TWI841526B

TWI841526B - 抗-SIRPα 抗體

Info

Publication number: TWI841526B
Application number: TW107112801A
Authority: TW
Inventors: 伊寧那姆漢斯凡; 伊爾薩斯安卓凡; 艾瑞克沃茲; 大衛路特傑休爾西克; 保羅維克
Original assignee: 荷蘭商賽羅帕公司
Priority date: 2017-04-13
Filing date: 2018-04-13
Publication date: 2024-05-11
Also published as: US20180312587A1; US10851164B2; CN110650976A; JP2020516300A; US20220135677A1; TW201841943A; CN110650976B; US20220135671A1; KR102702926B1; SG11201908813QA; KR20190140454A; WO2018190719A2; KR20240135066A; MX2023014569A; CN118267470A; MX2019012233A; AU2018252546A1; IL269405A; JP2022191386A; JP7160833B2

Abstract

本發明係關於抗-SIRPα抗體，以及此等抗體治療諸如癌症及傳染病之疾病的用途。

Description

抗-SIRPα 抗體

本發明係關於抗-SIRPα抗體，以及此等抗體治療疾病之用途。

信號調節蛋白α(signal regulatory protein alpha，SIRPα)係來自SIRP家族之膜糖蛋白。SIRP家族之成員共用某些常見結構基元(motif)。此等結構基元包括跨膜區段及含有三個藉由三對二硫鍵連接之Ig樣環的N端細胞外域。然而在SIRP家族成員之間，C端細胞內域不同。SIRPα具有延長的細胞內域，其含有四個酪胺酸殘基，形成兩個基於免疫受體酪胺酸之抑制基元(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，而SIRPβ1含有離胺酸殘基於跨膜域中，其後為短細胞內尾端(intracellular tail)，不含ITIM，充當DAP12之受體。已鑑別八種SIRPα單核苷酸多形現象，其中最普遍的係SIRPαV1及SIRPαV2(Takenaka等人，Nat.Immunol.2007,8：1313-23)。

「吃我(eat-me)」信號(亦即「改變自己(altered self)」)係專門由凋亡細胞而非健康細胞產生且在凋亡細胞而非健康細胞之表面上呈遞之細胞外選手，且對於藉由活化吞噬受體及後續信號傳導級聯起始吞噬作用至關重要。為了在凋亡細胞上呈遞，吃我信號需要細胞外移行(trafficking)。一個特定類別之吃我信號由膜錨定蛋白提供，諸如磷脂醯絲胺酸 (phosphatidylserine，PtdSer)及鈣網蛋白(calreticulin，CRT)。外翻的(Externalized)PtdSer與其在吞噬細胞上之受體結合以促進凋亡細胞之清除(此過程稱為胞葬作用(efferocytosis))。類似地，CRT在凋亡細胞之表面上上調且與吞噬細胞上之LDL受體相關蛋白1(LDL-receptor-related protein 1，LRP1)結合，由此介導吞噬作用(engulfment)。

SIRPα廣泛地表現於吞噬細胞(例如巨噬細胞、粒細胞及樹突狀細胞)上且經由其與跨膜蛋白CD47之相互作用充當抑制性受體。此相互作用介導稱為「別吃我(don't eat me)」信號之反應。此相互作用負調節先天性免疫細胞之效應功能，諸如宿主細胞吞噬作用。因為CD47常常存在於腫瘤細胞上，所以認為此「別吃我」信號有助於阻止腫瘤之吞噬細胞依賴性清除。儘管SIRPα與SIRPβ1之細胞外域存在相似性，但是在SIRP家族成員之間仍然存在功能差異。舉例而言，SIRPβ1不以可偵測之水準結合CD47且因此不介導「別吃我」信號。SIRPβ1反而參與骨髓細胞之活化。

據報導，破壞CD47-SIRPα信號傳導(例如藉由拮抗與CD47或SIRPα結合之單株抗體)造成實體腫瘤細胞及造血腫瘤細胞之增強的吞噬作用，包括神經膠母細胞瘤細胞之增加的活體外吞噬作用及顯著的活體內抗腫瘤活性。

在第一態樣中，本發明提供抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包含下文所指定之結構及功能特徵。

在各種實施例中，本發明提供一種與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含(i)、(ii)及(iii)中之一者、兩者或所有三者：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。

在各種其他實施例中，本發明提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含(i)、(ii)及(iii)中之一者、兩者或所有三者：(i)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3。

在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含一重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：75或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：78或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：82或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列， SEQ ID NO：84或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：86或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：88或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：102或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：7或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：10或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：12或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：14或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：16或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：18或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：30或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列。

在各種實施例中，本發明亦提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含(i)、(ii)及(iii)中之一者、兩者或所有三者：(i)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在各種其他實施例中，本發明亦提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含(i)、(ii)及(iii)中之一者、兩者或所有三者：(i)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段包含一輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：76或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：90或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：92或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列， SEQ ID NO：94或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：96或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：98或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：100或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：104或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：8或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：22或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：24或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：26或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：28或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：32或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列。

在各種實施例中，本發明提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；及(iv)包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在各種其他實施例中，本發明提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：(i)包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1；(ii)包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2；及/或(iii)包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3；及(iv)包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1；(v)包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2；及/或(vi)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：74相差1、2、3個或更多個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

在其他實施例中，本發明提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：7或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：10或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：12或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：14或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：16或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：18或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及 SEQ ID NO：30或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：8或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：22或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：24或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：26或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：28或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：32或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列。

在其他實施例中，本發明提供與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其包含：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列， SEQ ID NO：78或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：82或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：84或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：86或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：88或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：102或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：90或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：92或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：94或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：96或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：98或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：100或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：104或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。

在此上下文中，「序列相似性」係基於結合保守變化程度之一致性程度。「序列相似性」之百分比係相同的或保守改變的胺基酸或核苷酸之百分比，即「序列相似性」=(序列一致性百分比)+(保守變化之百分比)。因此，出於本發明的目的，認為「保守變化」及「一致性」係較廣泛的術語「相似性」之物種。因此，每當使用術語序列「相似性」時，該術語涵蓋序列「一致性」及「保守變化」。根據某些實施例，忽略保守變化且序列相似性百分比係指序列一致性百分比。在某些實施例中，所提及之序列一致性百分比所允許的序列變化全部或幾乎全部是保守變化；亦即，當序列係90%相同時，剩餘10%全部或幾乎全部是保守變化。術語「幾乎全部」在此情況下係指所允許之序列變化的至少75%係保守變化，更佳至少85%、再更佳至少90%且最佳至少95%。在抗體重鏈及/或輕鏈之某些實施例中，所允許之序列變化係在構架區內，而不是在CDR中。

該抗體較佳具有根據SEQ ID NO：7之重鏈。該抗體更佳具有根據SEQ ID NO：8之輕鏈。更佳地，重鏈係選自SEQ ID NO：10、12、14、 16、18或30中之任一者。更佳地，輕鏈係選自SEQ ID NO：20、22、24、26、28或32中之任一者。

或者，該抗體具有根據SEQ ID NO：75之重鏈。該抗體更佳具有根據SEQ ID NO：76之輕鏈。更佳地，重鏈係選自SEQ ID NO：78、80、82、84、86、88或102中之任一者。更佳地，輕鏈係選自SEQ ID NO：90、92、94、96、98、100或104中之任一者。

在以上實施例中之任一者中，抗體或其抗原結合片段可以分離，彼術語在本文中進行定義。

在以上實施例中之任一者中，抗體或其抗原結合片段係重組抗體，彼術語在本文中進行定義。

在以上實施例中之任一者中，抗體或其抗原結合片段係全長抗體，彼術語在本文中進行定義。

本發明之抗體或抗原結合片段可以從多種物種獲得。舉例而言，本發明之抗體可以包含免疫球蛋白序列，其為兔、小鼠、大鼠、天竺鼠(guinea pig)、雞、山羊、綿羊、驢、人類、駱馬或駱駝科序列或該等序列之組合(所謂的嵌合抗體)。最佳地，抗體或抗原結合片段係人類或人類化抗體或抗原結合片段。

術語抗體包括抗原結合部分，亦即保留結合抗原之能力的「抗原結合位點」(例如片段、子序列、互補決定區(complementarity determining region，CDR))，包括(i)Fab片段，一種由V_L、V_H、C_L及C_Hl域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由V_H及C_Hl域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂之V_L及V_H域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。提及術語「抗體」時亦包括單鏈抗體。較佳的治療性抗體係完整IgG抗體。如本文中所用之術語「完整IgG」意謂屬於基本上由所識別之免疫球蛋白γ基因編碼之抗體類別的多肽。在人類中，此類別包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在小鼠中，此類別包含IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3。抗體之IgG類別中之已知Ig域係V_H、Cγ1、Cγ2、Cγ3、V_L及C_L。

在以上實施例中之任一者中，抗體或其抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類或人類化抗體。在一個實施例中，抗體係IgG。在較佳實施例中，抗體係IgG1、IgG2或IgG4，且較佳係人類IgG1、IgG2或IgG4。

在上文所提及之實施例中之任一者中，本發明之抗體或其抗原結合片段可以包含上文所述之輕鏈可變區及人類κ或λ輕鏈恆定域及IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定域中之任一者。可以根據本發明使用的例示性輕鏈(κ)及重鏈(IgG2及IgG4)恆定區序列列舉於SEQ ID NO：63、65、67(各自為核苷酸序列)、64、66及68(各自為多肽序列)中。

僅舉例而言，在各種實施例中，該抗體或其抗原結合片段包含以下重鏈序列/輕鏈可變區序列組合中之一者：

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L1)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L2)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L3)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L4)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L5)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L1)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L2)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L3)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L4)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L5)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L1)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L2)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L3)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L4)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L5)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L1)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L2)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L3)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L4)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L5)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L1)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L2)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L3)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L4)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L5)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L1)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L2)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L3)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L4)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L5)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L6)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L1)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L2)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L3)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L4)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L5)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L6)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L1)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L2)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L3)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L4)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L5)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L6)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L1)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L2)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L3)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L4)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L5)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L6)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L1)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L2)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L3)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L4)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L5)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L6)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L1)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L2)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L3)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L4)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L5)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L6)

或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同。

在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：10且各輕鏈包含SEQ ID NO：20，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在其他較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：16且各輕鏈包含SEQ ID NO：28，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在再其他較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：18且各輕鏈包含SEQ ID NO：20，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：90，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：92，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在一些較佳實施例中，抗體或抗原結合片段係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：96，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同，且最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在一個實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體包含如上所述具有兩個輕鏈及兩個重鏈之全長抗體結構，其中各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1恆定區。

在一個實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體包含如上所述具有兩個輕鏈及兩個重鏈之全長抗體結構，其中各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG2恆定區。

在一個實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體包含如上所述具有兩個輕鏈及兩個重鏈之全長抗體結構，其中各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域且各重鏈包含人類IgG4恆定區。

在某些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段具有以下功能特徵中之一者、兩者、三者、四者或更多者，且較佳每一者：以<1nM之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：34之序列的人類SIRPαV1蛋白；及以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：61之序列的SIRPαV1(P74A)；且視情況亦以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：38之序列的人類SIRPβ1蛋白(在各情況下，其中減小的EC₅₀係相對於針對具有SEQ ID NO：34之序列的人類SIRPαV1蛋白的EC₅₀而言，且在各情況下較佳在藉由如下文中所述之細胞ELISA(CELISA)量測時)；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nm、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nM、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV2蛋白之細胞結合；在50nM、較佳67nM且更佳100nM之抗體濃度下；或者在比抗體對SIRPαV1或SIRPαV2之EC₅₀大10倍、較佳大50倍、更佳大100倍且再更佳大200倍的濃度下，不與SIRPβ1蛋白發生明顯的結合；以<10.0nM、更佳<5.0nM、再更佳<2.5nM且最佳約1.0nM或更小的IC₅₀抑制人類SIRPα與CD47之間的結合；及展現至少79且更佳85之T20「人類化(humanness)」評分。

較佳地，在100nM之抗體濃度下或者在比抗體對SIRPαV1或SIRPαV2之EC₅₀大200倍之抗體濃度下，本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段不與SIRPαV1(P74A)及SIRPβ1蛋白中之一者或兩者發生明顯的結合，而是以<10nM之EC50與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合。最佳地，各輕鏈包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域；且各重鏈包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區。

在某些實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段可以與至少一種治療劑結合。在一個實施例中，治療劑係第二抗體或其片段、免疫調節劑、激素、細胞毒素劑、酶、放射性核種、或結合於至少一種免疫調節劑、酶、放射性標記、激素、反義寡核苷酸或細胞毒素劑之第二抗體或其組合。

本發明亦提供經分離多肽，其包含SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、76、90、92、94、96、98、100、102、104、7、10、12、14、16、18、30、8、20、22、24、26、28及32中之任一者之胺基酸序列或任何該等序列之片段，或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。

本發明亦提供經分離核酸，其編碼本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段中之任一者。

在一個實施例中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：75或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列， SEQ ID NO：78或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：82或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：84或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：86或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：88或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：102或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：10或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：12或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：14或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：16或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：18或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：30或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列。

在某些實施例中，SEQ ID NO：10之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：9之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：12之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：11之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：14之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：16之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：15之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：18之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：17之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：30之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：29之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：78之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：77之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：80之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：79之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：82之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：81之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：84之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：83之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：86之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：85之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：88之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：87之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：102之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：101之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在一個實施例中，本發明提供一種經分離核酸，其編碼選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：76或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列， SEQ ID NO：90或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：92或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：94或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：96或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：98或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：100或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：104或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：8或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：22或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：24或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：26或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，SEQ ID NO：28或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列，及SEQ ID NO：32或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列。

在某些實施例中，SEQ ID NO：20之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：19之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：22之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：21之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：24之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：23之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：26之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：25之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：28之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：27之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：32之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：31之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：90之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：89之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：92之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：91之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：94之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：93之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：96之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：95之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：98之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：97之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：100之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：99之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，SEQ ID NO：104之胺基酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相似或相同之胺基酸序列由SEQ ID NO：103之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列編碼。

在某些實施例中，本發明之經分離核酸可以視情況包含前導序列(leader sequence)。

該等核酸可以包含以下核酸序列中之一或多者：SEQ ID NO：77之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：79之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：81之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：83之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：85之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：87之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：101之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：89之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：91之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：93之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：95之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列， SEQ ID NO：97之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：99之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：101之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：103之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：9之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：11之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：15之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：17之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：29之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：19之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：21之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或 99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：23之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：25之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：27之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，及/或SEQ ID NO：31之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列。

在某些實施例中，核酸可以編碼人類或人類化抗體，且包括用於重鏈及輕鏈之核酸序列。在一個實施例中，抗體係IgG。在較佳實施例中，抗體係IgG1、IgG2或IgG4，且較佳係人類IgG1、IgG2或IgG4。在某些實施例中，輕鏈序列包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域序列；且各重鏈序列包含人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區序列。

較佳地，該等核酸包含以下重鏈及輕鏈可變區核酸序列組合：

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L1)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L2)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L3)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L4)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L5)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L1)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L2)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L3)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L4)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L5)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L1)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L2)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L3)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L4)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L5)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L1)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L2)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L3)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L4)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L5)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L1)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L2)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L3)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L4)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L5)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L1)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L2)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L3)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L4)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L5)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L6)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L1)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L2)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L3)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L4)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L5)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L6)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L1)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L2)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L3)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L4)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L5)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L6)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L1)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L2)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L3)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L4)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L5)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L6)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L1)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L2)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L3)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L4)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L5)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L6)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L1)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L2)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L3)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L4)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L5)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L6)

或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：19或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：15及SEQ ID NO：27或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：19或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：89或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：91或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在一些較佳實施例中，核酸包含SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：95或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

本發明亦提供包含一或多種本發明核酸之表現載體。表現載體係包含用於目標核酸在宿主細胞中之轉錄所需之調節元件的DNA分子。通常將目標核酸置於某些調節元件之控制下，包括組成性或誘導性啟動子、組織特異性調節元件及強化子元件。當調節元件控制基因之表現時，此類目標核酸稱為「可操作地連接於」調節元件。

此等經分離核酸及包含其之表現載體可用於在重組宿主細胞中表現本發明之抗體或其抗原結合片段。因此，本發明亦提供包含本發明之表現載體的宿主細胞。

該等表現載體可以包含以下可操作地連接於調節元件之核酸序列中之一或多者：SEQ ID NO：77之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：79之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：81之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：83之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：85之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：87之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：101之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：89之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或 99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：91之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：93之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：95之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：97之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：99之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：103之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：11之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：13之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：15之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：17之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：29之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列， SEQ ID NO：19之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：21之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：23之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：25之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：27之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，及/或SEQ ID NO：31之核酸序列或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列。

在某些實施例中，表現載體包含編碼本發明之抗-SIRPα抗體之重鏈序列及輕鏈序列的核酸序列。較佳地，該等表現載體包含以下重鏈及輕鏈可變區核酸序列組合：

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L1)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L2)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L3)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L4)

SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L5)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L1)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L2)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L3)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L4)

SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L5)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L1)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L2)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L3)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L4)

SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L5)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L1)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L2)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L3)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L4)

SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L5)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：19(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L1)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：21(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L2)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：23(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L3)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：25(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L4)

SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：27(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L5)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L1)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L2)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L3)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L4)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L5)

SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L6)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L1)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L2)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L3)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L4)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L5)

SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L6)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L1)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L2)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L3)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L4)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L5)

SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L6)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L1)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L2)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L3)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L4)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L5)

SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L6)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L1)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L2)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L3)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L4)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L5)

SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L6)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：89(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L1)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：91(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L2)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：93(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L3)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：95(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L4)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：97(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L5)

SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：99(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L6)

或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

在以上實施例中之任一者中，表現載體可以編碼人類或人類化抗體之表現，且包括用於重鏈及輕鏈之核酸序列。在一個實施例中，抗體係IgG。在較佳實施例中，抗體係IgG1、IgG2或IgG4，且較佳係人類IgG1、IgG2或IgG4。在某些實施例中，輕鏈序列包含人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定域序列；且各重鏈序列包含人類IgG4恆定區序列。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：9且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：19，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：15且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：27，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：17且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：19，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：79且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：89，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：79且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：91，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一些較佳實施例中，表現載體編碼人類或人類化抗體之表現，其中重鏈核酸序列包含SEQ ID NO：79且輕鏈核酸序列包含SEQ ID NO：95，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同，且最佳係IgG1、IgG2或IgG4同型。

在一個實施例中，宿主細胞係中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞。在一個實施例中，宿主細胞係哺乳動物細胞(例如人類細胞，諸如HEK293細胞，倉鼠細胞，諸如CHO細胞等)、細菌細胞(例如大腸桿菌(E.coli)細胞)、酵母細胞(例如甲醇酵母(Pichia pastoris)細胞等)、植物細胞(例如本氏菸草(Nicotiana benthamiana)細胞)等。哺乳動物細胞因為糖基化模式最有利故係較佳的。

本發明亦提供包含本發明之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑的醫藥組合物。

在一個實施例中，組合物包含一或多種其他治療劑。在一個實施例中，其他治療劑係選自由以下組成之群：抗-CD27抗體或其抗原結合片段；抗-LAG3抗體或其抗原結合片段；抗-APRIL抗體或其抗原結合片段；抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗-VISTA抗體或其抗原結合片段；抗-BTLA抗體或其抗原結合片段；抗-TIM3抗體或其抗原結合片段；抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗-HVEM抗體或其抗原結合片段；抗-CD70抗體或其抗原結合片段；抗-CD137抗體或其抗原結合片段；抗-OX40抗體或其抗原結合片段；抗-CD28抗體或其抗原結合片段；抗-PD1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL2抗體或其抗原結合片段；抗-GITR抗體或其抗原結合片段；抗-ICOS抗體或其抗原結合片段；抗-ILT2抗體或其抗原結合片段；抗-ILT3抗體或其抗原結合片段；抗-ILT4抗體或其抗原結合片段；及抗-ILT5抗體或其抗原結合片段；抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；抗-IL-10抗體或其抗原結合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；TNF受體蛋白之促效劑(例如促效性抗體或其抗原結合片段或可溶性融合物)；免疫球蛋白樣蛋白質；細胞介素受體；整合素；信號傳導淋巴球性活化分子(signaling lymphocytic activation molecule，SLAM蛋白)；活化NK細胞受體；鐸樣受體(Toll like receptor)；OX40；CD2；CD7；CD27；CD28；CD30；CD40；ICAM-1；LFA-1(CDl la/CD18)；4-1BB(CD137)；B7-H3；ICOS(CD278)；GITR；BAFFR；LIGHT；HVEM(LIGHTR)；KIRDS2；SLAMF7； NKp80(KLRF1)；NKp44；NKp30；NKp46；CD19；CD4；CD8α；CD8β；IL2R β；IL2R γ；IL7R α；ITGA4；VLA1；CD49a；ITGA4；IA4；CD49D；ITGA6；VLA-6；CD49f；ITGAD；CDl ld；ITGAE；CD103；ITGAL；ITGAM；CDl lb；ITGAX；CDl lc；ITGB1；CD29；ITGB2；CD18；ITGB7；NKG2D；NKG2C；TNFR2；TRANCE/RANKL；DNAM1(CD226)；SLAMF4(CD244；2B4)；CD84；CD96(Tactile)；CEACAMl；CRTAM；Ly9(CD229)；CD160(BY55)；PSGL1；CD100(SEMA4D)；CD69；SLAMF6(NTB-A；Lyl08)；SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)；SLAM7；BLAME(SLAMF8)；SELPLG(CD162)；LTBR；LAT；GADS；PAG/Cbp；CD19a；與CD83特異性結合之配位體；CD47、PD-1、PD-L1；PD-L2；CTLA4；TIM3；LAG3；CEACAM(例如CEACAM-1、-3及/或-5)；VISTA；BTLA；TIGIT；LAIRl；IDO；TDO；CD160；TGFR β之抑制劑；及環二核苷酸或其他STING途徑促效劑。

本發明亦包含一種組合，其包含本發明之抗體或抗原結合片段及誘導ADCC之第二抗體，其中本發明之該抗體或抗原結合片段藉由第二抗體增強細胞之抗體介導之破壞。抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)係細胞介導之免疫防禦機制，免疫系統之效應細胞藉此有效地溶解膜表面抗原已被特異性抗體結合之目標細胞。ADCC常常認為是由自然殺手(natural killer，NK)細胞介導的，但是樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞及粒細胞亦可以介導ADCC。

本發明亦包含一種組合，其包含本發明之抗體或抗原結合片段及誘導ADCP之第二抗體，其中本發明之該抗體或抗原結合片段藉由第二抗體增強細胞之抗體介導之吞噬作用。抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP)係細胞介導之免疫防禦機制，目標細胞藉此經由粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞或巨噬細胞介導之吞噬作用殺死。

自然殺手(NK)細胞在癌症免疫療法中起重要作用，癌症免疫療法涉及單株抗體(monoclonal antibody，mAb)之腫瘤-抗原靶向。在靶向細胞之情況下，NK細胞可以經由某些在其細胞表面上表現之Fc受體「特異性地活化」。NK細胞可以表現FcγRIIIA及/或FcγRIIC，其可以與免疫球蛋白之Fc部分結合，傳輸NK細胞內之活化信號。在經由Fc受體藉由與目標細胞結合之抗體活化之後，NK細胞能夠溶解目標細胞而不預致敏(priming)，且分泌細胞介素，如干擾素γ，用以募集適應性免疫細胞。類似地，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)表現結合抗體之Fc片段且使其參與抗體依賴性細胞性細胞毒性/吞噬作用(ADCC/ADCP)的表面受體。因為SIRPα/CD47信號傳導誘導減少ADCC/ADCP之「別吃我」反應，所以藉由本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段阻斷此信號傳導可以增強攜帶治療性抗體所導向之抗原決定子之腫瘤細胞的ADCC。

可以在各種癌症及傳染病之治療中採用此ADCC/ADCP作為作用模式。可以與本發明之抗體或抗原結合片段組合的誘導ADCC/ADCP之抗體及抗體結合物的例示性清單包括但不限於利妥昔單抗(Rituximab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、馬妥昔單抗(margetuximab)、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗(veltuzumab)、奧濱尤妥珠單抗(Obinutuzumab)、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、達妥昔單抗(Dinituximab)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、西妥昔單抗(Cetuximab)、利妥昔單抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13及(CD20)₂xCD16、埃羅替尼(erlotinib)(Tarceva)、達雷木單抗(daratumumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、本妥昔單抗(brentuximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、依法妥珠單抗(ifabotuzumab)、伐吐珠單抗(farletuzumab)、奧特勒土珠單抗(otlertuzumab)、卡妥昔單抗(carotuximab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、因厄比利珠單抗(inebilizumab)、盧姆力土珠單抗(lumretuzumab)、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗(mogamulizumab)、ChiLob-7/4、樂妥昔單抗(leukotuximab)、伊薩妥昔單抗(isatuximab)、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奧普珠單抗(oportuzumab)、恩斯土昔單抗(ensituximab)、維多汀(vedotin)(Adcetris)、替伊莫單抗噻西坦(ibritumomab tiuxetan)、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla)。該等誘導ADCC/ADCP之抗體之目標抗原的例示性清單包括但不限於AMHR2、AXL、BCMA、CA IX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、Endoglin、EPHA2、EphA3、FGFR2b、葉酸受體α、海藻糖基(fucosyl)-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受體、TA- MUC1及PSMA。

在某些實施例中，第二抗體或其抗原結合片段誘導ADCP。僅舉例而言，抗體可選自由以下組成之群：利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、阿侖單抗、替伊莫單抗、伐吐珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202及MOR-208。

在本發明之抗體或抗原結合片段與一或多種誘導ADCC/ADCP之抗體及抗體結合物結合的實施例中，該等組合亦可視情況與其他治療劑或治療程序聯合使用。在一個實施例中，其他治療劑係選自由以下組成之群：抗-LAG3抗體或其抗原結合片段；抗-APRIL抗體或其抗原結合片段；抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗-VISTA抗體或其抗原結合片段；抗-BTLA抗體或其抗原結合片段；抗-TIM3抗體或其抗原結合片段；抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗-HVEM抗體或其抗原結合片段；抗-CD70抗體或其抗原結合片段；抗-CD137抗體或其抗原結合片段；抗-OX40抗體或其抗原結合片段；抗-CD28抗體或其抗原結合片段；抗-PD1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL2抗體或其抗原結合片段；抗-GITR抗體或其抗原結合片段；抗-ICOS抗體或其抗原結合片段；抗-ILT2抗體或其抗原結合片段；抗-ILT3抗體或其抗原結合片段；抗-ILT4抗體或其抗原結合片段；抗-ILT5抗體或其抗原結合片段；及抗-4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；抗-IL-10抗體或其抗原結合片段；及IL-10或聚乙二醇化IL-10。

本發明亦提供一種容器或注射裝置，其包含本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段中之任一者。

本發明亦提供一種製造本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含：將包含編碼本發明抗體(或其抗原結合片段)之重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸的宿主細胞在有利於該聚核苷酸之表現的條件下培養；及視情況，從宿主細胞及/或培養基回收抗體或抗原結合片段。在一個實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸及編碼輕鏈之聚核苷酸處於單一載體中。在另一實施例中，編碼重鏈之聚核苷酸及編碼輕鏈之聚核苷酸處於不同載體中。

本發明亦提供一種治療有需要之個體之癌症的方法，該方法包含向個體投與有效量的本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。

在一個實施例中，待治療個體係人類個體。在一個實施例中，其他治療劑係選自由以下組成之群：抗-LAG3抗體或其抗原結合片段；抗-APRIL抗體或其抗原結合片段；抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗-VISTA抗體或其抗原結合片段；抗-BTLA抗體或其抗原結合片段；抗-TIM3抗體或其抗原結合片段；抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗-HVEM抗體或其抗原結合片段；抗-CD70抗體或其抗原結合片段；抗-CD137抗體或其抗原結合片段；抗-OX40抗體或其抗原結合片段；抗-CD28抗體或其抗原結合片段；抗-PD1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL2抗體或其抗原結合片段；抗-GITR抗體或其抗原結合片段；抗-ICOS抗體或其抗原結合片段；抗-ILT2抗體或其抗原結合片段；抗-ILT3抗體或其抗原結合片段；抗-ILT4抗體或其抗原結合片段；抗-ILT5抗體或其抗原結合片段；及抗-4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；抗-IL-10抗體或其抗原結合片段；及IL-10或聚乙二醇化IL-10。

本發明亦提供治療個體之感染或傳染病之方法，該方法包含向個體投與有效量的本發明之抗體或抗原結合片段，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。在一個實施例中，待治療個體係人類個體。

在一個實施例中，其他治療劑係選自由以下組成之群：抗-LAG3抗體或其抗原結合片段；抗-APRIL抗體或其抗原結合片段；抗-TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗-VISTA抗體或其抗原結合片段；抗-BTLA抗體或其抗原結合片段；抗-TIM3抗體或其抗原結合片段；抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗-HVEM抗體或其抗原結合片段；抗-CD70抗體或其抗原結合片段；抗-CD137抗體或其抗原結合片段；抗-OX40抗體或其抗原結合片段；抗-CD28抗體或其抗原結合片段；抗-PD1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL1抗體或其抗原結合片段；抗-PDL2抗體或其抗原結合片段；抗-GITR抗體或其抗原結合片段；抗-ICOS抗體或其抗原結合片段；抗-ILT2抗體或其抗原結合片段；抗-ILT3抗體或其抗原結合片段；抗-ILT4抗體或其抗原結合片段；抗-ILT5抗體或其抗原結合片段；及抗-4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗-NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗-TSLP抗體或其抗原結合片段；抗-IL-10抗體或其抗原結合片段；及IL-10或聚乙二醇化IL-10。

本發明亦提供一種用於偵測樣品中之SIRPα肽或其片段之存在的方法，該方法包含使樣品與本發明之抗體或其抗原結合片段接觸且偵測抗體或片段與肽之間的複合物之存在；其中偵測到該複合物指示存在SIRPα肽。

圖1描繪市售抗-hSIRPα抗體與hSIRPβ1之交叉反應性及與hSIRPαV1及hSIRPαV2之對偶基因特異性結合。

圖2描繪KWAR23抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1及hSIRPγ之反應性。

圖3描繪抗體純系hSIRPα.50A對多種hSIRPα對偶基因之反應性。

圖4描繪hSIRPα.50A抗體阻斷重組hCD47/Fc蛋白與細胞表面表現之hSIRPα結合的能力。

圖5A及圖5B描繪hSIRPα.50A抗體與初級人類CD14+富集單核球之結合。

圖5C及圖5D描繪hSIRPα.50A抗體阻斷hCD47與初級人類CD14+富集單核球結合的能力。

圖6A描繪hSIRPα.50A抗體與初級人類粒細胞之結合。

圖6B描繪初級人類粒細胞在利妥昔單抗加或減hSIRPα.50A抗體存在下對腫瘤細胞之吞噬作用。

圖6C描繪初級人類粒細胞在達雷木單抗加或減hSIRPα.50A抗體存在下對腫瘤細胞之吞噬作用。

圖6D描繪初級人類粒細胞在阿侖單抗加或減hSIRPα.50A抗體存在下對腫瘤細胞之吞噬作用。

圖6E描繪初級人類粒細胞在西妥昔單抗加或減hSIRPα.50A抗體存在下對腫瘤細胞之吞噬作用。

圖7描繪人類巨噬細胞在指定抗體(利妥昔單抗或達雷木單抗)加或減hSIRPα.50A抗體存在下對腫瘤細胞之吞噬作用。

圖8描繪藉由針對hSIRPα之小鼠hSIRPα.50A及人類化hSIRPα.50A抗體阻斷hSIRPα/hCD47相互作用。

圖9描繪hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α及hSIRPα-VαC1αC2β之結合。

圖10A描繪hSIRPαV1(SEQ ID NO：133)、hSIRPαV2(SEQ ID NO：134)及hSIRPβ1 IgV(SEQ ID NO：135)域胺基酸序列之比對。

圖10B描繪缺失hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1(P74A)之結合。

圖11描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL及hSIRPγ之結合。

圖12描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3、hSIRPαV4、hSIRPαV5、hSIRPαV6、hSIRPαV8及hSIRPαV9之結合。

圖13描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體阻斷重組hCD47/Fc蛋白與細胞表面表現之hSIRPα結合的能力。

圖14描繪hSIRPα.40A抗體與初級人類CD14+富集單核球之結合(上面兩圖)及抗體hSIRPα.40A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用之能力(下面兩圖)。

圖15A描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與初級人類粒細胞之結合。

圖15B描繪初級人類粒細胞在利妥昔單抗加或減hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體存在下對Ramos細胞之吞噬作用。

圖16描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體增強利妥昔單抗誘導之Raji細胞吞噬作用。

圖17描繪小鼠hSIRPα.40A及人類化hSIRPα.40A抗體與hSIRPα之結合。

圖18描繪在人類化hSIRPα.40A抗體變異體存在下阻斷hCD47與hSIRPα之結合。

圖19描繪hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRP-VγC1βC2β、hSIRP-VβC1γC2β及hSIRP-VβC1βC2γ之結合。

圖20描繪缺失hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1(P74A)之結合。

圖21描繪嵌合hSIRPα.40A抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖22描繪人類化hSIRPα.40A抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖23A描繪小鼠hSIRPα.50A及嵌合hSIRPα.50A hIgG2及hIgG4抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖23B描繪嵌合hSIRPα.50A hIgG2及hIgG4抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖23C描繪嵌合hSIRPα.50A hIgG2及hIgG4抗體變異體影響達雷木單抗介導之吞噬作用的能力。

圖23D描繪小鼠hSIRPα.50A及嵌合hSIRPα.50A hIgG2抗體變異體影響粒細胞中之利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖24A描繪小鼠hSIRPα.50A及嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q或hSIRPα.50A.hIgG2抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

圖24B描繪小鼠hSIRPα.50A及嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q或hSIRPα.50A.hIgG2抗體變異體影響達雷木單抗介導之吞噬作用的能力。

圖25描繪嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G及hSIRPα.50A hIgG2或hIgG4抗體變異體影響利妥昔單抗介導之吞噬作用的能力。

本申請案主張2017年4月13日申請之荷蘭專利申請案2018708及2017年7月3日申請之荷蘭專利申請案2019166之權益，其各自以全文引用之方式併入本文中，包括所有表格、圖式及申請專利範圍。

縮寫

在本發明之詳細描述及實例中，將使用以下縮寫：

定義

為使本發明可較容易理解，在下文中特定地定義某些技術及科學術語。除非在本文件中其他地方特定地定義，否則本文所用之所有其他技術及科學術語均具有本發明所屬領域之一般技術者通常所理解之含義。

除非上下文另外清楚地規定，否則如本文、包括隨附申請專利範圍所用，諸如「一(a/an)」及「該(the)」之詞語之單數形式包括其對應複數個指示物。

「投藥」及「處理」在應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時係指外源性醫藥、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞處理涵蓋試劑與細胞之接觸，以及在流體與細胞接觸之情況下涵蓋試劑與流體之接觸。「投藥」及「處理」亦意謂藉由試劑、診斷劑、結合化合物或藉由另一細胞對例如某個細胞進行活體外及離體處理。

「處理(treat)」或「處理(treating)」意謂以內部或外部方式向具有一或多種疾病症狀或懷疑患有疾病之個體或患者投與治療劑，諸如含有本發明之抗體或抗原結合片段中之任一者的組合物，其中該治療劑對該疾病具有治療活性。通常，藥劑以藉由誘導一或多種疾病症狀之消退或抑制其進展達任何臨床上可量測之程度的方式有效緩解經治療個體或群體之此類症狀的量投與。可有效緩解任何特定疾病症狀之治療劑之量可根據諸如疾病病況、患者年齡及體重以及藥物在個體中引發所需反應之能力的因素而變化。疾病症狀是否已緩解可藉由醫師或其他熟練醫療保健提供者通常用以評定該症狀之嚴重程度或進程狀態的任何臨床量測來評定。

蛋白質之「重組表現」意謂外源基因在宿主生物體中轉錄及轉譯以產生蛋白質，該蛋白質在本文中稱為「重組蛋白」。

SIRPα及相關蛋白質

SIRPα屬於膜蛋白之類別，稱為「配對受體(paired receptor)」，其含有若干編碼具有相似細胞外區域但是不同的具有相反(活化或抑制)信號傳導能力之跨膜及/或細胞質區域的蛋白質(例如SIRPα、SIRPβ1及SIRPγ)的基因。如SIRPα，在NK細胞上存在若干配對受體實例且在骨髓細胞上存在一些，包括SIRP及CD200受體家族(Hatherley等人，Mol Cell.2008；31：266-277)。

SIRPα含有一個細胞外區域，該細胞外區域可以再分為三個單獨的域：Ig樣(免疫球蛋白樣)V型(IgV)、Ig樣C1型(IgC1)及Ig樣C2型(IgC2)域。IgV域亦稱為SIRPα之配位體結合N端域。像SIRPα一樣，相關蛋白質SIRPβ1及SIRPγ亦包含可以再分為IgV、IgC1及IgC2域之細胞外區域。然而，SIRPα、SIRPβ1及SIRPγ具有不同的細胞質區域。SIRPβ1具有僅6個胺基酸之極短的細胞質區域且缺乏與磷酸酶結合之信號傳導基元。此蛋白質反而與DNAX活化蛋白12(DNAX activation protein 12，DAP12)結合，DAP12係結合SIRPβ1之跨膜區中具有鹼性側鏈之胺基酸且能夠經由其基於免疫受體酪胺酸之活化基元(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)傳輸活化信號的二聚接附蛋白(adaptor protein)。SIRPγ亦具有4個胺基酸之短細胞質區域，但是其在跨膜區中缺乏帶電荷胺基酸側鏈且因此不與DAP12結合。因此，將SIRPγ標註為非信號傳導蛋白(Barclay,A.N.及Brown,M.H.,Nat Rev Immunol.2006；6：457-464)。

SIRPα之主要配位體係CD47，其由一個細胞外IgV域、五次跨膜域及短細胞質尾區組成。CD47充當經由SIRPα之NH2端IgV域介導之結合的細胞配位體。CD47有助於自我識別之證據來自於以下觀察結果：衍生自表現CD47之小鼠的脾巨噬細胞明確輸注來自CD47^-/-小鼠之血球 (Oldenborg等人，Science.2000；288：2051-2054)。

除了CD47之外，已報導另外兩種SIRPα配位體，稱為界面活性劑蛋白A及D(Sp-A及Sp-D)，其均屬於膠原凝集素家族(collectin family)。已報導，Sp-D以鈣及醣依賴性方式與SIRPα之近膜IgC2域結合。可以認為，Sp-A及Sp-D有助於藉由刺激肺泡巨噬細胞上之SIRPα而維持肺中之抗炎環境(Gardai等人，Cell.2003；115：13-23)。

八種人類SIRPα變異體之胺基酸序列列於SEQ ID NO：34、36、44、46、48、50、52及54中；編碼此等變異體之例示性核酸序列分別列於SEQ ID NO：33、35、43、45、47、49、51及53中。

為了比較，人類SIRPβ1及SIRPγ之胺基酸序列分別列於SEQ ID NO：38及40中，且例示性核酸序列分別列於SEQ ID NO：37及39中。

人類CD47之胺基酸序列列於SEQ ID NO：42中，且例示性核酸序列列於SEQ ID NO：41中。

下文中所論述之經修飾SIRPα多肽hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α、hSIRPα-VαC1αC2β及hSIRPαV1(P74A)列於SEQ ID NO：56、58、60及62中；編碼此等變異體之例示性核酸序列分別列於SEQ ID NO：55、57、59及61中。

抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段

本發明提供結合人類SIRPα之抗體或其抗原結合片段，及此類抗體或片段之用途。在一些實施例中，抗-SIRPα抗體經分離。

抗體是否特異性結合於多肽序列(例如人類SIRPα、hSIRPβ1等)可以使用此項技術中已知的任何分析法判定。此項技術中已知測定結合親和力之分析之實例包括表面電漿子共振(例如BIACORE)或類似技術(例如 KinExa或OCTET)。

如本文所用，術語「抗體」係指展現所期望之生物活性的抗體之任何形式。術語抗體包括抗原結合部分，亦即保留結合抗原之能力的「抗原結合位點」(例如片段、子序列、互補決定區(CDR))，包括(i)Fab片段，一種由V_L、V_H、C_L及C_H1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，其由V_H及C_H1域組成；(iv)Fv片段，其由抗體單臂之V_L及V_H域組成；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。提及術語「抗體」時亦包括單鏈抗體。較佳的治療性抗體係完整IgG抗體。如本文中所用之術語「完整IgG」意謂屬於基本上由所識別之免疫球蛋白γ基因編碼之抗體類別的多肽。在人類中，此類別包含IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在小鼠中，此類別包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。抗體之IgG類別中之已知Ig域係V_H、Cγ1、Cγ2、Cγ3、V_L及C_L。

本發明包括抗-SIRPα抗原結合片段及其使用方法。

如本文所用，「全長抗體」在IgG的情況下係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之二價分子。各重鏈包含V_H域，其後為恆定域(C_H1)、鉸鏈區及另外兩個恆定(C_H2及C_H3)域；而各輕鏈包含一個V_L域及一個恆定(C_L)域。全長抗體在IgM的情況下係包含5或6個連接著的免疫球蛋白的十價(decavalent)或十二價(dodecavalent)分子，其中各單體之免疫球蛋白具有兩個由重鏈及輕鏈形成之抗原結合位點。

如本文所用，除非另外指明，否則「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結合片段，亦即保留特異性結合於全長抗體所結合之抗原的能力的抗體片段，例如保留一或多個CDR區之片段。抗原結合片段之實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成之奈米抗體及多特異性抗體。

本發明包括抗-SIRPα Fab片段及其使用方法。「Fab片段」包含一個輕鏈及一條重鏈之C_H1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fab片段」可為抗體之木瓜蛋白酶裂解產物。

本發明包括抗-SIRPα抗體及其包含Fc區之抗原結合片段以及其使用方法。「Fc」區含有兩個包含抗體之C_H3及C_H2域的重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個或更多個二硫鍵及C_H3域之疏水性相互作用保持在一起。

本發明包括抗-SIRPα Fab'片段及其使用方法。「Fab'片段」含有一個輕鏈及一個重鏈之含有V_H域及C_H1域以及C_H1與C_H2域之間的區域的一部分或片段，使得在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')₂分子。

本發明包括抗-SIRPα F(ab')₂片段及其使用方法。「F(ab')₂片段」含有兩個輕鏈及兩個含有在C_H1與C_H2域之間的一部分恆定區的重鏈，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')₂片段由藉由兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。「F(ab')₂片段」可為抗體之胃蛋白酶裂解產物。

本發明包括抗-SIRPα Fv片段及其使用方法。「Fv區」包含來自重鏈及輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。

本發明包括抗-SIRPα scFv片段及其使用方法。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包含抗體之V_H及V_L域之抗體片段，其中此等域存在於單個多肽鏈中。通常，Fv多肽進一步在V_H與V_L域之間包含多肽連接子，其使得scFv能夠形成抗原結合所需之結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES，第113卷，Rosenburg及Moore編Springer-Verlag,New York，第269-315頁。亦參見國際專利申請公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。

本發明包括抗-SIRPα域抗體及其使用方法。「域抗體」係僅含重鏈之可變區或輕鏈之可變區的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或更多個V_H區與肽連接子共價結合以產生二價域抗體。二價域抗體之兩個V_H區可靶向相同或不同的抗原。

本發明包括抗-SIRPα二價抗體及其使用方法。「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性的(參見下文)。

本發明包括抗-SIRPα雙功能抗體及其使用方法。如本文所用，術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包含重鏈可變域(V_H)連接於同一多肽鏈中之輕鏈可變域(V_L)(V_H-V_L或V_L-V_H)。藉由使用過短以致於同一鏈上之兩個域之間不能配對的連接子，迫使域與另一條鏈之互補域配對，且產生兩個抗原結合位點。雙功能抗體更全面地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；及Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448中。杜氏抗體(Duobodies)描述於Labrijn等人，2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13)：5145-5150中。關於經工程改造之抗體變異體之綜述，通常參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

通常，以一定方式修飾之本發明之抗體或抗原結合片段在活性以莫耳表示時保留其結合活性之至少10%(與親本親本相比時)。較佳地，本發明之抗體或抗原結合片段保留親本抗體之SIRPα結合親和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多。亦意欲本發明之抗體或抗原結合片段可包括不實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變異體」或「功能保守變異體」)。

本發明包括經分離之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段及其使用方法。此處術語「經分離」不欲指此類生物分子之完全不存在；或水、緩衝液或鹽之不存在；或包括抗體或片段之醫藥調配物之組分之不存在。「經分離」抗體、抗原結合片段、核酸等係已從其天然環境之一或多種組分鑑別且分離及/或回收之物。在較佳實施例中，將抗體、抗原結合片段、核酸等純化至75重量%或更高，更佳90重量%或更高，再更佳95重量%或更高，再更佳98重量%或更高。因此，「經分離」生物分子至少部分不含產生該等生物分子之細胞或細胞培養物中的其他生物分子。此類生物分子包括核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他物質，諸如細胞碎片及生長培養基。經分離抗體或抗原結合片段可進一步至少部分不含表現系統組分，諸如來自宿主細胞或其生長培養基之生物分子

本發明包括抗-SIRPα嵌合抗體(例如人類恆定域/小鼠可變域)及其使用方法。如本文所用，「嵌合抗體」係具有來自第一抗體之可變域及來自第二抗體之恆定域的抗體，其中該第一及第二抗體來自不同物種。(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。通常，可變域從來自諸如嚙齒動物之實驗動物的抗體(「親本抗體」)獲得，且恆定域序列從人類抗體獲得，使得所得嵌合抗體相比於親本(例如小鼠)抗體將不大可能在人類個體中引起不良免疫反應。

本發明包括抗-SIRPα人類化抗體及其抗原結合片段(例如經人類化之大鼠或小鼠抗體)及其使用方法。如本文所用，術語「人類化抗體」係指含有來自人類與非人類(例如小鼠或大鼠)抗體之序列的抗體形式。一般而言，人類化抗體將包含基本上至少一個且典型地兩個可變域，其中所有或基本上所有高變環與非人類免疫球蛋白之彼等區域相對應且所有或基本上所有構架(FR)區係人類免疫球蛋白序列之彼等區域。人類化抗體可視情況包含人類免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分。關於人類化抗體之更多細節，參見例如Jones等人Nature,321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)；及Clark,Immunol.Today 21：397-402(2000)。

通常，基本抗體結構單元包含四聚體。各四聚體包括兩對相同的多肽鏈，每對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基端部分包括主要負責抗原識別之具有約100至110個或更多個胺基酸之可變區。重鏈之羧基端部分可定義主要負責效應功能之恆定區。通常，人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。此外，人類重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區連接，其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology第7章(Paul,W.編，第2版Raven Press,N.Y.(1989))。

各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除了雙功能或雙特異性抗體中以外，兩個結合位點通常相同。

通常，重鏈及輕鏈之可變域包含三個高變區，亦稱為互補決定區(CDR)，其位於相對保守構架區(FR)內。CDR通常藉由構架區對準，使得能夠結合於特定抗原決定基。一般而言，從N端至C端，輕鏈及重鏈可變域均包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。對各域之胺基酸之分配通常根據Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH公開案第91-3242號(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883之定義。

如本文所用，術語「高變區」係指抗體或其抗原結合片段之負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基(亦即輕鏈可變域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3以及重鏈可變域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(藉由序列定義抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(藉由結構定義抗體之CDR區)。如本文所用，術語「構架」或「FR」殘基係指除在本文中定義為CDR殘基之高變區殘基以外的可變域殘基。

「經分離核酸分子」或「經分離聚核苷酸」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成起點之DNA或RNA或其某一組合，其不與自然界中發現經分離聚核苷酸的聚核苷酸之全部或一部分結合，或連接於其在自然界中不連接之聚核苷酸。出於本發明之目的，應瞭解「包含」特定核苷酸序列「之核酸分子」不涵蓋完整染色體。除指定序列以外，「包含」指定核酸序列之經分離核酸分子可包括多達十種或甚至多達二十種或更多種其他蛋白質之編碼序列或其部分或片段，或可包括控制所述核酸序列之編碼區域之表現的可操作地連接之調節序列，及/或可包括載體序列。

片語「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。適用於原核生物之控制序列例如包括啟動子、視情況選用之操縱序列及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、聚腺苷酸化信號及強化子。

當核酸或聚核苷酸置放成與另一核酸序列成功能關係時其為「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與該多肽之DNA係可操作地連接的；若啟動子或強化子影響編碼序列之轉錄，則其與該序列係可操作地連接的；或若核糖體結合位點定位成方便轉譯，則其與編碼序列係可操作地連接的。一般而言，但未必總是，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列相鄰，且在分泌前導序列之情況下，相鄰且在閱讀相(reading phase)中。然而，強化子不必為相鄰的。連接藉由在方便的限制位點處連接來達成。若不存在此類位點，則根據習知操作使用合成寡核苷酸接附子(adaptor)或連接子。

如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有此類名稱均包括子代。因此，詞語「轉形體」及「轉形細胞」包括初級個體細胞及由其衍生之培養物，不考慮轉移數目。亦應理解，因為有意或無意突變，所以並非所有子代均具有精確相同的DNA含量。包括突變子代，其具有與最初轉形細胞中所篩檢相同的功能或生物活性。不同的名稱可以從上下文清楚其意思。

如本文所用，「生殖系序列」係指未經重排之免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用未經重排之免疫球蛋白序列的任何適合來源。人類生殖系序列可例如在美國國家衛生研究院(the United States National Institutes of Health)之美國國立關節炎及肌肉骨骼及皮膚病研究所(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)的網站上從JOINSOLVER生殖系資料庫獲得。小鼠生殖系序列可例如如Giudicelli等人，(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所述獲得。

例示性抗-SIRPα抗體之物理及功能特性

本發明提供具有指定結構及功能特徵之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段，及使用該等抗體或其抗原結合片段治療或預防疾病(例如癌症或傳染病)之方法。

如上所述，與本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段中之任一者結合於同一抗原決定基之抗體及片段亦形成本發明之一部分。在一個實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其與包含以下重鏈序列/輕鏈序列(或在各情況下與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列)組合中之一者的抗體結合於同一個人類SIRPα抗原決定基：

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L1)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L2)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L3)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L4)

SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H1L5)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L1)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L2)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L3)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L4)

SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H2L5)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L1)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L2)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L3)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L4)

SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H3L5)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L1)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L2)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L3)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L4)

SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H4L5)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：20(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L1)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：22(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L2)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：24(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L3)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：26(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L4)

SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：28(本文中稱為hSIRPα.50A.H5L5)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L1)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L2)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L3)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L4)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L5)

SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H1L6)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L1)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L2)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L3)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L4)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L5)

SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H2L6)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L1)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L2)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L3)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L4)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L5)

SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H3L6)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L1)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L2)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L3)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L4)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L5)

SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H4L6)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L1)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L2)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L3)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L4)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L5)

SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H5L6)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：90(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L1)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：92(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L2)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：94(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L3)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：96(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L4)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：98(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L5)

SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：100(本文中稱為hSIRPα.40A.H6L6)。

存在若干可用於在目標抗原上進行抗體抗原決定基定位(mapping)的方法，包括：H/D交換質譜法(H/D-Ex mass spectrometry)、交聯耦合質譜法(crosslinking coupled mass spectrometry)、X射線結晶、肽掃描分析(pepscan analysis)及定點突變誘發。舉例而言，氫氘交換(Hydrogen Deuterium Exchange，HDX)與蛋白水解及質譜法一起可用於測定特定抗原Y上抗體之抗原決定基。當僅在D₂O中及在其抗體存在下培育時，HDX-MS依賴於在不同時間間隔下抗原之氘併入程度之準確量測及比較。氘與暴露區域中之蛋白質醯胺主鏈上之氫交換，而與抗體結合之抗原區域將受到保護且在藉由LC-MS/MS分析蛋白水解片段之後將顯示較少交換或無交換。交聯耦合質譜法藉由使抗體及抗原與經質量標記之化學交聯劑結合而開始。接著使用高質量MALDI偵測確認複合物之存在。因為在交聯後Ab/Ag複合物之化學性質極其穩定，所以可對複合物施加諸多不同的酶及消化條件，提供諸多不同的重疊肽。此等肽之鑑別係使用高解析度質譜法及MS/MS技術進行。交聯肽之鑑別係使用與交聯試劑連接之質量標籤確定。在MS/MS碎片化及資料分析之後，在同一個實驗中確定抗原決定基及互補位(paratope)兩者。

本發明之範疇亦包括經分離抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段(例如人類化抗體)，包含本文所闡述之免疫球蛋白鏈之變異體，其中變異體展現以下特性中之一或多者：以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nm、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nM、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV2蛋白之細胞結合；在50nM、較佳67nM且更佳100nM之抗體濃度下；或者在比抗體對SIRPαV1或SIRPαV2之EC₅₀大10倍、較佳大50倍、更佳大100倍且再更佳大200倍的濃度下，不與SIRPβ1蛋白發生明顯的結合；以<10.0nM、更佳<5.0nM、再更佳<2.5nM且最佳約1.0nM或更小的IC₅₀抑制人類SIRPα與CD47之間的結合；及展現至少79且更佳85%之T20「人類化」。

在其他實施例中，本發明提供結合人類SIRPα(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32具有至少90%序列一致性之V_H域及V_L域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類SIRPα(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32具有至少95%序列一致性之V_H域及V_L域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類SIRPα(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32具有至少97%序列一致性之V_H域及V_L域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類SIRPα(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32具有至少98%序列一致性之V_H域及V_L域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類SIRPα(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104,8、20、22、24、26、28及32具有至少99%序列一致性之V_H域及V_L域的抗體或其抗原結合片段。較佳地，在各情況下，SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32及變異體之間的序列差異由保守取代組成且最佳限於構架殘基內之取代。

以下參考文獻涉及常用於序列分析之BLAST演算法：BLAST演算法：Camacho,C.等人(2009)：BMC Bioinformatics 10：421；Altschul等人(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul,S.F.等人，(1990)J. Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人，(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人，(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人，(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton,J.C.等人，(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock,J.M.等人，(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；比對評分系統：Dayhoff,M.O.等人，「A model of evolutionary change in proteins」.Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，增刊3.M.O.Dayhoff(編)，第345-352頁，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人，「Matrices for detecting distant relationships」.Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)第5卷，增刊3." M.O.Dayhoff(編)，第353-358頁，Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States,D.J.等人，(1991)Methods 3：66-70；Henikoff,S.等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919；Altschul,S.F.等人，(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；比對統計學：Karlin,S.等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin,S.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo,A.等人，(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；及Altschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments」.Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編)，(1997)第1-14頁，Plenum,New York。在本申請案中，一致性百分比比較較佳藉由BLAST演算法進行，其中演算法參數經選擇以在相應參考序列之整個長度內在相應序列之間達成最大匹配(例如預計臨限值：10；字號：6；查詢範圍中之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；間隙成本(gap cost)：存在值(existence)11，延伸值(extension)1；條件成分評分矩陣調整(conditional compositional score matrix adjustment))。

「保守修飾變異體」或「保守取代」係指蛋白質中之胺基酸經具有相似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構形及剛性等)之其他胺基酸取代，使得可時常進行該等變化，而不改變蛋白質之生物活性。熟習此項技術者認識到，一般而言，多肽之非必需區域中之單個胺基酸取代不會實質上改變生物活性(參見例如Watson等人，(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結構上或功能上相似之胺基酸之取代不大可能破壞生物活性。例示性保守取代闡述於下表1中。

本發明亦涵蓋本發明抗體之功能保守變異體。如本文所用，「功能保守變異體」係指一或多個胺基酸殘基已改變，但不改變所要的特性，諸如抗原親和力及/或特異性之抗體或片段。此類變異體包括但不限於一個胺基酸經具有相似特性之胺基酸替換，諸如表1之保守胺基酸取代。亦提供包含本發明抗-SIRPα抗體之V_L域的經分離多肽(例如SEQ ID NO：76、90、92、94、96、98、100、8、20、22、24、26、28及32)，及包含本發明抗-SIRPα抗體之V_H域的經分離多肽(例如SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、7、10、12、14、16、18及30)，其具有多達0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個胺基酸取代，且較佳保守取代。

本發明進一步包含編碼本發明之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段之多肽或免疫球蛋白鏈中之任一者的聚核苷酸。舉例而言，本發明包括編碼以下中之任一者中所述之胺基酸的聚核苷酸：SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、102、7、10、12、14、16、18及30；及SEQ ID NO：76、90、92、94、96、98、100、104、8、20、22、24、26、28及32。

在一個實施例中，提供編碼本文所闡述之經分離抗體或抗原結合片段之多肽鏈的經分離聚核苷酸，例如DNA。在一個實施例中，經分離聚核苷酸編碼包含至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白輕鏈可變(VL)域及/或至少一個根據本發明之成熟免疫球蛋白重鏈可變(VH)域的抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，經分離聚核苷酸編碼單一聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈，且在其他實施例中，編碼分開的聚核苷酸分子上之輕鏈及重鏈。在另一實施例中，聚核苷酸進一步編碼信號序列。

本發明亦提供包含本發明之經分離聚核苷酸的載體，例如表現載體，諸如質體，其中聚核苷酸可操作地連接於控制序列，當用載體轉染宿主細胞時，宿主細胞可識別該等控制序列。亦提供包含本發明之載體的宿主細胞及產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段或多肽的方法，該等方法包含在培養基中培養具有編碼抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之表現載體或核酸的宿主細胞，且從宿主細胞或培養基分離抗原或其抗原結合片段。

結合親和力

舉例而言而非限制，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以10×10^-9M或更低的K_D值二價結合人類SIRPα，該K_D值如藉由表面電漿子共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或生物層干涉法(OCTET))測定。在一個實施例中，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以約5-10×10^-9M之K_D值結合人類SIRPα或二價結合，該K_D值如藉由表面電漿子共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定。親和力按照K_D=k_off/k_on(k_off係解離速率常數，K_on係結合速率常數且K_D係平衡常數)計算。可藉由在多種濃度(c)下量測經標記之配位體之結合分數(r)來測定平衡時的親和力。資料使用史卡查方程式(Scatchard equation)：r/c=K(n-r)作圖：其中r=平衡時所結合的配位體莫耳數/受體莫耳數；c=平衡時之游離配位體濃度；K=平衡結合常數；且n=每個受體分子之配位體結合位點數目。藉由圖形分析，在Y軸上標繪r/c且在X軸上標繪r，從而產生史卡查曲線。在此項技術中熟知藉由史卡查分析進行抗體親和力量測。參見例如van Erp等人，J.Immunoassay 12：425-43,1991；Nelson及Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27：65-8,1988。

人類化

出於本文件之目的，「人類化」係使用T20評分分析儀定量單株抗體之可變區之人類化來量測，如Gao SH,Huang K,Tu H,Adler AS.Monoclonal antibody humanness score and its applications.BMC Biotechnology.2013：13：55.doi：10.1186/1472-6750-13-55中所述。

提供基於網路之工具，使用T20截止人類資料庫：http：//abAnalyzer.lakepharma.com計算抗體序列之T20評分。在計算T20評分之過程中，首先給輸入VH、VK或VL可變區蛋白質序列分配Kabat編號，且鑑別CDR殘基。使用blastp蛋白質-蛋白質BLAST演算法比較全長序列或僅構架序列(已移除CDR殘基)與相應抗體資料庫中之每一個序列。分離各成對比較之間的序列一致性，且在分析完資料庫中之每一個序列之後，基於與輸入序列之序列一致性將序列從高到低排序。對前20個匹配序列之一致性百分比取平均，獲得T20評分。

關於「所有人類資料庫(All Human Databases)」中之各鏈類型(VH、VK、VL)及序列長度(全長或僅構架)，使用T20評分分析儀用各抗體序列之相應資料庫對其進行評分。在排除輸入序列本身之後獲得前20個匹配序列之T20評分(因為序列1始終是輸入抗體本身，所以對序列2至21之一致性百分比取平均)。將各組之T20評分從高到低排序。對於大部分序列而言，評分之減小大致上是線性的；然而，對於抗體之後約15%而言，T20評分開始急劇減小。因此，移除序列之後15%且剩餘序列形成T20截止人類資料庫，其中T20評分截止值指示新資料庫中序列之最低T20評分。

如本文所用，「人類」抗體係具有至少79%且更佳至少85%之T20人類化評分的抗體。

抗-hSIRPα抗體阻斷與CD47結合之能力

在一些實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段能夠阻斷人類SIRPα與人類CD47之結合。阻斷人類SIRPα與人類CD47結合之能力可以使用此項技術中已知之任何方法確定。在一個實施例中，抗體阻斷人類SIRPα與人類CD47結合之能力係使用ELISA分析確定。

製造抗體及其抗原結合片段之方法

因此，本發明包括用於製造本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段的方法，其包含將表現抗體或片段之融合瘤細胞在有利於此類表現之條件下培養，且視情況從融合瘤及/或生長培養基(例如細胞培養基)分離抗體或片段。

本文所揭示之抗-SIRPα抗體亦可以重組方式產生(例如在大腸桿菌/T7表現系統、哺乳動物細胞表現系統或低級真核生物表現系統中)。在此實施例中，編碼本發明之抗體免疫球蛋白分子(例如V_H或V_L)的核酸可以插入基於pET之質體中且在大腸桿菌/T7系統中表現。舉例而言，本發明包括用於在宿主細胞(例如細菌宿主細胞，諸如大腸桿菌，諸如BL21或BL21DE3)中表現抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈的方法，其包含在亦包括編碼可操作地連接於T7啟動子之免疫球蛋白鏈之聚核苷酸的細胞中表現T7 RNA聚合酶。舉例而言，在本發明之一個實施例中，細菌宿主細胞，諸如大腸桿菌，包括編碼可操作地連接於lac啟動子之T7 RNA 聚合酶基因的聚核苷酸，且聚合酶及鏈之表現藉由宿主細胞與異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)一起培育來誘導。

存在若干產生重組抗體之方法，其為此項技術中已知的。重組產生抗體之方法的一個實例揭示於美國專利第4,816,567號中。

轉形可藉由任何已知用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術中熟知的，且包括聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸封裝在脂質體中、基因槍注射(biolistic injection)及DNA直接顯微注射至細胞核中。此外，核酸分子可藉由病毒載體引入哺乳動物細胞中。細胞轉形方法為此項技術中熟知的。參見例如美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號及第4,959,455號。

因此，本發明包括用於製造本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈的重組方法，其包含引入編碼抗體或片段之一或多個免疫球蛋白鏈(例如重鏈及/或輕鏈免疫球蛋白鏈)的聚核苷酸；在有利於此類表現之條件下培養宿主細胞(例如CHO或畢赤酵母(Pichia)或甲醇酵母)；及視情況從宿主細胞及/或宿主細胞所生長之培養基分離抗體或片段或鏈。

抗-SIRPα抗體亦可藉由美國專利第6,331,415號中所闡述之任何方法合成。

包括哺乳動物細胞在內的真核及原核宿主細胞作為用於表現本文所揭示之抗體或片段或免疫球蛋白鏈之宿主為此項技術中熟知的，且包括許多可從美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)獲得之永生化細胞株。此等細胞株尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(baby hamster kidney，BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及許多其他細胞株。哺乳動物宿主細胞包括人類、小鼠、大鼠、犬、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠細胞。尤其較佳之細胞株經由判定哪些細胞株具有高表現量來選擇。可使用之其他細胞株係昆蟲細胞株，諸如Sf9細胞、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包括酵母及絲狀真菌細胞，包括例如甲醇酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、考拉姆畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta)(甲醇誘導型酵母(Ogataea minuta)、林氏畢赤酵母(Pichia lindneri))、仙人掌畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、松櫟畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普氏畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬(Pichia sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母屬(Saccharomyces sp.)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麴菌(Aspergillus niger)、米麴菌(Aspergillus oryzae)、里氏木菌(Trichoderma reesei)、金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮刀菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、鐮孢黴(Fusarium venenatum)、小立碗蘚 (Physcomitrella patens)及粗厚神經胞子菌(Neurospora crassa)、畢赤酵母屬，任何酵母屬、多形漢遜酵母、任何克魯維酵母屬、白色念珠菌、任何麴菌屬(Aspergillus sp.)、里氏木菌、金孢子菌、任何鐮刀菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及粗厚神經胞子菌。當編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、及/或輕鏈或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養一段時間來產生抗體，這段時間足以實現抗體或片段或鏈在宿主細胞中表現或分泌至宿主細胞所生長之培養基中。

抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈可使用標準蛋白質純化方法從培養基回收。此外，可使用許多已知技術增強本發明之抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈(或來自其之其他部分)自產生細胞株之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)係用於增強在某些條件下表現的常用方法。GS系統整體或部分地結合歐洲專利第0216846號、第0256055號及第0323997號及第0338841號論述。因此，在本發明之一實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺酸合成酶基因且不存在麩醯胺酸之情況下在培養基中生長，然而其中，編碼免疫球蛋白鏈之聚核苷酸包含麩醯胺酸合成酶基因來彌補宿主細胞中該基因之缺乏。

本發明包括用於純化本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段的方法，其包含將包含抗體或片段之樣品引入純化培養基(例如陽離子交換培養基、陰離子交換培養基、疏水性交換培養基、親和純化培養基(例如蛋白質-A、蛋白質-G、蛋白質-A/G、蛋白質-L))且從該樣品之不與培養基結合之流過部分收集純化抗體或片段；或丟棄流過部分且從培養基溶離已結合的抗體或片段且收集溶離液。在本發明之一實施例中，培養基在施加樣品之管柱中。在本發明之一實施例中，純化方法係在抗體或片段在宿主細胞中重組表現之後進行，例如其中首先溶解宿主細胞，且視情況在培養基上純化之前，純化溶解產物去掉不溶材料。

一般而言，在特定細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白將具有為細胞株或轉殖基因動物中產生之糖蛋白所特有的糖基化模式。因此，抗體之特定糖基化模式將視用於產生抗體之特定細胞株或轉殖基因動物而定。然而，由本文中提供之核酸分子編碼或包含本文提供之胺基酸序列的所有抗體構成本發明，與抗體可具有之糖基化模式無關。類似地，在特定實施例中，具有僅包含非海藻糖基化N-聚糖之糖基化模式之抗體可為有利的，因為已證明此等抗體通常在活體外及活體內展現比其海藻糖基化對應物更有效之功效(參見例如Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。此等具有非海藻糖基化N-聚糖之抗體不可能具有免疫原性，因為其碳水化合物結構係人類血清IgG中存在之群體之正常組分。

本發明包括對SIRPα及另一抗原具有結合特異性的雙特異性及雙功能抗體及抗原結合片段及其使用方法，另一抗原諸如CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD117、CD123、c-Met、CEA、EGFR、EpCAM、HER2、HER3、PSMA、PTHR2、間皮素(mesothelin)、PD-1、PD-L1、TIM3。雙特異性或雙功能抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點的人工混合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法產生，包括融合瘤的融合或Fab'片段的連接。參見例如Songsivilai等人，(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，(1992)J Immunol.148：1547-1553。此外，雙特異性抗體可形成為「雙功能抗體」(Holliger等人，(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或「Janusins」(Traunecker等人，(1991)EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人，(1992)Int.J.Cancer Suppl.7：51-52)。包括「杜氏抗體」，其係具有正常IgG結構之雙特異性抗體(Labrijn等人，2013,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(13)：5145-5150)。

本發明進一步包括本文所揭示之抗-SIRPα抗體之抗-SIRPα抗原結合片段。抗體片段包括F(ab)₂片段，其可藉由例如胃蛋白酶對IgG進行酶促裂解而產生。Fab片段可藉由例如用二硫蘇糖醇或巰基乙胺還原F(ab)₂而產生。

免疫球蛋白可視其重鏈恆定域之胺基酸序列而分為不同類別。在一些實施例中，不同恆定域可附接至來源於本文所提供之CDR之人類化V_L及V_H區。存在至少五種主要類別的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。本發明包含此等類別或子類之抗體中之任一者之抗體及抗原結合片段。

在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含重鏈恆定區，例如人類恆定區，諸如γ1、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變異體。在另一實施例中，抗體或抗原結合片段包含輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區，諸如λ或κ人類輕鏈區或其變異體。舉例而言而非限制，人類重鏈恆定區可為γ4，且人類輕鏈恆定區可為κ。在一個替代性實施例中，抗體之Fc區係具有Ser228Pro突變之γ4(Schuurman,J等人，Mol.Immunol.38：1-8,2001)。

在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含IgG1亞型之重鏈恆定區。在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含IgG2亞型之重鏈恆定區。在一個實施例中，抗體或抗原結合片段包含IgG4亞型之重鏈恆定區。

抗體工程改造

進一步包括這樣的實施例，其中抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段係經工程改造之抗體，以在抗體之可變域內包括對構架殘基之修飾，例如以改良抗體或片段之特性。通常，進行此類構架修飾以降低抗體或片段之免疫原性。此通常藉由以下實現：將親本(例如嚙齒動物)抗體或片段中之可變域中之非CDR殘基(亦即構架殘基)替換為來自待使用抗體之物種之免疫組庫(immune repertoire)之類似殘基，例如在人類治療劑之情況下係人類殘基。此類抗體或片段稱為「人類化」抗體或片段。在一些情況下，需要增加經工程改造之(例如人類化)抗體之親和力或改變其特異性。一種方法係使一或多個構架殘基突變為相應生殖系序列。更特定言之，已經歷體細胞突變之抗體或片段可含有不同於抗體所來源之生殖系序列的構架殘基。此類殘基可藉由比較抗體或片段構架序列與抗體或片段所來源於之生殖系序列來鑑別。另一方法係在經工程改造之(例如人類化)抗體之一或多個位置處回到初始親本(例如嚙齒動物)殘基，例如恢復已在構架殘基替換過程中消失的結合親和力。(參見例如美國專利第5,693,762號、美國專利第5,585,089號及美國專利第5,530,101號)。

在某些實施例中，抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段經工程改造(例如人類化)以在構架及/或CDR中包括修飾來改良其特性。此類工程改造改變可以基於分子模型化。可構築親本(非人類)抗體序列之可變區的分子模型以瞭解抗體之結構特徵且用於鑑別抗體上可與抗原相互作用之潛在區域。習知CDR係基於免疫球蛋白序列之比對與鑑別可變區。Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest；Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,MD；第5版；NIH公開案第91-3242號；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人，(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616。Chothia及同事仔細檢查抗體晶體結構中環之構形且提出高變環。Chothia等人，(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883。歸類為「CDR」及「高變環」之區域之間存在變化。後期研究(Raghunathan等人，(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析了若干抗體-抗原晶體複合物且觀察到抗體中之抗原結合區不一定嚴格地與「CDR」殘基或「高變」環一致。非人類抗體之可變區的分子模型可用於引導可潛在結合於抗原之區域的選擇。實際上，基於模型之潛在抗原結合區不同於習知「CDR」或「高變」環。關於分子模型化，可以使用商業科學軟體，諸如Discovery Studio(BIOVIA，Dassault Systems)。人類構架可基於構架中及CDR中與非人類序列之最佳匹配來選擇。關於VH中之FR4(構架4)，將人類生殖系之VJ區與對應非人類區域相比較。在VL中之FR4(構架4)之情況下，將人類生殖系序列之J-κ及J-λ區與對應非人類區域相比較。在鑑別到適合人類構架之後，將CDR移植至所選人類構架中。在一些情況下，可以保留VL-VH界面處之某些殘基，如在非人類(親本)序列中。分子模型亦可用於鑑別可潛在地改變CDR構形且由此改變與抗原之結合的殘基。在一些情況下，保留此等殘基，如在非人類(親本)序列中。分子模型亦可用於鑑別暴露於溶劑之可引起諸如糖基化、去醯胺及氧化之不必要作用的胺基酸。可在設計階段較早引入可展性過濾器以消除/最小化此等潛在問題。

另一類型的構架修飾包括使構架區內或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞抗原決定基，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱為「去免疫」，且進一步詳細地描述於美國專利第7,125,689號中。

在特定實施例中，需要將某些含有暴露側鏈之胺基酸變成另一胺基酸殘基，以提供最終抗體之較高化學穩定性，以避免去醯胺或異構化。天冬醯胺之去醯胺可在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或QS序列上進行，且產生異天冬胺酸殘基，該殘基將扭結(kink)引入多肽鏈中且降低其穩定性(異天冬胺酸效應)。異構化可在DG、DS、DA或DT序列進行。在某些實施例中，本發明之抗體不含去醯胺或天冬醯胺異構位點。

舉例而言，天冬醯胺(Asn)殘基可變成Gln或Ala以降低在任何Asn-Gly序列處，尤其在CDR內形成異天冬胺酸鹽之可能性。在Asp-Gly序列處可能出現類似問題。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。異天冬胺酸鹽形成可減弱或完全消除抗體與其目標抗原之結合。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731,734。在一個實施例中，天冬醯胺變成麩醯胺酸(Gln)。亦可能需要改變與天冬醯胺(Asn)或麩醯胺酸(Gln)殘基相鄰之胺基酸以減小去醯胺之可能性，當小型胺基酸與天冬醯胺或麩醯胺酸相鄰出現時，去醯胺以較大速率發生。參見Bischoff及Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，CDR中任何甲硫胺酸殘基(通常為暴露於溶劑之Met)可改成Lys、Leu、Ala或Phe或其他胺基酸以減小甲硫胺酸之硫氧化之可能性，硫氧化會降低抗原結合親和力且亦有助於最終抗體製備中之分子異質性。同上。另外，為防止或最小化潛在易切斷之Asn-Pro肽鍵，可能需要將在CDR中發現之任何Asn-Pro組合改成Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。具有此類取代之抗體隨後進行篩選以確保取代不會將抗體對SIRPα之親和力或特異性或其他所需生物活性降低至不可接受之程度。

另一類型之構架修飾包括使構架區內之一或多個殘基突變以防止聚集。抗體聚集之風險可以使用空間聚集傾向(spatial aggregation propensity)評定，參見Chennamsetty,N等人(2010)J.Phys.Chem.114,6614-6624。該方法要求計算各原子之溶劑可接觸面積(Solvent Accessible Area，SAA)。隨後按照所有原子評分之總和計算分子聚集評分。關於指定半徑及大小之分子，此大致指示其整體聚集趨勢。將具有高聚集評分之殘基替換為具有較低評分之殘基(例如親水性較大之胺基酸)。

Fc區之抗體工程改造

本文所揭示之抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段亦可經工程改造以在Fc區內包括修飾，通常用以改變抗體之一或多種特性，諸如血清半衰期、補體固定(complement fixation)、Fc受體結合及/或效應功能(例如抗原依賴性細胞性細胞毒性)。此外，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段可經化學修飾(例如一或多個化學部分可附接至抗體)或經修飾以改變其糖基化，同樣用以改變抗體或片段之一或多種特性。此等實施例各自進一步詳細描述於下文中。Fc區中之殘基編號為Kabat之EU索引之編號。

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段亦包括具有經修飾(或經阻斷)之Fc區以提供經改變之效應功能的抗體及片段。參見例如美國專利第5,624,821號；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。此類修飾可用於增強或抑制免疫系統之各種反應，在診斷及療法中可能具有有利作用。Fc區之改變包括胺基酸變化(取代、缺失及插入)、糖基化或去糖基化及添加多個Fc區。Fc之改變亦可改變治療抗體中抗體之半衰期，實現不太頻繁之給藥且由此增加便利性且減少材料之使用。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731,734-35。

在一個實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段係在對應於重鏈恆定區之鉸鏈區中之位置228的位置包含絲胺酸至脯胺酸突變的IgG4同型抗體或片段(S228P；EU索引；SEQ ID NO：66)。已報導此突變可消除鉸鏈區中之重鏈間二硫橋鍵的不均一性(Angal等人(1993).Mol.Immunol.30：105-108；位置241係基於Kabat編號系統)。

在本發明之一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以使得鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目增加或減少。此方法進一步詳細描述於美國專利第5,677,425號中。改變CH1之鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數目以例如促進輕鏈及重鏈之組裝或提高或降低抗體之穩定性。

在另一實施例中，使本發明之抗體或抗原結合片段之Fc鉸鏈區突變以減小抗體或片段之生物半衰期。更特定言之，將一或多個胺基酸突變引入Fc鉸鏈片段之CH2-CH3域界面區域中，使得抗體或片段對葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcyl protein A，SpA)的結合相對於原生Fc鉸鏈域SpA結合而言減弱。此方法進一步詳細描述於美國專利第6,165,745號中。

在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段經修飾以增加其生物半衰期。多種方法係可能的。舉例而言，可引入以下突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利第6,277,375號中所述。或者，為了增加生物半衰期，可以在CH1或CL區內改變抗體以包含取自IgG之Fc區之CH2域的兩個環的救助受體(salvage receptor)結合抗原決定基，如美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。

在其他實施例中，藉由將至少一個胺基酸殘基替換為不同胺基酸殘基而改變Fc區以改變抗體或抗原結合片段之效應功能。舉例而言，可將選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之一或多個胺基酸用不同胺基酸殘基替換，使得抗體對效應配位體之親和力改變且保留親本抗體之抗原結合能力。親和力改變之效應配位體可為例如Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細地描述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。

在另一實例中，可將選自胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸用不同胺基酸殘基替換，使得抗體具有改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(complement dependent cytotoxicity，CDC)。此方法進一步詳細描述於美國專利第6,194,551號中。

在另一實例中，改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體之能力。此方法進一步描述於PCT公開案WO 94/29351中。

本發明之蛋白質，較佳係抗體且最佳係IgG抗體或其片段，可以具有改變的(例如相對於未修飾抗體而言)FcγR結合特性(結合特性之實例包括但不限於結合特異性、平衡解離常數(K_D)、解離速率及結合速率(分別係k_off及k_on)、結合親和力及/或親合力(avidity))且某些改變係較為期望的或不太期望的。此項技術中已知，平衡解離常數(K_D)定義為k_off/k_on，且K_a係K_D之倒數。

Fc區對其配位體之親和力及結合特性可以藉由此項技術中已知用於測定Fc-FcγR相互作用、亦即Fc區與FcγR之特異性結合的多種活體外分析方法(基於生化或免疫之分析)測定，包括但不限於平衡法(例如酶聯結免疫吸附劑分析(enzyme-linked immuno absorbent assay，ELISA)或放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA))，或動力學(例如BIACORE®、Octet®或KinExa®分析)，及其他方法，諸如間接結合分析、競爭性抑制分析、螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)、凝膠電泳及層析(例如凝膠過濾)。此等及其他方法可利用所檢驗之組分中一或多者上的標記及/或採用多種偵測方法，包括但不限於發色、螢光、發光或同位素標記。

在某些實施例中，本發明之蛋白質與選自由FcγRI、FcγRIIB、FcγRIIC、FcγRIIIA-F158及FcγRIIIA-V158組成之群的一或多種人類FcγR以比具有野生型人類IgG1重鏈恆定域(SEQ ID NO：119)Fc區或野生型人類IgG4重鏈恆定域(SEQ ID NO：66)Fc區之等效蛋白質小至少10倍、較佳至少30倍且更佳至少100倍的親和力結合。

在各種實施例中，本發明之蛋白質包含免疫球蛋白Fc區，其包含免疫球蛋白C2區及免疫球蛋白C3區及免疫球蛋白鉸鏈區。舉例而言，免疫球蛋白Fc區可為IgG Fc區、IgE Fc區或IgA Fc區。在某些較佳實施例中，蛋白質包含兩個免疫球蛋白Fc區，各免疫球蛋白Fc區包含免疫球蛋白C2區及免疫球蛋白C3區及免疫球蛋白鉸鏈區，其中免疫球蛋白Fc區中之一者之鉸鏈區與另一免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區結合形成二聚Fc結構。此類蛋白質最佳係人類或人類化IgG蛋白質。

在某些實施例中，本發明之蛋白質包含突變型IgG4 Fc區，且蛋白質較佳係包含兩個突變型IgG4 Fc區形成二聚Fc結構之IgG。舉例而言，突變型IgG4 Fc區可以包含表3中所列舉之突變或突變組合中之一者。此表中提及之恆定區之編號系統係如Kabat等人(1991,NIH公開案91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所闡述之EU索引的編號系統。在表中，第一個字母及編號表示未修飾之胺基酸及其位置且第二個字母表示在該位置之經取代之胺基酸。關於包括超過一個突變之組合的彼等條目，組合中之各突變由「/」隔開。

在某些實施例中，本發明之蛋白質包含突變型IgG1 Fc區，且蛋白質較佳係包含兩個突變型IgG1 Fc區形成二聚Fc結構的IgG。舉例而言，突變型IgG1 Fc區可以包含表4中所列舉之突變中之一者。此表中提及之恆定區之編號系統係如Kabat等人(1991,NIH公開案91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所闡述之EU索引的編號系統。在表中，第一個字母及編號表示未修飾之胺基酸及其位置且第二個字母表示在該位置之經取代之胺基酸。

在某些實施例中，突變型IgG1 Fc區可以包含表5中所列舉之突變組合中之一者。此表中提及之恆定區之編號系統係如Kabat等人(1991,NIH公開案91-3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所闡述之EU索引的編號系統。在表中，第一個字母及編號表示未修飾之胺基酸及其位置且第二個字母表示在該位置之經取代之胺基酸。關於超過一個突變之組合中之每一者，組合中之各突變由「/」隔開且缺失由「△」指示。

在某些實施例中，本發明之蛋白質包含野生型或突變型IgG2 Fc區，且蛋白質較佳係包含兩個野生型或突變型IgG2 Fc區形成二聚Fc結構的IgG。突變型IgG2 Fc區可以包含表6中所列舉之突變或突變組合中之一者。此表中提及之恆定區之編號系統係如Kabat等人(1991,NIH公開案91- 3242,National Technical Information Service,Springfield,VA)中所闡述之EU索引的編號系統。在表中，第一個字母及編號表示未修飾之胺基酸及其位置且第二個字母表示在該位置之經取代之胺基酸。關於包括超過一個突變之組合的彼等條目，組合中之各突變由「/」隔開。

具有經修飾之糖基化之抗體的產生

在再一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段包含特定糖基化模式。舉例而言，可製造無海藻糖基化或無糖基化抗體或片段(亦即抗體分別不含海藻糖或糖基化)。可改變抗體或片段之糖基化模式以例如增加抗體或片段對SIRPα抗原之親和力或親合力。此類修飾可藉由例如改變抗體或片段序列內糖基化位點中之一或多者來實現。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代，從而移除一或多個可變區構架糖基化位點，藉此消除該位點之糖基化。此類去糖基化可增加抗體或片段對抗原之親和力或親合力。參見例如美國專利第5,714,350號及第6,350,861號。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段可進一步包括在低級真核生物宿主細胞中產生的彼等，尤其是在真菌宿主細胞中，諸如已經基因工程改造以產生具有哺乳動物或人類樣糖基化模式的糖蛋白的酵母及絲狀真菌(參見例如Choi等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：5022-5027； Hamilton等人，(2003)Science 301：1244-1246；Hamilton等人，(2006)Science 313：1441-1443；Nett等人，Yeast 28(3)：237-52(2011)；Hamilton等人，Curr Opin Biotechnol.18(5)：387-92(2007))。此等經遺傳修飾之宿主細胞優於目前所用之哺乳動物細胞株的具體優勢係控制細胞中產生之糖蛋白之糖基化概況以使得可以產生特定N-聚糖結構佔優勢的糖蛋白組成的能力(參見例如美國專利第7,029,872號及美國專利第7,449,308號)。此等經遺傳修飾之宿主細胞已用於產生主要具有特定N-聚糖結構之抗體(參見例如Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24：210-215)。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段進一步包括在低級真核宿主細胞中產生且包含海藻糖基化及非海藻糖基化混合及複合N-聚糖的彼等抗體及其抗原結合片段，包括二等分(bisected)及多觸角(multiantennary)物種，包括但不限於N-聚糖，諸如GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂；Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂；NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂。

在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段可以包含具有至少一種選自由GlcNAcMan₅GlcNAc₂；GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂；及NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂組成之群的混合N-聚糖的抗體或片段。在特定態樣中，混合N-聚糖係組合物中之主要N-聚糖物種。

在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段包含具有至少一種選自由以下組成之群的複合N-聚糖的抗體及片段：GlcNAcMan₃GlcNAc₂；GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂；NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂； NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；及NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。在特定態樣中，複合N-聚糖係組合物中之主要N-聚糖物種。在其他態樣中，複合N-聚糖係一種特定N-聚糖物質，其在組合物中包含約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%複合N-聚糖。在一個實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段包含複合N-聚糖，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚糖包含結構NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂，其中此類結構無海藻糖基化。此類結構可例如在經工程改造之甲醇酵母宿主細胞中產生。

在特定實施例中，N-聚糖經海藻糖基化。一般而言，海藻糖與N-聚糖還原端之GlcNAc成α1,3-鍵，與N-聚糖還原端之GlcNAc成α1,6-鍵，與N-聚糖非還原端之Gal成α1,2-鍵，與N-聚糖非還原端之GlcNac成α1,3-鍵，或與N-聚糖非還原端之GlcNac成α1,4-鍵。

因此，在以上糖蛋白組合物之特定態樣中，糖型(glycoform)呈α1,3-鍵或α1,6-鍵海藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：Man₅GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAcMan₅GlcNAc₂(Fuc)、Man₃GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAcMan₃GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)及NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)；呈α1,3-鍵或α1,4-鍵海藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：GlcNAc(Fuc)Man₅GlcNAc₂、GlcNAc(Fuc)Man₃GlcNAc₂、GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂(Fuc1- 2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂及NANA₂Gal₂GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂；或呈α1,2-鍵海藻糖形式以產生選自由以下組成之群的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、NANAGal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂及NANA₂Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

在其他態樣中，抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限於Man₈GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂、Man₆GlcNAc₂、Man₅GlcNAc₂、Man₄GlcNAc₂或由Man₃GlcNAc₂ N-聚糖結構組成之N-聚糖。

在上述其他態樣中，複合N-聚糖進一步包括海藻糖基化及非海藻糖基化二等分及多觸角物種。

如本文所用，術語「N-聚糖」及「糖型」可互換使用且係指N連接之寡醣，例如藉由天冬醯胺-N-乙醯葡糖胺鍵附接至多肽之天冬醯胺殘基者。N連接之糖蛋白含有N-乙醯葡糖胺殘基連接於蛋白質中之天冬醯胺殘基之醯胺氮。在糖蛋白上發現之主要糖係葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)及唾液酸(例如N-乙醯基-神經胺酸(N-acetyl-neuraminic acid，NANA))。對於N連接之糖蛋白，糖基團之加工在ER之內腔中與轉譯同時發生，且在轉譯後在高基氏體(Golgi apparatus)中繼續。

N-聚糖具有Man₃GlcNAc₂之常用五碳醣核心(「Man」係指甘露糖；「Glc」係指葡萄糖；且「NAc」係指N-乙醯基；GlcNAc係指N-乙醯葡糖胺)。通常，N-聚糖結構以非還原端在左邊且還原端在右邊來呈現。N-聚糖之還原端為附接至蛋白質上包含糖基化位點之Asn殘基的末端。N-聚糖在包含添加至Man₃GlcNAc₂(「Man3」)核心結構(其亦稱為「三甘露糖核心」、「五碳醣核心」或「寡甘露糖(paucimannose)核心」)之周圍糖(例如GlcNAc、半乳糖、海藻糖及唾液酸)的分枝(觸角)數目方面不同。N-聚糖根據其分枝組分(例如高甘露糖、複合或混合)分類。「高甘露糖」型N-聚糖具有五個或更多個甘露糖殘基。「複合」型N-聚糖通常具有至少一個附接至「三甘露糖」核心之1,3甘露糖臂之GlcNAc及至少一個附接至1,6甘露糖臂之GlcNAc。複合N-聚糖亦可具有視情況經唾液酸或衍生物(例如「NANA」或「NeuAc」，其中「Neu」係指神經胺酸且「Ac」係指乙醯基)修飾之半乳糖(「Gal」)或N-乙醯半乳胺糖(「GalNAc」)殘基。複合N-聚糖亦可具有包含「二等分」GlcNAc及核心海藻糖(「Fuc」)之鏈內取代。複合N-聚糖亦可在「三甘露糖核心」上具有多個觸角，常常稱為「多觸角聚糖」。「混合」N-聚糖在三甘露糖核心之1,3甘露糖臂之末端上具有至少一個GlcNAc且在三甘露糖核心之1,6甘露糖臂上具有零或多個甘露糖。各種N-聚糖亦稱為「糖型」。

關於複合N-聚糖，術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」意謂如下。「G-2」係指可表徵為Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；術語「G-1」係指可表徵為GlcNAcMan₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；術語「G0」係指可表徵為GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；術語「G1」係指可表徵為GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；術語「G2」係指可表徵為Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；術語「A1」係指可表徵為NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構；且術語「A2」係指可表徵為NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂之N-聚糖結構。除非另外指明，否則術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」係指沒有海藻糖附接至N-聚糖還原端之GlcNAc殘基的N-聚糖物種。當術語包括「F」時，「F」指示N-聚糖物種在N-聚糖還原端之GlcNAc殘基上含有海藻糖殘基。舉例而言，G0F、G1F、G2F、A1F及A2F均指示N-聚糖進一步包括海藻糖殘基附接至N-聚糖還原端之GlcNAc殘基。諸如酵母及絲狀真菌之低級真核生物通常不產生可產生海藻糖之N-聚糖。

關於多觸角N-聚糖，術語「多觸角N-聚糖」係指在構成N-聚糖之1,6臂或1,3臂之非還原端的甘露糖殘基上進一步包含GlcNAc殘基或在構成N-聚糖之1,6臂及1,3臂之非還原端的各甘露糖殘基上包含GlcNAc殘基的N-聚糖。因此，多觸角N-聚糖可由式GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂、Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂或NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(2-4)Man₃GlcNAc₂表徵。術語「1-4」係指1、2、3或4個殘基。

關於二等分N-聚糖，術語「二等分N-聚糖」係指GlcNAc殘基連接於N-聚糖還原端之甘露糖殘基的N-聚糖。二等分N-聚糖可由式GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂表徵，其中各甘露糖殘基在其非還原端連接至GlcNAc殘基。相比之下，當多觸角N-聚糖表徵為GlcNAc₃Man₃GlcNAc₂時，該式指示兩個GlcNAc殘基連接於N-聚糖之兩個臂之一的非還原端處的甘露糖殘基，且一個GlcNAc殘基連接於N-聚糖之另一個臂之非還原端處的甘露糖殘基。

在某些實施例中，本發明之蛋白質包含無糖基化Fc區。舉例而言，IgG1 Fc區可以藉由缺失或取代殘基N297而無糖基化。

抗體物理特性

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段可在輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區中進一步含有一或多個糖基化位點。此類糖基化位點可由於抗原結合改變而引起抗體或片段之免疫原性增加或抗體之pK改變(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala及Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列之基元處進行。

各抗體或抗原結合片段將具有獨特的等電點(isoelectric point，pI)，其一般在6與9.5之間的pH範圍內。IgG1抗體之pI通常在7至9.5之pH值範圍內且IgG4抗體之pI通常在6至8之pH值範圍內。

各抗體或抗原結合片段將具有特徵性熔化溫度，且較高的熔化溫度指示較大的活體內整體穩定性(Krishnamurthy R及Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。一般而言，T_M1(初始展開溫度)可超過60℃、超過65℃或超過70℃。抗體或片段之熔點可使用差示掃描熱量測定(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)量測。

在另一實施例中，選擇不會快速降解之抗體及其抗原結合片段。抗體或片段之降解可使用毛細電泳法(capillary electrophoresis，CE)及MALDI-MS(Alexander AJ及Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)量測。

在另一實施例中，選擇具有極小聚集效應之抗體及其抗原結合片段，聚集效應可能會導致觸發不合需要之免疫反應及/或改變的或不利的藥物動力學特性。一般而言，具有25%或更小、20%或更小、15%或更小、10%或更小或5%或更小之聚集的抗體及片段係可接受的。聚集可藉由若干技術量測，包括尺寸排阻管柱(size-exclusion column，SEC)、高效液相層析(high performance liquid chromatography，HPLC)及光散射。

抗體結合物

本文所揭示之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段亦可與化學部分結合。化學部分可尤其為聚合物、放射性核苷酸(radionucleotide)或細胞毒性因子。在特定實施例中，化學部分係增加抗體或片段在個體體內之半衰期的聚合物。適合聚合物包括但不限於親水性聚合物，其包括但不限於聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)(例如分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa之PEG)、聚葡萄糖及單甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol，mPEG)。Lee等人，(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981))揭示PEG結合之單鏈抗體。Wen等人，(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)揭示抗體與附接至放射性金屬螯合劑(二伸乙三胺五乙酸(diethylenetriaminpentaacetic acid，DTPA))之PEG結合。

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段亦可與標記結合，諸如⁹⁹Tc、⁹⁰Y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁵S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th及⁴⁰K、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr及⁵⁶Fe。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段亦可經聚乙二醇化，例如以增加其生物(例如，血清)半衰期。為將抗體或片段聚乙二醇化，通常使抗體或片段與聚乙二醇(PEG)之反應形式，諸如PEG之反應性酯或醛衍生物，在一或多個PEG基團能附接至抗體或抗體片段之條件下反應。在特定實施例中，聚乙二醇化經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應進行。如本文所用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋已用於衍生其他蛋白質之PEG形式中之任一者，諸如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-順丁烯二醯亞胺。在某些實施例中，待聚乙二醇化之抗體或片段係無糖基化之抗體或片段。使蛋白質聚乙二醇化之方法為此項技術中已知的，且可應用於本發明之抗體。參見例如EP 0 154 316及EP 0 401 384。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段亦可與螢光或化學發光標記結合，該等標記包括螢光團，諸如稀土螯合劑、螢光素及其衍生物、若丹明(rhodamine)及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛、螢光胺(fluorescamine)、¹⁵²Eu、丹醯基(dansyl)、繖酮(umbelliferone)、螢光素、魯米諾標記(luminal label)、異魯米諾標記、芳族吖錠酯標記、咪唑標記、吖錠鹽標記、草酸酯標記、水母發光蛋白標記(aequorin label)、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。

本發明之抗體及其抗原結合片段亦可與細胞毒性因子結合，諸如白喉毒素、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白及化合物(例如，脂肪酸)、康乃馨蛋白(dianthin protein)、美洲商陸蛋白(Phytoiacca americana protein)PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)及伊諾黴素(enomycin)。

可以採用此項技術中已知之任何用於結合本發明之抗體及其抗原結合片段與各種部分的方法，包括由Hunter等人，(1962)Nature 144：945；David等人，(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等人，(1981)J.Immunol.Meth.40：219；及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30：407所述之彼等方法。用於結合抗體及片段之方法為此項技術中習知且極熟知。

抗-SIRPα抗體之治療性用途

進一步提供用於治療需要用本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段治療之個體、包括人類個體的方法。在本發明之一個實施例中，此類個體罹患感染或傳染病。

在本發明之另一實施例中，此類個體罹患癌症。在一個實施例中，癌症係例如骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、威爾姆氏癌(Wilm's cancer)、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑素瘤、腎橫紋肌樣瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、神經管胚細胞瘤、星形細胞瘤、退行性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅血球增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌、類癌瘤癌或肝癌、乳癌或胃癌。在本發明之一實施例中，癌症係轉移癌，例如上述種類之轉移癌。

可用本發明之抗體或抗原結合片段、組合物及方法治療的癌症包括但不限於：心臟：肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤及畸胎瘤；肺：支氣管癌(鱗狀細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌)、肺泡(細支氣管)癌瘤、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤錯構瘤(chondromatous hamartoma)、間皮瘤；胃腸：食道(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰臟(導管腺癌、胰島素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌、血管活性腸肽瘤(vipoma))、小腸(腺癌、淋巴瘤、類癌、卡波西氏肉瘤(Karposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)結腸直腸；泌尿生殖道：腎臟(腺癌、威爾姆氏瘤[腎母細胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱及尿道(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺(腺癌、肉瘤)、睪丸(精細胞癌、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎上皮癌、絨膜癌、肉瘤、間質細胞癌瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、腺瘤樣腫瘤、脂肪瘤)；肝：肝細胞瘤(肝細胞癌瘤)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨骼：骨原性肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞瘤脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液性纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤；神經系統：頭骨(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃瘤、畸形性骨炎)、腦膜(腦膜瘤、脊膜肉瘤、神經膠質過多)、腦(星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、胚細胞瘤[松果體瘤]、多形性神經膠母細胞瘤、少突神經膠質瘤、神經鞘瘤、視網膜母細胞瘤、先天性腫瘤)、脊髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；婦科：子宮(子宮內膜癌瘤)、子宮頸(子宮頸癌、腫瘤前子宮頸發育不良)、卵巢(卵巢癌[漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌、未分類的癌瘤]、粒層泡膜細胞瘤(granulosa thecal cell tumor)、塞特利氏-雷迪格細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰(鱗狀細胞癌、上皮內癌瘤、腺癌、纖維肉瘤、黑素瘤)、陰道(透明細胞癌瘤、鱗狀細胞癌、葡萄樣肉瘤(胚胎性橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌瘤)、乳房；血液學：血液(骨髓白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增生性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤[惡性淋巴瘤]；皮膚：惡性黑素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、痣發育不良痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕瘤、牛皮癬；及腎上腺：神經母細胞瘤。因此，如本文中所提供之術語「癌細胞」包括受以上鑑別之病狀中任一者折磨之細胞。

在一個實施例中，可用本發明之本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、組合物及方法治療的癌症包括但不限於：乳癌、胃癌、食道癌、胃食管連接部癌瘤(gastroesophageal junction carcinoma)、結腸直腸癌、頭頸癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、神經母細胞瘤、膀胱癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、肺癌、鱗狀細胞癌、黑素瘤、胰臟癌、前列腺癌、小細胞肺癌、腎癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、多形性膠質母細胞瘤、輸卵管癌、腹膜癌、血管肉瘤、肝細胞癌瘤、絨膜癌、軟組織肉瘤、慢性淋巴球性白血病、慢性髓細胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞非霍奇金氏淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、骨髓發育不良症候群、急性髓細胞性白血病、T細胞淋巴瘤、自然殺手細胞淋巴瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、急性淋巴細胞性白血病、多發性骨髓瘤。

在一個實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可用於治療感染及傳染病。如本文所用，術語「感染」係指生物體(亦即個體)之至少一個細胞被感染物感染的任何病況(例如，個體具有細胞內病原體感染，例如慢性細胞內病原體感染)。如本文所用，術語「感染物」係指在經感染生物體之至少一個細胞中誘導CD47表現(例如增加CD47表現)之外來生物性實體(亦即病原體)。舉例而言，感染物包括但不限於細菌、病毒、原生動物及真菌。

細胞內病原體尤其受關注。傳染病係由感染物引起之病症。一些感染物在某些條件下不引起可辨識的症狀或疾病，但是具有在改變之條件下引起症狀或疾病的可能性。本發明方法可用於治療慢性病原體感染，例如包括但不限於病毒感染，例如反轉錄病毒、慢病毒、嗜肝DNA病毒(hepadna virus)、疱疹病毒、痘病毒、人類乳頭狀瘤病毒等；細胞內細菌感染，例如分枝桿菌屬(Mycobacterium)、嗜衣體屬(Chlamydophila)、艾利希體屬(Ehrlichia)、立克次體屬(Rickettsia)、布氏桿菌屬(BruceIla)、退伍軍人桿菌屬(Legionella)、弗朗西斯氏菌屬(Francisella)、李斯特菌屬(Listeria)、考克斯氏體屬(Coxiella)、奈瑟氏菌屬(Neisseria)、沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia sp)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)等；及細胞內原生動物病原體，例如瘧原蟲屬(Plasmodium sp)、錐蟲屬(Trypanosoma sp.)、梨形鞭毛蟲屬(Giardia sp.)、弓形體屬(Toxoplasma sp.)、利什曼原蟲屬(Leishmania sp.)等。

在一個實施例中，本發明提供使用本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段治療個體的方法，其中個體罹患病毒感染。在一個實施例中，病毒感染係經選自由以下組成之群的病毒感染：人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、肝炎病毒(A、B或C)、疱疹病毒(例如VZV、HSV-I、HAV-6、HSV-II及CMV、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、黃病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、科沙奇病毒(coxsackie virus)、冠形病毒、呼吸道融合性病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒(rubella virus)、小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭狀瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒腦炎病毒(arboviral encephalitis virus)。

在一個實施例中，本發明提供使用本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段治療個體的方法，其中個體罹患細菌感染。在一個實施例中，細菌感染係經選自由以下組成之群的細菌感染：衣原體(Chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄狀球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假單胞菌(pseudomonas)、退伍軍人桿菌、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門氏菌、桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)、麻風分支桿菌(Mycobacterium leprae)、彌漫型麻風分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及包柔體屬(Borriella)。

在一個實施例中，本發明提供使用本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段治療個體的方法，其中個體罹患真菌感染。在一個實施例中，真菌感染係經選自由以下組成之群的真菌感染：念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、麴菌屬(Aspergillus)(薰煙色麴菌(fumigatus)、黑麴菌(niger)等)、毛黴屬(Genus Mucorales)(白黴菌屬(mucor)、犁頭黴屬(absidia)、根黴菌屬(rhizopus))、申克氏胞絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。

在一個實施例中，本發明提供使用本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段治療個體的方法，其中個體罹患寄生蟲感染。在一個實施例中，寄生蟲感染係經選自由以下組成之群的寄生蟲感染：溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福勒氏耐格里原蟲(Naegleria fowleri)、棘阿米巴蟲屬(Acanthamoeba)、蘭比亞梨形鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)、肺炎肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、微小巴倍蟲(Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)及巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。

「個體」可為哺乳動物，諸如人類、犬、貓、馬、牛、小鼠、大鼠、猴(例如獼猴，例如食蟹猴(Macaca fascicularis))或兔。在本發明之較佳實施例中，個體係人類個體。

術語「與……聯合(in association with)」指示在本發明方法中投與之組分(例如抗-SIRPα抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段)與抗癌劑一起可以調配成用於同時遞送的單一組合物或分別調配成兩種或更多種組合物(例如套組)。各組分可以在與投與另一組分時不同的時間向個體投與；舉例而言，各投藥可以在指定時間段內以若干時間間隔非同時(例如分開或依序)進行。此外，各別組分可藉由相同或不同途徑投與個體。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可以單獨使用，或與其他另外的治療劑及/或治療程序聯合使用，用於治療或預防需要此類治療或預防之個體的任何疾病，諸如癌症，例如如本文所論述。與其他治療劑聯合包含此類抗體及片段的組合物，例如包含醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物，亦為本發明之一部分。

因此，本發明提供一種治療人類個體之癌症的方法，其包含向個體投與有效量的本文所揭示之抗體或抗原結合片段，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。本發明亦提供一種治療人類個體之感染或傳染病的方法，其包含向個體投與有效量的本文所揭示之抗體或抗原結合片段，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。本發明亦提供一種增加免疫細胞之活性的方法，其包含向有需要之個體投與有效量的本文所揭示之抗體或抗原結合片段。在一個實施例中，方法係用於：治療癌症；治療感染或傳染病；或作為疫苗佐劑。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可以單獨使用或與腫瘤疫苗聯合使用。腫瘤疫苗之實例包括但不限於用於人類乳頭狀瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染引起之癌症的疫苗，諸如Gardasil^®、Gardisil9^®及Cervarix^®；預防B型肝炎病毒引起之肝癌的疫苗，諸如Engerix-B^®及Recombivax HB^®；觸發免疫反應之溶瘤病毒療法，諸如Imlygic^®；DNA疫苗，諸如Synchotrope MA2M質體DNA疫苗及ZYC101；乳腺球蛋白-a DNA疫苗(參見Clinical Cancer Res.2014 20(23)：5964-75)；基於載體之疫苗，諸如PSA-TRICOM(prostvac)、PANVAC-VF；基於單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)之疫苗(參見例如Therapeutic Advances in Vaccines,2014,2(5)137-148)；基於李斯特菌之疫苗(表現李斯特菌之一或多種癌症疫苗，諸如李斯特菌-間皮素(例如CRS-207)、ADXS-HPV、Axalimogene Filolisbac、李斯特菌-HER2/Neu、李斯特菌-EGFRvIII)、Adeno-CEA；同種異體疫苗，諸如GVAX、BLP-25(抗-安卡拉-黏蛋白1(anti-Ankara-mucin 1))、貝拉金普(Belagenpumatucel)-L、TG4010、CIMAvax表皮生長因子疫苗、NY-ESO、GM.CD40L-CCL21；自體疫苗，諸如：Adeno-CD40L、BCG、INGN-225；樹突狀細胞疫苗，諸如Provenge^®(Sipuleucel-T)、rF-CEA-MUC1-TRICOM(panvac-DC)；抗原疫苗，諸如MUC-1(stimuvax)、NY-ESO-1、GP-100、MAGE-A3(編碼黑素瘤抗原之基因A3)、INGN-225(參見Pharmacology & Therapeutics 153(2015)1-9)。

吃我信號可藉由如放射線療法或化學治療劑之細胞毒性療法升高，包括但不限於蒽環黴素(anthracycline)(小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))、奧沙利鉑(oxaliplatin)、硼替佐米(bortezomib)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、博萊黴素(bleomycin)、伏立諾他(vorinostat)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿糖胞苷(cytarabine)、潑尼龍(prednisolone)、多西他賽(docetaxel)、絲裂黴素C(mitomycin C)、拓樸替康(topotecan)/喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、唑來膦酸(zoledronic acid)、甲胺喋呤(methotrexate)、依魯替尼(ibrutinib)、阿柏西普(aflibercept)、貝伐單抗(bevacizumab)、托瑞米芬(toremifene)、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、艾德昔布(idelalisib)、巰嘌呤(mercaptopurine)、沙立度胺(thalidomide)、索拉非尼(sorafenib)。因此，在某些實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可以與化學治療劑聯合、與放射線療法等聯合使用。在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可以單獨使用或與靶向療法聯合使用。靶向療法之實例包括：激素療法、信號轉導抑制劑(例如EGFR抑制劑，諸如西妥昔單抗(Erbitux)及埃羅替尼(Tarceva))；CD20抑制劑(例如利妥昔單抗(Rituxan)及奧伐木單抗(ofatumumab)(Arzerra))；CD38抑制劑(例如達雷木單抗(DARZALEX))；CD52抑制劑(例如阿侖單抗(Campath))；HER2抑制劑(例如曲妥珠單抗(Herceptin)及帕妥珠單抗(Perjeta))；BCR-ABL抑制劑(諸如伊馬替尼(imatinib)(Gleevec)及達沙替尼(dasatinib)(Sprycel))；ALK抑制劑(諸如克唑替尼(crizotinib)(Xalkori)及色瑞替尼(ceritinib)(Zykadia))；BRAF抑制劑(諸如維羅非尼(vemurafenib)(Zelboraf)及達拉非尼(dabrafenib)(Tafinlar))、基因表現調節劑(例如地西他濱(decitabine)(Dacogen)及伏立諾他(Zolinza))、細胞凋亡誘導劑(例如硼替佐米(Velcade)及卡非佐米(carfilzomib)(Kyprolis))、血管生成抑制劑(例如貝伐單抗(Avastin)及雷莫蘆單抗(ramucirumab)(Cyramza))、免疫調節性醯亞胺藥物(immunomodulatory imide drug)(例如沙立度胺、來那度胺(lenalidomide)、泊利度胺(pomalidomide)及阿普司特(apremilast))、附接至毒素之單株抗體(例如本妥昔單抗維多汀(Adcetris)及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Kadcyla))。

本文所揭示之抗體或其抗原結合片段較佳可與靶向療法聯合使用，其中抗體用於介導ADCC/ADCP。功能生物分析可用於分析抗體藥物之作用模式及自ADCC區分ADCP作為作用模式。舉例而言，抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)分析通常利用正常人類外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)或其經分離效應細胞。分析變異可藉由使用以下減小：選擇性供體池與規定Fcγ受體IIa(FcγRIIa/CD32a)、IIIa(FcγRIIIa/CD16a)或IIIb(FcγRIIIb/CD16b)基因複製數變異(copy number variation，CNV)或基因型，諸如FcγRIIIa-158 V/V對比V/F或F/F、FcγRIIIa-131 H/H對比H/R或R/R，及FcγRIIIb-NA1及-NA2多形性變體。或者，效應細胞，諸如PBMC、PBMC衍生之自然殺手(NK)細胞、粒細胞、單核球、單核球衍生之巨噬細胞或樹突狀細胞(DC)，可以替換為表現FcγRIIIa之細胞株(例如經工程改造之NK92)。目標細胞之殺死可以藉由以下評定：量測特異性探針從使用⁵¹鉻(Cr⁵¹)或螢光染料預標記之目標細胞之釋放，該等螢光染料諸如鈣黃綠素(calcein)-乙醯氧基甲基(鈣黃綠素-AM)、羧基螢光素丁二醯亞胺基酯(carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)、2',7'-雙-(2-羧乙基)-5-(及-6)-羧基螢光素(BCECF)、銪(Eu)或碘化丙錠(propidium iodide，PI)；或藉由量測諸如乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)之胞溶質酶的釋放或核苷三磷酸(nucleoside triphosphate，ATP)之釋放。

相比之下，抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)可以藉由量測經由粒細胞、單核球、樹突狀細胞或巨噬細胞介導之吞噬作用對目標細胞造成的破壞來評定。ADCP分析使用PBMC衍生之細胞或骨髓細胞株，諸如分化成巨噬細胞或粒細胞之HL-60、THP-1及U937細胞。常用於誘導單核球性細胞株中之巨噬細胞分化之刺激包括佛波醇(phorbol)-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1,25-二羥基維生素D3(VD3)及視黃酸(retinoic acid，RA)。亦已知，RA可誘導例如HL-60細胞之最後粒細胞分化。目標細胞之吞噬作用可以藉由監測效應細胞中特異性探針從經螢光染料及pH敏感的染料預標記之目標細胞的內化來評定，螢光染料諸如細胞增殖染料eFluor450、CFSE，pH敏感的染料包括pHrodo及CypHer5E。吞噬作用係使用流動式細胞測量術或螢光顯微法藉由螢光標記效應細胞之增加量來衡量。「報導基因(reporter gene)」分析亦可用於評定ADCP。為了在報導基因分析中量測ADCP功能，首先藉由相關抗體之滴定培育目標細胞。在抗體結合至其在目標細胞表面上之同源目標之後，添加經工程改造之Jurkat效應細胞。若跟著發生ADCP途徑活化，則Jurkat細胞藉由報導基因NFAT-RE-luc2之表現而產生螢光素酶產物。隨後在添加螢光素酶分析試劑之後，在4-24小時誘導期之後量測螢光素酶活性。基於微量滴定盤之分析中之劑量依賴性反應可用於定量治療性抗體相比於適合參考項目之劑量-反應曲線之相對生物活性。

在特定實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段可以與抗癌治療劑或免疫調節性藥物組合使用，諸如免疫調節性受體抑制劑，例如特異性結合於受體之抗體或其抗原結合片段。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與以下中之一或多者聯合：

TNF受體蛋白之促效劑(例如促效性抗體或其抗原結合片段或可溶性融合物)、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、鐸樣受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CDl la/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a及與CD83特異性結合之配位體；或CD47、PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、CEACAM(例如CEACAM-1、-3及/或-5)、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIRl、IDO、TDO、CD160及/或TGFR β之抑制劑。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與一或多種環二核苷酸或其他STING途徑促效劑聯合。干擾素基因刺激劑(stimulator of interferon genes，STING，亦稱為TMEM173、MITA、 ERIS及MPYS)係侷限於ER之跨膜蛋白，ER響應於環二核苷酸(cyclic dinucleotide，CDN)之直接結合而發生構形改變，引起下游信號級聯，包括TBK1活化、IRF-3磷酸化及IFN-β及其他細胞介素之產生。表現腫瘤駐留型(tumor-resident)宿主抗原之細胞中之STING途徑參與誘導針對腫瘤衍生之抗原的自發性CD8+ T細胞反應。據報導，此途徑之活化及IFN-β之後續產生亦有助於輻射之抗腫瘤作用。STING促效劑及其用途描述於以下各者中，例如US20060040887、US20080286296、US20120041057、US20140205653、WO2014179335、WO 2014179760、US20150056224、WO 2015185565、WO 2016096174、WO 2016145102、WO 2017011444、WO 2017027645、WO 2017027646、WO 2017123657、WO 2017123669、WO 2017175147、WO 2017175156、WO 2018045204、WO 2018009648、WO 2018006652、WO 2018013887、WO 2018013908、US20180002369、US20180092937及US20180093964。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與以下中之一或多者聯合：抗-CD47抗體、抗-PD-1抗體(例如納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、抗-PDL1抗體、抗-TIGIT抗體、抗-APRIL抗體、抗-CTLA4抗體、抗-CS1抗體(例如埃羅妥珠單抗)、抗-KIR2DL1/2/3抗體(例如利瑞路單抗(lirilumab))、抗-CD137抗體(例如烏瑞魯單抗(urelumab))、抗-GITR抗體(例如TRX518)、抗-PD-L1抗體(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗-PD-L2抗體、抗-ILT1抗體、抗-ILT2抗體、抗-ILT3抗體、抗-ILT4抗體、抗-ILT5抗體、抗-ILT6抗體、抗-ILT7抗體、抗-ILT8抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40抗體、抗-ICOS、抗-KIR2DL1抗體、抗-KIR2DL2/3抗體、抗-KIR2DL4抗體、抗-KIR2DL5A抗體、抗-KIR2DL5B抗體、抗-KIR3DL1抗體、抗-KIR3DL2抗體、抗-KIR3DL3抗體、抗-NKG2A抗體、抗-NKG2C抗體、抗-NKG2E抗體、抗-4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗-TSLP抗體、抗-IL-10抗體、IL-10或聚乙二醇化IL-10、或此類目標之任何小有機分子抑制劑。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD20抗體(例如利妥昔單抗、奧伐木單抗、奧克珠單抗(ocrelizumab)、奧濱尤妥珠單抗、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、烏妥昔單抗、維妥珠單抗、替伊莫單抗噻西坦、托西莫單抗(tositumomab)、BVX-20、SCT-400或PRO131921)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD38抗體(例如達雷木單抗、伊薩妥昔單抗或MOR202)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-EGFR抗體(例如西妥昔單抗、CetuGEX、帕尼單抗(panitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、德帕土西珠單抗(depatuxizumab)或AFM-21)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-HER2抗體(例如曲妥珠單抗、TrasGEX、帕妥珠單抗、馬妥昔單抗或ADCT-502)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-HER3抗體(例如盧姆力土珠單抗、帕特里土單抗(patritumab)或LJM716)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD19抗體(例如因厄比利珠單抗、布林莫單抗(blinatumomab)、DI-B4、MDX-1342、MEDI-551、MOR208或4-G7SDIE)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD52抗體(例如阿侖單抗)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-EpCAM抗體(例如阿德木單抗(adecatumumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、依決洛單抗(edrecolomab)或ING-1)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-SLAMF7抗體(例如埃羅妥珠單抗或ABBV-838)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-PD-1抗體(例如納武單抗或派姆單抗)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-PD-L1抗體(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CTLA4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab)或曲美單抗(tremelimumab))聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD137抗體(例如烏瑞魯單抗)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-GITR抗體(例如TRX518或FPA154)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-OX40抗體(例如MEDI6469、MOXR0916或INCAGN1949)聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD40抗體(例如魯卡木單抗(lucatumumab)、達賽圖珠單抗(dacetuzmumab)、APX005M、ChiLob7/4、CP-870,893或JNJ-64457107)聯合。在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CS1抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL1/2/3抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD137(例如烏瑞魯單抗)抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-GITR(例如TRX518)抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-PD-L2抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL1抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL2抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL3抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL4抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL5抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL6抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL7抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ITL8抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-CD40抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-OX40抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL1抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL2/3抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL4抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL5A抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR2DL5B抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL1抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL2抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-KIR3DL3抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-NKG2A抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-NKG2C抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-ICOS抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-4-1BB抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-IL-10抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗-TSLP抗體聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與IL-10或聚乙二醇化IL-10聯合。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與諸如以下之抑制劑(例如小有機分子或抗體或其抗原結合片段)中之一或多者聯合：哺乳動物雷帕黴素目標(mammalian target of rapamycin，MTOR)抑制劑、細胞毒素劑、鉑試劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、微管穩定劑、紫杉烷、CD20抑制劑、CD52抑制劑、CD30抑制劑、核因子 κ-B之受體活化因子(Receptor activator of nuclear factor kappa-B，RANK)抑制劑、核因子κ-B配位體之受體活化因子(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL)抑制劑、ERK抑制劑、MAP激酶抑制劑、AKT抑制劑、MEK抑制劑、PI3K抑制劑、HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、Bcl2抑制劑、CD22抑制劑、CD79b抑制劑、ErbB2抑制劑或法呢基(farnesyl)蛋白質轉移酶抑制劑。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與以下中之任何一或多者聯合：13-順-視黃酸、3-[5-(甲磺醯基哌啶甲基)-吲哚基]-喹啉酮、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、5-脫氧尿苷、5'-脫氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、7-羥基星形孢菌素(7-hydroxystaurosporine)、A-443654、乙酸阿比特龍(abirateroneacetate)、白蛋白結合型紫杉醇(abraxane)、ABT-578、阿考比芬(acolbifene)、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、胺魯米特(aminoglutethimide)、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(Amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、血管生長抑素(angiostatin)、AP-23573、ARQ-197、阿佐昔芬(arzoxifene)、AS-252424、AS-605240、天冬醯胺酶(asparaginase)、AT-9263、阿曲生坦(atrasentan)、阿西替尼(axitinib)、AZD1152、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)疫苗、巴他布林(batabulin)、BC-210、貝索托克(besodutox)、貝伐單抗、比卡魯胺(bicalutamide)、Bio111、BIO140、博萊黴素、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、促鈣三醇(calcitriol)、喜樹鹼、卡奈替尼(canertinib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CC8490、西地尼布(Cediranib)、CG-1521、CG-781、克拉米多辛(chlamydocin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯毒素(chlorotoxin)、西侖吉肽(cilengitide)、西米替丁(cimitidine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯屈膦酸鹽(clodronate)、COL-3、CP-724714、環磷醯胺、環丙孕酮(cyproterone)、乙酸環丙孕酮、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)、達卡巴嗪(dacarbazine)、達諾司他(dacinostat)、放線菌素d(dactinomycin)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、達努塞替(danusertib)、達沙替尼(dasatanib)、道諾黴素、德卡替尼(decatanib)、魚藤素(deguelin)、地尼介白素(denileukin)、脫氧助間型黴素(deoxycoformycin)、縮酚酞(depsipeptide)、二芳基丙腈(diarylpropionitrile)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、迪夫托斯(diftitox)、多西他賽、多韋替尼(dovitinib)、小紅莓、屈洛昔芬(droloxifene)、艾特咔林(edotecarin)、經釔-90標記之艾多替德(edotreotide)、艾多替德、EKB-569、EMD121974、內皮生長抑素(endostatin)、恩雜魯胺(enzalutamide)、恩紮妥林(enzastaurin)、表柔比星、埃博黴素(epithilone)B、ERA-923、Erbitux、埃羅替尼、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依託泊苷、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非那雄安(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟羥甲基睪酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、FOLFOX方案、氟維司群 (Fulvestrant)、加利特隆(galeterone)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉馬替康(gimatecan)、戈舍瑞林(goserelin)、乙酸戈舍瑞林、棉子酚(gossypol)、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羥孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、羥基脲(hydroxyurea)、IC87114、艾達黴素、艾達昔芬(idoxyfene)、異環磷醯胺、IM862、伊馬替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干擾素、介白素-12、伊匹單抗、伊立替康(irinotecan)、JNJ-16241199、酮康唑(ketoconazole)、KRX-0402、沙立度胺、來那度胺、泊利度胺、阿普司特、拉帕替尼(lapatinib)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、乙酸亮丙瑞林、左旋咪唑(levamisole)、脂質體包埋的太平洋紫杉醇、洛莫司汀(lomustine)、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽酮(lucanthone)、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、馬立馬司他(marimastat)、氮芥(mechlorethamine)、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤、美司鈉(mesna)、甲胺喋呤、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、陶紮色替(tozasertib)、MLN8054、新伐司他(neovastat)、來那替尼(Neratinib)、紐拉迪布(neuradiab)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯米德(nilutimide)、諾拉曲特(nolatrexed)、NVP-BEZ235、奧利默森(oblimersen)、奧曲肽(octreotide)、奧伐木單抗、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧特羅那(orteronel)、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕泊昔布(palbociclib)、帕米膦酸鹽(pamidronate)、帕尼單抗、帕佐泮尼(pazopanib)、PD0325901、 PD184352、PEG-干擾素、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、哌立福新(perifosine)、苯丙胺酸氮芥(phenylalaninemustard)、PI-103、皮克立西(pictilisib)、PIK-75、派多西芬(pipendoxifene)、PKI-166、普卡黴素(plicamycin)、卟吩姆(porfimer)、潑尼松(prednisone)、甲基苄肼(procarbazine)、孕激素(progestins)、PX-866、R-763、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲賽(raltitrexed)、拉佐欣(razoxin)、地磷莫司(ridaforolimus)、利妥昔單抗、羅米地辛(romidepsin)、RTA744、魯比替康(rubitecan)、斯克太德(scriptaid)、Sdx102、塞利希布(seliciclib)、司美替尼(selumetinib)、司馬沙尼(semaxanib)、SF1126、西羅莫司(sirolimus)、SN36093、索拉非尼、螺內酯(spironolactone)、角鯊胺(squalamine)、SR13668、鏈脲佐菌素(streptozocin)、SU6668、辛二醯基苯胺異羥肟酸(suberoylanalide hydroxamic acid)、舒尼替尼(sunitinib)、合成雌激素、他侖帕奈(talampanel)、塔里穆尼拉赫帕雷普韋克(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、替西羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、替米利芬(tesmilifene)、睪固酮(testosterone)、漢防己鹼(tetrandrine)、TGX-221、沙立度胺、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、曲美單抗、替吡法尼(tipifarnib)、替沃紮尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、拓樸替康、檸檬酸托瑞米芬、曲貝替定(trabectedin)、曲妥珠單抗、維甲酸(tretinoin)、曲古抑菌素(trichostatin)A、單水合磷酸曲西立濱(triciribinephosphate monohydrate)、雙羥萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、TSE-424、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、丙戊酸(valproic acid)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、凡塔藍尼(vatalanib)、VEGF捕獲劑(VEGF trap)、長春鹼、長春新鹼、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、維他欣(vitaxin)、維特斯潘(vitespan)、伏立諾他、VX-745、渥曼青黴素(wortmannin)、Xr311、紮木單抗(zanolimumab)、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。

適合與本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段組合使用之抗癌劑的非限制性實例包括細胞生長抑制劑、免疫調節性醯亞胺藥物、細胞毒素劑、針對癌症及贅生性疾病之靶向治療劑(小分子、生物製劑、siRNA及微小RNA)，

1)抗代謝物(諸如甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、氟達拉濱、卡培他濱)；

2)烷基化劑，諸如替莫唑胺、環磷醯胺，

3)DNA相互作用及DNA損傷劑，諸如順鉑、奧沙利鉑、小紅莓，

4)電離輻射，諸如放射線療法，

5)拓樸異構酶II抑制劑，諸如依託泊苷、小紅莓，

6)拓樸異構酶I抑制劑，諸如伊立替康、拓樸替康，

7)微管蛋白相互作用劑，諸如太平洋紫杉醇、多西他賽、白蛋白結合型紫杉醇、埃博黴素(epothilones)，

8)驅動蛋白紡錘體蛋白抑制劑，

9)紡錘體檢查點抑制劑，

10)聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，諸如奧拉帕尼(olaparib)、MK-4827及維利帕尼(veliparib)

11)基質金屬蛋白酶(matrix metalloprotease，MMP)抑制劑

12)蛋白酶抑制劑，諸如組織蛋白酶D及組織蛋白酶K抑制劑

13)蛋白體(proteosome)或泛素化抑制劑，諸如硼替佐米，

14)突變體p53之用於恢復其野生型p53活性之活化劑

15)腺病毒-p53

16)Bcl-2抑制劑，諸如ABT-263

17)熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)調節劑，諸如格爾德黴素(geldanamycin)及17-AAG

18)組蛋白脫乙醯基酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑，諸如伏立諾他(SAHA)，

19)性激素調節劑，

a. 抗-雌激素，諸如他莫昔芬、氟維司群，

b. 選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulator，SERM)，諸如雷洛昔芬，

c. 抗-雄激素，諸如比卡魯胺、氟他胺

d. LHRH促效劑，諸如亮丙瑞林，

e. 5α-還原酶抑制劑，諸如非那雄安，

f. 細胞色素P450 C17解離酶(CYP450c17，亦稱為17αC)；

g. 芳香酶抑制劑，諸如來曲唑、阿那曲唑、依西美坦，

20)EGFR激酶抑制劑，諸如吉非替尼(geftinib)、埃羅替尼、拉帕替尼(laptinib)

21)雙重erbB1及erbB2抑制劑，諸如拉帕替尼

22)多靶向激酶(絲胺酸/蘇胺酸及/或酪胺酸激酶)抑制劑，

a. ABL激酶抑制劑，伊馬替尼及尼羅替尼、達沙替尼

b. VEGFR-1、VEGFR-2、PDGFR、KDR、FLT、c-Kit、Tie2、Raf、MEK及ERK抑制劑，諸如舒尼替尼、索拉非尼、凡德他尼、帕佐泮尼、PLX-4032、阿西替尼、PTK787、GSK-1120212

c. Polo樣激酶抑制劑

d. 極光激酶抑制劑

e. JAK抑制劑

f. c-MET激酶抑制劑

g. 週期素依賴性激酶抑制劑，諸如CDK1及CDK2抑制劑迪納昔布(Dinaciclib)SCH 727965(參見Parry等人，Molecular Cancer Therapeutics 9(8)：2344-53(2010))及CDK4/6抑制劑，諸如瑞博昔布(Ribociclib)、帕泊昔布、阿貝馬昔布(Abemaciclib)及曲來昔布(Trilaciclib)。

h. PI3K及mTOR抑制劑，諸如GDC-0941、BEZ-235、BKM-120及AZD-8055

i. 雷帕黴素及其類似物，諸如替西羅莫司、依維莫司及地磷莫司(deforolimus)

23)及其他抗癌(亦已知為抗贅生)劑，包括但不限於阿糖胞苷(ara-C)、阿德力黴素(adriamycin)、賽托克森(cytoxan)、卡鉑、尿嘧啶氮芥、氮芥(Clormethine)、異環磷醯胺(Ifosfsmide)、美法侖、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷(Pipobroman)、三伸乙基三聚氰胺(Triethylenemelamine)、三伸乙基硫代磷胺(Triethylenethiophosphoramine)、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲佐菌素、達卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱、噴司他汀、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、溫諾平(Navelbine)、博萊黴素、放線菌素d、道諾黴素、小紅莓、表柔比星、替尼泊苷、阿糖胞苷、培美曲塞、艾達黴素、光神黴素、脫氧助間型黴素、絲裂黴素-C、L-天冬醯胺酶、替尼泊苷、炔雌醇(Ethinylestradiol)、己烯雌酚、睪固酮、潑尼松、氟羥甲基睪酮、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮、甲潑尼龍、甲基睪固酮、潑尼龍、曲安西龍(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羥孕酮、胺魯米特、雌莫司汀、氟他胺乙酸甲羥孕酮、托瑞米芬、戈舍瑞林、卡鉑、羥基脲、安吖啶、甲基苄肼、米托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、多洛薩芬(Drolloxafine)、六甲三聚氰胺(Hexamethylmelamine)、百克沙(Bexxar)、澤娃靈(Zevalin)、三氧化二砷(Trisenox)、卟吩姆(Profimer)、噻替派、六甲蜜胺、多希(Doxil)、恩塔克(Ontak)、德泊噻(Depocyt)、安然愛思普(Aranesp)、優保津(Neupogen)、紐拉思塔(Neulasta)、帕利夫明(Kepivance)。

24)法呢基蛋白質轉移酶抑制劑，諸如SARASAR^TM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氫-5H-苯并[5,6]環庚[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-哌啶基]-2-側氧基乙基]-哌啶甲醯胺、替吡法尼

25)干擾素，諸如內含子A、聚乙二醇-內含子，

26)抗-erbB1抗體，諸如西妥昔單抗、帕尼單抗，

27)抗-erbB2抗體，諸如曲妥珠單抗，

28)抗-CD52抗體，諸如阿侖單抗，

29)抗-CD20抗體，諸如利妥昔單抗

30)抗-CD33抗體，諸如吉妥珠單抗奧佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)

31)抗-VEGF抗體，諸如Avastin，

32)TRIAL配位體，諸如來沙木單抗(Lexatumumab)、瑪帕單抗(mapatumumab)及AMG-655

33)抗-CTLA-4抗體，諸如伊匹單抗

34)針對CTA1、CEA、CD5、CD19、CD22、CD30、CD44、CD44V6、CD55、CD56、EpCAM、FAP、MHCII、HGF、IL-6、MUC1、PSMA、TAL6、TAG-72、TRAILR、VEGFR、IGF-2、FGF之抗體，

35)抗-IGF-1R抗體，諸如達洛圖單抗(MK-0646)及羅妥木單抗(robatumumab)(SCH 717454)。

「雌激素受體調節劑」係指不考慮機制，干擾或抑制雌激素與受體之結合的化合物。雌激素受體調節劑之實例包括但不限於他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬(idoxifene)、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟維司群、4-[7-(2,2-二甲基-1-側氧基丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并哌喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基丙酸酯、4,4'-二羥基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙及SH646。

「雄激素受體調節劑」係指不考慮機制，干擾或抑制雄激素與受體之結合的化合物。雄激素受體調節劑之實例包括非那雄胺及其他5α-還原酶抑制劑、尼魯米特(nilutamide)、氟他胺、比卡魯胺、利阿唑(liarozole)及乙酸阿比特龍。

「類視黃素受體調節劑」係指不考慮機制，干擾或抑制類視黃素與受體之結合的化合物。該等類視黃素受體調節劑之實例包括貝瑟羅汀(bexarotene)、維甲酸、13-順-視黃酸、9-順-視黃酸、α-二氟甲基鳥胺酸、ILX23-7553、反-N-(4'-羥苯基)維甲醯胺(retinamide)及N-4-羧苯基維甲醯胺。

「細胞毒素劑/細胞生長抑制劑」係指主要藉由直接干擾細胞功能而引起細胞死亡或抑制細胞增殖或抑制或干擾細胞有絲分裂的化合物，包括烷基化劑、腫瘤壞死因子、插入劑、低氧可活化化合物、微管抑制劑/微管穩定劑、有絲分裂驅動蛋白之抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶抑制劑、參與有絲分裂進程之激酶之抑制劑、參與生長因子及細胞介素信號轉導途徑之激酶之抑制劑、抗代謝物、生物反應修飾劑、激素/抗-激素治療劑、造血生長因子、單株抗體靶向治療劑、拓樸異構酶抑制劑、蛋白體抑制劑、泛素連接酶抑制劑及極光激酶抑制劑。

細胞毒素劑/細胞生長抑制劑之實例包括但不限於鉑配位化合物(platinum coordinator compound)、瑟特耐福(sertenef)、惡病質素(cachectin)、異環磷醯胺、他索那明(tasonermin)、氯尼達明(lonidamine)、卡鉑、六甲蜜胺、潑尼莫司汀(prednimustine)、二溴半乳糖醇(dibromodulcitol)、雷莫司汀(ranimustine)、福莫司汀(fotemustine)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑、替莫唑胺、庚鉑(heptaplatin)、雌莫司汀、對甲苯磺酸英丙舒凡(improsulfan tosilate)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尼莫司汀(nimustine)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、嘌嘧替派(pumitepa)、洛鉑(lobaplatin)、沙鉑、甲基絲裂黴素(profiromycin)、順鉑、伊洛福芬(irofulven)、右異環磷醯胺(dexifosfamide)、順-胺二氯(2-甲基-吡啶)鉑、苄基鳥嘌呤(benzylguanine)、葡磷醯胺(glufosfamide)、GPX100、(反,反,反)-雙-μ-(己烷-1,6-二胺)-μ-[二胺-鉑(II)]雙[二胺(氯)鉑(II)]四氯化物、二吖嗪啶基精胺(diarizidinylspermine)、三氧化二砷、1-(11-十二烷基胺基-10-羥基十一烷基)-3,7-二甲基黃嘌呤、左柔比星(zorubicin)、艾達黴素、道諾黴素、比生群(bisantrene)、米托蒽醌、吡柔比星(pirarubicin)、吡萘非特(pinafide)、戊柔比星、胺柔比星、抗新普拉通(antineoplaston)、3'-脫胺基-3'-(N-嗎啉基)-13-脫氧-10-羥基洋紅黴素(hydroxycarminomycin)、安那黴素(annamycin)、加柔比星(galarubicin)、依利奈法德(elinafide)、MEN10755、4-脫甲氧基-3-脫胺基-3-氮丙啶基-4-甲磺醯基-道諾黴素(參見WO 00/50032)。

低氧可活化化合物之實例係替拉紮明(tirapazamine)。

蛋白體抑制劑之實例包括但不限於雷克塔西汀(lactacystin)及MLN-341(Velcade)。

微管抑制劑/微管穩定劑之實例一般包括紫杉烷。具體化合物包括太平洋紫杉醇(Taxol^®)、硫酸長春地辛、3',4'-二脫氫-4'-脫氧-8'-去甲長春鹼(norvincaleukoblastine)、多烯紫杉醇(Taxotere^®)、根瘤菌素(rhizoxin)、海兔毒素(dolastatin)、羥乙磺酸米伏布林(mivobulin isethionate)、奧瑞他汀(auristatin)、西馬多丁(cemadotin)、RPR109881、BMS184476、長春氟寧(vinflunine)、念珠藻素(cryptophycin)、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺醯胺、脫水長春鹼(anhydrovinblastine)、N,N-二甲基-L-纈胺醯基-L-纈胺醯基-N-甲基-L-纈胺醯基-L-脯胺醯基-L-脯胺酸-第三丁基醯胺、TDX258、埃博黴素(參見例如美國專利第6,284,781號及第6,288,237號)及BMS188797。

拓樸異構酶抑制劑之一些實例係拓樸替康、海普胺(hycaptamine)、伊立替康、魯比替康、6-乙氧基丙醯基-3',4'-O-外-亞苄基-教酒菌素 (chartreusin)、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4'：b,7]-吲哚嗪并[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、勒托替康(lurtotecan)、7-[2-(N-異丙胺基)乙基]-(20S)喜樹鹼、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依託泊苷、替尼泊苷、索布佐生(sobuzoxane)、2'-二甲胺基-2'-脫氧-依託泊苷、GL331、N-[2-(二甲胺基)乙基]-9-羥基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲醯胺、奧沙那寧(asulacrine)、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲胺基)乙基]-N-甲胺基]乙基]-5-[4-氫氧基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氫呋喃并(3',4'：6,7)萘并(2,3-d)-1,3-間二氧雜環戊烯-6-酮、2,3-(亞甲二氧基)-5-甲基-7-羥基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓(phenanthridinium)、6,9-雙[(2-胺基乙基)胺基]苯并[g]異喹啉-5,10-二酮、5-(3-胺基丙胺基)-7,10-二羥基-2-(2-羥乙基胺甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙胺基)乙胺基]-7-甲氧基-9-側氧基-9H-噻

-4-基甲基]甲醯胺、N-(2-(二甲胺基)乙基)吖啶-4-甲醯胺、6-[[2-(二甲胺基)乙基]胺基]-3-羥基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮及地美司鈉(dimesna)。

有絲分裂驅動蛋白且尤其是人類有絲分裂驅動蛋白KSP之抑制劑之實例描述於以下公開案中：WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776。在一實施例中，有絲分裂驅動蛋白之抑制劑包括但不限於KSP之抑制劑、MKLP1之抑制劑、CENP-E之抑制劑、MCAK之抑制劑及Rab6-KIFL之抑制劑。

「組蛋白脫乙醯基酶抑制劑」之實例包括但不限於SAHA、TSA、奧克拉汀(oxamflatin)、PXD101、MG98及斯克太德。另外可在以下手稿中發現提到了其他組蛋白脫乙醯基酶抑制劑：Miller,T.A.等人J.Med.Chem.46(24)：5097-5116(2003)。

「參與有絲分裂進程之激酶之抑制劑」包括但不限於極光激酶之抑制劑、Polo樣激酶(PLK)之抑制劑(尤其是PLK-1之抑制劑)、bub-1之抑制劑及bub-R1之抑制劑。「極光激酶抑制劑」之實例係VX-680。

「抗增殖劑」包括反義RNA與DNA寡核苷酸，諸如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231及INX3001；及抗代謝物，諸如依諾他濱(enocitabine)、卡莫氟(carmofur)、喃氟啶(tegafur)、噴司他汀、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、曲美沙特(trimetrexate)、氟達拉濱、卡培他濱、加洛他濱(galocitabine)、十八烷基磷酸阿糖胞苷、福斯他濱鈉水合物(fosteabine sodium hydrate)、雷替曲塞、帕替希德(paltitrexid)、乙嘧替氟(emitefur)、噻唑呋林(tiazofurin)、地西他濱、諾拉曲塞、培美曲塞、奈拉濱(nelzarabine)、2'-脫氧-2'-亞甲基胞嘧啶核苷、2'-氟亞甲基-2'-脫氧胞嘧啶核苷、N-[5-(2,3-二氫-苯并呋喃基)磺醯基]-N'-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-脫氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯醯基]甘胺醯胺基]-L-甘油-B-L-甘露-庚哌喃糖基]腺嘌呤、阿匹立定(aplidine)、依特那斯汀(ecteinascidin)、曲沙他濱(troxacitabine)、4-[2-胺基-4-側氧基-4,6,7,8-四氫-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩醯基-L-麩胺酸、胺基喋呤(aminopterin)、5-氟尿嘧啶、丙胺菌素(alanosine)、11-乙醯基-8-(胺甲醯基氧基甲基)-4-甲醯基-6-甲氧基-14-氧雜-1,11-二氮雜四環(7.4.1.0.0)-十四-2,4,6-三烯-9-基乙酸酯、苦馬豆素(swainsonine)、洛美曲索(lometrexol)、右雷佐生(dexrazoxane)、蛋胺酶(methioninase)、2'-氰基-2'-脫氧-N4-軟脂醯基-1-B-D-阿糖呋喃糖基胞嘧啶、3-胺基吡啶-2-甲醛硫縮胺基脲及曲妥珠單抗。

單株抗體靶向治療劑之實例包括具有細胞毒素劑或放射性同位素附接至癌細胞特異性或目標細胞特異性單株抗體之彼等治療劑。實例包括百克沙。

「異戊二烯基-蛋白質轉移酶抑制劑」係指抑制異戊二烯基-蛋白質轉移酶中之任一者或任何組合的化合物，該等酶包括法呢基-蛋白質轉移酶(FPTase)、四異戊二烯基-蛋白質轉移酶I型(GGPTase-I)及四異戊二烯基-蛋白質轉移酶II型(GGPTase-II，亦稱為Rab GGPTase)。

異戊二烯基-蛋白質轉移酶抑制劑之實例可見於以下公開案及專利中：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美國專利第5,420,245號、美國專利第5,523,430號、美國專利第5,532,359號、美國專利第5,510,510號、美國專利第5,589,485號、美國專利第5,602,098號、歐洲專利公開案0 618 221、歐洲專利公開案0 675 112、歐洲專利公開案0 604 181、歐洲專利公開案0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美國專利第5,661,152號、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美國專利第5,571,792號、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436及美國專利第5,532,359號。關於異戊二烯基-蛋白質轉移酶抑制劑對血管生成之作用的實例，參見European J.of Cancer，第35卷，第9期，第1394-1401頁(1999)。

「血管生成抑制劑」係指不考慮機制，抑制新血管形成之化合物。血管生成抑制劑之實例包括但不限於酪胺酸激酶抑制劑，諸如酪胺酸激酶受體Flt-1(VEGFR1)及Flk-1/KDR(VEGFR2)之抑制劑、表皮衍生、纖維母細胞衍生或血小板衍生生長因子之抑制劑、基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、整合素阻斷劑、干擾素-α、介白素-12、戊聚糖聚硫酸鹽、環加氧酶抑制劑，包括非類固醇消炎藥(nonsteroidal anti-inflammatories，NSAID)，如阿司匹林(aspirin)及布洛芬(ibuprofen)以及選擇性環加氧酶-2抑制劑，如塞內昔布(celecoxib)及羅非考昔(rofecoxib)(PNAS，第89卷，第7384頁(1992)；JNCI，第69卷，第475頁(1982)；Arch.Opthalmol.，第108卷，第573頁(1990)；Anat.Rec.，第238卷，第68頁(1994)；FEBS Letters，第372卷，第83頁(1995)；Clin,Orthop.第313卷，第76頁(1995)；J.Mol.Endocrinol.，第16卷，第107頁(1996)；Jpn.J.Pharmacol.，第75卷，第105頁(1997)；Cancer Res.，第57卷，第1625頁 (1997)；Cell，第93卷，第705頁(1998)；Intl.J.Mol.Med.，第2卷，第715頁(1998)；J.Biol.Chem.，第274卷，第9116頁(1999))、類固醇消炎藥(諸如皮質類固醇、鹽皮質激素、地塞米松(dexamethasone)、潑尼松、潑尼龍、甲潑尼龍(methylpred)、倍他米松(betamethasone))、羧胺三唑、考布他汀(combretastatin)A-4、角鯊胺、6-O-氯乙醯基-羰基)-煙麯黴醇、沙立度胺、血管生長抑素、肌鈣蛋白-1、血管收縮素II拮抗劑(參見Fernandez等人，J.Lab.Clin.Med.105：141-145(1985))及VEGF抗體(參見Nature Biotechnology，第17卷，第963-968頁(1999年10月)；Kim等人，Nature,362,841-844(1993)；WO 00/44777；及WO 00/61186)。

血管生成抑制劑之其他實例包括但不限於內皮生長抑素、烏克瑞恩(ukrain)、豹蛙酶(ranpirnase)、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)環氧乙基]-1-氧雜螺[2,5]辛-6-基(氯乙醯基)胺基甲酸酯、乙醯基地那林(acetyldinanaline)、5-胺基-1-[[3,5-二氯-4-(4-氯苄醯基)苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲醯胺、CM101、角鯊胺、考布他汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露五糖磷酸鹽、7,7-(羰基-雙[亞胺基-N-甲基-4,2-吡咯并羰基亞胺基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亞胺基]-雙-(1,3-萘二磺酸鹽)及3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亞甲基]-2-吲哚啉酮(SU5416)。

調節或抑制血管生成且亦可與本發明化合物組合使用之其他治療劑包括調節或抑制凝血與纖維蛋白溶解系統之試劑(參見Clin.Chem.La.Med.38：679-692(2000)中之綜述)。此類調節或抑制凝血與纖維蛋白溶解途徑之試劑之實例包括但不限於肝素(參見Thromb.Haemost.80：10-23(1998))、低分子量肝素及羧肽酶U抑制劑(亦稱為活性凝血酶可活化纖維蛋白溶解抑制劑[TAFIa]之抑制劑)(參見Thrombosis Res.101：329-354 (2001))。TAFIa抑制劑已描述於美國第60/310,927號(2001年8月8日申請)及第60/349,925號(2002年1月18日申請)中。

「干擾細胞週期檢查點之試劑」係指抑制轉導細胞週期檢查點信號之蛋白質激酶，藉此使癌細胞對DNA損傷劑敏感之化合物。此類試劑包括ATR、ATM、CHK11及CHK12激酶之抑制劑及cdk及cdc激酶抑制劑，且具體而言，由7-羥基星形孢菌素、夫拉平度、CYC202(Cyclacel)及BMS-387032舉例說明。

「干擾受體酪胺酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)之試劑」係指抑制RTK且由此抑制瘤形成及腫瘤進程中所涉及之機制的化合物。此類試劑包括c-Kit、Eph、PDGF、Flt3及c-Met之抑制劑。其他試劑包括RTK之抑制劑，如Bume-Jensen及Hunter,Nature,411：355-365,2001所述。

「細胞增殖及存活信號傳導途徑之抑制劑」係指抑制細胞表面受體下游之信號轉導級聯的化合物。此類試劑包括絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑(包括但不限於Akt之抑制劑，諸如以下各者中所述：WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US 2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469)、Raf激酶之抑制劑(例如PLX-4032)、MEK之抑制劑(例如Arry-162、RO-4987655及GSK-1120212)、mTOR之抑制劑(例如AZD-8055、BEZ-235及依維莫司)及PI3K之抑制劑(例如GDC-0941、 BKM-120)。

如上所用，「整合素阻斷劑」係指選擇性拮抗、抑制或抵消生理配位體與α_vβ₃整合素之結合的化合物；選擇性拮抗、抑制或抵消生理配位體與αvβ5整合素之結合的化合物；拮抗、抑制或抵消生理配位體與α_vβ₃整合素及α_vβ₅整合素之結合的化合物；及拮抗、抑制或抵消表現於毛細管內皮細胞上之特定整合素之活性的化合物。該術語亦指α_vβ₆、α_vβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁及α₆β₄整合素之拮抗劑。該術語亦指α_vβ₃、α_vβ₅、α_vβ₈、α₁β₁、α₂β₁、α₅β₁、α₆β₁及α₆β₄整合素之任何組合的拮抗劑。

酪胺酸激酶抑制劑之一些具體實例包括N-(三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲醯胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亞甲基)吲哚啉-2-酮、17-(烯丙基胺基)-17-脫甲氧基格爾德黴素、4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氫-10-(羥甲基)-10-羥基-9-甲基-9,12-環氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg：3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮

-1-酮、SH268、金雀異黃酮(genistein)、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基胺基)-5,6-二甲基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶甲磺酸鹽、4-(3-溴-4-羥苯基)胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4'-羥苯基)胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺及EMD121974。

本發明所主張之抗體或抗原結合片段與PPAR-γ(亦即PPAR-gamma)促效劑及PPAR-δ(亦即PPAR-delta)促效劑之組合適用於治療某些惡性腫瘤。PPAR-γ及PPAR-δ係細胞核過氧化體增殖物活化受體γ及δ。文獻中已報導PPAR-γ在內皮細胞上之表現及其在血管生成中之參與(參見J. Cardiovasc.Pharmacol.1998；31：909-913；J.Biol.Chem.1999；274：9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；41：2309-2317)。最近證明，PPAR-γ促效劑可活體外抑制對VEGF之血管生成反應；曲格列酮(troglitazone)及羅格列酮(rosiglitazone)順丁烯二酸鹽均抑制視網膜新血管生成在小鼠中之發展。(Arch.Ophthamol.2001；119：709-717)。PPAR-γ促效劑及PPAR-γ/α促效劑之實例包括但不限於Lynparza®、Rucaparib®、Talazoparib®、尼拉帕尼(niraparib)、Veliparib®、噻唑啶二酮(諸如DRF2725、CS-011、曲格列酮、羅格列酮及吡格列酮(pioglitazone))、非諾貝特(fenofibrate)、吉非羅齊(gemfibrozil)、氯貝特(clofibrate)、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并異噁唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸及2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基

烷-2-甲酸。

本發明之抗體或抗原結合片段亦可適用於與芳香酶抑制劑組合治療或預防乳癌。芳香酶抑制劑之實例包括但不限於：阿那曲唑、來曲唑及依西美坦。

本發明之抗體或抗原結合片段亦可適用於與以下化學治療劑組合治療癌症：阿巴瑞克(abarelix)(Plenaxis depot^®)；阿地介白素(aldesleukin)(Prokine^®)；阿地介白素(Proleukin^®)；阿侖單抗(Campath^®)；亞利崔托寧(alitretinoin)(Panretin^®)；別嘌呤醇(allopurinol)(Zyloprim^®)；六甲蜜胺(Hexalen^®)；阿米福汀(Ethyol^®)；阿那曲唑(Arimidex^®)；三氧化二砷 (Trisenox^®)；天冬醯胺酶(Elspar^®)；阿紮胞苷(azacitidine)(Vidaza^®)；鹽酸苯達莫司汀(bendamustine hydrochloride)(Treanda^®)；貝伐單抗(bevacuzimab)(Avastin^®)；貝瑟羅汀膠囊(Targretin^®)；貝瑟羅汀凝膠(Targretin^®)；博萊黴素(Blenoxane^®)；硼替佐米(Velcade^®)；布雷菲爾德菌素(brefeldin)A；靜脈內白消安(Busulfex^®)；口服白消安(Myleran^®)；卡普睾酮(calusterone)(Methosarb^®)；卡培他濱(Xeloda^®)；卡鉑(Paraplatin^®)；卡莫司汀(BCNU^®、BiCNU^®)；卡莫司汀(Gliadel^®)；具有Polifeprosan 20植入物之卡莫司汀(Gliadel Wafer^®)；塞內昔布(Celebrex^®)；西妥昔單抗(Erbitux^®)；苯丁酸氮芥(Leukeran^®)；順鉑(Platinol^®)；克拉屈濱(Leustatin^®、2-CdA^®)；氯法拉濱(clofarabine)(Clolar^®)；環磷醯胺(Cytoxan^®、Neosar^®)；環磷醯胺(Cytoxan Injection^®)；環磷醯胺(Cytoxan Tablet^®)；阿糖胞苷(Cytosar-U^®)；阿糖胞苷脂質體(DepoCyt^®)；達卡巴嗪(DTIC-Dome^®)；放線菌素d、放線菌素D(Cosmegen^®)；達肝素鈉注射劑(dalteparin sodium injection)(Fragmin^®)；達雷木單抗(DARZALEX^®)；阿法達貝泊汀(Darbepoetin alfa)(Aranesp^®)；達沙替尼(Sprycel^®)；道諾黴素脂質體(DanuoXome^®)；道諾黴素、柔紅黴素(daunomycin)(Daunorubicin^®)；道諾黴素、柔紅黴素(Cerubidine^®)；地加瑞克(degarelix)(Firmagon^®)；地尼介白素迪夫托斯(Ontak^®)；右雷佐生(Zinecard^®)；鹽酸右雷佐生(Totect^®)；膜海鞘素(didemnin)B；17-DMAG；多西他賽(Taxotere^®)；小紅莓(Adriamycin PFS^®)；小紅莓(Adriamycin^®、Rubex^®)；小紅莓(Adriamycin PFS Injection^®)；小紅莓脂質體(Doxil^®)；丙酸屈他雄酮(Dromostanolone^®)；丙酸屈他雄酮(Masterone Injection^®)；依庫珠單抗 (eculizumab)注射劑(Soliris^®)；艾氏B溶液(Elliott's B Solution)(Elliott's B Solution^®)；伊屈潑帕(eltrombopag)(Promacta^®)；表柔比星(Ellence^®)；阿法依泊汀(Epoetin alfa)(epogen^®)；埃羅替尼(Tarceva^®)；雌莫司汀(Emcyt^®)；炔雌醇；磷酸依託泊苷(Etopophos^®)；依託泊苷、VP-16(Vepesid^®)；依維莫司錠劑(Afinitor^®)；依西美坦(Aromasin^®)；奈米氧化鐵(ferumoxytol)(Feraheme Injection^®)；非格司亭(Filgrastim)(Neupogen^®)；氟尿苷(動脈內)(FUDR^®)；氟達拉濱(Fludara^®)；氟尿嘧啶、5-FU(Adrucil^®)；氟維司群(Faslodex^®)；吉非替尼(Iressa^®)；格爾德黴素；吉西他濱(Gemzar^®)；吉妥珠單抗奧佐米星(Mylotarg^®)；乙酸戈舍瑞林(Zoladex Implant^®)；乙酸戈舍瑞林(Zoladex^®)；乙酸組胺瑞林(histrelin acetate)(Histrelin implant^®)；羥基脲(Hydrea^®)；替伊莫單抗噻西坦(Zevalin^®)；艾達黴素(Idamycin^®)；異環磷醯胺(IFEX^®)；甲磺酸伊馬替尼(Gleevec^®)；干擾素α 2a(Roferon A^®)；干擾素α-2b(Intron A^®)；碘苄胍(iobenguane)I 123注射劑(AdreView^®)；伊立替康(Camptosar^®)；伊沙匹隆(ixabepilone)(Ixempra^®)；拉帕替尼錠劑(Tykerb^®)；來那度胺(Revlimid^®)；來曲唑(Femara^®)；甲醯四氫葉酸(Wellcovorin^®、Leucovorin^®)；乙酸亮丙瑞林(Eligard^®)；左旋咪唑(Ergamisol^®)；洛莫司汀、CCNU(CeeBU^®)；氮芥(meclorethamine)、氮芥(nitrogen mustard)(Mustargen^®)；乙酸甲地孕酮(Megace^®)；美法侖、L-PAM(Alkeran^®)；巰嘌呤、6-MP(Purinethol^®)；美司鈉(Mesnex^®)；美司鈉(Mesnex tabs^®)；甲胺喋呤(Methotrexate^®)；甲氧沙林(methoxsalen)(Uvadex^®)；8-甲氧基補骨脂素(methoxypsoralen)；絲裂黴素C(Mutamycin^®)；米托坦(Lysodren^®)；米托蒽醌(Novantrone^®)；光神黴素；苯丙酸諾龍(nandrolone phenpropionate)(Durabolin-50^®)；奈拉濱(nelarabine)(Arranon^®)；尼羅替尼(Tasigna^®)；諾莫單抗(Nofetumomab)(Verluma^®)；奧伐木單抗(Arzerra^®)；奧普瑞介白素(Oprelvekin)(Neumega^®)；奧沙利鉑(Eloxatin^®)；太平洋紫杉醇(Paxene^®)；太平洋紫杉醇(Taxol^®)；太平洋紫杉醇蛋白質結合粒子(Abraxane^®)；帕利夫明(palifermin)(Kepivance^®)；帕米膦酸鹽(Aredia^®)；帕尼單抗(Vectibix^®)；帕佐泮尼錠劑(Votrienttm^®)；培加酶(Adagen(培加酶牛)^®)；培門冬酶(Oncaspar^®)；乙二醇化非格司亭(Neulasta^®)；培美曲塞二鈉(Alimta^®)；噴司他汀(Nipent^®)；哌泊溴烷(Vercyte^®)；普樂沙福(plerixafor)(Mozobil^®)；普卡黴素、光神黴素(Mithracin^®)；卟吩姆鈉(Photofrin^®)；普拉曲沙注射劑(pralatrexate injection)(Folotyn^®)；甲基苄肼(Matulane^®)；奎納克林(quinacrine)(Atabrine^®)；雷帕黴素；拉布立酶(Rasburicase)(Elitek^®)；鹽酸雷洛昔芬(Evista^®)；利妥昔單抗(Rituxan^®)；羅米地辛(Istodax^®)；羅米司亭(romiplostim)(Nplate^®)；沙格司亭(sargramostim)(Leukine^®)；沙格司亭(Prokine^®)；索拉非尼(Nexavar^®)；鏈脲佐菌素(Zanosar^®)；順丁烯二酸舒尼替尼(Sutent^®)；滑石(Sclerosol^®)；他莫昔芬(Nolvadex^®)；替莫唑胺(Temodar^®)；替西羅莫司(Torisel^®)；替尼泊苷、VM-26(Vumon^®)；睪內酯(Teslac^®)；硫鳥嘌呤、6-TG(Thioguanine^®)；硫代嘌呤；噻替派(Thioplex^®)；拓樸替康(Hycamtin^®)；托瑞米芬(Fareston^®)；托西莫單抗(Bexxar^®)；托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar^®)；反-視黃酸；曲妥珠單抗(Herceptin^®)；維甲酸、ATRA(Vesanoid^®)；三伸乙基三聚氰胺；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard Capsules^®)；戊柔比星(Valstar^®)；長春鹼 (Velban^®)；長春新鹼(Oncovin^®)；長春瑞濱(Navelbine^®)；伏立諾他(Zolinza^®)；渥曼青黴素；及唑來膦酸鹽(zoledronate)(Zometa^®)。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與一或多種止吐藥聯合，該一或多種止吐藥包括但不限於：卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥吡坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊(palonosetron)(由MGI Pharma以Aloxi出售)、阿匹坦(aprepitant)(由Merck and Co.以Emend出售；Rahway,NJ)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer以Benadryl®出售；New York,NY)、羥嗪(hydroxyzine)(由Pfizer以Atarax®出售；New York,NY)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co以Reglan®出售；Richmond,VA)、勞拉西泮(lorazepam)(由Wyeth以Ativan®出售；Madison,NJ)、阿普唑侖(alprazolam)(由Pfizer以Xanax®出售；New York,NY)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil以Haldol®出售；Raritan,NJ)、氟哌利多(droperidol)(Inapsine®)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.以Marinol®出售；Marietta,GA)、地塞米松(由Merck and Co.以Decadron®出售；Rahway,NJ)、甲潑尼龍(由Pfizer以Medrol®出售；New York,NY)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline以Compazine®出售；Research Triangle Park,NC)、格拉司瓊(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.以Kytril®出售；Nutley,NJ)、昂丹司瓊(ondansetron)(由Glaxosmithkline以Zofran®出售；Research Triangle Park,NC)、多拉司瓊(dolasetron)(由Sanofi-Aventis以Anzemet®出售；New York,NY)、特比司瓊(tropisetron)(由Novartis以Navoban®出售；East Hanover,NJ)。

癌症治療之其他副作用包括紅血球及白血球缺乏。因此，在本發明之一實施例中，抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與治療或預防此類缺乏之藥劑聯合，該藥劑諸如非格司亭、PEG-非格司亭、紅血球生成素、阿法依泊汀或阿法達貝泊汀。

在本發明之一實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段與抗癌放射線療法聯合投與。舉例而言，在本發明之一個實施例中，放射線療法係外部光束療法(external beam therapy，EBT)：遞送一束高能X射線至腫瘤位置之方法。光束在患者外部產生(例如藉由線性加速器)且靶向腫瘤部位。此等X射線可破壞癌細胞且小心治療計劃允許繞過周圍正常組織。不將放射源置放於患者體內。在本發明之一實施例中，放射線療法係質子束療法：以質子代替X射線轟擊病變組織之一種適形療法(conformal therapy)。在本發明之一實施例中，放射線療法係適形外部光束放射線療法：使用先進技術根據個體之身體結構調整放射線療法的程序。在本發明之一實施例中，放射線療法係近接療法(brachytherapy)：將放射性材料臨時置放於體內，通常用於為某個區域提供額外劑量或增強的輻射。

在本發明之一實施例中，與抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段聯合投與之外科程序係外科腫瘤切除術。

實驗及診斷用途

本文所揭示之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段可以用作親和純化劑。在此方法中，使用此項技術中熟知之方法將抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段固定在諸如Sephadex、玻璃或瓊脂糖樹脂或濾紙之固相上。使經固定抗體或片段與待純化之含有SIRPα蛋白(或其片段)之樣品接觸，且其後用適合溶劑洗滌支撐物，該溶劑將移除樣品中除SIRPα蛋白外之基本上所有材料，而SIRPα蛋白與經固定抗體或片段結合。最後，用溶離所結合之SIRPα(例如蛋白A)的溶劑洗滌支撐物。此類經固定抗體及片段形成本發明之一部分。

進一步提供用於產生適用於例如進行西方墨點(Western blot)及本文中論述之其他免疫分析之二級抗體的抗原。

抗-SIRPα抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段亦可適用於SIRPα蛋白之診斷分析，例如偵測其在特定細胞、組織或血清中之表現，該等特定細胞、組織或血清例如骨髓細胞，諸如單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜鹼細胞、嗜伊紅白血球及樹突狀細胞。此類診斷方法可適用於各種疾病診斷。

本發明包括結合使用本文所揭示之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段的ELISA分析(酶聯結免疫吸附劑分析)。

舉例而言，此類方法包含以下步驟：(a)用抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段塗佈基板(例如微量滴定盤之孔表面，例如塑膠盤)；(b)將待測試SIRPα之存在之樣品施加至基板；(c)洗滌該盤，由此移除樣品中未結合之材料；(d)施加亦對SIRPα抗原具有特異性之可偵測標記之抗體(例如，酶聯結抗體)；(e)洗滌基板，由此移除未結合之標記抗體；(f)若標記抗體係酶聯結的，則施加能藉由酶轉換成螢光信號之化學物質；及 (g)偵測標記抗體之存在。

偵測到與基板相關聯之標記指示存在SIRPα蛋白。

在另一實施例中，經標記之抗體或其抗原結合片段係用過氧化酶標記，該過氧化酶與ABTS(例如2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3',5,5'-四甲基聯苯胺反應，產生可偵測之顏色變化。或者，經標記之抗體或片段係用可偵測之放射性同位素(例如，³H)標記，該放射性同位素可藉由閃爍計數器在閃爍體存在下偵測。

本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段可用於西方墨點或免疫蛋白質墨點程序中。此類程序形成本發明之一部分且包括例如：

(1)視情況使用此項技術中已知之方法(例如半乾墨點法(semi-dry blotting)或罐墨點法(tank blotting))從待測試SIRPα之存在之樣品(例如從樣品中蛋白質之PAGE或SDS-PAGE電泳分離)轉移蛋白質至膜或其他固體基板上；使待測試結合SIRPα或其片段之存在之膜或其他固體基板與本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段接觸。

(2)洗滌膜一或多次以移除未結合之抗-SIRPα抗體或片段及其他未結合之物質；以及

(3)偵測所結合之抗-SIRPα抗體或片段。

此類膜可呈硝化纖維素或基於乙烯基(例如聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF))之膜的形式，待在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠或十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠中測試SIRPα之存在的蛋白質已轉移至該膜中(例如在凝膠中電泳分離後)。在膜與抗-SIRPα抗體或片段接觸之前，視情況阻斷膜，例如用脫脂奶粉或類似物阻斷，以便結合膜上之非特異性蛋白質結合位點。

偵測到經結合抗體或片段指示SIRPα蛋白存在於膜或基板上及樣品中。經結合抗體或片段之偵測可藉由抗體或片段與可偵測地標記之二級抗體(一種抗-免疫球蛋白抗體)結合，且隨後偵測該二級抗體之存在而進行。

本文所揭示之抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段亦可用於免疫組織化學。此類方法形成本發明之一部分且包含例如(1)使待測試SIRPα蛋白之存在的細胞(例如含有骨髓細胞之樣品，骨髓細胞諸如單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜鹼細胞、嗜伊紅白血球及樹突狀細胞)與本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段接觸；及(2)在細胞上或細胞中偵測抗體或片段。

若抗體或片段本身經可偵測地標記，則其可直接偵測。或者，可用經可偵測地標記之二級抗體結合抗體或片段，偵測該二級抗體。

本文所揭示之某些抗-SIRPα抗體及其抗原結合片段亦可用於活體內腫瘤成像。此類方法可包括將放射性標記之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段注射至待測試與SIRPα表現相關之腫瘤(例如其例如在腫瘤細胞表面上表現SIRPα)之存在的患者的體內，接著對患者身體進行核成像以偵測例如在包含高濃度的與腫瘤結合之抗體或片段的基因座上經標記抗體或片段之存在。該基因座之偵測指示SIRPα⁺腫瘤及腫瘤細胞之存在。

成像技術包括SPECT成像(單光子發射電腦斷層攝影術)或PET成像(正電子發射斷層攝影術)。標記包括例如碘-123(¹²³I)及鎝-99m(^99mTc)，例如結合SPECT成像或¹¹C、¹³N、¹⁵O或¹⁸F，例如結合PET成像或銦-111 (參見例如Gordon等人，(2005)International Rev.Neurobiol.67：385-440)。

醫藥組合物及投藥

為了製備本發明之抗-SIRPα抗體及抗原結合片段之醫藥或無菌組合物，將抗體或其抗原結合片段與醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。

治療劑及診斷劑之調配物可藉由與可接受之呈例如凍乾粉末、漿料、水溶液或懸浮液形式的載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備(參見例如，Hardman等人(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams及Wilkins,New York,NY；Avis等人(編)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

單獨或與另一治療劑組合投與的本發明抗體之毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在細胞培養物或實驗動物中測定，例如測定LD₅₀(群體50%之致死劑量)及ED₅₀(群體50%之治療有效劑量)。毒性與治療效果之間的劑量比率係治療指數(LD₅₀/ED₅₀)。從此等細胞培養分析及動物研究獲得之資料可用於調配在人類中使用之劑量範圍。此類化合物之劑量較佳處於循環濃度之範圍內，其包括幾乎無毒性之ED₅₀。劑量可視所採用劑型及投藥途徑而在此範圍內變化。

在另一實施例中，根據Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))，與本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段聯合向個體投與其他治療劑。

投藥模式可不同。投藥途徑包括經口、直腸、經黏膜、經腸、非經腸；肌肉內、皮下、皮內、髓內、鞘內、直接室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、經皮或動脈內。

在特定實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段可以藉由侵入式途徑，諸如藉由注射投與。在本發明之其他實施例中，抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物經靜脈內、皮下、肌肉內、動脈內、瘤內或藉由吸入、氣溶膠遞送而投與。藉由非侵入式途徑(例如經口；例如在丸劑、膠囊或錠劑中)投藥亦在本發明之範疇內。

本發明提供一種包含本發明之抗體或抗原結合片段或其醫藥組合物中之任一者的容器(例如，塑膠或玻璃瓶，例如具有蓋或層析管柱、空心針或注射器筒)。本發明亦提供一種包含本發明之抗體或抗原結合片段或其醫藥組合物中之任一者的注射裝置。注射裝置係一種經由非經腸途徑，例如肌肉內、皮下或靜脈內，將物質引入患者體內之裝置。舉例而言，注射裝置可為注射器(例如預填有醫藥組合物，諸如自動注射器)，其例如包括用於容納待注射之流體(例如抗體或片段或其醫藥組合物)的針筒或圓筒、用於刺穿皮膚及/或血管以注射流體之針；及用於將流體推出針筒且穿過針孔之推桿。在本發明之一實施例中，包含本發明之抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物之注射裝置係靜脈內(intravenous，IV)注射裝置。此類裝置包括抗體或片段或其醫藥組合物於套管或套管針/針中，其可附接至管，該管可附接至用於容納經由套管或套管針/針引入患者體內之流體(例如生理鹽水；或包含NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl₂且視情況包括葡萄糖之乳酸化林格氏溶液(lactated ringer solution))的袋或儲集器。在本發明之一實施例中，抗體或片段或其醫藥組合物可在將套管針及套管插入個體靜脈中且從所插入之套管中移除套管針之後引入裝置中。IV裝置可例如插入周邊靜脈(例如，手或臂中)；上腔靜脈或下腔靜脈，或心臟右心房內(例如，中心IV)；或鎖骨下、內頸靜脈或股靜脈，且例如向心臟推進，直至其到達上腔靜脈或右心房(例如，中心靜脈導管)。在本發明之一實施例中，注射裝置係自動注射器、噴射注射器或外部輸注泵。噴射噴射器使用液體之高壓狹窄噴射，其穿透表皮以將抗體或片段或其醫藥組合物引入患者體內。外部輸注泵係將抗體或片段或其醫藥組合物以控制量遞送至患者體內的醫療裝置。可以電方式或以機械方式對外部輸注泵供以動力。不同泵以不同方式操作，舉例而言，注射泵將流體容納於注射器之儲集器中且由可移動活塞控制流體遞送，彈性泵將流體容納於可延伸氣囊儲集器中且由來自氣囊之彈性壁的壓力驅動流體遞送。在蠕動泵中，一組輥在可撓性管形材料之長度上向下夾捏，推動流體向前。在多通道泵中，流體可從多個儲集器以多個速率遞送。

本文所揭示之醫藥組合物亦可用無針皮下注射裝置投與；諸如美國專利第6,620,135號、第6,096,002號、第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之裝置。此類包含醫藥組合物之無針裝置亦為本發明之一部分。本文所揭示之醫藥組合物亦可藉由輸注投與。用於投與醫藥組合物之熟知植入物及模組之實例包括以下中所揭示之植入物及模組：美國專利第4,487,603號，其揭示以控制速率分配藥物之可植入微型輸注泵；美國專利第4,447,233號，其揭示以精確輸注速率遞送藥物之藥物輸注泵；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注設備；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多腔室隔室之滲透藥物遞送系統。許多其他此類植入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者熟知，且包含本發明之醫藥組合物的彼等植入物、遞送系統及模組在本發明之範疇內。

或者，可以局部而非全身性方式投與本發明之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段，例如經由將抗體或片段直接注射至腫瘤中。此外，可以在靶向藥物遞送系統中投與抗體或片段，例如在塗有組織特異性抗體之脂質體中，例如靶向腫瘤。脂質體將靶向患病組織且由患病組織選擇性地吸收。此類方法及脂質體為本發明之一部分。

投藥方案視若干因素而定，包括治療性抗體或抗原結合片段之血清或組織轉換率、症狀程度、治療性抗體之免疫原性及生物基質中目標細胞之可接近性。較佳地，投藥方案遞送足夠的治療性抗體或片段以實現目標疾病病況之改善，同時最小化不希望之副作用。因此，所遞送之生物製劑之量部分地視特定治療性抗體及所治療之病狀的嚴重程度而定。可獲得關於治療性抗體或片段之適當劑量之選擇的指導(參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人，(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。

適當劑量由臨床醫師確定，例如使用此項技術中已知或懷疑影響治療之參數或因素。一般而言，劑量以略小於最佳劑量的量開始，且其隨後以小增量遞增，直至相對於任何負面的副作用，達成所要或最佳作用。重要的診斷性量測包括症狀之診斷性量測，例如炎症或所產生之發炎性細胞介素之含量。一般而言，期望將使用之生物製劑係衍生自與靶向治療之動物相同的物種，由此使對試劑之任何免疫反應降至最低。在人類個體之情況下，例如人類化及完全人類抗體可為所期望的。

本文所揭示之抗體或其抗原結合片段可藉由連續輸注或藉由例如每天一次、每週1至7次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩月一次、每季度一次、每半年一次、每年一次等投與之劑量提供。劑量可例如經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、肌肉內、顱內、脊椎內或藉由吸入提供。總週劑量一般係至少0.05微克/公斤體重，更一般而言至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/mL、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更大(參見例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人，(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：151-144)。亦可提供用以達成抗-SIRPα抗體在個體血清中之預定目標濃度的劑量，預定目標濃度諸如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/mL或更大。在其他實施例中，本發明之抗-SIRPα抗體每週一次、每兩週一次、「每4週一次」、每月一次、每兩月一次或每季度一次地以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500毫克/個體例如皮下或靜脈內投與。

如本文所用，術語「有效量」係指本發明之抗-SIRPα或其抗原結合片段在單獨或與另一治療劑組合向細胞、組織或個體投與時可有效引起例如癌症之疾病之一或多種症狀或癌症進程之可量測的改善的量。有效劑量進一步係指抗體或片段之足以引起症狀至少部分改善的量，至少部分改善例如腫瘤縮小或消除、腫瘤不生長、存活時間增加。當應用於單獨投與之個別活性成分時，有效劑量僅指該成分。當應用於組合時，有效劑量係指無論以組合形式連續還是同時投與，產生治療作用之活性成分之組合量。有效量之治療劑將使診斷性量測或參數改善至少10%；通常至少20%；較佳至少約30%；更佳至少40%且最佳至少50%。在使用主觀量測評定疾病嚴重程度之情況下，有效量亦可改善主觀量測。

套組

進一步提供包含一或多種組分之套組，該一或多種組分包括但不限於與一或多種額外組分聯合的如本文所論述之抗-SIRPα抗體或抗原結合片段，額外組分包括但不限於如本文所論述之醫藥學上可接受之載劑及/或治療劑。抗體或片段及/或治療劑可調配為純組合物或與醫藥學上可接受之載劑組合於醫藥組合物中。

在一個實施例中，套組包括本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物於一個容器中(例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中)及/或包括治療劑及其醫藥組合物於另一容器中(例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中)。

在另一實施例中，套組包含本發明之組合，包括本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段連同醫藥學上可接受之載劑，視情況與一或多種共同調配之治療劑組合，視情況呈醫藥組合物形式，在單一常見容器中。

若套組包括用於對個體非經腸投藥之醫藥組合物，則套組可包括用於進行此類投藥之裝置。舉例而言，套組可包括如上文所論述之一或多種皮下針或其他注射裝置。

套組可包括藥品說明書，其包括關於套組中之醫藥組合物及劑型之資訊。一般而言，此類資訊輔助患者及醫師有效且安全地使用所密封之醫藥組合物及劑型。舉例而言，可在藥品說明書中提供以下關於本發明之組合的資訊：藥物動力學、藥效學、臨床研究、功效參數、適應症及用法、禁忌、警告、注意事項、不良反應、藥劑過量、適宜劑量及投藥、如何提供、適宜儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商資訊及專利資訊。

套組亦可包含第二治療劑，例如以下各者中之一或多者：抗-CD47抗體、抗-APRIL抗體、抗-PD-1抗體(例如納武單抗、派姆單抗、抗-PDL1抗體、抗-TIGIT抗體、抗-CTLA4抗體、抗-CS1抗體(例如埃羅妥珠單抗)、抗-KIR2DL1/2/3抗體(例如利瑞路單抗)、抗-CD137抗體(例如烏瑞魯單抗)、抗GITR抗體(例如TRX518)、抗-PD-L1抗體(例如BMS-936559、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗-PD-L2抗體、抗-ILT1抗體、抗-ILT2抗體、抗-ILT3抗體、抗-ILT4抗體、抗-ILT5抗體、抗-ILT6抗體、抗-ILT7抗體、抗-ILT8抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40抗體、抗-ICOS、抗-KIR2DL1抗體、抗-KIR2DL2/3抗體、抗-KIR2DL4抗體、抗-KIR2DL5A抗體、抗-KIR2DL5B抗體、抗-KIR3DL1抗體、抗-KIR3DL2 抗體、抗-KIR3DL3抗體、抗-NKG2A抗體、抗-NKG2C抗體、抗-NKG2E抗體、抗-4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗-TSLP抗體、抗-IL-10抗體、IL-10或聚乙二醇化IL-10、或此類目標之任何小有機分子抑制劑；與選自由以下組成之群的抗原結合的抗體或其抗原結合片段：AMHR2、AXL、BCMA、CA IX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、內皮因子、EPHA2、EphA3、FGFR2b、葉酸鹽受體α、海藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受體、TA-MUC1及PSMA；利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、達妥昔單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13及(CD20)₂xCD16、埃羅替尼(Tarceva)、達雷木單抗、阿侖單抗、帕妥珠單抗、本妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、替伊莫單抗、依法妥珠單抗、伐吐珠單抗、奧特勒土珠單抗、卡妥昔單抗、依帕珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、樂妥昔單抗、伊薩妥昔單抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奧普珠單抗、恩斯土昔單抗、維多汀(Adcetris)、替伊莫單抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Kadcyla)；放射線療法或化學治療劑，包括但不限於蒽環黴素(小紅莓、表柔比星、道諾黴素、艾達黴素、米托蒽醌)、奧沙利鉑、硼替佐米、環磷醯胺、博萊黴素、伏立諾他、太平洋紫杉醇、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、潑尼龍、多西他賽、絲裂黴素C、拓樸替康/喜樹鹼、依託泊苷、唑來膦酸、甲胺喋呤、依魯替尼、阿柏西普、貝伐單抗、托瑞米芬、長春鹼、長春新鹼、艾德昔布、巰嘌呤、沙立度胺、索拉非尼；環二核苷酸或其他STING途徑促效劑；等等。

偵測套組及治療套組

出於便利性，可以在套組中提供本發明之抗-SIRPα抗體或其抗原結合片段，亦即預定量之試劑與進行診斷或偵測分析之說明書的包裝組合。在抗體或片段用酶標記之情況下，套組將包括酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光團之受質前驅體)。另外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或溶解緩衝液)及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供使分析靈敏度基本上達到最佳的試劑溶液濃度。特定言之，試劑可以通常凍乾的乾燥粉末形式提供，包括賦形劑，其一旦溶解將提供具有適當濃度之試劑溶液。

亦提供診斷或偵測試劑及包含一或多種此類試劑之套組用於多種偵測分析，包括例如免疫分析，諸如ELISA(夾心型或競爭形式)。套組組分可預附接至固體支撐物，或可在使用套組時施加至固體支撐物之表面。在本發明之一些實施例中，信號發生裝置可以與本發明之抗體或片段提前聯合，或可能需要在使用之前與一或多種組分組合，該一或多種組分例如緩衝液、抗體-酶結合物、酶受質或其類似物。套組亦可包括額外試劑，例如用於減少與固相表面非特異性結合之阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及其類似物。固相表面可呈管、珠粒、微量滴定盤、微球體或其他適合於固定蛋白質、肽或多肽之材料的形式。在特定態樣中，催化化學發光或發色產物形成或化學發光或發色受質還原的酶係信號產生裝置之組分。此類酶為此項技術中所熟知。套組可包含本文所述之捕捉試劑及偵測試劑中之任一者。套組亦可視情況包含用於進行本發明之方法的說明書。

亦提供一種套組，其包含包裝在諸如小瓶或瓶之容器中的抗-SIRPα抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段，且進一步包含附接至容器或與容器一起包裝的標籤，該標籤描述容器之內含物且提供適應症及/或關於使用容器內含物治療如本文所述之一或多種疾病病況的說明書。

在一個態樣中，套組係用於治療癌症且包含抗-SIRPα抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及其他治療劑或疫苗。套組可視情況進一步包括用於非經腸，例如靜脈內投藥之注射器。在另一態樣中，套組包含抗-SIRPα抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及附接至容器或與容器一起包裝的標籤，該標籤描述抗體或片段與疫苗或其他治療劑之用法。在又一態樣中，套組包含疫苗或其他治療劑及附接至容器或與容器一起包裝的標籤，該標籤描述疫苗或其他治療劑與抗-SIRPα抗體或片段之用法。在某些實施例中，抗-SIRPα抗體及疫苗或其他治療劑係在獨立小瓶中或一起組合在同一個醫藥組合物中。

如上文在組合療法部分中所論述，兩種治療劑同時投與不要求藥劑同時或藉由相同途徑投與，只要藥劑發揮其治療作用的時段存在重疊即可。涵蓋同時或依序投藥，如在不同日或週投藥。

亦可製備本文所揭示之治療及偵測套組，其包含本文所揭示之抗體、肽、抗原結合片段或聚核苷酸中之至少一者及使用組合物作為偵測試劑或治療劑之說明書。用於在此類套組中使用之容器通常可以包含至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其他適合容器，其中可以置放偵測及/或治療組合物中之一或多者，且較佳進行適當地等分。在亦提供第二治療劑的情況下，套組亦可含有第二不同容器，其中可置放此第二偵測及/或治療組合物。或者，複數種化合物可製備成單一醫藥組合物，且可包裝在單一容器裝置中，諸如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其他適合單一容器。本文所揭示之套組通常亦將包括用於嚴密地容納小瓶以便商業出售之裝置，諸如將所要小瓶保持在其中的注塑或吹塑塑膠容器。在套組內包括放射性標記、發色、螢光生成或其他類型可偵測標記或偵測裝置的情況下，標記試劑可提供於與偵測或治療組合物本身相同之容器中，或者可置放於第二不同容器裝置中，其中可置放且適當地等分此第二組合物。或者，偵測試劑及標記可製備於單一容器裝置中，且在大多數情況下，套組亦通常包括用於嚴密地容納小瓶以便商業出售及/或便於包裝及遞送之裝置。

亦提供用於進行本文所述之偵測或監測方法的裝置或設備。此類設備可包括其中可輸入樣品之腔室或管、視情況包括閥或泵以引導樣品流穿過裝置之流體處理系統、視情況選用之用以從血液分離血漿或血清的過濾器、用於添加捕捉試劑或偵測試劑之混合腔室及視情況選用之用於偵測結合於捕捉試劑免疫複合物之可偵測標記之量的偵測裝置。樣品流可為被動的(例如，藉由毛細管、流體靜力或其他在樣品施加後不需要另外操作裝置的力)或主動的(例如，藉由施加經由機械泵、電滲透泵、離心力或增加的氣壓所產生之力)或藉由主動力與被動力之組合。

在其他實施例中，亦提供處理器、電腦可讀記憶體及儲存在電腦可讀記憶體上且經調適以在處理器上執行，從而進行本文所述之方法中之任一者的常式。適合計算系統、環境及/或組態之實例包括個人電腦、伺服器電腦、手持式或膝上型裝置、多處理器系統、基於微處理器之系統、機上盒、可程式化消費型電子裝置、網路PC、小型電腦、大型電腦、包括以上系統或裝置中之任一者之分散式計算環境或此項技術中已知之任何其他系統。

較佳實施例

實施例1.一種與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其中抗體或抗原結合片段包含以下中之一或多者且視情況每一者：a.包含SEQ ID NO：69之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1，b.包含SEQ ID NO：70之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2，c.包含SEQ ID NO：71之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3，d.包含SEQ ID NO：72之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1，e.包含SEQ ID NO：73之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2，及f.包含SEQ ID NO：74之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3；或其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一或多者且視情況每一者：g.包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR1， h.包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR2，i.包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的重鏈可變區CDR3，j.包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR1，k.包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR2，及l.包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列的輕鏈可變區CDR3。

實施例2.如實施例1之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含包含以下的重鏈序列中之每一者：SEQ ID NO：69之胺基酸序列或與SEQ ID NO：69相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；SEQ ID NO：70之胺基酸序列或與SEQ ID NO：70相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及SEQ ID NO：71之胺基酸序列或與SEQ ID NO：71相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及/或包含以下的輕鏈序列中之每一者：SEQ ID NO：72之胺基酸序列或與SEQ ID NO：72相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；SEQ ID NO：73之胺基酸序列或與SEQ ID NO：73相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及SEQ ID NO：74之胺基酸序列或與SEQ ID NO：74相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；或其中該抗體或抗原結合片段包含包含以下的重鏈序列中之每一者：SEQ ID NO：1之胺基酸序列或與SEQ ID NO：1相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；SEQ ID NO：2之胺基酸序列或與SEQ ID NO：2相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及SEQ ID NO：3之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及/或包含以下的輕鏈序列中之每一者：SEQ ID NO：4之胺基酸序列或與SEQ ID NO：4相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；SEQ ID NO：5之胺基酸序列或與SEQ ID NO：5相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及SEQ ID NO：6之胺基酸序列或與SEQ ID NO：6相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列。

實施例3.如實施例2之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一者或兩者：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：78或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：82或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列， SEQ ID NO：84或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：86或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：88或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及SEQ ID NO：102或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：90或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：92或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：94或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：96或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：98或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：100或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及SEQ ID NO：104或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；或其中該抗體或抗原結合片段包含以下中之一者或兩者：包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：7或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：10或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：12或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：14或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：16或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：18或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及SEQ ID NO：30或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；及包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：8或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列， SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：22或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：24或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，SEQ ID NO：26或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及SEQ ID NO：28或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列，及SEQ ID NO：32或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。

實施例4.如實施例3之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其片段具有以下特徵：以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nm、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nM、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV2蛋白之細胞結合；在50nM、較佳67nM且更佳100nM之抗體濃度下；或者在比抗體對SIRPαV1或SIRPαV2之EC₅₀大10倍、較佳大50倍、更佳大100倍且再更佳大200倍的濃度下，不與SIRPβ1蛋白發生明顯的結合；以<10.0nM、更佳<5.0nM、再更佳<2.5nM且最佳約1.0nM或更小的IC₅₀抑制人類SIRPα與CD47之間的結合；及展現至少79且更佳85之T20「人類化」評分。

實施例5.如實施例1之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含以下重鏈序列/輕鏈序列組合中之一者：SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：78/SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：80/SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：82/SEQ ID NO：100， SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：84/SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：86/SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：98，SEQ ID NO：88/SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：10/SEQ ID NO：28， SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：12/SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：28，或在各情況下，與相應SEQ ID至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

實施例6.如實施例1至5中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體係完整IgG。

實施例7.如實施例1至6中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含野生型或突變型IgG2 Fc區。

實施例8.如實施例1至6中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含突變型IgG1 Fc區。

實施例9.如實施例1至6中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含突變型IgG4 Fc區。

實施例10.一種抗體或其抗原結合片段，其與如實施例5之抗體結合於同一個人類SIRPα抗原決定基。

實施例11.如實施例1至10中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類化的。

實施例12.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：10且各輕鏈包含SEQ ID NO：20。

實施例13.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：16且各輕鏈包含SEQ ID NO：28。

實施例14.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：18且各輕鏈包含SEQ ID NO：20。

實施例15.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：90。

實施例16.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：92。

實施例17.如實施例1至11中任一者之抗體或抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：95。

實施例18.如實施例1至17中任一者之抗體或抗原結合片段，其包含由哺乳動物細胞之表現所特有的糖基化模式，且視情況藉由從CHO細胞表現而糖基化。

實施例19.一種經分離多肽，其包含SEQ ID NO：75、78、80、82、84、86、88、76、90、92、94、96、98、100、102、104、7、10、12、14、16、18、30、8、20、22、24、26、28及32中之任一者之胺基酸序列，或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。

實施例20.一種經分離核酸，其編碼如實施例1至18之抗體或抗原結合片段中之任一者或如實施例19之多肽中之任一者。

實施例21.如實施例20之經分離核酸，其包含：SEQ ID NO：77之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：79之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：81之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：83之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99% 相同之核酸序列，SEQ ID NO：85之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：87之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：101之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：89之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：91之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：93之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：95之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：97之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：99之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：103之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：9之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列， SEQ ID NO：11之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：13之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：15之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：17之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：29之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：19之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：21之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：23之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：25之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，SEQ ID NO：27之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列，及/或SEQ ID NO：31之核酸序列與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之核酸序列。

實施例22.一種表現載體，其包含如實施例20或21之經分離核酸。

實施例23.如實施例22之表現載體，其編碼抗-SIRPα抗體之重鏈序列及輕鏈序列，該等表現載體包含以下選自由以下組成之群的第一核酸序列/第二核酸序列：SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：77/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：79/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：81/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：91， SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：83/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：85/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：87/SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：9/SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：21， SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：11/SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：25，及SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：27，或在各情況下與相應SEQ ID NO至少90%、95%、97%、98%或99%相同。

實施例24.一種宿主細胞，其包含如實施例22或23之表現載體。

實施例25.如實施例24之宿主細胞，其產生全長抗-SIRPα抗體。

實施例26.如實施例24或25中任一者之宿主細胞，其係細菌細胞、人類細胞、哺乳動物細胞、畢赤酵母細胞、植物細胞、HEK293細胞或中國倉鼠卵巢細胞。

實施例27.一種組合物，其包含如實施例1至18中任一者之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。

實施例28.如實施例27之組合物，其進一步包含誘導ADCC及/或ADCP之第二抗體或其抗原結合片段，其中本發明之該抗體或抗原結合片段藉由第二抗體增強細胞之抗體介導之破壞。

實施例29.如實施例28之組合物，其中該第二抗體或其抗原結合片段與選自由以下組成之群的抗原結合：AMHR2、AXL、BCMA、CA IX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、內皮因子、EPHA2、EphA3、FGFR2b、葉酸鹽受體α、海藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受體、TA-MUC1及PSMA。

實施例30.如實施例29之組合物，其中該第二抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、達妥昔單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13、(CD20)2xCD16、埃羅替尼(Tarceva)、達雷木單抗、阿侖單抗、帕妥珠單抗、本妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、替伊莫單抗、依法妥珠單抗、伐吐珠單抗、奧特勒土珠單抗、卡妥昔單抗、依帕珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX- 6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、樂妥昔單抗、伊薩妥昔單抗、DS-8895、FPA144、GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奧普珠單抗、恩斯土昔單抗、維多汀(Adcetris)、替伊莫單抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Kadcyla)。

實施例31.如實施例28之組合物，其中該第二抗體或其抗原結合片段誘導ADCP。

實施例32.如實施例31之組合物，其中該第二抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、阿侖單抗、替伊莫單抗、伐吐珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202及MOR-208。

實施例33.如實施例27之組合物，其進一步包含一或多種選自由以下組成之群的藥劑：抗-CD27抗體、抗-CD47抗體、抗-APRIL抗體、抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-TIGIT抗體、抗-CTLA4抗體、抗-CS1抗體、抗-KIR2DL1/2/3抗體、抗-CD137抗體、抗-GITR抗體、抗-PD-L2抗體、抗-ILT1抗體、抗-ILT2抗體、抗-ILT3抗體、抗-ILT4抗體、抗-ILT5抗體、抗-ILT6抗體、抗-ILT7抗體、抗-ILT8抗體、抗-CD40抗體、抗-OX40抗體、抗-ICOS、抗-KIR2DL1抗體、抗-KIR2DL2/3抗體、抗- KIR2DL4抗體、抗-KIR2DL5A抗體、抗-KIR2DL5B抗體、抗-KIR3DL1抗體、抗-KIR3DL2抗體、抗-KIR3DL3抗體、抗-NKG2A抗體、抗-NKG2C抗體、抗-NKG2E抗體、抗-4-1BB抗體、抗-TSLP抗體、抗-IL-10抗體、IL-10、聚乙二醇化IL-10、TNF受體蛋白之促效劑(例如促效性抗體或其抗原結合片段或可溶性融合物)、免疫球蛋白樣蛋白、細胞介素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)、活化NK細胞受體、鐸樣受體、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、ICAM-1、LFA-1(CDl la/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAM7、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、PAG/Cbp、CD19a、與CD83特異性結合之配位體、CD47之抑制劑、PD-1之抑制劑、PD-L1之抑制劑、PD-L2之抑制劑、CTLA4之抑制劑、TIM3之抑制劑、LAG3之抑制劑、CEACAM(例如CEACAM-1、-3及/或-5)之抑制劑、VISTA之抑制劑、BTLA之抑制劑、TIGIT之抑制劑、LAIR1之抑制劑、IDO之抑制劑、TDO之抑制劑、CD160之抑制劑、TGFR β之抑制劑及環二核苷酸或其他STING途徑促效劑。

實施例34.一種產生抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含：將包含編碼如實施例1至18之抗體或抗原結合片段中之任一者之重鏈及/或輕鏈的聚核苷酸的宿主細胞在有利於該聚核苷酸之表現的條件下培養；及視情況，從該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或抗原結合片段。

實施例35.一種用於偵測樣品中之SIRPα肽或其片段之存在的方法，該方法包含使該樣品與如實施例1至18中任一者之抗體或片段接觸，且偵測該抗體或片段與該肽之間的複合物之存在；其中偵測到該複合物指示存在該SIRPα肽。

實施例36.如實施例1至18中任一者之抗體或抗原結合片段或如實施例21至25中任一者之組合物，其係用於治療癌症或傳染病。

實施例37.如實施例1至18之抗體或抗原結合片段或如實施例27至33中任一者之組合物，其係用於減少人類個體中之SIRPα/CD47信號傳導。

實施例38.一種治療人類個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量的如實施例1至18中任一者之抗體或抗原結合片段、或如實施例22或23中任一者之表現載體、或如實施例24至26中任一者之宿主細胞、或如實施例27至33中任一者之組合物，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。

實施例39.一種治療人類個體之癌症的方法，該方法包含：向該個體投與有效量之(i)誘導ADCC及/或ADCP之抗體或其抗原結合片段；及(ii)如實施例1至18中任一者之抗體或抗原結合片段、或如實施例22 或23中任一者之表現載體、或如實施例24至26中任一者之宿主細胞、或如實施例27至33中任一者之組合物，視情況與其他治療劑或治療程序聯合，其中(ii)之投與藉由誘導ADCC及/或ADCP之抗體或其抗原結合片段增強細胞之抗體介導之破壞。

實施例40.如實施例39之方法，其中該誘導ADCC及/或ADCP之抗體或其抗原結合片段與選自由以下組成之群的抗原結合：AMHR2、AXL、BCMA、CA IX、CD4、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD38、CD40、CD52、CD98、CSF1R、GD2、CCR4、CS1、EpCam、EGFR、EGFRvIII、內皮因子、EPHA2、EphA3、FGFR2b、葉酸鹽受體α、海藻糖基-GM1、HER2、HER3、IL1RAP、κ骨髓瘤抗原、MS4A1、催乳素受體、TA-MUC1及PSMA。

實施例41.如實施例40之方法，其中該誘導ADCC及/或ADCP之抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、ADCT-502、Hul4.18K322A、Hu3F8、達妥昔單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗-RLI、c.60C3-RLI、Hul4.18-IL2、KM2812、AFM13、(CD20)2xCD16、埃羅替尼(Tarceva)、達雷木單抗、阿侖單抗、帕妥珠單抗、本妥昔單抗、埃羅妥珠單抗、替伊莫單抗、依法妥珠單抗、伐吐珠單抗、奧特勒土珠單抗、卡妥昔單抗、依帕珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、AFM21、AFM22、LY-3022855、SNDX-6352、AFM-13、BI-836826、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、樂妥昔單抗、伊薩妥昔單抗、DS-8895、FPA144、 GM102、GSK-2857916、IGN523、IT1208、ADC-1013、CAN-04、XOMA-213、PankoMab-GEX、chKM-4927、IGN003、IGN004、IGN005、MDX-1097、MOR202、MOR-208、奧普珠單抗、恩斯土昔單抗、維多汀(Adcetris)、替伊莫單抗、ABBV-838、HuMax-AXL-ADC及曲妥珠單抗-美坦新偶聯物(Kadcyla)。

實施例42.如實施例39或40之方法，其中該第二抗體或其抗原結合片段誘導ADCP。

實施例43.如實施例42之方法，其中該第二抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：利妥昔單抗、烏妥昔單抗、馬妥昔單抗、IMGN-529、SCT400、維妥珠單抗、奧濱尤妥珠單抗、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、阿侖單抗、替伊莫單抗、伐吐珠單抗、因厄比利珠單抗、盧姆力土珠單抗、4G7SDIE、BMS-986012、BVX-20、莫格利珠單抗、ChiLob-7/4、GM102、GSK-2857916、PankoMab-GEX、chKM-4927、MDX-1097、MOR202及MOR-208。

實施例44.一種治療人類個體之感染或傳染病的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如實施例1至18中任一者之抗體或抗原結合片段、或如實施例22或23中任一者之表現載體、或如實施例24至26中任一者之宿主細胞、或如實施例27至33中任一者之組合物，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。

實施例45.一種抗體，其具有以下特徵中之一或多者：以<1nM之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：34之序列的人類SIRPαV1蛋白；以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：61之序列的SIRPαV1(P74A)；及以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：38之序列的人類SIRPβ1蛋白，較佳在藉由細胞ELISA量測時；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nm、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合；以<10nM、較佳<5nM、更佳<1.5nM、再更佳<1.0nM、甚至更佳<0.5nM且最佳約0.3nM或更小的EC₅₀與表現人類SIRPαV2蛋白之細胞結合；在50nM、較佳67nM且更佳100nM之抗體濃度下；或者在比抗體對SIRPαV1或SIRPαV2之EC₅₀大10倍、較佳大50倍、更佳大100倍且再更佳大200倍的濃度下，不與SIRPβ1蛋白發生明顯的結合；以<10.0nM、更佳<5.0nM、再更佳<2.5nM且最佳約1.0nM或更小的IC₅₀抑制人類SIRPα與CD47之間的結合；及展現至少79且更佳85之T20「人類化」評分。

實施例46.如實施例45之抗體或抗原結合片段，其以<1nM之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：34之序列的人類SIRPαV1蛋白；以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：61之序列的SIRPαV1(P74A)；及以減小至少100倍之EC₅₀結合具有SEQ ID NO：38之序列的人類SIRPβ1蛋白。

實施例47.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：10或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例48.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：28或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：16或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例49.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：20或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：18或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例50.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：90或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例51.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：92或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例52.如實施例45或46之抗體或抗原結合片段，其包含一個或兩個包含SEQ ID NO：96或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的輕鏈及一個或兩個包含SEQ ID NO：80或與其至少90%、95%、97%、98%或99%相同之序列的重鏈。

實施例53.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體係完整IgG。

實施例54.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含野生型或突變型IgG2 Fc區。

實施例55.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含突變型IgG1 Fc區。

實施例56.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體包含突變型IgG4 Fc區。

實施例57.一種抗體或其抗原結合片段，其與如實施例45至52中任一者之抗體結合於同一個人類SIRPα抗原決定基。

實施例58.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段係人類化的。

實施例59.一種組合物，其包含如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。

實施例60.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段或如實施例59之組合物，其係用於治療癌症或傳染病。

實施例61.如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段或如實施例59之組合物，其係用於減少人類個體中之SIRPα/CD47信號傳導。

實施例62.一種治療人類個體之癌症的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段或如實施例59之組合物，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。

實施例63.一種治療人類個體之感染或傳染病的方法，該方法包含向該個體投與有效量之如實施例45至52中任一者之抗體或抗原結合片段或如實施例59之組合物，視情況與其他治療劑或治療程序聯合。

一般方法

描述分子生物學中之標準方法(Sambrook,Fritsch及Maniatis(1982年及1989年第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA，第217卷，Academic Press,San Diego,CA)。標準方法亦出現於Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第1-4卷，John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述選殖於細菌細胞中及DNA誘變(第1卷)、選殖於哺乳動物細胞及酵母中(第2卷)、糖結合物及蛋白質表現(第3卷)及生物信息學(第4卷)。

描述用於蛋白質純化之方法，包括免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白產生、蛋白質糖基化(參見例如Coligan等人，(2000)Current Protocols in Protein Science，第2卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人，(2001)Current Protocols in Molecular Biology，第3卷，John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY，第16.0.5-16.22.17頁；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；第45-89頁；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.，第384-391頁)。描述多株及單株抗體之產生、純化及片段化(Coligan等人，(2001)Current Protcols in Immunology，第1卷，John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow及Lane，同前文獻)。可獲得用於表徵配位體/受體相互作用之標準技術(參見例如Coligan等人，(2001)Current Protocols in Immunology，第4卷，John Wiley,Inc.,New York)。

可製備單株、多株及人類化抗體(參見例如Sheperd及Dean(編)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann及Dubel(編)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY，第139-243頁；Carpenter等人，(2000)J.Immunol.165：6205；He等人，(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美國專利第6,329,511號)。

人類化之替代方式係使用噬菌體上所展示之人類抗體庫或轉殖基因小鼠中之人類抗體庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等人(2001)Phage Display：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。

描述單鏈抗體及雙功能抗體(參見例如Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson及Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；及美國專利第 4,946,778號)。提供雙功能抗體(參見例如Mack等人，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15；Volkel等人，(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等人，(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等人，(1985)Science 229：81-83；Raso等人，(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等人，(1991)EMBO J.10：3655-3659；及美國專利第5,932,448號、第5,532,210號及第6,129,914號)。

亦提供雙特異性抗體(參見例如Azzoni等人(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。抗原之純化並非抗體產生所必需的。動物可經攜帶相關抗原之細胞免疫。隨後可從經免疫之動物分離脾細胞，且脾細胞可與骨髓瘤細胞株融合以產生融合瘤(參見例如Meyaard等人(1997)Immunity 7：283-290；Wright等人(2000)Immunity 13：233-242；Preston等人，同前文獻；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。

抗體可結合於例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體適用於治療、診斷、套組或其他目的，且包括例如與染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠態金)偶合之抗體(參見例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人 (2002)J.Immunol.168：883-889)。

可獲得用於流動式細胞測量術之方法，包括螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)(參見例如Owens等人，(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。可獲得適合修飾核酸，包括核酸引子及探針、多肽及抗體之螢光試劑用作例如診斷試劑(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。

描述免疫系統之組織學之標準方法(參見例如Muller-Harmelink(編)(1986)Human Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人，(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams及Wilkins,Phila,PA；Louis等人，(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。

可獲得用於測定例如抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能域、糖基化位點及序列比對之套裝軟體及資料庫(參見例如GenBank、Vector NTI®套件(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人，(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人，(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren等人，(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。

實例

以下實例用於說明本發明。此等實例不意欲限制本發明之範疇。

實例1：商業hSIRPα抗體之特異性

藉由細胞ELISA(CELISA)評估各種市售單株抗-hSIRPα抗體(表7)與以下各者結合之特異性：hSIRPα變異體1(hSIRPαV1；GenBank寄存編號：NM_001040022.1)(SEQ ID NO：34)、hSIRPα變異體2(hSIRPαV2；GenBank寄存編號：D86043.1)(SEQ ID NO：36)、hSIRPβ1(GenBank寄存編號：NM_006065.4)(SEQ ID NO：38)、hSIRPβ1轉錄物變異體3/hSIRPβL(NCBI寄存編號：NM_001135844.3)(SEQ ID NO：117)及hSIRPγ(NCBI寄存編號：NM_018556.3)(SEQ ID NO：40)。使用已用脂染胺2000短暫轉染之CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)確認反應性，其中將編碼hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL及hSIRPγ之全長開放閱讀框架之cDNA次選殖至pCI-neo載體(Promega,Madison,WI)中。將CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1、CHO-K1.hSIRPβL及CHO-K1.hSIRPγ細胞接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有5%新生牛血清(BioWest)及青黴素/鏈黴素(Pen/Strep)(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育24小時。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與經純化之hSIRPα抗體(使用10μg/mL及其稀釋液)一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現針對hSIRPαV1、 hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL及hSIRPγ之免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算。

如圖1中所描繪，市售hSIRPα抗體至少與hSIRPβ1、hSIRPβL或hSIRPγ交叉反應或展現對hSIRPαV2之對偶基因特異性結合。KWAR23抗體與所測試之SIRP受體家族之所有成員交叉反應：其與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL及hSIRPγ結合。

實例2：抗-hSIRPα抗體之免疫及選擇

為了產生與所有已知SIRPα對偶基因結合且不結合SIRPβ1之SIRPα抗體，用編碼hSIRPαV1及hSIRPαV2之pCI-neo表現構築體對小鼠進行免疫。使用Helios基因槍(BioRad,Hercules,CA)及塗有DNA之金彈(BioRad)，根據製造商之說明書，藉由基因槍免疫對小鼠進行免疫。簡言之，用pCI-neo-hSIRPαV1或pCI-neo-hSIRPαV2 cDNA以及小鼠Flt3L及小鼠GM-CSF之商業表現載體以2：1：1之比率(均來自Aldevron,Fargo,ND)塗佈1μm金粒子。總共使用1μg質體DNA塗佈500μg金粒子。具體而言，用基因槍在7至8週齡之雌性BALB/C小鼠(Harlan)之耳朵中進行免疫，兩耳均接受3個投藥循環。

出於正向及負向B細胞選擇及CELISA的目的，藉由分別用編碼 hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1及hCD47(NCBI寄存編號：NM_001777.3)(SEQ ID NO：42)之全長開放閱讀框架之pCI-neo載體轉染CHO-K1細胞，產生CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1及CHO-K1.hCD47穩定細胞株。藉由限制稀釋法獲得穩定純系。

使用CHO-K1.hSIRPαV1及CHO-K1.hSIRPαV2穩定細胞株，藉由CELISA評定抗體效價。在補充有10%胎牛血清(Hyclone)及80U青黴素/鏈黴素(Gibco)之DMEM-F12(Gibco)中維持此等表現hSIRPα之CHO-K1細胞株。將細胞以8×10⁴個細胞/孔接種至96孔平底組織培養盤中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培養，直至細胞層匯合。將細胞與經稀釋之小鼠血清之各樣品一起在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育1小時。接著，用磷酸鹽緩衝鹽水(Phosphate buffered Saline，PBS)/0.05% Tween-20(PBS-T)洗滌細胞且與山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(Southern Biotech)一起在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPα免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。在各個別小鼠血清樣品中，如在兩次DNA免疫之後所偵測，抗-hSIRPα效價高於1：2,500。對所有展現出針對hSIRPαV1及hSIRPαV2之反應性的小鼠進行最後第三次免疫且14天後處死。如先前所述製備剔除紅血球之脾臟及淋巴節細胞群體(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134)且冷凍於-180℃下。

為選擇產抗-hSIRPα抗體之B細胞，設計並開發一種優先結合表現與hSIRPαV1及hSIRPαV2結合之抗體的B細胞的選擇策略。從hSIRPαV1/V2 免疫小鼠收集脾細胞及淋巴結且將經分離細胞與接種至T25培養燒瓶中且在30戈雷(Gray)下照射的CHO-K1.hSIRPβ1一起培育。1小時後，藉由來回移動燒瓶輕輕地移除未結合的細胞。隨後將含有未結合細胞之培養基轉移至新的含有經照射之CHO-K1.hSIRPβ1細胞的T25燒瓶中。為了負向選擇hSIRPβ1反應性B細胞，此程序總共在冰上進行三次。接著，將含有未結合B細胞之培養基與在3,000戈雷下照射之CHO-K1.hSIRPαV1及CHO-K1.hSIRPαV2細胞一起培育。在冰上培育1.5小時後，使用培養基進行多個洗滌步驟，移除未結合細胞。隨後，用胰蛋白酶-EDTA(Sigma)收集含有結合有淋巴細胞之CHO-K1.hSIRPαV1及CHO-K1.hSIRPαV2細胞之T25燒瓶。培養所結合之B細胞，如由Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134所述。簡言之，將所選B細胞與10%(v/v)T細胞上清液及經50,000照射(25戈雷)之EL-4 B5飼養細胞(feeder cell)混合於96孔平底組織培養盤中最終200μl體積之培養基中。在第八天，藉由如下所述之CELISA針對hSIRPαV1及hSIRPαV2反應性篩選上清液。

將CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2及CHO-K1.hSIRPβ1接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有10%胎牛血清(Hyclone)及80U青黴素/鏈黴素(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培養，直至其匯合。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與來自B細胞培養物之上清液一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPαV1、抗-hSIRPαV2及抗-hSIRPβ1免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。

使用塗有重組hSIRPγ/Fc蛋白(R&D Systems，目錄號4486-SB-050；SEQ ID NO：108)之96孔MaxiSorp平底盤，藉由ELISA評定對人類SIRPγ之免疫反應性。在PBS/1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)中在室溫(room temperature，RT)下阻斷塗有蛋白質之96孔盤1小時。移除PBS/1% BSA且將培養盤與來自B細胞培養物之上清液一起在室溫下培育1小時。接著，用PBS-T洗滌培養盤且與山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(Southern Biotech)一起在室溫下培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌孔三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPγ免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。

藉由微型電融合，根據已公佈程序(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-34)，存在一些輕微偏差(例如忽略鏈蛋白酶反應)，使來自hSIRPα反應性上清液之對hSIRPβ1沒有反應性或只有極小反應性的B細胞純系永生化。簡言之，將B細胞與10⁶個Sp2/0-Ag14鼠類骨髓瘤細胞(ATCC CRL-1581)混合於電融合等莫耳緩衝液(Eppendorf)中。電融合在50μL融合腔室中藉由以下進行：15s、1MHz、23Vrms AC之交流電場；繼之以10μs、180伏DC之方形高場DC脈衝；及再次15s、1MHz、23Vrms AC之交流電場。將腔室之內含物轉移至融合瘤選擇培養基且在限制稀釋條件下塗於96孔盤中。在電融合之後第10天，藉由如上所述之CELISA及ELISA，針對hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1及hSIRPγ結合活性篩選融合瘤上清液。將分泌特異性結合hSIRPαV1及hSIRPαV2之抗體於上清液中的融合瘤冷凍於-180℃下(-1批)且藉由極限稀釋法次選殖以保護其完整性及穩定性。將穩定融合瘤冷凍於-180℃下(-LD1批)，直至細胞層匯合。

融合瘤之進一步選擇藉由以CELISA形式評定阻斷hSIRPαV1/hCD47相互作用之能力而進行。關於hCD47阻斷之評定，將CHO-K1.hCD47細胞接種於384孔平底組織培養盤中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下在培養基中培育。將重組hSIRPα/Fc蛋白(R&D Systems，目錄號4546-SA-050；SEQ ID NO：107)與含有hSIRPα反應性抗體及對照抗體(10μg/mL及其稀釋液)之融合瘤上清液之連續稀釋液一起在37℃、5% CO₂及95%濕度下預培育30分鐘。用PBS-T洗滌匯合的CHO-K1.hCD47細胞且與含有hSIRPα反應性抗體及重組hSIRPα/Fc蛋白之混合物一起在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞，隨後向細胞中添加山羊抗人類IgG-HRP結合物(Jackson Immuno Research)，將其在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現hSIRPα/Fc蛋白之結合。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。

在無血清培養基中培養所選穩定融合瘤7天；收集上清液且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂，根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。使用分光光度法定量抗體濃度。使用融合瘤培養物之上清液進行融合瘤之亞型分析(isotype)。簡言之，使用小鼠單株抗體亞型分析套組(Biorad)，基於具有相對於常見小鼠同型及輕鏈中之每一者的固定山羊抗小鼠抗體條帶的試紙條(dipstick)，進行亞型分析。所回收抗體經鑑別全係小鼠IgG1。藉由在LakePharma使用以下方法進行小鼠IgG1融合瘤材料之可變區之定序而闡明抗體序列：提取融合瘤細胞之總RNA，以便能夠進行cDNA合成。進行cDNA末端(RACE)之快速擴增，其允許將陽性片段選殖於TOPO(Thermo Fisher Scientific)載體中。對TOPO純系定序且使用VBASE2標註序列(Retter等人，VBASE2,an integrative V gene database.Nucleic Acids Res.2005年1月1日；33(資料庫期刊)：D671-4)。

實例3：hSIRPα抗體之表徵

以CELISA形式比較抗體hSIRPα.50A及抗體KWAR23(加拿大專利2939293 A1)與hSIRPα之結合特異性。用hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1及hSIRPγ(GenBank寄存編號：NM_018556.3)(SEQ ID NO：39)cDNA短暫轉染CHO-K1細胞。隨後，藉由CELISA，使用CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1及CHO-K1.hSIRPγ細胞評定hSIRPα結合。採用山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)用於小鼠抗體(包括hSIRPα.50A)且採用對照抗體，或者採用山羊抗人類IgG-HRP結合物(Jackson Immuno Research)用於KWAR23抗體，偵測所結合之抗體。KWAR23(SEQ ID NO：130；SEQ ID NO：131)在CHO細胞中表現為嵌合人類IgG4 κ抗體。如圖2及下表9中所示，KWAR23抗體與所測試SIRP受體家族之所有成員交叉反應：其與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1及hSIRPγ結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

此外，藉由CELISA，使用與上文相同的策略進一步研究hSIRPα.50A對所有已知的hSIRPα對偶基因(對偶基因變異體，如Takenaka等人，2007,Nat Immunol.8：1313-1323所述)的特異性。為此目的，使用經編碼以下之cDNA短暫轉染的CHO-K1細胞評定hSIRPα.50A結合：全長hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3(NA07056_V3)(SEQ ID NO：43)、hSIRPαV4(NA11832_V4)(SEQ ID NO：45)、hSIRPαV5(NA18502_V5)(SEQ ID NO：47)、hSIRPαV6(NA18507_V6)(SEQ ID NO：49)、hSIRPαV8(NA18570_V8)(SEQ ID NO：51)及hSIRPαV9(NA18943_V9)(SEQ ID NO：53)。圖3及下表10展現抗體純系hSIRPα.50A對此等hSIRPα對偶基因中之每一者的反應性。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

實例4：hCD47阻斷hSIRPα.50A之能力

藉由流動式細胞測量術分析hSIRPα.50A抗體阻斷重組hCD47/Fc蛋白(R&D Systems，目錄號4670-CD-050；SEQ ID NO：109)與細胞表面表現之hSIRPα結合的能力。為此目的，在該分析中使用THP-1(ATCC TIB-202)及U-937(ATCC CRL-1593.2)單核球細胞株作為hSIRPα之來源。將THP-1及U-937細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及hSIRPα.50A抗體(200μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

如圖4及下表11中所描繪，在增加量之hSIRPα.50A抗體存在下，監測與人類IgG1之Fc域融合之重組hCD47的結合。使用上文所述之基於流動式細胞測量術之方法，抗體hSIRPα.50A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

接著，研究hSIRPα.50A與在初級人類CD14⁺單核球上表現之hSIRPα的結合。此外，評定hSIRPα.50A阻斷hSIRPα與重組hCD47/Fc蛋白之間的相互作用的能力。為此目的，使用RosetteSep人類單核球富集混合物(Stemcell)，從經Ficoll純化之人類外周血單核細胞(PBMC)分離CD14+單核球。藉由流動式細胞測量術，在FACSVerse(BD Biosciences)上，基於CD14染色，使用APC-Cy7結合之小鼠抗人類CD14偵測抗體(BD Biosciences)確定富集後所存在之單核球的百分比。隨後，將CD14+富集之PBMC接種於96孔圓底組織培養盤中且與含有hSIRPα.50A抗體(25μg/mL及其稀釋液)之FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與FITC標記之山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)偵測抗體一起在PBS/1% BSA中在4 ℃下培育40分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

圖5A及圖5B及下表12指示hSIRPα.50A與初級人類CD14+富集之單核球結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度。為評定hSIRPα.50A之阻斷能力，將CD14+富集之單核球細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及hSIRPα.50A抗體(200μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。之後，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與10μg/mL DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育45分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。圖5C及圖5D及下表8證明抗體hSIRPα.50A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用之能力。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

實例5：在人類粒細胞吞噬作用分析中hSIRPα.50A mAb之功能性

為確認hSIRPα.50A在初級免疫細胞中之功能性，從健康的人類供體EDTA血液分離粒細胞(例如效應細胞)。首先，將各供體之EDTA血液合併且在300g下在20℃下離心6分鐘。接著，藉由抽吸移除血漿，且輕輕地再懸浮剩餘血球。將細胞回收於紅血球(red blood cell，RBC)溶解緩衝液(155mM NH4Cl；10mM KHCO3)中且在冰上培育10分鐘。接著，將細胞在300g下離心7分鐘。藉由抽吸移除含有溶解的RBC之上清液，且將剩餘血球輕輕地再懸浮於RBC溶解緩衝液中且在冰上保持1分鐘。藉由添加分析培養基(IMDM(Gibco)，補充有10%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中和RBC溶解液。將血球在300g下離心6分鐘且藉由抽吸移除上清液以儘可能地移除剩餘RBC。隨後，將紅血球溶解之血球再懸浮於含有10ng/mL IFNγ之分析培養基中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育細胞1小時。藉由用分析培養基溫和洗滌組織培養盤來收集含有人類粒細胞之非黏附血球(單核球因為黏附至塑膠表面而剔除)。藉由流動式細胞測量術，在FACSCanto II(BD Biosciences)上，基於高前散射(forward scatter，FSC)及側散射(side scatter，SSC)，確定細胞懸浮液中所存在之粒細胞的百分比。hSIRPα.50A與人類粒細胞之結合藉由將細胞與hSIRPα.50A抗體(25μg/mL及其稀釋液)一起在含有10%自體血清之PBS/1% BSA(PBS/1% BSA/10%血清)中在4℃下培育30分鐘來評定。接著，用PBS/1% BSA/10%血清洗滌細胞三次且與FITC標記之山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)偵測抗體一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於PBS/1% BSA/10%血清中且藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。圖6A顯示hSIRPα.50A與初級人類粒細胞結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度。

接著，在Raji(ECACC 85011429)、Daudi(ECACC 85011437)、Ramos(ECACC 85030802)及BJAB(DSMZ ACC-757)淋巴瘤細胞的情況下，用細胞增殖染料eFluor450(eBioscience)，或者針對FaDu細胞，用Vybrant DiD細胞標記溶液(Thermo Fisher Scientific)，對目標細胞進行螢光標記。根據製造商之說明書進行標記。將經標記目標細胞與經分離初級人類粒細胞一起以1：1比率(96孔圓底組織培養盤之每孔，目標細胞及效應細胞各7.5×10⁴個)在37℃、5% CO₂及95%濕度下在0.1μg/mL利妥昔單抗(抗-hCD20)存在下共培養2-3小時。此外，將細胞與0.1μg/mL利妥昔單抗一起在10μg/mL hSIRPα.50A存在下共培養。藉由使用流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上測定對eFluor450(或DID)呈陽性的粒細胞之百分比來分析吞噬作用。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

相比於小鼠IgG1同型對照，hSIRPα.50A強有力地增強利妥昔單抗誘導之腫瘤細胞吞噬作用(圖6B)。對其他現有治療性抗體採用相同程序，該等治療性抗體諸如0.05μg/mL達雷木單抗(抗-hCD38)、0.1μg/mL阿侖單抗(抗-hCD52)及0.1μg/mL西妥昔單抗(抗-hEGFR)(圖6C至圖6E)。此等資料證明，hSIRPα.50A藉由人類粒細胞增強抗體介導之腫瘤細胞吞噬作用。

實例6：在人類巨噬細胞吞噬作用分析中hSIRPα.50A mAb之功能性

藉由hSIRPα.50A阻斷CD47可增強人類巨噬細胞對人類淋巴瘤細胞腫瘤細胞之吞噬作用。首先使用RosetteSep人類單核球富集混合物(Stemcell)從Ficoll純化之人類外周血單核細胞(PBMC)富集CD14+單核球來產生人類巨噬細胞。將單核球接種至CellCarrier 96孔平底微量培養盤(Perkin Elmer)中且於含有50ng/mL人類單核球群落刺激因子(M-CSF)之巨噬細胞培養基(IMDM(Gibco)，補充有8.5%胎牛血清(Gibco)及青黴素/ 鏈黴素(Gibco))中在37℃、5% CO₂及95%濕度下培養7天以促進分化成巨噬細胞。此等單核球衍生之巨噬細胞(MDM)發生黏附，使得其他細胞得以被洗掉。計數人類Raji、Daudi、Ramos及BJAB淋巴瘤細胞且用細胞增殖染料eFluor450(eBioscience)根據製造商之說明書標記。在標記之後，將淋巴瘤細胞與含有10μg/mL抗-hSIRPα抗體、相應同型對照及0.1μg/mL利妥昔單抗(抗-hCD20)或0.05μg/mL達雷木單抗(抗-hCD38)之分析培養基(RPMI(Gibco)，補充有10%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))混合。隨後以2.5：1腫瘤細胞/吞噬細胞之比率向含有MDM之個別孔中添加淋巴瘤細胞，混合且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育2小時。在培育之後，用PBS洗滌孔以移除大部分未吞噬之腫瘤細胞，且在室溫下用2%甲醛固定細胞10分鐘。隨後對孔進行洗滌且於PBS/3% BSA中於暗處4℃下維持過夜。在室溫下用生物素結合之抗人類CD19純系HIB19(eBioscience)對孔中所存在之淋巴瘤細胞染色1小時，且隨後在室溫下用Alexa Fluor 488結合之抗生蛋白鏈菌素(Thermo Fisher Scientific)對比染色1小時。接著，在室溫下用DRAQ5(Thermo Fisher Scientific)對細胞核染色10分鐘，移除混合物，且向各孔中添加PBS。用Operetta自動化螢光顯微鏡(Perkin Elmer)分析細胞。用Columbus V2.6軟體處理並分析資料。

如圖7中所示，hSIRPα.50A增強利妥昔單抗及達雷木單抗介導之吞噬作用活性。人類淋巴瘤細胞之吞噬作用使用吞噬指數定量如下：(巨噬細胞內之腫瘤細胞數/巨噬細胞數)* 100；每個樣品計數至少200個巨噬細胞。

實例7：人類化抗體設計及CDR移植

使用CDR移植技術使小鼠hSIRPα.50A抗體人類化(參見例如美國專利第5,225,539號及Williams,D.G.等人，2010,Antibody Engineering，第1卷，第21章)。

首先，使用IgBLAST鑑別人類生殖系序列(Ye J.等人，2013,Nucleic Acids Res.41：W34-40)。關於hSIRPα.50A VH人類生殖系序列，鑑別V-基因IGHV1/OR15-2*02(75.2%一致性)，且關於VL人類生殖系序列，鑑別IGKV1-27*01(74.0%一致性)。使用這兩個生殖系序列直接移植小鼠CDR，產生以下兩個cDNA構築體：SEQ ID NO：17(VH)及SEQ ID NO：25(VL)。

接著，構建含有IMGT資料庫(Lefranc,M.-P.等人，1999,Nucleic Acid Res.27：209-212)中可用的所有人類序列的資料庫來鑑別85,848個個別序列。使用TBLASTN(2.2.31+)查詢此等序列以鑑別展現與hSIRPα.50A VH及VL序列之構架之最高一致性的模板序列。鑑別出三個VH及三個VL序列，該等序列展現75%或更高的相似性評分且展現相似的CDR長度，較佳分別與hSIRPα.50A VH CDR1、CDR2、CDR3及VL CDR1、CDR2及CDR3中的相同。

關於重鏈，選擇由GenBank(Benson,D.A.等人，2013,Nucleic Acids Res.41(D1)：D36-42)寄存編號AB066948、AB067235及U84168編碼之構架作為hSIRPα.50A VH CDR之直接移植模板，分別產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：9、11及13。關於輕鏈，選擇由GenBank寄存編號JF894288、AB363321及L12101編碼之構架作為hSIRPα.50A VL CDR之直接移植模板，產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：19、21及23。構架及CDR定義如Kabat等人(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,Kabat,E.等人，US Department of Health and Human Services,(1983))所述。

為瞭解人類化構架殘基對Fv結構的影響，在Discovery Studio 4.5內使用『抗體模型化級聯』(預設參數)製造小鼠hSIRPα.50A Fv之同源模型。同源模型於輕鏈及Fv而言係在PDB ID 1CIC之基礎上構建，且於重鏈而言係在PDB ID 4Q0X之基礎上構建。電腦模擬(in silico)移植CDR以研究接近CDR中之任一者且可能影響環構形之殘基，稱為游標殘基(Vernier residue)。鑑別可能影響環構形且距離CDR表面在<5Å內的殘基且用此位置之小鼠胺基酸取代。使用Discovery Studio 4.5檢查所得模板中轉譯後修飾(post translational modification，PTM)基元之存在且在可能的情況下(亦即非CDR、非游標殘基)，改變所得模板以防止PTM。關於重鏈，移除hSIRPα.50A VH中之預測序列PTM基元及結構考慮因素(亦即主鏈之剛性)，產生一種額外構築體設計：SEQ ID NO：15。關於輕鏈，PTM移除產生以下構築體：SEQ ID NO：27。

將CDR移植於所鑑別模板中之每一者上，該等模板表現為選殖於pcDNA3.1(+)載體(Thermo Fisher Scientific)中之人類IgG4(SEQ ID NO：65)、κ(SEQ ID NO：63)抗體且用於在FreeStyle 293-F人類胚胎腎細胞(HEK293T/17，ATCC CRL-11268)中短暫轉染。在各情況下，使用攜帶穩定Adair突變(Angal S.等人，1993,Mol Immunol.30：105-108)之IgG4版本，其中絲胺酸228轉換為脯胺酸。

實例8：人類化構築體之合成、表現及純化

編碼重鏈及輕鏈構築體之質體以1：1比率(總共30μg)混合且藉由使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)根據製造商之說明書轉染至FreeStyle 293- F細胞中而暫時表現。7天後收集上清液(30ml)且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。使用Zeba脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)，將緩衝液更換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝液。經純化抗體之濃度基於OD280(Nanodrop ND-1000)而確定。內毒素含量藉由LAL測試根據製造商之說明書(Lonza)確定。

實例9：人類化SIRPα抗體之結合

以CELISA形式研究人類化抗體與hSIRPα之結合。使用CHO-K1細胞確認hSIRPα抗體與人類SIRPαV1、SIRPαV2、hSIRPβ1及hSIRPγ之結合，該等細胞已經編碼次選殖至pCI-neo載體中之此等相應目標中之每一者的全長開放閱讀框架的cDNA短暫轉染。將CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1及CHO-K1.hSIRPγ細胞接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有5%新生牛血清(BioWest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育，直至細胞層匯合。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與經純化之hSIRPα抗體(10μg/mL及其稀釋液)一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗人類IgG-HRP結合物(Jackson Immuno Research)或山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPα免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算。在表9中描述人類化hSIRPα抗體之EC50值。

表13：人類化及親本hSIRPα.50A抗體與CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1及CHO-K1.hSIRPγ細胞之結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

應注意，具有H2重鏈之變異體不能在FreeStyle 293-F細胞中表現；以灰色表示之值係外推所得

親本及人類化hSIRPα抗體與hSIRPγ之結合進一步使用NK-92MI細胞(ATCC CRL-2408)評定，該等細胞係衍生自NK-92細胞株之介白素-2(IL-2)獨立的自然殺手細胞株。將NK-92MI細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與人類化hSIRPα.50A抗體變異體(100μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育30分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且在4℃下與FITC標記之小鼠抗人類IgG4(Abcam)或驢抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research)偵測抗體一起在PBS/1% BSA中培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於PBS/1% BSA中且藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

實例10：藉由人類化hSIRPα.50A抗體阻斷hCD47與hSIRPα之結合

hCD47阻斷藉由針對人類化hSIRPα.50A抗體之全譜之流動式細胞測量術評定。為此目的，使用脂染胺2000(Invitrogen)用編碼人類SIRPαV1之全長開放閱讀框架之pCI-neo載體短暫轉染HEK293細胞(ATCC CRL-1573)。經轉染細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下於培養基(DMEM-F12(Gibco)，含有10%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中培養，直至匯合。隨後，將細胞解離且接種於96孔圓底組織培養盤中且與人類化hSIRPα.50A抗體變異體(100μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育30分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與重組hCD47/Fc蛋白(ModiQuest；SEQ ID NO：42)一起在4℃下培育30分鐘。隨後，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且在4℃下與小鼠抗人類IgG1鉸鏈-FITC(Southern Biotech)偵測抗體一起培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於PBS/1% BSA中且藉由流動式細胞測量術在 FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料且使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)繪圖(圖8)。

如圖8中所描繪，在增加量之人類化hSIRPα.50A抗體變異體存在下，監測與人類IgG1之Fc域融合之重組hCD47的結合。所有抗體變異體全都阻斷hSIRPα/hCD47相互作用。

實例11：hSIRPα.50A之結合域

為鑑別hSIRPα.50A之結合區，基於人類SIRPαV1及hSIRPβ1胺基酸序列設計若干SIRPα交換突變體。基於SIRPα之摺疊，細胞外區域可以再分為三個單獨的域：Ig樣(免疫球蛋白樣)V型(IgV)、Ig樣C1型(IgC1)及Ig樣C2型(IgC2)域。IgV域亦稱為SIRPα之配位體結合N端域(其與CD47結合)。在全長hSIRPαV1序列(SEQ ID NO：33)的基礎上設計人類SIRPαV1/β1突變體且各個別Ig樣域經人類SIRPβ1(SEQ ID NO：37)之等效域取代。合成(GeneArt)編碼構築體hSIRPα-VβC1αC2α(SEQ ID NO：55)、hSIRPα-VαC1βC2α(SEQ ID NO：57)及hSIRPα-VαC1αC2β(SEQ ID NO：59)之cDNA且將其次選殖至pCI-neo載體中。使用CELISA測試hSIRPα.50A與交換突變體之結合。為此目的，使用脂染胺2000，分別用編碼hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPα-VβC1αC2α、hSIRPα-VαC1βC2α及hSIRPα-VαC1αC2β之pCI-neo載體短暫轉染CHO-K1細胞。經轉染細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下於培養基(DMEM-F12(Gibco)，含有5%新生牛血清(Biowest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中培養，直至匯合。隨後，將細胞胰蛋白酶化且接種於96孔平底組織培養盤中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下於培養基中培養，直至匯合。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與hSIRPα.50A及抗-hSIRPα純系SE5A5抗體一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(Southern Biotech)一起培育1小時。此後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPα免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。

本發明之抗體顯示缺失與hSIRPα-VβC1αC2α突變體之結合，指示hSIRPα.50A與hSIRPα之IgV域結合(圖9；表14)。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

為精確定位用於hSIRPα.50A與IgV域相互作用之胺基酸，基於hSIRPαV1/V2與hSIRPβ1之間的單胺基酸差異產生hSIRPαV1之若干點突變體。圖10A顯示hSIRPα與hSIRPβ1 IgV域之比對。藉由使用QuikChange II定點誘變套組(Stratagene)及全長hSIRPαV1序列(SEQ ID NO：33)作為供體cDNA，使hSIRPβ1中改變的hSIRPα IgV域中之胺基酸突變。使用CELISA測試hSIRPα.50A與hSIRPαV1點突變體之結合。為此目的，使用脂染胺2000，用編碼次選殖至pCI-neo載體中之hSIRPαV1及其突變體及hSIRPβ1之全長開放閱讀框架的cDNA短暫轉染CHO-K1細胞。將經轉染細胞接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有5%新生牛血清(BioWest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育24小時。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與經純化之hSIRPα抗體(使用10μg/mL及其稀釋液)一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現針對hSIRPαV1、hSIRPαV1突變體及hSIRPβ1之免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。如圖10B及下表15中所示，在位置74處之脯胺酸構成hSIRPα.50A與hSIRPαV1特異性結合之關鍵胺基酸。CHO-K1細胞上脯胺酸74轉換為丙胺酸處之hSIRPαV1(P74A)(SEQ ID NO：61)的表現引起hSIRPα.50A抗體結合之缺失。此脯胺酸不存在於hSIRPβ1之IgV域序列中。

實例12：hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體之表徵

以CELISA形式比較抗體hSIRPα.40A及hSIRPα.50A與hSIRPα之結合特異性。簡言之，用hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRPβL及hSIRPγ cDNA短暫轉染CHO-K1細胞。隨後，藉由CELISA，使用CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV2、CHO-K1.hSIRPβ1、CHO-K1.hSIRPβL及CHO-K1.hSIRPγ細胞評定hSIRPα結合。經結合抗體之偵測用山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)進行。如圖11及表16中所示，hSIRPα.40A及hSIRPα.50A抗體與hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβL及hSIRPγ結合，但不展示可偵測的hSIRPβ1結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

此外，藉由CELISA，使用與上文相同的策略進一步研究hSIRPα.40A對所有已知的hSIRPα對偶基因(對偶基因變異體，如Takenaka等人，Nat Immunol.8：1313-1323(2007)所述)的特異性。為此目的，使用經編碼以下之cDNA短暫轉染的CHO-K1細胞評定hSIRPα.40A結合：全長hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPαV3(NA07056_V3)(SEQ ID NO：44)、hSIRPαV4(NA11832_V4)(SEQ ID NO：46)、hSIRPαV5(NA18502_V5)(SEQ ID NO：48)、hSIRPαV6(NA18507_V6)(SEQ ID NO：50)、hSIRPαV8(NA18570_V8)(SEQ ID NO：52)及hSIRPαV9 (NA18943_V9)(SEQ ID NO：54)。圖12及表17展現抗體純系hSIRPα.40A對此等hSIRPα對偶基因中之每一者的反應性。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

實例13：hCD47阻斷hSIRPα.40A之能力

藉由流動式細胞測量術分析hSIRPα.40A抗體阻斷重組hCD47/Fc蛋白(R&D Systems，目錄號4670-CD-050；SEQ ID NO：109)與細胞表面表現之hSIRPα結合的能力。為此目的，在該分析中使用THP-1(ATCC TIB-202)及U-937(ATCC CRL-1593.2)單核球細胞株作為hSIRPα之來源。將THP-1及U-937細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及hSIRPα.40A抗體(100μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

如圖13及表18中所描繪，在增加量之hSIRPα.40A抗體存在下，監測與人類IgG1之Fc域融合之重組hCD47的結合。使用上文所述之基於流動式細胞測量術之方法，抗體hSIRPα.40A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

接著，研究hSIRPα.40A與在初級人類CD14⁺單核球上表現之hSIRPα的結合。此外，評定hSIRPα.40A阻斷hSIRPα與重組hCD47/Fc蛋白之間的相互作用的能力。為此目的，使用RosetteSep人類單核球富集混合物(Stemcell)，從經Ficoll純化之人類外周血單核細胞(PBMC)分離CD14+單核球。藉由流動式細胞測量術，在FACSVerse(BD Biosciences)上，基於CD14染色，使用APC-Cy7結合之小鼠抗人類CD14偵測抗體(BD Biosciences)確定富集後所存在之單核球的百分比。隨後，將CD14+富集之PBMC接種於96孔圓底組織培養盤中且與含有hSIRPα.40A抗體(20μg/mL及其稀釋液)之FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與Alexa Fluor 647標記之山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)偵測抗體一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

圖14(上面兩張圖)顯示hSIRPα.40A與初級人類CD14+富集之單核球結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度。為評定hSIRPα.40A之阻斷能力，將CD14+富集之單核球細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及hSIRPα.40A抗體(20μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。之後，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與10μg/mL DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育45分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。圖14(下面兩張圖)展現抗體hSIRPα.40A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用之能力。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

實例14：在人類粒細胞吞噬作用分析中hSIRPα.40A mAb之功能性

為確認hSIRPα.40A在初級免疫細胞中之功能性，從健康的人類供體EDTA血液分離粒細胞(例如效應細胞)。首先，將各供體之EDTA血液合併且在300g下在20℃下離心6分鐘。接著，藉由抽吸移除血漿，且輕輕地再懸浮剩餘血球。將細胞回收於紅血球(RBC)溶解緩衝液(155mM NH4Cl；10mM KHCO3)中且在冰上培育10分鐘。接著，將細胞在300g下離心7分鐘。藉由抽吸移除含有溶解的RBC之上清液，且將剩餘血球輕輕地再懸浮於RBC溶解緩衝液中且在冰上保持1分鐘。藉由添加分析培養基(IMDM(Gibco)，補充有10%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中和RBC 溶解液。將血球在300g下離心6分鐘且藉由抽吸移除上清液以儘可能地移除剩餘RBC。隨後，將紅血球溶解之血球再懸浮於含有10ng/mL IFNγ之分析培養基中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育細胞1小時。藉由用分析培養基溫和洗滌組織培養盤來收集含有人類粒細胞之非黏附血球(單核球因為黏附至塑膠表面而剔除)。藉由流動式細胞測量術，在FACSCanto II(BD Biosciences)上，基於高前散射(FSC)及側散射(SSC)，確定細胞懸浮液中所存在之粒細胞的百分比。hSIRPα.40A與人類粒細胞之結合藉由將細胞與hSIRPα.40A抗體(25μg/mL及其稀釋液)一起在含有10%自體血清之PBS/1% BSA(PBS/1% BSA/10%血清)中在4℃下培育30分鐘來評定。接著，用PBS/1% BSA/10%血清洗滌細胞三次且與FITC標記之山羊抗小鼠Ig(BD Biosciences)偵測抗體一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於PBS/1% BSA/10%血清中且藉由流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。圖15A及表19顯示hSIRPα.40A與初級人類粒細胞結合。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度。

接著，用細胞增殖染料eFluor450(eBioscience)螢光標記Ramos(ECACC 85030802)目標細胞。根據製造商之說明書進行標記。將經標記目標細胞與經分離初級人類粒細胞一起以1：1比率(96孔圓底組織培養盤之每孔，目標細胞及效應細胞各7.5×10⁴個)在37℃、5% CO₂及95%濕度下在0.1μg/mL利妥昔單抗(抗-hCD20)存在下共培養2-3小時。此外，將細胞與0.1μg/mL利妥昔單抗一起在10μg/mL hSIRPα.40A存在下共培養。藉由使用流動式細胞測量術在FACSCanto II(BD Biosciences)上測定對eFluor450呈陽性的粒細胞之百分比來分析吞噬作用。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。

相比於小鼠IgG1同型對照，hSIRPα.40A強有力地增強利妥昔單抗誘導之腫瘤細胞吞噬作用(圖15B)。

實例15：在人類巨噬細胞吞噬作用分析中hSIRPα.40A mAb之功能性

藉由hSIRPα.40A阻斷CD47可增強人類巨噬細胞對人類淋巴瘤細胞腫瘤細胞之吞噬作用。首先使用RosetteSep人類單核球富集混合物(Stemcell)從Ficoll純化之人類外周血單核細胞(PBMC)富集CD14+單核球來產生人類巨噬細胞。將單核球接種至CellCarrier 96孔平底微量培養盤(Perkin Elmer)中且於含有50ng/mL人類單核球群落刺激因子(M-CSF)之巨噬細胞培養基(IMDM(Gibco)，補充有8.5%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中在37℃、5% CO₂及95%濕度下培養7天以促進分化成巨噬細胞。此等單核球衍生之巨噬細胞(MDM)發生黏附，使得其他細胞得以被洗掉。計數人類Raji淋巴瘤細胞且用細胞增殖染料eFluor450(eBioscience)根據製造商之說明書標記。在標記之後，將淋巴瘤細胞與含有100μg/mL抗-hSIRPα抗體及其稀釋液、相應同型對照抗體及1μg/mL利妥昔單抗(抗-hCD20)之分析培養基(RPMI(Gibco)，補充有10%胎牛血清(Gibco)及青黴素/鏈黴素(Gibco))混合。隨後以2.5：1腫瘤細胞/吞噬細胞之比率向含有MDM之個別孔中添加淋巴瘤細胞，混合且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育2小時。在培育之後，用PBS洗滌孔以移除大部分未吞噬之腫瘤細胞，且在室溫下用2%甲醛固定細胞10分鐘。隨後對孔進行洗滌且於PBS/3% BSA中於暗處4℃下維持過夜。在室溫下用生物素結合之抗人類CD19純系HIB19(eBioscience)對孔中所存在之淋巴瘤細胞染色1小時，且隨後在室溫下用Alexa Fluor 488結合之抗生蛋白鏈菌素(Thermo Fisher Scientific)對比染色1小時。接著，在室溫下用DRAQ5(Thermo Fisher Scientific)對細胞核染色10分鐘，移除混合物，且向各孔中添加PBS。用Operetta自動化螢光顯微鏡(Perkin Elmer)分析細胞。用Columbus V2.6軟體處理並分析資料。

如圖16中所示，hSIRPα.40A增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性。人類淋巴瘤細胞之吞噬作用使用吞噬指數定量如下：(巨噬細胞內之腫瘤細胞數/巨噬細胞數)* 100；每個樣品計數至少200個巨噬細胞。

實例16：人類化抗體設計及CDR移植

使用CDR移植技術使小鼠hSIRPα.40A抗體人類化(參見例如美國專利第5,225,539號及Williams,D.G.等人，2010,Antibody Engineering，第1卷，第21章)。首先，使用IgBLAST鑑別人類生殖系序列(Ye J.等人，Nucleic Acids Res.41：W34-40(2013))。關於hSIRPα.40A VH人類生殖系序列，鑑別V-基因IGHV1-46*01(62.2%一致性)，且關於VL人類生殖系序列，鑑別IGKV1-39*01(68.4%一致性)。使用這兩個生殖系序列作為模板移植小鼠CDR，產生以下兩個cDNA構築體：SEQ ID NO：87(VH)及SEQ ID NO：99(VL)。

接著，構建含有IMGT資料庫(Lefranc,M.-P.等人，Nucleic Acid Res.27：209-212(1999))中可用的所有人類序列的資料庫來鑑別85,848個個別序列。使用TBLASTN(2.2.31+)查詢此等序列以鑑別展現與hSIRPα.40A VH及VL序列之構架之最高一致性的模板序列。鑑別出四個VH及四個VL序列，該等序列展現80%或更高的相似性評分且展現相似的CDR長度，較佳分別與hSIRPα.40A VH CDR1、CDR2、CDR3及VL CDR1、CDR2及CDR3中的相同。

關於重鏈，選擇由GenBank(Benson,D.A.等人，Nucleic Acids Res.41(D1)：D36-42(2013))寄存編號L39130、DJ031925、DJ326840及EF177968編碼之構架作為hSIRPα.40A VH CDR之移植模板，分別產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：77、79、81及83。關於輕鏈，選擇由GenBank寄存編號AY731031、DQ840993、AY942002及DQ535171編碼之構架作為hSIRPα.40A VL CDR之直接移植模板，產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：89、91、93及95。另外，構建含有公有領域中可得之所有人類化抗體序列的資料庫，鑑別300個序列。使用BLASTP(2.2.31+)查詢此等序列以鑑別展現與hSIRPα.40A VH及VL序列之構架之最高一致性的模板序列。關於重鏈，選擇吉妥珠單抗之構架作為hSIRPα.40A VH CDR之移植模板，產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：85。關於輕鏈，選擇阿珠單抗(Alacizumab)之構架作為hSIRPα.40A VL CDR之移植模板，產生以下cDNA構築體：SEQ ID NO：97。

構架及CDR定義如Kabat等人(「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,Kabat,E.等人，US Department of Health and Human Services,(1983))所述。

為研究人類化構架殘基對Fv結構的影響，在Discovery Studio 4.5內使用『抗體模型化級聯』(預設參數)製造小鼠hSIRPα.40A Fv之同源模型。同源模型於輕鏈而言係在PDB ID 3UMT之基礎上構建，於重鏈而言係在PDB ID 1EHL之基礎上構建，且於Fv而言係在PDB ID 3BGF之基礎上構建。電腦模擬移植CDR以研究接近CDR中之任一者且可能影響環構形之殘基，稱為游標殘基。鑑別可能影響環構形且距離CDR表面在<5Å內的殘基且用此位置之小鼠胺基酸取代。使用Discovery Studio 4.5檢查所得模板中轉譯後修飾(PTM)基元之存在且在可能的情況下(亦即非CDR、非游標殘基)，改變所得模板以防止PTM。VH CDR2含有可藉由天冬醯胺至絲胺酸突變移除之糖基化位點。

將CDR移植於所鑑別模板中之每一者上，該等模板表現為選殖於pcDNA3.1(+)載體(Thermo Fisher Scientific)中之人類IgG2(SEQ ID NO：68)、κ(SEQ ID NO：64)抗體且用於在FreeStyle 293-F人類胚胎腎細胞(HEK293T/17，ATCC CRL-11268)中短暫轉染。

實例17：嵌合及人類化構築體之合成、表現及純化

編碼重鏈及輕鏈人類化構築體之質體以1：1比率(總共30μg)混合且藉由使用293fectin轉染試劑(Invitrogen)根據製造商之說明書轉染至FreeStyle 293-F細胞中而暫時表現。7天後收集上清液(30ml)，經0.22μm過濾器過濾，且使用MabSelect Sure蛋白A樹脂根據製造商之說明書(GE Healthcare)純化抗體。使用Zeba脫鹽管柱(Thermo Fisher Scientific)，將緩衝液更換為10mM組胺酸、100mM NaCl pH 5.5緩衝液。經純化抗體之濃度基於OD280(Nanodrop ND-1000)而確定。內毒素含量藉由LAL測試根據製造商之說明書(Lonza)確定。

實例18：人類化SIRPα抗體之結合

藉由流動式細胞測量術，使用CHO-K1.hSIRPαV1穩定細胞株評定親本及人類化抗體與hSIRPα之結合。將CHO-K1.hSIRPαV1細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與人類化hSIRPα.40A抗體變異體(20μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且在4℃下與Alexa Fluor 647標記之山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)或Alexa Fluor 647標記之驢抗人類IgG(Jackson Immuno Research)偵測抗體一起在PBS/1% BSA中培育40分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算(圖17及表20)。

實例19：藉由人類化hSIRPα.40A抗體阻斷hCD47與hSIRPα之結合

hCD47阻斷藉由針對人類化hSIRPα.40A抗體之全譜之流動式細胞測量術評定。為此目的，在該分析中，使用U-937(ATCC CRL-1593.2)單核球細胞株作為hSIRPα之來源。將U-937細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及親本或人類化hSIRPα.40A抗體變異體(20μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與10μg/mL DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料且使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)繪圖。

如圖18及表21中所描繪，在增加量之人類化hSIRPα.40A抗體變異體存在下，監測與人類IgG1之Fc域融合之重組hCD47的結合。使用上文所述之基於流動式細胞測量術之方法，人類化hSIRPα.40A阻斷hSIRPα/hCD47相互作用。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

實例20：hSIRPα.40A之結合域

為鑑別hSIRPα.40A之結合區，基於人類SIRPβ1及SIRPγ胺基酸序列設計若干SIRPβ1交換突變體。基於SIRPα/β1/γ之摺疊，細胞外區域可以再分為三個單獨的域：Ig樣(免疫球蛋白樣)V型(IgV)、Ig樣C1型(IgC1)及Ig樣C2型(IgC2)域。IgV域亦稱為SIRPα及SIRPγ之配位體結合N端域(其與CD47結合)。基於全長hSIRPβ1序列(SEQ ID NO：38)設計人類SIRPβ1/γ突變體且各個別Ig樣域經人類SIRPγ(SEQ ID NO：40)之等效域取代。合成(GeneArt)編碼構築體hSIRP-VγC1βC2β(SEQ ID NO：110)、hSIRP-VβC1γC2β(SEQ ID NO：112)及hSIRP-VβC1βC2γ(SEQ ID NO：114)之cDNA且將其次選殖至pCI-neo載體中。使用CELISA測試 hSIRPα.40A與交換突變體之結合。為此目的，使用脂染胺2000，用分別編碼hSIRPαV1、hSIRPαV2、hSIRPβ1、hSIRP-VγC1βC2β、hSIRP-VβC1γC2β及hSIRP-VβC1βC2γ之pCI-neo載體短暫轉染CHO-K1細胞。經轉染細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下於培養基(DMEM-F12(Gibco)，含有5%新生牛血清(Biowest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中培養，直至匯合。隨後，將細胞胰蛋白酶化且接種於96孔平底組織培養盤中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下於培養基中培養，直至匯合。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與hSIRPα.40A、hSIRPα.50A及抗-hSIRPα純系SE5A5抗體一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP結合物(Southern Biotech)一起培育1小時。此後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現抗-hSIRPα免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。

本發明之抗體顯示與hSIRP-VγC1βC2β突變體之結合增加，指示hSIRPα.40A與hSIRPα及hSIRPγ之IgV域結合(圖19及表22)。EC50值表示觀察到總結合信號之50%時的濃度(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

為精確定位用於hSIRPα.40A與IgV域相互作用之胺基酸，基於hSIRPαV1/V2與hSIRPβ1之間的單胺基酸差異產生hSIRPαV1之若干點突變體。以下序列比對顯示hSIRPα與hSIRPβ1 IgV域之比對。

IgV域之序列比對：

藉由使用QuikChange II定點誘變套組(Stratagene)及全長hSIRPαV1序列(SEQ ID NO：33)作為供體cDNA，使hSIRPβ1中改變的hSIRPα IgV域中之胺基酸突變。使用CELISA測試hSIRPα.40A與hSIRPαV1點突變體之結合。為此目的，使用脂染胺2000，用編碼次選殖至pCI-neo載體中之hSIRPαV1及其突變體及hSIRPβ1之全長開放閱讀框架的cDNA短暫轉染CHO-K1細胞。將經轉染細胞接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有5%新生牛血清(BioWest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育24小時。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與經純化之hSIRPα抗體(使用10μg/mL及其稀釋液)一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現針對hSIRPαV1、hSIRPαV1突變體及hSIRPβ1之免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算(平均值及SD從兩個獨立實驗之值計算)。

如圖20及表23中所示，在位置74處之脯胺酸構成hSIRPα.40A與hSIRPαV1特異性結合之關鍵胺基酸。CHO-K1細胞上脯胺酸74(P74)轉換為丙胺酸處之hSIRPαV1(P74A)(SEQ ID NO：62)的表現引起hSIRPα.40A抗體結合之缺失。此脯胺酸不存在於hSIRPβ1之IgV域序列中，且可在IgV域之恰當構形中起作用。

實例21：人類巨噬細胞吞噬作用分析中嵌合hSIRPα.40A mAb變異體之功能性

移植於不同Fc恆定域上之hSIRPα.40A可變域之功能性藉由活體外吞噬作用分析，使用人類巨噬細胞評定。人類巨噬細胞吞噬作用分析之實驗條件與上文實例15中所說明的實驗條件類似。將經標記之Raji淋巴瘤細胞與含有10μg/mL或1μg/mL嵌合hSIRPα.40A抗體變異體及1μg/mL利妥昔單抗之分析培養基混合，且隨後以2.5：1腫瘤細胞/吞噬細胞之比率添加至MDM中。在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育細胞2小時。

用Operetta自動化螢光顯微鏡(Perkin Elmer)進行分析且用Columbus V2.6軟體處理並分析資料。人類淋巴瘤細胞之吞噬作用使用吞噬指數定量如下：(巨噬細胞內之腫瘤細胞數/巨噬細胞數)* 100；每個樣品計數至少200個巨噬細胞。

如圖21中所示，野生型(WT)嵌合hSIRPα.40A.hIgG4抗體不增強利妥昔單抗介導之吞噬作用，而含有N297Q(SEQ ID NO：126)、L234A.L235A(LALA)(SEQ ID NO：123)或L234A.L235A.P329G(LALAPG)(SEQ ID NO：125)突變之惰性嵌合hSIRPα.40A.hIgG1(SEQ ID NO：119)抗體變異體以濃度依賴性方式增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性。類似地，hSIRPα.40A.hIgG2及含有V234A.G237A.P238S.H268A.V309L.A330S.P331S(Sigma)(SEQ ID NO：122)突變之惰性嵌合hSIRPα.40A.hIgG2抗體變體以濃度依賴性方式增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性。

實例22：人類巨噬細胞吞噬作用分析中人類化hSIRPα.40A mAb變異體之功能性

藉由活體外吞噬作用分析，使用人類巨噬細胞評定選定的一組人類化hSIRPα.40A抗體變異體之功能性。人類巨噬細胞吞噬作用分析之實驗條件與實例6中所說明的實驗條件類似。

如圖22中所示，人類化hSIRPα.40A抗體變異體類似於移植於hIgG2 Fc上之抗體KWAR23，以濃度依賴性方式增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性。

實例23：人類巨噬細胞吞噬作用分析中嵌合hSIRPα.50A mAb變異體之功能性

移植於不同Fc恆定域上之hSIRPα.50A可變域之功能性藉由活體外吞噬作用分析，使用人類巨噬細胞評定。如圖23A中所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG4抗體略微增強利妥昔單抗介導之吞噬作用，而嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗體類似於鼠類hSIRPα.50A.mIgG1(SEQ ID NO：120)抗體，增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性。圖23B表明，相比於人類IgG2同型對照，嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗體強有力地以濃度依賴性方式增強由利妥昔單抗誘導之腫瘤細胞吞噬作用。類似地，hSIRPα.50A.hIgG2增強達雷木單抗介導之吞噬作用(抗-hCD38，使用0.05μg/mL)(圖23C)。

此外，hSIRPα.50A.hIgG2亦增強人類粒細胞中利妥昔單抗介導之吞噬作用。如圖23D中所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG2抗體增強由利妥昔單抗誘導之吞噬作用活性，達到與鼠類hSIRPα.50A.mIgG1抗體類似的程度。類似地，如圖24A中所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q、hSIRPα.50A.hIgG4.N297Q(SEQ ID NO：127)或hSIRPα.50A.hIgG2抗體藉由人類MDM增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性，達到與鼠類hSIRPα.50A.mIgG1抗體(利妥昔單抗，使用1μg/mL)類似的程度。當用達雷木單抗(0.05μg/mL)誘導吞噬作用時，在圖24B中得到類似的觀察結果。如圖25中所示，嵌合hSIRPα.50A.hIgG1.N297Q及hSIRPα.50A hIgG1.L234A.L235A.P329G抗體亦藉由人類MDM增強利妥昔單抗介導之吞噬作用活性，達到與hSIRPα.50A.hIgG2抗體(利妥昔單抗，使用1μg/mL)類似的程度。含有野生型hIgG1或hIgG4 Fc區之hSIRPα.50A之嵌合變異體不增強腫瘤細胞吞噬作用。

實例24：KWAR23、純系18D5、hSIRPα.50A及hSIRPα.40A抗體之比較

藉由CELISA評估單株抗-hSIRPα抗體KWAR23、來自WO2017/178653之純系18D5(SEQ ID NO：128；SEQ ID NO：129)、hSIRPα.50A及hSIRPα.40A與hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2及hSIRPβ1結合之特異性的直接比較。使用表現某種cDNA之CHO-K1細胞(ATCC CCL-61)確認反應性，該cDNA編碼次選殖至pCI-neo載體(Promega,Madison,WI)中之hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2及hSIRPβ1之全長開放閱讀框架。將CHO-K1.hSIRPαV1、CHO-K1.hSIRPαV1(P74A)、CHO-K1.hSIRPαV2及CHO-K1.hSIRPβ1細胞接種於96孔平底組織培養盤中之培養基(DMEM-F12(Gibco)，補充有5%新生牛血清(BioWest)及青黴素/鏈黴素(Gibco))中且在37℃、5% CO₂及95%濕度下培育24小時。隨後，移除培養基且將細胞在37℃、5% CO₂及95%濕度下與經純化之hSIRPα抗體(使用10μg/mL及其稀釋液)一起培育1小時。接著，用PBS-T洗滌細胞且在37℃、5% CO₂及95%濕度下與山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech)一起培育1小時。隨後，用PBS-T洗滌細胞三次且用TMB穩定之色素原(Invitrogen)顯現針對hSIRPαV1、hSIRPαV1(P74A)、hSIRPαV2及hSIRPβ1之免疫反應性。用0.5M H₂SO₄停止反應且在450及610nm下讀取吸光度。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算。

藉由流動式細胞測量術，使用Jurkat E6.1 T細胞白血病細胞株(ECACC 88042803)評定與hSIRPγ之結合。將Jurkat細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與抗-hSIRPα抗體(20μg/mL及其稀釋液)一起於PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與Alexa Fluor 647標記之山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)偵測抗體一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育40分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料。EC50值，即觀察到總結合信號之50%時之濃度，使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)計算。

如表24中所描繪，KWAR23及純系18D5抗體至少與hSIRPβ1及hSIRPαV1之P74A變異體交叉反應。在測試條件下，本發明之hSIRPα.50A及hSIRPα.40A抗體不與hSIRPβ1或hSIRPαV1之P74A變異體結合。就此而言，以類似方式區分本發明之hSIRPα.50A及hSIRPα.40A抗體與來自WO2013/056352之抗體純系SIRP29。WO2017/178653之圖7A及圖7B比較純系SIRP29及KWAR23與SIRPβ1(稱為「sirp-b」，產品編號ABIN3077231，antibodies-online.com)之結合，證明純系SIRP29及KWAR23各自對SIRPβ1具有奈莫耳親和力。

藉由流動式細胞測量術評定KWAR23、純系18D5及hSIRPα.40A抗體之hCD47阻斷。為此目的，在該分析中使用THP-1(ATCC TIB-202)及U-937(ATCC CRL-1593.2)單核球細胞株作為hSIRPα之來源。將THP-1及U-937細胞接種於96孔圓底組織培養盤中且與FcR阻斷試劑(Miltenyi Biotec)及指定抗-hSIRPα抗體(20μg/mL及其稀釋液)一起在PBS/1% BSA中在4℃下培育45分鐘。接著，用PBS/1% BSA洗滌細胞三次且與10μg/mL DyLight 488標記之重組hCD47/Fc蛋白一起在4℃下培育30分鐘。在此標記程序之後，洗滌細胞兩次，將其再懸浮於含有0.1μg/mL DAPI(BioLegend)之PBS/1% BSA中，且藉由流動式細胞測量術在FACSVerse(BD Biosciences)上分析。用FlowJo V10軟體(FlowJo,LLC)處理並分析資料且使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.)繪圖。在增加量之抗-hSIRPα抗體存在下，監測與人類IgG1之Fc域融合之重組hCD47的結合。從此資料計算hCD47阻斷之IC50值。IC50值表示觀察到半數抑制時之濃度。

如表18及表25中所描繪，hSIRPα.40A、hSIRPα.50A及KWAR23抗體阻斷rhCD47/Fc與分別表現hSIRPαV1及hSIRPαV2對偶基因之THP-1及U-937單核球細胞株結合。抗體純系18D5阻斷rhCD47/Fc與U-937單核球細胞株結合，但是不阻斷rhCD47/Fc與THP-1單核球細胞株結合，與18D5 不與hSIRPαV1結合之觀測結果一致(表24)。就此而言，以類似方式區分本發明之hSIRPα.50A及hSIRPα.40A抗體與抗體純系18D5。

實例25：定位hSIRPα-hSIRPα.40A與hSIRPα-hSIRPα.50A之間的相互作用界面

hSIRPα上由hSIRPα.40A或hSIRPα.50A結合之胺基酸藉由一個程序闡明，該程序包括氘化化學交聯，繼之以酶消化及使用質譜法偵測。首先，培育抗體hSIRPα.40A及抗原rhSIRPα-HIS(SinoBiological 11612-H08H-100，SEQ ID NO：132)或抗體hSIRPα.50A及抗原rhSIRPα-HIS以促進結合且藉由裝備有HM4相互作用模組(CovalX)之Ultraflex III MALDI TOF質譜儀(Bruker)驗證完整性及聚集程度。關於此等對照實驗，製備10μL抗體或抗原樣品之稀釋系列(1至128倍稀釋，始於1mg/mL)。各樣品取9μL使用K200 MALDI MS分析套組根據製造商之說明書(CovalX)交聯且培育180分鐘，同時直接使用1μL進行質譜分析(高質量MALDI)。質譜分析顯示，抗體及抗原具有所期望的分子量：hSIRPα.40A=151.68kDa(算上交聯劑152.78kDa)，hSIRPα.50A=151.80kD(算上交聯劑153.17kDa)，且rhSIRPα-HIS=46.05kDa(算上交聯劑48.67kDa)。關於抗原-抗體複合物之表徵，用過量抗原製造混合物(rhSIRPα-HIS：hSIRPα.40A之抗原：抗體比率：10.8μM：8.5μM，且rhSIRPα-HIS：hSIRPα.50A之抗原：抗體比率：5.4μM：2.13μM)。取9μL抗原-抗體混合物樣品使用K200 MALDI MS分析套組根據製造商之說明書交聯，同時直接使用1μL進行質譜分析。所偵測到的抗體及抗原之質量(hSIRPα.40A：151.18kDa，rhSIRPα-HIS 45.93kDa，hSIRPα.50A：151.69kDa，rhSIRPα-HIS 46.18kDa)與先前所偵測到之分子量一致。在交聯之後，偵測到抗原-抗體複合物係兩種非共價複合物，其中rhSIRPα-HIS：hSIRPα.40A之化學計量係1：1(195.24kDa)及2：1(240.48kDa)；及一種非共價複合物，其中rhSIRPα-HIS：hSIRPα.50A之化學計量係1：1(198.24kDa)。抗體與抗原非共價結合；未偵測到非共價聚集體或非特異性多聚體。

接著，進行rhSIRPα-HIS之肽質量指紋識別(fingerprinting)。根據製造商之說明書，對樣品進行ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶(Roche Diagnostic)蛋白水解，隨後藉由nLC-LTQ Orbitrap MS/MS，使用符合LTQ Orbitrap XL質譜儀(Thermo Scientific)的Ultimate 3000(Dionex)系統進行分析。此蛋白水解陣列引起序列之98%由所鑑別之肽覆蓋。

為以高解析度測定抗體hSIRPα.40A及hSIRPα.50A之與rhSIRPα-HIS抗原相互作用之胺基酸，抗原-抗體複合物(rhSIRPα-HIS：hSIRPα.40A比率10.8μM：8.5μM，rhSIRPα-HIS：hSIRPα.50A比率5.4μM：2.13μM)與氘化交聯劑d0/d12(K200 MALDI套組)一起培育180分鐘且用酶ASP-N、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶及嗜熱菌蛋白酶進行多酶促裂解。在交聯肽富集之後，藉由高解析度質譜(nLC-Orbitrap MS)分析樣品且使用XQuest(Jin Lee,Mol.Biosyst.4：816-823(2008))及Stavrox(Götze等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.23：76-87(2012))分析所產生之資料。在人類SIRPαV1(SEQ ID NO：34)上定位hSIRPα.40A及hSIRPα.50A之與rhSIRPα-HIS相互作用之胺基酸。hSIRPα.40A之交聯殘基描繪為粗體、加框，且hSIRPα.50A描繪為粗體、加底線：

在Discovery Studio中使用SIRPα(PDB ID 4CMM)之晶體結構量測殘基P74與所鑑別之交聯殘基之間的C-α距離。hSIRPα.50A所鑑別到之交聯殘基距離殘基P74在14.0至21.4埃C-α原子距離內；hSIRPα.40A所鑑別到之交聯殘基距離殘基P74在16.2至33.5埃C-α原子距離內。對於700Å²之抗原決定基-互補位表面積，C-α距離在預期範圍內(Rowley等人，Biotech.Ann.Rev.10：151-188(2004))。所鑑別之殘基及表面積明顯不同於抗-hSIRPα抗體KWAR23之結合抗原決定基(Ring等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 114：E10578-E10585(2017))。

實例26：本說明書所提及之序列

本文中所引用之所有參考文獻均以引用方式併入，其程度如同各個別公開案、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利特定且個別地指示以引用的方式併入一般。申請人意欲遵循37C.F.R.§1.57(b)(1)，此以引用方式併入之表述係關於每一個別出版物、資料庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請案或專利，其中每一者均依照37 C.F.R.§1.57(b)(2)明確鑑別，即使此類引用沒有緊接著以引用方式併入之專用表述。若在本說明書內包括任何以引用方式併入之專用表述，則其不以任何方式弱化此以引用方式併入之一般表述。本文中參考文獻之引用不意欲承認該參考文獻為相關先前技術，其亦絕不承認此等出版物或文獻之內容或日期。當參考文獻關於所主張之術語提供之定義與本說明書中所提供之定義衝突時，應使用本說明書中所提供之定義來解釋所主張發明。

本發明之範疇不受本文所述之特定實施例限制。實際上，根據前述描述及附圖，除了本文中所述內容之外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言亦將變得顯而易見。此類修改意欲屬於隨附申請專利範圍之範疇內。

可以認為，前述書面說明書已足夠熟習此項技術者實施本發明。根據前述描述，除本文所示及所述內容以外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將變得顯而易見且屬於隨附申請專利範圍之範疇內。

<110> 荷蘭商賽羅帕公司(SAIROPA B.V.)

<120> 抗-SIRPα抗體

<130> ABE-0007-UT

<140> TW 107112801

<141> 2018-04-13

<150> NL 2018708

<151> 2017-04-13

<150> NL 2019166

<151> 2017-07-03

<160> 137

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A重鏈CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A重鏈CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A重鏈CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A輕鏈CDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A輕鏈CDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：50A輕鏈CDR3

<400> 6

<210> 7

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：人類化50重鏈可變區(保守序列)

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> X=Q或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> X=Q或E

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> X=A或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> X=V或L

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> X=K或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> X=V或I

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> X=A或R

<220>

<221> misc_feature

<222> (42)..(42)

<223> X=G或E

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> X=I或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> X=R或K

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> X=V或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> X=T或I

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> X=I或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(79)

<223> X=A或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> X=D或E或Q

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> X=R或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (89)..(89)

<223> X=E或D

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> X=T或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (114)..(114)

<223> X=T或L

<400> 7

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：人類化50輕鏈可變區(保守序列)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> X=D或E

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> X=I或L

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> X=V或Q

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> X=L或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X=F或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> X=Q或K

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(43)

<223> X=A或S或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> X=E或D

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(74)

<223> X=T或A

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> X=S或N

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> X=S或N或G

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(83)

<223> X=F或I或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (85)..(85)

<223> X=A或D或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(104)

<223> X=L或V

<400> 8

<210> 9

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH1

<400> 9

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH1

<400> 10

<210> 11

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH2

<400> 11

<210> 12

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH2

<400> 12

<210> 13

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH3

<400> 13

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH3

<400> 14

<210> 15

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH4

<400> 15

<210> 16

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH4

<400> 16

<210> 17

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH5

<400> 17

<210> 18

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVH5

<400> 18

<210> 19

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL1

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL1

<400> 20

<210> 21

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL2

<400> 21

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL2

<400> 22

<210> 23

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL3

<400> 23

<210> 24

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL3

<400> 24

<210> 25

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL4

<400> 25

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL4

<400> 26

<210> 27

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL5

<400> 27

<210> 28

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50AVL5

<400> 28

<210> 29

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50A小鼠VH

<400> 29

<210> 30

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50A小鼠VH

<400> 30

<210> 31

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50A小鼠VL

<400> 31

<210> 32

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.50A小鼠VL

<400> 32

<210> 33

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> human SIRP alpha V1

<400> 33

<210> 34

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> human SIRP alpha V1

<400> 34

<210> 35

<211> 1509

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1509)

<223> human SIRP alpha V2

<400> 35

<210> 36

<211> 503

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(503)

<223> human SIRP alpha V2

<400> 36

<210> 37

<211> 1194

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1194)

<223> human SIRP beta 1

<400> 37

<210> 38

<211> 398

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(398)

<223> human SIRP beta 1

<400> 38

<210> 39

<211> 1161

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1161)

<223> human SIRP？

<400> 39

<210> 40

<211> 387

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(387)

<223> human SIRP？

<400> 40

<210> 41

<211> 969

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(969)

<223> human CD47

<400> 41

<210> 42

<211> 323

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(323)

<223> human CD47

<400> 42

<210> 43

<211> 1509

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1509)

<226> human SIRP alpha V3

<400> 43

<210> 44

<211> 503

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(503)

<223> human SIRP alpha V3

<400> 44

<210> 45

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> human SIRP alpha V4

<400> 45

<210> 46

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> human SIRP alpha V4

<400> 46

<210> 47

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> 人類SIRP alpha V5

<400> 47

<210> 48

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> 人類SIRP alpha V5

<400> 48

<210> 49

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> 人類SIRP alpha V6

<400> 49

<210> 50

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> 人類SIRP alpha V6

<400> 50

<210> 51

<211> 1509

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1509)

<223> 人類SIRP alpha V8

<400> 51

<210> 52

<211> 503

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(503)

<223> 人類SIRP alpha V8

<400> 52

<210> 53

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> 人類SIRP alpha V9

<400> 53

<210> 54

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> 人類SIRP alpha V9

<400> 54

<210> 55

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V beta C1 alphaC2 alpha

<400> 55

<210> 56

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V beta C1 alphaC2 alpha

<400> 56

<210> 57

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V alphaC1 beta C2 alpha

<400> 57

<210> 58

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V alphaC1 beta C2 alpha

<400> 58

<210> 59

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V alphaC1 alphaC2 beta

<400> 59

<210> 60

<211> 504

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha-V alphaC1 alphaC2 beta

<400> 60

<210> 61

<211> 1512

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1512)

<223> 人類SIRP alpha V1(P74A)

<400> 61

<210> 62

<211> 504

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(504)

<223> 人類SIRP alpha V1(P74A)

<400> 62

<210> 63

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(321)

<223> 人類kappa恆定域

<400> 63

<210> 64

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(107)

<223> 人類kappa恆定域

<400> 64

<210> 65

<211> 981

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(981)

<223> 人類IgG4恆定域(including S228P)

<400> 65

<210> 66

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(327)

<223> 人類IgG4恆定域(including S228P)

<400> 66

<210> 67

<211> 978

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(978)

<223> 人類IgG2恆定域

<220>

<221> misc_feature

<222> (769)..(769)

<223> n為g或t

<400> 67

<210> 68

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(326)

<223> 人類IgG2恆定域

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> X為A或S

<400> 68

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A重鏈CDR1

<400> 69

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A重鏈CDR2

<400> 70

<210> 71

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A重鏈CDR3

<400> 71

<210> 72

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A輕鏈CDR1

<400> 72

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A輕鏈CDR2

<400> 73

<210> 74

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：40A輕鏈CDR3

<400> 74

<210> 75

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：人類化40重鏈可變區(保守序列)

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> X=F或L

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> X=Q或R或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> X=E或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> X=L或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> X=A或K或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> X=L或M或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (38)..(38)

<223> X=K或R

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(40)

<223> X=A或R或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(48)

<223> X=I或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(67)

<223> X=K或R

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(68)

<223> X=A或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> X=L或M

<220>

<221> misc_feature

<222> (73)..(73)

<223> X=D或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(74)

<223> X=K或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (76)..(76)

<223> X=A或S或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (79)..(79)

<223> X=A或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (82)..(82)

<223> X=E或Q

<220>

<221> misc_feature

<222> (87)..(87)

<223> X=R或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (88)..(88)

<223> X=F或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (91)..(91)

<223> X=S或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(97)

<223> X=A或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (117)..(117)

<223> X=L或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (118)..(118)

<223> X=L或V

<400> 75

<210> 76

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：人類化40輕鏈可變區(保守序列)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> X=L或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> X=D或E

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> X=S或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(39)

<223> X=K或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (44)..(44)

<223> X=I或P

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(60)

<223> X=K或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(66)

<223> X=G或R

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(69)

<223> X=S或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(70)

<223> X=D或E

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(71)

<223> X=F或Y

<220>

<221> misc_feature

<222> (72)..(72)

<223> X=S或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> X=G或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> X=G或Q

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(104)

<223> X=L或V

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(107)

<223> X=H或K

<400> 76

<210> 77

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH1

<400> 77

<210> 78

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH1

<400> 78

<210> 79

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH2

<400> 79

<210> 80

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH2

<400> 80

<210> 81

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH3

<400> 81

<210> 82

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH3

<400> 82

<210> 83

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH4

<400> 83

<210> 84

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH4

<400> 84

<210> 85

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH5

<400> 85

<210> 86

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH5

<400> 86

<210> 87

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH6

<400> 87

<210> 88

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVH6

<400> 88

<210> 89

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL1

<400> 89

<210> 90

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL1

<400> 90

<210> 91

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL2

<400> 91

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL2

<400> 92

<210> 93

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL3

<400> 93

<210> 94

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL3

<400> 94

<210> 95

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL4

<400> 95

<210> 96

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL4

<400> 96

<210> 97

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL5

<400> 97

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL5

<400> 98

<210> 99

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL6

<400> 99

<210> 100

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40AVL6

<400> 100

<210> 101

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠VH

<400> 101

<210> 102

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠VH

<400> 102

<210> 103

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠VL

<400> 103

<210> 104

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠VL

<400> 104

<210> 105

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠重鏈

<400> 105

<210> 106

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alpha.40A小鼠輕鏈

<400> 106

<210> 107

<211> 581

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：rhSIRP alpha/Fc

<400> 107

<210> 108

<211> 538

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：rhSIRPg/Fc

<400> 108

<210> 109

<211> 358

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：rhCD47/Fc

<400> 109

<210> 110

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V？C1 beta C2 beta

<400> 110

<210> 111

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V？C1 beta C2 beta

<400> 111

<210> 112

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V beta C1？C2 beta

<400> 112

<210> 113

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V beta C1 gamma C2 beta

<400> 113

<210> 114

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V beta C1 beta C2 gamma

<400> 114

<210> 115

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP-V beta C1 beta C2 gamma

<400> 115

<210> 116

<211> 1194

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1194)

<223> 人類SIRP beta L

<400> 116

<210> 117

<211> 398

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(398)

<223> 人類SIRP beta L

<400> 117

<210> 118

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(990)

<223> 人類IgG1恆定域

<400> 118

<210> 119

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(330)

<223> 人類IgG1恆定域

<400> 119

<210> 120

<211> 336

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(336)

<223> 小鼠IgG1恆定域

<400> 120

<210> 121

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(107)

<223> 小鼠kappa恆定域

<400> 121

<210> 122

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(326)

<223> 人類IgG2恆定域，V234A-G237A-P238S-H268A-V309L-A330S-P331S(Sigma)突變體

<220>

<221> misc_feature

<222> (257)..(257)

<223> X為A或S

<400> 122

<210> 123

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(330)

<223> 人類IgG1恆定域，L234A-L235A突變體

<400> 123

<210> 124

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(990)

<223> 人類IgG1恆定域，L234A-L235A-P329G突變體

<400> 124

<210> 125

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(330)

<223> 人類IgG1恆定域，L234A-L235A-P329G突變體

<400> 125

<210> 126

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(330)

<223> 人類IgG1恆定域，N297Q突變體

<400> 126

<210> 127

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(327)

<223> 人類IgG4恆定域，S228P-N297Q突變體

<400> 127

<210> 128

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：18D5 VH

<400> 128

<210> 129

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：18D5 VL

<400> 129

<210> 130

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：KWAR23 VH

<400> 130

<210> 131

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：KWAR23 VL

<400> 131

<210> 132

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：rhSIRP alpha-HIS

<400> 132

<210> 133

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alphaV1

<400> 133

<210> 134

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP alphaV2

<400> 134

<210> 135

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：hSIRP beta 1

<400> 135

<210> 136

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：來自SEQ ID NO：80之子序列

<400> 136

<210> 137

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成：來自SEQ ID NO：78之子序列

<400> 137

Claims

一種與人類SIRPα結合之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含根據Kabat編號之以下序列：a.重鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列SYWMH(SEQ ID NO：69)，b.重鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列AIYPVNNDTTYNQKFKG(SEQ ID NO：70)、AIYPVNSDTTYNQKFKG(SEQ ID NO：136)或ALYPVNSDTTYNQKFKG(SEQ ID NO：137)，c.重鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列SFYYSLDAAWFVY(SEQ ID NO：71)，d.輕鏈可變區CDR1，其包含胺基酸序列RASQDIGSRLN(SEQ ID NO：72)，e.輕鏈可變區CDR2，其包含胺基酸序列ATSSLDS(SEQ ID NO：73)，及f.輕鏈可變區CDR3，其包含胺基酸序列LQYASSPFT(SEQ ID NO：74)。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體：以<10nM的EC₅₀與表現人類SIRPαV1蛋白之細胞結合；以<10nM的EC₅₀與表現人類SIRPαV2蛋白之細胞結合；相較於針對人類SIRPαV1蛋白之EC50，展現至少大於100倍之針對SIRPαV1(P74A)的EC50，該SIRPαV1(P74A)具有SEQ ID NO：62之序列；及相較於針對人類SIRPαV1蛋白之EC50，展現至少大於100倍之針對人類SIRPβ1的EC50。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含以下重鏈序列及輕鏈序列組合中之一者：SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：98，或SEQ ID NO：80及SEQ ID NO：100。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係完整IgG。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含野生型或突變型IgG2 Fc區，或其中該抗體包含突變型IgG1 Fc區，或其中該抗體包含突變型IgG4 Fc區。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段經人類化。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其係包含兩個重鏈及兩個輕鏈之人類化抗體，其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：90，或其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：92，或其中各重鏈包含SEQ ID NO：80且各輕鏈包含SEQ ID NO：96。
如請求項1或2之抗體或其抗原結合片段，其包含由哺乳動物細胞之表現所特有的糖基化模式。
一種經分離核酸，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段中之任一者。
如請求項9之經分離核酸，其包含：SEQ ID NO：79之核酸序列，及選自由SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97及SEQ ID NO：99組成之群之核酸序列。
一種一或多個表現載體，其包含如請求項9或10之經分離核酸。
如請求項11之一或多個表現載體，其編碼抗SIRPα抗體之重鏈序列及輕鏈序列，該表現載體包含選自以下組成之群的第一核酸序列及第二核酸序列：SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：93， SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：97，或SEQ ID NO：79及SEQ ID NO：99。
一種宿主細胞，其包含如請求項11或12之表現載體。
如請求項13之宿主細胞，其產生全長抗-SIRPα抗體，其中該宿主細胞係細菌細胞、哺乳動物細胞、畢赤酵母(Pichia)細胞或植物細胞。
如請求項14之宿主細胞，其中該哺乳動物細胞為人類細胞或中國倉鼠卵巢細胞。
如請求項15之宿主細胞，其中該人類細胞為HEK293細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
一種產生抗體或抗原結合片段之方法，該方法包含：將包含編碼如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段中之任一者之重鏈及/或輕鏈之聚核苷酸的宿主細胞在有利於該聚核苷酸之表現的條件下培養；及從該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或其抗原結合片段。
一種用於偵測樣品中之SIRPα肽或其片段之存在的方法，該方法包含使樣品與請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段接觸且偵測該抗體或其抗原結合片段與肽之間的複合物之存在；其中偵測到該複合物指示存在SIRPα肽。
一種如請求項1至8中任一項之抗體或其抗原結合片段的用途，其係用於製備用於治療癌症或傳染病的藥物。