JP2011526791A - Bacillusthuringiensis由来のVip3A殺昆虫性タンパク質であるAXMI−115、AXMI−113、AXMI−005、AXMI−163およびAXMI−184並びにその使用法 - Google Patents
Bacillusthuringiensis由来のVip3A殺昆虫性タンパク質であるAXMI−115、AXMI−113、AXMI−005、AXMI−163およびAXMI−184並びにその使用法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、分子生物学の分野に関する。殺昆虫性タンパク質をコードする新たな遺伝子が提供される。これらのタンパク質およびそれらをコードする核酸配列は、殺昆虫性製剤の調製およびトランスジェニック昆虫抵抗性植物の産生に有用である。
Bacillus thuringiensisは、昆虫の特定の目および種に対して特異的に毒性である結晶性封入体を産生するその能力によって特徴づけられるグラム陽性胞子形成土壌細菌であるが、植物および他の標的としない生物には無害である。この理由のために、Bacillus thuringiensis株またはその殺昆虫性タンパク質を含む組成物を、様々なヒトまたは動物の疾病のために農業的昆虫害虫または媒介昆虫を制御するための環境的に許容される殺昆虫剤として使用できる。
細菌、植物、植物細胞、組織および種子に対して昆虫抵抗性を付与するための組成物および方法が提供される。組成物は、デルタ−エンドトキシンポリペプチドの配列をコードする核酸分子、そのような核酸分子を含むベクター、および前記ベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はまた、エンドトキシンのポリペプチド配列、およびそのようなポリペプチドに対する抗体を含む。ヌクレオチド配列を、生物(微生物および植物を含む)における形質転換および発現のためにDNA構築物または発現カセットにおいて使用することができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、生物(微生物または植物を含むがこれらに限定されるわけではない)における発現のために設計された合成配列であり得る。組成物はまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織および種子を含む。
本発明は、生物、特に植物または植物細胞において昆虫抵抗性を調節するための組成物および方法に関する。前記方法は、本発明のデルタ−エンドトキシンタンパク質をコードするヌクレオチド配列で生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有する植物および微生物を調製するのに有用である。従って、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織および種子が提供される。
本発明の1つの局面は、デルタ−エンドトキシンタンパク質およびポリペプチドまたは生物学的に活性なその部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離または組換え核酸分子、並びに、デルタ−エンドトキシンをコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸分子に関する。本明細書で使用した用語「核酸分子」は、DNA分子(例えば組換えDNA、cDNAまたはゲノムDNA)およびRNA分子(例えばmRNA)並びにヌクレオチド類似体を使用して作製したDNAまたはRNAの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖DNAである。
デルタ−エンドトキシンタンパク質もまた本発明に包含される。「デルタ−エンドトキシンタンパク質」とは、配列番号4、5、6、13または14で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。その断片、生物学的に活性な部分、および変異体も提供され、そして本発明の方法を実施するために使用され得る。
デルタ−エンドトキシンのDNA配列は、様々な方法によって改変され得、そして、これらの改変により、本発明のデルタ−エンドトキシンによってコードされるものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNA配列がもたらされ得ることが認識される。このタンパク質は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入(約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、約130またはそれ以上までのアミノ酸置換、欠失または挿入を含む)を含む様々な方法で改変され得る。
本発明のデルタ−エンドトキシン配列は、対象の植物において発現させるための発現カセットに提供され得る。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現を行なうことのできるDNA構築物を意味する。典型的にはこれらはプロモーターおよびコード配列を含む。しばしば、このような構築物はまた、3’非翻訳領域を含む。このような構築物は、特定の細胞内構造、例えば葉緑体(または他のプラスチド)、小胞体、またはゴルジ装置へのペプチドの同時翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含み得る。
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入することを含む。「導入」とは、構築物が植物の細胞内部に近づけるように、植物にヌクレオチド構築物を提供することを意味する。本発明の方法は、植物にヌクレオチド構築物を導入するための特定の方法が使用されることを要求せず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも1つの細胞の内部に近づけることのみを要求する。ヌクレオチド構築物を植物に導入するための方法は当技術分野において公知であり、安定な形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法を含むがこれらに限定されるわけではない。
植物細胞に異種外来DNAを導入した後、植物ゲノムにおける異種遺伝子の形質転換または組込みは、組み込まれた遺伝子に関連した核酸、タンパク質および代謝物の分析などの様々な方法によって確認される。
本発明の別の局面において、殺昆虫活性を有するデルタ−エンドトキシンを発現しているトランスジェニック植物を作製し得る。例として前記した方法を使用してトランスジェニック植物を作製し得るが、トランスジェニック植物細胞を作製する様式は本発明にとって重要ではない。アグロバクテリウム媒介形質転換、微粒子銃形質転換、および非粒子媒介方法などの当技術分野において公知または記載された方法を、実験者の判断で使用し得る。デルタ−エンドトキシンを発現している植物を、例えば、カルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、およびこのようなトランスジェニックカルスからの繁殖性植物の再生などの、当技術分野において記載される一般的な方法によって単離し得る。このようなプロセスにおいて、植物細胞におけるその発現が、形質転換細胞を同定および選択するための能力を付与する限りにおいて、任意の遺伝子を選択マーカーとして使用し得る。
昆虫制御においてまたは殺昆虫剤として他の生物を操作する際に、本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含む株を使用するための一般的な方法は当技術分野において公知である。例えば、U.S. Patent No. 5,039,523およびEP 0480762A2を参照されたい。
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態で適用され、そして他の化合物と共に同時にまたは連続的に、処置しようとする穀物領域または植物に適用することができる。これらの化合物は、肥料、雑草除去剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗浄剤、殺昆虫性石鹸、ドルマントオイル(dormant oils)、ポリマー、および/または1回の製剤の適用後に標的領域の長期投与を可能とする遅延放出もしくは生分解性担体製剤であり得る。それらはまた、所望であれば、さらに農学的に許容される担体、界面活性剤、または製剤の分野で慣用的に使用される適用を促進する補助剤を一緒に含む、選択的除草剤、化学的殺昆虫剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、抗アメーバ剤、殺虫剤、抗真菌剤、抗細菌剤、抗線虫剤、軟体類駆除剤、またはこれらのいくつかの調製物の混合物であり得る。適切な担体および補助剤は、固体または液体であり得、そして製剤技術で通常使用される物質、例えば天然もしくは再生鉱物、溶媒、分散剤、湿潤剤、粘着付与剤、結合剤または肥料に相当する。同様に、製剤は、標的害虫による殺昆虫性製剤の摂食または摂取を可能とするために、食用「餌」へと調製し得るか、または害虫「罠」へと形作られ得る。
メイズ:Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ(European corn borer);Agrotis ipsilon、タマナヤガ(black cutworm);Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(corn earworm);Spodoptera frugiperda、ヨトウガ(fall armyworm);Diatraea grandiosella、南西部アワノメイガ(southwestern corn borer);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ(lesser cornstalk borer);Diatraea saccharalis、シュガーケインボーラー(surgarcane borer);Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム(western corn rootworm);Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム(northern corn rootworm);Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム(southern corn rootworm);Melanotus spp.、ワイアワーム(wireworms);Cyclocephala borealis、ノーザンマスクドコガネムシ(northern masked chafer)(アオドウガネ、white grub);Cyclocephala immaculata、サザンマスクドコガネムシ(southern masked chafer)(アオドウガネ);Popillia japonica、マメコガネ(Japanese beetle);Chaetocnema pulicaria、ミノハムシ(corn flea beetle);Sphenophorus maidis、メイズビルバグ(maize billbug);Rhopalosiphum maidis、コーンリーフアフィド(corn leaf aphid);Anuraphis maidiradicis、コーンルートアフィド(corn root aphid);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ(chinch bug);Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー(redlegged grasshopper);Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー(migratory grasshopper);Hylemya platura、タネバエ(seedcorn maggot);Agromyza parvicornis、コーンブロットリーフマイナー(corn blot leafminer);Anaphothrips obscrurus、グラススリップス(grass thrips);Solenopsis milesta、シーフアント(thief ant);Tetranychus urticae、ナミハダニ(twospotted spider mite);
ソルガム:Chilo partellus、ソルガムボーラー(sorghum borer);Spodoptera frugiperda、ヨウトガ;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(corn earworm);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム(granulate cutworm);Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ;エレオデス(Eleodes)属、コノデルス(Conoderus)属、およびアエオルス(Aeolus)属、ワイアワーム;Oulema melanopus、シリアルリーフビートル(cereal leaf beetle);Chaetocnema pulicaria、トウモロコシトビハムシ;Sphenophorus maidis、メイズビルバグ;Rhopalosiphum maidis、コーンリーフアフィド;Sipha flava、イエローシュガーケーンアフィド(yellow sugarcane aphid);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Contarinia sorghicola、ソルガムタマバエ(sorghum midge);Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ(carmine spider mite);Tetranychus urticae、ナミハダニ;
コムギ:Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム(army worm);Spodoptera frugiperda、ヨウトガ;Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Agrotis orthogonia、ウエスタンカットワーム(western cutworm);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Oulema melanopus、シリアルリーフビートル(cereal leaf beetle);Hypera punctata、クローバーリーフウィービル(clover leaf weevil);Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム;ロシアンウィートアフィド(Russian wheat aphid);Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ(greenbug);Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインアフィド(English grain aphid);Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー(differential grasshopper);Melanoplus sanguinipes、ミグラトリーグラスホッパー;Mayetiola destructor、ヘシアンバエ(Hessian fly);Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ(wheat midge);Meromyza americana、ウィートステムマゴット(wheat stem maggot);Hylemya coarctata、ウィートバルブフライ(wheat bulb fly);Frankliniella fusca、タバコスリップス(tobacco thrips);Cephus cinctus、ウィートステムソーフライ(wheat stem sawfly);Aceria tulipae、チューリップサビダニ(wheat curl mite);
ヒマワリ:Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス(sunflower bud moth);Homoeosoma electellum、サンフラワーモス(sunflower moth);zygogramma exclamationis、サンフラワービートル(sunflower beetle);Bothyrus gibbosus、キャロットビートル(carrot beetle);Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ(sunflower seed midge);
ワタ:Heliothis virescens、コットンバッドワーム(cotton budworm);Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(cotton bollworm);Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ(beet armyworm);Pectinophora gossypiella、ワタアカミムシ(pink bollworm);Anthonomus grandis、ボールウィービル(boll weevil);Aphis gossypii、ワタアブラムシ(cotton aphid);Pseudatomoscelis seriatus、コットンフリーホッパー(cotton fleahopper);Trialeurodes abutilonea、バンデッドウィングドホワイトフライ(bandedwinged whitefly);Lygus lineolaris、サビイロカスミカメ(tarnished plant bug);Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー;Thrips tabaci、ネギアザミウマ(onion thrips);Franklinkiella fusca、タバコスリップス;Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ(carmine spider mite);Tetranychus urticae、ナミハダニ;
コメ:Diatraea saccharalis、シュガーケインボーラー;Spodoptera frugiperda、ヨトウガ;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(corn earworm);Colaspis brunnea、グレープコラスピス(grape colaspis);Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ(rice water weevil);Sitophilus oryzae、ココクゾウムシ(rice weevil);Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ(rice leafhopper);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ(green stink bug);
ダイズ:Pseudoplusia includens、ソイビーンルーパー(soybean looper);Anticarsia gemmatalis、ベルベットビーンキャタピラー(velvetbean caterpillar);Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム(green cloverworm);Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ; Agrotis ipsilon、タマナヤガ;Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ;Heliothis virescens、コットンバッドワーム;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(cotton bollworm);Epilachna varivestis、インゲンテントウ(Mexican bean beetle);Myzus persicae、モモアカアブラムシ(green peach aphid);Empoasca fabae、ジャガイモヒメヨコバイ(potato leafhopper);Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ;Melanoplus femurrubrum、レッドレッグドグラスホッパー;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー;Hylemya platura、タネバエ(seedcorn maggot);Sericothrips variabilis、ソイビーンスリップス(soybean thrips);Thrips tabaci、ネギアザミウマ;Tetranychus turkestani、ストロベリースパイダーマイト(strawberry spider mite);Tetranychus urticae、ナミハダニ;
オオムギ:Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ; Agrotis ipsilon、タマナヤガ(black cutworm);Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ;Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Acrosternum hilare、グリーンスティンクバグ;Euschistus servus、ブラウンスティンクバグ(brown stink bug);Delia platura、タネバエ;Mayetiola destructor、ヘシアンバエ;Petrobia latens、ブラウンウィートマイト(brown wheat mite);
アブラナ:Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ(cabbage aphid);Phyllotreta cruciferae、フリービートル(Flea beetle);Mamestra configurata、バーサアーミーワーム(Bertha armyworm);Plutella xylostella、コナガ;デリア(Delia)属、ルートマゴット(Root maggots)。
植物収穫を増加させるための方法が提供される。前記方法は、植物または植物細胞に、本明細書で開示した殺昆虫性配列を含むポリヌクレオチドを導入することを含む。本明細書で定義したような植物の「収穫」は、植物によって産生されるバイオマスの品質および/または量をいう。「バイオマス」とは、任意の測定される植物産物を意味する。バイオマス産生の増加は、測定される植物産物の収穫の任意の向上である。植物収穫の向上は、いくつかの商業的な応用を有する。例えば、植物の葉のバイオマスの増加は、ヒトまたは動物の消費のための葉野菜の収穫を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加を使用して、植物に由来する医薬または工業製品の産生を増加させることができる。収穫の増加は、殺昆虫性配列を発現していない植物と比較して、収穫において少なくとも1%増加、少なくとも3%増加、少なくとも5%増加、少なくとも10%増加、少なくとも20%増加、少なくとも30%増加、少なくとも50%増加、少なくとも70%増加、少なくとも100%またはそれ以上の増加を含むがこれらに限定されるわけではない任意の統計学的に有意な増加を含み得る。
実施例1.Bacillus thuringiensis株ATX12983からの新たな毒素遺伝子Axmi115の発見
完全な遺伝子配列を、以下のようにMiDASゲノムアプローチを介して選択した株から同定した:
・株からの染色体外DNAの調製。染色体外DNAは、以下のいくつかまたは全ての混合物を含む:様々なサイズのプラスミド;ファージ染色体;精製プロトコルによって分離されないゲノムDNA断片;他の特徴づけられていない染色体外分子。
・サイズ分布断片を作製するための染色体外DNAの機械的または酵素的剪断。
・断片化DNAのシークエンス
・相同性および/または他のコンピューター分析を介した推定毒素遺伝子の同定。
・必要である場合、いくつかのPCRまたはクローニング戦略の1つによる対象の遺伝子の配列解読完了(例えばTAIL−PCR)。
遺伝子の長さ、DNA塩基対: 2409
タンパク質の長さ、アミノ酸残基: 803
推定されるタンパク質分子量、Da: 90877
公知の相同体およびおよその同一率:
Vip3Afl−70.7%
Axmi005−70.4%
Axmi026−70.4%
Vip3Aa7−70.1
AXMI−005殺昆虫性遺伝子を、以下のステップを使用して、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、U.S. Patent Publication No. 20040014091に記載のようにMiDASアプローチを使用してATX13002株から同定した:
遺伝子発見のために現在の戦略においてとったステップ:
ステップ1:株からの培養物を大量に増殖させた。その後、プラスミドDNAを、超遠心機で回転させた塩化セシウム勾配によって染色体DNAから分離した。その後、精製したプラスミドDNAを、平均サイズのコード領域を網羅するのに適した5〜10kbサイズ範囲へと霧状化した。断片末端を磨き、その後、平滑末端を産生する制限酵素で切断されたベクターに一晩かけてライゲートした。
ステップ3:一旦、ショットガンライブラリーの品質をチェックし確認したら、コロニーを96ウェルフォーマットで成長させ、調製し、そしてシークエンスした。ライブラリープレートを、初回のスクリーニングのためにベクター骨格について末端シークエンスした。
ステップ5:全ての解読をアセンブリプロジェクトへと編集し、そして一緒にアラインさせてコンティグを形成した。これらのコンティグを、コンティグに加えられていないかもしれない任意の個々の解読と共に、BLASTを使用して、バッチフォーマットを使用して、公知のデルタ−エンドトキシン遺伝子の全てのクラスからなる内部データベースに対して分析した。公知の遺伝子に対して任意の相同性を引き出した任意のコンティグまたは個々の解読を、仮定される完全コード領域を網羅したライブラリーから単一クローンを選択することによってさらに分析した。
ステップ6:その後、対象の領域を網羅する個々のクローン上を、配列を伸長するためのプライマーを設計することによって、1つずつ解読しながら歩行した。これは、クローンの両末端解読が接続されるまで行なわれ、そして網羅は少なくとも2回であった。その後、単一クローンの完了したコンティグを、BLAST(blastnおよびblastxの両方)を使用して全ての公知の殺昆虫性遺伝子の公共データベースに対して分析した。その後、両方の探索からのヒットを全ての遺伝子の内部データベース(コード配列のみにとどめられた)から引き出し、そして完了したライブラリークローン配列とアラインさせ、公知の遺伝子からの相違の比率を決定した。
完全な遺伝子配列を、以下のようにMiDASゲノムアプローチを介して選択された株から同定した:
・株からの染色体外DNAの調製。染色体外DNAは、以下のいくつかまたは全ての混合物を含む:様々なサイズのプラスミド;ファージ染色体;精製プロトコルによって分離されないゲノムDNA断片;他の特徴づけられていない染色体外分子。
・サイズ分布断片を作製するための染色体外DNAの機械的または酵素的剪断。
・断片化DNAのシークエンス
・相同性および/または他のコンピューター分析を介した推定毒素遺伝子の同定。
・必要である場合、いくつかのPCRまたはクローニング戦略の1つによる対象の遺伝子の配列解読完了(例えばTAIL−PCR)。
遺伝子の長さ、DNA塩基対: 2385
タンパク質の長さ、アミノ酸残基: 795
推定されるタンパク質分子量、Da: 89475
公知の相同体およびおよその同一率:
Vip3Ah−99%
Vip3Aa18−79.8%
Axmi005−79%
各々についての完全な遺伝子配列を、以下のようにMiDASゲノムアプローチを介して選択した株から同定した:
・株からの染色体外DNAの調製。染色体外DNAは、以下のいくつかまたは全ての混合物を含む:様々なサイズのプラスミド;ファージ染色体;精製プロトコルによって分離されないゲノムDNA断片;他の特徴づけられていない染色体外分子。
・サイズ分布断片を作製するための染色体外DNAの機械的または酵素的剪断。
・断片化DNAのシークエンス
・相同性および/または他のコンピューター分析を介した推定毒素遺伝子の同定。
・必要である場合、いくつかのPCRまたはクローニング戦略の1つによる対象の遺伝子の配列解読完了(例えばTAIL−PCR)。
遺伝子の長さ、DNA塩基対: 2370
タンパク質の長さ、アミノ酸残基: 790
推定されるタンパク質分子量、Da: 88,700
公知の相同体およびおよその同一率:
U.S. Patent 7,129,212からの配列番号17−98%
Axmi005−78%
遺伝子の長さ、DNA塩基対: 2370
タンパク質の長さ、アミノ酸残基: 790
推定されるタンパク質分子量、Da: 88,300
公知の相同体およびおよその同一率:
Vip3Afl−93%
Axmi005−86%
本発明の1つの局面において、合成axmi配列を作製する。これらの合成配列は、親axmi配列と比較して改変されたDNA配列を有し、そして、対応する親AXMIタンパク質と同一線上にあるが、多くのデルタ−エンドトキシンタンパク質に存在するC末端「結晶ドメイン」を欠失しているタンパク質をコードする。
Bacillus種における本発明の遺伝子およびタンパク質の発現の一例として、本明細書で開示した殺昆虫性遺伝子をPCRによって増幅し、そしてPCR産物を、当技術分野において周知の方法によって、Bacillus発現ベクターpAX916または別の適切なベクターにクローニングする。axmi遺伝子を有するベクターを含む、得られるBacillus株を、胞子形成が顕微鏡検査によって明らかとなるまで、CYS培地(10g/lバクト・カシトン(Bacto-casitone);3g/l酵母抽出液;6g/l KH2PO4;14g/l K2HPO4;0.5mM MgSO4;0.05mM MnCl2;0.05mM FeSO4)などの慣用的な増殖培地で培養する。試料を調製し、そしてバイオアッセイで活性について試験する。
E.coliに基づいた系における本発明の遺伝子およびタンパク質の発現法の一例として、各axmi遺伝子の完全ORFを、pRSF1bに基づいたE. coli発現ベクターにクローニングする。得られたクローンを、制限酵素解析によって、および最終的にクローニングされた遺伝子の完全なシークエンスによって確認する。
完全オープンリーディングフレーム並びに各遺伝子の上流および隣に天然に存在しているDNA領域の部分を含むDNAセグメントを含むE. coliクローンを作製した。axmi−113(配列番号5)、axmi−115(配列番号6)またはaxmi−005(配列番号4)の各々についてのこのDNAセグメントを増幅し、ベクターpAX916にクローニングして、それぞれクローンpAX5463、pAX5464およびpAX5465を生成した。得られたクローンを制限酵素解析によって、およびクローニングされた断片の完全なシークエンスによって確認した。
AXMI−005、AXMI−113またはAXMI−115を含む可溶性抽出液を、昆虫アッセイにおいて適切な対照を用いて試験した。24ウェル組織培養プレート(Corning)に、1mlの多種食餌(Bio-Serv)を満たし、そして固形化させた。一旦固形化すると、40μlのタンパク質試料を各ウェルの食餌表面に置き、そして室温で浸漬乾燥した。実験に依存して、卵塊または新生仔幼虫のいずれかを各ウェルに入れた。プレートをガス透過性メンブラン(Research Products International)で封をし、そして25℃および90%相対湿度でインキュベートした。5または7日後、試料を、緩衝液のみまたは非形質転換抽出液対照と比較して眼でスコアリングした。
遺伝子発現および精製
・Axmi184の毒素ドメインをコードするDNA領域を、E. coli発現ベクターpMAL−C4xの、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードするmalE遺伝子の後にクローニングした。このインフレーム融合により、E. coliにおいてMBP−Axmi084融合タンパク質の発現がなされた。
・E. coliにおける発現のために、BL21*DE3を個々のプラスミドで形質転換した。単一コロニーを、カルベニシリンおよびグルコースが補充されたLBに接種し、そして37℃で一晩増殖させた。次の日、新たな培地に、一晩培養液の1%を接種し、そして37℃でlog期まで増殖させた。その後、培養液を、20℃で一晩かけて0.3mM IPTGを用いて誘導した。各細胞ペレットを、20mMトリス−Cl緩衝液、pH7.4+200mM NaCl+1mM DTT+プロテアーゼ阻害剤中に懸濁し、そして超音波処理した。SDS−PAGEによる分析は、融合タンパク質の発現を確認した。
・全細胞遊離抽出液を、MBP−AXMI184融合タンパク質のアフィニティ精製のためにFPLCに付けたアミロースカラムに流した。結合した融合タンパク質をレジンから10mMのマルトース溶液を用いて溶出した。その後、精製融合タンパク質をXa因子またはトリプシンで切断して、AXMI184タンパク質からアミノ末端MBPタグを除去した。タンパク質の切断および可溶性を、SDS−PAGEによって決定した。
・切断したタンパク質を、昆虫アッセイにおいて適切な対照を用いて試験した。5日目のプレートの解読は、コナガに対するAXMI−184の以下の活性を示した。
コーンにおける発現のためにそのコドンが最適化されたaxmi005、axmi113およびaxmi115遺伝子を本実施例において使用した。タグが付いていないバージョンのoptaxmi005(pAX5478)、optaxmi113(pAX5493)およびoptaxmi115(pAX5477)を発現しているプラスミドを使用して、ここに記載のようなDNA交換構築物を設計した。
害虫に対して殺虫剤として作用する殺昆虫性タンパク質の能力は、しばしば多くの方法で評価される。当技術分野において周知な1つの方法は、摂食アッセイを実施することである。このような摂食アッセイにおいて、害虫を、試験しようとする化合物または対照試料のいずれかを含む試料に曝す。しばしば、これは試験しようとする材料またはこのような材料の適切な希釈液を、害虫が摂取する材料、例えば人工食餌上に置くことによって行なわれる。試験しようとする材料は、液体、固体、またはスラリーであり得る。試験しようとする材料を表面上に置き得、そしてその後、乾燥させ得るか、または食餌中に取り込み得る。あるいは、試験しようとする材料を溶融した人工食餌と混合し得、その後、アッセイチャンバーに分配し得る。アッセイチャンバーは、例えば、カップ、皿、またはマイクロタイタープレートのウェルであり得る。
本発明の遺伝子の各コード領域を、植物における発現のために、独立して、適切なプロモーターおよび終結配列と接続する。このような配列は当技術分野において周知であり、そして単子葉植物における発現のためのコメアクチンプロモーターまたはメイズユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現のためのArabidopsisUBQプロモーターまたはCaMV35Sプロモーター、およびnosまたはPinIIターミネーターを含み得る。プロモーター−遺伝子−ターミネーター構築物を作製および確認するための技術は当技術分野において周知である。
穂を受粉の8〜12日後に収集する。胚を穂から単離し、そして0.8〜1.5mmサイズのそのような胚を形質転換のために使用する。胚を、適切なインキュベーション培地上に胚盤側を上にして蒔き、そして暗闇で25℃で一晩インキュベートする。しかしながら、胚を一晩インキュベートすることそれ自体は必要ではない。胚を、5〜10分間、Tiプラスミド媒介導入のための適切なベクターを含むアグロバクテリウム株と接触させ、そしてその後、3日間(25℃で暗闇中)共培養培地上に蒔く。共培養後、外植片を5日間(25℃で暗闇中)回復期間培地に移す。外植片を、使用する特定の選択の性質および特徴に依存して、8週間まで選択培地中でインキュベートする。選択期間後、得られたカルスを、成熟体細胞胚の形成が観察されるまで、胚成熟培地に移す。その後、得られた成熟体細胞胚を微光の下に置き、そして再生プロセスを当技術分野において公知のように開始する。得られた芽を発根培地上で根づかせ、そして得られた植物を苗床ポットに移し、そしてトランスジェニック植物として繁殖させる。
メイズの穂を受粉から8〜12日後に収集する。胚を穂から単離し、そして0.8〜1.5mmサイズのそのような胚を形質転換のために使用する。胚を、適切なインキュベーション培地、例えばDN62A5S培地(3.98g/L N6塩;1mL/L(1000×ストック)N6ビタミン;800mg/L L−アスパラギン;100mg/L ミオ−イノシトール;1.4g/L L−プロリン;100mg/Lカザミノ酸;50g/Lスクロース;1mL/L(1mg/mLストック)2,4−D)上に胚盤側を上にして蒔き、そして暗闇で25℃で一晩インキュベートする。
Claims (19)
- a)配列番号1、2、3、11もしくは12のいずれかのヌクレオチド配列、またはその相補体;
b)配列番号1もしくは12のヌクレオチド配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、またはその相補体、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
c)配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、またはその相補体、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
d)配列番号4、5、6、13または14のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
e)配列番号4または14のアミノ酸配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;
f)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;および
g)配列番号4、5、6、13または14の変異体である殺昆虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記変異体は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のドメインが配列番号4、5、6、13または14の対応するドメインで交換された結果である
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。 - ヌクレオチド配列が植物における発現のために設計された合成配列である、請求項1の単離核酸分子。
- 合成配列が配列番号15、16、17または18のいずれかから選択される、請求項2の核酸分子。
- 請求項1の核酸分子を含む発現カセット。
- 異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む請求項4の発現カセット。
- 請求項4の発現カセットを含む植物または細菌宿主細胞。
- a)配列番号4、5、6、13または14のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
b)配列番号4または14のアミノ酸配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;
c)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;
d)配列番号1、2、3、11または12のいずれかのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド;
e)配列番号1または12のヌクレオチド配列に対して少なくとも96%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドは殺昆虫活性を有する;
f)配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドは殺昆虫活性を有する;
および
g)配列番号4、5、6、13または14の変異体であるポリペプチド、ここで、前記変異体は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のドメインが配列番号4、5、6、13または14の対応するドメインで交換された結果であり、前記ポリペプチドは殺昆虫活性を有する
からなる群より選択された、殺昆虫活性を有する単離ポリペプチド。 - 異種アミノ酸配列をさらに含む請求項7のポリペプチド。
- 請求項7のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
- 請求項7のポリペプチドを含む組成物。
- 組成物が、粉末、粉塵、ペレット、顆粒、スプレー、エマルション、コロイドおよび溶液からなる群より選択され、そして場合により前記組成物が、Bacillus thuringiensis細胞の培養液の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイゼーション、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製される、請求項10の組成物。
- チョウ目または甲虫目害虫個体群を、殺昆虫有効量の請求項7のポリペプチドと接触させることを含む、前記個体群を制御または死滅させるための方法。
- 請求項6の宿主細胞を、ポリペプチドをコードする核酸分子が発現される条件下で培養することを含む、殺昆虫活性を有するポリペプチドを産生するための方法。
- 殺昆虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物がそのゲノムに安定に取り込まれた植物であって、前記ヌクレオチド配列が、以下:
a)配列番号1、2、3、11または12のいずれかのヌクレオチド配列;
b)配列番号1または12のヌクレオチド配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
c)配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
d)配列番号4、5、6、13または14のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
e)配列番号4または14のアミノ酸配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は、殺昆虫活性を有する;
f)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;および
g)配列番号4、5、6、13または14の変異体である殺昆虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記変異体は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のドメインが配列番号4、5、6、13または14の対応するドメインで交換された結果であり;
前記ヌクレオチド配列は、植物細胞においてコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されている
からなる群より選択される植物。 - 植物が植物細胞である請求項14の植物。
- 種子が、
a)配列番号1、2、3、11または12のいずれかのヌクレオチド配列;
b)配列番号1または12のヌクレオチド配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
c)配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
d)配列番号4、5、6、13または14のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
e)配列番号4または14のアミノ酸配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;
f)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;および
g)配列番号4、5、6、13または14の変異体である殺昆虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記変異体は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のドメインが配列番号4、5、6、13または14の対応するドメインで交換された結果である
からなる群より選択されたヌクレオチド配列を含む、請求項14の植物のトランスジェニック種子。 - 植物またはその細胞に、殺昆虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの発現ベクターを導入することを含む、昆虫害虫から植物を保護するための方法であって、前記ヌクレオチド配列が、以下:
a)配列番号1、2、3、11または12のいずれかのヌクレオチド配列;
b)配列番号1または12のヌクレオチド配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
c)配列番号3のヌクレオチド配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、ここで、前記ヌクレオチド配列は、殺昆虫活性を有するタンパク質をコードする;
d)配列番号4、5、6、13または14のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
e)配列番号4または14のアミノ酸配列に対して少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;および
f)配列番号6のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記アミノ酸配列は殺昆虫活性を有する;
g)配列番号4、5、6、13または14の変異体である殺昆虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで、前記変異体は、配列番号4、5、6、13または14の1つ以上のドメインが配列番号4、5、6、13または14の対応するドメインで交換された結果である
からなる群より選択される方法。 - 1つ以上のドメインが、図2で概略を示したドメインから選択される、請求項1の単離核酸配列、請求項7のポリペプチド、請求項14の植物、請求項15の植物細胞、請求項16の種子、または請求項17の方法。
- 植物が、メイズ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科の植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、コメ、ダイズ、サトウダイコン、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびアブラナからなる群より選択される、請求項14の植物、請求項17の植物細胞、請求項18の植物種子、または請求項19の方法。
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