EA034764B1 - БЕЛКИ Cry1Da1 С ВАРИАНТАМИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ - Google Patents
БЕЛКИ Cry1Da1 С ВАРИАНТАМИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ Download PDFInfo
- Publication number
- EA034764B1 EA034764B1 EA201790842A EA201790842A EA034764B1 EA 034764 B1 EA034764 B1 EA 034764B1 EA 201790842 A EA201790842 A EA 201790842A EA 201790842 A EA201790842 A EA 201790842A EA 034764 B1 EA034764 B1 EA 034764B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- protein
- proteins
- insecticidal
- cry1da1
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 338
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 329
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 title description 36
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 claims abstract description 188
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims abstract description 97
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 74
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 43
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 36
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 27
- 241000255967 Helicoverpa zea Species 0.000 claims description 18
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 13
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 9
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 9
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 8
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 claims description 7
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 5
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 claims description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 241000555281 Brevibacillus Species 0.000 claims description 3
- 241000255990 Helicoverpa Species 0.000 claims description 3
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 3
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 claims description 3
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 claims description 2
- 241001414989 Thysanoptera Species 0.000 claims description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 47
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 abstract description 26
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 abstract description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 311
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 137
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 73
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 54
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 27
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 26
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 25
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 24
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 24
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 23
- 241000894007 species Species 0.000 description 23
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 22
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 22
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 22
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 22
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 21
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 19
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 19
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 16
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 230000000361 pesticidal effect Effects 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000004475 Arginine Chemical group 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 10
- 241001147398 Ostrinia nubilalis Species 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Chemical group OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 9
- 241000500437 Plutella xylostella Species 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 241000625764 Anticarsia gemmatalis Species 0.000 description 6
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 6
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 6
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 6
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Chemical group CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 6
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 5
- 241001340508 Crambus Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 241000122106 Diatraea saccharalis Species 0.000 description 5
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical group NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- 241000721451 Pectinophora gossypiella Species 0.000 description 5
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000035611 feeding Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 4
- 241001635274 Cydia pomonella Species 0.000 description 4
- 241001147381 Helicoverpa armigera Species 0.000 description 4
- 241001012098 Omiodes indicata Species 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 241000256247 Spodoptera exigua Species 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 4
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Chemical group OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 4
- 241000566547 Agrotis ipsilon Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Chemical group OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 3
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 3
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 3
- 241001367803 Chrysodeixis includens Species 0.000 description 3
- 241000879145 Diatraea grandiosella Species 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical group NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical group CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 3
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193981 Loxostege sticticalis Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 3
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 3
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 3
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 3
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 3
- 241000985245 Spodoptera litura Species 0.000 description 3
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 3
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical group CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- -1 organophosphates Chemical class 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Chemical group 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000001996 Agrotis orthogonia Species 0.000 description 2
- 241001259789 Amyelois transitella Species 0.000 description 2
- 241001002470 Archips argyrospila Species 0.000 description 2
- 241001423656 Archips rosana Species 0.000 description 2
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 2
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 2
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 2
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 2
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 241000426497 Chilo suppressalis Species 0.000 description 2
- 241000034870 Chrysoteuchia culmella Species 0.000 description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 2
- 241000098289 Cnaphalocrocis medinalis Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 2
- 241001572697 Earias vittella Species 0.000 description 2
- 241000400698 Elasmopalpus lignosellus Species 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004341 Gossypium herbaceum Nutrition 0.000 description 2
- 240000002024 Gossypium herbaceum Species 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- 241001000403 Herpetogramma licarsisalis Species 0.000 description 2
- 241000630740 Homoeosoma electellum Species 0.000 description 2
- 241000370523 Hypena scabra Species 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241001261104 Lobesia botrana Species 0.000 description 2
- 241000721703 Lymantria dispar Species 0.000 description 2
- 241000732113 Mamestra configurata Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 244000111261 Mucuna pruriens Species 0.000 description 2
- 235000008540 Mucuna pruriens var utilis Nutrition 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 241001525654 Phyllocnistis citrella Species 0.000 description 2
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 235000008406 SarachaNachtschatten Nutrition 0.000 description 2
- 241000563489 Sesamia inferens Species 0.000 description 2
- 235000004790 Solanum aculeatissimum Nutrition 0.000 description 2
- 235000008424 Solanum demissum Nutrition 0.000 description 2
- 235000018253 Solanum ferox Nutrition 0.000 description 2
- 235000000208 Solanum incanum Nutrition 0.000 description 2
- 235000013131 Solanum macrocarpon Nutrition 0.000 description 2
- 235000009869 Solanum phureja Nutrition 0.000 description 2
- 240000002307 Solanum ptychanthum Species 0.000 description 2
- 235000000341 Solanum ptychanthum Nutrition 0.000 description 2
- 235000017622 Solanum xanthocarpum Nutrition 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241001575047 Suleima Species 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 241001389006 Tuta absoluta Species 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000004634 feeding behavior Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 2
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 3-[(3s,5r,8r,9s,10s,13s,14s,17s)-10,13-dimethyl-3-[(2r,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-2h-furan-5-one Chemical compound O([C@@H]1C[C@H]2CC[C@@H]3[C@@H]([C@]2(CC1)C)CC[C@]1([C@H]3CC[C@@H]1C=1COC(=O)C=1)C)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O ZHVOBYWXERUHMN-KVJKMEBSSA-N 0.000 description 1
- 235000004507 Abies alba Nutrition 0.000 description 1
- 241000191291 Abies alba Species 0.000 description 1
- 241001652650 Agrotis subterranea Species 0.000 description 1
- 241000449794 Alabama argillacea Species 0.000 description 1
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 1
- 235000005254 Allium ampeloprasum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006108 Allium ampeloprasum Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 244000144730 Amygdalus persica Species 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241001002469 Archips Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000014698 Brassica juncea var multisecta Nutrition 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000010149 Brassica rapa subsp chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000006618 Brassica rapa subsp oleifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241001301148 Brassica rapa subsp. oleifera Species 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000010523 Cicer arietinum Nutrition 0.000 description 1
- 244000045195 Cicer arietinum Species 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 241000255749 Coccinellidae Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 240000007154 Coffea arabica Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 241001574015 Crocidosema Species 0.000 description 1
- 101710151559 Crystal protein Proteins 0.000 description 1
- 241000219112 Cucumis Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000014466 Douglas bleu Nutrition 0.000 description 1
- 241000353522 Earias insulana Species 0.000 description 1
- 241001095202 Ecdytolopha fabivora Species 0.000 description 1
- 241000202844 Eriophorum Species 0.000 description 1
- 244000004281 Eucalyptus maculata Species 0.000 description 1
- 240000009088 Fragaria x ananassa Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 240000004670 Glycyrrhiza echinata Species 0.000 description 1
- 235000001453 Glycyrrhiza echinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000006200 Glycyrrhiza glabra Nutrition 0.000 description 1
- 235000017382 Glycyrrhiza lepidota Nutrition 0.000 description 1
- 240000000047 Gossypium barbadense Species 0.000 description 1
- 235000009429 Gossypium barbadense Nutrition 0.000 description 1
- 235000009432 Gossypium hirsutum Nutrition 0.000 description 1
- 241001441330 Grapholita molesta Species 0.000 description 1
- 241001515769 Helicoverpa gelotopoeon Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000008694 Humulus lupulus Nutrition 0.000 description 1
- 244000025221 Humulus lupulus Species 0.000 description 1
- 108010060231 Insect Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- 240000007049 Juglans regia Species 0.000 description 1
- 235000009496 Juglans regia Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 241000562507 Liphyra brassolis Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000000982 Malva neglecta Species 0.000 description 1
- 235000000060 Malva neglecta Nutrition 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 240000005561 Musa balbisiana Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 241000256259 Noctuidae Species 0.000 description 1
- 241000238633 Odonata Species 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 241000497111 Paralobesia viteana Species 0.000 description 1
- 241000459456 Parapediasia teterrellus Species 0.000 description 1
- 241000721452 Pectinophora Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241001236219 Pinus echinata Species 0.000 description 1
- 235000005018 Pinus echinata Nutrition 0.000 description 1
- 235000017339 Pinus palustris Nutrition 0.000 description 1
- 241000758706 Piperaceae Species 0.000 description 1
- 241000219000 Populus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 235000006040 Prunus persica var persica Nutrition 0.000 description 1
- 101100457857 Pseudomonas entomophila (strain L48) mnl gene Proteins 0.000 description 1
- 240000001416 Pseudotsuga menziesii Species 0.000 description 1
- 235000005386 Pseudotsuga menziesii var menziesii Nutrition 0.000 description 1
- 241000255893 Pyralidae Species 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 241001456337 Rachiplusia Species 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 241000753145 Sitotroga cerealella Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 241000931750 Spodoptera cosmioides Species 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 244000204900 Talipariti tiliaceum Species 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 241000255901 Tortricidae Species 0.000 description 1
- 235000019714 Triticale Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 241000219094 Vitaceae Species 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000482268 Zea mays subsp. mays Species 0.000 description 1
- 244000128884 Zier Kohl Species 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000021405 artificial diet Nutrition 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N bioresmethrin Chemical compound CC1(C)[C@H](C=C(C)C)[C@H]1C(=O)OCC1=COC(CC=2C=CC=CC=2)=C1 VEMKTZHHVJILDY-UXHICEINSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000016213 coffee Nutrition 0.000 description 1
- 235000013353 coffee beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000011217 control strategy Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003031 feeding effect Effects 0.000 description 1
- 231100000502 fertility decrease Toxicity 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000007919 giant pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 244000155489 giant pumpkin Species 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000021021 grapes Nutrition 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940010454 licorice Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007758 mating behavior Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000004045 organic chlorine compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 239000004476 plant protection product Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 235000021012 strawberries Nutrition 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 241000228158 x Triticosecale Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
- C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/08—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having one or more single bonds to nitrogen atoms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Insects & Arthropods (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Fodder In General (AREA)
Abstract
Предложены сконструированные аминокислотные последовательности Cry1Da, обладающие улучшенной инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых и расширенным спектром в отношении чешуекрылых по сравнению с природным белковым токсином Cry1Da. Также предложены полинуклеотидные последовательности, предназначенные для применения в экспрессии улучшенных белков в растениях. В конкретных вариантах реализации изобретения предложены композиции, содержащие инсектицидно ингибирующее количество сконструированных белков, а также рекомбинантные растения, части растений и семена, содержащие полинуклеотидные конструкции, кодирующие один или более из улучшенных сконструированных белков.
Description
Включение перечня последовательностей
Машиночитаемая форма перечня последовательностей подана в электронном виде. Перечень последовательностей, включенный посредством ссылки в полном объеме, содержится в файле, созданном 13 октября 2015 г., с именем файла P34223WO00_SEQ_PCT.txt и размером 327235 байт (измерено в операционной системе MS-Windows®).
Область изобретения
Изобретение в целом относится к области белков, оказывающих ингибирующее действие на насекомых. Раскрывается новый класс сконструированных белков, проявляющих инсектицидную ингибирующую активность против сельскохозяйственных вредителей сельскохозяйственных культур и семян. В частности, раскрытый класс сконструированных ингибирующий белков обладает инсектицидной активностью в отношении чешуекрылых насекомых-вредителей. Предусмотрены растения, части растений и семена, содержащие полинуклеотидный конструкт, кодирующий один или более описанных сконструированных ингибирующих белков.
Уровень техники
Helicoverpa zea является характерным чешуекрылым вредителем основных сельскохозяйственных культур, включая кукурузу, хлопчатник и сою. Известный как кукурузная совка (CEW), хлопковая совка (CBW) и коробочный червь (SPW), этот вид многоядных насекомых особенно трудно контролировать с помощью инсектицидных белков Bacillus thuringiensis (Bt) или других видов бактерий. Н. zea считается подверженным риску развития резистентности к современным способам контроля насекомых, учитывая его способность питаться множеством различных культур и отсутствие в настоящее время стратегии контроля высоких доз. Соответственно, необходимы новые способы воздействия (СВ) для обеспечения долговечности трансгенных растений, защищенных от повреждения в результате питания H. zea.
Белок Cry1Da1 является чешуекрыло-активным белком, который был впервые описан Hofte, et al. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of a new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis. Nucleic Acids Res. 18(18) (1990): 5545. Данный белок проявляет отличную инсектицидную активность по отношению к видам рода Spodoptera, включая Spodoptera frugiperda (кукурузную листовую совку, FAW), вредителя некоторых пропашных культур, включая кукурузу, хлопчатник и сою. Однако Cry1Da1 проявляет низкую или умеренную активность по отношению к целому ряду других основных насекомых-вредителей, включая хлопковую сойку (например, Helicoverpa armigera и H. zea), огневок (например, Ostrinia nubilalis и Diatraea grandiosella) и соевую совку (Pseudoplusia includens). Из-за его узкого инсектицидного спектра и его неспособности обеспечить коммерческую защиту от ряда важных чешуекрылых сельскохозяйственных вредителей, таких как CEW, инсектицидный белок Cry1Da1 имеет ограниченное значение в качестве признака борьбы с насекомыми в трансгенных растениях. В результате никакие современные коммерческие сорта культур, защищенные от насекомых, не используют Cry1Da1 в качестве включенного в растение средства защиты.
Несмотря на свой узкий инсектицидный спектр, Cry1Da1 является интересным инсектицидным белком, потому что кажется, что белок Cry1Da1 использует альтернативные СВ для борьбы с некоторыми насекомыми-вредителями. Доказательством этого служат исследования колоний насекомых с множественной устойчивостью. Например, полученные из поля колонии Plutella xylostella (капустной моли) и Pectinophora gossypiella (хлопковой моли), которые устойчивы к интоксикации Cry1Ac, сохраняют полную чувствительность к белку Cry1Da1 (Tabashnik et al. Cross-Resistance of Pink Bollworm (Pectinophora gossypiella) to Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000). 4582-4584; Tabashnik, et al. Cross-Resistance to Bacillus thuringiensis Toxin CrylJa in a Strain of Diamondback Moth Adapted to Artificial Diet. J. Invert. Pathol. 76: 2000: 81-83. Эти данные свидетельствуют о том, что Cry1Da1 распознает рецепторы средней кишки чешуекрылых, отличные от тех, которые распознаются чешуекрыло-активными белками, которые в настоящее время внедрены в трансгенные сельскохозяйственные культуры, включая Cry1Ac, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1Fa, Cry2Ae и Cry2Ab2. В свете данного очевидного нового СВ оптимизация Cry1Da1-подобных белков для улучшения активности против более широкого спектра видов рода Helicoverpa при сохранении или увеличении их инсектицидной активности по отношению к видам рода Spodoptera могла бы создать включенную в растения, высококачественную защиту для борьбы с резистентностью насекомых.
Краткое описание изобретения
В настоящем изобретении идентифицированы несколько вариантов аминокислотных последовательностей каркасных белков TIC844 и Cry1Da, которые проявляют заметно улучшенную активность (по сравнению с нативным токсином Cry1Da1) по отношению к H. zea, сохраняя при этом отличную активность по отношению к S. frugiperda. Улучшенные варианты TIC844 и Cry1Da были разработаны, для экспрессии в сельскохозяйственных растениях (например, кукурузе, сое, хлопке, сахарном тростнике), и предоставляют новые варианты для управления устойчивостью in planta (в растении) и борьбы с насеко- 1 034764 мыми-вредителями в силу очевидного уникального способа воздействия CrylDa в сочетании с улучшенной активностью против H. zea.
Описанные в настоящем документе сконструированные токсичные белки чешуекрылых (называемые в настоящем документе сконструированные белковые токсины, сконструированные токсичные белки или сконструированные инсектицидные белки) являются производными природного инсектицидного токсина Bacillus thuringiensis Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) или химерного гомолога Cry1Da1, TIC844 (SEQ ID NO: 14), которые содержат основной токсин Cry1Da1, но имеют замененный протоксин Cry1Ab3 на нативный Cry1Da1-протоксиновый домен. Сконструированные инсектицидные белки согласно настоящему изобретению каждый содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, одно аминокислотное присоединение или одну аминокислотную делецию по сравнению с каркасными белками, представленными в любой из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14. Сконструированные инсектицидные белки согласно настоящему изобретению особенно токсичны для насекомых видов Helicoverpa zea (кукурузная совка, хлопковая совка, коробочный червь) и Spodoptera frugiperda (кукурузная листовая совка). Хотя белки каркасные TIC844 (SEQ ID NO: 14) и Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) проявляют низкую токсичность в отношении H. zea, инсектицидные белки, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают удивительной и неожиданно улучшенной инсектицидной активностью и улучшенным инсектицидным спектром против чешуекрылых насекомых-вредителей, включая H. zea.
В некоторых вариантах реализации изобретения предложен инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42, или ее фрагмент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидный белок проявляет ингибирующую активность в отношении видов насекомых отряда Lepidoptera (Чешуекрылые). Виды чешуекрылых вредителей, которые имеют негативное влияние на сельское хозяйство, включают, без ограничения, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку малую (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Chrysodeixis includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hypena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia), мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus), плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную персиковую (Grapholita molesta), листовертку почковую подсолнечника (Suleima helianthana), капустную моль (Plutella xylostella), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella), розовую стеблевую совку (Sesamia inferens), шелкопряда непарного (Lymantria dispar), совку хлопковую американскую (A1abama argillacea), листовертку плодовых деревьев (Archips argyrospila), листовертку резанную золотистую (Archips rosana), огневку азиатскую стеблевую или огневку желтую рисовую (Chilo suppressalis), листовертку рисовую (Cnaphalocrocis medinalis), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), мотылька травяного (Crambus teterrellus), огневку кукурузную юго-западную (Diatraea grandiosella), огневку сахарного тростника (Diatraea saccharalis), совку хлопковую египетскую (Earias insulana), совку пятнистую (Earias vittella), совку американскую (Helicoverpa armigera), совку хлопковую или американскую кукурузную совку (Helicoverpa zea), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), гроздевую листовертку (Lobesia botrana), цитрусовую минурующую моль (Phyllocnistis citrella), белянку капустную (Pieris brassicae), репницу или белянку репную (Pieris rapae), азиатскую хлопчатниковую совку или азиатскую хлопковую совку (Spodoptera litura) и пасленового минера (Tuta absoluta).
Также в настоящем документе раскрыт полинуклеотид, кодирующий сконструированный инсектицидный белок или его фрагмент, обладающий пестицидной активностью, причем полинуклеотид функционально связан с гетерологичным промотором, а сконструированный инсектицидный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42.
В другом варианте реализации изобретения в настоящем документе раскрыт полинуклеотид, кодирующий сконструированный инсектицидный белок, причем полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, которая необязательно гибридизуется в строгих условиях с обратным комплементом полинуклеотидной последовательности, указанной в любой из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 41; или кодирует сконструированный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO: 44,
- 2 034764
SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:
10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ
ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42.
Также в настоящем документе предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид, представленный в любой из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 41, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной клетки-хозяина или растительной клетки-хозяина. Рассматриваемые бактериальные клетки-хозяева включают бактериальные клетки-хозяева, выбранные из группы, состоящей из Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, и Erwinia, причем вид рода Bacillus представляет собой Bacillus cereus или Bacillus thuringiensis, указанный Brevibacillus представляет собой Brevibacillus laterosperous, а указанная Escherichia представляет собой Escherichia coii. Кроме того, предполагаемые растительные клетки-хозяева включают однодольные или двудольные растения.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения предложена композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая сконструированный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42, или ее фрагмент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых. Предполагается, что данная композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых может дополнительно содержать по меньшей мере один агент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, отличный от сконструированного инсектицидного белка. Рассматриваемые агенты, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, включают белок, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых и химический состав, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомых. Предполагается, что, по меньшей мере, один другой пестицидный агент может проявлять активность в отношении одного или нескольких видов вредителей отрядов Lepidoptera, Coleopterar Hemipterar Homoptera или Thysanoptera.
Также раскрыто в настоящем документе семя, содержащее ингибирующе эффективное в отношении насекомых количество сконструированного инсектицидного белка, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42; или полинуклеотид, указанный в любой из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 41.
Способ борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями, включающий приведение в контакт чешуекрылого насекомого-вредителя с ингибирующим количеством сконструированного инсектицидного белка, также раскрыт в настоящем документе в другом варианте реализации изобретения.
В еще одном варианте реализации изобретения, в настоящем документе раскрыта трансгенная клетка растения, растение или часть растения, содержащие сконструированный инсектицидный белок. Предложены способы борьбы с чешуекрылым насекомым-вредителем, включающие предоставление вредителю трансгенной клетки растения, растения или части растения, содержащих сконструированный инсектицидный белок.
Рассматриваются также товарные продукты, полученные из клетки растения, растения или части растения, содержащие сконструированный инсектицидный белок, причем продукт содержит определяемое количество сконструированного инсектицидного белка. Рассматриваемые товарные продукты включают биомассу растений, масло, муку грубого помола, корм для животных, муку, хлопья, отруби, волокно, кожуру и обработанные семена.
Другой способ, раскрытый в настоящем документе, представляет собой способ получения семени, содержащего сконструированный инсектицидный белок, включающий стадии, на которых: высаживают по меньшей мере одно семя, содержащее сконструированный инсектицидный белок; выращивают растение из указанного семени; и собирают семена от растений, причем собранное семя содержит инсектицидный белок.
Еще один способ, раскрытый в данной заявке, представляет собой способ ингибирования активности чешуекрылых насекомых-вредителей от кормления на культурном растении, включающий модификацию одного или нескольких аминокислотных остатков SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14 путем замещения одного или более аминокислотного(-ых) остатка(-ов) для получения модифицированной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14; и получения доступного количества обладающей ингибирующей активностью в отношении чешуекрылых модифицированной SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14 внутри, на поверхно- 3 034764 сти или вблизи тканей указанного культурного растения; причем модифицированный аминокислотный остаток SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14 выбран из группы, состоящей из серина в положении 282, замененного лизином или валином, тирозина в положении 316, замененного серином, изолейцина в положении 368, замененного пролином или аргинином, серина в положении 374, замененного аргинином, аспарагина в положении 375, замененного гистидином и изолейцина в положении 432, замененного лейцином.
Также предложены рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, кодирующие сконструированные инсектицидные белки согласно настоящему изобретению. Рассматриваемые рекомбинантные полинуклеотидные молекулы содержат полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 41; и, необязательно, полинуклеотидную последовательность, кодирующую агент, обладающий ингибиторной активностью в отношении насекомых, отличный от инсектицидного белка.
Другой способ, раскрытый в настоящем заявке, представляет собой способ увеличения активности в отношении чешуекрылых и усиления спектра ингибирования чешуекрылых у каркасного белка, включающий модификацию одного или более аминокислотного(-ых) остатка(-ов) SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14 путем замещения аминокислотного(-ых) остатка(-ов) для получения сконструированного инсектицидного белка, причем модифицированный аминокислотный остаток SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 14 выбран из группы, состоящей из серина в положении 282, замененного лизином или валином, тирозина в положении 316, замененного серином, изолейцина в положении 368, замененного пролином или аргинином, серина в положении 374, замененного аргинином, аспарагина в положении 375, замененного гистидином и изолейцина в положении 432, замененного лейцином. В некоторых вариантах реализации данного способа сконструированный инсектицидный белок имеет по меньшей мере восьмикратно увеличенную летальность Helicoverpa zea по сравнению с каркасным белком.
Другие варианты реализации, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, примеров и формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 представлены значения MIC50 (минимальной ингибирующей концентрации) каркасного белка TIC844 (SEQ ID NO: 14), по сравнению со сконструированным инсектицидным белком TIC844_8 (SEQ ID NO: 26) для двух различных колоний Helicoverpa zea (CEW) -Union City и Benzon.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1.
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1.
SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1_3.
SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_3.
SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1_4.
SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_4.
SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1_5.
SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_5.
SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1_6.
SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_6.
SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок Cry1Da1_7.
SEQ ID NO: 12 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_7.
SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC844.
| SEQ TIC844. | ID | NO: | 14 | представляет | собой | аминокислотную | последовательность | белкового | токсина |
| SEQ TIC844_2. | ID | NO: | 15 | представляет | собой | нуклеотидную последовательность, | кодирующую белок | ||
| SEQ TIC844 2. | ID | NO: | 16 | представляет | собой | аминокислотную | последовательность | белкового | токсина |
- 4 034764
SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок
TIC844_4.
SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_4.
SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC844_5.
SEQ ID NO: 20 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_5.
SEQ ID NO: 21 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC844_6.
SEQ ID NO: 22 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_6.
SEQ ID NO: 23 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC844_7.
SEQ ID NO: 24 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_7.
SEQ ID NO: 25 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую белок TIC844_8.
SEQ ID NO: 26 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_8.
SEQ ID NO: 27 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1 в растениях.
SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1.
SEQ ID NO: 29 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_2.nno в растениях.
SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_2.nno.
SEQ ID NO: 31 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_3.nno в растениях.
SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_3.nno.
SEQ ID NO: 33 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_4.nno в растениях.
SEQ ID NO: 34 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_4.nno.
SEQ ID NO: 35 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_5.nno в растениях.
SEQ ID NO: 36 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_5.nno.
SEQ ID NO: 37 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_6.nno в растениях.
SEQ ID NO: 38 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_6.nno.
SEQ ID NO: 39 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка Cry1Da1_7.nno в растениях.
SEQ ID NO: 40 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина Cry1Da1_7.nno.
SEQ ID NO: 41 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка TIC844_9.nno в растениях.
SEQ ID NO: 42 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_9.nno.
SEQ ID NO: 43 представляет собой полинуклеотидную последовательность, сконструированную для экспрессии белка TIC844_11.nno в растениях.
SEQ ID NO: 44 представляет собой аминокислотную последовательность белкового токсина TIC844_11.nno.
Подробное описание изобретения
В настоящем документе представлены сконструированные инсектицидные белки, демонстрирующие удивительно более высокие уровни токсической активности против видов отряда Чешуекрылые и более широкий инсектицидный спектр по сравнению с другими ранее известными инсектицидными белками чешуекрылых. Эти сконструированные инсектицидные белки получают из каркасных инсектицидных белков, которые служат в качестве шаблонов для различных аминокислотных модификаций. Приме- 5 034764 ры таких каркасных инсектицидных белков включают, но не ограничиваются ими, CrylDal и TIC844 (гомолог Cry1Da1). TIC844 содержит основной токсин Cry1Da1 (т.е. домены I, II и III), но использует домен протоксина Cry1Ab3 для обеспечения хорошей экспрессии в Bacillus thuringiensis (Bt). Экспрессия Cry1Da1 в Bt является плохой при использовании родного домена протоксина Cry1Da1. Однако, как показано в настоящей заявке, экспрессия основного токсина Cry1Da1 заметно улучшается в некристаллообразующих штаммах Bt, когда удаляется нативный протоксиновый домен, а сегмент кодирования основного токсина Cry1Da1 слит с сегментом, кодирующим протоксиновый домен Cry1Ab3. Примечательно, что белки TIC844 (SEQ ID NO: 14) и Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2) не демонстрируют коммерчески полезный спектр ингибирования чешуекрылых и улучшенную ингибирующую активность в отношении чешуекрылых, наблюдаемую у сконструированных инсектицидных белков.
Сконструированные инсектицидные белки, описанные в настоящем изобретении, связаны с модификациями аминокислот, так что модифицированные белки обладают улучшенным спектром ингибирования чешуекрылых и/или улучшенной ингибирующей активностью в отношении чешуекрылых по сравнению с исходным каркасным белком TIC844 или Cry1Da1. Фразы более активный, улучшенная активность, повышенная специфичность, повышенная токсическая активность, повышенная токсичность, улучшенная ингибирующая активность в отношении чешуекрылых, более высокая ингибирующая активность в отношении чешуекрылых и усиленный спектр ингибирования чешуекрылых относятся к сопоставлению активности сконструированного инсектицидного белка с активностью каркасного белка (TIC844 или Cry1Da1) против насекомого-чешуекрылого, причем активность, приписываемая сконструированному инсектицидному белку, больше, чем активность, приписываемая каркасному белку. В некоторых вариантах реализации изобретения инсектицидные белки, предложенные в настоящем документе, обладают улучшенным спектром ингибирования чешуекрылых и/или улучшенной или большей ингибирующей активностью в отношении чешуекрылых по сравнению с активностью каркасного белка TIC844 или Cry1Da1, причем виды чешуекрылых-вредителей включают, но не ограничиваются ими, Helicoverpa zea и Spodoptera frugiperda.
Используемые в настоящем документе термины и фразы активный или активность; пестицидная активность или пестицидный; или инсектицидная активность, ингибирующая инсектицидная активность, инсектицидный или инсектицидно ингибирующее количество, относятся к эффективности токсичного агента, такого как инсектицидный белок, в ингибировании (ингибировании роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), подавлении (подавлении роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), контроле (контроле заражения вредителями, контроле активности кормления вредителями на определенной культуре, содержащей эффективное количество описанного инсектицидного белка) или уничтожении (вызывая заболеваемость, смертность, или снижение плодовитости) вредителя. Точно так же количество, оказывающее ингибирующую активность на чешуекрылых относится к количеству токсичного агента, такого как инсектицидный белок, что приводит к любому измеримому ингибированию жизнеспособности чешуекрылых, росту чешуекрылых, развитию чешуекрылых, размножению чешуекрылых, кормовому поведению чешуекрылых, брачному поведению чешуекрылых и/или любому измеримому снижению неблагоприятных эффектов, испытываемых растением от питания чешуекрылых. Эти термины призваны включать результат обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного агента для вредителя, при котором предоставление вредителю токсичного агента приводит к заболеваемости, смертности, снижению плодовитости или задержке роста. Эти термины также включают отталкивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семени, клеток растения или от конкретного географического положения, где растение может произрастать, в результате предоставления пестицидно эффективного количества токсичного агента в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсичного агента быть эффективным в ингибировании роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, в связи с предоставлением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомых отряда Lepidoptera. Токсичный агент может быть продуцирован растением или может быть применен к растению или в окружающей среде в том месте, где находится растение.
Пестицидно эффективное количество токсического агента, если оно предусмотрено в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность, когда токсичность попадает в организм вредителя. Токсичный агент может представлять собой пестицидный белок, или один или более химических агентов, известных в данной области техники. Пестицидные или инсектицидные химические агенты и пестицидные или инсектицидные белковые агенты могут быть использованы по отдельности или в сочетании друг с другом. Химические агенты включают, но не ограничиваются ими, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Пестицидные или инсектицидные белковые агенты включают сконструированные инсектицидные белки, представленные в данной заявке, а также другие белковые токсичные агенты, включая те, которые нацелены на разновидности чешуекрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как белки Cry, дос- 6 034764 тупные в данной области техники для применения при борьбе с видами родов Coleopteran, Hemipteran и
Homopteran.
Термин сегмент или фрагмент используется в настоящем документе для описания последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая сконструированные инсектицидные белки.
Предполагается, что упоминание вредителя, особенно вредителя сельскохозяйственного растения, означает насекомых-вредителей культурных растений, особенно тех чешуекрылых насекомыхвредителей, которые контролируются описанными инсектицидными белками. Однако упоминание вредителя может также включать насекомых-вредителей отрядов Coleoptera (Жесткокрылые), Hemiptera (Полужесткокрылые) и Homoptera (Равнокрылые), а также нематод и грибы, в случае, если токсические агенты, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с описанными инсектицидными белками.
Раскрытые сконструированные инсектицидные белки проявляют инсектицидную активность по отношению к насекомым-вредителям из видов насекомых отряда Чешуекрылые, включая имаго, куколок, личинок и новорожденных. Насекомые отряда Lepidoptera, включают, без ограничений, совок луговых, совок, листоверток, и совок из семейства Noctuidae, например, кукурузную листовую совку (Spodoptera frugiperda), совку малую (Spodoptera exigua), совку латуковую (Mamestra configurata), совку-ипсилон (Agrotis ipsilon), совку капустную (Trichoplusia ni), соевую совку (Pseudoplusia includens), совку бархатных бобов (Anticarsia gemmatalis), совку клеверную (Hypena scabra), табачную листовертку (Heliothis virescens), совку хлопковую (Agrotis subterranea), совку луговую (Pseudaletia unipuncta), совку прямоугольную (Agrotis orthogonia); точильщиков, чехлоносок, бабочек, огневок Шишковых, гусениц бабочки капустницы и пироморфид из семейства Pyralidae, например, мотылька стеблевого кукурузного (Ostrinia nubilalis), бабочку-огневку (Amyelois transitella), кукурузную огневку (Crambus caliginosellus), лугового мотылька (Herpetogramma licarsisalis), огневку подсолнечниковую (Homoeosoma electellum), точильщика зернового кукурузного (Elasmopalpus lignosellus); листоверток, дымчастых листоверток, плодожорок и плодовых листоверток из семейства Tortricidae, например, плодожорку яблонную (Cydia pomonella), листовертку виноградную (Endopiza viteana), листовертку восточную персиковую (Grapholita molesta), листовертку подсолнечника (Suleima helianthana); и многих других экономически важных представителей отряда Lepidoptera, например, капустную моль (Plutella xylostella), розового коробочного червя (Pectinophora gossypiella) и шелкопряда непарного (Lymantria dispar). Другие насекомые-вредители отряда Lepidoptera включает, например, Alabama argillacea (совка хлопковая американская), Archips argyrospila (листовертка плодовых деревьев), Archips rosana (листовертая резанная золотистая) и другие виды Archips, Chilo suppressalis (огневка азиатская стеблевая или желтая рисовая огневка), Cnaphalocrocis medinalis (листовертка рисовая), Crambus caliginosellus (кукурузная огневка), Crambus teterrellus (мотылек травяной), Diatraea grandiosella (огневка кукурузная юго-западная), Diatraea saccharalis (огневка сахарного тростника), Earias insulana (совка хлопковая египетская), Earias vittella (совка пятнистая), Helicoverpa armigera (совка американская), Helicoverpa zea (совка хлопковая или американская кукурузная совка), Heliothis virescens (табачная листовертка), Herpetogramma licarsisalis (луговой мотылек), Lobesia botrana (гроздевая листовертка), Phyllocnistis citrella (цитрусовая минурующая моль), Pieris brassicae (белянка капустная), Pieris rapae (репница или белянка репная), Plutella xylostella (капустная моль), Spodoptera exigua (совка малая), Spodoptera litura (азиатская хлопчатниковая совка, азиатская хлопковая совка) и Tuta absoluta (пасленовый минер).
Указанная в настоящей заявке выделенная молекула ДНК или эквивалентный термин или фраза означает, что молекула ДНК представляет собой молекулу, которая присутствует отдельно или в сочетании с другими композициями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, последовательность терминации транскрипции и т.п., которые, естественно, находятся в ДНК генома организма, не считаются выделенными до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте, где он находится, в естественном геноме. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части были бы выделенными в рамках данного описания, если элемент не находится внутри генома организма и в том месте, где он находится, в геноме, в котором он естественным образом находится. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой естественным образом находится последовательность, кодирующая белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность природного инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей настоящего описания. Для целей настоящего описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, то есть нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или подобной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых коли- 7 034764 чествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарных продуктах, полученных из растения или бактерии.
Как описано далее в примерах, повторяющиеся циклы конструирования, тестирования и отбора более двух тысяч (2000) вариантов аминокислотной последовательности TIC844 и Cry1Da1 привели к идентификации определенных аминокислотных остатков, которые могут быть замещены, вставлены или удалены из данного каркасного белка для получения искусственных инсектицидных белков, которые обладают расширенным спектром ингибирования чешуекрылых и/или улучшенной ингибирующей активностью в отношении чешуекрылых (т.е. более токсичным; меньшее количество инсектицидного белка, необходимо для получения того же уровня смертности) по сравнению со спектром и активностью базовых каркасных белков, TIC844 или Cry1Da1. Эти повторяющиеся этапы конструирования, тестирования и отбора также привели к идентификации замещений, вставок или делеций нейтральных аминокислотных остаток в каркасных белках TIC844 и Cry1Da1, которые не изменяют ингибирующий спектр или активность в отношении насекомых. Конкретные аминокислотные остатки в каркасе TIC844 и Cry1Da1, которые могут быть модифицированы для получения улучшенного спектра ингибирования чешуекрылых и/или улучшенной ингибирующей активности в отношении чешуекрылых, по сравнению с TIC844 или Cry1Da1, идентифицированы в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации изобретения сконструированный инсектицидный белок, предложенный в настоящем документе, может проявлять примерно восьмикратную или большую ингибирующую активность в отношении чешуекрылых против видов вредителей отряда Чешуекрылые, по сравнению с каркасным белком SEQ ID NO: 14 (TIC844) или SEQ ID NO: 2 (Cry1Da1).
Термин конструирование в этих повторяющихся циклах включал определение релевантных остатков в каркасном белке для модификации с целью создания модифицированного тестового белка и клонирование и экспрессию полученных модифицированных тестовых белков. Атомарная структура каркасных белков была использована для направления и дополнения полуслучайных подходов к выбору аминокислотных остатков для модификации при конструировании. Термин тестирование в этих повторяющихся циклах включал сравнение видоспецифичных видовых активностей модифицированного тестового белка с его исходным каркасным белком. Термин отбор в этих повторяющихся циклах включал идентификацию модифицированных тестовых белков с улучшенной активностью (улучшенные варианты) и соответствующих остатков, которые были сконструированы для создания этих улучшенных вариантов (эти улучшенные варианты называются в настоящем документе сконструированными инсектицидными белками).
Примерами способов тестирования и отбора сконструированных инсектицидных белков являются введение одинаковых количеств модифицированного тестового белка и каркасного белка (TIC844 или Cry1Da1) насекомому-вредителю в контролируемых условиях анализа и измерение, и сравнение эффективности модифицированных тестовых белков и каркасных белков. Другой способ тестирования и отбора сконструированных инсектицидных белков включает определение доз белка (например, концентрации белка в рационе) модифицированного тестового белка и каркасного белка (TIC844 или Cry1Da1), которые вызывают эквивалентные ответы популяции насекомых в контролируемых условиях анализа (то есть, получение кривой зависимости доза-эффект). Для сравнения использовалась статистически значимая величина дозы, используемая для сравнения: средняя летальная концентрация (LC50), необходимая для уничтожения 50% исследуемой популяции или концентрации ингибирования линьки (MIC50), медианная концентрация, необходимая для ингибирования линьки на 50%).
В некоторых вариантах реализации изобретения сконструированные инсектицидные белки, описанные в настоящем документе, содержат по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в следующих относительных положениях TIC844 (SEQ ID NO: 14) или Cry1Da1 (SEQ ID NO: 2): серии в положении 282 замещенный лизином или валином, тирозин в положении 316 замещенный серином, изолейцин в положении 368 замещенный пролином или аргинином, серии в положении 374 замещенный аргинином, аспарагин в положении 375 замещенный гистидином и изолейцин в положении 432 замещенный лейцином. Сконструированные инсектицидные белки могут также содержать по меньшей мере две, три, четыре или более из этих аминокислотных замещений или делеций в рамках одной и той же сконструированной инсектицидной последовательности белка.
Сконструированные инсектицидные белки, которые содержат данные аминокислотные модификации, включают белки, представленные как SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 44, и их фрагменты, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых. Каждый из этих сконструированных инсектицидных белков имеет измеренную массу около 132 кДа. Отдельные характеристики инсектицидных каркасных белков TIC844 и Cry1Da1 и сконструированных инсектицидных белков, полученных из них, представлены в табл. 1.
- 8 034764
Таблица 1. Характеристики TIC844, CrylDal и сконструированных инсектицидных белков
| Белок (Название/SEQ ID NO. ) | Молекулярная масса (в дальтонах) | Аминокислотная длина | Изоэлектрическая точка | Заряд при РН 7,0 | Количество сильноосновных (-) аминокислот | Количество сильнокислых аминокислот | Количество гидрофобных аминокислот | Количество полярных аминокислот |
| CrylDal/ N0:2 | 132481,87 | 1165 | 5,087 | -39,319 | 113 | 156 | 388 | 347 |
| CrylDal_ 3/NO:4 | 132405,77 | 1165 | 5,087 | -39,318 | 113 | 156 | 388 | 347 |
| CrylDal_ 4/NO:6 | 132550,98 | 1165 | 5,112 | -38,319 | 114 | 156 | 388 | 346 |
| CrylDal_ 5/NO:8 | 132448,80 | 1165 | 5,112 | -38,318 | 114 | 156 | 387 | 347 |
| CrylDal_ 6/NO:10 | 132430,82 | 1165 | 5,112 | -38,319 | 114 | 156 | 387 | 346 |
| CrylDal_ 7/NO:12 | 132401,78 | 1165 | 5,087 | -39,318 | 113 | 156 | 388 | 346 |
| Т1С844/ | 129182,91 | 1139 | 5,026 | -39,540 | 110 | 153 | 382 | 340 |
| N0:14 | ||||||||
| TIC844_2 /N0:16 | 129129,85 | 1139 | 5,048 | -39,373 | 110 | 153 | 382 | 339 |
| TIC844_4 /NO:18 | 129106,81 | 1139 | 5,026 | -39,539 | 110 | 153 | 382 | 340 |
| TIC844_5 /N0:20 | 1291118,08 | 1069 | 5,325 | -27,535 | 105 | 136 | 363 | 321 |
| TIC844_6 /N0:22 | 129252,02 | 1139 | 5,050 | -38,540 | 111 | 153 | 382 | 339 |
| TIC844_7 /N0:24 | 129149,84 | 1139 | 5,050 | -38,539 | 111 | 153 | 381 | 340 |
| TIC844_8 /N0:26 | 129102,82 | 1139 | 5,026 | -39,539 | 110 | 153 | 382 | 339 |
| CrylDal/ N0:28 | 132481,87 | 1165 | 5,087 | -39,319 | 113 | 156 | 388 | 347 |
| CrylDal_ 2.nno/N0 :30 | 132552,95 | 1166 | 5,087 | -39,319 | 113 | 156 | 389 | 347 |
| CrylDal_ 3.nno/NO :32 | 132476,85 | 1166 | 5,087 | -39,318 | 113 | 156 | 389 | 347 |
| CrylDal_ 4.nno/NO : 34 | 132622,06 | 1166 | 5,112 | -38,319 | 114 | 156 | 389 | 346 |
| CrylDal_ 5.nno/NO :36 | 132519,88 | 1166 | 5,112 | -38,318 | 114 | 156 | 388 | 347 |
| CrylDal_ 6.nno/NO : 38 | 132501,90 | 1166 | 5,112 | -39,319 | 114 | 156 | 388 | 346 |
| CrylDal_ 7.nno/NO | 132472,86 | 1166 | 5,087 | -39,318 | 113 | 156 | 389 | 346 |
| :40 | ||||||||
| TIC844_9 .nno/NO: 42 | 129253,99 | 1140 | 5,026 | -39,540 | 110 | 153 | 383 | 340 |
| TIC844_1 1.nno/NO : 44 | 129173,90 | 1140 | 5,026 | -39,539 | 110 | 153 | 383 | 339 |
- 9 034764
Фрагменты сконструированных инсектицидных белков, описанных в настоящем документе, могут быть укороченными формами, в которых одна или несколько аминокислот удаляются с N-конца, Cконца, середины белка, или их комбинаций без потери ингибирующей активности в отношении насекомых. Эти фрагменты должны сохранять ингибирующую активность родительского инсектицидного белка в отношении насекомых.
Белки, которые имеют сходство со сконструированными инсектицидными белками, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники. Например, идентичность аминокислотных последовательностей белков, связанных со сконструированными белками, может быть проанализирована с использованием выравнивания Clustal W с использованием данных параметров по умолчанию: Матрица весовых оценок: blosum, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,0, штраф на продолжение делеции: 0,05, гидрофильные делеции: Вкл., гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штраф на остаткоспецифичные делеции: Вкл. (Thompson, et al (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывают в виде выражения 100% умноженных на (идентичности аминокислот/длина искомого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и обеспечивают результаты, аналогичные тем, которые получены с использованием выравнивания Clustal W.
Как описано далее в примерах данной заявки, синтетические или искусственные последовательности, кодирующие каркасные белки и сконструированные инсектицидные белки, были разработаны для применения в растениях. Иллюстративные синтетические нуклеотидные последовательности, которые были разработаны для применения у растений, изложены в SEQ ID NO:27 (Cry1Da1.nno), SEQ ID NO:29 (Cry1Da1_2.nno), SEQ ID NO:31 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO:33 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO:35 (Cry1Da1_5.nno), SEQ ID NO:37 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO:39 (Cry1Da1_7.nno), SEQ ID NO:41 (TIC844_9.nno) и SEQ ID NO:43 (TIC844_11.nno).
Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие эти синтетические или искусственные нуклеотидные последовательности, конструировали и вводили в клетки растений кукурузы, хлопчатника и сои в соответствии со способами и методиками трансформации, известными в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было замечено, экспрессировали сконструированный инсектицидный белок или каркасный белок. Для проверки пестицидной активности биотесты проводили в присутствии личинок чешуекрылых-вредителей с использованием высечек из листьев растений, полученных от трансформированных растений.
Рассматриваются композиции молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют сконструированные инсектицидные белки. Например, сконструированный инсектицидный белок может быть экспрессирован конструктами рекомбинантной ДНК, в которых полинуклеотидная молекула с ОРС (открытой рамкой считывания), кодирующая сконструированный инсектицидный белок, функционально связана с элементами генетической экспрессии, такими как промотор и любой другой регуляторный элемент, необходимый для экспрессии в системе, для которой предназначен данный конструкт. Неограничивающие примеры включают растительный функциональный промотор, функционально связанный с кодирующими последовательностями синтетических инсектицидных белков, для экспрессии сконструированного инсектицидного белка в растениях, или Bt-функциональным промотор, функционально связанный с кодирующими последовательностями синтетических инсектицидных белков, для экспрессии белка в бактерии Bt или других видах рода Bacillus. Другие элементы могут быть функционально связаны со сконструированными кодирующими последовательностями инсектицидного белка, включая, но не ограничиваясь ими, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые иммобилизационные метки (гистидиновые метки), транслокационные пептиды (т.е. пластидные транзитные пептиды, сигнальные пептиды) полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи. Приведенные в настоящем документе иллюстративные молекулы рекомбинантного полинуклеотида включают, но не ограничиваются ими, гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39 b SEQ ID NO:43, который кодирует полипептид или белок, имеющий аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO:4 (Cry1Da1_3), SEQ ID NO:6 (Cry1Da1_4), SEQ ID NO:8 (Cry1Da1_5), SEQ ID NO:10 (Cry1Da1_6), SEQ ID NO:12 (Cry1Da1_7), SEQ ID NO:16 (TIC844_2), SEQ ID NO:18 (TIC844_4), SEQ ID NO:20 (TIC844_5), SEQ ID NO:22 (TIC844_6), SEQ ID NO:24 (TIC844_7), SEQ ID NO:26 (TIC844_8), SEQ ID NO:32 (Cry1Da1_3.nno), SEQ ID NO:34 (Cry1Da1_4.nno), SEQ ID NO:36 (Cry1Da1_5.nno), SEQ ID NO:38 (Cry1Da1_6.nno), SEQ ID NO:40 (Cry1Da1_7.nno) и SEQ ID NO:44 (TIC844_11.nno). Гетерологичный промотор также может быть функционально связан с синтетическими кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими нацеленный на пластиду сконструированный инсектицидный белок и нецелевой сконструированный инсектицидный белок. Предполагается, что кодоны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей сконструированный инсектицидный белок, описанный в настоящем документе, могут быть замещены синонимичными кодонами (известными в данном уровне техники как молчащая замена).
- 10 034764
Рекомбинантная молекула ДНК или конструкт, содержащие сконструированную инсектицидную кодирующую белок последовательность, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует один или более токсичных агентов, которые могут быть сконфигурированы для одновременной экспрессии или коэкспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей сконструированный инсектицидный белок, белок, отличный от сконструированного инсектицидного белка, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают, но не ограничиваются ими, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые действуют, с целью повышения эффективности агента, оказывающего ингибирующее воздействие на насекомое, например, путем облегчения его экспрессии, влияния на его стабильность в растениях, оптимизации свободной энергии для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектра его активности. Вспомогательный белок может облегчать захват одного или более агентов, обладающих ингибирующим воздействием на насекомых, например, или усиливать токсический эффект токсичного агента.
Рекомбинантную молекулу ДНК или конструкт можно сформировать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК экспрессировались от одного промотора, или каждый белок, или молекула дцРНК находилась под контролем отдельного промотора, или некоторой их комбинации. Белки согласно данному изобретению могут быть экспрессированы системой множественной экспрессии генов, в которой сконструированный инсектицидный белок экспрессируется из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа системы экспрессии. Например, бактериальная система множественной экспрессии генов может использовать единственный промотор для управления экспрессией многократносвязанных/тандемных открытых рамок считывания из одного оперона (т.е., полицистронной экспрессии). В другом примере растительная система множественной экспрессии генов может использовать многократнонесвязанные экспрессионные кассеты, каждая из которых экспрессирует другой белок или другой токсичный агент, такой как одна или более молекул дцРНК.
Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или рекомбинантные конструкты ДНК, содержащие сконструированную кодирующую последовательность инсектицидного белка, могут быть доставлены в клетки-хозяева при помощи векторов, например, плазмидного, бакуловирусного, синтетической хромосомы, вирионного, космидного, фагмидного, фагового или вирусного вектора. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или кратковременной экспрессии сконструированной кодирующей последовательности инсектицидного белка в клетке-хозяине или последующей экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или рекомбинантный конструкт ДНК, которые содержат сконструированную инсектицидную последовательность, кодирующую последовательность белка, и которые вводят в клетку-хозяина, упоминаются в настоящем документе как трансген.
В настоящем документе предложены трансгенные бактерии, трансгенные клетки растений, трансгенные растения и трансгенные части растений, которые содержат полинуклеотид, кодирующий любой один или более инсектицидных белков. Термин бактериальная клетка или бактерия может включать, но не ограничивается ими, клетку видов родов Agrobacterium, Bacillus, Escherichia, Salmonella, Pseudomonas или Rhizobium. Термин клетка растения или растение может включать, но не ограничивается ими, клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. Рассматриваемые растения и клетки растений включают, но не ограничиваются ими, люцерну, банан, ячмень, бобы, брокколи, капусту, капусту декоративную, морковь, маниок, клещевину, капусту цветную, сельдерей, нут, капусту пекинскую, цитрусовые, кокосовый орех, кофе, кукурузу, клевер, хлопчатник, тыквенные, огурец, ель Дугласа, баклажан, эвкалипт, лен, чеснок, виноград, хмель, лук-порей, салат латук, сосну Лоблолли, просо, дыни, орех, овес, маслину, лук, декоративные растения, пальму, пастбищную траву, горох, арахис, перец, голубиный горох, сосну, картофель, тополь, тыкву, сосну лучистую, редис, рапс, рис, корневищные злаки, рожь, сафлор, кустарниковые розы, сорго, сосну южную, сою, шпинат, тыкву гигантскую, клубнику, сахарную свеклу, сахарный тростник, подсолнечник, кукурузу сахарную, ликвидамбар смолоносный, сладкий картофель, просо, чай, табак, помидор, тритикале, дерновую траву, арбуз и клетку или растение пшеницы. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и трансгенные части растений, регенерированные из трансгенной клетки растения. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени, путем черенкования, отщипывания, измельчения или иным образом разъединения части с растением. В некоторых вариантах реализации изобретения часть растения может представлять собой семя, коробочку, лист, цветок, стебель, корень или любую их часть или нерегенерируемую честь трансгенной части растения. Используемый в данном контексте термин нерегенерируемая часть трансгенной части растения представляет собой часть, из которой не может быть индуцировано образование целого растения, или из которой не может быть индуцировано образование целого растения, способного к половому и/или вегетативному размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.
Предложены способы получения трансгенных растений, которые содержат чешуекрыло ингиби
- 11 034764 рующие количества сконструированных инсектицидных белков. Такие растения могут быть получены путем введения полинуклеотида, который кодирует сконструированные инсектицидные белки, предложенные в настоящей заявке, в растительную клетку и отбора растения (полученного из указанной растительной клетки), которое экспрессирует инсектицидно- или чешуекрыло ингибирующее количество сконструированного белка. Растения могут быть получены из клеток растений путем регенерации или методик трансформации семян, пыльцы или меристемы. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
Растения, экспрессирующие сконструированные инсектицидные белки, можно скрещивать путем селекции с трансгенными трансформантами, экспрессирующими другие инсектицидные белки и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как другие признаки борьбы с насекомыми, гены устойчивости к гербицидам, гены, дающие признаки урожайности или устойчивости к стрессу, и т.п., или данные черты могут быть объединены в один вектор, так чтобы все признаки были связаны между собой.
Обработанные растительные продукты, содержащие обнаруживаемое количество сконструированного инсектицидного белка, сегмент, обладающий ингибирующей активностью в отношении насекомого или его фрагмент, или любую отличительную его часть, также описаны в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации изобретения обработанный продукт выбран из группы, состоящей из частей растения, биомассы растения, масла, муки грубого помола, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, волокна, шелухи, обработанного семени и семени. В некоторых вариантах реализации изобретения, обработанный продукт является нерегенерируемым. Растительный продукт может содержать товарный или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или трансгенной части растения, причем товарный или другие продукты могут быть отслежены с помощью коммерческой деятельности путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированной РНК или белка, которые кодируют или содержат отличительные части сконструированного инсектицидного белка.
Способы борьбы с насекомыми, в частности поражение видами отряда Чешуекрылые, культурных растений, со сконструированными инсектицидными белками, также описаны в настоящей заявке. Такие способы могут включать выращивания растений, содержащих инсектицидно- или чешуекрылоингибирующее количество сконструированного инсектицидного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать одно или более из следующего: (i) применение любой композиции, содержащей или кодирующей сконструированный инсектицидный белок, к растению или семени, что приводит к образованию растения; и (ii) трансформацию растения или клетки растения, что приводит к образованию растения с полинуклеотидом, кодирующим сконструированный инсектицидный белок. В общем, предполагается, что сконструированный инсектицидный белок может быть обеспечен в композиции, обеспечен, в микроорганизме, обеспечен, в трансгенном растении для придания ингибирующей активности в отношении насекомых отряда Чешуекрылые.
В некоторых вариантах реализации изобретения, сконструированный инсектицидный белок является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной путем культивирования рекомбинантной Bacillus или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной, для экспрессии сконструированного инсектицидного белка в условиях, пригодных для экспрессии. Такая композиция может быть получена с помощью высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, осаждения или концентрации культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих сконструированный инсектицидный белок. Такой процесс может привести к образованию экстракта бактериальных клеток, суспензии клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или осаждению клеток Bacillus или другого энтомопатогена. Получив сконструированный инсектицидный белок, таким образом, создают композицию, которая содержит сконструированный инсектицидном белок, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца и может поставляться для различных применений, включая продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении сельскохозяйственные насекомых или препараты кормовой биомассы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых в кормовых биотестах.
В одном варианте реализации изобретения, для того, чтобы уменьшить вероятность развития устойчивости, композиция или трансгенное растение, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащие сконструированный инсектицидный белок могут дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный токсичный агент, который проявляет ингибирующей активностью в отношении одних и тех же видов чешуекрылых насекомых, но который отличается от сконструированного инсектицидного белка. Возможные дополнительные токсичные агенты для такой композиции включают молекулы белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых. Одним из примеров использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описаны в Baum, et al. (Патентная публикация США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид(ы) для борьбы с чешуекрылыми насекомыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей
- 12 034764 из белка, проявляющего ингибирующую активность в отношении насекомых, такого как, но не ограничиваясь ими, Cry1A (патент США № 5880275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A.105, Cry1Ae, Cry1B (патентная публикация США № 10/525318), Cry1C (патент СшА № 6033874), Cry1D, Cry1E, Cry1F и химеры Cry1A/F (патент США № 7070982, 6962705 и 6713063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab (патент США № 7064249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, VIP3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035, и AXMI-045 (патентная публикация США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI- 97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (патентная публикация США 20130310543 A1), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (патентная публикация США 2013-0104259 A1), AXMI134 (патентная публикация США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (патентная публикация США 20100160231 A1), AXMI-184 (патентная публикация США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI207, AXMI-209 (патентная публикация США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (патентная публикация США 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (патентная публикация США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (патентная публикация США 2014-0033363 A1), AXMI270 (патентная публикация США 2014-0223598 A1), AXMI-345 (патентная публикация США 20140373195 A1), DIG-3 (патентная публикация США 2013-0219570 A1), DIG-5 (патентная публикация США 2010-0317569 A1), DIG-11 (патентная публикация США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производные (патентная публикация США 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производные (патентная публикация США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (патентная публикация США 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (патентная публикация США 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (патентная публикация США 2014-0007292 A1), Pput_1063 (патентная публикация США 2014-0007292 A1), Pput_1064 (патентная публикация США 2014-0007292 A1), GS-135 и его производные (патентная публикация США 2012-0233726 A1), GS153 и его производные (патентная публикация США 2012-0192310 A1), GS154 и его производные (патентная публикация США 2012-0192310 A1), GS155 и его производные (патентная публикация США 20120192310 A1), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патентной публикации США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патентной публикации США 2012-0047606 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патентной публикации США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2, и ее производные, как описано в патентной публикации США 2011-0112013 A, SEQ ID NO: 2 и 4, и их производные, как описано в патентной публикации США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2, и ее производные, как описано в патентной публикации США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2, и ее производные, как описано в патентной публикации США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патентной публикации США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 или 4, и их производные, как описано в патентной публикации США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патенте США № 7772465 (B2), CF161_0085 и его производные как описано в WO2014/008054 А2, токсичные белки, обладающие активностью в отношении чешуекрылых и их производные, как описано в патентных публикациях США US2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 и US2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2, и ее производные, как описано в US7510878 (B2), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в патенте США № 7812129 (B1); и тому подобное.
В других вариантах реализации изобретения, композиция или трансгенное растение, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых, могут дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный токсичный агент, который проявляет инсектицидную ингибирующую активность в отношении насекомых-вредителей, которые не восприимчивы к ингибирующей активности сконструированных инсектицидных белков согласно настоящему изобретению (например, жесткокрылых, полужесткокрылых и прямокрылых вредителей), для расширения полученного спектра ингибирующей активности в отношении насекомых.
Такой дополнительный токсичный агент для борьбы с жесткокрылыми насекомыми-вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, но не ограничиваясь этим, Cry3Bb (патент США 6501009), варианты Cry1C, варианты Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (патентная публикация США 20130167264 A1) AXMI-184 (патентная публикация США 2010-0004176 A1), AXMI-205 (патентная публикация США 2014-0298538 A1), axmi207 (патентная публикация США 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI220 (патентная публикация США 20140245491 A1), AXMI-221z, AXMI-223z (патентная публикация США 2014-0196175 A1), AXMI-279 (патентная публикация США 2014-0223599 A1), AXMI-R1 и их варианты (патентная публикация США 2010-0197592 A1), TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (патентная публикация США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация заявки на патент США № 2010/0017914), IP3, и его варианты (патентная публикация США 2012-0210462 A1) и таHexatoxin-Hv1a (публикация заявки на патент США US2014-0366227 A1).
Такой дополнительный токсичный агент для борьбы с полужесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящая из белков, обладающих активностью в отношении полужесткокрылых, таких как, но не ограничиваясь ими, TIC1415 (патентная публикация США 2013-0097735 A1), TIC807 (патент США № 8609936), TIC834 (патентная публикация США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (патентная публикация США 2010-0137216 A1) и AXMI-171 (патентная публикация США 2013-0055469
- 13 034764
A1). Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и полужесткокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на сайте номенклатуры токсина Bacillus thuringiensis поддерживаемом Neil Crickmore (во интернете, по адресу btnomenclature.info).
Кодирующие последовательности сконструированного инсектицидного белка и последовательности, имеющие значительный процент идентичности со сконструированными инсектицидными белками могут быть идентифицированы с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, сконструированные инсектицидные белки могут быть использованы для получения антител, которые специфически связываются с родственными белками, и могут быть использованы для скрининга и поиска других тесно связанных белков.
Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие сконструированные инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга с целью выявления других представителей класса с использованием методов термического цикла или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 3 могут быть использованы, для определения наличие или отсутствие сконструированного инсектицидного трансгена в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученном из товарного продукта. С учетом чувствительности некоторых способов обнаружения нуклеиновых кислот, которые используют олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 3 могут быть использованы для обнаружения соответствующего сконструированную инсектицидного белка в товарных продуктов, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта, получена из трансгенного растения, содержащего SEQ ID NO: 3.
Другие отличительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующих примеров и формулы изобретения.
Примеры
Ввиду вышеизложенного специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны изменения в конкретных аспектах, которые раскрыты и все будет получен подобный или аналогичный результат, не отходя от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, раскрытые в настоящем документе, не следует интерпретировать как ограничение. Следует понимать, что полное раскрытие каждой из указанных выше публикаций включено в описании настоящей заявки.
Пример 1. Разработка модифицированных тестовых белков и подготовка образцов для биологического анализа на насекомых.
Данный пример иллюстрирует способы, принятые для определения соответствующих аминокислотных остатков в каркасных белках, для модификации, для создания модифицированных тестовых белков, а также клонирование и экспрессию полученных модифицированных тестовых белков.
Некоторые методики молекулярной инженерии были использованы в многоуровневом подходе для конструирования улучшенных вариантов CrylDal, имеющих улучшенный спектр ингибирующей активности в отношении чешуекрылых и/или улучшенную ингибирующую активность в отношении чешуекрылых по сравнению с каркасными белками CrylDal и TIC844 (гомолог CrylDal). Первый тур, или начальный этап конструирования, в первую очередь основан на гипотезах. Вторые и третьи туры были статистически управляемыми этапами конструирования. Например, во втором туре конструирования, статистически безвредные мутации были комбинированы с предполагаемыми полезными мутациями для получения двойных мутаций, которые удовлетворяли определенным статистическим критериям. В третьем туре конструирования, все данные из предыдущих испытаний были проанализированы с помощью нескольких статистических методов. Только мутации, продемонстрировавшие статистически значимое улучшение в более чем одном статистическом методе, были выбраны для окончательного пула мутаций. Варианты, разработанные в данном туре, содержали одну или две положительные мутации из вариантов, ранее подтвержденных как положительные. Таким образом, конструирование третьего тура существенно обогащало активные варианты по сравнению с первым и вторым туром. Как показано в последующих Примерах, использование трехтуровой стратегии конструирования определяет как одиночные, так и синергичные мутации, которые обеспечили значительное улучшение активности против CEW для некоторых улучшенных вариантов по отношению к каркасным TIC844 и CrylDal.
Способы, которые были использованы для создания модифицированных тестовых белок включают, но не ограничены ими, полуслучайные модификации, направленные модификации отклонений в выравнивании TIC844/CrylDal с другими нативными белками Bacillus Thuringensis (Bt), и структурно/функциональное конструирование. Примеры используемых методик молекулярной инженерии включают следующие.
Связывание рецептора. Восприимчивость чешуекрылых насекомых-вредителей, в частности, совка кукурузной (CEW, Helicoverpa zea) к улучшенным вариантам CrylDal/TIC844 может быть отнесена к разным целевым кишечным рецепторам. Подходы, которые были использованы для улучшения связывания с рецепторами в кишечнике, тем самым увеличивая токсичность, включают: (l) подвергание мутации каждой позиции в апикальных петлях домена II по всем аминокислотным типам; и (2) замену всех
- l4 034764 возможных комбинаций апикальных петель домена II на те же от других гомологов CrylDal (например,
CrylDbl, Cry1Dc1) и CEW-активных трехдоменых токсинов (например, Cry1Bb1, Cry1Ja1 и Cry2Ab2).
Подходы, основанные на выравнивании. Выравнивание Cry1Da1 с другими гомологами (например, Cry1Db1 и Cry1Dc1) было использовано для идентификации областей изменчивости. В результате выравнивания были идентифицированы сто пятьдесят (150) позиций и двести девяносто пять (295) уникальных единичных мутаций. Эти позиции были расположены во всех трех доменах. Позиции в границах четырех (4) аминокислот друг от друга, были сгруппированы вместе. Только мутации из одинаковых исходных последовательностей были назначены для каждой группы позиций, с образованием ста тридцати двух (132) уникальных вариантов.
Подходы поверхностного мутагенеза. Полинуклеотиды, кодирующие поверхностные позиции в доменах II и III каркасных белков, были подвергнуты мутагенезу при сканировании. В позициях каркасного белка, где не присутствовал аланин, аминокислотные остатки были заменены на аланин. Аргининовые мутации в дополнении к аланиновым были введены в поверхностных положениях, в которых нативные остатки представляли собой лизин. Рациональность мутационных замен лизина на аргинин была основан на наблюдении, что токсины, обладающие активностью в отношении чешуекрылых, как правило, имеют очень мало лизина и много аргинина и, таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что изменение в поверхностных положениях лизина в доменах II и III на аргинин может увеличить активность модифицированного тестового белка в отношении чешуекрылых.
Изменение протеолитических событий. Существует гипотеза, что протеолитический процесс является важным аспектом деятельности трехдоменных токсинов в средней кишке чешуекрылых насекомых. Для тестирования этого было создано несколько наборов мутаций способных изменять любое протеолитическое расщепление. Потенциальные сайты расщепления расположены на N-конце и между доменом III и протоксином. Мутационные позиции включают предсказанные области петли от N-конца к началу спирали 4, и с C-конца домена III до ~40 аминокислот в протоксине. Как правило, остатки глицина гипотетически содействовали протеолизу или посредством распознавания протеолитического сайта, или за счет увеличения гибкости белка, тем самым делая его более восприимчивым к протеолитическому расщеплению. Кроме того, трипсин и химотрипсин оба представляют собой протеазы, которые широко известны в качестве жизнеспособных протеаз в средней кишке чешуекрылых. Остатки лизина обеспечивают сайты узнавания для трипсина, а остатки тирозина обеспечивают сайты узнавания для химотрипсина. Таким образом, выбранные мутационные позиции в потенциальных сайтах расщепления подвергали глициновым, лизиновым или тирозиновым мутациям.
Потенциальные горячие точки мутаций от других CEW-активных токсинов. Была проанализированы данные активности и отсутствии активности против CEW для большого набора белков (включая химер, фрагменты и нативные последовательности).
Информация, полученная из статистического анализа этих данных, была использована для выявления потенциальных специфических мутаций или позиций для мутаций, которые, вероятно, увеличат CEW-активности конечных модифицированных тестовых белков.
Модифицированные тестовые белки, полученные в результате молекулярных методик инженерии, описанных выше, были клонированы с использованием способов, известные в данной области техники в рекомбинантный экспрессионный вектор плазмиды Bt уменьшали экспрессию специфического промотора спорообразование и трансформирован в некристаллообразующую клетку-хозяина Bt.
Пример 2. Тестирование модифицированных тестовых белков в кормовых биотестах против чешуекрылых вредителей.
Данный пример иллюстрирует тестирование модифицированных тестовых белков, созданных путем экспериментов конструирования, описанных в примере 1.
Путем экспериментов конструирования, описанных в примере 1, были произведены около двух тысяч пятисот (2500) рекомбинантных штаммов Bt, экспрессирующих более двух тысяч трехсот (2300) различных модифицированных тестовых белков. Эти модифицированные тестовые белки экспрессировались Bt и испытывались на токсичность в отношении различных видов отряда Lepidoptera. Эксперименты кормления были проведены на новорожденных личинках (<24 ч после вылупления) различных видов чешуекрылых, включая совку кукурузную (CEW, Helicoverpa zea) и кукурузную листовую совку (FAW, Spodoptera frugiperda). Яйца насекомого для CEW-тестирования были получены из двух различных лабораторных колоний: Benson Research, Карлайл штат Пенсильвания и Monsanto Company, Юнион-Сити, штат Теннесси. Все экспрессированные модифицированные тестовые белки были протестированы против CEW, и некоторые из этих модифицированных тестовых белков, демонстрирующих повышенную активность против CEW по сравнению с их родительскими каркасными белками, были протестированы против FAW, в дополнении к выполнению дополнительного биотеста для подтверждения активности против CEW.
Различные протоколы для биотестов и оценки смертности и задержке роста насекомых известны в данной области техники. Были использованы вариации способов, таких, как те, которые описаны в публикации патентной заявки РСТ № WO 2012/139004 и в патенте США № 7927598.
Пример 3. Модифицированные тестовые белки проявляющие улучшенную активность против
- 15 034764
CEW.
Данный пример иллюстрирует открытие расширенного ингибирующего спектра в отношении чешуекрылых и/или улучшенной или увеличенной ингибирующей активности в отношении чешуекрылых для некоторых из модифицированных тестовых белков по сравнению с активностью каркасных белков TIC844 или Cry1Da1 в нескольких этапах тестирования.
Модифицированные тестовые белки, созданные при помощи экспериментов конструирования, описанных в примере 1, и испытанных в биотесте насекомых, как описано в примере 2, были испытаны в повторяющихся этапах, в которых сравнивали активность в отношении видов чешуекрылых модифицированных тестовых белков с их соответствующими родительскими каркасными белками (т.е., TIC844 или Cry1Da1). На первом этапе триста семьдесят (370) различных модифицированных тестовых белков продемонстрировали повышенную токсичность в отношении CEW по сравнению с CMP TIC844 или Cry1Da1 в кормовом биотесте. В каждом из этих кормовых биотестов, одинаковые количества белка (или модифицированный тестовый белок или каркасный белок) были предоставлены CEW в контролируемых условиях анализа с однократной дозой. Активность модифицированных тестов белков и каркасных белков определяли путем измерения и сравнения наблюдаемой смертности и задержки роста каждого из биотестов модифицированной тестовых белков к наблюдаемой смертности и задержке роста биотестов родительских каркасных белков.
Из трех сто семидесяти (370) модифицированных тестовых белков, которые продемонстрировали повышенную токсичность в отношении CEW по сравнению с каркасными белками в однодозных тестах, около сто восемьдесят (180) из них были дополнительно испытаны в FAW-биотестах, чтобы определить, поддерживали или проявляли эти модифицированные тестовые белки повышенную активность по отношению к FAW по сравнению с их родительскими каркасными белками. От около сорока (40) до пятидесяти (50) из этих модифицированных тестовых белков проявляли сходную или более высокую активность в отношении FAW по сравнению с их родительскими каркасными белками. Эти дополнительно исследованные модифицированные тестовые белки были также испытаны в дополнительных CEWбиотестах, для подтверждения активности в отношении CEW. В результате этих этапов отбора и тестирования модифицированных тестовых белков, которые продемонстрировали улучшенную активность в отношении CEW при сохранении или улучшении активности в отношении FAW был получен окончательный список улучшенных вариантов (упоминаемый в настоящем документе как сконструированные инсектицидных белки). В Таблице 2 приводятся эти сконструированные инсектицидные белки и аминокислотные мутации в каждом сконструированном инсектицидном белке. В табл. 2 также представлена активность каркасных и сконструированных инсектицидных белков в отношении CEW и FAW (инсектицидная активность показана в значении LC50 (концентрация токсина, необходимая, для уничтожения 50% популяции насекомых в течение заданной длительности воздействия. Чем ниже значение LC50, тем выше токсичность) и значении MIC50 (концентрация, необходимая для ингибирования линьки определенной возрастной стадии 50% личинок в течение фиксированной длительности воздействия). В данной таблице показано, что сконструированные инсектицидные белки обладают улучшенной активностью в отношении CEW, при сохранении или улучшении активности в отношении FAW.
- 16 034764
Таблица 2. Аминокислотные мутации и данные активности для каркасных белков и сконструированных
* Аминокислотные мутации идентифицированы с использованием стандартного кода IUPAC аминокислот. См., IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature. Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides. Eur. J. Biochem. 138:9-37(1984). Первая аббревиатура аминокислотной последовательности указывает на исходную аминокислоту в данном каркасном белке, число указывает положение аминокислоты, а вторая аббревиатура аминокислотной последовательности, указывает на аминокислоту, расположенную в этом положении в усовершенствованном варианте белка.
** Основной токсин Cry1Da1 идентичен основному токсину TIC844.
Далее демонстрируется улучшенный ингибирующий спектр чешуекрылых и улучшенная ингибирующая активностью в отношении чешуекрылых для сконструированных инсектицидных белков, летальность сконструированного инсектицидного белка TIC844_8 относительно его родительского каркасного белка представлена на чертеже. На гистограмме показано значения MIC50 TIC844_8 по сравнению с
- 17 034764 каркасом белка TIC844 для двух различных колоний CEW, Union City и Benzon. Результаты биотестов, изображенные на чертеже, были рассчитаны из биотестов препаратов, очищенных градиентом сахарозы. Эти вторичные биотесты были проведены с препаратами белков, очищенными градиентом сахарозы вместо спорово-кристаллических препаратов белков для того, чтобы гарантировать, что улучшенная активность TIC844_8 сохраняется при более интенсивной очистке. Кроме того, колонию Union City тестировали для подтверждения повышенной активности, наблюдаемой в колонии Benzon. Как показано на чертеже, мутации в трех остатках TIC844_8 (S282V_Y316S_I368P), придавали 8-кратное улучшение летальности CEW, по сравнению с TIC844, для колонии Union City и 50-кратное улучшение летальности CEW, по сравнению с TIC844, для колонии Benzon.
Далее демонстрируется улучшенный ингибирующий спектр в отношении чешуекрылых и улучшенную ингибирующую активность в отношении чешуекрылых для сконструированных инсектицидных белков, профили активности против насекомых для TIC844 и TIC844_8 из кормовых биотестов, проводимых в отношении широкого спектра видов насекомых-чешуекрылых, приведены в табл. 3. Насекомые, в отношении которых проводились испытания в биотестах из табл. 3, включают совку ипсилон (BCW, Agrotis ipsilon), совку кукурузную (CEW, Helicoverpa zea), совку кукурузную листовую (FAW, Spodoptera frugiperda), совку южную (SAW, Spodoptera eridiania), совку ни (CLW, Trichoplusia ni), огневку кукурузную (ECB, Ostrinia nubilalis), юго-западного кукурузного мотылька (SWC, Diatraea grandiosella), совку табачную (TBW, Heliothis virescens), гусеницу бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis), совку соевую (SBL, Chrysodeixis includes) и огневку сахарного тростника (SCB, Diatraea saccharalis). В данной табл. 3 представлен улучшенный ингибирующий спектр TIC844_8 в отношении чешуекрылых по сравнению с родительским каркасным белком TIC844, в частности, с улучшенной активностью против CEW и VBC.
Таблица 3. Спектр активности для TIC844 и TIC844_8 в . отношении насекомых
| SEQ ID NO. | Белок | BCW | CEW | FAW | SAW | CLW | ECB | SWC | TBW | VBC | SBL | SCB |
| 26 | TIC844 _8 | * | * | * | * | * | * | * | ||||
| 14 | TIC844 | * | * | * | * | * |
* Активен в отношении указанных видов насекомых.
Улучшенный ингибирующий спектр сконструированных инсектицидных белков в отношении чешуекрылых, далее продемонстрирован в таблице 4, в которой представлен профиль активности насекомых для некоторых модифицированных инсектицидных белков из исследований кормовых биотестов. Насекомые, в отношении которых проводились испытания в биотестах из таблицы 4, включают совку американскую (CBW, Helicoverpa armigera), совку азиатскую хлопковую (TCW, Spodoptera litura), совку малую (BAW, Spodoptera exigua), розового коробочного червя (PBW, Pectinophora gossypiella), совку розовую стеблевую (PSB, Sesamia inferens) и совку пятнистую (SBW, Earias vitella). Результаты, представленные в таблице 4, указывают на повышенный ингибирующий спектр в отношении чешуекрылых у перечисленных сконструированных инсектицидных белков (по сравнению с каркасным белком Cry1Da1) в частности, с улучшенной активностью против CBW, PBW (устойчивые к Cry1Ac), PBW (естественного происхождения) и SBW.
Таблица 4. Сравнение профилей инсектицидной активности для Cry1Da1 и сконструированных инсектицидных белков
| SEQ ID NO. | Белок | CBW | TCW | BAW | PBW (Выращенный в лаборатории) | PBW (устойчивый к CrylAc) | PBW (естественного происхождения) | PSB | SBW |
| 2 | CrylDal | + | + | + | + | + | + | ||
| 12 | CrylDal_7 | + | + | + | + | + | + | + | |
| 18 | TIC844_4 | + | + | + | + | + | + | ||
| 20 | TIC844_5 | + | + | + | + | + | + | ||
| 24 | TIC844_7 | + | + | + | + | + |
+Активен в отношении указанных видов насекомых.
- 18 034764
Пример 4. Синтез генов, кодирующих инсектицидные сконструированные белки и каркасные белки для экспрессии в растениях.
Данный пример иллюстрирует синтез полинуклеотидов, кодирующих сконструированные инсектицидные белки и каркасные белки для экспрессии в растениях.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие каркасные белки и сконструированные инсектицидные белки для экспрессии в растениях, были разработаны и синтезированы в соответствии со способами, описанными в патенте США № 5500365, избегая определенные неподходящие проблемные последовательности, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные ATTTA и A/T, при сохранении аминокислотной последовательности исходного каркасного или сконструированного инсектицидного белка. Нуклеотидные последовательности этих генов, кодирующие сконструированные белки и каркасные белки для экспрессии в растениях, перечислены ниже в Таблице 5.
Таблица 5. Полинуклеотидных последовательностей, сконструированные для использования в растениях, кодирующие каркасные и сконструированные инсектицидные белки
| Нуклеотидная SEQ ID NO. | БЕЛОК | ВАРИАНТ |
| 27 | CrylDal.nno | Отсутствует (каркасный белок) |
| 29 | CrylDal_2.nno | CrylDal+A2** |
| 31 | CrylDal_3.nno | CrylDal+Y316S+A2 |
| 33 | CrylDal_4.nno | CrylDal+S374R+A2 |
| 35 | CrylDal 5.nno | CrylDal+S374R+A2 |
| 37 | CrylDal_6.nno | CrylDal+S282K_Y316S_I368P+A 2 |
| 39 | CrylDal_7.nno | CrylDal+S282V_Y316S_I368P+A 2 |
| 41 | TIC844_9.nno | TIC844+A2 |
| 43 | TlC844_11.nno | TIC844+S282V_Y316S_I368P+A2 |
** Обозначение вариантов A2 означает вставку остатка аланина в аминокислотное положении 2 по сравнению с нативной последовательностью для целей клонирования в экспрессионные векторы растений.
Пример 5. Экспрессионные кассеты для экспрессии модифицированных инсектицидных белков в растениях.
Данный пример иллюстрирует конструирование экспрессионных кассет, содержащих полинуклеотидные последовательности, сконструированные для использования в растениях, кодирующие каркасные и сконструированные инсектицидные белки.
Разнообразные растительные экспрессионные кассеты были сконструированы с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей каркасные и сконструированные инсектицидные белки, сконструированы для экспрессии в растениях, представлены в табл. 5. Такие экспрессионные кассеты могут быть использованы для временной экспрессии в протопластах растений или трансформации клеток растений. Типичные экспрессионные кассеты были сконструированы с учетом возможного размещения белка в клетке. Один набор экспрессионных кассет был разработан таким образом, чтобы обеспечить трансляцию белка и его расположение в цитозоле. Другой набор экспрессионных кассет был разработан для получения транзитного пептида, смежного с белковым токсином, для обеспечения ориентации на органеллы клетки, такие как хлоропласт или пластида. Все экспрессионные кассеты были сконструированы, чтобы начаться на 5'-конце с промотора, который может состоять из нескольких промоторных элементов, энхансерных элементов или других экспрессионных элементов, известных специалистам в данной области техники, функционально связанных, для повышения экспрессии трансгена. За промоторной последовательностью, как правило, непрерывно следует одна или более лидерная последовательность на 3'конце промотора. Интронная последовательность, как правило, расположена на 3'-конце лидерной последовательности, для улучшения экспрессии трансгена. Последовательность, кодирующая токсин или транзитный пептид, и последовательность, кодирующая токсин, как правило, расположена на 3'-конце функционально связанного промотора, лидера и интрона. Последовательность 3'-HTO, как правило, расположена, на 3'-конце кодирующей последовательности для облегчения терминации транскрипции и обеспечения последовательности, важной для полиаденилирования получаемого транскрипта. Все элементы, описанные выше, были функционально связаны между собой и расположены последовательно, часто с дополнительными последовательностями, используемыми для конструирования экспрессионной
- 19 034764 кассеты.
Пример 6. Трансформационные векторы, содержащие экспрессионную кассету каркасного или сконструированного инсектицидного белка.
Данный пример иллюстрирует включение каркасных или сконструированных инсектицидных белков в ткани растений.
Способы получения трансгенного растения, экспрессирующего сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий каркасный белок или сконструированный инсектицидный белок может быть осуществлен с использованием вариации способов, хорошо известных в данной области техники. В общем, способ включает преобразование пригодной клетки-хозяина с сегментом ДНК, который содержит промотор, функционально связанный с кодирующим участком, кодирующим один или более модифицированных инсектицидных белков или каркасных белков. Такой кодирующий участок, как правило, функционально связан с участком терминации транскрипции, причем промотор способен управлять транскрипцией кодирующего участка в клетке, и, следовательно, обеспечивает клетке способность продуцировать полипептид in vivo. Векторы, плазмиды, космиды, и сегменты ДНК, используемые в трансформации таких клеток, как правило, включают опероны гены или последовательности, полученные из генов, как нативные, так и полученные синтетически, в частности те, которые кодируют раскрытые сконструированные инсектицидные белки. Эти ДНК-конструкты могут дополнительно содержать структуры, такие как промоторы, энхансеры, полилинкеры или другие генные последовательности, которые могут регулировать деятельность конкретных искомых генов. Полученные трансгенные растения, части растений и клетки растений тестировали для определения экспрессии и биологической активности кодируемого белка.
Примеры способов, которые могут быть модифицированы для получения трансгенных растений, экспрессирующих белки, проявляющие активность в отношении чешуекрылых, включают описанные, например, белки Cry1A (патент США № 5880275), Cry1B (публикация заявки на патент США № 10/525318), Cry1C (патент США № 6033874), химеры Cry1A/F (патенты США № 7070982, 6962705 и 6713063), и белок Cry2Ab (патент США № 7064249).
Пример 7. Активность в отношении чешуекрылых сконструированного инсектицидного белка в стабильно трансформированной кукурузе.
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую сконструированными инсектицидными белками в отношении чешуекрылых-вредителей, экспрессированными растениями кукурузы и предложенными в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей.
R0 трансгенные растения кукурузы, экспрессирующие белки Cry1Da1 и Cry1Da1_7.nno были получены с использованием векторов, содержащих экспрессионные кассеты, описанные в примере 6. F1 трансгенные растения кукурузы были выращены из семян, полученных путем опыления соцветий с зародышевой плазмой коммерческих нетрансформированных растений дикого типа пыльцой от R0 трансформантов.
Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотесты с использованием дисков из листьев растений были проведены аналогично тем, которые описаны в патенте США № 8344207. Нетрансформированное растение использовали для получения ткани для негативного контроля. Оценивали множество объектов трансформации для каждого бинарного вектора, и результаты были сведены в таблицу.
Инсектицидная активность трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих белки Cry1Da1 и Cry1Da1_7.nno в поколениях F1 и R0 приведена в табл. 6, в дополнении к инсектицидной активности трансгенных растений кукурузы, экспрессирующих белки Cry1Da1 и Cry1Da1_7.nno на стадии F1 в полевых условиях. В частности, в Таблице 6 представлен профиль активности в отношении чешуекрылых для Cry1Da1_7.nno по сравнению с родительским каркасным белком Cry1Da1 при тестировании против CEW, FAW и SWC. Как видно из Таблицы б, в отличие от Cry1Da1, Cry1Da1_7.nno демонстрирует активность против обоих CEW и FAW в R0 и F1 биотестах и F1 полевых испытания.
Таблица 6. Профиль инсектицидной активности для Cry1Da1 и Cry1Da1_7.nno,
- 20 034764
Пример 8. Активность в отношении чешуекрылых у модифицированных инсектицидных белков в стабильно трансформированном хлопчатника.
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую сконструированными инсектицидными белками в отношении чешуекрылых-вредителей, экспрессированными растениями хлопчатника и предложенными в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей. Растения хлопчатника, экспрессирующие белки Cry1Da1_7.nno и TIC844_11.nno были получены с использованием векторов, содержащих экспрессионные кассеты, описанные в примере 6. Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Ткань листьев хлопчатника использовали в биотесте, описанном в примере 7, и испытывали против CBW, FAW, совки табачной (TBW, Heliothis virescens) и SBL. В табл. 7 представлена активность, наблюдаемая в отношении данных видов чешуекрылых в стабильно трансформированном поколении R0 хлопчатника. Как видно из табл. 7, Cry1Da1_7.nno и TIC844_11.nno продемонстрировали активность в отношении двух или более видов чешуекрылых-вредителей в стабильно трансформированном поколении R0 хлопчатника.
Таблица 7. Биотест профиля активности Cry1Da1_7.nno и TIC844_11.nno экспрессированных в поколении Ro хлопчатника
| Токсин | CBW | FAW | TBW | SBL |
| CrylDal_7.nno (SEQ ID NO: 40) | + | + | + | + |
| TIC844_11.nno (SEQ ID NO: 44) | + | + | - | + |
+ Активен в отношении видов насекомых; - не активен в отношении видов насекомых.
Выбранные объекты трансформации были использованы для получения R1 растений. R1 растения, экспрессирующие Cry1Da1_7.nno, анализировали на устойчивость к CBW, FAW и SBL. Ткани листа, бутона и коробочки использовали в биотестах, в дополнении к полевым испытаниям, проведенным в теплицах. В табл. 8 продемонстрирована активность, наблюдаемую в данных тестах. Как показано в табл. 8, Cry1Da1_7.nno продемонстрировал активность против CBW, FAW и SBL в биотестах и полевых испытаниях.
Таблица 8. Профиль инсектицидной активности Cry1Da1_7.nno экспрессированного
Пример 9. Активность в отношении чешуекрылых у модифицированных инсектицидных белков в стабильно трансформированной сое.
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую сконструированными инсектицидными белками в отношении чешуекрылых-вредителей, экспрессированными растениями сои и предложенными в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей. Растения сои, экспрессирующие белки Cry1Da1_7.nno, TIC844_9.nno и TIC844_11.nno были получены с использованием векторов, содержащих экспрессионные кассеты, описанные в примере 6. Ткань листа собирали и использовали в биотесте, как описано в примере 7, или, в альтернативном варианте, лиофилизированную ткань использовали в рационе насекомых для биотестов. Биотест проводили в отношении различных видов чешуекрылых, в том числе SAW, SBL и совку кукурузную (SPW, Helicoverpa zea). В табл. 9 представлена активность, наблюдаемая в отношении данных чешуекрылых-вредителей в стабильно трансформированном поколении Ro сои. Как видно из Таблицы 9, Cry1Da1_7.nno и TIC844_11.nno продемонстрировали активность в отношении SPW, SAW и SBL. TIC844_9.nno (TIC844 плюс дополнительный аланин для клонирования) не продемонстрировали активность против SPW.
Таблица 9. Биотест профиля активности Cry1Da1_7.nno, TIC844_9.nno и TIC844_11.nno экспрессированных в поколении R сои
| Токсин | SPW | SAW | SBL |
| CrylDal_7.nno (SEQ ID NO: 40) | + | + | + |
| TIC844_ll.nno (SEQ ID NO: 44) | + | + | + |
| TIC844_9.nno (SEQ ID NO: 42) | - | + | + |
+ Активен в отношении видов насекомых; - не активен в отношении видов насекомых.
- 21 034764
Выбранные объекты трансформации были использованы для получения R1 растений. R1 растения, экспрессирующие Cry1Da1_7.nno, анализировали на устойчивость к SAW, SBL, SPW и гусенице бархатных бобов (VBC, Anticarsia gemmatalis). Ткань листа собирали с растений поколения R1 и использовали в кормовом биотесте. В табл. 10 продемонстрирована активность, наблюдаемую в данных тестах. Как показано в табл. 10, Cry1Da1_7.nno продемонстрировал активность в отношении SPW, SAW и SBL.
Таблица 10. Биотест профиля активности Cry1Da1_7.nno, экспрессированного в поколении R1 сои
| Токсин | SPW | SAW | SBL | VBC |
| CrylDal 7.nno (SEQ ID NO: 40) | + | + | + | - |
+Активен в отношении видов насекомых; - не активен в отношении видов насекомых.
В табл. 11 представлены результаты полевых испытаний, проведенных в теплицах на стабильно трансформированных растениях сои поколения R1, экспрессирующих Cry1Da1_7.nno. Виды, использованные для заражения растений в теплицах, включают совку черную (BLAW, Spodoptera cosmioides), моль фасолевую (BSM, Crocidosema aporema), совку южноамериканскую (SAPW, Helicoverpa gelotopoeon), пяденицу подсолнечниковую (SFL, Rachiplusia пи) и VBC. В Таблице 11 продемонстрирована активность, наблюдаемую в данных тестах. Как показано в табл. 11, Cry1Da1_7.nno продемонстрировал активность в отношении BLAW, SAPW и SFL.
Таблица 11. Профиль активности Cry1Da1_7.nno, экспрессированного в поколении R1 сои, протестированный в полевых испытаниях в теплице
| Токсин | BLAW | BSM | SAPW | SFL | VBC |
| CrylDal_7.nno (SEQ ID NO: 40) | + | - | + | + | - |
+ Активен в отношении видов насекомых; - не активен в отношении видов насекомых.
Все композиции и способы, описанные и заявленные в настоящем документе, могут быть проведены и осуществлены без излишних экспериментов в свете настоящего описания. Хотя композиции настоящего изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты, изменения, модификации и перестройки могут быть применены к композиции, описанной в настоящем документе, без отступления от концепции, сущности и объема настоящего изобретения. Более конкретно будет очевидно, что определенные агенты, которые схожи и химически, и физиологически, могут быть использованы вместо агентов, описанных в настоящем документе, достигая тех же или подобных результатов. Все такие аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Claims (15)
1. Сконструированный инсектицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, отличающийся тем, что сконструированный инсектицидный белок проявляет ингибирующую активность против насекомых отряда Lepidoptera.
2. Сконструированный инсектицидный белок по п.1, отличающийся тем, что указанные насекомые отряда Lepidoptera выбраны из родов Spodoptera и Helicoverpa.
3. Сконструированный инсектицидный белок по п.2, в котором указанные насекомые родов Spodoptera и Helicoverpa выбраны из Spodoptera frugiperda и Helicoverpa zea.
4. Полинуклеотид, кодирующий сконструированный инсе'ктицидный белок по п.1, функционально связанный с гетерологичным промотором.
5. Полинуклеотид, кодирующий сконструированный инсе'ктицидный белок по п.1, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 39.
6. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.5, выбранная из группы, состоящей из бактериальной клетки-хозяина и растительной клетки-хозяина.
7. Клетка-хозяин по п.6, отличающаяся тем, что выбрана из группы, состоящей из Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Brevibacillus, Escherichia, Pseudomonas, Klebsiella, и Erwinia.
8. Клетка-хозяин по п.6, отличающаяся тем, что растительная клетка-хозяин получена из растения, выбранного из группы, состоящей из однодольных и двудольных растений.
9. Композиция, содержащая сконструированную инсектицидный белок по п.1, проявляющая ингибирующую активность против насекомых отряда Lepidoptera.
10. Композиция по п.9, дополнительно содержащая по меньшей мере один другой агент, обладающий инсектицидной активностью, отличный от сконструированного инсектицидного белка по п.1, выбранный из группы, состоящей из инсектицидного белка, и молекулы дцРНК, обладающей инсектицидной активностью.
11. Композиция по п.10, отличающаяся тем, что по меньшей мере один другой агент, обладающий
- 22 034764 инсектицидной активностью, проявляет активность в отношении одного или более насекомых отрядов
Lepidoptera, Coleoptera, Hemiptera, Homoptera или Thysanoptera.
12. Семя, содержащее эффективное количество:
a) сконструированного инсектицидного белка по п. 1 или
b) полинуклеотида по п.4.
13. Способ борьбы с насекомыми отряда Lepidoptera, включающий приведение в контакт указанных насеомых с эффективным количеством сконструированного инсектицидного белка по п.1.
14. Трансгенное растение или часть растения, содержащие сконструированный инсектицидный белок по п.1.
15. Способ получения семени, содержащего полинуклеотид, кодирующий сконструированный инсектицидный белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, включающий:
a) получение по меньшей мере одного семени от трансгенного растения по п.14;
b) посадку по меньшей мере одного семени, содержащего сконструированный инсектицидный белок по п.1;
c) выращивание растений из указанных семян и
d) сбор семени от указанных растений, причем указанное собранное семя содержит указанный по- линуклеотид.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462064994P | 2014-10-16 | 2014-10-16 | |
| US201462065017P | 2014-10-17 | 2014-10-17 | |
| PCT/US2015/055779 WO2016061377A2 (en) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | Lepidopteran-active cry1da1 amino acid sequence variant proteins |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201790842A1 EA201790842A1 (ru) | 2017-08-31 |
| EA034764B1 true EA034764B1 (ru) | 2020-03-18 |
| EA034764B9 EA034764B9 (ru) | 2020-05-21 |
Family
ID=54477236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201790842A EA034764B9 (ru) | 2014-10-16 | 2015-10-15 | БЕЛКИ Cry1Da1 С ВАРИАНТАМИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US10059959B2 (ru) |
| EP (2) | EP3207144B1 (ru) |
| JP (1) | JP6648127B2 (ru) |
| KR (1) | KR102127552B1 (ru) |
| CN (2) | CN106852147B (ru) |
| AR (1) | AR102301A1 (ru) |
| AU (2) | AU2015332370B2 (ru) |
| BR (1) | BR122020005237B1 (ru) |
| CA (1) | CA2963702A1 (ru) |
| CL (2) | CL2017000896A1 (ru) |
| CO (1) | CO2017004808A2 (ru) |
| CR (1) | CR20170197A (ru) |
| CU (1) | CU24405B1 (ru) |
| EA (1) | EA034764B9 (ru) |
| EC (1) | ECSP17029287A (ru) |
| ES (1) | ES2739948T3 (ru) |
| IL (1) | IL251571B (ru) |
| MX (1) | MX2017004914A (ru) |
| MY (1) | MY189597A (ru) |
| NI (1) | NI201700043A (ru) |
| NZ (1) | NZ730634A (ru) |
| PE (2) | PE20170942A1 (ru) |
| PH (2) | PH12017500696A1 (ru) |
| SG (2) | SG11201702748TA (ru) |
| SV (1) | SV2017005421A (ru) |
| UA (1) | UA123036C2 (ru) |
| UY (1) | UY36362A (ru) |
| WO (1) | WO2016061377A2 (ru) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201542093A (zh) | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
| CA3222614A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-29 | AgBiome, Inc. | Pesticidal genes and methods of use |
| EP3550961A4 (en) * | 2016-12-12 | 2020-11-04 | Syngenta Participations AG | ENGINEERED PROTEIN PESTICIDES AND METHODS FOR CONTROLLING PLANT PESTS |
| BR102018009263A8 (pt) * | 2018-05-07 | 2023-01-31 | Embrapa Pesquisa Agropecuaria | Molécula de ácido nucleico cry1da códon-otimizada, construção de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, célula vegetal, planta transgênica, método para transformar uma célula, método para produzir uma planta transgênica, método de controle de pragas invertebradas de plantas de cultivo e usos da molécula de ácido nucleico |
| JP2021532744A (ja) * | 2018-07-30 | 2021-12-02 | モンサント テクノロジー エルエルシー | トウモロコシの遺伝子組み換え事象ｍｏｎ９５３７９ならびにその検出及び使用方法 |
| CN109917032B (zh) * | 2019-03-13 | 2021-08-24 | 杭州老爸评测科技有限公司 | 一种转Bt蛋白食品中Bt蛋白的定量检测方法 |
| BR102019023319A2 (pt) * | 2019-11-06 | 2021-05-18 | Embrapa-Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuaria | molécula de ácido nucléico do evento transgênico de milho me240913 expressando a proteína cry1da, célula, planta e semente transgênica, usos das mesmas, produto de planta, método, kit e amplicon para detecção do evento, e métodos para produzir uma planta transgênica e de controle de insetos-pragas lepidópteros |
| CA3206159A1 (en) | 2020-12-21 | 2022-06-30 | Monsanto Technology Llc | Novel insect inhibitory proteins |
| UY39585A (es) | 2020-12-23 | 2022-07-29 | Monsanto Technology Llc | Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas |
| US11673922B2 (en) | 2020-12-31 | 2023-06-13 | Monsanto Technology Llc | Insect inhibitory proteins |
| CN113913457B (zh) * | 2021-10-29 | 2023-09-19 | 隆平生物技术(海南)有限公司 | 一种抑制或杀灭桃蛀螟的方法及其应用 |
| CN114766435B (zh) * | 2022-04-27 | 2023-05-09 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 以谷物种子的水培苗盘人工饲养草地贪夜蛾幼虫的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0358557A2 (en) * | 1988-09-06 | 1990-03-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants transformed with a DNA sequence from bacillus thuringiensis lethal to lepidoptera |
| US20050155103A1 (en) * | 1996-11-27 | 2005-07-14 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants expressing lepidopteran-active delta-endotoxins |
| WO2011041256A2 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| WO2014055881A1 (en) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects |
Family Cites Families (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2164633T3 (es) | 1989-02-24 | 2002-03-01 | Monsanto Technology Llc | Genes vegetales sinteticos y procedimiento para su preparacion. |
| EP0400246A1 (en) * | 1989-05-31 | 1990-12-05 | Plant Genetic Systems, N.V. | Prevention of Bt resistance development |
| US5188960A (en) * | 1989-06-27 | 1993-02-23 | Mycogen Corporation | Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins |
| UA48104C2 (ru) | 1991-10-04 | 2002-08-15 | Новартіс Аг | Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя |
| US6713063B1 (en) | 1996-11-20 | 2004-03-30 | Monsanto Technology, Llc | Broad-spectrum δ-endotoxins |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US6023013A (en) * | 1997-12-18 | 2000-02-08 | Monsanto Company | Insect-resistant transgenic plants |
| BR9910174A (pt) * | 1998-05-01 | 2001-03-06 | Maxygen Inc | Processo para se obter um gene recombinante otimizado de resistência à praga, biblioteca, e, processo para se obter um organismo que seja patogênico a uma praga de vegetal |
| US6489542B1 (en) | 1998-11-04 | 2002-12-03 | Monsanto Technology Llc | Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids |
| US6501009B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-12-31 | Monsanto Technology Llc | Expression of Cry3B insecticidal protein in plants |
| WO2001019859A2 (en) * | 1999-09-15 | 2001-03-22 | Monsanto Technology Llc | LEPIDOPTERAN-ACTIVE BACILLUS THURINGIENSIS δ-ENDOTOXIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
| WO2001045122A1 (en) | 1999-12-15 | 2001-06-21 | Strategic Diagnostics, Inc. | Reagents, methods and kits for detecting bacillus thuringiensis proteins |
| JP2004506432A (ja) | 2000-08-25 | 2004-03-04 | シンジェンタ・パティシペーションズ・アクチェンゲゼルシャフト | Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫性結晶タンパク質由来の新規殺虫性毒素 |
| AR035215A1 (es) | 2000-11-20 | 2004-05-05 | Monsanto Technology Llc | Polinucleotido aislado, primer y segundo polinucleotido cebador, metodo para detectar el suceso vegetal de algodon 531, molecula de polinucleotido aislado obtenida por dicho metodo, equipo de deteccion de acido nucleico y metodo para determinar la cigosidad del genoma de una planta de algodon. |
| AU2002322499A1 (en) | 2001-01-26 | 2002-12-03 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Transgenic plants protected against parasitic plants |
| EG26529A (en) | 2001-06-11 | 2014-01-27 | مونسانتو تكنولوجى ل ل سى | Prefixes for detection of DNA molecule in cotton plant MON15985 which gives resistance to damage caused by insect of squamous lepidoptera |
| US6868634B2 (en) | 2001-10-04 | 2005-03-22 | Mississippi State University | Insect resistance management in agricultural applications |
| US20060112447A1 (en) | 2002-08-29 | 2006-05-25 | Bogdanova Natalia N | Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants |
| CA2562022C (en) | 2004-04-09 | 2016-01-26 | Monsanto Technology Llc | Compositions and methods for control of insect infestations in plants |
| WO2006012366A2 (en) * | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Phyllom Llc | Methods for making and using recombinant bacillus thuringiensis spores |
| CA2601857A1 (en) | 2005-04-01 | 2006-10-12 | Nadine Carozzi | Axmi-027, axmi-036 and axmi-038, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use |
| NZ566028A (en) | 2005-08-31 | 2011-09-30 | Monsanto Technology Llc | Nucleotide sequences encoding insecticidal proteins |
| US7521235B2 (en) | 2006-07-21 | 2009-04-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Unique novel Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity |
| US8148077B2 (en) | 2006-07-21 | 2012-04-03 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Method for identifying novel genes |
| CA2672036C (en) | 2006-12-08 | 2015-10-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis crystal polypeptides, polynucleotides, and compositions thereof |
| ES2601577T3 (es) | 2007-03-28 | 2017-02-15 | Syngenta Participations Ag | Proteínas insecticidas |
| US8609936B2 (en) | 2007-04-27 | 2013-12-17 | Monsanto Technology Llc | Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis |
| US7772465B2 (en) | 2007-06-26 | 2010-08-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| US8283524B2 (en) | 2008-05-15 | 2012-10-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| CN102076858B (zh) | 2008-06-11 | 2013-10-30 | 先锋国际良种公司 | 具有鳞翅目活性的新的苏云金芽孢杆菌基因 |
| EA020327B1 (ru) | 2008-06-25 | 2014-10-30 | Атеникс Корпорейшн | Гены токсинов и способы их применения |
| EA035103B1 (ru) | 2008-07-02 | 2020-04-28 | Атеникс Корпорейшн | Инсектицидный полипептид axmi-115 дельта-эндотоксина и его применение |
| US8445749B2 (en) | 2008-09-19 | 2013-05-21 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| US20100077507A1 (en) | 2008-09-22 | 2010-03-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity |
| EP2361307B1 (en) | 2008-12-22 | 2014-09-24 | Athenix Corporation | Pesticidal genes from Brevibacillus and methods for their use |
| CA2747826A1 (en) | 2008-12-23 | 2010-07-01 | Athenix Corporation | Axmi-150 delta-endotoxin gene and methods for its use |
| US8692065B2 (en) | 2009-01-23 | 2014-04-08 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| AR075371A1 (es) | 2009-02-05 | 2011-03-30 | Athenix Corp | Genes de delta endotoxina variante axmi-r1 y metodos de uso de los mismos |
| US8318900B2 (en) | 2009-02-27 | 2012-11-27 | Athenix Corp. | Pesticidal proteins and methods for their use |
| WO2010141141A2 (en) | 2009-03-11 | 2010-12-09 | Athenix Corporation | Axmi-001, axmi-002, axmi-030, axmi-035, and axmi-045: toxin genes and methods for their use |
| CN102459315B (zh) | 2009-04-17 | 2016-03-02 | 陶氏益农公司 | Dig-3杀虫cry毒素 |
| JP2012529911A (ja) | 2009-06-16 | 2012-11-29 | ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー | Ｄｉｇ−１０殺虫性ｃｒｙ毒素 |
| WO2010147880A2 (en) | 2009-06-16 | 2010-12-23 | Dow Agrosciences Llc | Dig-11 insecticidal cry toxins |
| AU2010260302A1 (en) | 2009-06-16 | 2011-12-15 | Dow Agrosciences Llc | DIG-5 insecticidal Cry toxins |
| US8461415B2 (en) | 2009-07-31 | 2013-06-11 | Athenix Corp. | AXMI-192 family of pesticidal genes and methods for their use |
| US8772577B2 (en) | 2009-11-12 | 2014-07-08 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| KR101854478B1 (ko) * | 2009-12-16 | 2018-05-03 | 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 | 변형 ＣＲＹ１Ｃａ 살곤충 ＣＲＹ 단백질 |
| WO2011084324A2 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| BR122019005253A8 (pt) | 2010-02-18 | 2022-07-05 | Athenix Corp | Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo recombinante com atividade pesticida, composição, bem como métodos para o controle de uma população de pragas para matar uma praga, para a produção de um polipeptídeo com atividade pesticida, para a proteção de uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta |
| AU2011218130B2 (en) | 2010-02-18 | 2016-03-03 | Athenix Corp. | AXMI218, AXMI219, AXMI220, AXMI226, AXMI227, AXMI228, AXMI229, AXMI230, and AXMI231 delta-endotoxin genes and methods for their use |
| WO2012024200A2 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Novel bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| BR112013015515A2 (pt) | 2010-12-28 | 2018-04-24 | Pioneer Hi Bred Int | molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada da planta, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga de lepidóptero, método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de dna, método para proteger uma planta contra uma praga |
| CN103328637B (zh) | 2011-01-24 | 2016-01-27 | 先锋国际良种公司 | 具有抗鳞翅目昆虫活性的新型苏云金芽孢杆菌基因 |
| CA2826229A1 (en) | 2011-02-11 | 2012-08-16 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Synthetic insecticidal proteins active against corn rootworm |
| US8878007B2 (en) | 2011-03-10 | 2014-11-04 | Pioneer Hi Bred International Inc | Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity |
| EP2794887A2 (en) * | 2011-03-30 | 2014-10-29 | Universidad Nacional Autonoma De Mexico | Mutant bacillus thuringiensis cry genes and methods of use |
| US9321814B2 (en) | 2011-03-30 | 2016-04-26 | Athenix Corp. | AXMI238 toxin gene and methods for its use |
| GB201105418D0 (en) | 2011-03-31 | 2011-05-18 | Univ Durham | Pesticide |
| MX346662B (es) | 2011-04-07 | 2017-03-27 | Monsanto Technology Llc | Familia de toxinas inhibidoras de insectos activas contra insectos hemipteros y lepidopteros. |
| UY34227A (es) | 2011-07-28 | 2013-02-28 | Athenix Corp | Acido nucleico recombinante que codifica el gen de la toxina axmi270, vectores, células, plantas y sus métodos de empleo |
| ES2647596T3 (es) | 2011-07-28 | 2017-12-22 | Athenix Corp. | Variantes de proteínas AXMI205 y métodos para su uso |
| UA122657C2 (uk) | 2011-07-29 | 2020-12-28 | Атенікс Корп. | Ген пестициду axmi279 та спосіб його застосування |
| CA2866241C (en) | 2012-03-08 | 2021-03-16 | Athenix Corp. | Axmi345 delta-endotoxin gene and methods for its use |
| CA2868815C (en) | 2012-04-06 | 2017-10-24 | Monsanto Technology Llc | Proteins toxic to hemipteran insect species |
| US9688730B2 (en) | 2012-07-02 | 2017-06-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| US9475847B2 (en) | 2012-07-26 | 2016-10-25 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Insecticidal proteins and methods for their use |
| AR092971A1 (es) | 2012-10-26 | 2015-05-06 | Lilly Co Eli | Inhibidores de agrecanasa |
| TW201542093A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-11-16 | 艾格里遺傳學股份有限公司 | 用於控制玉米穗蟲之Ｃｒｙ１Ｄ |
-
2015
- 2015-10-15 JP JP2017520327A patent/JP6648127B2/ja active Active
- 2015-10-15 EA EA201790842A patent/EA034764B9/ru not_active IP Right Cessation
- 2015-10-15 CN CN201580055966.8A patent/CN106852147B/zh active Active
- 2015-10-15 MX MX2017004914A patent/MX2017004914A/es unknown
- 2015-10-15 WO PCT/US2015/055779 patent/WO2016061377A2/en active Application Filing
- 2015-10-15 AU AU2015332370A patent/AU2015332370B2/en active Active
- 2015-10-15 PE PE2017000712A patent/PE20170942A1/es unknown
- 2015-10-15 UA UAA201909488A patent/UA123036C2/uk unknown
- 2015-10-15 SG SG11201702748TA patent/SG11201702748TA/en unknown
- 2015-10-15 SG SG10201911581WA patent/SG10201911581WA/en unknown
- 2015-10-15 CR CR20170197A patent/CR20170197A/es unknown
- 2015-10-15 BR BR122020005237-6A patent/BR122020005237B1/pt active IP Right Grant
- 2015-10-15 NZ NZ730634A patent/NZ730634A/en unknown
- 2015-10-15 PE PE2021001320A patent/PE20220960A1/es unknown
- 2015-10-15 EP EP15791074.6A patent/EP3207144B1/en active Active
- 2015-10-15 CU CU2017000048A patent/CU24405B1/es unknown
- 2015-10-15 EP EP19160017.0A patent/EP3517616A1/en not_active Withdrawn
- 2015-10-15 KR KR1020177013030A patent/KR102127552B1/ko active IP Right Grant
- 2015-10-15 ES ES15791074T patent/ES2739948T3/es active Active
- 2015-10-15 MY MYPI2017701292A patent/MY189597A/en unknown
- 2015-10-15 US US14/884,432 patent/US10059959B2/en active Active
- 2015-10-15 CA CA2963702A patent/CA2963702A1/en active Pending
- 2015-10-15 CN CN202011075400.0A patent/CN112175052B/zh active Active
- 2015-10-16 UY UY0001036362A patent/UY36362A/es active IP Right Grant
- 2015-10-16 AR ARP150103362A patent/AR102301A1/es unknown
-
2017
- 2017-04-05 IL IL251571A patent/IL251571B/en active IP Right Grant
- 2017-04-07 NI NI201700043A patent/NI201700043A/es unknown
- 2017-04-07 SV SV2017005421A patent/SV2017005421A/es unknown
- 2017-04-11 PH PH12017500696A patent/PH12017500696A1/en unknown
- 2017-04-11 CL CL2017000896A patent/CL2017000896A1/es unknown
- 2017-05-12 CO CONC2017/0004808A patent/CO2017004808A2/es unknown
- 2017-05-12 EC ECIEPI201729287A patent/ECSP17029287A/es unknown
- 2017-12-07 US US15/835,346 patent/US10287605B2/en active Active
-
2018
- 2018-07-27 US US16/047,187 patent/US10457958B2/en active Active
-
2019
- 2019-06-05 CL CL2019001541A patent/CL2019001541A1/es unknown
- 2019-08-19 AU AU2019219724A patent/AU2019219724B2/en active Active
- 2019-09-17 US US16/573,538 patent/US10801037B2/en active Active
- 2019-12-20 PH PH12019502912A patent/PH12019502912A1/en unknown
-
2020
- 2020-09-22 US US17/028,518 patent/US11396661B2/en active Active
-
2022
- 2022-07-26 US US17/815,122 patent/US11905519B2/en active Active
-
2024
- 2024-01-04 US US18/404,247 patent/US20240247280A1/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0358557A2 (en) * | 1988-09-06 | 1990-03-14 | Plant Genetic Systems, N.V. | Plants transformed with a DNA sequence from bacillus thuringiensis lethal to lepidoptera |
| US20050155103A1 (en) * | 1996-11-27 | 2005-07-14 | Monsanto Technology Llc | Transgenic plants expressing lepidopteran-active delta-endotoxins |
| WO2011041256A2 (en) * | 2009-10-02 | 2011-04-07 | Syngenta Participations Ag | Insecticidal proteins |
| WO2014055881A1 (en) * | 2012-10-05 | 2014-04-10 | Dow Agrosciences Llc | Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| CRICKMORE N ET AL: "Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins.", MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY REVIEWS, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 62., no. 03., 1 September 1998 (1998-09-01), US, pages 807 - 813., XP002132141, ISSN: 1092-2172 * |
| F. RAJAMOHAN, O. ALZATE, J. A. COTRILL, A. CURTISS, D. H. DEAN: "Protein engineering of Bacillus thuringiensis �-endotoxin: Mutations at domain II of CryIAb enhance receptor affinity and toxicity toward gypsy moth larvae", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 93, no. 25, 10 December 1996 (1996-12-10), pages 14338 - 14343, XP055278189, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.93.25.14338 * |
| H H�FTE, SOETAERT PIET, JANSENS STEFAN, PEFEROEN MARNIX,: "Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of new Lepidoptera-specific crystal protein gene from Bacillus thuringiensis", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, INFORMATION RETRIEVAL LTD., vol. 18, no. 18, 25 September 1990 (1990-09-25), pages 5545 - 5545, XP055238596, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/18.18.5545 * |
| HOFTE H., WHITELEY H. R.: "INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEINS OF BACILLUS THURINGIENSIS.", MICROBIOLOGICAL REVIEWS, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, WASHINGTON, DC, US, vol. 53., 1 June 1989 (1989-06-01), US, pages 242 - 255., XP000374163, ISSN: 0146-0749 * |
| KIM, Y.S. ; ROH, J.Y. ; KANG, J.N. ; WANG, Y. ; SHIM, H.J. ; LI, M.S. ; CHOI, J.Y. ; JE, Y.H.: "Mutagenesis of Bacillus thuringiensiscry1Ac gene and its insecticidal activity against Plutella xylostella and Ostrinia furnacalis", BIOLOGICAL CONTROL, SAN DIEGO, CA, US, vol. 47, no. 2, 1 November 2008 (2008-11-01), US, pages 222 - 227, XP025480667, ISSN: 1049-9644, DOI: 10.1016/j.biocontrol.2008.07.011 * |
| PARDO-LOPEZ, L. ; MUNOZ-GARAY, C. ; PORTA, H. ; RODRIGUEZ-ALMAZAN, C. ; SOBERON, M. ; BRAVO, A.: "Strategies to improve the insecticidal activity of Cry toxins from Bacillus thuringiensis", PEPTIDES, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 30, no. 3, 1 March 2009 (2009-03-01), AMSTERDAM, NL, pages 589 - 595, XP025991581, ISSN: 0196-9781, DOI: 10.1016/j.peptides.2008.07.027 * |
| SARASWATHY NACHIMUTHU, KUMAR P A: "Protein engineering of delta-endotoxins of Bacillus thuringiensis", EJB ELECTRONIC JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, CONICYT, SANTIAGO, CL, vol. 7, no. 2, 15 August 2004 (2004-08-15), CL, pages 178 - 188, XP002681430, ISSN: 0717-3458 * |
| WAGNER LUCENA, PATR�CIA PELEGRINI, DIOGO MARTINS-DE-SA, FERNANDO FONSECA, JOSE GOMES, LEONARDO DE MACEDO, MARIA DA SILVA, RAQUEL S: "Molecular Approaches to Improve the Insecticidal Activity of Bacillus thuringiensis Cry Toxins", TOXINS, vol. 6, no. 8, pages 2393 - 2423, XP055238443, DOI: 10.3390/toxins6082393 * |
| YU REN, LIU HUAMEI; SONG FUPING; HUANG DAFANG; ZHANG JIE: "Effect of Cry1Ca7 protein modified by site-directed mutagenesis on inhibiting Spodoptera exigua Hubner", ACTA MICROBIOLOGICA SINICA - WEISHENGWU XUEBAO, vol. 48, no. 6, 4 June 2008 (2008-06-04), pages 733 - 738, XP055238869 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11905519B2 (en) | Lepidopteran-active Cry1Da1 amino acid sequence variant proteins | |
| US11198888B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
| EA037469B1 (ru) | Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым | |
| US11920145B2 (en) | Insect inhibitory proteins | |
| EP3328187B1 (en) | Novel insect inhibitory proteins | |
| EA040283B1 (ru) | БЕЛКИ Cry1Da1 С ВАРИАНТАМИ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ | |
| BR112017007735B1 (pt) | Cassetes de expressão, proteína inseticida projetada, célula hospedeira, composição inibidora de insetos, bem como métodos para controlar uma praga de lepidópteros | |
| EA040497B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей | |
| EA040152B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей | |
| EA040101B1 (ru) | Новые химерные инсектицидные белки, токсичные или ингибиторные в отношении чешуекрылых-вредителей |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TH4A | Publication of the corrected specification to eurasian patent | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |