小時或在最後劑量後4週(對於恢復後動物)採集。DC，裝置對照。Rec，恢復後。數據代表除了低劑量(4.5 mg/劑量)雌性群組(n=3)外，每個治療群組中n=4只猴子之平均值±SEM。
圖150繪示實例性結果，其展示在幼年食蟹猴小腦：3個月之中間隊列中之HNS定位。圖150A繪示實例性結果，其展示媒劑對照動物(0 mg/劑量)小腦對HNS免疫染色呈陰性；20x放大倍數。圖150B繪示實例性結果，其展示低劑量(1.5 mg/劑量)動物小腦顯示僅限於分子層之最低陽性染色；20x放大倍數。圖150C繪示實例性結果，其展示中等劑量(4.5 mg/劑量)動物小腦在外顆粒層中顯示最低染色；20x放大倍數。圖150D繪示實例性結果，其在高劑量(8.3 mg/劑量)動物小腦(包括分子層、外顆粒層及普爾欽細胞)中展示中度染色；20x放大倍數。
圖151繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後最初20分鐘內，將HNS在頭部區域中之濃度對時間作圖。
圖152繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在腦中之濃度對時間作圖。
圖153繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在腦區中之濃度對時間作圖。
圖154繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在頭部區域中之濃度對時間作圖。
圖155繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在脊柱近端中之濃度對時間作圖。
圖156繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在脊柱中部中之濃度對時間作圖。
圖157繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在脊柱遠端中之濃度對時間作圖。
圖158繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在肝中之濃度對時間作圖。
圖159繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS在腦中之濃度對時間作圖(個體(上圖)及平均值±SD(下圖))。
圖160繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之肝臟濃度對時間作圖(個體(上圖)及平均值±SD(下圖))。
圖161繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之腎濃度對時間作圖(個體(上圖)及平均值±SD(下圖))。
圖162繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之心臟濃度對時間作圖(個體(上圖)及平均值±SD(下圖))。
圖163繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之皮膚濃度對時間作圖(個體(上圖)及平均值±SD(下圖))。
圖164繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之腦濃度對時間作圖(上圖)，且繪示腦中非房室PK參數之比較(下圖)。
圖165繪示實例性研究，其中在以1及10 mg/kg IT給予124I-HNS後，將HNS之肝濃度對時間作圖(上圖)，且繪示肝中非房室PK參數之比較(下圖)。
圖166展示使用來自正常人類之實例性一級成纖維細胞進行rhNaglu及Naglu-IGFII之細胞內在化研究。rhNaglu之細胞吸收極低，而Naglu-IGFII之細胞吸收非常顯著。Naglu-IGFII內在化之飽和曲線顯示受體介導吸收。此吸收受IGFII抑制，但不受甘露糖-6-磷酸鹽抑制。
圖167繪示使用B型聖菲利波個體之成纖維細胞(GM01426)之實例性共焦顯微術研究之結果。觀察到Naglu-IGFII之廣泛內在化，以及Naglu-IGFII與Lamp-1之共定位。
圖168係實例性圖解，其顯示Naglu在野生型(WT)、Naglu-/-(KO)及雜合體Naglu+/-(Het)小鼠中之活性。在B型聖菲利波小鼠之腦、肝、腎及脾中觀察到Naglu完全缺陷。
圖169繪示小鼠腦之俯視圖及側視圖以指示腦池內注射(IC)位點及用於組織學分析之切片平面。中間顯微照片係以1x大小觀察之小鼠腦橫切片。加框區域指示底部顯微照片中4x顯微影像之範圍。底部顯微照片係組織學載玻片之4x影像。框A及B指示圖170及圖171中40x顯微影像之範圍。
圖170繪示在腦池內注射(IC)後7天時，B型聖菲利波小鼠中大腦皮質之實例性免疫組織化學(40x)。rhNaglu及Naglu-IGFII二者在神經元以及在神經膠質細胞中皆呈現廣泛細胞吸收，且兩種蛋白質之間之分佈及細胞吸收模式極為類似。(抗人類Naglu單株抗體)。
圖171繪示對大腦皮質之實例性LAMP-1免疫染色(40x放大倍數)。與野生型小鼠腦相比，觀察到溶酶體貯積增加在媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中，如增加之LAMP-1免疫染色陽性點所示。rhNalgu及Naglu-IGFII治療之B型聖菲利波小鼠二者之腦呈現與wt小鼠極為類似之溶酶體貯積減少。
圖172A展示在IT投與Naglu之Naglu缺陷型小鼠白質組織中，相對於投與媒劑之相同Naglu缺陷型小鼠，細胞空泡形成廣泛降低。圖172B展示在腦脊髓膜內投與Naglu之Naglu缺陷型小鼠白質組織中，相對於投與媒劑之相同Naglu缺陷型小鼠，溶酶體相關膜蛋白1(LAMP1)免疫染色顯著降低。
圖173以定量方式展示並相對於野生型及投與媒劑之Naglu缺陷型小鼠二者比較在投與Naglu之Naglu缺陷型小鼠大腦皮質、尾狀核及豆狀核殼(CP)、丘腦(TH)、小腦(CBL)及白質(WM)中量測之LAMP濃度。在經7天時程腦脊髓膜內投與三種劑量之Naglu(圖173A)後，所分析腦組織每一區域中之LAMP陽性區域相對於經兩週時程投與兩種劑量之Naglu(圖173B)進一步減少。
圖174展示在此圖中使用人類CNS之實例性正中矢狀位解剖學簡圖作為參照來顯示在wt插管大鼠中之IT注射位點。箭號指示IT注射在脊髓及大腦皮質區域中之大致解剖學位置，其中取組織用於免疫組織化學研究。
圖175展示在IT注射後腦中之實例性Naglu活性。在注射Naglu-TAT及Naglu-IGFII之wt大鼠中，Naglu活性顯著較高。(在腦脊髓膜內注射後大鼠中之腦平均naglu活性SFB.05.09)
圖176繪示在IT注射後24hr對經rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFII、Naglu-kif及PerT-Naglu治療之wt插管大鼠中大腦皮質之實例性Naglu免疫染色(20x)。Naglu-IGFII係唯一在腦實質中呈現充分廣泛分佈之蛋白質。在Naglu-IGFII治療大鼠中，神經元及神經膠質細胞之細胞吸收亦顯著。另一方面，在rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu kif及PerT-Naglu治療群組中，蛋白質留在腦脊髓膜(M)中。
圖177繪示圖176中所選載玻片之實例性高放大倍數圖。上圖顯示在rhNaglu治療wt插管大鼠中，rhNaglu留在腦脊髓膜(M)處，在腦實質中未發現陽性染色。下圖顯示在 Naglu-IGFII治療wt插管大鼠中，在腦實質中觀察到良好廣泛分佈，且在神經元及神經膠質細胞中觀察到細胞吸收。
圖178展示在最後IT注射後24hr，實例性Naglu在腦及肝中之活性。在三個治療群組中，Naglu在腦中之活性未顯示顯著差異，Naglu在肝中之活性亦係如此。此結果表明，在腦及肝中檢測到之Naglu活性主要係由於最後注射所致，該最後注射係在屠宰前24hr進行。(在IT注射Naglu-IGFII後Naglu KO小鼠中之平均活性SFB.02.10)
圖179展示在IT注射Naglu-IGFII後，腦及肝中之實例性總GAG含量。媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中之總GAG呈現進行性增加，此反映隨B型聖菲利波小鼠衰老出現之積聚效應。在3x注射群組中觀察到腦中之GAG出現統計學上顯著之降低(p<0.05)。在2x及3x注射群組中亦觀察到肝中之GAG出現統計學上顯著之降低(p<0.05)。肝中GAG含量之變化快於且大於腦中，且在針對亨特氏症候群IT遞送I2S中亦觀察到此現象。(在IT注射Naglu-IGFII後Naglu KO小鼠中之總GAG濃度SFB.02.10)
圖180繪示在IT注射後，Naglu在B型聖菲利波小鼠腦中之實例性生物分佈。Naglu免疫螢光染色揭示腦脊髓膜(M)及腦實質上之Naglu-IGFII蛋白質。在2x及3x注射群組中觀察到細胞吸收。G：神經膠質細胞。
圖181係實例性圖解，其顯示小鼠腦之冠狀切片。框指示LAMP-1免疫染色照片取自何處。為顯示蛋白質分佈及功效之程度，選擇大腦皮質及皮質下組織(例如尾狀核、丘腦及白質)進行LAMP-1免疫染色。
圖182係實例性圖解，其以40x放大倍數顯示大腦皮質之LAMP-1免疫染色。與野生型小鼠腦相比，在媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中觀察到溶酶體貯積增加，如增加之LAMP-1免疫染色陽性點所示。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。
圖183係實例性圖解，其顯示尾狀核(皮質下核)之LAMP-1免疫染色(40x)。與在大腦皮質中所觀察到者類似，在媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中觀察到溶酶體貯積增加，如增加之LAMP-1免疫染色陽性點所示。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。
圖184係實例性圖解，其顯示丘腦(間腦核)之LAMP-1免疫染色(40x)。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸降低，以及3x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點之尺寸及數量降低。
圖185係實例性圖解，其顯示白質之LAMP-1免疫染色(40x)。神經元軸突纖維之縱向軌跡可區分圖181-184中所示之白質與灰質。然而，與野生型小鼠相比，在媒劑治療B型聖菲利波小鼠腦中可觀察到相同模式之溶酶體貯積增加。在Naglu-IGFII IT注射後溶酶體貯積之降低表現為2x及3x注射治療之B型聖菲利波小鼠腦中陽性點尺寸之降低及數量之減少。
圖186係實例性圖解，其顯示小腦皮質之LAMP-1免疫染色。小腦皮質之形態表現為密集聚集之顆粒神經元、細胞過少分子層及該顆粒神經元與該分子層之間之普爾欽神經元單層。藉由較大細胞質及少量突入分子層中之樹突來鑑別普爾欽神經元。
圖187係實例性圖解，其顯示腦、脊髓及肝中之Naglu染色。在腦及脊髓中，僅在腦脊髓膜(M)中藉由IHC檢測到注射Naglu，且在任何其他區域中皆未檢測到Naglu陽性染色。在肝中，竇狀隙細胞(S)呈Naglu陽性且在肝細胞(H)中未發現Naglu吸收。
圖188係實例性圖解，其顯示肝及脊髓之LAMP免疫染色及H & E染色。與媒劑動物相比，LAMP染色在整個經Naglu治療之肝及脊髓二者中皆有所降低。H & E染色顯示，肝細胞中之細胞空泡形成在治療群組中相對於媒劑治療動物有所降低。
圖189A及圖189B係實例性圖解，其顯示在經3個月6次每隔一週(EOW) IT注射Naglu後，腦之H & E染色及腦之形態改良。在經治療腦中，細胞空泡形成(箭號)在所有檢查區域中相對於媒劑群組皆有所降低。
圖190A及圖190B係實例性圖解，其顯示在經3個月6次IT Naglu注射後，不同腦區中之LAMP免疫染色。與媒劑治療群組相比，IT投與B型聖菲利波小鼠之Naglu可使溶酶體活性在LAMP免疫染色所揭示之所有檢查區域中降低。此降低之特徵在於LAMP陽性細胞之數量減少、細胞尺寸減小且染色變淡。在小腦及腦幹(其位於腦中接近脊髓之尾狀部分中)中發現相對於其他腦區顯著降低。亦在包括白質、海馬及丘腦之深層腦區中發現顯著降低。
圖191A及圖190B係實例性圖解，其顯示在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之Iba IHC，其揭示小神經膠質細胞之激活。與媒劑治療群組相比，在Naglu治療群組中未觀察到陽性細胞數量及染色強度降低。然而，在所有檢查腦區中，與媒劑群組(插圖)中之較大且形成空泡之細胞相比，陽性小神經膠質細胞之細胞形態變化且細胞尺寸減小。
圖192A及圖192B係實例性圖解，其顯示在經3個月6次IT Naglu注射後，各腦區中之GFAP IHC，其揭示星形細胞激活。與媒劑治療群組相比，GFAP陽性染色在小腦及腦幹中有所降低，且在其他檢查區域中略有降低。
(無元件符號說明)

Claims (6)

  1. 一種包含溶酶體酵素之替代酵素的組合物之用途，其係用於製備供向患有或易患與溶酶體酵素之含量或活性降低有關之溶酶體貯積症的個體之經腦脊髓膜內投與之藥物，其特徵在於該酵素係以至少5mg/ml之濃度且以至少10mg之劑量存在於組合物中，其中該組合物包含至多為50mM之磷酸鹽。
  2. 如請求項1之用途，其中該組合物具有大約3.0-8.0之pH值。
  3. 如請求項1之用途，其中該組合物包含一或多種(i)緩衝劑、(ii)表面活性劑或(iii)滲透壓調節劑(tonicifier)。
  4. 如請求項1之用途，其中該組合物係以小於5mL之單次劑量體積投與。
  5. 如請求項1之用途，其中該組合物之腦脊髓膜內投與不會在該個體中引起實質不良效應。
  6. 如請求項1之用途，其中該組合物之腦脊髓膜內投與不會引起適應性T細胞介導之免疫反應。
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