UA121663C2 - Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих - Google Patents
Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих Download PDFInfo
- Publication number
- UA121663C2 UA121663C2 UAA201704657A UAA201704657A UA121663C2 UA 121663 C2 UA121663 C2 UA 121663C2 UA A201704657 A UAA201704657 A UA A201704657A UA A201704657 A UAA201704657 A UA A201704657A UA 121663 C2 UA121663 C2 UA 121663C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- protein
- plant
- insecticidal protein
- engineered insecticidal
- engineered
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 329
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 320
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 75
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 title 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 185
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 96
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 88
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 45
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 43
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims abstract description 40
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 24
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 3
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 claims description 3
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 296
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 134
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 55
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 22
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 21
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 19
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 19
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 19
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 19
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 description 18
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 17
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 17
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 17
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 17
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 17
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 17
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 17
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 15
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 14
- 241001414720 Cicadellidae Species 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 description 8
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 8
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 8
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 8
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 6
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000346285 Ostrinia furnacalis Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000255901 Tortricidae Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 4
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 4
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 4
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 3
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 3
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000256682 Peregrinus maidis Species 0.000 description 3
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 3
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 3
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 3
- 230000019637 foraging behavior Effects 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 2
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 241001572697 Earias vittella Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000000047 Gossypium barbadense Species 0.000 description 2
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 description 2
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000111261 Mucuna pruriens Species 0.000 description 2
- 235000008540 Mucuna pruriens var utilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 2
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 description 2
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 description 2
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 description 2
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 description 2
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 description 2
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 description 2
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 2
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 2
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 2
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 2
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 2
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- -1 organophosphates Chemical class 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 description 2
- 241000254032 Acrididae Species 0.000 description 1
- 241000107983 Aleyrodes proletella Species 0.000 description 1
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 241001629128 Alnetoidia alneti Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 101100378707 Caenorhabditis elegans air-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000009852 Cucurbita pepo Nutrition 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 241001641949 Desmia funeralis Species 0.000 description 1
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 1
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 1
- 241001095202 Ecdytolopha fabivora Species 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 235000016623 Fragaria vesca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 235000011363 Fragaria x ananassa Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000603223 Homo sapiens Nischarin Proteins 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000006550 Liquidambar Nutrition 0.000 description 1
- 241000208682 Liquidambar Species 0.000 description 1
- 241000659518 Lozotaenia capensana Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001647769 Mirza Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100038995 Nischarin Human genes 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 1
- 241001236219 Pinus echinata Species 0.000 description 1
- 235000005018 Pinus echinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017339 Pinus palustris Nutrition 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000256626 Pterygota <winged insects> Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 241000221987 Russula Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000563489 Sesamia inferens Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 241001191022 Sphenophorus levis Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 244000128884 Zier Kohl Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N bioresmethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OCC1=COC(CC=2C=CC=CC=2)=C1 VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007711 cytoplasmic localization Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003031 feeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000007919 giant pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 244000155489 giant pumpkin Species 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000002129 infrared reflectance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N loratadine Chemical compound C1CN(C(=O)OCC)CCC1=C1C2=NC=CC=C2CCC2=CC(Cl)=CC=C21 JCCNYMKQOSZNPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007758 mating behavior Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000005382 thermal cycling Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 230000009417 vegetative reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013466 vegetative reproduction Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
Abstract
Винахід стосується сконструйованого інсектицидного білка, який має інгібіторну активність відносно видів комах ряду Lepidoptera. Винахід також стосується полінуклеотиду, який кодує сконструйований інсектицидний білок, клітини-хазяїна, яка містить полінуклеотид, композиції, яка має інгібуючу активність відносно комах, насіння, трансгенної клітини рослини, товарного продукту, рекомбінантної полінуклеотидної молекули, молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, способу боротьби з лускокрилим шкідником та способу отримання насіння.
Description
(54) СКОНСТРУЙОВАНИЙ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК, ЯКИЙ МАЄ АКТИВНІСТЬ ПРОТИ ЛУСКОКРИЛИХ (57) Реферат:
Винахід стосується сконструйованого інсектицидного білка, який має інгібіторну активність відносно видів комах ряду Герідоріега. Винахід також стосується полінуклеотиду, який кодує сконструйований інсектицидний білок, клітини-хазяїна, яка містить полінуклеотид, композиції, яка має інгібуючу активність відносно комах, насіння, трансгенної клітини рослини, товарного продукту, рекомбінантної полінуклеотидної молекули, молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, способу боротьби з лускокрилим шкідником та способу отримання насіння.
ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕННІ ЗАЯВКИ
І0001) Ця заявка заявляє пріоритет за попередніми заявками США 62/064994, поданої 16 жовтня 2014 року і 62/065017, поданої 17 жовтня 2014 р., які включені в повному обсязі в цей документ шляхом посилань.
ВКЛЮЧЕННЯ ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
І0002| Форма переліку послідовностей для машинного зчитування подана в електронному вигляді. Перелік послідовностей, включений шляхом посилання в повному обсязі, міститься у файлі, створеному 13 жовтня 2015 року, з ім'ям файлу РЗ34223ММ000 5ЕО РСТІХІ і розміром 327235 байт (виміряно в операційній системі М5-УМіпдом/5Ф)).
ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ
І0003)| Винахід в цілому відноситься до області білків, які здійснюють інгібуючу дію на комах.
Розкривається новий клас сконструйованих білків, які проявляють інсектицидну ингібуючу активність проти сільськохазяїнських шкідників сільськохазяїнських культур і насіння. Зокрема, розкритий клас сконструйованих інгібуючих білків, які мають інсектицидну активність по відношенню до лускокрилих комах-шкідників. Передбачені рослини, частини рослин і насіння, що містять полінуклеотидний конструкт, який кодує один або більше розкритих сконструйованих інгібуючих білків.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
(0004) Неїїсомегра 7єа є характерним лускокрилим шкідником основних сільськохазяїнських культур, включаючи кукурудзу, бавовник і сою. Відомий як кукурудзяна совка (СЕМУ), бавовняна совка (СВУМ) і коробковий черв'як (5РУМ), цей вид багатоядних комах особливо важко контролювати за допомогою інсектицидних білків Васійи5 ІПигіпдіеп5іє (В) або інших видів бактерій. Н. 7еа вважається схильним до ризику розвитку резистентності до сучасних способів контролю комах, з огляду на його здатність харчуватися безліччю різних культур і відсутність в цей час стратегії контролю високих доз. Відповідно, необхідні нові способи впливу (СВ) для забезпечення довговічності трансгенних рослин, захищених від пошкодження в результаті харчування Н. 7еа. 0005) Білок Стуїбра1 є лускокрило-активним білком, який був вперше описаний Нопйе, еї аї. "МисіІеоїїде зедиепсе апа дедисед атіпо асій зедоепсе ої а пем/ І ерідорієга-х5ресіїіс сгувзіаї ргоївіп депе їйот Васійи5 (пигіпдіеп5і5." Мисіеіс Асід5 Ке5. 18(18) (1990): 5545. Цей білок проявляє відмінну інсектицидну активність по відношенню до видів роду Зродорієега, включаючи зродоріега Ігидірегда (кукурудзяну листову совку, ЕАММ), шкідника деяких просапних культур, включаючи кукурудзу, бавовник і сою. Однак Сгтгу!Ора!1 проявляє низьку або помірну активність по відношенню до цілого ряду інших основних комах-шкідників, включаючи бавовняну сойку (наприклад, Неїїсомегра агтідега і Н. 7еа), вогнівок (наприклад, О5ігіпіа пибіадйв5 і Оіаїгаєа дгапаїіозеїІа) і соєву совку (Рзецйдоріивіа іпсіцдеп5). Через його вузький інсектицидний спектр та його нездатності забезпечити комерційний захист від ряду важливих лускокрилих сільськохазяїнських шкідників, таких як СЕМУ, інсектицидний білок Сгуї!Оа! має обмежене значення як ознака боротьби з комахами в трансгенних рослинах. В результаті ніякі сучасні комерційні сорти культур, захищені від комах, не використовують Сту!Оаї як включений в рослину засіб захисту. (0006) Незважаючи на свій вузький інсектицидний спектр, Сту1ба!1 є цікавим інсектицидним білком, тому що здається, що білок Сгтуїра!1 використовує альтернативні СВ для боротьби з деякими комахами-шкідниками. Доказом цього служать дослідження колоній комах з множинною стійкістю. Наприклад, отримані з поля колонії РішепПа хуїозіеїІа (капустяної молі) та
Ресііпорпога доззурієЇа (бавовняної молі), які стійкі до інтоксикації СтутАс, зберігають повну чутливість до білка Сгу!Оаї1 (Табазнппік еї аї. "Сто55-Вевзівїапсе ої Ріпк ВоЇмогт (Ресііпорнога доззурієіа) то Васі игіпдіепвіє їохіп5. " Аррі. Епмігоп. Містобіої. 6б (2000). 4582-4584;
Табавнпік, еї а. "Сто55-Невівіапсе ю ВасіПйи5 Іпигіпдіеєпвів Тохіп Стуїда іп а 5ігаіп ої Оіатопабаск
Моїй Адарієй юю Апіїїсіа! Оівї" 9. Іпмей. Раїйої. 76: 2000: 81-83. Ці дані свідчать про те, що
Стуїба1 розпізнає рецептори середньої кишки лускокрилих, відмінні від тих, які розпізнаються лускокрило-активними білками, які в цей час впроваджені в трансгенні сільськохазяїнські культури, включаючи СтутАс, СтутАр, СтутА.105, СтуїРБа, Сгу2Аєе і Сту2АБ2. У світлі цього очевидного нового СВ оптимізація Стгу!Оа1-подібних білків для поліпшення активності проти більш широкого спектра видів роду Неїїсомегра при збереженні або збільшенні їх інсектицидної активності по відношенню до видів роду Зродорієга могла б створити включений в рослини, високоякісний захист для боротьби з резистентністю комах.
КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І0007| У цьому винаході ідентифіковані декілька варіантів амінокислотних послідовностей 60 каркасних білків ТІС844 і Сту!ба, які проявляють помітно поліпшену активність (у порівнянні з нативним токсином Стгу!їОа!) по відношенню до Н. 7еа, зберігаючи при цьому відмінну активність по відношенню до 5. їШидірегада. Покращені варіанти ТІС844 і Стуїра були розроблені, для експресії в сільськохазяїнських рослинах (наприклад, кукурудзі, сої, бавовнику, цукровій тростині), і надають нові варіанти для управління стійкістю іп ріапіа (в рослині) і боротьби з комахами-шкідниками в силу очевидного унікального способу впливу СтуїМра в поєднанні з поліпшеною активністю проти Н. 7еа. 0008) Розкриті в цьому документі сконструйовані токсичні білки лускокрилих (звані в цьому документі «сконструйовані білкові токсини», «сконструйовані токсичні білки» або «сконструйовані інсектицидні білки») є похідними природного інсектицидного токсину Васійи5 10. Шигіпдієпві5 Сту!Обаї! (ЗЕО ІО МО: 2) або химерного гомолога Стгу1ра!, ТІС844 (ЗЕО ІЮО МО: 14), які містять основний токсин СтуїОа!1!, але мають замінений протоксин СтгулАрБЗ на нативний
СтуїОа1-протоксиновий домен. Сконструйовані інсектицидні білки за цим винаходом кожен містить щонайменше одну амінокислотну заміну, одне амінокислотне приєднання або одну амінокислотну делецию в порівнянні з каркасними білками, представленими в будь-якій з ЗЕО
ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 14. Сконструйовані інсектицидні білки за цим винаходом є особливо токсичними для комах видів Неїїсомегра 7єа (кукурудзяна совка, бавовняна совка, коробковий черв'як) і Зродорієга їгидірегаа (кукурудзяна листова совка). Хоча каркасні білки ТІС844 (З5ЕО ІЮ
МО: 14) ї СтуїОраї (5ЕО ІО МО: 2) проявляють низьку токсичність по відношенню до Н. 7еа, інсектицидні білки, запропоновані в цьому винаході, мають дивовижну і несподівано поліпшену інсектицидну активність і поліпшений інсектицидний спектр проти лускокрилих комах-шкідників, включаючи Н. 7єа.
ІЇ0009| У деяких варіантах реалізації винаходу запропонований інсектицидний білок, що містить амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій з «ФЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІО МО: 40,
ЗЕО ІО МО: 12, БЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО
ІО МО: 16, 5ЕО ІО МО: 18, 5ЕО І МО: 20, 5ЕО 10 МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 24, 5ЕО ІО МО: 32, 5ЕО
ІО МО: 34, ЗЕО ІЮО МО: 36, ЗЕО ІЮО МО: 38 або 5ЕО ІО МО: 42, або її фрагмент, що має інгібуючу активність по відношенню до комах. У деяких варіантах реалізації винаходу інсектицидний білок проявляє інгібуючу активність по відношенню до видів комах ряду Іерідорієга (Лускокрилі).
Види лускокрилих шкідників, які мають негативний вплив на сільське хазяїнство, включають, без обмеження, кукурудзяну листову совку (Зродорієега ігидірегаа), совку малу (Зродорієга ехідца), совку латукову (Матебзіга сопіїдигага), совку-іпсилон (Адгоїї5 ірзіп), совку капустяну (Ттіспоріизіа пі), соєву совку (Спгузодеїхі5 іпсіцдеп5), совку оксамитових бобів (Апіїсагвіа деттаїгаїй5), совку конюшинову (Нурепа з5сабга), тютюнову листовійку (Неїоїпів міге5сеп5), совку бавовняну (Адгоїї5 з,ибіеггапеа), совку лугову (Рзецдаїейа ипірипсіа), совку прямокутну (Адгоїї5 огпподопіа), метелика стеблового кукурудзяного (О5ігіпіа пибрііаій5), метелика-вогнівку (Атуеїоі5 їгапзіїеПа), кукурудзяну вогнівку (Статбриз саїїдіпозеПи5), лугового метелика (Негредгатта
Іїсаг:ізаїї5), вогнівку соняшникову (Нотоеозота еїесіеПшт), точильника зернового кукурудзяного (Еіаєтораїрих ІмщдпозеїПйи5), плодожерку яблуневу (Судіа ротопеїа), листовійку виноградну (Епдоріла міеапа), листовійку східну персикову (Сгарпоїйа тоїевіа), листовійку брунькову соняшнику (Зцівїта Пеїйап(папа), капустяну моль (Рішейа хуЇозіейа), рожевого коробкового хробака (Ресііпорпога доззуріейа), рожеву стеблову совку (безатіа іптегеп5), шовкопряда непарного (Гутапіга аїзраг), совку бавовняну американську (АіІабата агойасеа), листовійку плодових дерев (АгсПпір5 агдугозрііа), листовійку різану золотисту (Агопір5 гозапа), вогнівку азіатську стеблову або вогнівку жовту рисову (Спо зирргеззаїї5), листовійку рисову (Спарпаосгосі5 тедіпаїї5), кукурудзяну вогнівку (Статриз саїїдіпозеПи5), метелика трав'яного (Статрих еїегтеїйи5), вогнівку кукурудзяну південно-західну (Оіаїгаєа дгапаїйозейа), вогнівку цукрової тростини (Оіаїгаєа засспагаїй5), совку бавовняну єгипетську (Еагіах5 іп5ціапа), совку плямисту (Еагіа5 мійеїйа), совку американську (Неїїсомегра агтідега), совку бавовняну або американську кукурудзяну совку (Неїїсомегра 7еа), лугового метелика (Негре(одгатта
Ісагвізаї5), гронову листовійку (І обезіа Броїгапа), цитрусового мінуючого метелика (РпуПоспівіів5 сіїгеПа), білявку капустяну (Рієгі5 ргаз5ісає), репніцу або білявку ріпняну (Ріегі5 гарає), азіатську бавовникову совку або азіатську бавовняну совку (Зродорієга Ійига) і пасльонового мінера (Тиша арзоїша).
ІЇО0О10| Також в цьому документі розкритий полінуклеотид, що кодує сконструйований інсектицидний білок або його фрагмент, що має пестицидну активність, причому полінуклеотид функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, а сконструйований інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій з «ФЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІО МО: 40,
ЗЕО ІО МО: 12, БЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО
ІО МО: 16, БЕО ІО МО: 18, 5ЕО І МО: 20, 5ЕО 10 МО: 22, 5ЕО І МО: 24, 5ЕО ІО МО: 32, 5ЕО 60 ІО МО: 34, БЕО ІЮО МО: 36, 5БЕО ІО МО: 38 або 5ЕО ІО МО: 42.
І0О011) В іншому варіанті реалізації винаходу, в цьому документі розкритий полінуклеотид, який кодує сконструйований інсектицидний білок, причому полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка необов'язково гібридизується в жорстких умовах із зворотним комплементом полінуклеотидної послідовності, зазначеної в будь-якій з ФЕО ІЮ МО: 43, 5ЕО ІЮО МО: 39, 5ЕО ІЮ
МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО І МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО І МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІЮО МО: 21, 5ЕО І МО: 23, 5ЕО ІЮ МО: 31,
ЗЕО ІЮ МО: 33, 5ЕО ІЮО МО: 35, 5ЕО ІЮО МО: 37 або 5ЕО ІО МО: 41; або кодує сконструйований інсектицидний білок, що містить амінокислотну послідовність, зазначену в будь-якій з ЗЕО ІЮ
МО: 44, 5ЕО ІЮ МО: 40, 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮ МО: 4, БЕО І МО: 6, 5ЕО І МО: 8,5ЕО1ІЮ МО: 10, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО І МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО І МО: 22, 5ЕО ІЮ МО: 24,
ЗЕО ІЮ МО: 32, ЗЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮО МО: 36, ЗЕО ІЮ МО: 38 або ЗЕО ІЮ МО: 42.
І0012| Також в цьому документі запропонована клітина-хазяїн, що містить полінуклеотид, представлений в будь-якій з ФЕО ІЮ МО: 43, ЗЕО ІЮ МО: 39, 5ЕО ІЮО МО: 11, 5ЕО ІЮО МО: 11, 5ЕО
ІО МО: 25, 5ЕО І МО: 3, 5ЕО І МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 15, 5ЕО І МО: 17, ЗЕО ІО МО: 19, 5ЕО ІО МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 23, 5ЕО ІЮ МО: 31, 5ЕО ІО МО: 33, 5ЕО ІЮ МО: 35, ЗЕО ІЮО МО: 37 або ЗЕО ІЮ МО: 41, причому клітина-хазяїн вибрана з групи, що складається з бактеріальної клітини-хазяїна або рослинної клітини-хазяїна. Розглянуті бактеріальні клітини- хазяї включають бактеріальні клітини-хазяї, вибрані з групи, що складається з Адгобасіегішт,
Впі2оБішт, Васіїи5, Вгемірасійи5, Ебспегіспіа, Рзейдотопав, КіІерзієПа, ії Егміпіа, причому вид роду ВасйШи5 являє собою ВасіШи5 сегеи5 або Васійи5 (Шигіпдіепві5, зазначений Вгемібасійи5 являє собою Вгемібасійн5 Іа(егозрегоцй5, а зазначена Е5сПегіспіа являє собою ЕзспПегіспіа сої.
Крім того, передбачувані рослинні клітини-хазяї включають однодольні або дводольні рослини.
ЇО013| У ще одному варіанті реалізації винаходу запропонована композиція, яка має інгібуючу активність по відношенню до комах, що містить сконструйований інсектицидний білок, який містить амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій з «ЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО І
МО: 40, 5ЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО І МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО І МО: 10, 5ЕО ІО МО: 16, 5ЕО ІО МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО І МО: 24, 5ЕО І МО: 32, ЗЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮО МО: 36, ЗЕО ІЮО МО: 38 або 5ЕО ІО МО: 42, або її фрагмент, що має інгібуючу активність по відношенню до комах. Передбачається, що ця композиція, яка має інгібуючу активність по відношенню до комах може додатково містити щонайменше один агент, який має інгібуючу активність по відношенню до комах, відмінний від сконструйованого інсектицидного білка. Розглянуті агенти, які мають інгібуючу активність по відношенню до комах, включають білок, що має інгібуючу активність по відношенню до комах, молекулу ддРНК, що має інгібуючу активність по відношенню до комах і хімічний склад, що має інгібуючу активність по відношенню до комах. Передбачається, що, щонайменше, один інший пестицидний агент може проявляти активність у відношенні одного або декількох видів шкідників рядів І ерідорієга,
СоІеорієга, Нетірієга, Ноторіега або Тпузапоріега.
І0014| Також розкрита в цьому документі насінина, яка містить інгібуюче ефективну по відношенню до комах кількість сконструйованого інсектицидного білка, що містить амінокислотну послідовність, представлену в будь-якій з ЗЕО ІЮ МО: 44, 5ЕО ІЮО МО: 40, 5ЕО ІЮ
МО: 12, 5ЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО І МО: 16, 5ЕО І МО: 18, 5ЕО ІО МО: 20, 5ЕО І МО: 22, 5ЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО ІО МО: 32, 5ЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮ МО: 36, 5ЕО ІЮО МО: 38 або 5ЕО ІО МО: 42; або полінуклеотид, зазначений в будь- якій з ЗЕО ІЮ МО: 43, ЗЕО ІЮ МО: 39, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІО МО: 25, 5ЕО І МО:
З, ЗЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮО МО: 15, 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 19,
ЗЕО ІО МО: 21, 5ЕО ІЮО МО: 23, 5ЕО ІЮО МО: 31, 5ЕО ІЮО МО: 33, 5ЕО ІЮО МО: 35, 5ЕО І МО: 37 або 5ЕО ІЮ МО: 41. 0015) Спосіб боротьби з лускокрилими комахами-шкідниками, що включає приведення в контакт лускокрилої комахи-шкідника з інгібуючою кількістю сконструйованого інсектицидного білка, також розкрито в цьому документі в іншому варіанті реалізації винаходу. 0016) У ще одному варіанті реалізації винаходу, в цьому документі розкрита трансгенна клітина рослини, рослина або частина рослини, що містять сконструйований інсектицидний білок. Запропоновано способи боротьби з лускокрилою комахою-шкідником, які включають надання шкіднику трансгенної клітини рослини, рослини або частини рослини, що містять сконструйований інсектицидний білок. Розглядаються також матеріали, отримані з клітини рослини, рослини або частини рослини, що містять сконструйований інсектицидний білок, причому продукт містить кількість сконструйованого інсектицидного білка, яку можливо визначити. Розглянуті матеріали включають біомасу рослин, масло, борошно грубого помелу, корм для тварин, борошно, пластівці, висівки, волокно, шкірку та оброблене насіння. 60 І0017| Інший спосіб, розкритий в цьому документі, являє собою спосіб отримання насінини,
яка містить сконструйований інсектицидний білок, що включає: висаджування щонайменше однієї насінини, яка містить сконструйований інсектицидний білок; вирощування рослин із зазначеної насінини; та збір насіння від рослин, причому зібрана насінина містить інсектицидний білок. (0018) Ще один спосіб, розкритий в цій заявці, являє собою спосіб інгібування активності лускокрилих комах-шкідників від годування на культурній рослині, який включає модифікацію одного або більше амінокислотних залишків 5ЕО І МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 14 шляхом заміщення одного або більше амінокислотного(-их) залишку(-ів) для отримання модифікованої
ЗЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 14; та забезпечення наявності інгібуючої по відношенню до лускокрилих кількості модифікованої ЗЕО ІЮО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 14 всередині, на поверхні або поблизу тканин зазначеної культурної рослини; причому модифікований амінокислотний залишок ЗЕО ІО МО: 2 або 5ЕО ІО МО: 14 вибраний з групи, що складається з серину в положенні 282, заміненого на лізин або валін, тирозину в положенні 316, заміненого на серин, ізолейцину в положенні 368, заміненого на пролін або аргінин, серину в положенні 374, заміненого на аргінин, аспарагіну в положенні 375, заміненого на гістидин та ізолейцину в положенні 432, заміненого на лейцин.
Ї0019| Також запропоновані рекомбінантні полінуклеотидні молекули, які кодують сконструйовані інсектицидні білки за цим винаходом. Розглянуті рекомбінантні полінуклеотидні молекули містять полінуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з ЗЕО ІЮ МО: 43, 5ЕОІО МО: 39, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО І МО: 25, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5,
ЗЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІО МО: 9, 5ЕО ІО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕБЕО 10 МО: 19, 5ЕО ІЮ МО: 21,
ЗЕО ІО МО: 23, 5ЕО ІЮО МО: 31, 5ЕО І МО: 33, 5ЕО ІО МО: 35, 5ЕО І МО: 37 або 5ЕО ІО МО: 41; і, необов'язково, полінуклеотидну послідовність, яка кодує агент, що має інгібіторну активність по відношенню до комах, відмінний від інсектицидного білка.
І0020| Інший спосіб, розкритий в цій заявці, являє собою спосіб збільшення активності по відношенню до лускокрилих і посилення спектра інгібування лускокрилих у каркасного білка, що включає модифікацію одного або більше амінокислотного(-их) залишку(-ів) ЗЕО ІЮ МО: 2 або
ЗБО ІО МО: 14 шляхом заміщення амінокислотного(-их) залишку(-ів) для отримання сконструйованого інсектицидного білка, причому модифікований амінокислотний залишок ЗЕО
ІО МО: 2 або 5ЕО ІЮО МО: 14 вибраний з групи, що складається з серину в положенні 282, заміненого на лізин або валін, тирозину в положенні 316, заміненого на серин, ізолейцину в положенні 368, заміненого на пролін або аргінин, серину в положенні 374, заміненого на аргінин, аспарагіну в положенні 375, заміненого на гістидин та ізолейцину в положенні 432, заміненого на лейцин. У деяких варіантах реалізації цього способу сконструйований інсектицидний білок має щонайменше у вісім разів збільшену летальність Неїїсомегра 7еа в порівнянні з каркасним білком. 0021) Інші варіанти реалізації, особливості та переваги цього винаходу будуть очевидні з наступного докладного опису, прикладів і формули винаходу.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
І0022| На Фіг. 1 представлені значення МІС5О (мінімальної інгібуючої концентрації) каркасного білка ТІС844 (ЗЕО ІЮ МО: 14), у порівнянні зі сконструйованим інсектицидним білком
ТІС844 8 (5БО ІО МО: 26) для двох різних колоній Неїїсомегра 76а (СЕММ) - «Опіоп Су» і «Вепооп».
КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
00231) 5ЕО ІО МО: 1 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СгуїОа!1. (0024) 5ЕО ІО МО: 2 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину СгуїОа!1. 00251) 5ЕО ІО МО: З являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СгуїОа! 3. 0026) 5ЕО ІО МО: 4 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину СтуїОа! 3.
І0027| 5ЕО ІО МО: 5 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СтуїОаї 4. (0028) 5ЕО ІО МО: 6 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину СтгуїОа!1 4.
І0029| 5ЕО ІО МО: 7 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СгуїОа! 5. 0030 5ЕО ІО МО: 8 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину СгуїОа! 5. 00311 БЕО ІО МО: 9 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СгуїОа! 6.
І(0032| ЗЕО 10 МО: 10 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стуїба! 6.
Ї0ОЗЗ| ЗЕО І МО: 11 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок СгуїОра! 7.
І(0034| ЗЕО 10 МО: 12 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стуїба! 7. 00351) 5ЕО ІО МО: 13 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844. 60 0036) БЕО І МО: 14 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844.
І0037| 5ЕО ІО МО: 15 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 2. 0038) 5ЕО ІО МО: 16 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 2.
Ї0039| БЕО ІО МО: 17 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 4. 0040 5ЕО ІО МО: 18 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 4. (00411 БЕО ІО МО: 19 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 5. 00421) 5ЕО ІО МО: 20 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 5. 00431) 5ЕО ІО МО: 21 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 6. (0044| 5ЕО ІО МО: 22 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 6. (00451 5ЕО ІО МО: 23 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 7. (0046) 5ЕО ІО МО: 24 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 7. (0047) 5ЕО ІО МО: 25 являє собою нуклеотидну послідовність, що кодує білок ТІС844 8. (0048) 5ЕО ІО МО: 26 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину ТІС844 8. (0049| 5ЕО ІО МО: 27 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка Стуїба! в рослинах. 0050 5ЕО ІО МО: 28 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину СгуїОа!1.
Ї0051| 5ЕО ІО МО: 29 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОа! 2.ппо в рослинах.
І(0052| ЗЕО 10 МО: 30 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стутїраї 2.ппо.
Ї0053| 5ЕО ІО МО: 31 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОа! 3З.ппо в рослинах.
І(0054| 5ЕО 10 МО: 32 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стутра! 3.ппо.
ІЇ0055| 5ЕО ІО МО: 33 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОаї1 4.ппо в рослинах. (0056 ЗЕО 10 МО: 34 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стутра! 4.ппо.
ІЇ0057| 5ЕО ІО МО: 35 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОа! 5.ппо в рослинах.
І(0058| ЗЕО 10 МО: 36 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стутра!1 5.ппо.
ІЇ0059| 5ЕО ІО МО: 37 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОа! б.ппо в рослинах.
ІЇ0О6О| ЗЕО 10 МО: 38 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
СтуїОаї б.ппо.
ІЇ0061| 5ЕО ІО МО: 39 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка СтуїОа! 7.ппо в рослинах.
І0О62| 5ЕО 10 МО: 40 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
Стутра!1 7.ппо.
Ї0063| 5ЕО ІО МО: 41 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка ТІС844 9.ппо в рослинах.
І(0064| ЗЕО 10 МО: 42 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
ТІСВ844 9.ппо.
ІЇ0065| 5ЕО ІО МО: 43 являє собою полінуклеотидну послідовність, сконструйовану для експресії білка ТІС844 11.ппо в рослинах.
І(0066| ЗЕО 10 МО: 44 являє собою амінокислотну послідовність білкового токсину
ТІСВ844 11.ппо.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
І0067| У цьому документі представлені сконструйовані інсектицидні білки, що демонструють дивно вищі рівні токсичної активності проти видів ряду Лускокрилі і більш широкий інсектицидний спектр в порівнянні з іншими раніше відомими інсектицидними білками лускокрилих. Ці сконструйовані інсектицидні білки отримують з каркасних інсектицидних білків, які виступають в якості шаблонів для різних амінокислотних модифікацій. Приклади таких каркасних інсектицидних білків включають, але не обмежуються ними, СтуїОаї і ТІС844 (гомолог СтуїОа1). ТІС844 містить основний токсин Сту!їОаї (тобто домени І, ЇЇ та ІІ) але використовує домен протоксину СтгтутАБЗ3, для забезпечення гарної експресії в Васійи5
ІШигіпдіепзі5 (ВО. Експресія Сту1їба! в Ві є поганою при використанні рідного домену протоксину
СтуїОа1ї. Однак, як показано в цій заявці, експресія основного токсину СтуїОаї1 помітно поліпшується в некристаллоутворюючих штамах Ві, коли видаляється нативний протоксиновий 60 домен, а сегмент кодування основного токсину Сту!їОа1! злитий з сегментом, що кодує протоксиновий домен СтутАбБЗ. Примітно, що білки ТІС844 (5ЕО ІЮ МО: 14) і Сту1ра1 (ЗЕО ІО
МО: 2) не демонструють комерційно корисний спектр інгібування лускокрилих і поліпшену інгібуючу активність по відношенню до лускокрилих, що спостерігається у сконструйованих інсектицидних білків.
ІЇ0068| Сконструйовані інсектицидні білки, описані в цьому винаході, пов'язані з модифікаціями амінокислот, так що модифіковані білюим мають поліпшений спектр інгібування лускокрилих і/або поліпшену інгібуючу активність по відношенню до лускокрилих в порівнянні з вихідним каркасним білком 1ТІС844 або СгуїОа1ї. Фрази «більш активний», «поліпшена активність», «підвищена специфічність», «підвищена токсична активність», «підвищена токсичність», «поліпшена інгібуюча активність по відношенню до лускокрилих», «більш висока інгібуюча активність по відношенню до лускокрилих» і «посилений спектр інгібування лускокрилих» відносяться до зіставлення активності сконструйованого інсектицидного білка з активністю каркасного білка (ТІС844 або Стгуїра!1) проти комахи-лускокрилого, причому активність, приписувана сконструйованому інсектицидному білку, більше, ніж активність, приписувана каркасному білку. У деяких варіантах реалізації винаходу інсектицидні білки, запропоновані в цьому документі, мають поліпшений спектр інгібування лускокрилих і/або поліпшену або більшу інгібуючу активність по відношенню до лускокрилих в порівнянні з активністю каркасного білка ТІС844 або СгуїОра!ї, причому види лускокрилих-шкідників включають, але не обмежуються ними, Неїїсомегра 7єа і 5родорієга ігидірегаа.
І0069| Використовувані в цьому документі терміни і фрази «активний» або «активність»; «пестицидна активність» або «пестицидний»; або «інсектицидна активність», «інгібуюча інсектицидна активність», «інсектицидний» або «інсектицидно інгібуюча кількість», відносяться до ефективності токсичного агента, такого як інсектицидний білок, в інгібуванні (інгібуванні зростання, годування, плодючості або життєздатності), пригніченні (пригніченні росту, годування, плодючості або життєздатності), контролі (контролі зараження шкідниками, контролі активності годування шкідниками на певній культурі, що містить ефективну кількість описаного інсектицидного білка) або знищення (викликаючи захворюваність, смертність, або зниження плодючості) шкідника. Також «кількість, що надає інгібуючу активність на лускокрилих» відноситься до кількості токсичного агента, такого як інсектицидний білок, що призводить до будь-якого вимірного інгібування життєздатності лускокрилих, зростання лускокрилих, розвитку лускокрилих, розмноженню лускокрилих, кормової поведінки лускокрилих, шлюбної поведінки лускокрилих і/або будь-якого вимірного зниження несприятливих ефектів, які відчуває рослина від харчування лускокрилих. Ці терміни покликані включати результат забезпечення пестицидно ефективної кількості токсичного агента для шкідника, при якому надання шкідника токсичного агента призводить до захворюваності, смертності, зниження плодючості або затримки росту. Ці терміни також включають відштовхування шкідника від рослини, тканини рослини, частини рослини, насінини, клітин рослини або від конкретного географічного положення, де рослина може виростати, в результаті надання пестицидно ефективної кількості токсичного агента в або на рослині. Загалом, пестицидна активність відноситься до здатності токсичного агента бути ефективним в інгібуванні росту, розвитку, життєздатності, кормової поведінки, кормової поведінки, плодючості або будь-якого вимірного зниження, викликаного несприятливими ефектами, в зв'язку з наданням в раціон комахи цього білка, фрагмента білка, сегмента білка або полінуклеотиду, конкретному цільовому шкіднику, включаючи, але не обмежуючись ними, комах ряду І ерідорієга. Токсичний агент може бути продукований рослиною або може бути застосований до рослини або в навколишньому середовищі в тому місці, де знаходиться рослина. 0070) Пестицидно ефективна кількість токсичного агента, якщо вона передбачена в раціоні цільового шкідника, проявляє пестицидну активність, коли токсин потрапляє в організм шкідника. Токсичний агент може являти собою пестицидний білок, або один або більше хімічних агентів, відомих в цій області техніки. Пестицидні або інсектицидні хімічні агенти та пестицидні або інсектицидні білкові агенти можуть бути використані окремо або в поєднанні один з одним.
Хімічні агенти включають, але не обмежуються ними, молекули ддцРНК, націлені на специфічні гени для пригнічення в цільовому шкіднику, органохлориди, органофосфати, карбамати, піретроїди, неонікотиноїди та ріаноїди. Пестицидні або інсектицидні білкові агенти включають сконструйовані інсектицидні білки, представлені в цій заявці, а також інші білкові токсичні агенти, включаючи ті, які націлені на різновиди лускокрилих, а також білкові токсини, які використовуються для боротьби з іншими шкідниками рослин, такі як білки Сгу, доступні в цій області техніки для застосування при боротьбі з видами рядів СоіІеоріега, Нептірієга та
Ноторіега. 60 І0071| Термін «сегмент» або «фрагмент» використовується в цьому документі для опису послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот, які коротше, ніж повна амінокислотна або нуклеотидна послідовність, яка описує сконструйовані інсектицидні білки.
І0072| Передбачається, що згадка шкідника, особливо шкідника сільськохазяїнської рослини, означає комах-шкідників культурних рослин, особливо тих лускокрилих комах-шкідників, які контролюються описаними інсектицидними білками. Однак згадка шкідника може також включати комах-шкідників рядів СоІеорієга (Твердокрилі), Нептірієга (Напівтвердокрилі) та
Ноторіеєга (Равнокрилі), а також нематод і гриби, в разі, якщо токсичні агенти, націлені на цих шкідників, спільно локалізуються або присутні разом з описаними інсектицидними білками. 0073) Розкриті сконструйовані інсектицидні білки проявляють інсектицидну активність по відношенню до комах-шкідників з видів комах ряду Лускокрилі, включаючи імаго, лялечок, личинок та новонароджених. Комахи ряду Іерідорієга, включають, без обмежень, совок лугових, совок, листокруток, і совок з родини Мосіцідає, наприклад, кукурудзяну листову совку (Зродоріега І пидірегаа), совку малу (Зродоріега ехідча), совку латукову (Матезіга сопіїдигагйа), совку-іпсилон (Адгоїіїз ірзіоп), совку капустяну (Тгіспоріибзіа пі), соєву совку (Рзеипйдоріивіа іпсіцдеп5), совку оксамитових бобів (Апіїсагзіа деттаїйаїї5), совку конюшинову (Нурепа 5сабга), тютюнову листовійку (Неїїоїйпі5 мігезєсеп5), совку бавовняну (Аагоїї5 5ибіегапеа), совку лугову (Рзеидаїєйа ипірипсіа), совку прямокутну (Адгоїї5 огпіподопіа); точильників, чехлоносок, метеликів, вогнівок шишкових, гусениць метелика капустянки та піроморфід з родини Ругаїїдає, наприклад, метелика стеблового кукурудзяного (Оз5ігіпіа пибіїіаій5), метелика-вогнівку (Атуеїоіб їгапзйейМа), кукурудзяну вогнівку (Статрив5 саїїдіпозеїПйи5), лугового метелика (Негре(одгатта
Іїсаг:ізаїї5), вогнівку соняшникову (Нотоеозота еїесіеПшт), точильника зернового кукурудзяного (ЕІазтораїІри5 ІдпозеПи5); листокруток, димчастих листокруток, плодожерок і плодових листокруток з родини Тогігісідає, наприклад, плодожерки яблуні (Судіа ротопега), листовійку виноградну (Епаоріга міеапа), листовійку східну персикову (Сгарпоїйа тоїевіа), листовійку соняшнику (Зцівїта Пеїїапіпапа); і багатьох інших економічно важливих представників ряду
І ерідоріега, наприклад, капустяну міль (РішейПа хуїовзіейа), рожевого коробкового хробака (Ресііпорпога доззуріеПМа) і шовкопряда непарного (І утапігіа аізраг). Інші комахи-шкідники ряду
І ерідоріега включає, наприклад, АіІабата агоійасеа (совка бавовняна американська), Агспір5 агдугозріїа (листовійка плодових дерев), Агойпір5 гозапа (листовійка різана золотиста) та інші види Агспір5, Спо зирргеззаїї5 (вогнівка азіатська стеблова або жовта рисова вогнівка),
Спарпа!йосгосі5 теаіпаїї5 (листовійка рисова), Статбрив5 саїїдіпозеПйи5 (кукурудзяна вогнівка),
Статбри»х їеїйеггтеїПи5 (метелик трав'яний), Оіайаєа дгапаіозеПйа (вогнівка кукурудзяна південно- західна), Оіаїгаєа 5асспагаїї5 (вогнівка цукрової тростини), Еагіа5 іп5Шапа (совка бавовняна єгипетська), Еагіає міЩШеМйа (совка плямиста), Неїїсомегра аптідега (совка американська),
Неїїсомегра леа (совка бавовняна або американська кукурудзяна совка), Неїоїтів міге5сеп5 (тютюнова листовійка), Негреодгатта Іісагвізаїї5 (луговий метелик), Гобевзіа роїгапа (листовійка гронова), РіпуПоспівііх сійгейа (цитрусова мінуючая моль), Ріегі5 Бгазвзісає (білявка капустяна),
Рієгі5 гарає (ріпниця або білявка ріпнака), РішейПа хуїоєіїеПа (капустяна моль), Зродорієега ехідча (совка мала), 5родоріеєга Ійига (азіатська бавовникова совка, азіатська бавовняна совка) та Тиша арзоїЇша (пасльоновий мінер). 0074) Зазначена в цій заявці «виділена молекула ДНК» або еквівалентний термін або фраза означає, що молекула ДНК являє собою молекулу ДНК, яка присутня окремо або в поєднанні з іншими композиціями, але не в її природному середовищі. Наприклад, елементи нуклеїнової кислоти, такі як кодуюча послідовність, інтронна послідовність, нетрансльована лідерна послідовність, промоторна послідовність, послідовність термінації транскрипції і т.п., які, природно, знаходяться в ДНК геному організму, не вважаються «виділеними» до тих пір, поки елемент знаходиться в геномі організму та в тому місці, де він знаходиться, в природному геномі. Проте, кожен з цих елементів та їх частини були б «виділеними» в рамках цього опису, якщо елемент не знаходиться всередині геному організму та в тому місці, де він знаходиться, в геномі, в якому він природним чином знаходиться. Саме так нуклеотидна послідовність, що кодує інсектицидний білок або будь-який інсектицидний варіант цього білка, який зустрічається в природі, буде являти собою виділену нуклеотидну послідовність, якщо нуклеотидна послідовність не перебуває у ДНК бактерії, в якій природним чином знаходиться послідовність, що кодує білок. Синтетична нуклеотидна послідовність, що кодує амінокислотну послідовність природного інсектицидного білка, буде вважатися виділеною для цілей цього опису. Для цілей цього опису будь-яка трансгенна нуклеотидна послідовність, тобто нуклеотидна послідовність
ДНК, вбудована в геном клітин рослини або бактерії, або присутня у позахромосомному векторі, буде вважатися виділеною нуклеотидною послідовністю незалежно від того, чи присутня вона в плазміді або подібній структурі, використовуваній для трансформації клітин, в геномі рослини 60 або бактерії, або присутній в кількостях, які виявляються в тканинах, потомстві, біологічних зразках або матеріалах, отриманих з рослини або бактерії.
ІЇ0075| Як описано далі в Прикладах, цикли конструювання, тестування і відбору, що повторюються, понад двох тисяч (2000) варіантів амінокислотної послідовності ТІС844 і
Сту1ра1 привели до ідентифікації певних амінокислотних залишків, які можуть бути заміщені, вставлені або видалені з цього каркасного білка для отримання штучних інсектицидних білків, які мають розширений спектр інгібування лускокрилих і/або поліпшену інгібуючу активність по відношенню до лускокрилих (тобто більш токсичним; менша кількість інсектицидного білка, необхідно для отримання того ж рівня смертності) в порівнянні зі спектром і активністю базових каркасних білків, ТІС844 або Стгу1Ора1. Ці повторювані етапи конструювання, тестування та відбору також привели до ідентифікації заміщень, вставок або делецій нейтральних амінокислотних залишок в каркасних білках ТІС844 і Сгу1Ва, які не змінюють інгібуючий спектр або активність по відношенню до комах. Конкретні амінокислотні залишки в каркасі ТІС844 і
Стгуїраї, які можуть бути модифіковані для отримання поліпшеного спектра інгібування лускокрилих і/або поліпшеної інгібуючої активності по відношенню до лускокрилих, у порівнянні з ТІС844 або СтгуїОра!, ідентифіковані в цьому документі. У деяких варіантах реалізації винаходу сконструйований інсектицидний білок, запропонований в цьому документі може проявляти приблизно восьмикратну або велику інгібуючу активність по відношенню до лускокрилих проти видів шкідників ряду Лускокрилі, в порівнянні з каркасним білком 5ЕО ІЮ МО: 14 (ТІС844) або 5ЕО ІЮ МО: 2 (Сту1ба!). 0076) Термін «конструювання» в цих циклах включав визначення релевантних залишків в каркасному білку для модифікації з метою створення модифікованого тестового білка і клонування та експресію отриманих модифікованих тестових білків. Атомарна структура каркасних білків була використана для наведення та доповнення напіввипадкових підходів до вибору амінокислотних залишків для модифікації при конструюванні. Термін «тестування» в цих циклах включав порівняння видоспецифічності видових активностей модифікованого тестового білка з його вихідним каркасних білком. Термін «відбір» в цих циклах включав ідентифікацію модифікованих тестових білків з поліпшеною активністю (поліпшені варіанти) і відповідних залишків, які були сконструйовані для створення цих поліпшених варіантів (ці поліпшені варіанти називаються в цьому документі «сконструйованими інсектицидними білками»).
І0077| Прикладами способів тестування і відбору сконструйованих інсектицидних білків є введення однакових кількостей модифікованого тестового білка і каркасного білка (ТІС844 або
СтгуїОа1ї) комасі-шкіднику в контрольованих умовах аналізу і вимірювання, та порівняння ефективності модифікованих тестових білків і каркасних білків. Інший спосіб тестування і відбору сконструйованих інсектицидних білків включає визначення доз білка (наприклад, концентрації білка в раціоні) модифікованого тестового білка і каркасного білка (ТІС844 або
СтгуїОра1), які викликають еквівалентні відповіді популяції комах в контрольованих умовах аналізу (тобто, отримання кривої залежності доза-ефект). Для порівняння використовувалася статистично значуща величина дози, яка використовується для порівняння: середня смертельна концентрація (ІС50), необхідна для знищення 50 95 досліджуваної популяції або концентрації інгібування линьки («МІС5О»), медіанна концентрація, необхідна для пригнічення линьки на 50 965). 0078) У деяких варіантах реалізації винаходу сконструйовані інсектицидні білки, описані в цьому документі, містять щонайменше одну амінокислотну модифікацію в наступних відносних положеннях ТІС844 (5ЕО ІЮ МО: 14) або Сгуїра! (ЗЕ6О ІЮ МО: 2): серин в положенні 282 замінений на лізин або валін, тирозин в положенні 316 замінений на серин, ізолейцин в положенні 368 замінений на пролін або аргінін, серин в положенні 374 замінений на аргинін, аспарагін в положенні 375 замінений на гістидин та ізолейцин в положенні 432 замінений на лейцин. Сконструйовані інсектицидні білюи можуть також містити щонайменше дві, три, чотири або більше з цих амінокислотних замін або делецій в рамках однієї і тієї ж сконструйованої інсектицидної послідовності білка.
ІЇ0079| Сконструйовані інсектицидні білки, які містять ці амінокислотні модифікації, включають білки, представлені як ЗЕО ІЮ МО: 4, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 10,
ЗЕО ІЮ МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 20, 5ЕО І МО: 22, 5ЕО ІО МО: 24,
ЗЕО ІЮО МО: 26, ЗЕО ІЮО МО: 32, 5ЕО ІЮ МО: 34, 5ЕО ІЮО МО: 38, ЗЕО ІЮ МО: 40 ї ЗЕО ІО МО: 44, та їх фрагменти, що мають інгібуючу активність по відношенню до комах. Кожен з цих сконструйованих інсектицидних білків має виміряну масу близько 132 кДа. Окремі характеристики інсектицидних каркасних білків ТІС844 і СтуїМраї і сконструйованих інсектицидних білків, отриманих з них, представлені в Таблиці 1.
Таблиця 1
Характеристики ТІС844, Сгу1ба! і сконструйованих інсектицидних білків.
Молекулярна Заря Кількість Кількість Кількість Кількість
Білок (Назва/5зЕО уляр Амінокислотна|зоелектричнаї р Аісильнолужних - маса(у при сильнокислихігідрофобних полярних
ІО МО.) довжина точка (-) ! дальтонах) РН 7,0 - амінокислот |Іамінокислотіамінокислоті амІіІНОКИСЛОТ
Стутба1ї 2.ппо/М 7
Стутбат З.ппо/М -
Стутїбат 4.ппо/М -
Стутбат 5.ппо/М -
Стутбат б.ппо/М -
Стутбат 7.ппо/М 7
ТІС844 9.ппо/МО: -
ТІС844 11.ппо/МОЇ -
І0080| Фрагменти сконструйованих інсектицидних білків, описаних в цьому документі, можуть бути скороченими формами, в яких одна або кілька амінокислот видаляються з М-кінця,
С-кінця, середини білка, або їх комбінацій без втрати інгібуючої активності по відношенню до комах. Ці фрагменти повинні зберігати інгібуючу активність батьківського інсектицидного білка по відношенню до комах. 0081) Білки, які мають схожість зі сконструйованими інсектицидними білками, можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння один з одним з використанням різних комп'ютерних алгоритмів, відомих в цій області техніки. Наприклад, ідентичність амінокислотних послідовностей білків, зв'язаних зі сконструйованими білками, може бути проаналізована з використанням вирівнювання Сіивіаї МУ з використанням цих параметрів за замовчуванням:
Матриця вагових оцінок: Біозит, штраф на внесення делеції в вирівнювання: 10,0, штраф на продовження делеції: 0,05, гідрофільні делеції: Увімкн., гідрофільні залишки: СРЗМООЕКК, штраф на залишкоспецифічні делеції: Увімкн. (Тпотрзоп, еї а! (1994) Мисієїс Асід5 Кезеагсй, 22:А4673-4680). Відсоток ідентичності амінокислот далі розраховують у вигляді виразу 100 90 помножених на (ідентичності амінокислот/довжина бажаного білка). Інші алгоритми вирівнювання також доступні в цій області техніки і забезпечують результати, аналогічні тим, які отримані з використанням вирівнювання Сіиеаї МУ. (0082) Як описано далі в прикладах цієї заявки, синтетичні або штучні послідовності, що кодують каркасні білки і сконструйовані інсектицидні білки, були розроблені для застосування в рослинах. Ілюстративні синтетичні нуклеотидні послідовності, які були розроблені для застосування у рослин, викладені в 5БО ІЮ МО: 27 (СтгуїОа1.ппо), БО ІЮ МО: 29 (Стуїраї 2.ппо), БЕО ІЮ МО: 31 (СтуїОаї 3.ппо), хЕО ІО МО: 33 (СтуїОаї 4.ппо), БЕО І МО: 35 (СтуїОаї 5.ппо), БЕО ІО МО: 37 (Сту!їОа! б.ппо), зЕО І МО: 39 (СтуїОаї 7.ппо), БЕО ІОЮ
МО: 41 (ТІС844 9.ппо) і 5ЕО ІО МО: 43 (ТІС844 11.ппо).
І0083| Експресійні касети та вектори, що містять ці синтетичні або штучні нуклеотидні послідовності, конструювали та вводили в клітини рослин кукурудзи, бавовнику та сої відповідно до способів та методик трансформації, відомих в цій галузі техніки. Трансформовані клітини регенерували в трансформовані рослини, які, як було відмічено, експресували сконструйований інсектицидний білок або каркасний білок. Для перевірки пестицидної активності біотести проводили в присутності личинок лускокрилих-шкідників з використанням висічок з листя рослин, отриманих від трансформованих рослин. (0084) Розглядаються композиції молекул рекомбінантної нуклеїнової кислоти, які кодують сконструйовані інсектицидні білки. Наприклад, сконструйований інсектицидний білок може бути експресованим конструктами рекомбінантної ДНК, в яких полінуклеотидна молекула з ВРЗ (відкритою рамкою зчитування), що кодує сконструйований інсектицидний білок, функціонально зв'язана з елементами генетичної експресії, такими як промотор і будь-який інший регуляторний елемент, необхідний для експресії в системі для якої призначений цей конструкт. Необмежуючі приклади включають рослинний функціональний промотор, функціонально зв'язаний з кодуючими послідовностями синтетичних інсектицидних білків, для експресії сконструйованого інсектицидного білка в рослинах, або Ві-функціональний промотор, функціонально зв'язаний з кодуючими послідовностями синтетичних інсектицидних білків, для експресії білка в бактерії Ві або інших видах роду Васійш5. Інші елементи можуть бути функціонально зв'язані зі сконструйованими кодуючими послідовностями інсектицидного білка, включаючи, але не обмежуючись ними, енхансери, інтрони, нетрансльовані лідери, кодовані білкові імобілізаційні мітки (гистидинові мітки), транслокаціонні пептиди (тобто пластидні транзитні пептиди, сигнальні пептиди) поліпептидні послідовності для посттрансляційних модифікуючих ферментів, сайти зв'язування рибосом і сайти-мішені РНКІ. Наведені в цьому документі ілюстративні молекули рекомбінантного полінуклеотида включають, але не обмежуються ними, гетерологічний промотор, функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, таким як ЗЕО ІЮ МО: 3, 5ЕО ІЮ МО: 5,
ЗЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІО МО: 15, 5ЕО ІО МО: 17, 5ЕО ІО МО: 19,
ЗЕО ІЮ МО: 21, 5ЕО ІЮО МО: 23, 5ЕО ІЮ МО: 25, 5ЕО ІЮО МО: 31, 5ЕО ІЮ МО : 33, 5ЕО ІЮ МО: 35,
ЗЕО ІЮО МО: 37, 5ЕБЕО ІЮО МО: 39 Б 5ЕО ІО МО: 43, який кодує поліпептид або білок, який має амінокислотну послідовність, зазначену в 5ЕО ІЮ МО: 4 (СтуїОа! 3), 5БЕО1ІО МО: 6 (Сту1Оа1 4),
ЗЕО І МО: 8 (СтуїОаї 5), 5ЕОІО МО: 10 (СтуїОаї 6), 5ЕО ІЮ МО: 12 (СтуїОа! 7), 5ЕОІЮ МО: 16 (ТІС844 2), БЕО ІЮ МО: 18 (ТІС844 4), 5Е6О І МО: 20 (ТІС844 5), 5ЕО ІЮ МО: 22 (ТІС844 б),
БЕО ІЮ МО: 24 (ТІС844 7), 5ЕО І МО: 26 (ТІС844 8), 5ЕО І МО: 32 (СтуїОраї! 3.ппо), хЕО Ір
МО: 34 (СтуїОраї! 4.ппо), «БЕО ІО МО : 36 (СтуїОаї! 5.ппо), зЕО ІО МО: 38 (СтуїОа! б.ппо), з«»ЕО
ІО МО: 40 (СтуїОа! 7.ппо) ії 5ЕО ІЮ МО: 44 (ТІС844 11.ппо). Гетерологічний промотор також може бути функціонально зв'язаний з синтетичними кодуючими послідовностями ДНК, що кодують націлений на пластид сконструйований інсектицидний білок і нецільовий сконструйований інсектицидний білок. Передбачається, що кодони молекули рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує сконструйований інсектицидний білок, описаний в цьому документі, можуть бути заміщені синонімічними кодонами (відомими в цьому рівні техніки як мовчазна заміна). (0085) Рекомбінантна молекула ДНК або конструкт, що містять сконструйовану інсектицидну послідовність, що кодує білок, може додатково містити область ДНК, яка кодує один або більше токсичних агентів, які можуть бути налаштовані для одночасної експресії або коекспрессії з послідовністю ДНК, що кодує сконструйований інсектицидний білок, білок, відмінний від сконструйованого інсектицидного білка, молекулу дцРНК, що має інгібуючу активність по відношенню до комах або допоміжний білок. Допоміжні білки включають, але не обмежуються ними, кофактор, ферменти, партнери по зв'язуванню або інші агенти, які діють, 3 метою підвищення ефективності агента, який надає інгібуючий вплив на комах, наприклад, шляхом полегшення його експресії, впливу на його стабільність в рослинах, оптимізації вільної енергії для олігомеризації, збільшуючи його токсичність і збільшуючи спектр його активності.
Допоміжний білок може полегшувати захоплення одного або більше агентів, що мають 60 інгібуючий вплив на комах, наприклад, або посилювати токсичний ефект токсичного агента.
(0086) Рекомбінантну молекулу ДНК або конструкт можна сформувати так, щоб всі білки або молекули ддцРНК експресувалися від одного промотора, або кожен білок, або молекула ддРНК перебувала під контролем окремого промотора, або деякої їх комбінації. Білки за винаходом можуть бути експресовані системою множинної експресії генів, в якій сконструйований інсектицидний білок експресується із загального нуклеотидного сегмента, який також містить інші відкриті рамки зчитування і промотори, в залежності від обраного типу системи експресії.
Наприклад, бактеріальна система множинної експресії генів може використовувати єдиний промотор для керування експресією багатократнозв'язаних/тандемних відкритих рамок зчитування з одного оперону (тобто, поліцистронної експресії). В іншому прикладі рослинна система множинної експресії генів може використовувати багатократнозв'язані експресійні касети, кожна з яких експресує інший білок або інший токсичний агент, такий як одна або більше молекул ддРНК.
І0087| Рекомбінантні молекули нуклеїнової кислоти або рекомбінантні конструкти ДНК, що містять сконструйовану послідовність, що кодує інсектицидний білок, можуть бути доставлені в клітини-хазяї за допомогою векторів, наприклад, плазмідного, бакуловірусного, синтетичної хромосоми, віріону, космідного, фагмідного, фагового або вірусного вектора. Такі вектори можуть бути використані для досягнення стабільної або короткочасної експресії сконструйованої послідовності, що кодує інсектицидний білок в клітині-хазяїні або подальшої експресії кодованого поліпептиду. Екзогенний рекомбінантний полінуклеотид або рекомбінантний конструкт ДНК, які містять сконструйовану інсектицидну послідовність, що кодує послідовність білка, і які вводять в клітину-хазяїна, згадуються в цьому документі як «трансген». (0088) У цьому документі запропоновано трансгенні бактерії, трансгенні клітини рослин, трансгенні рослини і трансгенні частини рослин, які містять полінуклеотид, що кодує будь-який один або більше інсектицидних білків. Термін «бактеріальна клітина» або «бактерія» може включати, але не обмежується ними, клітину видів родів Адгобасіегішт, Васійи5, Е5спегіспіа,
ЗаІтопейПа, Рзепдотопах або ЕПігобішт. Термін «клітина рослини» або «рослина» може включати, але не обмежується ними, клітину дводольної рослини або клітину однодольної рослин. Розглянуті рослини і клітини рослин включають, але не обмежуються ними, люцерну, банан, ячмінь, боби, броколі, капусту, капусту декоративну, моркву, маніок, рицину, капусту кольорову, селеру, нут, капусту пекінську, цитрусові, кокосовий горіх, каву, кукурудзу, конюшину, бавовник, гарбузові, огірок, сосну Дугласа, баклажан, евкаліпт, льон, часник, виноград, хміль, цибулю-порей, салат латук, сосну Лоболі, просо, дині, горіх, овес, маслину, цибулю, декоративні рослини, пальму, пасовищну траву, горох, арахіс, перець, голубиний горох, сосну, картоплю, тополю, гарбуз, сосну променисту, редис, рапс, рис, кореневищні злаки, жито, сафлор, чагарникові троянди, сорго, сосну південну, сою, шпинат, гарбуз гігантський, полуницю, цукровий буряк, цукрову тростину, соняшник, кукурудзу цукрову, ліквідамбар смолоносний, солодку картоплю, просо, чай, тютюн, томат, тритікалє, дернову траву, кавун і клітину або рослину пшениці. У деяких варіантах реалізації винаходу представлені трансгенні рослини і трансгенні частини рослин, одержані з трансгенної клітини рослини. У деяких варіантах реалізації винаходу трансгенні рослини можуть бути отримані з трансгенної насінини, шляхом живцювання, відщипування, подрібнення або іншим способом роз'єднання частини з рослиною.
У деяких варіантах реалізації винаходу частина рослини може являти собою насінину, коробочку, лист, квітку, стебло, корінь або будь-яку їх частину або частину трансгенної частини рослини, яка регенерується. Використовуваний в цьому контексті термін частина трансгенної частини рослини, «яка не регенерується» є частиною, з якої не може бути індуковано утворення цілої рослини, або з якої не може бути індуковано утворення цілої рослини, здатної до статевого іМабо вегетативного розмноження. У деяких варіантах реалізації винаходу частина частини рослини, яка не регенерується, являє собою частину трансгенної насінини, коробочки, листа, квітки, стебла або кореня.
І0089| Запропоновано способи отримання трансгенних рослин, які містять лускокрило- інгібуючі кількості сконструйованих інсектицидних білків. Такі рослини можуть бути отримані шляхом введення полінуклеотиду, який кодує сконструйовані інсектицидні білки, запропоновані в цій заявці, в рослинну клітину, та відбору рослини (отриманої із зазначеної рослинної клітини), яка експресує інсектицидно- або лускокрило-інгібуючу кількість сконструйованого білка. Рослини можуть бути отримані з клітин рослин шляхом регенерації або завдяки методикам трансформації насіння, пилку або меристеми. Способи трансформації рослин відомі в цій області техніки.
І0090| Рослини, які експресують сконструйовані інсектицидні білки, можна схрещувати шляхом селекції з трансгенними трансформантами, які експресують інші інсектицидні білки і/або 60 експресують інші трансгенні ознаки, такі як інші ознаки боротьби з комахами, гени стійкості до гербіцидів, гени, що дають ознаки врожайності або стійкості до стресу, і т.п., або ці риси можуть бути об'єднані в один вектор, так щоб всі ознаки були зв'язані між собою.
ІЇ0091| Оброблені рослинні продукти, що містять кількість (придатну для виявлення) сконструйованого інсектицидного білка, сегмент, що має інгібуючу активність по відношенню до комахи або його фрагмент, або будь-яка відмінна його частина, також описані в цій заявці. У деяких варіантах реалізації винаходу оброблений продукт вибраний з групи, що складається з частин рослини, біомаси рослини, олії, борошна грубого помелу, цукру, корму для тварин, борошна, пластівців, висівок, волокна, лушпиння, обробленого насіння та насіння. У деяких варіантах реалізації винаходу, оброблений продукт являє собою той, що не здатен регенеруватися. Рослинний продукт може містити матеріал або інші комерційні продукти, отримані з трансгенної рослини або трансгенної частини рослини, причому матеріал або інші продукти можуть бути відслідковані за допомогою комерційної діяльності шляхом виявлення нуклеотидних сегментів або РНК, яка експресувалася, або білка, які кодують або містять відмінні частини сконструйованого інсектицидного білка.
Ї0092| Способи боротьби з комахами, зокрема ураження видами ряду І еріаорієга, культурних рослин, зі сконструйованими інсектицидними білками, також описані в цій заявці.
Такі способи можуть включати вирощування рослин, що містять інсектицидно- або лускокрило- інгібуючу кількість сконструйованого інсектицидного білка. У деяких варіантах реалізації винаходу такі способи можуть додатково включати одне або більше з наступного: (Її) застосування будь-якої композиції, яка містять або кодує сконструйований інсектицидний білок, до рослини або насінини, що призводить до утворення рослини; і (її) трансформацію рослини або клітини рослини, що призводить до утворення рослини з полінуклеотидом, що кодує сконструйований інсектицидний білок. Загалом, передбачається, що сконструйований інсектицидний білок може бути забезпечений в композиції, забезпечений в мікроорганізмі, забезпечений в трансгенній рослині для додання інгібуючої активності по відношенню до комах ряду І ерідорієга. 0093) У деяких варіантах реалізації винаходу, сконструйований інсектицидний білок являє собою інсектицидно активний інгредієнт композиції, яка має інгібуючу активність по відношенню до комах, отриману шляхом культивування рекомбінантної ВасіШи5 або будь-якої іншої рекомбінантної бактеріальної клітини, трансформованої, для експресії сконструйованого інсектицидного білка в умовах, придатних для експресії. Така композиція може бути одержана за допомогою висушування, ліофілізації, гомогенізації, екстракції, фільтрації, центрифугування, осадження або концентрації культури таких рекомбінантних клітин, що експресують/продукують сконструйований інсектицидний білок. Такий процес може привести до утворення екстракту бактеріальних клітин, суспензії клітин, клітинного гомогенату, клітинного лізату, клітинного супернатанту, клітинного фільтрату або осадження клітин Васійн5 або іншого ентомопатогену.
Отримавши сконструйований інсектицидний білок, таким чином створюють, композицію, яка містить сконструйований інсектицидні білок, може містити бактеріальні клітини, бактеріальні спори, а також параспоральні тільця, і може поставлятися для різних застосувань, включаючи продукти-спреї, що мають інгібуючу активністю по відношенню до сільськохазяїнських комах або препарати кормової біомаси, що мають інгібуючу активність по відношенню до комах в кормових біотестах. 0094) В одному варіанті реалізації винаходу, для того, щоб зменшити ймовірність розвитку стійкості, композиція або трансгенні рослини, що мають інгібуючу активність по відношенню до комах, які містять сконструйований інсектицидний білок можуть додатково містити щонайменше один додатковий токсичний агент, який проявляє інгібуючу активністю по відношенню до одних і тих же видів лускокрилих комах, але який відрізняється від сконструйованого інсектицидного білка. Можливі додаткові токсичні агенти для такої композиції включають молекули білка, що має інгібуючу активність по відношенню до комах і молекулу ддРНК, що має інгібуючу активність по відношенню до комах. Одним із прикладів використання таких рибонуклеотидних послідовностей для боротьби з комахами-шкідниками описані в Вашт, еї аї. (Патентна публікація США 2006/0021087 Аї1). Такий додатковий поліпептид(и) для боротьби з лускокрилими комахами-шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, який проявляє інгібуючу активність по відношенню до комах, такого як, але не обмежуючись ними,
СтузА (патент США Мо 5880275), СтутАб, СтутАс, СгутА.105, СтуТАеє, Сту1В (патентна публікація
США Мо 10/525318), Стуї!С (патент США Мо 6033874), Стгу10О, Сту1Е, Стуї1Е і химери СтутА/Е (патент США Мо 7070982, 6962705 та 6713063), Сту1б, Сту1Н, СгутІ, Стуту, СтуїК, Сгут,, СтгугА,
Сту2АБЬ (патент США Мо 7064249), Стуг2Аеє, Стгу4В, Сгуб, Сту7, Сгув8, Стгу9, Сгу15, Сту4ЗА, Стгу4ЗВ,
СтубіАа!т, ЕТ66, ТІС400, ТІС800, ТІС834, ТІС1415, МІРЗА, МІРЗАБ, МІРЗВ, АХМІ-001, АХМІ-0О02, 60 АХМІ-030, АХМІ-035, і АХМІ-045 (патентна публікація США 2013-0117884 АТ), АХМІ-52, АХМІ-58,
АХМІ-88, АХМІ-97, АХМІ-102, АХМІ-112, АХМІ-117, АХМІ-100 (патентна публікація США 2013- 0310543 А1), АХМІ-115, АХМІ-113, АХМІ-005 (патентна публікація США 2013-0104259 АТ), АХМІ- 134 (патентна публікація США 2013-0167264 АТ), АХМІ-150 (патентна публікація США 2010- 0160231 АТ), АХМІ-184 (патентна публікація США 2010-0004176 АТ), АХМІ-196, АХМІ-204, АХМІ- 207, АХМІ-209 (патентна публікація США 2011-0030096 Ат), АХМІ-218, АХМІ-220 (патентна публікація США 2014-0245491 АТ), АХМІ-2217, АХМІ-2227, АХМІ-2237, АХМІ-2247, АХМІ-2257 (патентна публікація США 2014-0196175 АТ), АХМІ-238 (патентна публікація США 2014-0033363
АТ), АХМІ-270 (патентна публікація США 2014-0223598 АТ), АХМІ-345 (патентна публікація США 2014-0373195 А), 0І0-3 (патентна публікація США 2013-0219570 Ат), 0Іб-5 (патентна публікація США 2010-0317569 АТ), 0106-11 (патентна публікація США 2010-0319093 АТ), АПР- ТА і його похідні (патентна публікація США 2014-0033361 АТ), АТПР-1В і його похідні (патентна публікація США 2014-0033361 Ат), РІР-ТАРІР-1В (патентна публікація США 2014-0007292 АТ),
РЗЕЕМЗ174 (патентна публікація США 2014-0007292 А1), АЕСЕО-592740 (патентна публікація
США 2014-0007292 АТ), Рришї 1063 (патентна публікація США 2014-0007292 АТ), Рриї 1064 (патентна публікація США 2014-0007292 АТ), 555-135 і його похідні (патентна публікація США 2012-0233726 АТ), 55153 і його похідні (патентна публікація США 2012-0192310 АТ), 55154 і його похідні (патентна публікація США 2012-0192310 АТ), 55155 і його похідні (патентна публікація США 2012-0192310 АТ), ЗЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації
США 2012-0167259 А1, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2012- 0047606 А1, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2011-0154536 АТ,
ЗЕО ІЮО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2011-0112013 АТ, 5ЕО ІЮ МО: 2 і 4, та їх похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0192256 А1, 5ЕО ІЮО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0077507 АТ, ЗЕО ІЮО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0077508 АТ, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в патентній публікації США 2009-0313721 АТ, 5ЕО ІЮО МО: 2 або 4, та їх похідні, як описано в патентній публікації США 2010-0269221 А1, 5ЕО ІО МО: 2 та її похідні, як описано в патенті США
Мо 7772465 (82), СЕ161 0085 та його похідні як описано в УМО2014/008054 А2, токсичні білки, що мають активність по відношенню до лускокрилих та їх похідні, як описано в патентних публікаціях США 0О52008-0172762 А1, О052011-0055968 А1 та О52012-0117690 А1; 5ЕО ІЮ МО: 2, та її похідні, як описано в 57510878 (82), 5ЕО ІЮО МО: 2 та її похідні, як описано в патенті
США Мо 7812129 (В1); і тому подібне. 0095) В інших варіантах реалізації винаходу, композиція або трансгенна рослина, що має інгібуючу активність по відношенню до комах, можуть додатково містити щонайменше один додатковий токсичний агент, який проявляє інсектицидну інгибуючу активність по відношенню до комах-шкідників, які не сприйнятливі до інгібуючої активності сконструйованих інсектицидних білків за цим винаходом (наприклад, жорстокрилих, напівжорсткокрилих і прямокрилих шкідників), для розширення отриманого спектра інгібуючої активності по відношенню до комах.
ІЇ0096| Такий додатковий токсичний агент для боротьби з жорсткокрилими комахами- шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білка, що має інгібуючу активність по відношенню до комах, такого як, але не обмежуючись цим, СгузВр (патент США 6501009), варіанти Сту1С, варіанти СтузА, СтгуЗ , СтузЗВ, Стгу34/35, 5307, АХМІ134 (патентна публікація
США 2013-0167264 Ат!) АХМІ-184 (патентна публікація США 2010-0004176 Ат), АХМІ-205 (патентна публікація США 2014-0298538 АТ), ахті207 (патентна публікація США 2013-0303440
АТ), АХМІ-218, АХМІ-220 (патентна публікація США 20140245491 АТ), АХМІ-2217, АХМІ-2237 (патентна публікація СШ 2014-0196175 АТ), АХМІ-279 (патентна публікація США 2014-0223599
АТ), АХМІ-К і їх варіанти (патентна публікація США 2010-0197592 АТ), ТІС407, ТІС417, ТІС431,
ТІС807, ТІС853, ТІС901, ТІС1201, ТІСЗ3131 , 01-10 (патентна публікація США 2010-0319092 АТ), еНІР5 (публікація заявки на патент США Ме 2010/0017914), ІРЗ, і його варіанти (патентна публікація США 2012-0210462 АТ) і І -Нехаїхіп-Нута (публікація заявки на патент США О0О52014- 05366227 АТ).
І0097| Такий додатковий токсичний агент для боротьби з напівжорсткокрилими шкідниками може бути вибраний з групи, що складається з білків, що мають активність по відношенню до напівжорсткокрилих, таких як, але не обмежуючись ними, ТІС1415 (патентна публікація США 2013-0097735 АТ), ТІС807 (патент США Мо 8609936), ТІС834 (патентна публікація США 2013- 0269060 Ат), АХМІ-036 (патентна публікація США 2010-0137216 АТ) ії АХМІ-171 (патентна публікація США 2013-0055469 А1). Додаткові поліпептиди для боротьби з жорсткокрилими, лускокрилими і напівжосткокрилими комахами-шкідниками можна знайти на сайті номенклатури токсину ВасшШив5 Пигіпдіепзіз підтримуваному Мей СтісКтоге (в Інтернеті, за адресою
Біпотепсіайиге.іпо). 60 0098) Кодуючі послідовності сконструйованого інсектицидного білка та послідовності, які мають значний відсоток ідентичності зі сконструйованими інсектицидними білками можуть бути ідентифіковані з використанням способів, відомих фахівцям в цій області техніки, таких як полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), термічна ампліфікація та гібридизація. Наприклад, сконструйовані інсектицидні білки можуть бути використані для отримання антитіл, які специфічно зв'язуються з родинними білками, і можуть бути використані для скринінгу і пошуку інших тісно пов'язаних білків. 00991 Крім того, нуклеотидні послідовності, що кодують сконструйовані інсектицидні білки, можуть бути використані в якості зондів і праймерів для скринінгу з метою виявлення інших представників класу з використанням методів термічного циклу або ізотермічної ампліфікації та гібридизації. Наприклад, олігонуклеотиди, отримані з послідовностей, зазначених в ЗЕО ІЮ МО:
З можуть бути використані, для визначення наявність або відсутність сконструйованого інсектицидного трансгену в зразку дезоксирибонуклеїнової кислоти, отриманому з матеріалу. З урахуванням чутливості деяких способів виявлення нуклеїнових кислот, які використовують олігонуклеотиди, передбачається, що олігонуклеотиди, отримані з послідовностей, зазначених в
ЗБО 10 МО: З можуть бути використані для виявлення відповідного сконструйовану інсектицидного білка в матеріалах, отриманих з об'єднаних джерел, де тільки частина матеріалу, отримана з трансгенної рослини, що містить ЗЕО ІЮ МО: 3.
ІО10О0) Інші відмітні ознаки і переваги цього винаходу будуть очевидні з наступних прикладів і формули винаходу.
ПРИКЛАДИ
ІО101| Зважаючи на вищезазначене фахівцям в цій галузі техніки повинне бути зрозуміло, що можуть бути зроблені зміни в конкретних аспектах, які розкриті та буде отримано подібний або аналогічний результат, не відходячи від суті та об'єму винаходу. Таким чином, конкретні структурні та функціональні деталі, розкриті в цьому документі, не слід інтерпретувати як обмеження. Слід розуміти, що повне розкриття кожної із зазначених вище публікацій включено в опис цієї заявки.
ПРИКЛАД 1
Розробка модифікованих тестових білків і підготовка зразків для біологічного аналізу на комах (01021) Цей Приклад ілюструє способи, прийняті для визначення відповідних амінокислотних залишків в каркасних білках, для модифікації, для створення модифікованих тестових білків, а також клонування та експресію отриманих модифікованих тестових білків.
ІО103| Деякі методики молекулярної інженерії були використані в багаторівневому підході для конструювання покращених варіантів Сту!Оа1, що мають покращений спектр інгібуючої активності по відношенню до лускокрилих і/або поліпшену інгибуючу активність по відношенню до лускокрилих в порівнянні з каркасними білками Стгу1ба! і ТІС844 (гомолог Сту1їра1). Перший тур, або початковий етап конструювання, в першу чергу заснований на гіпотезах. Другі та треті тури були статистично керованими етапами конструювання. Наприклад, у другому турі конструювання, статистично нешкідливі мутації були комбіновані з передбачуваними корисними мутаціями для отримання подвійних мутацій, які відповідали певним статистичним критеріям. У третьому турі конструювання, всі дані з попередніх випробувань були проаналізовані за допомогою декількох статистичних методів. Тільки мутації, які продемонстрували статистично значуще поліпшення в більш ніж одному статистичному методі були обрані для остаточного пулу мутацій. Варіанти, розроблені в цьому турі, містили одну або дві позитивні мутації з варіантів, раніше підтверджених як позитивні. Таким чином, конструювання третього туру істотно збагачувало активні варіанти в порівнянні з першим і другим туром. Як показано в наступних прикладах, використання трьохтурової стратегії конструювання визначає як поодинокі, так ії синергічні мутації, які забезпечили значне поліпшення активності проти СЕМУ/ для деяких поліпшених варіантів по відношенню до каркасних ТІС844 і Сту1Обаї1.
ІЇО104| Способи, які були використані для створення модифікованих тестових білків включають, але не обмежені ними, напіввипадкові модифікації, спрямовані модифікації відхилень у вирівнюванні ТІС844/Сгу1Оа!1 з іншими нативними білками Васійи5 Ф(шгіпдепвів (ВО, і структурно/функціональне конструювання. Приклади використовуваних методик молекулярної інженерії включають такі.
ІЇО105| Зв'язування рецептора. Сприйнятливість лускокрилих комах-шкідників, зокрема, совки кукурудзяної (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа) до поліпшених варіантів Стгу1Оа1/71С844 може бути віднесена до різних цільових кишкових рецепторів. Підходи, які були використані для поліпшення зв'язування з рецепторами в кишечнику, тим самим збільшуючи токсичність, включають: (1) піддавання мутації кожної позиції в апікальних петлях домену ІІ за всіма 60 амінокислотними типами; і (2) заміну всіх можливих комбінацій апікальних петель домену ІІ на ті ж від інших гомологів Стуїра! (наприклад, Стгу1!ОБ1, Сту1Ос1) і СЕМ/-активних трьеохдомених токсинів (наприклад, Сту!ВБ1, Стуїда1 і Сту2АбБЗг).
І0106| Підходи, засновані на вирівнюванні Вирівнювання СтуїОра! з іншими гомологами (наприклад, Сгтгу!Ор1 ї Сту1Ос1) було використано для ідентифікації областей мінливості. В результаті вирівнювання були ідентифіковані сто п'ятдесят (150) позицій і двісті дев'яносто п'ять (295) унікальних одиничних мутацій. Ці позиції були розташовані у всіх трьох доменах. Позиції в межах чотирьох (4) амінокислот один від одного, були згруповані разом. Тільки мутації з однакових вихідних послідовностей були призначені для кожної групи позицій, з утворенням сто тридцяти двох (132) унікальних варіантів.
І0107| Підходи поверхневого мутагенезу. Полінуклеотиди, що кодують поверхневі позиції в доменах ІІ і І каркасних білків були піддані мутагенезу при скануванні. У позиціях каркасного білка, де не був присутній аланін, амінокислотні залишки були замінені на аланін. Аргинінові мутації в доповненні до аланіновуї були введені в поверхневих положеннях, в яких нативні залишки представляли собою лізин. Раціональність мутаційних замін лізину на аргінін була заснована на спостереженні, що токсини, який має активність по відношенню до лускокрилих, як правило, мають дуже мало лізину та багато аргініну і, таким чином, була висунута гіпотеза про те, що зміна в поверхневих положеннях лізину в доменах ЇЇ ії І на аргінін може збільшити активність модифікованого тестового білка відносно лускокрилих.
ІО108)| Зміна протеолітичних подій. Існує гіпотеза, що протеолітичний процес є важливим аспектом діяльності трьохдоменних токсинів в середній кишці лускокрилих комах. Для тестування цього було створено кілька наборів мутацій здатних змінювати будь-яке протеолітичне розщеплення. Потенційні сайти розщеплення розташовані на М-кінці та між доменом ІІ і протоксином. Мутаційні позиції включають передбачені області петлі від М-кінця до початку спіралі 4, їі з С-кінця домену ІІ до «40 амінокислот в протоксині. Як правило, залишки гліцину гіпотетично сприяли протеолізу або за допомогою розпізнавання протеолітичного сайту, або за рахунок збільшення гнучкості білка, тим самим роблячи його більш сприйнятливим до протеолітичного розщеплення. Крім того, трипсин і хімотрипсин обидва являють собою протеази, які широко відомі в якості життєздатних протеаз в середній кишці лускокрилих.
Залишки лізину забезпечують сайти впізнавання для трипсину, а залишки тирозину забезпечують сайти впізнавання для хімотрипсина. Таким чином, обрані мутаційні позиції в потенційних сайтах розщеплення піддавали гліциновим, лізіновим або тирозиновим мутаціям. (0109) Потенційні гарячі точки мутацій від інших СЕМУ-активних токсинів. Були проаналізовані дані активності та відсутності активності проти СЕМ/ для великого набору білків (включаючи химер, фрагменти і нативні послідовності). Інформація, отримана зі статистичного аналізу цих даних, була використана для виявлення потенційних специфічних мутацій або позицій для мутацій, які, ймовірно, збільшать СЕМ/-активності кінцевих модифікованих тестових білків.
ІО110| Модифіковані тестові білки, отримані в результаті молекулярних методик інженерії, описаних вище, були клоновані з використанням способів, відомих в цій області техніки, в рекомбінантний експресійний вектор плазміди Ві, після специфічного промотору експресії спороутворення і трансформовані в некристалоутворюючу клітину-хазяїна ВІ.
ПРИКЛАД 2
Тестування модифікованих тестових білків в кормових біотестах проти лускокрилих шкідників (0111) Цей Приклад ілюструє тестування модифікованих тестових білків, створених шляхом експериментів конструювання, описаних в Прикладі 1.
ІЇО112|) Шляхом експериментів конструювання, описаних в Прикладі 1, були зроблені близько двох тисяч п'ятисот (2500) рекомбінантних штамів Ві, що експресують більше двох тисяч трьохсот (2300) різних модифікованих тестових білків. Ці модифіковані тестові білки експресувалися Ві і випробовувалися на токсичність по відношенню до різних видів ряду
І ерідоріега. Експерименти годування були проведені на новонароджених личинках («24 годин після вилуплення) різних видів лускокрилих, включаючи совку кукурудзяну (СЕМУ, Неїїсомегра 7еа) і кукурудзяну листову совку (БАМУ, Зродоріега їШидірегда). Яйця комахи для СЕМУ- тестування були отримані з двох різних лабораторних колоній: Вепзоп Кезеагс!, Карлайл штат
Пенсільванія і Мопзапіо Сотрапу, Юніон-Сіті, штат Теннессі. Всі експресовані модифіковані тестові білюи були протестовані проти СЕМУ, і деякі з цих модифікованих тестових білків, що демонструють підвищену активність проти СЕМУ в порівнянні з їх батьківськими каркасними білками, були протестовані проти РАМУ, в доповненні до виконання додаткового біотеста для підтвердження активності проти СЕМУ. 60 01131 Різні протоколи для біотестів і оцінки смертності та затримки росту комах відомі в цій області техніки. Були використані варіації способів, таких, як ті, які описані в публікації патентної заявки РСТ Мо УМО 2012/139004 і в патенті США Мо 7927598.
ПРИКЛАД З
Модифіковані тестові білки, які проявляють поліпшену активність проти СЕМ/ 0114 Цей Приклад ілюструє відкриття розширеного інгибуючого спектра відносно лускокрилих і/або поліпшеної або збільшеної інгібуючої активності відносно лускокрилих для деяких з модифікованих тестових білків у порівнянні з активністю каркасних білків ТІС844 або
Стгу1їба! в декількох етапах тестування.
ІЇО115| Модифіковані тестові білки, створені за допомогою експериментів конструювання, описаних в Прикладі 1, і випробуваних в біотесті комах, як описано в Прикладі 2, були випробувані в повторюваних етапах, в яких порівнювали активність по відношенню до видів лускокрилих модифікованих тестових білків з їх відповідними батьківськими каркасними білками (тобто, ТІС844 або Стгу1ї!Ора1). На першому етапі триста сімдесят (370) різних модифікованих тестових білків продемонстрували підвищену токсичність по відношенню до СЕМУ в порівнянні з
ТІС844 або Сгу!ра!ї! в кормовому біотесті У кожному з цих кормових біотестів, однакові кількості білка (або модифікований тестовий білок або каркасний білок) були надані СЕУМ в контрольованих умовах аналізу з одноразовою дозою. Активність модифікованих тестів білків і каркасних білків визначали шляхом вимірювання та порівняння спостережуваної смертності та затримки росту кожного з біотестів модифікованих тестових білків до смертності, що спостерігається та затримки росту біотестів батьківських каркасних білків.
ІО116| З трьохсот сімдесяти (370) модифікованих тестових білків, які продемонстрували підвищену токсичність по відношенню до СЕМУ в порівнянні з каркасними білками в однодозних тестах, близько ста вісімдесяти (180) з них були додатково перевірені в РАМУ-біотестах, щоб визначити, підтримували або проявляли ці модифіковані тестові білки підвищену активність по відношенню до ЕАМУ в порівнянні з їх батьківськими каркасними білками. Від близько сорока (40) до п'ятдесяти (50) з цих модифікованих тестових білків проявляли подібну або більш високу активність по відношенню до ЕБАММ в порівнянні з їх батьківськими каркасними білками. Ці додатково досліджені модифіковані тестові білки були також випробувані в додаткових СЕМУ/- біотестах, для підтвердження активності по відношенню до СЕМУ. В результаті цих етапів відбору і тестування модифікованих тестових білків, які продемонстрували поліпшену активність по відношенню до СЕМ при збереженні або поліпшенні активності по відношенню до
ЕАМУ був отриманий остаточний список поліпшених варіантів (наведений в цьому документі як «сконструйовані інсектицидні білки»). У Таблиці 2 наводяться ці сконструйовані інсектицидні білки та амінокислотні мутації в кожному сконструйованому інсектицидному білку. У Таблиці 2 також представлена активність каркасних і сконструйованих інсектицидних білків по відношенню до СЕМ/ ії ЕАМ/ (інсектицидна активність показана в значенні ЇС50 (концентрація токсину, необхідна, для знищення 50 95 популяції комах протягом заданої тривалості впливу. Чим нижче значення ЇС50, тим вище токсичність) і значенні МІС5О (концентрація, необхідна для пригнічення линьки певної вікової стадії 50 96 личинок протягом фіксованого тривалості впливу).
В цій таблиці показано, що сконструйовані інсектицидні білюим мають поліпшену активністю по відношенню до СЕМУ, при збереженні або поліпшенні активності по відношенню до ЕАМУ.
Ї Сво (мкг/см2) по МІС»о (мкг/смг) по
Білок відношенню до СЕМУ відношенню до СЕМУ (Назва/5ЕО ІС) Амінокислотні Мутації" колонії Веп2оп в Колонія Веплоп в
МО.) підготовчому спорово- підготовчому спорово- кристалічному біотесті кристалічному біотесті
МО: 10 5282К УЗ3165 ІЗбВР
МО: 12 282 У3165 ІЗбВР
ТІС844 2/МО: ТІС844 з
ТІС844 5/МО: ТІС844 з
ТІС844 8/МО: ТІС844 з " Амінокислотні мутації ідентифіковані з використанням стандартного коду ІРАС амінокислот. Див., ІОРАС-ІШВ доїпї Соттіввіоп оп Віоспетіса! Мотепсіаїшге. Мотепсіашге апа
Зутброїївт ог Атіпо Асід5 апа Реріїде5. Еиг. У. Віоспет. 138:9-37(1984). Перша абревіатура амінокислотної послідовності вказує на вихідну амінокислоту в цьому каркасному білку, число вказує положення амінокислоти, а друга абревіатура амінокислотної послідовності, вказує на амінокислоту, розташовану в цьому положенні в удосконаленому варіанті білка. «х Основний токсин Сту1!ба! ідентичний основному токсину ТІС844.
ІО117| Далі демонструється покращений інгібуючий спектр лускокрилих і поліпшена інгібуюча активність по відношенню до лускокрилих для сконструйованих інсектицидних білків, летальність сконструйованого інсектицидного білка ТІС844 8 по відношенню до його батьківського каркасного білка представлена на Фіг. 1. На гістограмі на Фиг.1 показано значення
МІС5О ТІС844 8 у порівнянні з каркасом білка ТІС844 для двох різних колоній СЕМУ, Опіоп Сну та Веп2оп. Результати біотестів, зображені на Фіг. 1, були розраховані з біотестів препаратів, очищених градієнтом сахарози. Ці вторинні біотести були проведені з препаратами білків, очищеними градієнтом сахарози замість спорово-кристалічних препаратів білків для того, щоб гарантувати, що поліпшена активність ТІС844 8 зберігається при більш інтенсивному очищенні.
Крім того, колонію Опіоп Сйу тестували для підтвердження підвищеної активності, що спостерігається в колонії Веп2оп. Як показано на Фіг. 1, мутації в трьох залишках ТІС844 8 (5282У У3165 ІЗ68Р), надавали 8-кратне поліпшення летальності СЕМУ, у порівнянні з ТІС844, для колонії Опіоп Спйу та 50-кратне поліпшення летальності СЕМУ, у порівнянні з ТІС844, для колонії Вепг2оп.
ІО118) Далі демонструється покращений інгібуючий спектр по відношенню до лускокрилих і поліпшена інгібуюча активність по відношенню до лускокрилих для сконструйованих інсектицидних білків, профілі активності проти комах для ТІС844 і ТІС844 8 з кормових біотестів, що проводяться по відношенню до широкого спектра видів комах-лускокрилих, наведені в Таблиці 3. Комахи, по відношенню до яких проводилися випробування в біотестах з
Таблиці 3, включають совку іпсилон (ВСМУ, Адгоїй5 ірзіоп), совку кукурудзяну (СЕМУ, Неїїсомегра 7ва), совку кукурудзяну листову (ЕЄАМУ, Зродоріега ігидірегаа), совку південну (ЗАМ, Ззродорієтга егідіапіа) , совку ні (СІ МУ, Тгіспоріизіа пі), вогнівку кукурудзяну (ЕСВ, Озігіпіа пибіїаїйй5), південно- західного кукурудзяного метелика (З5УУС, Оіаїгаєа дгапаіїозеПа), совку тютюнову (ТВМУ, Неїїоїтів мігезсеп5), гусеницю оксамитових бобів (МВС, Апіїсагзіа детитаїйаїйє), совку соєву (ЗВІ,
Спгузодеїхіх іпсічаев) і вогнівку цукрової тростини (ЗСВ, Оіаїгаєа засспагаїї5). В цій Таблиці З представлений покращений інгібуючий спектр ТІС844 8 по відношенню до лускокрилих в порівнянні з батьківським каркасних білком ТІС844, зокрема, з поліпшеною активністю проти
СЕМ і МВС.
Таблиця З
Спектр активності для ТІС844 і ТІС844 8 по відношенню до комах.
ЗЕО І .
МО. Білок ВСУ | СЕМ/ | ГАМУ | БАМ/ | СІМ/ | ЕСВ | 5МУС | ТВМУ | МВС | ВІ | 5СВ тісвад в! | с 177 171 11711111 това. | Її /с 1 1 71 1 1 7171 х Активний відносно зазначених видів комах.
ІО119| Покращений інгібуючий спектр сконструйованих інсектицидних білків по відношенню до лускокрилих, далі продемонстрований в Таблиці 4, в якій представлений профіль активності комах для деяких модифікованих інсектицидних білків з досліджень кормових біотестів. Комахи, по відношенню до яких проводилися випробування в біотестах з Таблиці 4, включають совку американську (СВУУ, Неїїсомегра аптідега), совку азіатську бавовняну (ТОМУ, Зродорієега Ійига), совку малу (ВАМУ, бродорієга ехідча), рожевого коробкового хробака (РВМУ, Ресііпорпога до55уріеМПа), совку рожеву стеблову (Р5В, 5езатіа іп'егеп5) і совком плямисту (ЗВУМ, Еагіа5 міеа). Результати, представлені в Таблиці 4, вказують на підвищений інгібуючий спектр відносно лускокрилих у перерахованих сконструйованих інсектицидних білків (в порівнянні з каркасним білком Стуїра!1!) зокрема, з поліпшеною активністю проти СВМУУ, РВУМ (стійкі до
СтутАс), РВУМ (природного походження) і ЗВУУ.
Таблиця 4
Порівняння профілів інсектицидної активності для Сту1баї! і сконструйованих інсектицидних білків.
ЕО РМ. о
Ти Білок СвМ/ | тс | ВАМ (Вирощений РВУМ(стійкийР ВУЖ природного Ров ВМ
МО в до СтутАс) | походження)
І лабораторії) сура. | | 5 | 5! т | 56 | з « суба! 7 5 | 5 | її Її я | | 11 тсва4 4 я | я | я 11113 | Ї1111111111ї1 1 тс 5 я | я | я 11173 Її Ї1111111111ї1 1 тсв447| я | 5 | 41 я ЇЇ 5 Її 1 ж Активний відносно зазначених видів комах.
ПРИКЛАД 4
Синтез генів, що кодують інсектицидні сконструйовані білки і каркасні білки для експресії в рослинах (01201 Цей приклад ілюструє синтез полінуклеотидів, що кодують сконструйовані інсектицидні білки і каркасні білки для експресії в рослинах.
ІО121| Нуклеотидні послідовності, що кодують каркасні білки і сконструйовані інсектицидні білки для експресії в рослинах, були розроблені та синтезовані в відповідності зі способами, описаними в патенті США Мо 5500365, уникаючи певні невідповідні проблемні послідовності, такі як послідовності поліаденілювання рослин, збагачені АТТТА і А/ЇІ, при збереженні амінокислотної послідовності вихідного каркасного або сконструйованого інсектицидного білка.
Нуклеотидні послідовності цих генів, що кодують сконструйовані білки та каркасні білки для експресії в рослинах, наведені нижче в Таблиці 5.
Таблиця 5
Полінуклеотидні послідовності, сконструйовані для використання в рослинах, які кодують каркасні і сконструйовані інсектицидні білки.
Нуклеотидна ЗЕО ІЮ МО. БІЛОК ВАРІАНТ
Стуї1їраї.ппо Відсутні (каркасний білок)
- Аг - Аг
Аг "х Позначення варіантів «Аг» означає вставку залишку аланіну в амінокислотне положенні 2 в порівнянні з нативною послідовністю для цілей клонування в експресійні вектори рослин.
ПРИКЛАД 5
Експресійні касети для експресії модифікованих інсектицидних білків в рослинах (0122) Цей приклад ілюструє конструювання експресійних касет, що містять полінуклеотидні послідовності, сконструйовані для використання в рослинах, які кодують каркасні і сконструйовані інсектицидні білки.
ІО123| Різноманітні рослинні експресійні касети були сконструйовані з полінуклеотидної послідовністю, що кодує каркасні та сконструйовані інсектицидні білки, сконструйовані для експресії в рослинах, представлені в Таблиці 5. Такі експресійні касети можуть бути використані для тимчасової експресії в протопластах рослин або трансформації клітин рослин. Типові експресійні касети були сконструйовані з урахуванням можливого розміщення білка в клітині.
Один набір експресійних касет був розроблений таким чином, щоб забезпечити трансляцію білка і його розташування в цитоплазмі. Інший набір експресійних касет був розроблений для отримання транзитного пептиду, суміжного з білковим токсином, для забезпечення орієнтації на органели клітини, такі як хлоропласт або пластида. Усі експресійної касети були сконструйовані, щоб початися на 5'-кінці з промотора, який може складатися з декількох промоторних елементів, енхансерних елементів або інших експресійних елементів, відомих фахівцям в цій області техніки, функціонально зв'язаних, для підвищення експресії трансгена. За промоторною послідовністю, як правило безперервно слідує одна або більше лідерних послідовність на 3'- кінці промотора. Інтронна послідовність, як правило, розташована на 3'-кінці лідерної послідовності, для поліпшення експресії трансгена. Послідовність, що кодує токсин або транзитний пептид, і послідовність, що кодує токсин, як правило, розташована на 3'-кінці функціонально зв'язаного промотора, лідера і інтрона. Послідовність 3-НТО, як правило, розташована, на 3'-кінці кодуючої послідовності для полегшення термінації транскрипції та забезпечення послідовності, важливої для поліаденілювання одержуваного транскрипта. Всі елементи, описані вище, були функціонально зв'язані між собою і розташовані послідовно, часто з додатковими послідовностями, використовуваними для конструювання експресійної касети.
ПРИКЛАД 6
Трансформаційні вектори, що містять експресійну касету каркасного або сконструйованого інсектицидного білка
І(0124| Цей приклад ілюструє включення каркасних або сконструйованих інсектицидних білків в тканини рослин. (01251 Способи отримання трансгенної рослини, яка експресує сегмент нуклеїнової кислоти, що кодує каркасний білок або сконструйований інсектицидний білок може бути здійснені з використанням варіації способів, добре відомих в цій області техніки. Загалом, спосіб включає перетворення придатної клітини-хазяїна з сегментом ДНК, який містить промотор, функціонально зв'язаний з кодуючою ділянкою, яка кодує один або більше модифікованих інсектицидних білків або каркасних білків. Така кодуюча ділянка, як правило, функціонально зв'язана з ділянкою термінації транскрипції, причому промотор здатний управляти транскрипцією кодує ділянки в клітині, і, отже, забезпечує клітині здатність продукувати поліпептид іп мімо. Вектори, плазміди, косміди і сегменти ДНК, які використовуються в трансформації таких клітин, як правило, включають оперони, гени або послідовності, отримані з генів, як нативні, так і отримані синтетично, зокрема ті, які кодують розкриті сконструйовані інсектицидні білки. Ці ДНК-конструкти можуть додатково містити структури, такі як промотори, енхансери, полілінкери, або інші генні послідовності, які можуть регулювати діяльність конкретних бажаних генів. Отримані трансгенні рослини, частини рослин і клітини рослин тестували для визначення експресії та біологічної активності кодованого білка.
ІЇО126| Приклади способів, які можуть бути модифіковані для отримання трансгенних рослин, які експресують білки, що проявляють активність по відношенню до лускокрилих, включають описані, наприклад, білки СтутА (патент США Мо 5880275), Сту1В (публікація заявки на патент США Мо 10/525318), Сту!С (патент США Мо 6033874), химери СтутА/Е (патенти США
Мо 7070982, 6962705 та 6713063) і білок Сту2АБ (патент США Мо 7064249).
ПРИКЛАД 7
Активність по відношенню до лускокрилих сконструйованого інсектицидного білка в стабільно трансформованій кукурудзі
ІО127| Цей приклад ілюструє інгібіторну активність, що проявляється сконструйованими інсектицидними білками по відношенню до лускокрилих-шкідників, які експресовані рослинами кукурудзи і запропонованими у вигляді корму для відповідних комах-шкідників.
ІО128| КО трансгенні рослини кукурудзи, які експресують білки Сту!їОа! і Стуїраї 7.ппо були отримані з використанням векторів, що містять експресійні касети, описані в Прикладі 6. Е1 трансгенні рослини кукурудзи були вирощені з насіння, отриманого шляхом запилення суцвіть з зародкової плазмою комерційних нетрансформованих рослин дикого типу пилком від КО трансформантів.
І0129| Трансформовані клітини індукували для утворення рослин за допомогою способів, відомих в цій області техніки. Біотести з використанням дисків з листя рослин були проведені аналогічно тим, які описані в патенті США Мо 8344207. Нетрансформовану рослину використовували для отримання тканини для негативного контролю. Оцінювали безліч об'єктів трансформації для кожного бінарного вектора, і результати були зведені в таблицю.
ІО130| Інсектицидна активність трансгенних рослин кукурудзи, що експресують білки
СтуїОа!1 і СтгуїОаї1! 7.ппо в поколіннях Е1ї і КО приведена в Таблиці б, в доповненні до інсектицидної активності трансгенних рослин кукурудзи, що експресують білки Сгу1браї і
Стуїтїра1 7.ппо на стадії Е1 в польових умовах. Зокрема, в Таблиці 6 представлений профіль активності по відношенню до лускокрилих для СтуїОаї 7.ппо в порівнянні з батьківським каркасних білком СгуїОра!1 при тестуванні проти СЕМУ, ЕАМУМ і ЗМУС. Як видно з Таблиці 6, на відміну від Стуї!Оа!, СтуїОаї 7.ппо демонструє активність проти обох СЕМУ і РГАУМ в КО ії Е1 біотестах і Е1 польових випробуваннях.
Таблиця 6
Профіль інсектицидної активності для Стгу1Оа! і СтуїОаї1 7.ппо, експресованих в рослинах кукурудзи.
Білок Пол Пол Пол ввоюмо) | во) м р и) я) є р ПМ) во) єр Ли е е е ве | рр нт нт
Стутра!1 7.ппо щи | 11313111 11 ж- Активний по відношенню до видів комах; - Неактивний по відношенню до видів комах; НТ не тестували
ПРИКЛАД 8
Активність по відношенню до лускокрилих у модифікованих інсектицидних білків в стабільно трансформованому бавовнику
І0131| Цей приклад ілюструє інгібіторну активність, що проявляється сконструйованими інсектицидними білками по відношенню до лускокрилих-шкідників, які експресовані рослинами бавовника і запропонованими у вигляді корму для відповідних комах-шкідників.
ІЇО132| Рослини бавовнику, які експресують білки СгуїМраї 7.ппо і ТІС844 11.ппо були отримані з використанням векторів, що містять експресійні касети, описані в Прикладі 6.
Трансформовані клітини індукували для утворення рослин за допомогою способів, відомих в цій області техніки. Тканина листя бавовнику використовували в біотесті, описаному в Прикладі 7, і випробовували проти СВУМУ, РАМУ, совки тютюнової (ТВМУ, Неїїоїпів міге5сеп5) і ЗВІ.. В Таблиці 7 представлена активність, яка спостерігається по відношенню до цих видів лускокрилих в стабільно трансформованому поколінні КО бавовнику. Як видно з Таблиці 7, СтуїОраї 7.ппо їі
ТІС844 11.ппо продемонстрували активність по відношенню до двох або більше видів лускокрилих-шкідників в стабільно трансформованому поколінні КО бавовнику.
Таблиця 7
Біотест профілю активності СтуїОа! 7.ппо і ТІС844 11.ппо експресованих в поколінні Ко бавовнику.
Стутра!1 7.ппо з з з з
ЗЕО І МО: 40
ТІСВ844 11.ппо з з з
ЗЕО ІЮ МО: 44 - Активний по відношенню до видів комах; - Неактивний по відношенню до видів комах.
ІО133| Вибрані об'єкти трансформації були використані для отримання Кі! рослин. К1 рослини, які експресують СгуїМра1! 7.ппо, аналізували на стійкість до СВУУ, ЕАМУ і ЗВІ. Тканини листа, бутону та коробочки використовували в біотестах, в доповненні до польових випробувань, проведених в теплицях. В Таблиці 8 продемонстрована активність, що спостерігається в цих тестах. Як показано в Таблиці 8, СтгуїОаї 7.ппо продемонстрував активність проти СВМУ, ЕАМУ і ВІ. в біотестах і польових випробуваннях.
Таблиця 8
Профіль інсектицидної активності Сгу!Оа1 7.ппо, експресованого в поколінні КЕ: бавовнику. 17711111 свМ11117 71111111 РАМ | БВ | Теплиця:З/
ЗЕО І МО: 40 - Активний відносно видів комах; - Не активний по відношенню до видів комах.
ПРИКЛАД 9
Активність по відношенню до лускокрилих у модифікованих інсектицидних білків в стабільно трансформованій сої
І0134| Цей приклад ілюструє інгібіторну активність, що проявляється сконструйованими інсектицидними білками по відношенню до лускокрилих-шкідників, які експресовані рослинами сої і запропонованими у вигляді корму для відповідних комах-шкідників.
ІЇО135| Рослини сої, які експресують білки СгуїОаї 7.ппо, ТІС844 9.ппо і ТІС844 11.ппо були отримані з використанням векторів, що містять експресійні касети, описані в Прикладі 6.
Тканину листа збирали і використовували в біотесті, як описано в Прикладі 7, або, в альтернативному варіанті, ліофілізовану тканину використовували в раціоні комах для біотестів.
Біотест проводили по відношенню до різних видів лускокрилих, в тому числі ЗАМУ, ЗВІ і совки кукурудзяної (5РМУ, Неїїсомегра 7еа). В Таблиці 9 представлена активність, яка спостерігається по відношенню до цих лускокрилих-шкідників в стабільно трансформованому поколінні КО сої.
Як видно з Таблиці 9, СтуїОаї 7.ппо і ТІС844 11.ппо продемонстрували активність по відношенню до З5РУМ, ЗАММ і ВІ. ТІС844 9О.ппо (ТІС844 плюс додатковий аланін для клонування) не продемонстрували активність проти 5РМУ.
Таблиця 9
Біотест профілю активності СгтуїОа1! 7.ппо, ТІС844 9.ппо і ТІС844 11.ппо експресованих в поколінні Ко сої.
ЗЕО І МО: 40
ТІСВ844 11.ппо з з з
ЗЕО ІЮ МО: 44
ТІС844 9.ппо з з
ЗЕО І МО: 42 ж- Активний по відношенню до видів комах; - Неактивний по відношенню до видів комах.
ІО136| Вибрані об'єкти трансформації були використані для отримання КІ! рослин. К1 рослини, які експресують СгуїМра1 7.ппо, аналізували на стійкість до ЗБАМУ, ЗВГ, ЗРУМ і гусениці оксамитових бобів (УВС, Апіісагзіа деттаїаїї5). Тканина листа збирали з рослин покоління КІ і використовували в кормовому біотесті В Таблиці 10 продемонстрована активність, що спостерігається в цих тестах. Як показано в Таблиці 10, СтгуїОраї 7.ппо продемонстрував активність по відношенню до 5РУМ, БАМУ і ЗВІ..
Таблиця 10.
Біотест профілю активності СгтуїОа1! 7.ппо, експресованого в поколінні К: сої.
Стутра!1 7.ппо з з з
ЗЕО І МО: 40 ж- Активний по відношенню до видів комах; - Неактивний по відношенню до видів комах. (01371 У Таблиці 11 представлено результати польових випробувань, проведених в теплицях на стабільно трансформованих рослинах сої покоління К!, що експресують
СтгуїОа1 7.ппо. Види, використані для зараження рослин в теплицях, включають совку чорну (ВГАМУ, бродоріега созтіоіїде5), моль квасоляну (В5М, Скгосідозета арогета), совку американську (ЗАРМУ, Неїїсомегра деІюіороеєоп), п'ядуна соняшникового (5РЕЇ., КаспПіріивіа пи) і
МВС. В Таблиці 11 продемонстрована активність, що спостерігається в цих тестах. Як показано в Таблиці 11, СтуїОра1 7.ппо продемонстрував активність по відношенню до ВІ АМУ, ЗБАРУУ і
ЗР.
Таблиця 11.
Профіль активності СтуїОра! 7.ппо, експресованого в поколінні К.: сої протестований в польових випробуваннях в теплиці.
ВІ-АМУ/ ЗАРМ/
Стутра!1 7.ппо з з з
ЗЕО І МО: 40 т Активний по відношенню до видів комах; - Неактивний по відношенню до видів комах.
ІО138) Всі композиції і способи, описані і заявлені в цьому документі, можуть бути проведені та здійснені без зайвих експериментів в межах цього опису. Хоча композиції винаходу були описані з точки зору вищезазначених ілюстративних варіантів реалізації, фахівцям в цій області техніки буде зрозуміло, що варіанти, зміни, модифікації та перебудови можуть бути застосовані до композиції, описаної в цьому документі, без відступу від концепції, сутності та обсягу цього винаходи.
Більш конкретно, буде очевидно, що певні агенти, які схожі і хімічно, ї фізіологічно, можуть бути використані замість агентів, описаних в цьому документі, досягаючи тих самих або подібних результатів.
Всі такі аналогічні заміни та модифікації, очевидні фахівцям в цій області техніки, вважаються такими, що виходять за межі суті, об'єму і концепції цього винаходу, як визначено в наведеній формулі винаходу.
Claims (19)
1. Сконструйований інсектицидний білок, який містить 5ЕО ІЮ МО: 44, який відрізняється тим, що сконструйований інсектицидний білок виявляє інгібувальну активність проти видів комах ряду Герідоріега.
2. Сконструйований інсектицидний білок за п. 1, який відрізняється тим, що види ряду І ерідорієга вибрані з групи, яка складається з родів 5роаоріега і Неї/ісомегра.
3. Сконструйований інсектицидний білок за п. 1, який відрізняється тим, що види ряду І ерідорієга вибрані з групи, яка складається з видів Не/сомегра 7єа і бродорієга птидірегда.
4. Полінуклеотид, який кодує сконструйований інсектицидний білок, причому полінуклеотид функціонально зв'язаний з гетерологічним промотором, а сконструйований інсектицидний білок містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО ІО МО: 44.
5. Полінуклеотид, який кодує сконструйований інсектицидний білок, який відрізняється тим, що вказаний полінуклеотид містить нуклеотидну послідовність, яка: а) представлена 5ЕО ІО МО: 43; або р) кодує сконструйований інсектицидний білок, що містить БЕО ІО МО: 44.
6. Клітина-хазяїн, яка містить полінуклеотид, представлений ЗЕО ІЮ МО: 43, де вказана клітина-хазяїн вибрана з групи, яка складається з бактеріальної клітини-хазяїна і рослинної клітини-хазяїна.
7. Клітина-хазяїн за п. б, де вказана бактеріальна клітина-хазяїн вибрана з групи, яка складається з Адгобасіепит, НРігобійт, Васшив, Вгемібасійи5, ЕвсНегпіснпіа, Рзеидотопазв, КІерзіейла і Епміпіа.
8. Клітина-хазяїн за п. 6, де вказана рослинна клітина-хазяїн вибрана з групи, яка складається з однодольних і дводольних рослин.
9. Композиція, яка має інгібувальну активність відносно комах, яка містить сконструйований інсектицидний білок, що містить 5ЕО ІО МО: 44.
10. Композиція, яка має інгібувальну активність відносно комах за п. 9, яка додатково містить щонайменше один агент, який має інгібувальну активність відносно комах, який відрізняється від сконструйованого інсектицидного білка.
11. Композиція, яка має інгібувальну активність відносно комах за п. 10, де вказаний щонайменше один агент, який має інгібувальну активність відносно комах, вибраний з групи, яка складається з білка, який має інгібувальну активність відносно комах, і молекули длРНК, яка має інгібувальну активність відносно комах.
12. Композиція, яка має інгібувальну активність відносно комах за п. 10, де вказаний щонайменше один інший агент, який має інгібувальну активність відносно комах, виявляє активність відносно одного або більше видів шкідників рядів І ерідорієга, СоІєорієга, Нетірієга, Ноторієга або Тпузапоріега.
13. Трансгенне насіння, яке містить: а) інгібуючу ефективну відносно комах кількість сконструйованого інсектицидного білка, що містить 5ЕО ІЮ МО: 44; або р) полінуклеотид, представлений ЗЕО ІЮ МО: 43.
14. Спосіб боротьби з лускокрилим шкідником, що включає подачу в раціон лускокрилому шкіднику інгібуючої кількості сконструйованого інсектицидного білка за п. 1.
15. Трансгенна клітина рослини, рослина або частина рослини, що містять сконструйований інсектицидний білок за п. 1.
16. Спосіб боротьби з лускокрилим шкідником, що включає подачу в раціон шкіднику трансгенної клітини рослини, рослини або частини рослини за п. 15, причому клітина рослини, рослина або частина рослини експресують інгібуючу відносно лускокрилих кількість сконструйованого інсектицидного білка.
17. Товарний продукт, отриманий з трансгенної клітини рослини, рослини або частин рослини за п. 15, де вказаний продукт містить сконструйований інсектицидний білок, і де вказаний продукт вибраний з групи, яка складається з біомаси рослини, борошна грубого помелу, корму для тварин, борошна, пластівців, висівок, волокна, лушпиння і обробленого насіння.
18. Спосіб отримання насіння, що містить сконструйований інсектицидний білок за п. 1, який включає: а) посадку множини насінин, які містять сконструйований інсектицидний білок за п. 1; р) вирощування рослин з вказаного насіння; і с) збір насіння від вказаних рослин, де вказане зібране насіння містить сконструйований інсектицидний білок за п. 1.
19. Рекомбінантна полінуклеотидна молекула, яка кодує сконструйований інсектицидний білок за п. 1, яка містить нуклеотидну послідовність, яка містить зЕО ІЮО МО: 43; і полінуклеотидну послідовність, яка кодує агент, який має інгібіторну активність відносно комах, який відрізняється від інсектицидного білка.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462064994P | 2014-10-16 | 2014-10-16 | |
| US201462065017P | 2014-10-17 | 2014-10-17 | |
| PCT/US2015/055779 WO2016061377A2 (en) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA121663C2 true UA121663C2 (uk) | 2020-07-10 |
Family
ID=54477236
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201704657A UA121663C2 (uk) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих |
| UAA201909488A UA123036C2 (uk) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201909488A UA123036C2 (uk) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US10059959B2 (uk) |
| EP (2) | EP3517616A1 (uk) |
| JP (1) | JP6648127B2 (uk) |
| KR (1) | KR102127552B1 (uk) |
| CN (2) | CN106852147B (uk) |
| AR (1) | AR102301A1 (uk) |
| AU (2) | AU2015332370B2 (uk) |
| BR (1) | BR122020005237B1 (uk) |
| CA (1) | CA2963702A1 (uk) |
| CL (2) | CL2017000896A1 (uk) |
| CO (1) | CO2017004808A2 (uk) |
| CR (1) | CR20170197A (uk) |
| CU (1) | CU24405B1 (uk) |
| EA (1) | EA034764B9 (uk) |
| EC (1) | ECSP17029287A (uk) |
| ES (1) | ES2739948T3 (uk) |
| IL (1) | IL251571B (uk) |
| MX (1) | MX380621B (uk) |
| MY (1) | MY189597A (uk) |
| NI (1) | NI201700043A (uk) |
| NZ (1) | NZ730634A (uk) |
| PE (2) | PE20220960A1 (uk) |
| PH (2) | PH12017500696B1 (uk) |
| SG (2) | SG11201702748TA (uk) |
| SV (1) | SV2017005421A (uk) |
| UA (2) | UA121663C2 (uk) |
| UY (1) | UY36362A (uk) |
| WO (1) | WO2016061377A2 (uk) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201542093A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
| ES2739948T3 (es) * | 2014-10-16 | 2020-02-04 | Monsanto Technology Llc | Proteínas variantes con secuencias de aminoácidos Cry1Da1 activas contra lepidópteros |
| RU2021110857A (ru) * | 2015-12-22 | 2021-04-26 | Агбайоми, Инк. | Пестицидные гены и способы использования |
| CN110062579B (zh) * | 2016-12-12 | 2023-06-27 | 先正达参股股份有限公司 | 工程化的杀有害生物蛋白和控制植物有害生物的方法 |
| BR102018009263A8 (pt) * | 2018-05-07 | 2023-01-31 | Embrapa Pesquisa Agropecuaria | Molécula de ácido nucleico cry1da códon-otimizada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, célula vegetal, planta transgênica, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transgênica, método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e usos da molécula de ácido nucleico |
| JP7592580B2 (ja) * | 2018-07-30 | 2024-12-02 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシの遺伝子組み換え事象ｍｏｎ９５３７９ならびにその検出及び使用方法 |
| CN109917032B (zh) * | 2019-03-13 | 2021-08-24 | 杭州老爸评测科技有限公司 | 一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法 |
| BR102019023319A2 (pt) * | 2019-11-06 | 2021-05-18 | Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria | molécula de ácido nucléico do evento transgênico de milho me240913 expressando a proteína cry1da, célula, planta e semente transgênica, usos das mesmas, produto de planta, método, kit e amplicon para detecção do evento, e métodos para produzir uma planta transgênica e de controle de insetos-pragas lepidópteros |
| MX2023007427A (es) | 2020-12-21 | 2023-07-03 | Monsanto Technology Llc | Proteinas inhibidoras de insectos novedosas. |
| UY39585A (es) | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| EP4271188A4 (en) | 2020-12-31 | 2024-12-11 | Monsanto Technology LLC | NEW INSECTICIDAL PROTEINS |
| CN113913457B (zh) * | 2021-10-29 | 2023-09-19 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种抑制或杀灭桃蛀螟的方法及其应用 |
| CN114766435B (zh) * | 2022-04-27 | 2023-05-09 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 以谷物种子的水培苗盘人工饲养草地贪夜蛾幼虫的方法 |
| CN119823240A (zh) * | 2024-03-27 | 2025-04-15 | 北京大北农生物技术有限公司 | 杀虫蛋白的用途 |
| KR20250167675A (ko) * | 2024-03-27 | 2025-12-01 | 베이징 다베이농 바이오테크놀로지 컴퍼니 리미티드 | 살충 단백질 및 그의 용도 |
Family Cites Families (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0358557B1 (en) * | 1988-09-06 | 1995-04-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants transformed with a DNA sequence from bacillus thuringiensis lethal to lepidoptera |
| EP1103616A3 (en) | 1989-02-24 | 2001-06-27 | Monsanto Company | Synthetic plant genes and method for preparation |
| EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
| US5188960A (en) * | 1989-06-27 | 1993-02-23 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| UA48104C2 (uk) | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US5942664A (en) | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6023013A (en) * | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| CN1314911A (zh) * | 1998-05-01 | 2001-09-26 | 麦克西根股份有限公司 | 用dna改组优化害虫抗性基因 |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| AU7491600A (en) * | 1999-09-15 | 2001-04-17 | Monsanto Technology Llc | Lepidopteran-active bacillus thuringiensis delta-endotoxin compositions and methods of use |
| BR0016458A (pt) | 1999-12-15 | 2004-08-31 | Strategic Diagnostics Inc | Reagentes, métodos e kits para detectar proteìnas de bacillus thuringiensis |
| EP1311162B1 (en) | 2000-08-25 | 2005-06-01 | Syngenta Participations AG | Bacillus thurigiensis crystal protein hybrids |
| AU2002236442A1 (en) | 2000-11-20 | 2002-05-27 | Monsanto Technology Llc | Cotton event pv-ghbk04 (531) and compositions and methods for detection thereof |
| WO2002094008A2 (en) | 2001-01-26 | 2002-11-28 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Transgenic plants protected against parasitic plants |
| EG26529A (en) | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| US6868634B2 (en) | 2001-10-04 | 2005-03-22 | Mississippi State University | Insect resistance management in agricultural applications |
| AU2003265637A1 (en) | 2002-08-29 | 2004-03-19 | Natalia N. Bogdanova | Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants |
| EP2308971B1 (en) | 2004-04-09 | 2016-08-17 | Monsanto Technology LLC | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| EP1778714A4 (en) * | 2004-07-20 | 2008-05-21 | Phyllom Llc | PROCESS FOR THE PREPARATION AND USE OF RECOMBINANT SPORES OF BACILLUS THURINGIENSIS |
| CA2601857A1 (en) | 2005-04-01 | 2006-10-12 | Nadine Carozzi | Axmi-027, axmi-036 and axmi-038, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use |
| EP1919935B1 (en) | 2005-08-31 | 2012-12-05 | Monsanto Technology LLC | Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins |
| WO2008011586A2 (en) | 2006-07-21 | 2008-01-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis toxin with anti-coleopteran activity |
| WO2008011574A2 (en) | 2006-07-21 | 2008-01-24 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis toxin with anti-lepidopteran activity |
| BRPI0720135A2 (pt) | 2006-12-08 | 2012-11-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | molécula de ácido nucleico isolada, vetor, cassete de expressão, célula hospedeira, planta transgênica, semente, molécula de ácido nucleico, vetor, poliptìdeo, método para produzir uma planta com resistência a insetos aumentada, polinucleotìdeo isolado, cassete de expressão recombinante, polipeptìdeo isolado, célula hospedeira transformada, planta transformada, semente transformada |
| RU2532838C2 (ru) | 2007-03-28 | 2014-11-10 | Зингента Партисипейшнс Аг | Инсектицидные белки |
| US8609936B2 (en) | 2007-04-27 | 2013-12-17 | Monsanto Technology Llc | Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis |
| US7772465B2 (en) | 2007-06-26 | 2010-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| US8283524B2 (en) | 2008-05-15 | 2012-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| CA2727614A1 (en) | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| CN105002189A (zh) | 2008-06-25 | 2015-10-28 | 阿森尼克斯公司 | 毒素基因及其使用方法 |
| PE20110310A1 (es) | 2008-07-02 | 2011-05-29 | Athenix Corp | Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 y axmi-184: proteinas insecticidas |
| US8445749B2 (en) | 2008-09-19 | 2013-05-21 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| US20100077507A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity |
| US20100162439A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-06-24 | Athenix Corporation | Pesticidal genes from brevibacillus and methods for their use |
| MX2011006694A (es) | 2008-12-23 | 2011-10-24 | Athenix Corp | Gen de delta-endotoxina axmi-150 y metodos de uso del mismo. |
| CN102361982B (zh) | 2009-01-23 | 2015-03-11 | 先锋国际良种公司 | 具有鳞翅目活性的新苏云金芽孢杆菌基因 |
| BRPI1007915B1 (pt) | 2009-02-05 | 2019-05-14 | Athenix Corporation | Genes de variante axmi-r1 delta-endotoxina, vetor, célula hospedeira microbiana, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, e métodos para controlar e matar uma população de peste de coleópteros, 5 e para protegeruma planta de uma peste |
| AR075634A1 (es) | 2009-02-27 | 2011-04-20 | Athenix Corp | Proteinas pesticidas y metodos de uso de las mismas |
| AR075818A1 (es) | 2009-03-11 | 2011-04-27 | Athenix Corp | Axmi-001, axmi- 002, axmi-030 y axmi -035 y axmi -045: genes de toxina y metodos para su uso |
| WO2010120452A1 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Dow Agrosciences Llc | Dig-3 insecticidal cry toxins |
| MX2011013674A (es) | 2009-06-16 | 2012-01-20 | Dow Agrosciences Llc | Toxinas cry dig-5 insecticidas. |
| KR20120039625A (ko) | 2009-06-16 | 2012-04-25 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 살충성 ｄｉｇ-11 ｃｒｙ 독소 |
| RU2012101277A (ru) | 2009-06-16 | 2013-07-27 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Инсектицидные cry-токсины dig-10 |
| MX2012001426A (es) | 2009-07-31 | 2012-03-26 | Athenix Corp | Familia de genes plaguicidas axmi-192 y metodos para su uso. |
| PH12012500642A1 (en) * | 2009-10-02 | 2019-07-10 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| CA2780540A1 (en) | 2009-11-12 | 2011-05-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| BR112012015005A2 (pt) * | 2009-12-16 | 2015-09-01 | Dow Agrosciences Llc | Proteínas cry inseticidas cry1ca modificadas |
| US8586832B2 (en) | 2009-12-21 | 2013-11-19 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity |
| EP2536266A2 (en) | 2010-02-18 | 2012-12-26 | Athenix Corp. | Axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, and axmi231 delta-endotoxin genes and methods for their use |
| EP2536267B1 (en) | 2010-02-18 | 2015-07-22 | Athenix Corp. | AXMI221z, AXMI222z, AXMI223z, AXMI224z, AND AXMI225z DELTA-ENDOTOXIN GENES AND METHODS FOR THEIR USE |
| MX2013001742A (es) | 2010-08-19 | 2013-05-14 | Pioneer Hi Bred Int | Nuevo gen de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera |
| BR112013015515A2 (pt) | 2010-12-28 | 2018-04-24 | Pioneer Hi Bred Int | molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada da planta, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga de lepidóptero, método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de dna, método para proteger uma planta contra uma praga |
| MX2013008392A (es) | 2011-01-24 | 2013-08-12 | Pioneer Hi Bred Int | Nuevos genes de bacillus thuringiensis con actividad lepidoptera. |
| CA2826229A1 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic insecticidal proteins active against corn rootworm |
| US8878007B2 (en) | 2011-03-10 | 2014-11-04 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| WO2012131495A2 (en) * | 2011-03-30 | 2012-10-04 | Universidad Nacional Autónoma de México | Mutant bacillus thuringiensis cry genes and methods of use |
| US9321814B2 (en) | 2011-03-30 | 2016-04-26 | Athenix Corp. | AXMI238 toxin gene and methods for its use |
| GB201105418D0 (en) | 2011-03-31 | 2011-05-18 | Univ Durham | Pesticide |
| US9238678B2 (en) | 2011-04-07 | 2016-01-19 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory toxin family active against hemipteran and/or lepidopteran insects |
| RS56642B1 (sr) | 2011-07-28 | 2018-03-30 | Athenix Corp | Axmi205 varijanta proteina i postupci za njihovu upotrebu |
| MX363910B (es) | 2011-07-28 | 2019-04-08 | Athenix Corp | Gen de la toxina axmi270 y sus metodos de uso. |
| BR112014002027A8 (pt) | 2011-07-29 | 2022-07-05 | Athenix Corp | Gene pesticida axmi279 e métodos para a sua utilização |
| CA2866241C (en) | 2012-03-08 | 2021-03-16 | Athenix Corp. | Axmi345 delta-endotoxin gene and methods for its use |
| WO2013152264A2 (en) | 2012-04-06 | 2013-10-10 | Monsanto Technology Llc | Proteins toxic to hemipteran insect species |
| US9688730B2 (en) | 2012-07-02 | 2017-06-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US9475847B2 (en) | 2012-07-26 | 2016-10-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| WO2014055881A1 (en) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects |
| AR092971A1 (es) | 2012-10-26 | 2015-05-06 | Lilly Co Eli | Inhibidores de agrecanasa |
| TW201542093A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
| ES2739948T3 (es) * | 2014-10-16 | 2020-02-04 | Monsanto Technology Llc | Proteínas variantes con secuencias de aminoácidos Cry1Da1 activas contra lepidópteros |
-
2015
- 2015-10-15 ES ES15791074T patent/ES2739948T3/es active Active
- 2015-10-15 BR BR122020005237-6A patent/BR122020005237B1/pt active IP Right Grant
- 2015-10-15 EA EA201790842A patent/EA034764B9/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-10-15 MY MYPI2017701292A patent/MY189597A/en unknown
- 2015-10-15 CU CU2017000048A patent/CU24405B1/es unknown
- 2015-10-15 CA CA2963702A patent/CA2963702A1/en active Pending
- 2015-10-15 MX MX2017004914A patent/MX380621B/es unknown
- 2015-10-15 PE PE2021001320A patent/PE20220960A1/es unknown
- 2015-10-15 UA UAA201704657A patent/UA121663C2/uk unknown
- 2015-10-15 EP EP19160017.0A patent/EP3517616A1/en not_active Withdrawn
- 2015-10-15 AU AU2015332370A patent/AU2015332370B2/en active Active
- 2015-10-15 CN CN201580055966.8A patent/CN106852147B/zh active Active
- 2015-10-15 CN CN202011075400.0A patent/CN112175052B/zh active Active
- 2015-10-15 KR KR1020177013030A patent/KR102127552B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2015-10-15 SG SG11201702748TA patent/SG11201702748TA/en unknown
- 2015-10-15 SG SG10201911581WA patent/SG10201911581WA/en unknown
- 2015-10-15 JP JP2017520327A patent/JP6648127B2/ja active Active
- 2015-10-15 NZ NZ730634A patent/NZ730634A/en unknown
- 2015-10-15 PE PE2017000712A patent/PE20170942A1/es unknown
- 2015-10-15 WO PCT/US2015/055779 patent/WO2016061377A2/en not_active Ceased
- 2015-10-15 EP EP15791074.6A patent/EP3207144B1/en active Active
- 2015-10-15 CR CR20170197A patent/CR20170197A/es unknown
- 2015-10-15 UA UAA201909488A patent/UA123036C2/uk unknown
- 2015-10-15 US US14/884,432 patent/US10059959B2/en active Active
- 2015-10-16 UY UY0001036362A patent/UY36362A/es active IP Right Grant
- 2015-10-16 AR ARP150103362A patent/AR102301A1/es active IP Right Grant
-
2017
- 2017-04-05 IL IL251571A patent/IL251571B/en active IP Right Grant
- 2017-04-07 NI NI201700043A patent/NI201700043A/es unknown
- 2017-04-07 SV SV2017005421A patent/SV2017005421A/es unknown
- 2017-04-11 PH PH12017500696A patent/PH12017500696B1/en unknown
- 2017-04-11 CL CL2017000896A patent/CL2017000896A1/es unknown
- 2017-05-12 EC ECIEPI201729287A patent/ECSP17029287A/es unknown
- 2017-05-12 CO CONC2017/0004808A patent/CO2017004808A2/es unknown
- 2017-12-07 US US15/835,346 patent/US10287605B2/en active Active
-
2018
- 2018-07-27 US US16/047,187 patent/US10457958B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-05 CL CL2019001541A patent/CL2019001541A1/es unknown
- 2019-08-19 AU AU2019219724A patent/AU2019219724B2/en active Active
- 2019-09-17 US US16/573,538 patent/US10801037B2/en active Active
- 2019-12-20 PH PH12019502912A patent/PH12019502912A1/en unknown
-
2020
- 2020-09-22 US US17/028,518 patent/US11396661B2/en active Active
-
2022
- 2022-07-26 US US17/815,122 patent/US11905519B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-04 US US18/404,247 patent/US12398401B2/en active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA121663C2 (uk) | Сконструйований інсектицидний білок, який має активність проти лускокрилих | |
| UA123480C2 (uk) | Химерний інсектицидний білок, інгібіторний відносно лускокрилих шкідників | |
| BR112014022195A2 (pt) | Produção de peptídeo tóxico, expressão de peptídeo em plantas e combinações de peptídeos ricos em cisteína | |
| JPH02231094A (ja) | 昆虫選択的毒素、その毒素をコードする遺伝子、その毒素に結合する抗体およびその毒素を発現するトランスジェニック植物細胞および植物 | |
| CN102972426B (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN106591352B (zh) | 杀虫蛋白组合及其管理昆虫抗性的方法 | |
| MXPA06007005A (es) | Composiciones de proteinas y genes secretados de bacillus thuringiensis y usos de las mismas. | |
| UA122046C2 (uk) | Рекомбінантний поліпептид із інсектицидною активністю | |
| EA037469B1 (ru) | Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым | |
| JP2017536122A (ja) | 新規の昆虫抑制タンパク質 | |
| KR20230078719A (ko) | 해충 방제용 뮤-디구에톡신-Dc1a 변이형 폴리펩타이드 | |
| US20240287539A1 (en) | Insect inhibitory proteins | |
| JP7125976B2 (ja) | 新規の昆虫阻害タンパク質 | |
| UA126327C2 (uk) | Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що проявляє інгібуючу активність відносно комах | |
| BR112020026523A2 (pt) | Proteínas inibidoras de inseto | |
| CN116848250A (zh) | 新型昆虫抑制蛋白 | |
| CN103734169A (zh) | 控制害虫的方法 | |
| CN116670155A (zh) | 新型昆虫抑制性蛋白质 | |
| ES2435079T3 (es) | Nuevas proteínas bacterianas con actividad plaguicida | |
| EA040283B1 (ru) | БЕЛКИ Cry1Da1 С ВАРИАНТАМИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ | |
| CN120358940A (zh) | 新型昆虫抑制蛋白 | |
| BR122025006475A2 (pt) | Molécula de ácido nucleico recombinante, planta ou parte da mesma, semente da planta, uso das mesmas, planta resistente à infestação de insetos, composição inibidora de insetos, produto primário, métodos para produção de sementes, para controlar uma infestação de pragas e para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante ou para detectar a presença de uma proteína pesticida ou seu fragmento | |
| BR122025006482A2 (pt) | Molécula de ácido nucleico recombinante, planta ou parte da mesma, semente da planta, uso das mesmas, planta resistente à infestação de insetos, composição inibidora de insetos, produto primário, métodos para produção de sementes, para controlar uma infestação de pragas e para detectar a presença da molécula de ácido nucleico recombinante ou para detectar a presença de uma proteína pesticida ou seu fragmento | |
| Al-Forqani | Development of Insect Resistance Potato Cultivars Via Agrobacterium Mediated Transformation with Cry1Ac Gene Expression G-Endotoxin | |
| BR112019012768A2 (pt) | proteínas inibidoras de inseto |