TWI854952B

TWI854952B - 抗cd27抗體

Info

Publication number: TWI854952B
Application number: TW106132858A
Authority: TW
Inventors: 艾咪 M 畢本; 成俊張; 維若妮卡關; 迪爾曼羅倫斯斐亞達; 思薇特拉娜莎黛柯娃; 傑洛霖王; 提瑞奧利佛菲斯柯曼; 維尼費德 W 葡西斯; 伊寧那姆漢斯凡; 伊爾薩斯安卓凡; 拉斯谷倫
Original assignee: 美商默沙東有限責任公司; 荷蘭商默沙東荷蘭藥廠
Priority date: 2016-09-26
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2024-09-11

Abstract

本發明係關於抗CD27抗體，以及該等抗體在治療疾病(諸如癌症及感染性疾病)中之用途。

Description

抗CD27抗體

本發明係關於治療藉由刺激免疫反應、尤其藉由刺激抗原特異性T淋巴球來改善之病狀。本發明之各個態樣適於治療任一已知或預計藉由刺激CD27+免疫細胞或藉由抑制一或多種免疫檢查點蛋白來改善之病狀。藉由本發明適宜治療之病狀係藉由免疫刺激所改善者，例如感染性疾病及癌症。更具體而言，本發明係關於抗CD27抗體以及該等抗體在治療諸如癌症及感染性疾病等疾病中之用途。

將CD27(TNF受體家族成員)鑑別為人類T細胞上之膜分子(van Lier等人，1987,J.Immunol.139：1589-96)。根據當前證據，CD27具有單一配體CD70，後者亦係TNF家族成員(Goodwin等人，1993,Cell 73：447-56)。

CD27由造血細胞、尤其淋巴球譜系細胞、亦即T-、B-及NK細胞排他性地表現。最初將CD27定義為增強對TCR刺激之增殖性反應之人類T細胞共刺激分子(van Lier等人，1987,J.Immunol.139：1589-96)。CD70(CD27之配體)之存在指示CD27調介之共刺激之時刻及持久性。

CD70在不成熟樹突狀細胞中之轉基因表現足以將對病毒或腫瘤之免疫學耐受性轉變成CD8+ T細胞反應性。同樣，激動可溶性CD70在肽免疫化時促進CD8+ T細胞反應(Rowley等人，2004,J Immunol 172：6039-6046)，且在CD70轉基因小鼠中，因應於TCR刺激之CD4+及CD8+效應細胞形成得以大大促進(Arens等人，2001,Immunity 15：801-12；Tesselaar等人，2003,Nat Immunol 4：49-54；Keller等人，2008,Immunity 29：334-346)。在小鼠淋巴瘤模型中，在CD70基因轉殖或注射抗小鼠CD27抗體時可改良腫瘤排斥(Arens等人，2003,J Exp Med 199：1595-1605；French等人，2007,Blood 109：4810-15；Sakanishi及Yagita,2010,Biochem.Biophys.Res.Comm.393：829-835；WO 2008/051424；WO 2012/004367)。

在WO2012/004367中，闡述無需交聯來活化CD27調介之免疫反應共刺激之第一抗人類激動抗體(稱為hCD27.15)。另外，揭示在交聯時活化CD27之抗人類CD27抗體(稱為1F5)(WO2011/130434及Vitale等人，Clin.Cancer Res,2012,18(14)：3812-3821)。然而，業內仍需研發具有改良特性(包含能夠結合具有來自食蟹猴之A59T SNP及CD27之人類CD27)之抗人類CD27抗體。

本發明提供包括下文所指定之結構及功能特徵之抗CD27抗體及其抗原結合片段。

在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；及(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；及(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(iii)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在本發明之另一實施例中，抗體或抗原結合片段包括重鏈可變區及輕鏈可變區，該等可變區包括：重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S，或包括與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在本發明之另一實施例中，抗體或抗原結合片段包括：結合至人類CD27且包括輕鏈免疫球蛋白可變區、重鏈免疫球蛋白可變區或輕鏈及重鏈免疫球蛋白可變區二者之抗體或其抗原結合片段，其選自由以下組成之群：包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列或與SEQ ID NO：7區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列或與SEQ ID NO：8區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括包括SEQ ID NO：9之胺基酸序列或與SEQ ID NO：9區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：14之胺基酸序列或與SEQ ID NO：14區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括包括SEQ ID NO：32之胺基酸序列或與SEQ ID NO：32區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：33之胺基酸序列或與SEQ ID NO：33區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括包括SEQ ID NO：34之胺基酸序列或與SEQ ID NO：34區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：35之胺基酸序列或與SEQ ID NO：35區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括包括SEQ ID NO：39之胺基酸序列或與SEQ ID NO：39區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：40之胺基酸序列或與SEQ ID NO：40區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括選自由SEQ ID NO：10-13組成之群或與SEQ ID NO：10-13中一者區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或選自由SEQ ID NO：15-18中任一者組成之群或與SEQ ID NO：15-18中一者之胺基酸序列相差1、2或3個保守取代之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列或與SEQ ID NO：10區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列或與SEQ ID NO：15區別於1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價 KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段係人類化的。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括：重鏈可變區，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO：9、10、11、12、13、32、34及39；及輕鏈可變區，其選自由以下組成之群：SEQ ID NO：14、15、16、17、18、33、35及40。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括：重鏈可變區，其與與SEQ ID NO：10、11、12或13中之任一者包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；及輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：15、16、17或18中之任一者包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括：重鏈可變區，其關於SEQ ID NO：10、11、12或13中之任一者包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代；及輕鏈可變區，其關於SEQ ID NO：15、16、17或18中之任一者包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250 pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在另一實施例中，本發明提供結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，其與SEQ ID NO：10、11、12或13中之任一者包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性；及輕鏈可變區，其與SEQ ID NO：15、16、17或18中之任一者包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。在一實施例中，所提出序列變化僅出現於抗體之框架區中。

在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，其包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列；其中抗體或其抗原結合片段包括與選自由SEQ ID NO：9-13組成之群之重鏈可變區包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之重鏈可變區及與選自由SEQ ID NO：14-18組成之群之輕鏈可變區包括至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之輕鏈可變區。在該上文所提及之實施例中，序列變化出現於框架區中，且抗體或其抗原結合片段包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴 CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在本發明之另一實施例中，提供包括輕鏈及重鏈免疫球蛋白可變區之結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其選自由以下組成之群：包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：9之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：14之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：32之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：33之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：34之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：35之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：39之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：40之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括選自由SEQ ID NO：10-13組成之群之可變重鏈及選自由SEQ ID NO：15-18組成之群之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列之可變重鏈及含有SEQ ID NO：15之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；包括SEQ ID NO：10-12中之任一者之可變重鏈及SEQ ID NO：15-17中之任一者之可變輕鏈的抗體或抗原結合片段；及包括SEQ ID NO：13之可變重鏈及SEQ ID NO：18之可變輕鏈的抗體或抗原結合片段。

在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。

在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在另一實施例中，本發明提供一種抗體或其抗原結合片段，其包括：包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列之可變輕鏈，其中抗體或其抗原結合片段結合至人類CD27。

在一實施例中，本發明係關於結合至人類CD27之經分離抗體或抗原結合片段，其包括包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈或包括最多25個胺基酸取代之其變體及/或包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列且包括最多25個胺基酸取代的輕鏈。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在上文任一實施例中，可分離抗體或其抗原結合片段。

在上文任一實施例中，抗體或其抗原結合片段係重組抗體。

在上文任一實施例中，抗體可為全長抗體。

在上文任一實施例中，抗體或其抗原結合片段可為人類化抗體。

在上文任一實施例中，抗體或其抗原結合片段可為包括兩條重鏈及兩條輕鏈之人類化抗體，且視情況係完整IgG抗體。在一實施例中，重鏈係IgG同型之重鏈。在一實施例中，重鏈係IgG1同型之重鏈。在另一實施例中，重鏈係IgG2同型之重鏈。在另一實施例中，重鏈係IgG4同型之重鏈。在另一實施例中，重鏈係IgM同型之重鏈。在一實施例中，抗體包括SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：28之重鏈恆定結構域。

在本發明之另一態樣中，抗體或其抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S，且重鏈恆定結構域係IgG1或IgG4同型。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在上文所提及之任一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包括由以下組成之重鏈區：(a)上述可變重鏈中之任一者及(b)前導肽(例如SEQ ID NO：26之前導肽)。在上文所提及之任一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段可包括由以下組成之輕鏈區：(a)上述輕鏈中之任一者及(b)前導肽(例如SEQ ID NO：27之前導肽)。

在本發明之上文所提及實施例中之任一者中，抗體或其抗原結合片段可為包括上文所闡述任一重鏈可變區及任一人類重鏈恆定結構域之抗體。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段係IgG同型，且包括人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4人類重鏈恆定結構域。在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段包括人類重鏈IgG1恆定結構域(SEQ ID NO：30)或其變體，其中該變體相對於SEQ ID NO：30包括最多20個胺基酸取代。在另一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括人類重鏈IgG4恆定結構域，其中位置228之胺基酸(使用EU編號方案)已自Ser取代為Pro(SEQ ID NO：28)。在另一實施例中，重鏈係IgM同型之重鏈。

在上文所提及之任一實施例中，抗體或其抗原結合片段可包括上文所闡述之任一輕鏈可變區及人類輕鏈恆定結構域。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段包括含有SEQ ID NO：29之胺基酸序列之人類κ輕鏈恆定結構域。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括具有兩條輕鏈及兩條重鏈之全四聚體結構，其中每一輕鏈包括：包括SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定區；且每一重鏈包括：包括SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者之可變區及人類IgG1恆定區(SEQ ID NO：30)。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括具有兩條輕鏈及兩條重鏈之全四聚體結構，其中每一輕鏈包括：包括SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈包括：包括SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者之可變區及人類IgM恆定區。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括具有兩條輕鏈及兩條重鏈之全四聚體結構，其中每一輕鏈包括：包括SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈包括：包括SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者之可變區及人類IgG2恆定區。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由SEQ ID NO：36組成；且每一重鏈係由SEQ ID NO：37組成。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體係由兩條輕鏈及兩條重鏈組成，其中每一輕鏈係由SEQ ID NO：36組成；且每一重鏈係由SEQ ID NO：37組成。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由SEQ ID NO：36組成；且每一重鏈係由SEQ ID NO：38組成。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體係由兩條輕鏈及兩條重鏈組成，其中每一輕鏈係由SEQ ID NO：36組成；且每一重鏈係由SEQ ID NO：38組成。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由以下組成：包括SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈係由以下組成：由SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者組成之可變區及人類IgM恆定區。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體係由兩條輕鏈及兩條重鏈組成，其中每一輕鏈係由以下組成：包括SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈係由以下組成：由SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者組成之可變區及人類IgM恆定區。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體包括兩條輕鏈及兩條重鏈，其中每一輕鏈係由以下組成：由SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者組成之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈係由以下組成：包括SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者之可變區及人類IgG1恆定區。

在一實施例中，本發明抗CD27抗體係由兩條輕鏈及兩條重鏈組成，其中每一輕鏈係由以下組成：由SEQ ID NO：14-18、33、35及40中之任一者組成之可變區及人類κ輕鏈或人類λ輕鏈恆定結構域；且每一重鏈係由以下組成：包括SEQ ID NO：9-13、32、34及39中之任一者之可變區及人類IgG1恆定區。

在本發明之另一態樣中，上文任一抗體或抗原結合片段包括哺乳動物細胞或CHO細胞之表現之醣基化模式特性。

在某些實施例中，抗CD27抗體或其抗原結合片段偶聯至至少一種治療劑。在一實施例中，治療劑係第二抗體或其片段、免疫調節劑、激素、細胞毒性劑、酶、放射性核素、偶聯至至少一種免疫調節劑、酶、放射性標記、激素、反義寡核苷酸或細胞毒性劑之第二抗體或其組合。

本發明亦提供經分離多肽，其包括SEQ ID NO：1-18、32-40及44-45中之任一者之胺基酸序列或該等序列中之任一者的片段。

本發明亦提供編碼本發明之任一抗CD27抗體或抗原結合片段之經分離核酸。在一實施例中，本發明提供編碼SEQ ID NO：1-18、32-40及44-45中之任一多肽之經分離核酸，其中該等多肽可視情況包括前導序列。在另一實施例中，本發明提供包括SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47或二者之經分離核酸。本發明亦提供包括編碼SEQ ID NO：1-18、32-40及44-45中之任一多肽(其中該等多肽可視情況包括前導序列)之核酸或包括SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47或二者之核酸的表現載體。該等經分離核酸及包括其之表現載體可用於在重組宿主細胞中表現本發明抗體或其抗原結合片段。因此，本發明亦提供包括編碼SEQ ID NO：1-18、32-40及44-45中之任一多肽之核酸(其中該等多肽可視情況包括前導序列)或包括SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47或二者之核酸的宿主細胞。在一實施例中，宿主細胞係細菌細胞、人類細胞、哺乳動物細胞、畢赤酵母屬(Pichia)細胞、植物細胞、HEK293細胞或中國倉鼠卵巢細胞。在一實施例中，宿主細胞係中國倉鼠卵巢細胞。在一實施例中，宿主細胞係酵母細胞，例如畢赤酵母屬細胞或巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)宿主細胞。

本發明亦提供包括本發明之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑之醫藥組合物。在一實施例中，該組合物包括另一治療劑。在一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群：抗LAG3抗體或其抗原結合片段；抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗VISTA抗體或其抗原結合片段；抗BTLA抗體或其抗原結合片段；抗TIM3抗體或其抗原結合片段；抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗HVEM抗體或其抗原結合片段；抗CD70抗體或其抗原結合片段；抗OX40抗體或其抗原結合片段；抗CD28抗體或其抗原結合片段；抗PD1抗體或其抗原結合片段；抗PDL1抗體或其抗原結合片段；抗PDL2抗體或其抗原結合片段；抗GITR抗體或其抗原結合片段；抗ICOS抗體或其抗原結合片段；抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；抗ILT2抗體或其抗原結合片段；抗ILT3抗體或其抗原結合片段；抗ILT4抗體或其抗原結合片段；及抗ILT5抗體或其抗原結合片段；抗4-1BB(CD137)抗體或其抗原結合片段；抗NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗TSLP抗體或其抗原結合片段；抗IL-10抗體或其抗原結合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激動劑；CXCR2拮抗劑；及PARP抑制劑。

在本發明醫藥組合物之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

本發明亦包括含有本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段與一種、兩種或更多種治療劑之組合的組合；其中第二治療劑係選自由以下組成之群：抗LAG3抗體或其抗原結合片段；抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗VISTA抗體或其抗原結合片段；抗BTLA抗體或其抗原結合片段；抗TIM3抗體或其抗原結合片段；抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗HVEM抗體或其抗原結合片段；抗CD70抗體或其抗原結合片段；抗OX40抗體或其抗原結合片段；抗CD28抗體或其抗原結合片段；抗PD1抗體或其抗原結合片段；抗PDL1抗體或其抗原結合片段；抗PDL2抗體或其抗原結合片段；抗GITR抗體或其抗原結合片段；抗ICOS抗體或其抗原結合片段；抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；抗ILT2抗體或其抗原結合片段；抗ILT3抗體或其抗原結合片段；抗ILT4抗體或其抗原結合片段；抗ILT5抗體或其抗原結合片段；抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗TSLP抗體或其抗原結合片段；抗IL-10抗體或其抗原結合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激動劑；CXCR2拮抗劑；及PARP抑制劑。

在本發明組合之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

本發明亦提供包括本發明之任一抗CD27抗體或抗原結合片段之器皿或注射器件。在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N,X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。

本發明亦提供產生本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段之方法，其包括：在有益於表現多核苷酸之條件下培養包括編碼本發明抗體(或其抗原結合片段)之重鏈及/或輕鏈之多核苷酸的宿主細胞；及視情況自宿主細胞及/或培養基回收抗體或抗原結合片段。在一實施例中，編碼重鏈之多核苷酸及編碼輕鏈之多核苷酸位於單一載體中。在另一實施例中，編碼重鏈之多核苷酸及編碼輕鏈之多核苷酸位於不同載體中。在一實施例中，編碼重鏈之多核苷酸及編碼輕鏈之多核苷酸編碼包括以下之抗體或抗原結合片段：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供編碼重鏈之多核苷酸及編碼輕鏈之多核苷酸，該重鏈及該輕鏈係來自包括以下之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。

本發明亦提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段以及視情況另一治療劑或治療程序。在一實施例中，擬治療個體係人類個體。在一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群：抗LAG3抗體或其抗原結合片段；抗 TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗VISTA抗體或其抗原結合片段；抗BTLA抗體或其抗原結合片段；抗TIM3抗體或其抗原結合片段；抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗HVEM抗體或其抗原結合片段；抗CD70抗體或其抗原結合片段；抗OX40抗體或其抗原結合片段；抗CD28抗體或其抗原結合片段；抗PD1抗體或其抗原結合片段；抗PDL1抗體或其抗原結合片段；抗PDL2抗體或其抗原結合片段；抗GITR抗體或其抗原結合片段；抗ICOS抗體或其抗原結合片段；抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；抗ILT2抗體或其抗原結合片段；抗ILT3抗體或其抗原結合片段；抗ILT4抗體或其抗原結合片段；抗ILT5抗體或其抗原結合片段；及抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗TSLP抗體或其抗原結合片段；抗IL-10抗體或其抗原結合片段；抗IL-10抗體或其抗原結合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激動劑；CXCR2拮抗劑；及PARP抑制劑。

在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N,X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。

在一實施例中，本發明提供一種組合物，其包括：(i)本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段；及(ii)抗PD1抗體，其包括SEQ ID NO：53之重鏈序列及SEQ ID NO：48之輕鏈序列。在另一實施例中，本發明提供一種組合物，其包括：(a)本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段；及(b)抗PD1抗體，其包括SEQ ID NO：52之重鏈可變序列及SEQ ID NO：78之輕鏈可變序列。在一實施例中，在投與抗CD27抗體之前投與抗PD1抗體。在一實施例中，在投與抗CD27抗體之前4-10天投與抗PD1抗體。在一實施例中，使用抗PD1抗體預治療可調節免疫細胞，從而使得增強抗CD27抗體之Fc調介之功能。在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。

本發明亦提供治療個體之感染或感染性疾病之方法，其包括向個體投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段以及視情況另一治療劑或治療程序。在一實施例中，所治療個體係人類個體。在一實施例中，另一治療劑係選自由以下組成之群：抗LAG3抗體或其抗原結合片段；抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；抗VISTA抗體或其抗原結合片段；抗BTLA抗體或其抗原結合片段；抗TIM3抗體或其抗原結合片段；抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；抗HVEM抗體或其抗原結合片段；抗CD70抗體或其抗原結合片段；抗OX40抗體或其抗原結合片段；抗CD28抗體或其抗原結合片段；抗PD1抗體或其抗原結合片段；抗PDL1抗體或其抗原結合片段；抗PDL2抗體或其抗原結合片段；抗GITR抗體或其抗原結合片段；抗ICOS抗體或其抗原結合片段；抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；抗ILT2抗體或其抗原結合片段；抗ILT3抗體或其抗原結合片段；抗ILT4抗體或其抗原結合片段；抗ILT5抗體或其抗原結合片段；及抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；抗NKG2A抗體或其抗原結合片段；抗NKG2C抗體或其抗原結合片段；抗NKG2E抗體或其抗原結合片段；抗TSLP抗體或其抗原結合片段；抗IL-10抗體或其抗原結合片段；IL-10或聚乙二醇化IL-10；STING激動劑；CXCR2拮抗劑；及PARP抑制劑。

本發明亦提供包括本發明之抗體或抗原結合片段之疫苗。在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N,X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5 之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。在一實施例中，疫苗進一步包括抗原。

本發明亦提供檢測試樣中之CD27肽或其片段之存在之方法，其包括使試樣與本發明之抗體或其抗原結合片段接觸及檢測抗體或片段與肽之間之複合物的存在；其中複合物之檢測指示CD27肽之存在。在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，其包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。

本發明亦提供增加免疫細胞之活性之方法，其包括使免疫細胞與本發明之任一抗體或抗原結合片段接觸。在一實施例中，本發明提供增加免疫細胞之活性之方法，其包括向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段。在一實施例中，該方法係用於：治療癌症，治療感染或感染性疾病，或作為疫苗佐劑。在一實施例中，可藉由量測免疫細胞之增殖來檢測免疫細胞活性之增加。舉例而言，可藉由量測T細胞之增殖來檢測T細胞活性之增加。在一實施例中，可藉由離體量測源自個體之試樣中之T細胞活化來檢測免疫細胞活性之增加。在一實施例中，藉由以下方式來測定T細胞活性之增加：(i)量測混合淋巴球反應或誘導產生選自由以下組成之群之細胞介素之T細胞受體(TCR)信號傳導的直接抗CD3 mAb刺激：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13；(ii)量測一或多種選自由以下組成之群之細胞介素之SEB誘導之產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13；或(iii)量測選自由以下組成之群之細胞介素之TT誘導之產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13。在一實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段包括含有以下之重鏈可變區及輕鏈可變區：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在另一實施例中，本發明提供包括重鏈可變區及輕鏈可變區之結合至人類CD27之抗體或抗原結合片段，該等可變區包括：(i)重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；(ii)重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；(iii)重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；(iv)輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；(v)輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及(vi)輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。

圖1展示，抗體hCD27.15不結合CD27 A59T。藉由瞬時轉染將CD27及CD27 A59T表現於CHO-K1上。藉由流式細胞術量測hCD27.15(人類化6B)及Fc-mCD70至CD27及CD27 A59T之結合。儘管Fc-mCD70結合CD27及CD27 A59T，但hCD27.15僅結合CD27。「EV」代表空載體。

圖2展示，抗體hCD27.15不結合恆河獼猴(Macaca mulatta)CD27。藉由瞬時轉染將HsCD27及MmCD27表現於CHO-K1上。藉由流式細胞術量測hCD27.15(嵌合c-4)至HsCD27及MmCD27之結合。y軸代表陽性細胞%。「EV」代表空載體。y軸係陽性細胞%。

圖3A-3B展示本發明之各種抗CD27抗體之重鏈及輕鏈可變區與種系VH及VL序列之比對：131AVH6(SEQ ID NO：10)、131AVH7(SEQ ID NO：11)、131A親代VH(「PVH」、SEQ ID NO：7)、131AVH8(SEQ ID NO：12)、131AVH9(SEQ ID NO：13)、VH1-102(SEQ ID NO：64)、VH1-146(SEQ ID NO：65)；131AVL6(SEQ ID NO：15)、131AVL7(SEQ ID NO：16)、131A親代VL(「PVL」、SEQ ID NO：8)、131AVL8(SEQ ID NO：17)、131AVL9(SEQ ID NO：18)、VK1-O2(SEQ ID NO：66)、VK3-L6(SEQ ID NO：67)。

圖4展示131AVH6VL6-huIgG1與1F5-huIgG1相比在具有MC38腫瘤之huCD27敲入小鼠中之抗腫瘤活性，如藉由腫瘤體積及治療後天數所量測。所有圖形之X軸皆係治療開始後之天數，左圖之y軸係腫瘤體積(mm³)(平均值±SEM)；右圖之y軸係個別小鼠之腫瘤體積(mm³)。「IC」代表同型對照。

圖5展示131AVH6VL6-huIgG1與抗PD-1之組合在具有MB49腫瘤之huCD27敲入小鼠中之抗腫瘤活性。所有圖形之X軸皆係治療開始後之天數，上圖之y軸係腫瘤體積(mm³)(平均值±SEM)；下方4個圖之y軸係個別小鼠之腫瘤體積(mm³)。「IC」代表同型對照。

圖6A-6C.hCD27.131AVH6VL6-huIgG1誘導表現CD27之293FT細胞中之NF-κB活化。使用編碼人類WT、A59T或恆河猴CD27之質體瞬時轉染含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之人類胚胎腎細胞(293FT-NF-κB-螢光素酶細胞)。將細胞在存在或不存在抗人類CD27抗體下刺激16-20小時，然後分析NF-κB活化，如藉由螢光素酶活性所讀出。展示在使用mAb hCD27.131AVH6VHL6 huIgG1、1F5 huIgG1或hCD27.15-4B IgG4刺激(A)hCD27 WT、(B)hCD27 A59T或(C)恆河猴表現HEK293FT細胞之後螢光素酶活性相對於未刺激細胞之倍數變化值。數據代表來自1個實驗之三重量測(+SD)。數據代表3-6個獨立實驗。所有圖形之y軸皆代表倍數變化(NFκB-Luc)，且所有圖形之x軸皆代表Log10濃度(ug/ml)。

圖7A及7B.hCD27.131A IgG1及IgG4人類化變體誘導表現CD27之293FT細胞中之NF-κB活化。使用編碼人類WT CD27之質體瞬時轉染含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之人類胚胎腎細胞(293FT-NF-κB-螢光素酶細胞)。將細胞在存在或不存在抗人類CD27抗體下刺激16-20小時，然後分析NF-κB活化，如藉由螢光素酶活性所讀出。展示在使用(A) 人類IgG1或(B)IgG4框架上之人類化hCD27.131A抗體刺激之後螢光素酶活性相對於未刺激細胞之倍數變化值。所有圖形之y軸皆代表倍數變化(NFκB-Luc)，且所有圖形之x軸皆代表CD27 Ab濃度(ug/ml)。「UT」代表未治療；「131A c huIgG1」代表「131A嵌合體huIgG1」；「131A c huIgG4」代表「131A嵌合體huIgG4」。

圖8.131AVH6VL6-IgG1在一級人類腫瘤TIL培養液中之生物活性。使用I型膠原酶及DNase I將自手術切除術獲得之人類腫瘤組織(N=20,16 NSCLC、3 RCC及1H&N)消解至單一細胞懸浮液中。使用0.1、1、10或20μg/mL 131AVH6VL6-hIgG1在10ng/ml抗CD3存在下處理含有各種腫瘤細胞類型之混合物之富集活細胞。處理亦包含同型對照(IgG1及IgG4，20μg/ml)及10μg/mL抗PD-1(派姆單抗(pembrolizumab))。收集上清液以用於在第6天進行干擾素γ(IFNγ)量測。展示平均IFNγ濃度及平均值之標準誤差。y軸係IFNγ(pg/ml)(平均值±SEM)。藉由配對、參數、雙尾T-測試測定治療組與同型對照組之間之對比之P值。IFNγ=干擾素γ；IgG1=免疫球蛋白G子類1；IgG4=免疫球蛋白G子類4；SEM=平均值之標準誤差；Un=未刺激。

圖9.比較131AVH6VL6-IgG1與hCD27.15-4BIgG4及IF5-IgG1在一級人類腫瘤TIL培養液中之生物活性。亦使用hCD27.15-4BIgG4及IF5-IgG1同時測試來自20種腫瘤中之13種(12 NSCLC及1 H&N癌症)之經消解人類腫瘤細胞。使用0.1、1、10或20μg/mL 131AVH6VL6-hIgG1、hCD27.15-4BIgG4及IF5-IgG1(包含同型對照(IgG1及IgG4，20μg/ml)及10μg/mL抗PD1(派姆單抗)對照)處理含有各種腫瘤細胞類型之混合物之富集活細胞。使用10ng/ml可溶性抗CD3(BioLegend，純系OKT3)作為刺激。收集上清液以用於在第6天進行干擾素γ(IFNγ)量測。展示平均IFNγ濃度及平均值之標準誤差。y軸係IFNγ(pg/ml)(平均值±SEM)。藉由配對、參數、雙尾T-測試測定治療組與同型對照組之間之對比之P值。IFNγ=干擾素γ；IgG1=免疫球蛋白G子類1；IgG4=免疫球蛋白G子類4；SEM=平均值之標準誤差；Un=未刺激。

圖10.小鼠hCD27.131A(小鼠IgG1)、人類化hCD27.15(人類IgG4，純系6B)、1A4(Beckman Coulter IM2034，純系1A4CD27，小鼠IgG1)、9F4(Sanquin PeliCluster CD27；Art.No.M1455，純系CLB-CD27/1，9F4，小鼠IgG2a)及1F5IgG1至表現於CHO-K1細胞上之hCD27丙胺酸突變體之結合(藉由流式細胞術)。列示所測試之hCD27變體。胺基酸對應於UniProt P26842-1序列。胺基酸1-20構成信號肽。將結合表示為相對於結合至hCD27之抗體(將其設定於100%)擬合C信號之幾何平均值。「EV」代表空載體；「B」代表結合，「LB」代表損失結合。

圖11. 131AVH6VL6Fab-CD27及M2177Fab-CD27複合物之結構之對比(Obmolova等人，Mol Immunol.2017 Mar；83：92-99,2017)：同等物展示為抗原結構疊加後之條帶；CD27呈黑色粗線形式，且Fab呈細線形式，黑色、淺灰色分別係131AVH6VL6Fab及M2177Fab。自PDB 5TLK分別使用Fab輕鏈、重鏈及抗原之鏈A、B及X獲得M2177-CD27複合物之同等物。

圖12A及12B. 131AVH6VL6Fab-CD27(A)及M2177Fab-CD27複合物(B)之結構之對比，特寫視圖：輸入模型及圖片定向與圖11相同，但該視圖在Fab-抗原界面上放大以更佳地展示對比。使用與圖11相同之條帶代表、色彩及厚度規定(只是M2177-CD27共結構係淺灰色)，但將涉及極性相互作用之殘基側鏈指示為枝條。將截止距離為3.30Å之H鍵及鹽橋展示為虛線，使用較短虛線代表鹽橋。

圖13A及13B. 在基於細胞之ELISA中，小鼠抗hCD27純系hCD27.131A不與1F5IgG1交叉競爭結合至hCD27。測試小鼠hCD27.131A及小鼠hCD27.15與1F5IgG1至hCD27之競爭性結合。(A)左圖：競爭細胞ELISA實驗設置。右圖：連續稀釋1F5IgG1、隨後1μg/ml小鼠hCD27.131A、小鼠hCD27.15或小鼠IgG1同型對照之交叉競爭數據。(B)左圖：反向競爭細胞ELISA實驗設置。右圖：連續稀釋小鼠hCD27.131A、小鼠hCD27.15或小鼠IgG1同型對照、隨後1μg/ml 1F5IgG1之交叉競爭數據。具有誤差槓之數據點代表具有一定範圍之雙重量測之平均值。各圖形之Y軸代表抗體結合(OD450-620)。

圖14.131AVH6VL6-hIgG1及1F5-hIgG1在原代CD8 T細胞共刺激分析中之生物活性。「IC」代表同型對照。上圖、中圖及下圖形分別代表來自供體91、供體11及供體816之實驗。

縮寫

在整個本發明之詳細闡述及實例中，將使用下列縮寫： ADCC 抗體依賴性細胞毒性

CDC 補體依賴性細胞毒性

CDR 免疫球蛋白可變區中之互補決定區，其係使用Kabat編號系統所定義

CHO 中國倉鼠卵巢

ELISA 酶聯免疫吸附分析

FR 抗體框架區：排除CDR區之免疫球蛋白可變區。

HRP 辣根過氧化物酶

IFN 干擾素

IC50 產生50%抑制之濃度

IgG 免疫球蛋白G

Kabat Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院(National Institutes of Health),Bethesda,Md.)提出之免疫球蛋白比對及編號系統

mAb或Mab或MAb 單株抗體

SEB 葡萄球菌腸毒素(Staphylococcus Enterotoxin)B

TCR T細胞受體

TT 破傷風類毒素

V區 Ig鏈中在不同抗體之間序列可變之區段。其延伸至輕鏈中之Kabat殘基107及重鏈中之113。

VH 免疫球蛋白重鏈可變區

VK 免疫球蛋白κ輕鏈可變區

定義

為可更易於理解本發明，下文明確定義某些技術及科學術語。除非在此文件其他部分中明確定義，否則本文所用之所有其他技術及科學術語皆具有熟習本發明所屬領域技術者通常所理解之含義。

如本文(包含隨附申請專利範圍)中所使用，除非上下文明確指示，否則詞語之單數形式(例如「一(a、an)」及「該(the)」)包含其相應複數個指示物。

「投與」及「處理」在應用於動物、人類、實驗個體、細胞、組織、器官或生物流體時係指外源性醫藥、治療、診斷試劑或組合物與動物、人類、個體、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞之處理涵蓋使試劑與細胞接觸，以及使試劑與流體接觸，其中該流體係與細胞接觸。「投與」及「處理」亦意指(例如)細胞由試劑、診斷、結合化合物或由另一細胞之活體外及離體處理。

「治療(treat或treating)」意指將治療劑(例如含有本發明之任一抗體或抗原結合片段之組合物)以內部或外部方式投與具有該藥劑對其具有治療活性之具有一或多種疾病症狀或懷疑患有疾病之個體或患者。通常，藥劑係以有效緩解所治療個體或群體之一或多種疾病症狀(不論藉由誘導該等症狀消退抑或將該等症狀之進展抑制任一臨床可量測程度)之量來投與。有效緩解任一特定疾病症狀之治療劑之量可根據諸如以下等因素而有所變化：疾病狀態、患者之年齡及體重及藥物在個體中誘發期望反應之能力。可藉由通常由醫師或其他熟練健康保健提供者用於評價疾病症狀之嚴重程度或進展狀態之任一臨床量測來評價該症狀是否已緩解。

CD27

在本發明之一實施例中，人類CD27之胺基酸序列包括SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20之胺基酸序列(其與SEQ ID NO：19一致，但包含SNP-A59T)。基於ExAC資料庫，rs25680等位基因(通稱為A59T)之頻率具有19.78%之整體平均值。

在本發明之一實施例中，食蟹猴(例如長尾猴(Macaca fascicularis)CD27或恆河獼猴CD27(mmCD27))之胺基酸序列包括SEQ ID NO：21中所揭示之胺基酸序列。

抗CD27抗體及其抗原結合片段

本發明提供結合人類CD27之抗體或其抗原結合片段及該等抗體或片段之用途。在一些實施例中，抗CD27抗體係經分離抗體。

在一些實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段以約5-10nM之KD結合至人類CD27(SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20)。在一實施例中，結合至人類CD27之本發明抗體亦與mmCD27具有交叉反應性如本文中所使用，「交叉反應性」係指抗體能夠與來自其他物種之同源蛋白發生反應。可使用業內已知之任一分析來測定抗體是否結合至人類CD27或mmCD27。業內已知用以測定結合親和力之分析之實例包含表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)。

本發明包含抗CD27抗體及其使用方法。如本文中所使用，術語「抗體」係指展現期望生物活性之任一形式的抗體。因此，其係以最廣泛意義使用且具體而言涵蓋(但不限於)單株抗體(包含含有兩條輕鏈及兩條重鏈之全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人類化抗體、全人類抗體及嵌合抗體。

本發明包含抗CD27抗原結合片段及其使用方法。除非另外指示，否則如本文中所使用，「抗體片段」或「抗原結合片段」係指抗體之抗原結合片段，亦即保留特異性結合至由全長抗體結合之抗原之能力之抗體片段，例如保留一或多個CDR區之片段。抗原結合片段之實例包含(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')₂及Fv片段；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如sc-Fv)；自抗體片段形成之多特異性抗體。

本發明包含抗CD27 Fab片段及其使用方法。「Fab片段」包括一條輕鏈及一條重鏈之C_H1及可變區。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fab片段」可為抗體之木瓜酶裂解之產物。

本發明包含抗CD27抗體及包括Fc區之其抗原結合片段以及其使用方法。「Fc」區含有包括抗體之C_H3及C_H2結構域之兩個重鏈片段。兩個重鏈片段藉由兩個或更多個二硫鍵且藉由C_H3結構域之疏水性相互作用保持在一起。

本發明包含抗CD27 Fab’片段及其使用方法。「Fab'片段」含有一條輕鏈及部分或一種重鏈中含有V_H結構域及C_H1結構域亦及C_H1與C_H2結構域之間之區域之片段，從而鏈間二硫鍵可形成於兩個Fab'片段之兩條重鏈之間以形成F(ab')₂分子。

本發明包含抗CD27F(ab’)₂片段及其使用方法。「F(ab')₂片段」含有兩條輕鏈及含有C_H1與C_H2結構域之間之恆定區部分之兩條重鏈，從而在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。F(ab')₂片段由此由兩個藉由兩條重鏈之間之二硫鍵保持在一起之Fab'片段構成。「F(ab')₂片段」可為抗體之胃蛋白酶裂解之產物。

本發明包含抗CD27 Fv片段及其使用方法。「Fv區」包括來自重鏈及輕鏈之可變區，但缺乏恆定區。

本發明包含抗CD27 scFv片段及其使用方法。術語「單鏈Fv」或「scFv」抗體係指包括抗體之V_H及V_L結構域之抗體片段，其中該等結構域存在於單一多肽鏈中。通常，Fv多肽進一步在V_H結構域與V_L結構域之間包括多肽連接體，其使scFv能形成用於抗原結合之期望結構。關於scFv之綜述，參見Pluckthun(1994)THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES,vol.113,Rosenburg及Moore編輯， Springer-Verlag,New York,pp.269-315。亦參見國際專利申請案公開案第WO 88/01649號及美國專利第4,946,778號及第5,260,203號。

本發明包含抗CD27二價抗體及其使用方法。「二價抗體」包括兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。然而，二價抗體可為雙特異性(參見下文)。

本發明包含抗CD27二價抗體及其使用方法。如本文中所使用，術語「二價抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，該等片段包括在同一多肽鏈(V_H-V_L或V_L-V_H)中與輕鏈可變結構域(V_L)連結之重鏈可變結構域(V_H)。藉由使用過短而不容許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。二價抗體更全面闡述於(例如)以下文獻中：EP 404,097；WO 93/11161；及Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448。關於經改造抗體變體之綜述，通常參見Holliger及Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136。

通常，在以莫耳計來表示活性時，以一定方式修飾之本發明之抗體或抗原結合片段保留至少10%的其結合活性(在與親代抗體比較時)。較佳地，本發明之抗體或抗原結合片段保留親代抗體之至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高之CD27結合親和力。亦預計，本發明之抗體或抗原結合片段可包含不實質上改變其生物活性之保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體之「保守變體」或「功能保守變體」)。

本發明包含經分離抗CD27抗體及其抗原結合片段以及其使用方法。「經分離」抗體或其抗原結合片段至少部分地不含來自產生其之細胞或細胞培養液中之其他生物分子。該等生物分子包含核酸、蛋白質、脂質、碳水化合物或其他材料(例如細胞碎屑及生長培養基)。經分離抗體或抗原結合片段可另外至少部分地不含表現系統組分(例如來自宿主細胞之生物分子)或其生長培養基。通常，術語「經分離」意欲係指完全不存在該等生物分子或不存在水、緩衝劑或鹽或不存在包含抗體或片段之醫藥調配物之組分。

本發明包含抗CD27嵌合抗體(例如人類恆定結構域/小鼠可變結構域)及其使用方法。如本文中所使用，「嵌合抗體」係具有來自第一抗體之可變結構域及來自第二抗體之恆定結構域之抗體，其中第一及第二抗體係來自不同物種。(美國專利第4,816,567號；及Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855)。通常，可變結構域係自來實驗動物(例如齧齒類動物)之抗體(「親代抗體」)獲得，且恆定結構域序列係自人類抗體獲得，從而所得嵌合抗體較親代(例如小鼠)抗體較不可能在人類個體中誘發不良免疫反應。

本發明包含抗CD27人類化抗體及其抗原結合片段(例如已人類化之大鼠或小鼠抗體)及其使用方法。本發明包含131A抗體之任一人類化形式。如本文中所使用，「131A抗體」及「hCD27.131A」可互換使用且係指包括SEQ ID NO：7之VH區及SEQ ID NO：8之VL區之抗體。如本文中所使用，術語「人類化抗體」係指含有來自人類及非人類(例如小鼠或大鼠)抗體之序列之抗體形式。通常，人類化抗體將包括實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部超變環對應於非人類免疫球蛋白之超變環，且全部或實質上全部框架(FR)區為人類免疫球蛋白序列之FR區。人類化抗體可視情況包括人類免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分。關於人類化抗體之其他細節可參見(例如)Jones等人，Nature, 321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332：323-329(1988)；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596(1992)；及Clark,Immunol.Today 21：397-402(2000)。

一般而言，基本抗體結構單元包括四聚體。每一四聚體包含兩對相同多肽鏈，每一對具有一條「輕」鏈(約25kDa)及一條「重」鏈(約50-70kDa)。每一鏈之胺基末端部分包含主要負責抗原識別之約100個至110個或更多胺基酸之可變區。重鏈之羧基末端部分可定義主要負責效應物功能之恆定區。通常，人類輕鏈分類為κ及λ輕鏈。另外，人類重鏈通常分類為μ、δ、α或ε，且將抗體之同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由約12或更多個胺基酸之「J」區接合，其中該重鏈亦包含約10或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.編輯，第2版，Raven Press,N.Y.(1989)。

每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點。因此，一般而言，完整抗體具有兩個結合位點。除在雙功能或雙特異性抗體中外，兩個結合位點通常相同。

通常，重鏈及輕鏈二者之可變結構域包括三個超變區，亦稱為互補決定區(CDR)，其位於相對保守之框架區(FR)內。CDR通常係藉由框架區對準，從而使得能夠結合至特異性表位。一般而言，自N-末端至C-末端，輕鏈及重鏈可變結構域二者皆包括FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸與每一結構域之比對通常係根據如下之定義：Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；第5版；NIH出版號91- 3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等人(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia等人(1989)Nature 342：878-883。

如本文中所使用，術語「框架」或「FR」殘基係指不同於本文定義為CDR殘基之超變區殘基之可變結構域殘基。

如本文中所使用，術語「超變區」係指負責抗原結合之抗體或其抗原結合片段之胺基酸殘基。超變區包括「CDR」(亦即輕鏈可變結構域中之CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈可變結構域中之CDRH1、CDRH2及CDRH3)之胺基酸殘基。參見Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，國立衛生研究院，Bethesda,Md.(藉由序列定義抗體之CDR區)；亦參見Chothia及Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(藉由結構定義抗體之CDR區)。

「經分離之核酸分子」或「經分離之多核苷酸」意指基因組、mRNA、cDNA或合成來源之DNA或RNA或其一些組合，其不與自然中發現之分離多核苷酸之全部或一部分之多核苷酸締和，或連接至自然中不連接之多核苷酸。出於本發明目的，應理解，「包括特定核苷酸序列之核酸分子」不涵蓋完整染色體。「包括」指定核酸序列之經分離核酸分子，除指定序列外，亦可包含多達10種或甚至多達20種或更多種其他蛋白質或其部分或片段之編碼序列，或可包含控制所列核酸序列之編碼區表現之可操作地連接之調節序列，及/或可包含載體序列。

片語「控制序列」係指在特定宿主生物體中對於表現可操作地連接之編碼序列所需之DNA序列。舉例而言，適用於原核生物之控制序列包含啟動子、視情況操縱子序列，及核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、多腺苷酸化信號及增強子。

當一種核酸或多核苷酸與另一核酸序列以功能性關係放置時，該核酸或多核苷酸係「可操作地連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA係可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子係可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點定位以有助於轉譯，則該核糖體結合位點係可操作地連接至該編碼序列。通常，但非總是，「可操作地連接」意指所連接之DNA序列係鄰接，且在分泌前導序列之情形下係鄰接且位於閱讀框(reading phase)中。然而，增強子不必鄰接。連接係藉由在方便限制位點接合來完成。若該等位點不存在，則根據習用慣例使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。

如本文中所使用，表達「細胞」、「細胞系」及「細胞培養液」可互換使用，且所有該等名稱皆包含子代。因此，詞語「轉變體」及「轉變細胞」包含原代個體細胞及源自其之培養液，而不考慮轉移次數。亦應理解，並非所有子代之DNA含量皆因有意或無意突變而精確地相同。本發明包含在初始轉變細胞中篩選之具有相同功能或生物活性之突變體子代。倘若意欲使用不同名稱，則其可自上下文明了。

如本文中所使用，「種系序列」係指未重排免疫球蛋白DNA序列之序列。可使用任一適宜來源之未重排免疫球蛋白序列。可(例如)自美國國立衛生研究院之National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases之網站上之JOINSOLVER種系資料庫獲得人類種系序列。可(例如)如Giudicelli等人(2005)Nucleic Acids Res.33：D256-D261中所闡述來獲得小鼠種系序列。

實例性抗CD27抗體之物理及功能性質

本發明提供具有指定結構及功能特徵之抗CD27抗體及其抗原結合片段及使用該等抗體或其抗原結合片段治療或預防疾病(例如癌症或感染性疾病)之方法。

「本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段」包含：本文所論述之任一抗體或其抗原結合片段(例如表12中所揭示之hCD27.131A或其人類化形式)或其變體(例如序列變體或功能變體)；任一包括表12中所陳述CDR中之任一者或多者之抗體或抗原結合片段。

如上文所陳述，與本發明之任一抗CD27抗體或其抗原結合片段結合至相同表位之抗體及片段亦形成本發明之一部分。在一實施例中，本發明提供與包括SEQ ID NO：10之可變重鏈及SEQ ID NO：15之可變輕鏈之抗體結合至人類CD27之相同表位的抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供與包括SEQ ID NO：7之可變重鏈及SEQ ID NO：8之可變輕鏈之抗體結合至人類CD27之相同表位的抗體或其抗原結合片段。可利用若干方法來將抗體表位定位於靶抗原上，包含：H/D-Ex質譜、X射線結晶學、pepscan分析、丙胺酸掃描、羥基足跡分析及定點誘變。舉例而言，可使用HDX(氫氘交換)以及蛋白水解及質譜來測定特定抗原Y上之抗體表位。HDX-MS依賴於在自身及在其抗體存在下培育於D₂O中時在不同時間間隔下抗原之氘納入程度之準確量測及比對。氘與暴露區中蛋白質之醯胺主鏈上之氫發生交換，而結合至抗體之抗原之區域得以保護且在藉由LC-MS/MS分析蛋白水解片段之後展示較小或不展示交換。在一實施例中，藉由以下方式來測定表位：解析CD27或其片段與抗CD27抗體或其片段之間之複合物之X射線晶體結構，且鑑別抗CD27抗體殘基4Å內之一或多個 CD27殘基。在另一實施例中，表位包含(例如)與抗CD27抗體殘基具有凡得瓦(van der Waals)、極性相互作用、鹽橋或氫鍵接觸之CD27殘基。在另一實施例中，藉由誘變(例如丙胺酸掃描)CD27殘基且分析因該誘變而損失之至抗CD27抗體之結合來測定表位。

本發明提供在結合至人類CD27時結合至少一個選自由SEQ ID NO：19之Leu18、Asp34、Gln35及Lys38組成之群之殘基的抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段結合至少一個、兩個、三個或四個選自由SEQ ID NO：19之Leu18、Asp34、Gln35及Lys38組成之群之殘基。本發明亦提供在結合至人類CD27時結合至少一個選自由SEQ ID NO：19之Gln35及Lys38組成之群之殘基的抗體或其抗原結合片段。在一實施例中，抗體或其抗原結合片段至少結合SEQ ID NO：19之Gln35及Lys38。

在前述實施例之另一實施例中，抗體或抗原結合片段進一步結合一或多個選自由SEQ ID NO：19之Pro8、Glu9、His11、Lys17、His36及Arg37組成之群之殘基(一個、兩個、三個、四個、五個或六個殘基)。在另一實施例中，抗體或抗原結合片段進一步結合一或多個選自由SEQ ID NO：19之Glu9、Lys17、His36及Arg37組成之群之殘基(一個、兩個、三個或四個殘基)。在本發明之另一態樣中，抗體或其抗原結合片段結合SEQ ID NO：19之殘基Pro8、Glu9、His11、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37及Lys38。在另一實施例中，抗體或抗原結合結合SEQ ID NO：19之殘基Glu9、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37及Lys38。

在前述實施例之一實施例中，抗體或其抗原結合片段視情況具有下列特性中之至少一者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

本發明抗CD27抗體之免疫球蛋白鏈以及其CDR之實例包含(但不限於)揭示於表12中者(SEQ ID NO：7-18及32-40)。本發明包含任一包括SEQ ID NO：7-18及32-40及44-45之胺基酸序列或由組成之多肽，及編碼該等多肽之重組核苷酸。

本發明範圍包含經分離抗CD27抗體及其抗原結合片段(例如人類化抗體)，其包括本文所陳述免疫球蛋白鏈之變體(例如SEQ ID NO：7-18、32-40及44-45中之任一者)；其中該變體展現下列性質中之一或多者：根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5 倍。在一實施例中，變體包括關於SEQ ID NO：7-18、32-40及44-45中之任一者之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸取代。

在其他實施例中，本發明提供結合人類CD27(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：7-18及32-40中之至少一者具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之V_L結構域及V_H結構域之抗體或其抗原結合片段；其中該變體展現期望結合及性質，例如根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27，根據細胞ELISA分析以小於150pM或小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 A59T；根據細胞ELISA分析以小於100pM或小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；以約5-10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定；與食蟹猴或恆河猴CD27交叉反應；阻斷人類CD27結合至人類CD70；增加T細胞活化；刺激IL-2及IFNγ之抗原特異性T細胞產生；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；在抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27而言具有小於0.5nM之EC50；以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及增加人類腫瘤培養液中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。在一實施例中，人類CD27、人類CD27A59T或恆河猴CD27表現細胞係含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體之瞬時轉染CD27質體之HEK293FT人類胚胎腎細胞。在一實施例中，藉由呈CD25+CD69+形式之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化，且CD8+ T 細胞活化平均增加約1.5-2倍。在另一實施例中，在20ug/ml抗CD27抗體及10ng/ml抗CD3抗體下，抗CD3誘導之IFN_γ產生增加至少1.5倍。

在其他實施例中，本發明提供結合人類CD27(例如人類化抗體)且與SEQ ID NO：8、14-18、33、35及40之任一V_L結構域及SEQ ID NO：7、9-13、32、34及39之任一V_H結構域具有至少95%序列一致性之V_L結構域及V_H結構域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類CD27(例如人類化抗體)且具有關於SEQ ID NO：8、14-18、33、35及40之任一V_L結構域及SEQ ID NO：7、9-13、32、34及39之任一V_H結構域之V_L結構域及V_H結構域的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，本發明提供結合人類CD27(例如人類化抗體)且具有與SEQ ID NO：8、14-18、33、35及40之任一V_L結構域及SEQ ID NO：7、9-13、32、34及39之任一V_H結構域具有至少99%序列一致性之V_L結構域及V_H結構域的抗體或其抗原結合片段。

「保守修飾變體」或「保守取代」係指蛋白質中之胺基酸經具有類似特性(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構形及剛性等)之其他胺基酸取代，從而通常可進行變化而不改變蛋白質之生物活性。熟習此項技術者應認識到，一般而言，在多肽之非必需區中之單一胺基酸取代不會實質上改變生物活性(例如參見Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Pub.Co.,p.224(第4版))。另外，結構或功能類似之胺基酸之取代較不可能破壞生物活性。實例性保守取代陳述於表1中。

本發明抗體之功能保守變體亦由本發明涵蓋。本文所用之「功能保守變體」係指一或多個胺基酸殘基已發生改變而不改變期望性質(例如抗原親和力及/或特異性)之抗體或片段。該等變體包含(但不限於)使用具有類似性質之胺基酸代替一種胺基酸，例如表1之保守胺基酸取代。亦提供具有最多0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代之包括本發明抗CD27抗體之V_L結構域之經分離多肽(例如SEQ ID NO：8、14-18、33、35及40)及包括本發明抗CD27抗體之V_H結構域之經分離多肽(例如SEQ ID NO：7、9-13、32、34及39)。

在另一實施例中，提供結合CD27且具有與本文所闡述之一或多個V_L結構域或V_H結構域具有至少99% 98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%或75%序列一致性之V_L結構域及V_H結構域並展現特異性CD27結合之抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明之結合抗體或其抗原結合片段包括具有最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多個胺基酸取代之V_L及V_H結構域(具有及不具有信號序列)，且展現特異性CD27結合。

多核苷酸及多肽

本發明進一步包括編碼本發明之抗CD27抗體及其抗原結合片段之任一多肽或免疫球蛋白鏈之多核苷酸。舉例而言，本發明包含編碼SEQ ID NO：1-18、32-40及44-45中之任一者中所闡述之胺基酸之多核苷酸。在另一實施例中，本發明提供包括SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47或二者之經分離核酸。

在一實施例中，提供編碼本文所陳述之經分離抗體或抗原結合片段之多肽鏈之經分離多核苷酸(例如DNA)。在一實施例中，經分離多核苷酸編碼包括至少一個本發明之成熟免疫球蛋白輕鏈可變(V_L)結構域及/或至少一個本發明之成熟免疫球蛋白重鏈可變(V_H)結構域之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，經分離多核苷酸編碼單一多核苷酸分子上之輕鏈及重鏈，且在其他實施例中輕鏈及重鏈編碼於單獨多核苷酸分子上。在另一實施例中，多核苷酸進一步編碼信號序列。

在一實施例中，本發明包括編碼包括CDR-H1(SEQ ID NO：1)、CDR-H2(SEQ ID NO：2)及CDR-H3(SEQ ID NO：3)之V_H結構域或其抗原結合片段之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼包括CDR-L1(SEQ ID NO：4)、CDR-L2(SEQ ID NO：5)及CDR-L3(SEQ ID NO：6)之V_L結構域或其抗原結合片段之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：7之V_H結構域之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：8之V_L結構域之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：10-13中之任一者之V_H結構域之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：10之V_H結構域之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：15-18中之任一者之V_L結構域之經分離多核苷酸。

在一實施例中，本發明包括編碼SEQ ID NO：15之V_L結構域之經分離多核苷酸。

本發明亦提供包括本發明之經分離多核苷酸之載體(例如表現載體，例如質體)，其中該多核苷酸可操作地連接至在宿主細胞經載體轉染時由宿主細胞識別之控制序列。亦提供包括本發明載體之宿主細胞及產生本文所揭示之抗體或其抗原結合片段或多肽之方法，該方法包括：在培養基中培養含有表現載體或編碼抗體或其抗原結合片段之免疫球蛋白鏈之核酸之宿主細胞，及自宿主細胞或培養基分離抗原或其抗原結合片段。

本發明亦包含在藉由BLAST算法實施對比時包括與本文所提供抗體之胺基酸序列至少約75%一致、80%一致、更佳地至少約90%一致及最佳地至少約95%一致(例如95%、96%、97%、98%、99%、100%)之胺基酸序列之多肽(例如免疫球蛋白多肽)，其中選擇該算法之參數以得到各別參考之序列整個長度上各別序列之間之最大匹配(例如預期臨限值：10；字長：3；詢問範圍之最大匹配：0；BLOSUM 62矩陣；空位成本：存在：11，延伸：1；條件性組份評分矩陣調節)。

序列一致性係指在最佳地比對兩個序列時兩個多肽之胺基酸在等效位置相同之程度。

下列參考文獻係關於通常用於序列分析之BLAST算法：BLAST算法：Altschul等人(2005)FEBS J.272(20)：5101-5109；Altschul,S.F.等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；Gish,W.等人(1993)Nature Genet.3：266-272；Madden,T.L.等人(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul,S.F.等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402；Zhang,J.等人(1997)Genome Res.7：649-656；Wootton,J.C.等人(1993)Comput.Chem.17：149-163；Hancock,J.M.等人(1994)Comput.Appl.Biosci.10：67-70；比對評分系統：Dayhoff,M.O.等人，「A model of evolutionary change in proteins.」Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5，增刊3.M.O.Dayhoff(編輯)，pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.等人，「Matrices for detecting distant relationships.」Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5，增刊3.M.O.Dayhoff(編輯)，pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219：555-565；States,D.J.等人(1991)Methods 3：66-70；Henikoff,S.等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915- 10919；Altschul,S.F.等人(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；ALIGNMENT STATISTICS：Karlin,S.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268；Karlin,S.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877；Dembo,A.等人(1994)Ann.Prob.22：2022-2039；及Altschul,S.F.「Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments.」Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai編輯)，(1997)pp.1-14,Plenum,New York。

結合親和力

舉例而言且並不加以限制，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以10×10^-9M或更低之二價K_D值結合人類CD27或CD27A59T(SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20)，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定且如使用人類CD27-Fc融合蛋白或人類CD27A59T-Fc融合蛋白所量測。在一實施例中，本文所揭示之抗體及抗原結合片段可以約5-10×10^-9M之二價K_D值結合人類CD27或CD27A59T，如藉由表面電漿共振(例如BIACORE)或類似技術(例如KinExa或OCTET)所測定且使用人類CD27-Fc融合蛋白或人類CD27A59T-Fc融合蛋白如所量測。

免疫細胞活化

在一些實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段增加免疫細胞之活性。可使用業內已知之任一方法來檢測增加免疫細胞之活性。在一實施例中，可藉由量測免疫細胞之增殖來檢測免疫細胞活性之增加。舉例而言，可藉由量測T細胞增殖或信號轉導事件(例如免疫受體或將信號傳遞至轉錄調節子之下游激酶之酪胺酸磷酸化)來檢測T細胞活性之增加。在其他實施例中，可藉由量測特定靶細胞上之CTL或NK細胞毒性功能或IFNγ細胞介素反應(其與抗腫瘤免疫性之刺激有關)來檢測免疫細胞活性之增加。在其他實施例中，可藉由量測源自個體之試樣中之離體T細胞活化來檢測免疫細胞活性之增加。在一實施例中，藉由以下方式來測定T細胞活性之增加：(i)量測一或多種選自由以下組成之群之促發炎性細胞介素之SEB(葡萄球菌腸毒素B)誘導之產生：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13；或(ii)量測混合淋巴球反應或誘導產生選自由以下組成之群之細胞介素之TCR信號傳導的直接抗CD3 mAb刺激：IL-2、TNFα、IL-17、IFNγ、IL-1β、GM-CSF、RANTES、IL-6、IL-8、IL-5及IL-13。在某些實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段將刺激IL-2及/或IFNγ之抗原特異性T細胞產生至少1.5倍。

在一些實施例中，可藉由流式細胞術根據CD25及CD69上調來檢測本發明之抗體或抗原結合片段增加免疫細胞活性之能力。

抗hCD27抗體阻斷結合至hCD70之能力

在一些實施例中，本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段能夠阻斷人類CD27結合至人類CD70。可使用業內已知之任一方法來測定阻斷人類CD27結合至人類CD70之能力。在一實施例中，使用ELISA分析來測定抗體阻斷人類CD27結合至人類CD70之能力。

製備抗體及其抗原結合片段之方法

因此，本發明包含製備本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在有益於表現之條件下培養表現該抗體或片段之雜交瘤細胞及視情況自雜交瘤及/或生長培養基(例如細胞培養基)分離抗體或片段。

亦可以重組方式產生本文所揭示之抗CD27抗體(例如在大腸桿菌(E. coli)/T7表現系統、哺乳動物細胞表現系統或低級真核生物表現系統中)。在此實施例中，可將編碼本發明之抗體免疫球蛋白分子之核酸(例如V_H或V_L)插入基於pET之質體中且表現於大腸桿菌/T7系統中。舉例而言，本發明包含在宿主細胞(例如細菌宿主細胞，例如大腸桿菌，例如BL21或BL21DE3)中表現抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之方法，其包括在亦包含編碼可操作地連接至T7啟動子之免疫球蛋白鏈之多核苷酸之細胞中表現T7 RNA聚合酶。舉例而言，在本發明之一實施例中，細菌宿主細胞(例如大腸桿菌)包含編碼因可操作地連接至lac啟動子之T7 RNA聚合酶基之多核苷酸，且藉由使用IPTG(異丙基-β-D-半乳糖硫吡喃糖苷)培育宿主細胞來誘導聚合酶及鏈之表現。

存在產生業內已知之重組抗體之若干方法。重組產生抗體之一種方法實例揭示於美國專利第4,816,567號中。

藉由將多核苷酸引入宿主細胞中之任一已知方法來進行轉變。用於將異源多核苷酸酸引入哺乳動物細胞中之方法在業內已眾所周知，且包含右旋糖酐調介之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺調介之轉染、原生質體融合、電穿孔、將多核苷酸囊封於脂質體中、生物槍注射及直接向細胞核中顯微注射DNA。另外，可藉由病毒載體將核酸分子引入哺乳動物細胞中。轉變細胞之方法在業內已眾所周知。例如參見美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號及第4,959,455號。

因此，本發明包含製備本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段或其免疫球蛋白鏈之重組方法，其包括：引入編碼抗體或片段之一或多條免疫球蛋白鏈(例如免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈)之多核苷酸；在有益於表現之條件下培養宿主細胞(例如CHO或畢赤酵母屬或巴斯德畢赤酵母)，及視情況自宿主細胞及/或生長宿主細胞之培養基分離抗體或片段或鏈。

亦可藉由美國專利第6,331,415號中所陳述之任一方法來合成抗CD27抗體。

用於表現本文所揭示之抗體或片段或免疫球蛋白鏈之真核及原核宿主細胞(包含哺乳動物宿主細胞)在業內已眾所周知且包含許多可自美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC)獲得之永生化細胞系。該等細胞系尤其包含中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO、SP2細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌瘤細胞(例如Hep G2)、A549細胞、3T3細胞、HEK-293細胞及諸多其他細胞系。哺乳動物宿主細胞包含人類、小鼠、大鼠、狗、猴、豬、山羊、牛、馬及倉鼠之細胞。經由測定哪些細胞系具有高表現程度來選擇尤佳細胞系。可使用之其他細胞系係昆蟲細胞系(例如Sf9細胞)、兩棲動物細胞、細菌細胞、植物細胞及真菌細胞。真菌細胞包含酵母及絲狀真菌細胞，包含(例如)巴斯德畢赤酵母、芬蘭畢赤酵母(Pichia finlandica)、喜海藻糖畢赤酵母(Pichia trehalophila)、克拉瑪依畢赤酵母(Pichia koclamae)、膜醭畢赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小畢赤酵母(Pichia minuta)(微小畢赤酵母(Ogataea minuta)、林德利畢赤酵母(Pichia lindneri))、歐普提畢赤酵母(Pichia opuntiae)、耐熱畢赤酵母(Pichia thermotolerans)、千屈菜畢赤酵母(Pichia salictaria)、古爾姆畢赤酵母(Pichia guercuum)、皮傑普氏畢赤酵母(Pichia pijperi)、具柄畢赤酵母(Pichia stiptis)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)、畢赤酵母屬、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、酵母菌屬(Saccharomyces sp.)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces sp.)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麯黴(Aspergillus niger)、米曲黴菌(Aspergillus oryzae)、裡氏木黴(Trichoderma reesei)、勞肯諾溫斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、鐮孢菌屬(Fusarium sp.)、禾穀鐮孢菌(Fusarium gramineum)、鑲片鐮孢菌(Fusarium venenatum)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)及紅麵包黴菌(Neurospora crassa)。畢赤酵母屬、任一酵母菌屬、多形漢森酵母、任一克魯維酵母屬、白色念珠菌、任一曲黴菌(Aspergillus)屬、裡氏木黴、勞肯諾溫斯金孢子菌、任一鐮孢菌屬、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)及紅麵包黴菌。在將編碼重鏈或其抗原結合部分或片段、輕鏈及/或其抗原結合片段之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足以容許在宿主細胞中表現抗體或片段或鏈或分泌至生長宿主細胞之培養基中之時間段來產生抗體。

可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈。另外，可使用諸多已知技術來增強本發明之抗體及其抗原結合片段及免疫球蛋白鏈(或來自其之其他部分)自產生細胞系之表現。舉例而言，麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)係用於增強在某些條件下之表現之常用方式。結合歐洲專利第0 216 846號、第0 256 055號及第0 323 997號及歐洲專利申請案第89303964.4號來整體或部分地論述GS系統。因此，在本發明之一實施例中，哺乳動物宿主細胞(例如CHO)缺乏麩醯胺酸合成酶基因且使其在不存在麩醯胺酸下於培養基中生長，然而，其中編碼免疫球蛋白鏈之多核苷酸包括補充宿主細胞中之基因缺乏之麩醯胺酸合成酶基因。

一般而言，在特定細胞系或轉基因動物中產生之醣蛋白具有在該細胞系或轉基因動物中產生之醣蛋白之特性性醣基化模式。因此，抗體之特定醣基化模式取決於用於產生抗體之特定細胞系或轉基因動物。然而，獨立於抗體可具有之醣基化模式，由本文所提供之核酸分子編碼或包括本文所提供之胺基酸序列之所有抗體皆構成本發明。類似地，在特定實施例中，具有僅包括非岩藻糖基化N-聚醣之醣基化模式之抗體可較為有利，此乃因該等抗體已展示通常在活體外及活體內展現大於其岩藻糖基化對應體之強力效能(例如參見Shinkawa等人，J.Biol.Chem.278：3466-3473(2003)；美國專利第6,946,292號及第7,214,775號)。具有非岩藻糖基化N-聚醣之該等抗體很可能沒有免疫原性，此乃因其碳水化合物結構係存在於人類血清IgG中之正常群體組分。

本發明包含對CD27及另一抗原(例如PD-1、PD-L1或LAG-3)具有結合特異性之雙特異性及雙功能抗體及抗原結合片段及其使用方法。在本發明之一實施例中，抗CD27鏈包括表12中所闡述之VH/VL序列中之任一者，且抗PD1鏈包括SEQ ID NO：48及53或SEQ ID NO：78及52之胺基酸序列(或該等序列中之任一者之抗原結合片段)。雙特異性或雙功能抗體係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法(包含雜交瘤融合或連接Fab'片段)來產生。例如參見Songsivilai等人(1990)Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人(1992)J Immunol.148：1547-1553。另外，雙特異性抗體可形成為「雙價抗體」(Holliger等人(1993)PNAS USA 90：6444-6448)或形成為「鉀努星(Janusins)」(Traunecker等人(1991)EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人(1992)Int.J.Cancer增刊7：51-52)。

本發明進一步包含本文所揭示之抗CD27抗體之抗CD27抗原結合片段。抗體片段包含F(ab)₂片段，後者可藉由使用(例如)胃蛋白酶酶促裂解IgG來產生。可藉由(例如)使用二硫蘇糖醇或巰基乙基胺還原F(ab)₂來產生Fab片段。

端視重鏈之恆定結構域之胺基酸序列，可將免疫球蛋白分配至不同種類。在一些實施例中，不同恆定結構域可附加至衍生自本文所提供之CDR之人類化V_L及V_H區。存在至少5大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等種類中之若干可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4；IgA1及IgA2。本發明包括該等種類或子類中之任一者之抗體及抗原結合片段。

在一實施例中，抗體或抗原結合片段包括重鏈恆定區，例如人類恆定區，例如γ1、γ2、γ3或γ4人類重鏈恆定區或其變體。在另一實施例中，抗體或抗原結合片段包括輕鏈恆定區，例如人類輕鏈恆定區，例如λ或κ人類輕鏈區或其變體。舉例而言且並不加以限制，人類重鏈恆定區可為γ4且人類輕鏈恆定區可為κ。在一替代實施例中，抗體之Fc區係具有Ser228Pro突變之γ4(Schuurman,J等人，Mol.Immunol.38：1-8,2001)。

在一實施例中，抗體或抗原結合片段包括IgG1亞型之重鏈恆定區。在一實施例中，抗體或抗原結合片段包括IgG2亞型之重鏈恆定區。在一實施例中，抗體或抗原結合片段包括IgG4亞型之重鏈恆定區。

抗體改造

進一步包含如下實施例：其中抗CD27抗體及其抗原結合片段係改造抗體以包含對親代hCD27.131A單株抗體之可變結構域內之框架殘基之修飾，從而(例如)改良抗體或片段之性質。通常，該等框架修飾經進行以降低抗體或片段之免疫原性。此通常係藉由使用來自擬使用抗體之物種之免疫譜之類似殘基(例如在人類治療情形下之人類殘基)代替親代(例如齧齒類動物)抗體或片段中可變結構域中的非CDR殘基(亦即框架殘基)來達成。此一抗體或片段稱為「人類化」抗體或片段。在一些情形下，期望增加經改造(例如人類化)抗體之親和力，或改變其特異性。一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應之種系序列。更具體而言，已經受體細胞突變之抗體或片段可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體或片段框架序列與衍生出該抗體或片段之種系序列來鑑別。另一方式係在經改造(例如人類化)抗體之一或多個位置復原至原始親代(例如齧齒類動物)殘基以(例如)恢復可在代替框架殘基之過程時損失之結合親和力。(例如參見美國專利第5,693,762號、美國專利第5,585,089號及美國專利第5,530,101號。)

在某些實施例中，對抗CD27抗體及其抗原結合片段進行改造(例如人類化)以在框架及/或CDR中包含修飾，從而改良其性質。該等改造變化可基於分子建模。可構築親代(非人類)抗體序列之可變區之分子模型以理解抗體之結構特徵且用於鑑別抗體上可與抗原相互作用之潛在區域。習用CDR係基於比對免疫球蛋白序列及鑑別可變區。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等人；國立衛生研究院，Bethesda,Md.；第5版；NIH Publ.No.91-3242；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等人(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616。Chothia及合作者小心檢驗抗體晶體結構中之環及所提出超變區環之構形。Chothia等人(1987)J Mol.Biol.196：901-917或Chothia 等人(1989)Nature 342：878-883。分類為「CDR」及「超變環」之區域之間存在變化。後期研究(Raghunathan等人(2012)J.Mol Recog.25,3,103-113)分析若干抗體-抗原晶體複合物且觀察到抗體中之抗原結合區未必與「CDR」殘基或「超變」環嚴格一致。可使用非人類抗體之可變區之分子模型來引導選擇可潛在結合至抗原之區域。在實踐中，基於模型之潛在抗原結合區不同於習用「CDR」或「超變」環。可使用商業科學軟體(例如MOE(Chemical Computing Group))進行分子建模。可基於與框架及CDR中之非人類序列之最佳匹配來選擇人類框架。對於VH中之FR4(框架4)而言，將人類種系之VJ區與相應非人類區域進行比較。在VL中之FR4(框架4)之情形下，將人類種系序列之J-κ及J-λ區與相應非人類區域進行比較。在鑑別出適宜人類框架後，立即將CDR接枝至所選人類框架中。在一些情形下，可保留VL-VH界面中之某些殘基，如在非人類(親代)序列中。亦可使用分子模型來鑑別可潛在改變CDR構形且由此結合至抗原之殘基。在一些情形下，該等殘基得以保留，如在非人類(親代)序列中。亦可使用分子模型來鑑別可產生不期望效應(例如醣基化/去醯胺化及氧化)之溶劑暴露之胺基酸。可在設計階段之早期引入可開發性過濾器以消除/最小化該等潛在問題。

另一類型之框架修飾涉及突變框架區或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基以去除T細胞表位，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方式亦稱為「去免疫化」且進一步詳細闡述於美國專利第7,125,689號中。

在特定實施例中，期望將某些含有暴露側鏈之胺基酸改變為另一胺基酸殘基以提供最終抗體之較大化學穩定性，從而避免去醯胺化或異構化。天門冬醯胺酸之去醯胺化可在NG、DG、NG、NS、NA、NT、QG或 QS序列上發生且造成產生異天門冬胺酸殘基，其向該多肽鏈中引入扭結且降低其穩定性(異天門冬胺酸效應)。異構化可發生於DG、DS、DA或DT序列。在某些實施例中，本發明抗體不含去醯胺化或天門冬醯胺酸異構位點。

舉例而言，可將天門冬醯胺酸(Asn)殘基改變為Gln或Ala以減小在任何Asn-Gly序列、尤其在CDR內形成異天門冬胺酸之可能。類似問題可發生於Asp-Gly序列。Reissner及Aswad(2003)Cell.Mol.Life Sci.60：1281。異天門冬胺酸形成可減弱或完全消除抗體結合至其靶抗原。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731至734。在一個實施例中，將天門冬醯胺酸改變為麩醯胺酸(Gln)。亦可期望改變毗鄰天門冬醯胺酸(Asn)或麩醯胺酸(Gln)殘基之胺基酸以減小去醯胺化之可能性，去醯胺化以較大速率發生於小胺基酸毗鄰天門冬醯胺酸或麩醯胺酸出現時。參見Bischoff & Kolbe(1994)J.Chromatog.662：261。另外，可將CDRs中之任何甲硫胺酸殘基(通常係溶劑暴露之Met)改變為Lys、Leu、Ala或Phe或其他胺基酸以減小甲硫胺酸硫發生氧化之可能性，該氧化可減小抗原結合親和力且亦造成最終抗體製劑中之分子異質性(見上文)。另外，為防止或最少化潛在易裂Asn-Pro肽鍵，可期望將發現於CDR中之任何Asn-Pro組合改變為Gln-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。隨後篩選具有該等取代之抗體以確保該等取代不將抗體對CD27之親和力或特異性或其他期望生物活性降至不可接受之程度。

Fc區之抗體改造

亦可改造本文所揭示之抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)以在Fc區內包含修飾，從而通常改變抗體之一或多種性質(例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或效應物功能(例如抗原依賴性細胞毒性))。另外，可以化學方式修飾本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)(舉例而言，可將一或多個化學部分附接至抗體)或加以修飾以改變其醣基化，此同樣會改變抗體或片段之一或多種性質。該等實施例中之每一者進一步詳細闡述於下文中。Fc區中殘基之編號係Kabat之EU指數編號。

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦包含具有經修飾(或阻斷)Fc區之抗體及片段以提供改變之效應物功能。例如參見美國專利第5,624,821號；WO2003/086310；WO2005/120571；WO2006/0057702。可使用該等修飾來增強或阻抑免疫系統之各種反應，其在診斷及療法中可能具有有益效應。Fc區之改變包含胺基酸變化(取代、缺失及插入)、醣基化或去醣基化及添加多個Fc區。Fc變化亦可改變治療抗體之抗體半衰期，從而使得能夠以較小頻率投藥且由此增加材料之便利性並降低其使用。參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116：731 734-35。

在一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)係在對應於重鏈恆定區之鉸鏈區中之位置228(S228P；EU索引)之位置包括絲胺酸至脯胺酸突變的IgG4同型抗體或片段。已報導，此突變可廢除鉸鏈區中之重鏈間二硫橋之異質性(Angal等人，見上文；位置241係基於Kabat編號系統)。

在本發明之一實施例中，修飾CH1之鉸鏈區，從而增加或降低鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數。此方式進一步闡述於美國專利第5,677,425號中。改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以(例如)促進輕鏈及重鏈組裝或增加或降低抗體之穩定性。

在另一實施例中，使本發明之抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)之Fc鉸鏈區進行突變以降低抗體或片段之生物半衰期。更具體而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區域中，從而該抗體或片段具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損之葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方式進一步詳細闡述於美國專利第6,165,745號中。

在另一實施例中，對本發明之抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)進行修飾以增加其生物半衰期。多種方式係可能的。舉例而言，可引入下列突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如美國專利第6,277,375號中所闡述。或者，為增加生物半衰期，可在CH1或CL區內改變抗體以含有自IgG之Fc區中CH2結構域之兩個環獲取之補救受體結合表位，如美國專利第號5,869,046及6,121,022中所闡述。

在其他實施例中，藉由使用不同胺基酸殘基代替至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體或抗原結合片段之效應物功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基代替，從而抗體具有改變之對效應物配體之親和力且保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應物配體可為(例如)Fc受體或補體之C1組分。此方法進一步詳細闡述於美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。

在另一實例中，一或多個選自胺基酸殘基329、331及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基代替，從而抗體具有經改變之C1q結合及/或降低或消除之補體依賴性細胞毒性(CDC)。此方式進一步詳細闡述於美國專利第6,194,551號中。

在另一實例中，改變胺基酸位置231及239內之一或多個胺基酸殘基以藉此改變抗體結合補體之能力。此方式進一步闡述於PCT公開案WO 94/29351中。

在又一實例中，藉由修飾下列位置之一或多個胺基酸來對Fc區進行修飾以降低本發明之抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或降低抗體或片段對Fcγ受體之親和力之能力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。此方式進一步闡述於PCT公開案WO 00/42072中。此外，已定位人類IgG1上用於FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點且已闡述具有改良結合之變體(參見Shields等人(2001)J.Biol.Chem. 276：6591-6604)。

在本發明之一實施例中，藉由修飾殘基243及264來對Fc區進行修飾以降低本發明抗體(例如抗體131A及其人類化形式)調介效應物功能及/或增加抗發炎性性質之能力。在一實施例中，藉由將位置243及264之殘基變為丙胺酸來修飾抗體或片段之Fc區。在一實施例中，藉由修飾殘基243、264、267及328來修飾Fc區以降低抗體或片段調介效應物功能及/或增加抗發炎性性質之能力。

改變之效應物功能

在一些實施例中，對抗CD27抗體之Fc區進行修飾以增加或減小抗體或抗原結合片段調介效應物功能及/或增加/降低結合至Fcγ受體(FcγR)之能力。

本文所用之術語「效應物功能」欲指以下功能中之一或多者：抗體依賴性細胞介導之細胞毒性活性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性活性(CDC)調介之反應、Fc調介之吞噬作用或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及經由FcRn受體之抗體再循環。

據信，抗原結合蛋白之恆定區與各種Fc受體(FcR)(包含FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及FcγRIII(CD16))之間之相互作用可調介抗原結合蛋白之效應物功能(例如ADCC及CDC)。Fc受體亦對於抗體交聯較為重要，此可對於抗腫瘤免疫性較為重要。

可以諸多方式來量測效應物功能，包含(例如)經由使FcγRIII結合至天然殺手細胞或經由使FcγRI結合至單核球/巨噬球來量測ADCC效應物功能。舉例而言，可在天然殺手細胞分析中評價本發明抗原結合蛋白之ADCC效應物功能。該等分析之實例可參見Shields等人，2001 J.Biol. Chem.,Vol.276,p 6591-6604；Chappel等人，1993 J.Biol.Chem.,Vol 268,p 25124-25131；Lazar等人，2006 PNAS,103；4005-4010。

在殘基Asn297上含有特定突變或改變之醣基化之人類IgG1恆定區已展示可減小結合至Fc受體。在其他情形下，突變亦已展示會增強ADCC及CDC(Lazar等人，NAS 2006,103；4005-4010；Shields等人，J Biol Chem 2001,276；6591-6604；Nechansky等人，Mol Immunol,2007,44；1815-1817)。

在本發明之一實施例中，該等突變位於選自239、332及330(IgG1)之一或多個位置或其他IgG同型中之等效位置。適宜突變之實例係S239D及I332E及A330L。在一實施例中，本文所闡述之本發明抗原結合蛋白在位置239及332發生突變(例如S239D及I332E)或在另一實施例中其在三個或更多個選自239及332及330之位置發生突變(例如S239D及I332E及A330L)。(EU索引編號)。

在本發明之一替代實施例中，提供包括具有改變之醣基化特徵以便抗原結合蛋白具有增強之效應物功能之重鏈恆定區之抗體。舉例而言，其中抗體具有增強之ADCC或增強之CDC，或其中具有增強之ADCC及CDC效應物功能二者。產生具有改變之醣基化特徵之抗原結合蛋白之適宜方法的實例闡述於WO2003011878、WO2006014679及EP1229125中。

在另一態樣中，本發明提供「非岩藻糖基化」或「無岩藻糖基化」抗體。非岩藻糖基化抗體含有不含岩藻糖殘基之Fc之複合物型N-聚醣之三-甘露糖基核心結構。因增強之FcγRIIIa結合能力，故該等缺乏來自Fc N-聚醣之核心岩藻糖殘基之醣基改造抗體可展現強於岩藻糖基化等效物之ADCC。

本發明亦提供產生本發明抗體之方法，其包括以下步驟：a)培養包括含有如本文所闡述之經分離核酸之表現載體之重組宿主細胞，其中重組宿主細胞不包括α-1,6-岩藻糖基轉移酶；及b)回收抗原結合蛋白。重組宿主細胞通常可不含編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之基因(例如酵母宿主細胞，例如畢赤酵母屬)或可經基因修飾以鈍化α-1,6-岩藻糖基轉移酶。可利用經基因修飾以鈍化編碼α-1,6-岩藻糖基轉移酶之FUT8基因之重組宿主細胞。例如參見可自BioWa,Inc.(Princeton,N.J.)獲得之POTELLIGENT^TM技術系統，其中缺乏FUT8基因之功能拷貝之CHOK1SV細胞產生具有增強之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的單株抗體，該活性大於在具有功能FUT8基因之細胞中產生之相同單株抗體。POTELLIGENT^TM技術系統之態樣闡述於US7214775、US6946292、WO0061739及WO0231240中。熟習此項技術者亦瞭解其他適當系統。

熟習此項技術者應明瞭，該修飾可不僅單獨使用，但可彼此組合使用以進一步增強或降低效應物功能。

具有經修飾醣基化之抗體之產生

在再一實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)包括特定醣基化模式。舉例而言，可製備無岩藻糖基化或無醣基化抗體或片段(亦即，抗體分別缺乏岩藻糖或醣基化)。可改變抗體或片段之醣基化模式以(例如)增加抗體或片段對CD27抗原之親和力或親合力。該等修飾可藉由(例如)改變抗體或片段序列內之一或多個醣基化位點來達成。舉例而言，可製備一或多個胺基酸取代以去除一或多個可變區框架醣基化位點，由此消除該位點處之醣基化。該無醣基化可增加抗體或片段對抗原之親和力或親合力。例如參見美國專利第5,714,350號及第 6,350,861號。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可進一步包含在低級真核生物宿主細胞、尤其真菌宿主細胞(例如酵母及絲狀真菌)中產生者，該等細胞經基因改造以產生具有哺乳動物-或人類樣醣基化模式之醣蛋白(例如參見Choi等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.100：5022-5027；Hamilton等人(2003)Science 301：1244-1246；Hamilton等人(2006)Science 313：1441-1443；Nett等人，Yeast 28(3)：237-52(2011)；Hamilton等人，Curr Opin Biotechnol.Oct；18(5)：387-92(2007))。該等基因修飾之宿主細胞較當前所用哺乳動物細胞系之特定優點在於能夠控制在該等細胞中產生之醣蛋白之醣基化特徵，從而可產生特定N-聚醣結構佔優勢之醣蛋白組合物(例如參見美國專利第7,029,872號及美國專利第7,449,308號)。

已使用該等基因修飾之宿主細胞來產生主要具有特定N-聚醣結構之抗體(例如參見Li等人(2006)Nat.Biotechnol.24：210-215)。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)進一步包含在低級真核宿主細胞中產生且包括岩藻糖基化及非岩藻糖基化雜合及複合N-聚醣(包含二等分及多天線物質，包含(但不限於)N-聚醣，例如GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂；Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂；NANA_(1-4)Gal_(1-4)GlcNAc_(1-4)Man₃GlcNAc₂)者。

在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可包括具有至少一種選自由以下組成之群之雜合N-聚醣之抗體或片段：GlcNAcMan₅GlcNAc₂；GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂；及NANAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。在特定態樣中，雜合N-聚醣係組合物中之主要N-聚醣物質。

在特定實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)包括具有至少一種選自由以下組成之群之複合N-聚醣之抗體及片段：GlcNAcMan₃GlcNAc₂；GalGlcNAcMan₃GlcNAc₂；NANAGalGlcNAcMan₃GlcNAc₂；GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂；及NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。在特定態樣中，複合N-聚醣係組合物中之主要N-聚醣物質。在其他態樣中，複合N-聚醣係佔組合物中複合N-聚醣之約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之特定N-聚醣物質。在一實施例中，本文所提供之抗體及其抗原結合片段包括複合N-聚醣，其中至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%之複合N-聚醣包括結構NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂，其中該結構係無岩藻糖基化。該等結構可(例如)在經改造巴斯德畢赤酵母宿主細胞中產生。

在特定實施例中，N-聚醣發生岩藻糖基化。一般而言，岩藻糖在N-聚醣之還原端與GlcNAc呈α1,3-鍵聯，在N-聚醣之還原端與GlcNAc呈α1,6-鍵聯，在N-聚醣之非還原端與Gal呈α1,2-鍵聯，在N-聚醣之非還原端與GlcNac呈α1,3-鍵聯，或在N-聚醣之非還原端與GlcNAc呈α1,4-鍵聯。

因此，在上述醣蛋白組合物之特定態樣中，醣型係呈α1,3-鍵聯或α1,6-鍵聯岩藻糖以產生選自由以下組成之群之醣型：Man₅GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAcMan₅GlcNAc₂(Fuc)、Man₃GlcNAc₂(Fuc)、 GlcNAcMan₃GlcNAc₂(Fuc)、GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、GalGlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)、NANAGal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)及NANA₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂(Fuc)；呈α1,3-鍵聯或α1,4-鍵聯岩藻糖以產生選自由以下組成之群之醣型：GlcNAc(Fuc)Man₅GlcNAc₂、GlcNAc(Fuc)Man₃GlcNAc₂、GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、GalGlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂、Gal₂GlcNAc₂(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂及NANA₂Gal₂GlcNAc₂(Fuc_1-2)Man₃GlcNAc₂；或呈α1,2-鍵聯岩藻糖以產生選自由以下組成之群之醣型：Gal(Fuc)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂、NANAGal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂及NANA₂Gal₂(Fuc_1-2)GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂。

在其他態樣中，抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段包括高甘露糖N-聚醣，包含(但不限於)Man₈GlcNAc₂、Man₇GlcNAc₂、Man₆GlcNAc₂、Man₅GlcNAc₂、Man₄GlcNAc₂或由Man3GlcNAc2 N-聚醣結構組成之N-聚醣。

在上文之其他態樣中，複合N-聚醣進一步包含岩藻糖基化及非岩藻糖基化二等分及多天線物質。

如本文中所使用，術語「N-聚醣」及「醣型」可互換使用且係指N-連接寡醣，例如藉由天門冬醯胺酸-N-乙醯基葡萄糖胺鍵聯附接至多肽之天門冬醯胺酸殘基者。N-連接醣蛋白含有連接至蛋白質中之天門冬醯胺酸殘基之醯胺氮之N-乙醯基葡萄糖胺殘基。發現於醣蛋白上之主要醣係葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙醯基葡萄糖胺(GlcNAc)及唾液酸(例如N-乙醯基-神經胺酸(NANA))。在ER之管腔中以共轉譯方式處理醣基團且在高爾基體(Golgi apparatus)中繼續以轉譯後方式處理N-連接醣蛋白。

N-聚醣具有常用Man₃GlcNAc₂之五醣核心(「Man」係指甘露糖；「Glc」係指葡萄糖；且「NAc」係指N-乙醯基；GlcNAc係指N-乙醯基葡萄糖胺)。通常，N-聚醣結構在左側呈現非還原端且在右側呈現還原端。N-聚醣之還原端位於附接至在蛋白質上包括醣基化位點之Asn殘基之端。N-聚醣區別於包括添加至Man₃GlcNAc₂(「Man3」)核心結構(其亦稱為「三甘露糖核心」、「五醣核心」或「寡甘露糖核心」)之周邊醣(例如GlcNAc、半乳糖、岩藻糖及唾液酸)之支鏈(天線)數。根據支鏈組分來將N-聚醣分類(例如高甘露糖、複合物或雜合物)。「高甘露糖」類型N-聚醣具有5個或更多個甘露糖殘基。「複合物」型N-聚醣通常具有至少一個附接至「三甘露糖」核心之1,3甘露糖臂之GlcNAc及至少一個附接至1,6甘露糖臂之GlcNAc。複合N-聚醣亦可具有視情況經唾液酸或衍生物(例如「NANA」或「NeuAc」，其中「Neu」係指神經胺酸且「Ac」係指乙醯基)修飾之半乳糖(「Gal」)或N-乙醯基半乳糖胺(「GalNAc」)殘基。複合N-聚醣亦可具有包括「二等分」GlcNAc及核心岩藻糖(「Fuc」)之鏈內取代。複合N-聚醣亦可在「三甘露糖核心」上具有多個天線，通常稱為「多天線聚醣」。「雜合」N-聚醣在三甘露糖核心之1,3甘露糖臂之末端具有至少一個GlcNAc且在三甘露糖核心之1,6甘露糖臂上具有0個或更多個甘露糖。各種N-聚醣亦稱為「醣型」。

就複合N-聚醣而言，術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」之含義如下。「G-2」係指可描述為 Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G-1」係指可描述為GlcNAcMan3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G0」係指可描述為GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G1」係指可描述為GalGlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「G2」係指可描述為Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；術語「A1」係指可描述為NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構；且術語「A2」係指可描述為NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2之N-聚醣結構。除非另外指示，否則術語「G-2」、「G-1」、「G0」、「G1」、「G2」、「A1」及「A2」係指在N-聚醣之還原端缺乏附接至GlcNAc殘基之岩藻糖之N-聚醣物質。在該術語包含「F」時，「F」指示N-聚醣物質在N-聚醣之還原端於GlcNAc殘基上含有岩藻糖殘基。舉例而言，G0F、G1F、G2F、A1F及A2F皆指示，N-聚醣進一步在N-聚醣之還原端包含附接至GlcNAc殘基之岩藻糖殘基。低級真核生物(例如酵母及絲狀真菌)通常不產生可產生岩藻糖之N-聚醣。

就多天線N-聚醣而言，術語「多天線N-聚醣」係指在構成N-聚醣中1,6臂或1,3臂之非還原端之甘露糖殘基上進一步包括GlcNAc殘基或在構成N-聚醣中1,6臂及1,3臂之非還原端之每一甘露糖殘基上進一步包括GlcNAc殘基的N-聚醣。因此，可藉由式GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2、Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2或NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(2-4)Man3GlcNAc2來描述多天線N-聚醣。術語「1-4」係指1、2、3或4個殘基。

就二等分N-聚醣而言，術語「二等分N-聚醣」係指GlcNAc殘基連接至N-聚醣之還原端之甘露糖殘基之N-聚醣。可藉由式 GlcNAc3Man3GlcNAc2來描述二等分N-聚醣，其中每一甘露糖殘基在其非還原端連接至GlcNAc殘基。與之相比，在將多天線N-聚醣描述為GlcNAc3Man3GlcNAc2時，該式指示，兩個GlcNAc殘基在N-聚醣之兩個臂中之一者之非還原端連接至甘露糖殘基，且一個GlcNAc殘基在N-聚醣之另一臂之非還原端連接至甘露糖殘基。

抗體物理性質

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可另外在輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區中含有一或多個醣基化位點。該等醣基化位點可使得增加抗體或片段之免疫原性或改變抗體之pK(因改變抗原結合)(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala及Morrison(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知醣基化發生在含有N-X-S/T序列之基序處。

每一抗體或抗原結合片段(例如131A或其人類化形式)具有通常在6至9.5之pH範圍內之獨特等電點(pI)。IgG1抗體之pI通常在7-9.5之pH範圍內且IgG4抗體之pI通常在6-8之pH範圍內。

每一抗體或抗原結合片段(例如131A或其人類化形式)將具有特徵性熔融溫度，其中較高熔融溫度指示活體內較大總體穩定性(Krishnamurthy R及Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。一般而言，T_M1(初始去摺疊之溫度)可大於60℃、大於65℃或大於70℃。可使用差示掃描量熱法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性分析(Murray等人(2002)J. Chromatogr Sci 40：343-9)量測抗體或片段之熔點。

在另一實施例中，選擇不快速降解之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)。抗體或片段之降解可使用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS(Alexander AJ及Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)來量測。

在另一實施例中，選擇具有最小聚集效應之抗體(例如抗體131A及其人類化形式)及其抗原結合片段，聚集效應可使得觸發不期望免疫反應及/或改變或不利之藥物動力學性質。通常，在聚集為25%或更小、20%或更小、15%或更小、10%或更小或5%或更小時，抗體及片段可接受。聚集可藉由若干技術來量測，該等技術包含粒徑篩析管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射。

抗體偶聯物

本文所揭示之抗CD27抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可偶聯至化學部分。化學部分可尤其係聚合物、放射性核苷酸或細胞毒性因子。在特定實施例中，化學部分係增加抗體或片段在個體身體中之半衰期之聚合物。適宜聚合物包含(但不限於)親水性聚合物，其包含(但不限於)聚乙二醇(PEG)(例如分子量為2kDa、5kDa、10kDa、12kDa、20kDa、30kDa或40kDa之PEG)、右旋糖酐及單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。Lee等人(1999)(Bioconj.Chem.10：973-981)揭示PEG偶聯之單鏈抗體。Wen等人(2001)(Bioconj.Chem.12：545-553)揭示具有附接至放射性金屬螯合劑(二乙烯三胺五乙酸(DTPA))之PEG之偶聯抗體。

本文所揭示之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可與諸如以下等標記偶聯：⁹⁹Tc、⁹⁰Y、¹¹¹In、³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、 ¹³¹I、¹¹C、¹⁵O、¹³N、¹⁸F、³⁵S、⁵¹Cr、⁵⁷To、²²⁶Ra、⁶⁰Co、⁵⁹Fe、⁵⁷Se、¹⁵²Eu、⁶⁷CU、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pd、²³⁴Th及⁴⁰K、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、⁵²Tr及⁵⁶Fe。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可經聚乙二醇化以(例如)增加其生物(例如血清)半衰期。為對抗體或片段實施聚乙二醇化，通常在一或多個PEG基團變得附接至抗體或抗體片段之條件下，使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)之反應性形式(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)進行反應。在特定實施例中，聚乙二醇化係藉由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文中所使用，術語「聚乙二醇」意欲涵蓋PEG之已用於衍生其他蛋白質之任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，擬聚乙二醇化之抗體或片段係無醣基化抗體或片段。聚乙二醇化蛋白質之方法為業內已知且可適用於本發明抗體。例如參見EP 0 154 316及EP 0 401 384。

本文所揭示之抗體及抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可與螢光或化學發光標記偶聯，包含螢光團(例如稀土螯合物)、螢光黃及其衍生物、玫瑰紅及其衍生物、異硫氰酸酯、藻紅素、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰-苯二甲醛、螢哢明、¹⁵²Eu、丹磺醯基、傘形酮、螢光素、魯米那標記(luminal label)、異魯米那標記、芳香族吖啶酯標記、咪唑標記、吖啶鹽標記、草酸酯標記、水母素標記、2,3-二氫酞嗪二酮、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記及穩定自由基。

本發明之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可偶聯至細胞毒性因子，例如白喉毒素(diptheria toxin)、銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)外毒素A鏈、蓖麻毒蛋白A鏈、相思子素A鏈、莫迪素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白質及化合物(例如脂肪酸)、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytoiacca americana)蛋白PAPI、PAPII及PAP-S、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素及伊諾黴素(enomycin)。

可採用業內已知將本發明之抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)偶聯至各種部分之任一方法，包含由以下文獻所闡述之方法：Hunter等人(1962)Nature 144：945；David等人(1974)Biochemistry 13：1014；Pain等人(1981)J.Immunol.Meth.40：219；及Nygren,J.,(1982)Histochem.and Cytochem.30：407。偶聯抗體及片段之方法已係習知且在業內已眾所周知。

抗CD27抗體之治療用途

另外，提供治療需要使用本文所揭示之經分離抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)治療個體(包含人類個體)之方法。在本發明之一實施例中，該等個體患有感染或感染性疾病。本發明亦提供用於治療癌症或治療感染或感染性疾病之本發明之抗體或抗原結合片段。本發明亦提供本發明之抗體或抗原結合片段之用途，其用以製造用於增加免疫細胞活化、治療癌症或治療感染或感染性疾病之藥劑。

在本發明之另一實施例中，該個體患有癌症。在一實施例中，癌症係(例如)骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、神經母細胞瘤、腎癌、白血病、腎移行細胞癌症、膀胱癌、維爾姆斯氏癌(Wilm’s cancer)、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌(例如非小細胞肺癌)、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、多發性骨髓瘤、腎細胞癌、視網膜母細胞瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、黑色素瘤、腎之橫紋肌樣腫瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、軟骨肉瘤、腦癌、神經膠母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始神經外胚層瘤、髓母細胞瘤、星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭瘤、真性多血症、血小板增多、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、子宮內膜癌症、類癌或肝癌、乳癌或胃癌。在本發明之一實施例中，癌症係轉移性癌症，例如上述種類之轉移性癌症。

可藉由本發明之抗體或抗原結合片段、組合物及方法治療之癌症包含(但不限於)：心臟癌：肉瘤(血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤)、黏液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤及畸胎瘤；肺癌：支氣管癌(鱗狀細胞癌、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、腺癌)、肺泡(支氣管)癌、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨錯構瘤、間皮瘤；胃腸道癌：食管癌(鱗狀細胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃癌(癌瘤、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰臟癌(導管腺癌、胰島素瘤、升糖素瘤、胃泌素瘤、類癌腫瘤、胰腺瘤)、小腸癌(腺癌、淋巴瘤、類癌腫瘤、卡波西氏肉瘤(Karposi's sarcoma)、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經纖維瘤、纖維瘤)、大腸癌(腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯構瘤、平滑肌瘤)、結腸直腸癌；泌尿生殖道癌：腎癌(腺癌、維爾姆斯氏腫瘤[腎母細胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱及尿道癌(鱗狀細胞癌、移行細胞癌、腺癌)、前列腺癌(腺癌、肉瘤)、睪丸癌(精原細胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、間質性細胞癌、纖維瘤、纖維腺瘤、類腺瘤腫瘤、脂肪瘤)；肝癌：肝細胞瘤(肝細胞癌)、膽管癌、肝母細胞瘤、血管肉瘤、肝細胞腺瘤、血管瘤；骨癌：成骨肉瘤(骨肉瘤)、纖維肉瘤、惡性纖維性組織細胞瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性淋巴瘤(網狀細胞肉瘤)、多發性骨髓瘤、惡性巨細胞腫瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤(骨軟骨性外生骨疣)、良性軟骨瘤、軟骨母細胞瘤、軟骨黏液樣纖維瘤、骨樣骨瘤及巨細胞腫瘤；神經系統癌：顱骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、變形性骨炎)、腦膜癌(腦膜瘤、腦脊膜肉瘤、神經膠質過多)、腦癌(星形細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質瘤、室管膜瘤、生殖細胞瘤[松果體瘤]、多形性神經膠母細胞瘤、少突神經膠質瘤、許旺氏細胞瘤(schwannoma)、視網膜母細胞瘤、先天腫瘤)、骨髓神經纖維瘤、腦膜瘤、神經膠質瘤、肉瘤)；婦科癌：子宮癌(子宮內膜癌)、子宮頸癌(子宮頸癌瘤、腫瘤前期子宮頸發育不良)、卵巢癌(卵巢癌瘤[漿液囊腺癌、黏液囊腺癌、未分類癌]、粒層泡膜細胞腫瘤、塞托利-雷丁氏細胞腫瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、無性細胞瘤、惡性畸胎瘤)、外陰癌(鱗狀細胞癌、上皮內癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤)、陰道癌(透明細胞癌、鱗狀細胞癌、葡萄形肉瘤(胚胎型橫紋肌肉瘤)、輸卵管(癌)、乳癌；血液學癌：血液癌(骨髓樣白血病[急性及慢性]、急性淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴球性白血病、骨髓增殖性疾病、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群)、何傑金氏病(Hodgkin's disease)、非何傑金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’s lymphoma)[惡性淋巴瘤]；皮膚癌：惡性黑色素瘤、基底細胞癌、鱗狀細胞癌、卡波西氏肉瘤、痣(發育異常痣)、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、疤痕疙瘩、牛皮癬及腎上腺癌：神經母細胞瘤。因此，本文所提供之術語「癌性細胞」包含由上文所鑑別病狀中之任一者影響之細胞。

在一實施例中，可由本文所揭示之抗體或其抗原結合片段、本發明之組合物及方法治療之癌症包含(但不限於)：肺癌、胰臟癌、結腸癌、結腸直腸癌、骨髓樣白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓單核細胞性白血病、甲狀腺癌、骨髓發育不良症候群、膀胱癌、表皮癌、黑色素瘤、乳癌、前列腺癌、頭頸癌、卵巢癌、腦癌、間質源癌、肉瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤、腎癌、肝細胞瘤、非何傑金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤及間變性甲狀腺癌。

在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)治療個體之方法，其中該個體患有病毒感染。在一實施例中，病毒感染係選自由以下組成之群之病毒之感染：人類免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎病毒(A、B或C型)、皰疹病毒(例如VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流行性感冒病毒、蟲媒病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯薩奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或蟲媒病毒腦炎病毒。

在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段治療個體之方法，其中該個體患有細菌感染。在一實施例中，細菌感染感染選自由以下組成之群之細菌：披衣菌屬(Chlamydia)、立克次體菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克雷伯菌(klebsiella)、變形桿菌(proteus)、沙雷氏菌屬(serratia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、軍團菌屬(Legionella)、白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheriae)、沙門桿菌屬(Salmonella)、桿菌(bacilli)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、破傷風梭菌(Clostridium tetan)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、炭疽桿菌(Bacillus anthricis)、鼠疫耶爾辛氏菌(Yersinia pestis)、麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、瀰漫型麻瘋分枝桿菌(Mycobacterium lepromatosis)及柏麗拉菌(Borriella)。

在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段治療個體之方法，其中該個體患有真菌感染。在一實施例中，真菌感染係選擇由以下組成之群之真菌之感染：假絲酵母(Candida)(白酵母(albicans)、克柔酵母(krusei)、光滑酵母(glabrata)、熱帶酵母(tropicalis)等)、新隱球菌(Cryptococcus neoformans)、曲黴菌(煙麯黴(fumigatus)、黑麯黴(niger)等)、毛黴(Mucorales)屬(毛黴(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴(rhizopus))、申克氏孢子菌絲(Sporothrix schenckii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、厭酷球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)。

在一實施例中，本發明提供使用本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段治療個體之方法，其中該個體患有寄生蟲感染。在一實施例中，寄生蟲感染係選自由以下組成之群之寄生蟲之感染：溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸絨毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡原蟲(Naegleria fowleri)、棘狀變形蟲(Acanthamoeba)、蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)、卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、小鼠焦蟲 (Babesia microti)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓蟲(Toxoplasma gondii)及巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。

「個體」可為哺乳動物，例如人類、狗、貓、馬、牛、小鼠、大鼠、猴(例如食蟹猴，例如長尾猴)或兔。在本發明之較佳實施例中，個體係人類個體。

術語「聯合」指示，可將在本發明方法中投與之組分(例如抗CD27抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)以及抗癌劑調配成單一組合物以用於同時遞送或分開調配成兩種或更多種組合物(例如套組)。每一組分可在不同於在投與另一組分時之時間投與個體；舉例而言，可以若干間隔在給定時間段內非同時(例如分開或依序)給予每一投與。此外，可藉由相同途徑或藉由不同途徑將分開組分投與個體。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)可單獨或聯合其他治療劑及/或治療程序來使用以用於治療或預防需要治療或預防之個體之任一疾病(例如癌症，例如如本文所論述者)。組合物(例如包括醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物，包括該等抗體及片段以及其他治療劑)亦係本發明之一部分。

因此，本發明提供治療人類個體之癌症之方法，其包括向個體投與有效量之本文所揭示之抗體或抗原結合片段以及視情況其他治療劑或治療程序。本發明亦提供治療人類個體之感染或感染性疾病之方法，其包括向個體投與有效量之本文所揭示之抗體或抗原結合片段以及視情況其他治療劑或治療程序。本發明亦提供增加免疫細胞之活性之方法，其包括向有需要之個體投與有效量之本文所揭示之抗體或抗原結合片段。在一實施例中，該方法係用於：治療癌症；治療感染或感染性疾病；或作為疫苗佐劑。在另一實施例中，本發明提供本發明之抗體或抗原結合片段，其用於與另一治療劑組合：治療癌症；增加免疫細胞之活性；或治療感染或感染性疾病。在另一實施例中，本發明提供本發明之抗體或抗原結合片段之用途，其用以製造與另一治療劑組合用於增加免疫細胞活化、治療癌症或治療感染或感染性疾病之藥劑。在另一實施例中，本發明提本發明之抗體或抗原結合片段與另一治療劑供之組合，其用於治療癌症；增加免疫細胞之活性；或治療感染或感染性疾病。

在其他實施例中，本發明提供治療人類個體之癌症或治療其感染或感染性疾病之方法，其包括向個體投與有效量之本發明之抗體或抗原結合片段或本發明之表現載體或宿主細胞以及視情況另一治療劑或治療程序。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可單獨或聯合腫瘤疫苗使用。腫瘤疫苗之實例包含(但不限於)用於人類乳頭瘤病毒(HPV)感染引起之癌症之疫苗，例如Gardasil^®、Gardasil^®及Cervarix^®；預防B型肝炎病毒引起之肝癌之疫苗，例如Engerix-B^®及Recombivax HB^®；觸發免疫反應之溶瘤病毒療法，例如Imlygic^®；DNA疫苗，例如Synchotrope MA2M質體DNA疫苗及ZYC101；乳腺珠蛋白-a DNA疫苗(參見Clinical Cancer Res.2014 20(23)：5964-75)；基於載體之疫苗，例如PSA-TRICOM(普羅塔克(prostvac))、PANVAC-VF；基於單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)之PSA疫苗(參見Therapeutic Advances in Vaccines,2014,2(5)137-148)、間皮素李斯特菌(Listeria-mesothelin)Adeno- CEA；異基因疫苗，例如GVAX、BLP-25(抗Ankara-黏蛋白1)、Belagenpumatucel-L、TG4010、CIMAvax表皮生長因子疫苗、NY-ESO、GM.CD40L-CCL21；自體疫苗，例如：Adeno-CD40L、BCG、INGN-225；樹突狀細胞疫苗，例如Provenge^®(Sipuleucel-T)、rF-CEA-MUC1-TRICOM(panvac-DC)；抗原疫苗，例如MUC-1(史迪瓦克(stimuvax))、NY-ESO-1、GP-100、MAGE-A3(編碼基因A3之黑色素瘤抗原)、INGN-225(參見Pharmacology & Therapeutics 153(2015)1-9)。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可單獨或聯合化學治療劑使用。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可單獨或聯合輻射療法使用。

在特定實施例中，本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可單獨或聯合靶向療法使用。靶向療法之實例包含：激素療法、信號轉導抑制劑(例如EGFR抑制劑，例如西妥昔單抗(cetuximab)(Erbitux)及埃羅替尼(erlotinib)(Tarceva))；HER2抑制劑(例如曲妥珠單抗(trastuzumab)(Herceptin)及帕妥珠單抗(pertuzumab)(Perjeta))；BCR-ABL抑制劑(例如伊馬替尼(imatinib)(Gleevec)及達沙替尼(dasatinib)(Sprycel))；ALK抑制劑(例如克裡唑蒂尼(crizotinib)(Xalkori)及塞瑞替尼(ceritinib)(Zykadia))；BRAF抑制劑(例如威羅菲尼(vemurafenib)(Zelboraf)及達拉非尼(dabrafenib)(Tafinlar))、基因表現調節劑、細胞凋亡誘導劑(例如硼替佐米(bortezomib)(Velcade)及卡夫佐米(carfilzomib)(Kyprolis))、血管生成抑制劑(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)(Avastin)及雷莫蘆單抗(ramucirumab)(Cyramza)、附接至毒素之單株抗體(例如貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)(Adcetris)及阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla))。

在特定實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可與抗癌治療劑或免疫調節藥物(例如免疫調節受體抑制劑，例如特異性結合至受體之抗體或其抗原結合片段)組合使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)係聯合以下中之一或多者來使用：抗PD1抗體、抗PDL1抗體、抗TIGIT抗體、抗CTLA4抗體、抗CS1抗體(例如埃羅妥珠單抗(elotuzumab))、抗KIR2DL1/2/3抗體(例如利麗魯單抗(lirilumab))、抗CD137抗體(例如烏瑞魯單抗(urelumab))、抗GITR抗體(例如TRX518)、抗PD1抗體(例如派姆單抗、納武單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab)(CT-011))、抗PD-L1抗體(例如BMS-936559、德瓦魯單抗(durvalumab)、MSB0010718C或MPDL3280A)、抗PD-L2抗體、抗ILT1抗體、抗ILT2抗體、抗ILT3抗體、抗ILT4抗體、抗ILT5抗體、抗ILT6抗體、抗ILT7抗體、抗ILT8抗體、抗CD40抗體、抗OX40抗體、抗ICOS、抗SIRPα、抗KIR2DL1抗體、抗KIR2DL2/3抗體、抗KIR2DL4抗體、抗KIR2DL5A抗體、抗KIR2DL5B抗體、抗KIR3DL1抗體、抗KIR3DL2抗體、抗KIR3DL3抗體、抗NKG2A抗體、抗NKG2C抗體、抗NKG2E抗體、抗4-1BB抗體(例如PF-05082566)、抗TSLP抗體、抗IL-10抗體、IL-10或聚乙二醇化IL-10或該等靶之任一小有機分子抑制劑。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗PD1抗體(例如派姆單抗、納武單抗、匹利珠單抗(CT-011))來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗PDL1抗體(例如BMS-936559、德瓦魯單抗、MSB0010718C或MPDL3280A)來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗CTLA4抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗CS1抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL1/2/3抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗CD137(例如烏瑞魯單抗)抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗GITR(例如TRX518)抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗PD-L2抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL1抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL2抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段 (例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL3抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL4抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL5抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL6抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL7抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ITL8抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗CD40抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗OX40抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL1抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL2/3抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL4抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL5A抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR2DL5B抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR3DL1抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR3DL2抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗KIR3DL3抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗NKG2A抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗NKG2C抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗ICOS抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗SIRPα抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗4-1BB抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗IL-10抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合抗TSLP抗體來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段 (例如抗體131A或其人類化形式)係聯合IL-10或聚乙二醇化IL-10來使用。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合一或多種諸如以下等抑制劑(例如小有機分子或抗體或其抗原結合片段)來使用：MTOR(雷帕黴素(rapamycin)之哺乳動物靶)抑制劑、細胞毒性劑、鉑藥劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、微管穩定劑、紫杉烷(taxane)、CD20抑制劑、CD52抑制劑、CD30抑制劑、RANK(核因子κ-B之受體活化劑)抑制劑、STING激動劑、CXCR2拮抗劑、RANKL(核因子κ-B配體之受體活化劑)抑制劑、ERK抑制劑、MAP激酶抑制劑、AKT抑制劑、MEK抑制劑、PARP抑制劑、PI3K抑制劑、HER1抑制劑、HER2抑制劑、HER3抑制劑、HER4抑制劑、Bcl2抑制劑、CD22抑制劑、CD79b抑制劑、ErbB2抑制劑或法呢基蛋白轉移酶抑制劑。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合以下中之任一者或多者來使用：13-順式-視黃酸、3-[5-(甲基磺醯基六氫吡啶甲基)-吲哚基]-喹啉酮、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、5-去氧尿苷、5'-去氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、6-巰基嘌呤、7-羥基星狀孢菌素、A-443654、乙酸阿比特龍(abirateroneacetate)、abraxane、ABT-578、阿考比芬(acolbifene)、ADS-100380、ALT-110、六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、胺魯米特(aminoglutethimide)、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)、血管抑素(angiostatin)、AP-23573、ARQ-197、阿左昔芬(arzoxifene)、AS-252424、AS-605240、天門冬醯胺酸酶、AT-9263、阿曲生坦 (atrasentan)、阿西替尼(axitinib)、AZD1152、卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)疫苗、巴他布林(batabulin)、BC-210、比索杜克(besodutox)、貝伐珠單抗、比卡魯胺(bicalutamide)、Bio111、BIO140、博來黴素(bleomycin)、BMS-214662、BMS-247550、BMS-275291、BMS-310705、硼替佐米(bortezimib)、布舍瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、骨化三醇(calcitriol)、喜樹鹼(camptothecin)、卡奈替尼(canertinib)、卡培他濱(capecitabine)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、CC8490、西地尼布(Cediranib)、CG-1521、CG-781、克來米多辛(chlamydocin)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、氯黴素(chlorotoxin)、西侖吉肽(cilengitide)、，西米替丁(cimitidine)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯膦酸(clodronate)、COL-3、CP-724714、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環丙孕酮(cyproterone)、乙酸環丙孕酮(cyproteroneacetate)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿糖核苷(cytosinearabinoside)、達卡巴嗪(dacarbazine)、達諾司他(dacinostat)、更生黴素(dactinomycin)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、達努塞替(danusertib)、達沙替尼(dasatanib)、柔紅黴素(daunorubicin)、地卡塔尼(decatanib)、魚藤素(deguelin)、地尼白介素(denileukin)、去氧助間型黴素(deoxycoformycin)、縮酚酸肽(depsipeptide)、二芳基丙腈、二乙基己烯雌酚(diexylstilbestrol)、地非多克(diftitox)、多西他賽(docetaxel)、多韋替尼(dovitinib)、多柔比星(doxorubicin)、屈洛昔芬(droloxifene)、依多卡琳(edotecarin)、釔-90標記之依多曲肽(edotreotide)、依多曲肽、EKB-569、EMD121974、內皮抑素、恩雜魯胺(enzalutamide)、恩紮妥林(enzastaurin)、表柔比星(epirubicin)、艾比斯隆(epithilone B)、ERA- 923、Erbitux、埃羅替尼、雌二醇(estradiol)、雌氮芥(estramustine)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非那雄胺(finasteride)、夫拉平度(flavopiridol)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟氫可的松(fludrocortisone)、氟甲睪酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、FOLFOX方案、氟維司群(Fulvestrant)、紮來泰隆(galeterone)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉馬替康(gimatecan)、戈舍瑞林(goserelin)、乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、棉籽酚(gossypol)、GSK461364、GSK690693、HMR-3339、己酸羥孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、羥基脲(hydroxyurea)、IC87114、伊達比星(Idarubicin)、依多芬(idoxyfene)、異環磷醯胺(ifosfamide)、IM862、伊馬替尼、IMC-1C11、INCB24360、INO1001、干擾素、介白素-12、伊匹單抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、JNJ-16241199、酮康唑(ketoconazole)、KRX-0402、拉帕替尼(lapatinib)、拉索昔芬(lasofoxifene)、來曲唑(letrozole)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、柳培林(leuprolide)、乙酸柳培林(leuprolide acetate)、左旋咪唑(levamisole)、脂質體包埋之太平洋紫杉醇(paclitaxel)、洛莫司汀(lomustine)、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽酮(lucanthone)、LY292223、LY292696、LY293646、LY293684、LY294002、LY317615、馬立馬司他(marimastat)、甲基二氯乙基胺(mechlorethamine)、乙酸甲羥助孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、乙酸甲地孕酮(megestrolacetate)、美法侖(melphalan)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、胺甲喋呤(methotrexate)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、陶紮色替(tozasertib)、MLN8054、新伐司他(neovastat)、奈拉替尼(Neratinib)、奈拉達布(neuradiab)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯米德(nilutimide)、諾拉曲塞(nolatrexed)、NVP-BEZ235、奧利默森(oblimersen)、奧曲肽(octreotide)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉帕尼(olaparib)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧特羅那(orteronel)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、太平洋紫杉醇、帕博西尼(palbociclib)、帕米膦酸(pamidronate)、帕尼單抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、PD0325901、PD184352、PEG-干擾素、培美曲塞(pemetrexed)、噴司他汀(pentostatin)、哌立福辛(perifosine)、苯丙胺酸芥菜(phenylalaninemustard)、PI-103、匹克昔布(pictilisib)、PIK-75、哌噴昔芬(pipendoxifene)、PKI-166、普卡黴素(plicamycin)、卟菲爾鈉(porfimer)、普賴松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、助孕素(progestins)、PX-866、R-763、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷佐生(razoxin)、利達羅莫司(ridaforolimus)、利妥昔單抗(rituximab)、羅米地辛(romidepsin)、RTA744、盧比替康(rubitecan)、斯瑞泰德(scriptaid)、Sdx102、塞利西裡(seliciclib)、司美替尼(selumetinib)、西馬夏尼(semaxanib)、SF1126、西羅莫司(sirolimus)、SN36093、索拉菲尼(sorafenib)、螺內酯(spironolactone)、角鯊胺(squalamine)、SR13668、鏈脲黴素(streptozocin)、SU6668、辛二醯苯胺異羥肟酸(suberoylanalide hydroxamic acid)、舒尼替尼(sunitinib)、合成雌激素、他侖帕奈(talampanel)、塔裡莫拉維克病毒(talimogene laherparepvec)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、替西羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、替米利芬(tesmilifene)、睪固酮(testosterone)、粉防己鹼(tetrandrine)、TGX-221、沙利竇邁(thalidomide)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、噻替派(thiotepa)、替西木單抗(ticilimumab)、替吡法尼(tipifarnib)、替肟紮尼(tivozanib)、TKI-258、TLK286、托泊替康(topotecan)、檸檬酸托瑞米芬(toremifene citrate)、曲貝替定(trabectedin)、曲妥珠單抗、維甲酸(tretinoin)、曲古抑菌素A(trichostatin A)、單水合磷酸曲西瑞賓(triciribinephosphatemonohydrate)、雙羥萘酸曲普瑞林(triptorelin pamoate)、TSE-424、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、丙戊酸(valproic acid)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、VEGF trap、長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine)、維他辛(vitaxin)、維特斯潘(vitespan)、伏立諾他(Vorinostat)、VX-745、渥曼青黴素(wortmannin)、Xr311、紮木單抗(zanolimumab)、ZK186619、ZK-304709、ZM336372、ZSTK474。

擬與本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段組合使用之適宜抗癌劑之非限制性實例包含針對癌症及贅瘤性疾病之細胞生長抑制劑、細胞毒性劑、靶向治療劑(小分子、生物試劑、siRNA及微RNA)，

1)抗代謝物(例如胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、吉西他濱、氟達拉濱、卡培他濱)；

2)烷基化劑，例如替莫唑胺、環磷醯胺，

3)DNA相互作用及DNA損害劑，例如順鉑、奧沙利鉑、多柔比星，

4)離子化輻照，例如輻射療法，

5)拓撲異構酶II抑制劑，例如依託泊苷、多柔比星，

6)拓撲異構酶I抑制劑，例如伊立替康、托泊替康，

7)微管蛋白相互作用劑，例如太平洋紫杉醇、多西他賽、Abraxane、埃博黴素(epothilone)，

8)紡錘體驅動蛋白抑制劑，

9)紡錘體檢查點抑制劑，

10)聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑，例如奧拉帕尼、尼拉帕尼(niraparib)及維利帕尼(veliparib)

11)基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑

12)蛋白酶抑制劑，例如細胞自溶酶D及細胞自溶酶K抑制劑

13)蛋白體或泛素化抑制劑，例如硼替佐米，

14)恢復野生型p53活性之突變體p53抑制劑

15)腺病毒-p53

16)Bcl-2抑制劑，例如ABT-263

17)熱激蛋白(HSP)調節劑，例如格爾德黴素(geldanamycin)及17-AAG

18)組織蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑，例如伏立諾他(SAHA)，

19)性激素調節劑，

a.抗雌激素，例如他莫昔芬、氟維司群，

b.選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，例如雷洛昔芬，

c.抗雄激素，例如比卡魯胺、氟他胺

d.LHRH激動劑，例如柳培林，

e.5α-還原酶抑制劑，例如非那雄胺，

f.細胞色素P450 C17裂解酶(CYP450c17，亦稱為17αC)；

g.芳香酶抑制劑，例如來曲唑、阿那曲唑、依西美坦，

20)EGFR激酶抑制劑，例如吉非替尼、埃羅替尼、拉帕替尼

21)雙重erbB1及erbB2抑制劑，例如拉帕替尼

22)多靶向激酶(絲胺酸/蘇胺酸及/或酪胺酸激酶)抑制劑，

a.ABL激酶抑制劑：伊馬替尼及尼羅替尼、達沙替尼

b.VEGFR-1、VEGFR-2、PDGFR、KDR、FLT、c-Kit、Tie2、Raf、MEK及ERK抑制劑，例如舒尼替尼、索拉菲尼、凡德他尼、帕唑帕尼、PLX-4032、阿西替尼、PTK787、GSK-1120212

c.Polo樣激酶抑制劑

d.極光激酶抑制劑

e.JAK抑制劑

f.c-MET激酶抑制劑

g.PI3K及mTOR抑制劑，例如GDC-0941、BEZ-235、BKM-120及AZD-8055

h.雷帕黴素及其類似物，例如替西羅莫司、依維莫司及地弗莫司(deforolimus)

i.STING(干擾素基因刺激劑)激動劑

j.CXCR(CXC趨化介素受體)抑制劑、CXCR2拮抗劑

23)及其他抗癌(亦稱為抗腫瘤)劑包含(但不限於)ara-C、阿德力黴素(adriamycin)、癌得星(cytoxan)、卡鉑、尿嘧啶氮芥、氮芥(Clormethine)、異環磷醯胺、美法侖、氮芥苯丁酸、哌泊溴烷(Pipobroman)、三乙烯三聚氰胺、三乙烯硫代磷胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈脲黴素、達卡巴嗪、氟尿苷、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、噴司他汀、長春鹼、長春新鹼、長春地辛、長春瑞濱、溫諾平(Navelbine)、博來黴素、更生黴素、柔紅黴素、多柔比星、表柔比星、替尼泊苷、阿糖胞苷、培美曲塞、伊達比星、光輝黴素、去氧助間型黴素、絲裂黴素-C、L-天門冬醯胺酸酶、替尼泊苷、乙炔雌二醇(Ethinylestradiol)、二乙基己烯雌酚、睪固酮、普賴松、氟甲睪酮、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(testolactone)，乙酸甲地孕酮、甲基普賴蘇濃(Methylprednisolone)、甲基睪固酮(Methyltestosterone)、普賴蘇濃(prednisolone)、曲安奈德(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羥助孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特、雌氮芥、氟他胺、乙酸甲羥助孕酮，托瑞米芬(Toremifene)、戈舍瑞林、卡鉑、羥基脲、安吖啶、丙卡巴肼米、托坦、米托蒽醌、左旋咪唑、多洛薩芬(Drolloxafine)、六甲基三聚氰胺(Hexamethylmelamine)、Bexxar、Zevalin、(Trisenox)、卟菲爾鈉、噻替派、六甲蜜胺、Doxil、Ontak、Depocyt、Aranesp、Neupogen、Neulasta、Kepivance。

24)法呢基蛋白轉移酶抑制劑，例如SARASAR^TM(4-[2-[4-[(11R)-3,10-二溴-8-氯-6,11-二氫-5H-苯并[5,6]環庚[1,2-b]吡啶-11-基-]-1-六氫吡啶基]-2-側氧基乙基]-六氫吡啶甲醯胺、替吡法尼

25)干擾素，例如Intron A、Peg-Intron，

26)抗erbB1抗體，例如西妥昔單抗、帕尼單抗，

27)抗erbB2抗體，例如曲妥珠單抗，

28)抗CD52抗體，例如阿倫單抗(Alemtuzumab)，

29)抗CD20抗體，例如利妥昔單抗

30)抗CD33抗體，例如吉妥珠單抗-奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)

31)抗VEGF抗體，例如Avastin，

32)TRIAL配體，例如來沙木單抗(Lexatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)及AMG-655

33)抗CTLA-4抗體，例如伊匹單抗

34)針對CTA1、CEA、CD5、CD19、CD22、CD30、CD44、CD44V6、CD55、CD56、EpCAM、FAP、MHCII、HGF、IL-6、MUC1、PSMA、TAL6、TAG-72、TRAILR、VEGFR、IGF-2、FGF之抗體，

35)抗IGF-1R抗體，例如達洛珠單抗(MK-0646)及羅妥木單抗(robatumumab)(SCH 717454)。

「雌激素受體調節劑」係指干擾或抑制雌激素結合至受體(不論機制如何)之化合物。雌激素受體調節劑之實例包含(但不限於)他莫昔芬、雷洛昔芬、艾多昔芬(idoxifene)、LY353381、LY117081、托瑞米芬、氟維司群、丙酸4-[7-(2,2-二甲基-1-側氧基丙氧基-4-甲基-2-[4-[2-(1-六氫吡啶基)乙氧基]苯基]-2H-1-苯并吡喃-3-基]-苯基-2,2-二甲基酯、4,4’-二羥基二苯甲酮-2,4-二硝基苯基-腙及SH646。

「雄激素受體調節劑」係指干擾或抑制雄激素結合至受體(不論機制如何)之化合物。雄激素受體調節劑之實例包含非那雄胺及其他5α-還原酶抑制劑、尼魯米特(nilutamide)、氟他胺、比卡魯胺、利阿唑(liarozole)及乙酸阿比特龍(abiraterone acetate)。

「類視色素受體調節劑」係指干擾或抑制類視色素結合至受體(不論機制如何)之化合物。該等類視色素受體調節劑之實例包含貝沙羅汀(bexarotene)、維甲酸、13-順式-視黃酸、9-順式-視黃酸、α-二氟甲基鳥胺酸、ILX23-7553、反式-N-(4’-羥基苯基)視黃醯胺及N-4-羧基苯基視黃醯胺。

「細胞毒性/細胞生長抑制劑」係指主要藉由直接干擾細胞功能或抑制或干擾細胞收縮來引起細胞死亡或抑制細胞增殖之化合物，包含烷基化劑、腫瘤壞死因子、嵌入劑、低氧可活化化合物、微管抑制劑/微管穩定劑、有絲分裂驅動蛋白之抑制劑、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、涉及有絲分裂進展之激酶之抑制劑、涉及生長因子及細胞介素信號轉導路徑之激酶之抑制劑、抗代謝物、生物反應改良劑、激素/抗激素治療劑、造血生長因子、單株抗體靶向治療劑、拓撲異構酶抑制劑、蛋白體抑制劑、泛素連接酶抑制劑及極光激酶抑制劑。

細胞毒性/細胞生長抑制劑之實例包含(但不限於)鉑配位化合物、色替納弗(sertenef)、惡病質素(cachectin)、異環磷醯胺、他索那敏(tasonermin)、氯尼達明(lonidamine)、卡鉑、六甲蜜胺、潑尼氮芥(prednimustine)、二溴衛矛醇(dibromodulcitol)、雷莫司汀(ranimustine)、福莫司汀(fotemustine)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑、替莫唑胺、庚鉑(heptaplatin)、雌氮芥、甲苯磺酸英丙舒凡(improsulfan tosilate)、曲磷胺(trofosfamide)、尼莫司汀(nimustine)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、嘌嘧替派(pumitepa)、樂鉑(lobaplatin)、沙鉑(satraplatin)、甲基絲裂黴素(profiromycin)、順鉑、伊羅夫文(irofulven)、右異環磷醯胺(dexifosfamide)、順式-胺二氯(2-甲基-吡啶) 鉑、苄基鳥嘌呤、葡磷醯胺(glufosfamide)、GPX100、四氯化(反式，反式，反式)-雙-μ-(己烷-1,6-二胺)-μ-[二胺-鉑(II)]雙[二胺(氯)鉑(II)]、二氮丙啶基精胺(diarizidinylspermine)、三氧化砷、1-(11-十二烷基胺基-10-羥基十一烷基)-3,7-二甲基黃嘌呤、佐柔比星(zorubicin)、伊達比星、柔紅黴素、比生群(bisantrene)、米托蒽醌、吡柔比星(pirarubicin)、吡萘非特(pinafide)、戊柔比星、胺柔比星、抗瘤酮(antineoplaston)、3’-去胺基-3’-嗎啉基-13-去側氧基-10-羥基洋紅黴素、脂質體蒽環黴素(annamycin)、加蘭柔比星(galarubicin)、依利奈法德(elinafide)、MEN10755、4-去甲氧基-3-去胺基-3-氮丙啶基-4-甲基磺醯基-柔紅黴素(參見WO 00/50032)。

低氧可活化化合物之一實例係替拉紮明(tirapazamine)。

蛋白體抑制劑之實例包含(但不限於)乳胞素(lactacystin)及MLN-341(Velcade)。

微管抑制劑/微管穩定劑之實例通常包含紫杉烷。具體化合物包含太平洋紫杉醇(Taxol^®)、硫酸鹽長春地辛(vindesine sulfate)、3’,4’-二去氫-4’-去氧-8’-去甲長春鹼、多西紫杉醇(docetaxol)(Taxotere^®)、利索新(rhizoxin)、多拉斯他汀(dolastatin)、羥乙基磺酸米伏布林(mivobulin isethionate)、奧裡斯他汀(auristatin)、西馬多丁(cemadotin)、RPR109881、BMS184476、長春氟寧(vinflunine)、念珠藻素(cryptophycin)、2,3,4,5,6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基)苯磺醯胺、脫水長春鹼(anhydrovinblastine)、N,N-二甲基-L-纈胺醯基-L-纈胺醯基-N-甲基-L-纈胺醯基-L-脯胺醯基-L-脯胺酸-第三丁基醯胺(SEQ ID NO：68)、TDX258、埃博黴素(例如參見美國專利第6,284,781號及第6,288,237號) 及BMS188797。

拓撲異構酶抑制劑之一些實例係托泊替康、海卡他胺(hycaptamine)、伊立替康、盧比替康、6-乙氧基丙醯基-3’,4’-O-外-亞苄基-教酒菌素、9-甲氧基-N,N-二甲基-5-硝基吡唑并[3,4,5-kl]吖啶-2-(6H)丙胺、1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3’,4’：b,7]-吲嗪并[1,2b]喹啉-10,13(9H,15H)二酮、勒托替康(lurtotecan)、7-[2-(N-異丙基胺基)乙基]-(20S)喜樹鹼、BNP1350、BNPI1100、BN80915、BN80942、磷酸依託泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷、索布佐生(sobuzoxane)、2’-二甲基胺基-2’-去氧-依託泊苷、GL331、N-[2-(二甲基胺基)乙基]-9-羥基-5,6-二甲基-6H-吡啶并[4,3-b]咔唑-1-甲醯胺、阿蘇拉尼(asulacrine)、(5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(二甲基胺基)乙基]-N-甲基胺基]乙基]-5-[4-羥基-3,5-二甲氧基苯基]-5,5a,6,8,8a,9-六氫呋喃并(3’,4’：6,7)萘并(2,3-d)-1,3-二氧雜環戊烯-6-酮、2,3-(亞甲基二氧基)-5-甲基-7-羥基-8-甲氧基苯并[c]-菲啶鎓、6,9-雙[(2-胺基乙基)胺基]苯并[g]異喹啉-5,10-二酮、5-(3-胺基丙基胺基)-7,10-二羥基-2-(2-羥乙基胺基甲基)-6H-吡唑并[4,5,1-de]吖啶-6-酮、N-[1-[2(二乙基胺基)乙基胺基]-7-甲氧基-9-側氧基-9H-噻噸-4-基甲基]甲醯胺、N-(2-(二甲基胺基)乙基)吖啶-4-甲醯胺、6-[[2-(二甲基胺基)乙基]胺基]-3-羥基-7H-茚并[2,1-c]喹啉-7-酮及地美司鈉(dimesna)。

有絲分裂驅動蛋白及尤其人類有絲分裂驅動蛋白KSP之抑制劑之實例闡述於公開案WO03/039460、WO03/050064、WO03/050122、WO03/049527、WO03/049679、WO03/049678、WO04/039774、WO03/079973、WO03/099211、WO03/105855、WO03/106417、 WO04/037171、WO04/058148、WO04/058700、WO04/126699、WO05/018638、WO05/019206、WO05/019205、WO05/018547、WO05/017190、US2005/0176776中。在一實施例中，有絲分裂驅動蛋白之抑制劑包含(但不限於)KSP抑制劑、MKLP1抑制劑、CENP-E抑制劑、MCAK抑制劑及Rab6-KIFL抑制劑。

「組織蛋白去乙醯酶抑制劑」之實例包含(但不限於)SAHA、TSA、澳沙福拉定(oxamflatin)、PXD101、MG98及斯瑞泰德。其他組織蛋白去乙醯酶抑制劑之其他參考可參見下列原稿：Miller,T.A.等人，J.Med.Chem.46(24)：5097-5116(2003)。

「涉及有絲分裂進展之激酶之抑制劑」包含(但不限於)極光激酶抑制劑、Polo樣激酶抑制劑(PLK；尤其PLK-1抑制劑)、bub-1抑制劑及bub-R1抑制劑。「極光激酶抑制劑」之一實例係VX-680。

「抗增殖性藥劑」包含反義RNA及DNA寡核苷酸，例如G3139、ODN698、RVASKRAS、GEM231及INX3001；及抗代謝物，例如依諾他濱(enocitabine)、卡莫氟(carmofur)、替加氟(tegafur)、噴司他汀、去氧氟尿苷(doxifluridine)、曲美沙特((trimetrexate)、氟達拉濱、卡培他濱、加洛他濱(galocitabine)、阿糖胞苷(cytarabine ocfosfate)、水合福思他濱鈉(fosteabine sodium hydrate)、雷替曲塞、帕替曲塞(paltitrexid)、乙嘧替氟(emitefur)、噻唑呋林(tiazofurin)、地西他濱(decitabine)、諾拉曲塞、培美曲塞、奈拉濱(nelzarabine)、2’-去氧-2’-亞甲基胞苷、2’-氟亞甲基-2’-去氧胞苷、N-[5-(2,3-二氫-苯并呋喃基)磺醯基]-N’-(3,4-二氯苯基)脲、N6-[4-去氧-4-[N2-[2(E),4(E)-十四碳二烯醯基]甘胺醯基胺基]-L-甘油-B-L-甘露-庚吡喃糖苷基]腺嘌呤、阿匹利定(aplidine)、海鞘素 (ecteinascidin)、曲沙他濱(troxacitabine)、4-[2-胺基-4-側氧基-4,6,7,8-四氫-3H-嘧啶并[5,4-b][1,4]噻嗪-6-基-(S)-乙基]-2,5-噻吩醯基-L-麩胺酸、胺基蝶呤(aminopterin)、5-氟尿嘧啶、阿拉諾新(alanosine)、乙酸11-乙醯基-8-(胺甲醯基氧基甲基)-4-甲醯基-6-甲氧基-14-氧雜-1,11-二氮雜四環(7.4.1.0.0)-十四-2,4,6-三烯-9-基酯、苦馬豆素(swainsonine)、洛美曲索(lometrexol)、右雷佐生(dexrazoxane)、甲硫胺酸酶(methioninase)、2’-氰基-2’-去氧-N4-棕櫚醯基-1-B-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶、3-胺基吡啶-2-甲醛硫半卡腙及曲妥珠單抗。

單株抗體靶向治療劑之實例包含彼等具有附接至癌細胞特異性或靶細胞特異性單株抗體之細胞毒性劑或放射性同位素之治療劑。實例包含Bexxar。

「異戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑」係指抑制任一異戊二烯基蛋白轉移酶酶(包含法呢基蛋白轉移酶(FPTase)、牛龍牛兒基牛龍牛兒基蛋白轉移酶類型I(GGPTase-I)及牛龍牛兒基牛龍牛兒基蛋白轉移酶類型II(GGPTase-II，亦稱為Rab GGPTase))或其任一組合之化合物。

異戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑之實例可參見下列公開案及專利：WO 96/30343、WO 97/18813、WO 97/21701、WO 97/23478、WO 97/38665、WO 98/28980、WO 98/29119、WO 95/32987、美國專利第5,420,245號、美國專利第5,523,430號、美國專利第5,532,359號、美國專利第5,510,510號、美國專利第5,589,485號、美國專利第5,602,098號、歐洲專利公開案0 618 221、歐洲專利公開案0 675 112、歐洲專利公開案0 604 181、歐洲專利公開案0 696 593、WO 94/19357、WO 95/08542、WO 95/11917、WO 95/12612、WO 95/12572、WO 95/10514、美國專利第5,661,152號、WO 95/10515、WO 95/10516、WO 95/24612、WO 95/34535、WO 95/25086、WO 96/05529、WO 96/06138、WO 96/06193、WO 96/16443、WO 96/21701、WO 96/21456、WO 96/22278、WO 96/24611、WO 96/24612、WO 96/05168、WO 96/05169、WO 96/00736、美國專利第5,571,792號、WO 96/17861、WO 96/33159、WO 96/34850、WO 96/34851、WO 96/30017、WO 96/30018、WO 96/30362、WO 96/30363、WO 96/31111、WO 96/31477、WO 96/31478、WO 96/31501、WO 97/00252、WO 97/03047、WO 97/03050、WO 97/04785、WO 97/02920、WO 97/17070、WO 97/23478、WO 97/26246、WO 97/30053、WO 97/44350、WO 98/02436及美國專利第5,532,359號。關於異戊二烯基蛋白轉移酶抑制劑對血管生成之作用之實例，參見European J.of Cancer,Vol.35,No.9,pp.1394-1401(1999)。

「血管生成抑制劑」係指抑制新血管形成(不論機制如何)之化合物。血管生成抑制劑之實例包含(但不限於)酪胺酸激酶抑制劑(例如酪胺酸激酶受體Flt-1(VEGFR1)及Flk-1/KDR(VEGFR2)之抑制劑)、表皮源、纖維母細胞源或血小板源生長因子之抑制劑、MMP(基質金屬蛋白酶)抑制劑、整聯蛋白阻斷劑、干擾素-α、介白素-12、多硫酸戊聚糖酯(pentosan polysulfate)、環氧合酶抑制劑(包含非類固醇抗發炎劑(NSAID)，例如阿司匹林(aspirin)及布洛芬(ibuprofen)；以及選擇性環氧合酶2抑制劑，例如塞來昔布(celecoxib)及羅非昔布(rofecoxib))(PNAS,Vol.89,p.7384(1992)；JNCI,Vol.69,p.475(1982)；Arch.Opthalmol.,Vol.108,p.573(1990)；Anat.Rec.,Vol.238,p.68(1994)；FEBS Letters,Vol. 372,p.83(1995)；Clin,Orthop.Vol.313,p.76(1995)；J.Mol.Endocrinol.,Vol.16,p.107(1996)；Jpn.J.Pharmacol.,Vol.75,p.105(1997)；Cancer Res.,Vol.57,p.1625(1997)；Cell,Vol.93,p.705(1998)；Intl.J.Mol.Med.,Vol.2,p.715(1998)；J.Biol.Chem.,Vol.274,p.9116(1999))、類固醇抗發炎劑(例如皮質類固醇、鹽皮質激素、地塞米松(dexamethasone)、普賴松、普賴蘇濃、甲潑尼龍(methylpred)、倍他米松(betamethasone)、甲醯胺三唑、康布瑞塔卡汀(combretastatin)A-4、角鯊胺、6-O-氯乙醯基-羰基)-煙麯黴醇(fumagillol)、沙利竇邁、血管抑素、肌鈣蛋白-1、血管緊張素II拮抗劑(參見Fernandez等人，J.Lab.Clin.Med.105：141-145(1985))及VEGF抗體(參見Nature Biotechnology,Vol.17,pp.963-968(1999年10月)；Kim等人，Nature,362,841-844(1993)；WO 00/44777；及WO 00/61186)。

血管生成抑制劑之其他實例包含(但不限於)內皮抑素、烏克蘭(ukrain)、豹蛙酶(ranpirnase)、IM862、5-甲氧基-4-[2-甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)環氧乙烷基]-1-氧雜螺[2,5]辛-6-基(氯乙醯基)胺基甲酸酯、乙醯二苯胺(acetyldinanaline)、5-胺基-1-[[3,5-二氯-4-(4-氯苯甲醯基)苯基]甲基]-1H-1,2,3-三唑-4-甲醯胺、CM101、角鯊胺、康布瑞塔卡汀、RPI4610、NX31838、硫酸化甘露戊糖磷酸酯、7,7-(羰基-雙[亞胺基-N-甲基-4,2-吡咯並羰基亞胺基[N-甲基-4,2-吡咯]-羰基亞胺基]-雙-(1,3-萘二磺酸酯)及3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)亞甲基]-2-吲哚啉酮(SU5416)。

調節或抑制血管生成且亦可與本發明化合物組合使用之其他治療劑包含調節或抑制凝血及纖維蛋白溶解系統之藥劑(綜述可參見Clin.Chem.La.Med.38：679-692(2000))。調節或抑制凝血及纖維蛋白溶解路徑之該等藥劑之實例包含(但不限於)肝素(參見Thromb.Haemost.80：10-23(1998))、低分子量肝素及羧肽酶U抑制劑(亦稱為活性凝血酶可活化纖維蛋白溶解抑制劑[TAFIa])(參見Thrombosis Res.101：329-354(2001))。TAFIa抑制劑已闡述於U.S.Ser.No.60/310,927(2001年8月8日提出申請)及60/349,925(2002年1月18日提出申請)。

「干擾受體酪胺酸激酶(RTK)之抑制劑」係指抑制RTK且由此抑制涉及腫瘤形成及腫瘤進展之機制之化合物。該等藥劑包含c-Kit、Eph、PDGF、Flt3及c-Met之抑制劑。其他藥劑包含RTK抑制劑，如由Bume-Jensen及Hunter,Nature,411：355-365,2001所闡述。

「細胞增殖及存活信號傳導路徑之抑制劑」係指抑制細胞表面受體下游之信號轉導級聯之化合物。該等藥劑包含絲胺酸/蘇胺酸激酶抑制劑(包含(但不限於)Akt抑制劑，例如闡述於以下文獻中者：WO 02/083064、WO 02/083139、WO 02/083140、US 2004-0116432、WO 02/083138、US 2004-0102360、WO 03/086404、WO 03/086279、WO 03/086394、WO 03/084473、WO 03/086403、WO 2004/041162、WO 2004/096131、WO 2004/096129、WO 2004/096135、WO 2004/096130、WO 2005/100356、WO 2005/100344、US 2005/029941、US 2005/44294、US 2005/43361、60/734188、60/652737、60/670469)、Raf激酶抑制劑(例如PLX-4032)、MEK抑制劑(例如Arry-162、RO-4987655及GSK-1120212)、mTOR抑制劑(例如AZD-8055、BEZ-235及依維莫司)及PI3K抑制劑(例如GDC-0941、BKM-120)。

如上文所使用，「整聯蛋白阻斷劑」係指選擇性拮抗、抑制或抵抗生理學配體結合至αvβ3整聯蛋白之化合物、選擇性拮抗、抑制或抵抗生理學配體結合至αvβ5整聯蛋白之化合物、拮抗、抑制或抵抗生理學配體結合至αvβ3整聯蛋白及αvβ5整聯蛋白二者之化合物及拮抗、抑制或抵抗表現於毛細管內皮細胞上之特定整聯蛋之活性之化合物。該術語亦係指αvβ6、αvβ8、α1β1、α2β1、α5β1、α6β1及α6β4整聯蛋白之拮抗劑。該術語亦係指αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αv1β1、α2β1、α5β1、α6β1及α6β4整聯蛋白之任一組合之拮抗劑。

酪胺酸激酶抑制劑之一些具體實例包含N-(三氟甲基苯基)-5-甲基異噁唑-4-甲醯胺、3-[(2,4-二甲基吡咯-5-基)甲基茚基)二氫吲哚-2-酮、17-(烯丙基胺基)-17-去甲氧基格爾德黴素、4-(3-氯-4-氟苯基胺基)-7-甲氧基-6-[3-(4-嗎啉基)丙氧基]喹唑啉、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺、BIBX1382、2,3,9,10,11,12-六氫-10-(羥甲基)-10-羥基-9-甲基-9,12-環氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg：3’,2’,1’-kl]吡咯並[3,4-i][1,6]苯并二氮雜環辛間四烯-1-酮、SH268、金雀異黃酮(genistein)、STI571、CEP2563、4-(3-氯苯基胺基)-5,6-二甲基-7H-吡咯並[2,3-d]嘧啶甲烷磺酸酯、4-(3-溴-4-羥基苯基)胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉、4-(4’-羥基苯基)胺基-6,7-二甲氧基喹唑啉、SU6668、STI571A、N-4-氯苯基-4-(4-吡啶基甲基)-1-酞嗪胺及EMD121974。

本發明所主張抗體或抗原結合片段與PPAR-γ(亦即PPAR-伽馬)激動劑及PPAR-δ(亦即PPAR-德爾塔)激動劑之組合可用於治療某些惡性腫瘤。PPAR-γ及PPAR-δ係細胞核過氧化物酶體增殖子活化受體γ及δ。PPAR-γ在內皮細胞上之表現及其與血管生成之關聯已報告於文獻中(參見J.Cardiovasc.Pharmacol.1998；31：909-913；J.Biol.Chem. 1999；274：9116-9121；Invest.Ophthalmol Vis.Sci.2000；41：2309-2317)。最近，PPAR-γ激動劑已展示可在活體外抑制對VEGF之血管生成反應；曲格列酮(troglitazone)及羅格列酮(rosiglitazone)馬來酸鹽抑制在小鼠中發生視網膜新血管形成。(Arch.Ophthamol.2001；119：709-717)。PPAR-γ激動劑及PPAR-γ/α激動劑之實例包含(但不限於)Lynparza®、Rucaparib®、Talazoparib®、尼拉帕尼、Veliparib®、噻唑啶二酮(例如DRF2725、CS-011、曲格列酮、羅格列酮及吡格列酮(pioglitazone))、非諾貝特(fenofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)、氯貝丁酯(clofibrate)、GW2570、SB219994、AR-H039242、JTT-501、MCC-555、GW2331、GW409544、NN2344、KRP297、NP0110、DRF4158、NN622、GI262570、PNU182716、DRF552926、2-[(5,7-二丙基-3-三氟甲基-1,2-苯并異噁唑-6-基)氧基]-2-甲基丙酸及2(R)-7-(3-(2-氯-4-(4-氟苯氧基)苯氧基)丙氧基)-2-乙基

烷-2-甲酸。

本發明之抗體或抗原結合片段亦可與芳香酶抑制劑組合用於治療或預防乳癌。芳香酶抑制劑之實例包含(但不限於)：阿那曲唑、來曲唑及依西美坦。

本發明之抗體或抗原結合片段亦可與下列化學治療劑組合用於治療癌症：阿巴瑞克(abarelix)(Plenaxis depot®)；阿地白介素(aldesleukin)(Prokine®)；阿地白介素(Proleukin®)；阿倫單抗(Campath®)；阿利維A酸(alitretinoin)(Panretin®)；別嘌呤醇(allopurinol)(Zyloprim®)；六甲蜜胺(Hexalen®)；阿米福汀(Ethyol®)；阿那曲唑(Arimidex®)；三氧化砷(Trisenox®)；天門冬醯胺酸酶(Elspar®)；阿紮胞苷(azacitidine)(Vidaza®)；苯達莫司汀鹽酸鹽(bendamustine hydrochloride) (Treanda®)；貝伐珠單抗(bevacuzimab)(Avastin®)；貝沙羅汀膠囊(Targretin®)；貝沙羅汀凝膠(Targretin®)；博來黴素(Blenoxane®)；硼替佐米(Velcade®)；佈雷菲德菌素A(brefeldin A)；靜脈內白消安(Busulfex®)；口服白消安(Myleran®)；卡普睪酮(calusterone)(Methosarb®)；卡培他濱(Xeloda®)；卡鉑(Paraplatin®)；卡莫司汀(BCNU®,BiCNU®)；卡莫司汀(Gliadel®)；卡莫司汀與聚苯丙生(Polifeprosan)20植入物(Gliadel Wafer®)；塞來昔布(Celebrex®)；西妥昔單抗(Erbitux®)；氮芥苯丁酸(Leukeran®)；順鉑(Platinol®)；克拉屈濱(Leustatin®,2-CdA®)；氯法拉濱(clofarabine)(Clolar®)；環磷醯胺(Cytoxan®,Neosar®)；環磷醯胺Cytoxan Injection®)；環磷醯胺(Cytoxan Tablet®)；阿糖胞苷(Cytosar-U®)；阿糖胞苷脂質體(DepoCyt®)；達卡巴嗪(DTIC-Dome®)；更生黴素、放線菌素D(actinomycin D)(Cosmegen®)；達肝素(dalteparin)鈉注射物(Fragmin®)；達貝泊汀α(Darbepoetin alfa)(Aranesp®)；達沙替尼(Sprycel®)；柔紅黴素脂質體(DanuoXome®)；柔紅黴素、道諾黴素(daunomycin)(Daunorubicin®)；柔紅黴素、道諾黴素(daunomycin)(Cerubidine®)；地加瑞克(degarelix)(Firmagon®)；地尼白介素-地非多克(Denileukin diftitox)(Ontak®)；右雷佐生(dexrazoxane)(Zinecard®)；右雷佐生鹽酸鹽(Totect®)；代代寧B(didemnin B)；17-DMAG；多西他賽(Taxotere®)；多柔比星(Adriamycin PFS®)；多柔比星(Adriamycin®,Rubex®)；多柔比星(Adriamycin PFS Injection®)；多柔比星脂質體(Doxil®)；丙酸屈他雄酮(Dromostanolone ®)；丙酸屈他雄酮(Masterone Injection®)；依庫珠單抗(eculizumab)注射物(Soliris®)；愛立特氏(Elliott's)B溶液(Elliott's B Sloution®)；艾曲波帕(eltrombopag)(Promacta®)；表柔比星(Ellence®)；阿法依伯汀(Epoetin alfa)(epogen®)；埃羅替尼(Tarceva®)；雌氮芥(Emcyt®)；乙炔雌二醇；磷酸依託泊苷(Etopophos®)；依託泊苷VP-16(Vepesid®)；依維莫司錠劑(Afinitor®)；依西美坦(Aromasin®)；奈米氧化鐵(ferumoxytol)(Feraheme Injection®)；非格司亭(Filgrastim)(Neupogen®)；氟尿苷(動脈內)(FUDR®)；氟達拉濱(Fludara®)；氟尿嘧啶，5-FU(Adrucil®)；氟維司群(Faslodex®)；吉非替尼(Iressa®)；格爾德黴素；吉西他濱(Gemzar®)；吉妥珠單抗-奧佐米星(Mylotarg®)；乙酸戈舍瑞林(Zoladex Implant®)；乙酸戈舍瑞林(Zoladex®)；乙酸組胺瑞林(histrelin acetate)(Histrelin Implant®)；羥基脲(Hydrea®)；替坦異貝莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)(Zevalin®)；伊達比星(Idamycin®)；異環磷醯胺(IFEX®)；甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(Gleevec®)；干擾素α 2a(Roferon A®)；干擾素α-2b(Intron A®)；碘苄胍(iobenguane)I 123注射物(AdreView®)；伊立替康(Camptosar®)；伊沙匹隆(ixabepilone)(Ixempra®)；拉帕替尼錠劑(Tykerb®)；勒鈉度胺(lenalidomide)(Revlimid®)；來曲唑(Femara®)；甲醯四氫葉酸(Wellcovorin®,Leucovorin®)；乙酸柳培林(Eligard®)；左旋咪唑(Ergamisol®)；洛莫司汀CCNU(CeeBU®)；雙氯乙基甲胺(meclorethamine)、氮芥(nitrogen mustard)(Mustargen®)；乙酸甲地孕酮(Megace®)；美法侖L-PAM(Alkeran®)；巰基嘌呤，6-MP(Purinethol®)；美司鈉(Mesnex®)；美司鈉(Mesnex tabs®)；胺甲喋呤(Methotrexate®)；甲氧沙林(methoxsalen)(Uvadex®)；8-甲氧沙林(8-methoxypsoralen)；絲裂黴素C (Mutamycin®)；米托坦(Lysodren®)；米托蒽醌(Novantrone®)；光輝黴素(mitramycin)；苯丙酸諾龍(Durabolin-50®)；耐拉濱(nelarabine)(Arranon®)；尼羅替尼(Tasigna®)；諾非單抗(Nofetumomab)(Verluma®)；奧法木單抗(Arzerra®)；奧普瑞白介素(Oprelvekin)(Neumega®)；奧沙利鉑(Eloxatin®)；太平洋紫杉醇(Paxene®)；太平洋紫杉醇(Taxol®)；太平洋紫杉醇蛋白質結合顆粒(Abraxane®)；帕利非明(palifermin)(Kepivance®)；帕米膦酸(Aredia®)；帕尼單抗(Vectibix®)；帕唑帕尼錠劑(Votrienttm®)；培加酶(pegademase)(Adagen(Pegademase Bovine)®)；培加帕酶(pegaspargase)(Oncaspar®)；培非拉斯替(Pegfilgrastim)(Neulasta®)；培美曲塞二鈉(Alimta®)；噴司他汀(Nipent®)；哌泊溴烷(Vercyte®)；普樂沙福(plerixafor)(Mozobil®)；普卡黴素、光輝黴素(Mithracin®)；卟菲爾鈉(Photofrin®)；普拉曲沙(pralatrexate)注射物(Folotyn®)；丙卡巴肼(Matulane®)；奎納克林(quinacrine)(Atabrine®)；雷帕黴素；拉布立酶(Rasburicase)(Elitek®)；雷洛昔芬鹽酸鹽(Evista®)；利妥昔單抗(Rituxan®)；羅米地辛(Istodax®)；羅米司亭(romiplostim)(Nplate®)；沙格莫丁(sargramostim)(Leukine®)；沙格莫丁(Prokine®)；索拉菲尼(Nexavar®)；鏈脲黴素(Zanosar®)；馬來酸舒尼替尼(Sutent®)；滑石粉(Sclerosol®)；他莫昔芬(Nolvadex®)；替莫唑胺(Temodar®)；替西羅莫司(Torisel®)；替尼泊苷VM-26(Vumon®)；睪內酯(Teslac®)；硫鳥嘌呤，6-TG(thioguanine®)；硫基嘌呤；噻替派(Thioplex®)；托泊替康(Hycamtin®)；托瑞米芬(Fareston®)；托西莫單抗(tositumomab)(Bexxar®)；托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar®)；反式-視黃酸；曲妥珠單抗(Herceptin®)；維甲酸，ATRA(Vesanoid®)；三乙烯三聚氰胺；尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard Capsules®)；戊柔比星(Valstar®)；長春鹼(Velban®)；長春新鹼(Oncovin®)；長春瑞濱(Navelbine®)；伏立諾他(Zolinza®)；渥曼青黴素；及唑來膦酸鹽(zoledronate)(Zometa®)。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係聯合一或多種止吐藥來使用，包含(但不限於)：卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥匹坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其他NK-1受體拮抗劑、帕洛司瓊(palonosetron)(由MGI Pharma以Aloxi形式出售)、阿瑞吡坦(aprepitant)(由Merck and Co.；Rahway,NJ以Emend形式出售)、苯海拉明(diphenhydramine)(由Pfizer；New York,NY以Benadryl®形式出售)、羥嗪(hydroxyzine)(由Pfizer；New York,NY以Atarax®形式出售)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(由AH Robins Co,；Richmond,VA以Reglan®形式出售)、勞拉西泮(lorazepam)(由Wyeth；Madison,NJ以Ativan®形式出售)、阿普唑侖(alprazolam)(由Pfizer；New York,NY以Xanax®形式出售)、氟哌啶醇(haloperidol)(由Ortho-McNeil；Raritan,NJ以Haldol®形式出售)、達哌啶醇(droperidol)(Inapsine®)、屈大麻酚(dronabinol)(由Solvay Pharmaceuticals,Inc.；Marietta,GA以Marinol®形式出售)、地塞米松(由Merck and Co.；Rahway,NJ以Decadron®形式出售)、甲基普賴蘇濃(由Pfizer；New York,NY以Medrol®形式出售)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)(由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC以Compazine®形式出售)、格拉司瓊(granisetron)(由Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley,NJ以Kytril®形式出售)、昂丹司瓊(ondansetron) (由Glaxosmithkline；Research Triangle Park,NC以Zofran®形式出售)、多拉司瓊(dolasetron)(由Sanofi-Aventis；New York,NY以Anzemet®形式出售)、托烷司瓊(tropisetron)(由Novartis；East Hanover,NJ以Navoban®形式出售)。

癌症治療之其他副效應包含紅血細胞及白血細胞缺陷。因此，在本發明之一實施例中，聯合抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)與治療或預防此一缺陷之藥劑(例如非格司亭、PEG-非格司亭、紅血球生成素(erythropoietin)、阿法依伯汀或達貝泊汀α)。

在本發明之一實施例中，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)係與抗癌輻射療法聯合投與。舉例而言，在本發明之一實施例中，輻射療法係外部光束療法(EBT)：將高能量X射線光束遞送至腫瘤位置之方法。光束生成於患者外部(例如藉由線性加速器)且靶向於腫瘤位點處。該等X射線可破壞癌細胞且小心治療計劃使得並不破壞周圍正常組織。並無放射性來源置於患者身體內部。在本發明之一實施例中，輻射療法係質子束療法：使用質子代替X射線來轟擊患病組織之一類適形療法。在本發明之一實施例中，輻射療法係適形外部光束輻射療法：使用先進技術調整輻射療法以用於個體之身體結構之程序。在本發明之一實施例中，輻射療法係短距離放射療法：將放射性材料暫時放置於身體內，通常用於給予某一區域額外劑量或加強輻射。

在本發明之一實施例中，與抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)聯合投與之手術程序係手術腫瘤切除術。

在另一實施例中，向患者輸注使用抗CD27特異性抗體或其抗原結合片段離體擴增之自體T細胞。在另一實施例中，向患者投與自體T細胞與抗CD27特異性抗體或其抗原結合片段之組合。在又一實施例中，使用癌症疫苗對患者接種疫苗，且輸注使用抗CD27特異性抗體或其抗原結合片段離體擴增之自體T細胞。自體T細胞可為自體浸潤淋巴球、使用針對腫瘤抗原之高親和力T細胞受體轉導之T細胞或使用由具有T細胞信號傳導分子之內部結構域之雜合免疫球蛋白輕鏈構成之嵌合抗原受體轉導的T細胞。參見Kalos M.及June C.H.,Immunity,39,2013,p49-60；Wu R.等人，Cancer J.2012；18(2)：160-175；及June,C.H.,J.Clin.Invest.117：1466-1476(2007)。

實驗及診斷應用

可使用本文所揭示之抗CD27抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)作為親和力純化藥劑。在此製程中，使用業內熟知之方法將抗CD27抗體及其抗原結合片段固定於固相(例如Sephadex、玻璃或瓊脂糖樹脂或濾紙)上。使經固定抗體或片段與含有擬純化CD27蛋白(或其片段)之試樣接觸，且然後使用去除試樣中除CD27蛋白(其結合至經固定抗體或片段)外之實質上所有材料之適宜溶劑洗滌載體。最後，使用洗脫所結合CD27(例如蛋白質A)之溶劑洗滌載體。該等經固定抗體及片段形成本發明之一部分。

另外提供用於生成可用於(例如)實施西方印漬(Western blot)及本文所論述其他免疫分析中之二級抗體之抗原。

抗CD27抗體(例如人類化抗體)及其抗原結合片段亦可用於診斷分析CD27蛋白，例如檢測其在特定細胞、組織或血清(例如腫瘤細胞，例如黑色素瘤細胞)中之表現。該等診斷方法可用於各種疾病診斷。

本發明包含納入使用本文所揭示之抗CD27抗體或其抗原結合片段 (例如抗體131A或其人類化形式)之ELISA分析(酶聯免疫吸附分析)。

舉例而言，此一方法包括下列步驟：(a)使用抗CD27抗體或其抗原結合片段塗覆基板(例如微量滴定板孔之表面，例如塑膠板)；(b)將擬測試CD27之存在之試樣施加至基板上；(c)洗滌該板，從而去除試樣中之未結合材料；(d)施加亦對CD27抗原具有特異性之可檢測標記之抗體(例如酶聯抗體)；(e)洗滌基板，從而去除未結合之經標記抗體；(f)若經標記抗體發生酶聯，則施加藉由酶轉化成螢光信號之化學物質；及(g)檢測經標記抗體之存在。

與基板締合之標記之檢測指示存在CD27蛋白。

在另一實施例中，經標記抗體或其抗原結合片段經過氧化物酶標記，過氧化物酶與ABTS(例如2,2'-次偶氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺進行反應以產生可檢測之色彩變化。或者，經標記抗體或片段係使用可藉由閃爍計數器在閃爍體存在下檢測之可檢測放射性同位素(例如³H)來標記。

本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)可用於西方印漬或免疫蛋白印漬程序中。此一程序形成本發明之一部分且包含(例如)：

(1)視情況使用業內已知之方法(例如半乾印漬或罐式印漬)將蛋白質自擬測試CD27之存在之試樣(例如自試樣中之蛋白質之PAGE或SDS- PAGE電泳分離)轉移於膜或其他固體基板上；使擬測試結合CD27或其片段之存在之膜或其他固體基板與本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段接觸。

此一膜可採用硝基纖維素或基於乙烯基(例如聚二氟亞乙烯(PVDF))之膜形式，在該膜上轉移(例如在凝膠中電泳分離後)擬在非變性PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠或SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳)凝膠中測試CD27之存在之蛋白質。在使膜與抗CD27抗體或片段接觸之前，視情況(例如)使用脫脂奶粉或諸如此類阻斷膜以結合膜上之非特異性蛋白質結合位點。

(2)洗滌膜一或多次以去除未結合抗CD27抗體或片段及其他未結合物質；及

(3)檢測所結合抗CD27抗體或片段。

所結合抗體或片段之檢測指示，CD27蛋白存在於膜或基板上及試樣中。可藉由使抗體或片段與可檢測地標記且然後檢測二級抗體之存在之二級抗體(抗免疫球蛋白抗體)結合來檢測所結合抗體或片段。

本文所揭示之抗CD27抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可用於免疫組織化學。此一方法形成本發明之一部分且包含(例如)：(1)使擬測試CD27蛋白之存在之細胞(例如腫瘤細胞，例如黑色素瘤細胞)與本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段接觸；及(2)檢測細胞上或其中之抗體或片段。

若抗體或片段本身經可檢測地標記，則其可直接檢測。或者，可藉由所檢測之可檢測地標記之二級抗體來結合抗體或片段。

本文所揭示之某些抗CD27抗體及其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)亦可用於活體內腫瘤成像。此一方法可包含：將經放射性標記之抗CD27抗體或其抗原結合片段注射至擬測試與CD27表現有關之腫瘤(例如其在(例如)腫瘤細胞表面上表現CD27)之存在的患者身體中，隨後使患者身體核成像以檢測經標記抗體或片段(例如)在包括高濃度結合至腫瘤之抗體或片段之基因座處之存在。基因座之檢測指示存在CD27⁺腫瘤及腫瘤細胞。

成像技術包含SPECT成像(單光子發射電腦化斷層攝影術)或PET成像(正電子發射斷層攝影術)。標記包含(例如)碘-123(¹²³I)及鍀-99m(^99mTc)(例如結合SPECT成像)或¹¹C、¹³N、¹⁵O或¹⁸F(例如結合PET成像)或銦-111(例如參見Gordon等人(2005)International Rev.Neurobiol.67：385-440)。

醫藥組合物及投與

為製備本發明之抗CD27抗體及抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)之醫藥或無菌組合物，將該抗體或其抗原結合片段與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences及U.S.Pharmacopeia：National Formulary,Mack Publishing Company,Easton,PA(1984)。

可藉由與可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合成(例如)凍乾粉末、漿液、水溶液或懸浮液之形式來製備治療劑及診斷劑之調配物(例如參見Hardman等人(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams 及Wilkins,New York,NY；Avis等人(編輯)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY；Lieberman等人(編輯)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY；Weiner及Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。

可藉由標準醫藥程序在細胞培養液或實驗動物中來測定本發明抗體(單獨投與或與另一治療劑組合投與)之毒性及治療效能，例如測定LD₅₀(使50%之群體致死之劑量)及ED₅₀(在50%之群體中治療有效之劑量)。毒性效應與治療效應之間之劑量比率為治療指數(LD₅₀/ED₅₀)。在調配用於人類中之劑量範圍中可使用自該等細胞培養分析及動物研究獲得之數據。該等化合物之劑量較佳地在具有極低毒性或無毒性之循環濃度(包含ED₅₀)的範圍內。端視所用劑型及投與途徑，劑量可在此範圍內有所變化。

在另一實施例中，根據Physicians' Desk Reference 2003(Thomson Healthcare；第57版(2002年11月1日))將另一治療劑與本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)聯合投與個體。

投與模式可有所變化。投與途徑包含口服、直腸、經黏膜、經腸、非經腸、肌內、皮下、真皮內、髓內、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜腔內、鼻內、眼內、吸入、吹入、局部、皮膚、經皮或動脈內。

在特定實施例中，可藉由侵襲性途徑(例如藉由注射)投與本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)。在本發明之其他實施例中，經靜脈內、經皮下、經肌內、經動脈內、經腫瘤內或藉由吸入、氣溶膠遞送來投與抗CD27抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物。藉由非侵襲性途徑(例如經口；例如以丸劑、膠囊或錠劑形式)投與亦在本發明範圍內。

本發明提供包括本發明之任一抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)或其醫藥組合物之器皿(例如塑膠或玻璃小瓶，例如含有蓋或層析管柱、具孔針或注射筒)。本發明亦提供包括本發明之任一抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)或其醫藥組合物之注射器件。注射器件係經由非經腸途徑(例如肌內、皮下或靜脈內)將物質引入患者身體中之器件。舉例而言，注射器件可為注射器(例如預填充醫藥組合物，例如自動注射器)，其(例如)包含容納擬注射流體(例如抗體或片段或其醫藥組合物)之筒或捲筒；針，其用於穿刺皮膚及/或血管以用於注射流體；及柱塞，其用於將流體推出筒且穿過針孔。在本發明之一實施例中，包括本發明之抗體或其抗原結合片段或其醫藥組合物之注射器件係靜脈內(IV)注射器件。此一器件在套管或套針/針中包含抗體或片段或其醫藥組合物，該套管或套針/針附接至亦可附接至用於容納經由套管或套針/針引入患者身體中之流體(例如鹽水；或包括NaCl、乳酸鈉、KCl、CaCl₂且視情況包含葡萄糖之乳酸化林格氏溶液(ringer solution))之袋或儲槽之管。在本發明之一實施例中，在將套針及套管插入個體之靜脈中且自插入套管取出套針後，可立即將抗體或片段或其醫藥組合物引入器件中。IV器件可(例如)插入周邊靜脈(例如手或臂中)；上腔靜脈或下腔靜脈中，或心臟右心房內(例如中心IV)；或插入鎖骨下、頸內靜脈或股靜脈中且(例如)朝向心臟前進直至其到達上腔靜脈或右心房(例如中心靜脈線)為止。在本發明之一實施例中，注射器件係自動注射器、噴射器或外部輸注幫浦。噴射器使用高壓液體窄噴嘴滲透表皮以將抗體或片段或其醫藥組合物引入患者身體中。外部輸注幫浦係將抗體或片段或其醫藥組合物以受控量遞送至患者身體中之醫學器件。外部輸注幫浦可為電驅動或機械驅動。不同幫浦以不同方式發揮作用，舉例而言，注射器幫浦將流體容納於注射器之儲槽中，且可移動活塞控制流體遞送，彈性幫浦將流體容納於彈性氣囊儲槽中，且來自氣囊彈性壁之壓力驅動流體遞送。在蠕動幫浦中，一組輥於撓性管之長度上夾緊向下，從而推動流體向前。在多通道幫浦中，可自多個儲槽以多個速率遞送流體。

亦可使用無針皮下注射器件投與本文所揭示之醫藥組合物；例如美國專利第6,620,135號、第6,096,002號、第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中所揭示之器件。該等包括醫藥組合物之無針器件亦係本發明之一部分。亦可藉由輸注來投與本文所揭示之醫藥組合物。用於投與醫藥組合物之熟知植入物及模組之實例包含揭示於以下案件中者：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以受控速率分配藥劑之可植入微輸注幫浦；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送藥劑之藥劑輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多室腔室之滲透藥物遞送系統。許多其他該等植入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者所熟知且包括本發明醫藥組合物者在本發明範圍內。

或者，可以局部方式而非全身性方式來投與本發明之抗CD27抗體或抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)，例如經由將抗體或片段直接注射至腫瘤(例如CD27⁺腫瘤)中。另外，可以靶向藥物遞送系統來投與抗體或片段，例如以塗覆有靶向(例如)特徵在於免疫病理學之腫瘤(例如CD27⁺腫瘤)之組織特異性抗體之脂質體。將脂質體靶向受影響組織且由受影響組織選擇性吸收。該等方法及脂質體係本發明之一部分。

投與方案取決於若干因素，包含治療抗體或抗原結合片段之血清或組織轉換率、症狀之程度、治療抗體之免疫原性及生物基質中靶細胞之易接近性。較佳地，投與方案遞送足夠治療抗體或片段以實現改良靶疾病狀態，而同時最小化不期望副效應。因此，所遞送生物製劑之量部分地取決於特定治療抗體及所治療病狀之嚴重程度。可利用選擇治療抗體或片段之適當劑量之導則(例如參見Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(編輯)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(編輯)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。

適當劑量之確定係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療之參數或因素來進行。通常，劑量係以稍微小於最佳劑量之量開始且此後以較小增量增加，直至相對於任何不利副效應達成期望或最佳效應為止。重要之診斷手段包含彼等(例如)發炎之症狀或所產生發炎性細胞介素之濃度。一般而言，期望所用生物製劑與靶向治療之動物衍生自相同物種，由此最小化對於試劑之任一免疫反應。在人類個體之情形下，舉例而言，可期望人類化及完全人類抗體。

可藉由連續輸注或藉由(例如)每天、每週1-7次、每週、每兩週、每月、每兩月、每季度、每半年、每年等投與之劑量來提供本文所揭示之抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)。可(例如)經靜脈內、經皮下、經局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經大腦內、經脊柱內或藉由吸入來提供劑量。總週劑量為通常至少0.05μg/kg體重、更通常至少0.2μg/kg、0.5μg/kg、1μg/kg、10μg/kg、100μg/kg、0.25mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/ml、10mg/kg、25mg/kg、50mg/kg或更高(例如參見Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52：151-144)。亦可提供劑量以達成抗CD27抗體在個體血清中之預定靶濃度，例如0.1、0.3、1、3、10、30、100、300μg/ml或更高。在其他實施例中，舉例而言，經皮下或經靜脈內每週、每兩週、「每4週」、每月、每兩月或每季度以10、20、50、80、100、200、500、1000或2500mg/個體來投與本發明抗CD27抗體。

如本文中所使用，術語「有效量」係指本發明之抗CD27或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)在單獨或與另一治療劑組合投與細胞、組織或個體時有效引起一或多種疾病症狀(例如癌症或癌症進展)之可量測改良之量。有效劑量另外係指抗體或片段足以使得至少部分地改善症狀(例如腫瘤收縮或消除、腫瘤生長缺乏增、加存活時間)之量。在施加至個體單獨投與之活性成分時，有效劑量係指該單獨成分。在應用於組合時，有效量係指引起治療效果之活性成分之組合量，不論係組合、連續或同時投與。治療有效量將使得改良診斷量測或參數至少10%、通常至少20%、較佳地至少約30%、更佳地至少40%及最佳地至少50%。倘若使用主觀量測來評價疾病嚴重程度，則有效量亦可使得改良主觀量測。

套組

另外提供之套組包括一或多種組分，該等組分包含(但不限於)如本文所論述之抗CD27抗體或抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)以及一或多種其他組分(包含(但不限於)醫藥上可接受之載劑及/或如本文所論述之治療劑)。可將抗體或片段及/或治療劑調配為純組合物或與醫藥上可接受之載劑組合調配成醫藥組合物。

在一實施例中，套組在一個容器中(例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中)包含本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A或其人類化形式)或其醫藥組合物且/或在另一容器中(例如在無菌玻璃或塑膠小瓶中)包含治療劑及其醫藥組合物。

在另一實施例中，套組包括本發明之組合，該組合包含本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如人類化131A)以及醫藥上可接受之載劑視情況與一或多種治療劑一起視情況在單一、公用容器中調配成醫藥組合物之組合。

若套組包含用於非經腸投與個體之醫藥組合物，則該套組可包含用於實施該投與之器件。舉例而言，套組可包含一或多個皮下針或如上文所論述之其他注射器件。

套組可包含含有涉及套組中之醫藥組合物及劑型之資訊之包裝插頁。通常，該資訊有助於患者及醫師有效且安全地使用經包封之醫藥組合物及劑型。舉例而言，關於本發明組合之下列資訊可提供於插頁中：藥物動力學、藥效動力學、臨床研究、效能參數、適應症及用法、禁忌、警告、預防措施、不良反應、超劑量、適當劑量及投與、供應方式、適當儲存條件、參考文獻、製造商/經銷商資訊及專利資訊。

檢測套組及治療套組

為方便起見，本發明之抗CD27抗體或其抗原結合片段(例如抗體131A及其人類化形式)可提供於套組中，亦即預定量試劑與實施診斷或檢測分析之說明書之經包裝組合。在抗體或片段經酶標記之情形下，套組將包含酶所需之受質及輔因子(例如提供可檢測發色團或螢光團之受質前體)。另外，可包含其他添加劑，例如穩定劑、緩衝劑(例如阻斷緩衝劑或裂解緩衝劑)及諸如此類。各種試劑之相對量可廣泛變化以提供實質上最佳化分析敏感性之溶液中試劑濃度。特定而言，試劑可提供為通常凍乾之乾燥粉末，該等乾燥粉末包含在溶解時將提供具有適當濃度之試劑溶液之賦形劑。

亦提供診斷或檢測試劑及用於各種檢測分析(包含(例如)免疫分析，例如ELISA(夾心型或競爭性形式))中之包括一或多種該試劑之套組。可將套組組分預附接至固體載體上，或在使用套組時可施加至固體載體之表面上。在本發明之一些實施例中，可使信號生成構件與本發明之抗體或片段預締合或可能需要在使用之前與一或多種組分(例如緩衝劑、抗體-酶偶聯物、酶受質或諸如此類)進行組合。套組亦可包含其他試劑，例如用於減小非特異性結合至固相表面之阻斷試劑、洗滌試劑、酶受質及諸如此類。固相表面可呈管、珠粒、微量滴定板、微球體或其他適於固定蛋白質、肽或多肽之材料形式。在特定態樣中，催化形成化學發光或發色產物或還原化學發光或發色受質之酶係信號生成構件之組分。該等酶在業內已眾所周知。套組可包括本文所闡述之捕獲劑及檢測試劑中之任一者。視情況，套組亦可包括實施本發明方法之說明書。

亦提供一種套組，其包括包裝於容器(例如小瓶或瓶)中之抗CD27抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段，且進一步包括附接至容器或與容器一起包裝之標記，該標記闡述容器之內容物且提供使用容器內容物來治療一或多種如本文所闡述之疾病狀態之適應症及/或說明書。

在一態樣中，套組係用於治療癌症且包括抗CD27抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及另一治療劑或疫苗。套組可視情況進一步包含用於非經腸(例如靜脈內)投與之注射器。在另一態樣中，套組包括抗CD27抗體(例如人類化抗體)或其抗原結合片段及附接至容器或與容器一起包裝之標記(該標記闡述抗體或片段之使用)以及疫苗或另一治療劑。在又一態樣中，套組包括疫苗或另一治療劑及附接至容器或與容器一起包裝之標記(其闡述疫苗之使用)或包括另一治療劑以及抗CD27抗體或片段。在某些實施例中，抗CD27抗體及疫苗或另一治療劑處於分開小瓶中或一起組合於相同醫藥組合物中。除上述腫瘤疫苗外，可組合使用用於感染性疾病之疫苗與抗CD27抗體或其抗原結合片段，例如COMVAX^®、M-M-R^® II、Pedvax HIB^®、PNEUMOVAX^® 23、ProQuad^®、RotaTeq^®、VARIVAX^®及ZOSTAVAX^®。

如上文在組合療法部分中所論述，同時投與兩種治療劑無需同時或藉由相同途徑投與藥劑，只要藥劑施加其治療效應之時間段存在重疊即可。涵蓋同時或依序投與，如在不同日期或週投與。

亦可製備包括本文所揭示之至少一種抗體、肽、抗原結合片段或多核苷酸及使用組合物作為檢測試劑或治療劑之說明書之本文所揭示之治療及檢測套組。用於該等套組中之容器可通常包括至少一個小瓶、測試管、燒瓶、瓶、注射器或其他適宜容器，在該容器中可放置一或多種檢測及/或治療組合物，且較佳地適宜等分。在亦提供第二治療劑之情形下，套組亦可含有可放置此第二檢測及/或治療組合物之第二不同容器。或者，複數種化合物可製備成單一醫藥組合物，且可包裝於單一容器構件(例如小瓶、燒瓶、注射器、瓶或其他適宜單一容器)中。本文所揭示之套組亦通常包含含有用於商業規模之封閉限制小瓶之構件，例如保留期望小瓶之吹模塑膠容器。在放射性標記、發色或其他類型之可檢測標記或檢測構件包含於套組內之情形下，可將標記劑作為檢測或治療組合物本身提供於相同容器中，或可替代地置於可放置此第二組合物且適宜等分之第二不同容器構件中。或者，可在單一容器構件中製備檢測試劑及標記，且在大部分情形下，套組亦通常包含含有用於商業規模及/或便利包裝及遞送之小瓶之構件。

亦提供用於實施本文所闡述之檢測或監測方法之器件或裝置。此一裝置可包含室或管(其可輸入試樣)、流體處置系統(視情況包含引導試樣流經器件之閥門或幫浦)、視情況過濾器(用以自血液分離血漿或血清)、混合室(用於添加捕獲劑或檢測試劑)及視情況檢測器件(用於檢測結合至捕獲藥劑免疫複合物之可檢測標記之量)。試樣之流動可為被動的(例如藉由毛細管力、流體靜力學力或其他在施加試樣時無需另外操縱器件之力)或主動(例如藉由施加經由機械幫浦、電滲幫浦離、心力或增加之空氣壓力生成之力)或藉由主動及被動力之組合來流動。

在其他實施例中，亦提供處理器、電腦可讀取記憶體及儲存於電腦可讀取記憶體且適於在處理器上執行以實施本文所闡述之任一方法之常式。適宜計算系統、環境及/或構形之實例包含個人電腦、伺服器電腦、手持式或膝上式器件、多處理器系統、基於微處理器之系統、機頂盒、可程式化消費電子裝置、網絡PC、微電腦、主機電腦、包含上文任一系統或器件或業內已知之任何其他系統之分布式計算環境。

一般方法

分子生物中之標準方法闡述於以下文獻中：Sambrook、Fritsch及Maniatis(1982及1989年第2版，2001年第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook及Russell(2001)Molecular Cloning，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)。標準方法亦出現於以下文獻中：Ausbel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY，其闡述在細菌細胞中之選殖及DNA誘變(Vol.1)、哺乳動物細胞及酵母中之選殖(Vol.2)、糖偶聯物及蛋白質表現(Vol.3)及生物資訊學(Vol.4)。

闡述包含免疫沈澱、層析、電泳、離心及結晶之蛋白質純化之方法(Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。闡述化學分析、化學修飾、轉譯後修飾、融合蛋白之產生、蛋白質之醣基化(例如參見Coligan等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology, Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。闡述多株及單株抗體之產生、純化及斷裂(Coligan等人(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow及Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow及Lane，見上文).可獲得表徵配體/受體相互作用之標準技術(例如參見Coligan等人(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。

可製備單株、多株及人類化抗體(例如參見Sheperd及Dean(編輯)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann及Dubel(編輯)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow及Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter等人(2000)J.Immunol.165：6205；He等人(1998)J.Immunol.160：1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274：27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272：10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342：877-883；Foote及Winter(1992)J.Mol.Biol.224：487-499；美國專利第6,329,511號)。

人類化之替代方式係使用在噬菌體上顯示之人類抗體庫或轉基因小鼠中之人類抗體庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14：309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1：837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15：146-156；Hoogenboom及Chames(2000)Immunol.Today 21：371-377；Barbas等人(2001)Phage Display：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17：397-399)。

闡述單鏈抗體及二價抗體(例如參見Malecki等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：213-218；Conrath等人(2001)J.Biol.Chem.276：7346-7350；Desmyter等人(2001)J.Biol.Chem.276：26285-26290；Hudson及Kortt(1999)J.Immunol.Methods 231：177-189；及美國專利第4,946,778號)。提供雙官能抗體(例如參見Mack等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7021-7025；Carter(2001)J.Immunol.Methods 248：7-15；Volkel等人(2001)Protein Engineering 14：815-823；Segal等人(2001)J.Immunol.Methods 248：1-6；Brennan等人(1985)Science 229：81-83；Raso等人(1997)J.Biol.Chem.272：27623；Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Traunecker等人(1991)EMBO J.10：3655-3659；及美國專利第5,932,448號、第5,532,210號及第6,129,914號)。

亦提供雙特異性抗體(例如參見Azzoni等人(1998)J.Immunol.161：3493；Kita等人(1999)J.Immunol.162：6901；Merchant等人(2000)J.Biol.Chem.74：9115；Pandey等人(2000)J.Biol.Chem.275：38633；Zheng等人(2001)J.Biol Chem.276：12999；Propst等人(2000)J.Immunol.165：2214；Long(1999)Ann.Rev.Immunol.17：875)。

抗原之純化並非生成抗體所必需的。可將動物使用攜載所關注抗原之細胞進行免疫。然後可將脾細胞自經免疫動物分離，且脾細胞可與骨髓瘤細胞系融合以產生雜交瘤(例如參見Meyaard等人(1997)Immunity 7：283-290；Wright等人(2000)Immunity 13：233-242；Preston等人，見上文；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163：5157-5164)。

抗體可偶聯至(例如)小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體可用於治療、診斷、套組或其他目的，且包含偶合至(例如)染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠質金)之抗體(例如參見Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146：169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160：3891-3898；Hsing及Bishop(1999)J.Immunol.162：2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168：883-889)。

可獲得用於流式細胞術之方法，包含螢光活化細胞分選(FACS)(例如參見Owens等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry，第2版；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。可獲得用作(例如)診斷試劑之適於修飾核酸(包含核酸引物及探針)、多肽及抗體之螢光試劑(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,MO)。

闡述免疫系統之組織學之標準方法(例如參見Muller-Harmelink(編輯)(1986)人類Thymus：Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams及Wilkins,Phila,PA；Louis等人(2002)Basic Histology：Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。

可獲得用於測定(例如)抗原片段、前導序列、蛋白質摺疊、功能結構域、醣基化位點及序列比對之軟體包裝及資料庫(例如參見GenBank,Vector NTI® Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin包裝(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；DeCypher®(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne等人(2000)Bioinformatics 16：741-742；Menne等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16：741-742；Wren等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68：177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133：17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14：4683-4690)。

實例1：抗CD27抗體之免疫化及選擇 使用CD27 cDNA對小鼠實施免疫

為生成抗hCD27抗體，將編碼hCD27之全長開放閱讀框之cDNA亞選殖至pCI-neo載體(Promega,Madison,WI)中。藉由在CHO-K1細胞(美國模式培養物保藏所，Manassas,VA)中瞬時轉染pCI-neo-hCD27及流式細胞術使用10μg/ml小鼠抗hCD27 IgG1(BD Pharmingen 555439號)、隨後使用山羊抗小鼠IgG1-FITC(1：100)(Southern Biotechnology,Birmingham,AL)來檢查所獲得載體之表現。

藉由基因槍免疫化使用Helios基因槍(BioRad,Hercules,CA)及DNA塗覆之金彈(BioRad)遵循製造商說明書來對小鼠實施免疫。簡言之，使用pCI-neo-hCD27 cDNA及用於小鼠Flt3L及小鼠GM-CSF(以2：1：1比率)(皆來自Aldevron,Fargo,ND)之商業表現載體塗覆1μm金顆粒。使用總共1μg質體DNA來塗覆500μg金顆粒。

具體而言，使用基因槍在7-8週齡雌性BALB/c小鼠之耳朵中實施免疫，兩隻耳朵皆接受3個循環之注射。藉由細胞ELISA在兩次DNA免疫化之後於小鼠血清中檢測到大約1：4,000之抗hCD27效價。在細胞ELISA中，在所有培育步驟之後使用PBST(含有0.01% Tween 20之PBS)進行洗滌步驟。將親代CHO-K1或CHO-K1.hCD27細胞接種(40,000個細胞/孔)於組織培養板中且在37℃下培育過夜。第二天，去除培養基且將細胞與小鼠血清(稀釋液)在37℃下一起培育1小時。接下來，使用PBST洗滌細胞且在37℃下與1：1,000山羊-抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology,1030-05號)一起培育1小時。

隨後，使用PBST將細胞洗滌6次且使用100μl OptiEIA TMB受質(BD Biosciences,Franklin Lake,NJ)觀察抗hCD27免疫反應性。使用100μl 0.5M H₂SO₄停止反應且在460nm及620nm下讀取吸光度。對針對hCD27顯示反應性之小鼠實施最終第四次免疫且在4天後處死。

如先前所闡述來製備紅血球消耗性脾細胞群體(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134)且冷凍於-140℃下。

產生抗hCD27抗體之B細胞之選擇

為選擇產生抗hCD27抗體之B細胞純系，消耗1.5×10⁷紅血球消耗性脾細胞之單核球。藉由在4℃或37℃下結合於已在T25燒瓶中生長至鋪滿之經輻照(3,000 RAD)CHO-K1.hCD27轉染物上來選擇hCD27特異性B細胞。在充分洗滌以消耗非特異性B細胞之後，藉由胰蛋白酶處理根據製造商說明書(Invitrogen，目錄編號25200-056)收集所結合B細胞。接下來，如由Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-134所闡述來培養 B細胞。簡言之，在96孔平底組織培養板中以200μl DMEM F12/P/S/10%BCS之最終體積混合所選B細胞與7.5%(v/v)T細胞上清液及50,000個經輻照(2,500 RAD)EL-4 B5撫育細胞。

在第8天，如上文所闡述藉由細胞ELISA針對hCD27反應性來篩選上清液。另外，測試hCD27反應性上清液至表現於CHO-K1細胞上之恆河獼猴CD27(mmCD27)之結合。[恆河獼猴CD27基因庫登錄號gi109095214]]在細胞ELISA中，在所有培育步驟之後使用PBST(含有0.01% Tween 20之PBS)進行洗滌步驟。將親代CHO-K1、CHO-K1.hCD27或CHO-K1.mmCD27細胞接種(40,000個細胞/孔)於組織培養板中且在37℃下培育過夜。第二天，去除培養基且將細胞與B細胞上清液(稀釋液)在37℃下一起培育一小時。接下來，使用PBST洗滌細胞且在37℃下與1：1,000山羊-抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotechnology，1030-05號)一起培育一小時。隨後，使用PBST將細胞洗滌6次且使用100μl TMB穩定之發色團(Invitrogen，目錄編號SB02)觀察抗hCD27免疫反應性。使用100μl 0.5M H₂SO₄停止反應且在460nm及620nm下讀取吸光度。

隨後，藉由微量-電融合遵循公開程序來使來自上清液之展示結合至hCD27及mmCD27之64 B細胞純系永生化(Steenbakkers等人，1992,J.Immunol.Meth.152：69-77；Steenbakkers等人，1994,Mol.Biol.Rep.19：125-34)。具體而言，混合B細胞10⁶個Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞，且藉由使用DMEM F12培養基洗滌來去除血清。使用鏈黴蛋白酶(Pronase)溶液(Calbiochem，目錄編號4308070.536)將細胞處理3分鐘且使用電融合等莫耳濃度緩衝液(Electrofusion Isomolar Buffer)(Eppendorf，目錄編號53702)進行洗滌。在50μl融合室中藉由30s、2MHz、400V/cm、隨後 10μs、3kV/cm之正方形、高場脈衝之交替電場且再次藉由30s、2MHz、400V/cm之交替電場來實施電融合。

將室內容物轉移至雜交瘤選擇性培養基中且在限制性稀釋條件下平鋪於96孔板中。在融合後第8或9天，如上所述篩選雜交瘤上清液之hCD27反應性。如上所述在細胞ELISA實驗中測試雜交瘤上清液至表現hCD27(A59T)之CHO-K1.mmCD27或CHO-K1細胞之結合。另外，使用均相時間解析螢光(HTRF)分析探究雜交瘤上清液與抗體hCD27.15之交叉競爭。抗體hCD27.15闡述於WO2012/004367中，其係由雜交瘤產生、由ATCC寄存、具有寄存登錄號PTA-11008且具有SEQ ID NO：3之VH區及SEQ ID NO：4之VL區(參照WO2012/004367中之SEQ ID NO)之抗體。在此分析中，將0.6nM生物素化hCD27.15與1.2nM rhCD27-Fc(R&D systems，382-CD-100)、1.33nM鏈黴抗生物素蛋白(Streptavidin)-K(受體)及1.25nM抗人類Fc-D2(供體)一起培育。添加上清液之連續稀釋液。與hCD27.15之交叉競爭使得自供體至受體之能量轉移有所減小且表示為△F((665/615試樣比率-665/615背景比率)/665/615背景比率，其中背景係藉由在不添加rhCD27-Fc下來測定)。在Victor2分光光度計(PerkinElmer)上於615nM及665nM下量測螢光。

最後，測試雜交瘤上清液觸發CD27信號傳導之能力。將使用hCD27-pcDNA及NF-κB-螢光素酶報告基因構築體共轉染之HEK293T細胞暴露於雜交瘤上清液之連續稀釋液24小時。使用Steady Lite Plus High Sensitivity Luminescence Reporter Gene Assay system(PerkinElmer,6016757)及Victor分光光度計(PerkinElmer)量測螢光素酶活性。

接下來，選擇46種雜交瘤用於藉由單輪限制性稀釋進行亞選殖。在篩選結合至CHO-K1.hCD27之限制性稀釋上清液之後，選擇純系進行冷凍且儲存。如上所述進一步分析限制性稀釋上清液至CHO-K1.hCD27之結合、與hCD27.15之交叉競爭及NF-κB刺激，從而容許選擇16種用於無血清抗體產生之雜交瘤。

實例2：抗hCD27抗體之純化及表徵

將穩定雜交瘤在無血清培養基中培養7天且收穫上清液。藉由根據製造商說明書與Mab Select SuRe Prot A樹脂(GE Healthcare 17-5438)混合且自Poly-prep層析管柱(BioRad 731-1550)洗脫來純化抗體。接下來，使用Zeba離心式去鹽管柱(Life Technologies 89889)將抗體去鹽且再緩衝於pH 7.4 PBS(Gibco)中並使用分光光度測定法量化。

隨後在一系列實驗中表徵經純化抗體。如上所述，藉由細胞ELISA測定其結合至CHO-K1.hCD27及CHO-K1.mmCD27之能力。亦藉由HTRF分析探究其是否展示與hCD27.15交叉競爭且探究其在NF-κB螢光素酶報告基因分析中是否能夠誘導CD27信號傳導。另外，如下所述來檢驗抗體是否對原始人類CD8⁺ T細胞具有刺激效應。基本上根據製造商說明書，使用RosetteSep人類CD8+ T細胞富集混合劑(StemCell 15063)及Ficoll梯度離心自血沉棕黃層分離未接觸原始CD8⁺ T細胞，隨後使用BD IMag^TM人類原始CD8⁺ T細胞富集套組(BD目錄號558569)實施基於MACS之陰性選擇。藉由流式細胞術使用抗CD8及抗CD45RA抗體檢查經分離CD8⁺ T細胞之純度及純性。接下來，將其以1.5×10⁵個細胞/孔之濃度接種於96孔板中。使用可溶性抗CD3 mAb(OKT-3)以0.125μg/ml之最終濃度且使用抗CD28 mAb(Sanquin，純系15E8)以1.0μg/ml之最終濃度在經純化抗體之連續稀釋液存在下來刺激細胞。在4天之後，使用碘化丙啶(PI)測定細胞之存活率且藉由流式細胞術測定活化細胞之數量。

基於使用上述實驗所獲得之結果，選擇hCD27.131A抗體以用於進一步之分析。抗體hCD27.131A(或「小鼠親代131A」)係具有SEQ ID NO：7之VH區及SEQ ID NO：8之VL區之小鼠IgG1抗體。

實例3：抗體hCD27.15至hCD27(A59T)及mmCD27之親和力

先前，如WO2012/004367中所闡述來分離激動hCD27.15抗體。對hCD27.15實施人類化以產生hCD27.15-6B(來自WO2012/004367之具有相同CDR區SEQ ID NO：24及25之hCD27.15之人類化形式)及嵌合hCD27.15-c4(小鼠hCD27.15可變區及人類IgG4恆定區，SEQ ID NO：22及23)。如圖1及2中分別所展示，該等形式之hCD27.15抗體不結合至hCD27(A59T)中頻繁出現之SNP且不結合至食蟹猴CD27(亦在本文中稱為MmCD27或恆河獼猴CD27)。與之相比，抗體hCD27.131A特異性選擇結合至hCD27(A59T)中頻繁出現之SNP及食蟹猴CD27。

實例4：hCD27.131A抗體之人類化

使用說明書中所闡述之方法對小鼠hCD27.131A抗體實施人類化。自小鼠hCD27.131A抗體，構築下列人類化可變重鏈：131AVH6、131AVH7、131AVH8、131AVH9(SEQ ID NO：10-13)；且構築下列人類化可變輕鏈：131AVL6、131AVL7、131AVL8、131AVL9(SEQ ID NO：15-18)。製備具有人類IgG1、IgG2或IgG4恆定區之抗體131AVH6VL6、131AVH6VL7、131AVH6VL8、131AVH7VL6、131AVH7VL7、131AVH7VL8、131AVH8VL6、131AVH8VL7、131AVH8VL8及131AVH9VL9。

實例5：結合至細胞表面CD27

在CHO-EXP1細胞或HEK293EXP1細胞中表現131AVH6VL6-hIgG1及131AVH6VL6-hIgG2抗體。在HEK293EXP1細胞中表現1F5 hIgG1(或「1F5」或「1F5IgG1」，具有US2011/0274685中之1F5之可變區)。使用基於細胞之ELISA形式，分析經純化抗體至表現人類CD27之CHOK1細胞、表現人類CD27 A59T之CHOK1細胞之結合及至表現恆河猴CD27之CHOK1細胞的交叉反應性。將表現人類CD27之CHOK1細胞、表現人類CD27 A59T之CHOK1細胞及表現恆河猴CD27之CHOK1細胞平鋪於96孔組織培養板中之50μl DMEM/F12,、10% BCS及慶大黴素(gentamycin)(CHO-K1培養基)。在分析之前兩天以2×10⁴個細胞/孔平鋪細胞或在分析之前一天以4×10⁴個細胞/孔平鋪細胞。在分析之前自孔去除培養基，隨後在100μL新鮮培養基中以起始濃度10μg/mL及8步驟1：4連續稀釋培育mAb。將抗體在室溫下培育30-60分鐘並利用PBS/0.05% Tween 20使用細胞ELISA洗滌方案在Biotek EL405x Select CW板洗滌器上洗滌3次。將50微升檢測抗體(HRP-偶聯山羊抗人類IgG(Jackson，目錄號109-036-098))以1：5000稀釋度添加至CHO-K1培養基中且在室溫下培育30-60分鐘。如上所述洗滌分析板且使用TMB顯影，並使用TMB終止溶液(KPL目錄號50-85-06)或0.1N磷酸終止。在Molecular Devices VersaMax讀板儀上於450nm/650nm下讀取板。使用滴定曲線來測定半最大有效濃度(EC₅₀)。

將來自人類健康志願者之血液作為Palo Alto志願者血液供體程式之一部分收集至含有K2-EDTA(BD vacutainer,BD Biosciences，目錄號367863)之管中。在Bioreclamation處將來自恆河猴之血液收集至含有K2-EDTA(BD vacutainer,BD Biosciences，目錄號367863)之管中，輕微倒置，儲存於4℃中，且在4℃下過夜運輸至Merck Research實驗室，Palo Alto,CA處。在接收後，目測證實血液並無裂解或凝血之明顯體徵。將100微升血液在96孔板(Costar，目錄號3960)中在4℃下於暗處與表型抗體及指示濃度之測試或對照抗體之混合劑一起培育30分鐘。然後藉由與1.7mL氯化銨-鉀紅血細胞裂解溶液(Life Technologies，，目錄號A10492-01)一起培育5分鐘來裂解紅血細胞(RBC)。使用2ml ACK裂解溶液再重複裂解步驟一次，且然後使用300ml ACK裂解溶液再次重複。在添加1.7ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Hyclone，目錄號SH30028.02)之後，然後洗滌細胞。然後將細胞再懸浮於100μL含有0.1μL可固定細胞活力染料eFluor506(eBioscience，目錄號65-0866-18)之PBS中且在4℃下於暗處培育30分鐘。藉由以下方式來洗滌經標記細胞：再懸浮於2mL含有於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Hyclone，目錄號SH30028.02)中之2%胎牛血清(SAFC，目錄號12103C)及2mM EDTA(Life technologies，目錄號15575-038)之染色緩衝液(SB)中，隨後在1300rpm下離心5分鐘。如所闡述使用SB重複洗滌步驟且然後藉由與1%低聚甲醛(Electron Microscopy Sciences，目錄號15710)於暗處在4℃下於PBS中一起培育15分鐘來進行固定。在SB中最終洗滌之後，使用高通量採樣儀在LSR-Fortessa流式細胞儀(BD Biosciences)中獲取試樣且藉由FlowJo軟體(Tree Star Inc)分析數據。

131AVH6VL6-hIgG1結合至經轉染CHO細胞(cELISA)或原代T細胞(流式細胞術)上之細胞表面人類CD27之EC50低於1F5-hIgG1大約4倍(表3)。

在CHO-EXP1細胞或HEK293EXP1細胞中表現人類化131A-hIgG1及131A-hIgG4變體抗體。使用基於細胞之ELISA形式分析經純化抗體至表現人類CD27之CHOK1細胞之結合。將表現人類CD27之CHOK1細胞平鋪於96孔組織培養板中之50μl DMEM/F12、10% BCS(胎牛血清)(CHO-K1培養基)中。在分析之前兩天以2×10⁴個細胞/孔平鋪細胞或在分析之前一天以4×10⁴個細胞/孔平鋪細胞。在分析之前自孔去除培養基，隨後將mAb在100μL新鮮培養基中以起始濃度10μg/mL及8步驟1：5連續稀釋(hIgG4抗體)或以起始濃度50μg/mL及8步驟1：5連續稀釋(hIgG1抗體)培育。將抗體在室溫下培育30-60分鐘並利用PBS/0.05% Tween 20使用細胞 ELISA洗滌方案在Biotek EL405x Select CW板洗滌器上洗滌3次。將50微升檢測抗體(HRP-偶聯山羊抗人類IgG(Southern Biotech，目錄號2014-05)以1：2000稀釋度添加至CHO-K1培養基中且在室溫下培育30-60分鐘。如上所述洗滌分析板且使用TMB顯影，並使用TMB終止溶液(KPL目錄號50-85-06)或0.1N磷酸終止。在Molecular Devices SpectraMax Plus 384讀板儀上於450nm/650nm下讀取板。使用滴定曲線來測定半最大有效濃度(EC₅₀)。

所有人類化131A-hIgG1及131A-hIgG4變體抗體結合至經轉染CHO細胞上之細胞表面人類CD27之EC50(cELISA)皆在131AVH6VL6-hIgG1之EC50之2倍內(表4)，而1F5-hIgG1之EC50大約高於131AVH6VL6-hIgG1 4倍(表3)。

自Stanford血液中心之血沉棕黃層獲得來自人類健康志願者之血液且藉由密度離心使用Ficoll-Plaque Plus(GE healthcare，17-1440-03號)分離末梢血單核細胞(PBMC)。然後藉由與2mL氯化銨-鉀(ACK)紅血細胞裂解溶液(Lifeechnologies，A10492-01號)一起在室溫下培育5分鐘來裂解PBMC部分中之剩餘紅血細胞(RBC)，且然後在10mL含有於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(Hyclone，SH30028.02號)中之2%胎牛血清(SAFC，12103C號)及2mM EDTA(Life technologies，15575-038號)之染色緩衝液(SB)中洗滌，隨後在300g下離心5分鐘。然後使用Vicell自動化細胞計數器(Beckman Coulter 383556號)將細胞計數且將2×10⁵個細胞/孔分佈於U形底96孔板中。然後將細胞再懸浮於100μL含有0.1μL可固定細胞活力染料eFluor506(eBioscience，65-0866-18號)之PBS中且在4℃下於暗處培育30分鐘。藉由再懸浮於150ul染色緩衝液(SB)中、隨後在300g下離心5分鐘來洗滌經標記細胞。然後將細胞再懸浮於100ul含有各種濃度之一級抗CD27抗體之SB中，在4℃下於暗處培育30分鐘，隨後如先前所闡述實施洗滌及離心步驟。接下來，使用PE偶聯之二級小鼠抗人類IgG1抗體(Southern biotech HP6001號)將細胞染色以檢測人類化抗CD27純系，或使用驢抗小鼠Alexa555(Thermofisher A-31570號)進行染色以檢測親代小鼠抗CD27抗體。將細胞在4℃下於暗處培育30分鐘，隨後實施洗滌及離心步驟。接下來，使用表面標記物(CD3、CD4、CD8、CD11b)之表型抗體之混合劑將細胞染色且在4℃下於暗處培育30分鐘，隨後實施洗滌及離心步驟。最後，藉由與100ul BD Cytofix(BD biosciences 554655號)在4℃下於暗處一起培育10分鐘來固定細胞，隨後實施洗滌及離心步驟。在LSR-Fortessa流式細胞儀(BD Biosciences)中使用高通量採樣器獲取試樣且藉由FlowJo軟體(Tree Star Inc)分析數據。

表5：人類化131A抗CD27抗體至人類T細胞中之細胞表面CD27之結合

EC₅₀=半最大有效濃度；SD=標准偏差；MFI=平均螢光強度

EC50=半最大有效濃度；SD=標准偏差；MFI=平均螢光

所有人類化131A-hIgG1變體抗體結合至原代T細胞之EC50(流式細胞術)皆相當(在10%內)或低於131AVH6VL6-hIgG1之EC50(表5)，而1F5-hIgG1之EC50大約高於131AVH6VL6-hIgG1 5倍(表3)。

實例6：抗CD27抗體結合至人類CD27重組蛋白之親和力測定

藉由表面電漿共振使用Biacore T200系統(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)量測抗人類CD27抗體131AVH6VL6-hIgG1及131AVH6VL6-hIgG2之動力學結合活性。經由胺偶合化學將大約400RU人類CD27-Fc融合蛋白、大約2000RU人類CD27 A59T-Fc融合蛋白或大約300RU恆河猴CD27-Fc融合蛋白固定於Series S CM5感測器晶片(目錄號BR-1005-30)上。使用HBS-EP+緩衝液(BR-1006-69)作為運行緩衝液且流速為50μL/min。將不同濃度之131AVH6VL6-hIgG1及131AVH6VL6-hIgG2(介於4.1nM至400nM之間)注射於抗原表面上。抗體注射持續180秒且在注射之後監測解離900秒。在每一注射循環後，使用30秒注射之3M MgCl₂再生抗原表面。

藉由扣除來自空白表面之反應及來自緩衝液注射之反應來「雙重參照」感測圖且用於分析締合(ka)及解離(kd)之速率常數及平衡解離常數KD。利用1：1蘭格繆爾(Langmuir)結合模型使用Biacore T200評估軟體(2.0版)來擬合所得數據組。表6匯總抗人類CD27抗體對人類CD27-Fc融合蛋白、人類CD27 A59T-Fc融合蛋白及恆河猴CD27-Fc融合蛋白之親和力。

使用Biacore 4000系統(Biacore,GE Healthcare,Piscataway,NJ)實施表面電漿共振(SPR)實驗以測定人類化抗CD27.131A hIgG1及hIgG4變體對加His9G標籤之人類及食蟹猴CD27重組蛋白(「His9G」，揭示為SEQ ID NO：69)(內部，HEK293細胞之瞬時質體轉染)之動力學結合活性。遵循製造商方案經由胺偶合小鼠抗人類IgG(Fc)抗體(人類抗體捕獲套組，GE/Biacore，目錄號BR-1008-39)來製備Series S CM5感測器晶片(GE/Biacore，目錄號BR-1005-30)之表面，從而產生約9000RU之固定抗體。在25℃下於經過濾及脫氣之pH 7.4 HBS-EP+運行緩衝液(GE/Biacore，目錄號1006-69)中實施分析。在10uL/分鐘之流速下以6.6nM(1ug/ml)經120秒捕獲抗CD27.131A嵌合體及變體。使用經抗人類Fc抗體修飾但缺乏CD27抗體之流動槽斑點作為參考。將加His9G標籤之人類或食蟹猴CD27蛋白(「His9G」，揭示為SEQ ID NO：69)之5點2倍稀釋系列(3.13nM至50nM)經180秒(締合期)以30uL/分鐘注射於抗體表面上，隨後施加600秒之緩衝液流(解離期)。在每一注射循環之後，使用30秒注射之3M MgCl₂再生晶片表面。

藉由扣除來自空白表面之反應及來自緩衝液注射之反應來雙重參照數據且用於分析締合(k _a)及解離(k _d)之速率常數及平衡解離常數K _D。利用蘭格繆爾1：1結合模型使用Biacore 4000 BIA評估軟體1.0版(GE/Biacore)擬合所得數據組。表7匯總人類化抗CD27.131A hIgG1及hIgG4變體對人類及食蟹猴CD27/His蛋白之親和力。

實例7：131AVH6VL6-hIgG1與1F5-hIgG1相比在小鼠腫瘤模型中之抗腫瘤活性

小鼠：藉由以下方式來生成B6.Cg-Cd27^tm1(CD27)Jbo/Tac小鼠(huCD27KI小鼠)：使用人類CD27基因之細胞外結構域交換小鼠CD27基因之細胞外結構域，隨後回交至C56BL6/J背景直至1449 SNP分析展示97.95%-98.99%之C57BL/6接受者基因體為止。自維持於Taconic實驗室(Germantown,NY)之Merck繁殖群獲得平均體重為20.3克(17.5-23.5g範圍)之大約8至12週齡雌性huCD27KI小鼠。隨意提供習用動物混合飼料及水。

抗體試劑：自內部來源獲得呈冷凍(-80℃)儲備液形式之單株抗體。藉由重組細胞系產生131AVH6VL6-hIgG1抗體及1F5-hIgG1。自雜交瘤細胞培養液產生小鼠IgG2a同型對照(同型對照)且其對感染性黏液囊疾病病毒VP2-4-3_GV具有特異性。

抗體試劑之調配物：調配物緩衝液對每一抗體具有特異性以穩定蛋白質且防止沈澱。調配物如下：同型對照：20mM乙酸鈉，9%蔗糖，pH 5.5；131AVH6VL6-hIgG1：20mM乙酸鈉，9%蔗糖，pH 5.5；1F5-hIgG1：10mM磷酸鈉+75mM NaCl+3%蔗糖，pH 7.4。

腫瘤細胞系製備及植入：MC38係衍生自C57BL6/J小鼠結腸腺癌之細胞系。將來自冷凍儲備液之MC38細胞以單層培養液形式在活體外於37℃下在5% CO₂空氣氣氛中維持於補充有10%胎牛血清(Hyclone目錄SH30088.03)之DMEM培養基(Cellgro目錄10-013CV)中。將於100μL體積DMEM基礎培養基中之1×10⁶個對數期及亞鋪滿之MC38細胞經皮下(SC)注射於每一小鼠之背部右側腹中。首先使用電子剪毛器在用於植入之區域中將小鼠剃毛。

腫瘤量測及體重：在第一劑量前一天量測腫瘤且隨後每週量測兩次。使用電子卡尺量測腫瘤長度及寬度且使用公式體積(mm³)=0.5×長度×寬度²測定腫瘤體積，其中長度係最長之尺寸。週期性稱重小鼠以監測總體健康狀況。在治療之前，將小鼠稱重且量測來自個別小鼠之腫瘤。為防止偏離，去除重量或腫瘤體積之任何離群值且將剩餘小鼠分配至具有等效平均腫瘤大小之治療組。在具MC38腫瘤小鼠中之平均腫瘤體積達到約85mm³(70-100mm³範圍)時，在植入後約5天，開始投藥。如下所述向動物投與抗體。

投藥溶液製備、投與及分析：將擬在動物模型中測試之抗體之冷凍儲備液解凍且轉移至濕冰中。為避免重複冷凍解凍，將每一小瓶之儲備液解凍一次且儲存於4℃下。在解凍後，在一個月內使用抗體。在每一投藥之前，將每一抗體之儲備溶液在適當稀釋劑中稀釋至標稱濃度且立即投用。將投藥溶液之等分試樣快速冷凍於乾冰中且儲存於-80℃下直至分析。使用基於多陣列技術(電化學發光檢測及圖案化陣列之組合)之Meso Scale Discovery(MSD^®,Rockville,MD)平臺來評價投藥溶液。

投藥及結果：以5mg/kg劑量每3-4天向具MC38腫瘤huCD27敲入小鼠經腹膜腔內投與131AVH6VL6-hIgG1、1F5-hIgG1或同型對照且總共7個劑量。在投藥後，繼續監測動物且每週兩次量測腫瘤體積。如由圖4中所展示之結果所顯示，131AVH6VL6-hIgG1之抗腫瘤反應大於1F5-hIgG1之抗腫瘤反應。

實例8：131AVH6VL6-hIgG1與抗PD-1抗體之組合在小鼠腫瘤模型中之抗腫瘤活性

小鼠：自維持於Taconic實驗室(Germantown,NY)之繁殖群獲得平均體重為21.21克(18.06-23.21克範圍)之大約10至13週齡雌性B6.Cg-Cd27^tm1(CD27)Jbo/Tac(huCD27KI)小鼠。隨意提供習用動物混合飼料及水。

抗體試劑：自內部來源獲得呈冷凍(-80℃)儲備液形式之單株抗體。藉由重組細胞系產生131AVH6VL6-hIgG1及抗鼠類PD-1小鼠IgG1抗體(muDX400)。同型對照係對感染性黏液囊疾病病毒VP2-4-3_GV具有特異性之小鼠IgG2a且自雜交瘤細胞培養產生。

抗體試劑之調配物：將所有抗體調配於20mM乙酸鈉、9% pH 5.5蔗糖中以穩定蛋白質且防止沈澱。

腫瘤細胞系製備及植入：MB49係衍生自C57BL6/J小鼠膀胱癌之腫瘤細胞系。將來自冷凍儲備液之MB49細胞以單層培養液形式在活體外於37℃下在5% CO₂空氣氣氛中維持於補充有10%胎牛血清(Hyclone目錄SH30088.03)之DMEM培養基(Cellgro目錄10-013CV)中。將於100μL體積DMEM基礎培養基中之5×10⁵個對數期及亞鋪滿之MB49細胞經皮下(SC)注射於每一小鼠之背部右側腹中。首先使用電子剪毛器在用於植入之區域中將小鼠剃毛。

腫瘤量測及體重：在第一劑量前一天量測腫瘤且隨後每週量測兩次。使用電子卡尺量測腫瘤長度及寬度且使用公式體積(mm³)=0.5×長度×寬度²測定腫瘤體積，其中長度係最長之尺寸。週期性稱重小鼠以監測總體健康狀況。在治療之前，將小鼠稱重且量測來自個別小鼠之腫瘤。為防止偏離，去除重量或腫瘤體積之任何離群值且將剩餘小鼠分配至具有等效平均腫瘤大小之治療組。在具MB49腫瘤小鼠中之平均腫瘤體積達到約91.56mm³(80.94-102.89mm³範圍)時，在植入後約7天，開始投藥。如下所述向動物投與抗體。

投藥溶液製備、投與及分析：將擬在動物模型中測試之抗體之冷凍儲備液解凍且轉移至濕冰中。為避免重複冷凍解凍，將每一小瓶之儲備液解凍一次且以足以使用一次之體積製備等分試樣。將聚丙烯、低黏著管用於此目的。等分試樣快速冷凍於乾冰中且儲存於-80℃下。在每一投藥之前，將一份等分試樣解凍且在適當稀釋劑中稀釋至標稱濃度並立即投用。將投藥溶液之等分試樣快速冷凍於乾冰中且儲存於-80℃下直至分析。使用基於多陣列技術(電化學發光檢測及圖案化陣列之組合)之Meso Scale Discovery(MSD^®,Rockville,MD)平臺來評價投藥溶液。

投藥及結果：以5mg/kg劑量向具MB49腫瘤huCD27 KI小鼠經腹膜腔內投與131AVH6VL6-hIgG1、muDX400、131AVH6VL6-hIgG1+muDX400或同型對照。每3-4天投與131AVH6VL6-hIgG1且總共6個劑量。每週投與muDX400且總共4個劑量。在投藥後，繼續監測動物且每週兩次量測腫瘤體積。如由圖5中所展示之結果所顯示，單獨之131AVH6VL6-hIgG1或muDX400具有最小抗腫瘤反應，然而，與131AVH6VL6-hIgG1+muDX400之組合療法使得顯著增強抗腫瘤效能。

實例9：NF-κB活化分析

細胞：藉由穩定轉染方法使用Zeocin藥物選擇(293FT-NF-

B-螢光素酶細胞)預先產生含有NF-κB-螢光素酶報告基因構築體(pNiFty2-Luc,Invivogen)之HEK293FT人類胚胎腎細胞。

細胞培養：在補充有10%熱失活胎牛血清(Hyclone)、1X Pen/strep/麩醯胺酸(Cellgro)及200ug/mL Zeocin(Life Technologies)之DMEM+2mM麩醯胺酸(Cellgro)中生長293FT-NF

B-螢光素酶細胞。

抗體：藉由在CHO-EXPI或293-EXPI細胞中瞬時表現來產生hCD27.131A IgG1及IgG4抗體。藉由293-EXPI細胞中之瞬時表現來產生1F5 IgG1。藉由CHO細胞中之穩定表現來產生hCD27.15-4B IgG4。藉由標準蛋白質A方法純化所有抗體。

轉染：將編碼用於人類CD27 WT(參考序列：NP_001233)、人類CD27變體p.Ala59Thr(「A59T」，等位基因頻率：0.2，參考序列：rs25680)或恆河猴/食蟹猴CD27(參考序列：XP_001104337.1/XP_005569963.1)之蛋白質之全長cDNA選殖至pCI-neo表現載體中。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)將CD27質體瞬時轉染至293FT-NF

B-螢光素酶細胞中。使用流式細胞術證實所有CD27構築體之表面表現。

使用抗體之刺激：在瞬時轉染CD27構築體之後大約16-20h，使用細胞解離緩衝液(Millipore)或TyrpLE Express(Life)收穫細胞，加以計數且以5,000-10,000個細胞/孔再平鋪於96孔透明底發光板(Corning)中之Opti-MEM(Life Technologies)中，且使其在37℃下靜置/黏附30-180分鐘，然後使用可溶性抗CD27抗體進行刺激。然後如所指示將可溶性抗hCD27 hCD27.131A IgG1或hCD27.131A IgG4(最高劑量10μg/ml)、1F5 IgG1(最高劑量10μg/ml)及hCD27.15-4B IgG4(最高劑量160μg/ml)抗體以4倍或10倍稀釋系列一式三份添加至細胞中，將細胞在37℃下培育16-20小時。

NF-κB活性分析：在與抗體在37℃下一起培育16-20h之後，將細胞在室溫下靜置5分鐘，然後添加Bright-Glo(Promega)。然後使板避光且在室溫下培育10分鐘，然後在發光計/發光讀板儀(Molecular Device-LJL BioSyst或Envision system)上進行分析。基於無抗體下之條件來計算關於抗體之倍數變化值。使用倍數變化值以使用GraphPad Prism軟體實施劑量反應之非線性曲線擬合[模型：log(激動劑)vs.反應-可變斜率(4參數)，不施加約束條件]。

比較CD27同種型中之可溶性活性，hCD27.131A VH6VL6 huIgG1顯示在所有同種型中誘導NF-κB活性之最高潛力(圖6)。hCD27.131A VH6VL6 huIgG1對WT及A59T人類CD27展示相當功效(平均值分別為EC50 2.22及4.72nM)，且對恆河猴CD27展示大約7倍強之功效(平均值為0.29nM)(表8)。與之相比，1F5 huIgG1在呈可溶性形式時並不始終具有活性且由此不能計算之1F5 huIgG1 EC50值(圖6)。

hCD27.15-4B IgG4(來自WO2012/004367之具有相同CDR區SEQ ID NO：41及42之hCD27.15之人類化形式)始終針對表現hCD27 WT之細胞展示活性，但並不針對表現CD27 A59T或表現恆河猴CD27之細胞展示活性。此表明，hCD27.15-4B並不對CD27之A59T等位基因(總體以20%之頻率存在)具有活性。對於親代hCD27.15純系看到相同趨勢(數據未展示)。另外，hCD27.15-4B IgG4 mAb誘導NF-κB活性之功效小於hCD27.131AVH6VL6-huIgG1。在該等實驗中，hCD27.15-4B IgG4即使在160μg/ml之劑量下亦不誘導NF-κB信號傳導之穩態且由此EC50值不可計算。表9展示在單一2.5μg/ml濃度下NF-κB活化之倍數變化值以闡釋較低劑量下之活性差異。舉例而言，在2.5μg/ml下於WT CD27表現細胞中，hCD27.131A VH6VL6 huIgG1展示高於hCD27.15-4B IgG4(平均倍數變化：2.52±.45 vs.1.82±.38，配對t-測試p值：0.01)或高於1F5 huIgG1(倍數變化：1.34±.29，p值：0.001)之功效。總而言之，該等數據展示，hCD27.131A VH6VL6 huIgG1展示針對WT CD27及CD27之A59T微小變體等位基因以及恆河猴CD27之明顯NF-κB螢光素酶活性，且闡釋hCD27.131A VH6VL6 huIgG1展示高於1F5 huIgG1之活性及強於hCD27.15-4B IgG4之活性之程度。

測試若干人類化hCD27.131A變體之CD27誘導之NF-κB螢光素酶活性(圖7)。所有人類化變體皆展示高於1F5 IgG1之活性。嵌合小鼠-人類hCD27.131A抗體之直接對比展示嵌合huIgG1或huIgG4框架對NF-κB螢光素酶活性之類似活化(圖7A)。總而言之，所有人類化hCD27.131A huIgG1變體之行為皆彼此類似，且展示遠高於1F5 huIgG1之NF-κB螢光素酶活性(10μg/ml中值倍數變化：5.32 vs.2.23，圖7A)。類似地，所有人類化hCD27.131A IgG4變體皆展示高於1F5 huIgG1之活性(10μg/ml中值倍數變化：3.06 vs.1.73)，其中較大活性範圍係在個別131A IgG4抗體之間所觀察(圖7B)。

實例10：原代人類及恆河猴T細胞共刺激分析中之生物活性

根據製造商說明書使用RosetteSep人類CD8+ T細胞富集混合劑(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)自血沉棕黃層獲得人類富集CD8+ T細胞。簡言之，將血沉棕黃層與抗體混合劑一起培育，使用PBS+2% FBS稀釋，然後在浮力密度培養基Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,United Kingdom)上離心以丸化不期望細胞以及RBC。然後自血漿及密度培養基界面去除富集CD8+ T細胞，充分洗滌且使用ACK裂解緩衝液(Thermo Fisher,MA,USA)裂解。藉由使用人類原始CD8+ T細胞富集組(BD Biosciences,CA,USA)進一步處理試樣來分離原始CD8+ T細胞。使用新鮮細胞或經冷凍用於將來實驗中。

對於活化分析而言，將原始CD8+細胞在DMEM-F12(Gibco,CA,USA)、5%熱失活人類血清(Sigma,MO,USA)、50μM 2-巰基乙醇(Sigma,MO,USA)、100U/ml青黴素(penicillin)及100ug/ml鏈黴素(streptomycin)(Lonza,Switzerland)中再懸浮至7.5×10⁵個細胞/ml。將1.5×10⁵個細胞在亞最佳劑量之αCD3(0.025-0.05μg/ml純系OKT3,Biolegend,CA,USA)及αCD28(1μg/ml純系15E8,Cell Sciences,MA,USA)存在下與單獨之可溶性131AVH6VL6-hIgG1、1F5-hIgG1、同型或抗CD3/抗CD28一起在37℃、5% CO₂培育器中於平底96孔板中培養3天。在刺激後，使用PBS洗滌細胞，且然後使用可固定細胞活力染料(eBioscience,CA,USA)在4℃下染色30分鐘。藉由洗滌去除過量染料且使用TruStain FcX(Biolegend,CA,USA)阻斷細胞。然後將細胞與表型抗體(FITC小鼠抗人類CD69(純系FN50,BD Biosciences,CA,USA)、PE/CF594小鼠抗人類CD4(純系L200,BD Biosciences,CA,USA)、PE/Cy7小鼠抗人類CD25(純系M-A251,BD Biosciences,CA,USA)及 Pacific Blue小鼠抗人類CD3(純系SP34-2,BD Biosciences,CA,USA)及APC/Cy7小鼠抗人類CD8a(純系RPA-T8,Biolegend,CA,USA))一起在4℃下培育30分鐘，然後洗滌且使用1%低聚甲醛固定。藉由流式細胞術在BD LSRFortessa^TM(BD Biosciences,CA,USA)上針對表面標記物CD25及CD69量測T細胞活化。藉由係CD25+CD69+之CD8+ T細胞%來量測CD8+ T細胞活化。

131AVH6VL6-hIgG1在一級CD8+ T細胞分析中以可溶性形式呈現活性(相對於同型對照平均增加2.3倍)，而1F5-hIgG1則不能(圖14)。

實例11：一級人類腫瘤培養液中之生物活性

根據州及聯邦規則自商業供應商獲得來自患有非小細胞肺癌(NSCLC)、腎細胞癌(RCC)及頭頸癌(H&N)之患者之人類腫瘤樣品。

消解人類腫瘤以生成混合腫瘤TIL

在操作場所收集新鮮腫瘤組織且在4℃下於AQIX培養基(AQIX,UK)中過夜運輸至Merck Research實驗室，Palo Alto,CA。藉由使用解剖刀細切自腫瘤解離單細胞，隨後在37℃下於含有10mL具有100mg/mL I型膠原酶(Invitrogen，目錄號17100-017)及10,000U/mL DNase I (Worthington Biochemical，目錄號LS002060)之達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)(Cellgro，目錄號10-013-CV)之消解培養基中培育30分鐘。將消解試樣上下吸取若干次，經由70-μM過濾器過濾，並在DMEM完整培養基中洗滌。若細胞存活率小於30%，則實施Ficoll-密度梯度分離以富集活細胞。對來自腫瘤消解之混合細胞以1000×g實施Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare，目錄號17-1440-03)密度梯度離心20分鐘。自培養基：Ficoll界面收集富集活細胞並使用達爾伯克氏磷酸鹽緩衝鹽水(Dulbecco’s phosphate-buffered saline，DPBS)洗滌2次。

腫瘤TIL培養上清液中針對腫瘤浸潤T細胞活化之IFNγ檢測

在96孔圓底板中培養總共0.1×10⁶/孔之腫瘤消解細胞且使用10ng/ml可溶性抗CD3(BioLegend，純系OKT3，目錄號371304)在指示濃度之131AVH6VL6-hIgG1(CHO-EXPI細胞之瞬時質體轉染-懸浮培養液)、抗PD1(派姆單抗)或hCD27.15-4BIgG4、IF5-hIgG1或同型(抗PCSK9，IgG1及IgG4)存在下進行刺激。在第6天收集上清液且使用人類IFNγ組織培養套組(MSD，目錄號K151AEB)量測IFNγ。

因CD27表現於原始T細胞以及記憶T細胞上，故假設131AVH6VL6-hIgG1可在腫瘤浸潤之記憶T細胞中具有共刺激效應。為評估131AVH6VL6-hIgG1活化人類腫瘤免疫阻抑性環境中之T細胞之能力，使用來自人類腫瘤消解之混合細胞群體進行實驗。在10ng/ml抗CD3存在下，將0.1、1、10及20μg/ml 131AVH6VL6-hIgG1添加至單一經消解腫瘤組織細胞培養液中保持6天。在6天上清液中量測iIFNγ。來自20種腫瘤之結果展示於圖8中。131AVH6VL6-hIgG1以劑量依賴性方式增強人類腫瘤TIL之抗CD3誘導之IFNγ產生，其中在10μg/ml及20μg/ml下具有統計學顯著變化(分別為p<0.001及p<0.01)。亦藉由在來自13種腫瘤之TIL IFNγ產生分析中比較兩種其他抗CD27 mAb h27.15-4BIgG4及IF5-IgG1來研究131AVH6VL6-hIgG1(圖9)。131AVH6VL6-hIgG1係展示統計學顯著增加抗CD3誘導之IFNγ產生之唯一mAb(p<0.05)。

實例12：用於鑑別抗CD27抗體之表位之丙胺酸掃描

使用CHO-K1細胞、瞬時轉染之pCI-neo空載體、pCI-neo.hCD27及若干pCI-neo.CD27Ala突變體構築體測定若干抗hCD27抗體結合至一系列hCD27丙胺酸突變體之能力。在6孔板中每孔使用4μg質體DNA及10μl Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen,11668-019)(二者皆稀釋於OPTI-MEMI(Gibco，目錄號31985))根據製造商說明書來實施轉染。

在將轉染細胞在37℃及5% CO₂下於加濕培育器中培育一天之後，在DPBS中洗滌一次，使用400μl無酶細胞解離溶液(Gibco,13151-014)剝離且收集於800μl冰冷MACS緩衝液(Miltenyi Biotec,130-091-221)中。將剝離細胞以大約1.2×10⁵個細胞/孔轉移至96孔圓底孔板中。在旋轉細胞之後，棄除上清液且將細胞再懸浮於殘餘體積中，添加一級抗體且在4℃下培育30分鐘。使用DPBS/BSA 1%將細胞洗滌三次，隨後離心，棄除上清液且再懸浮於殘餘體積中。藉由在4℃下使用山羊-抗小鼠IgG-FITC(BD Bioscience,349031,2μl/孔)或山羊-抗人類IgG-FITC(γ-鏈特異性)(SouthernBiotech,2040-02,2μl/孔)染色30分鐘來檢測一級抗體之結合。在洗滌一次之後，使用HTS讀板儀(FACS Canto II)及FlowJo軟體檢測抗體結合以用於數據分析。自分析排除碎屑、死細胞及雙聯體。將結合表示為相對於結合至hCD27之抗體(將其設定於100%)擬合C信號之幾何平均值。

如圖10中所展示，使胺基酸P8、H36、R37及K38發生突變使得小鼠hCD27.131A不能結合至hCD27，如由深陰影所指示。hCD27.131A展示來自hCD27.15,1A4及1F5IgG1之不同結合特徵。

實例13：藉由X射線晶體結構對CD27及131AVH6VL6-hIgG1之表位定位複合物形成及純化：

藉由以2：1之莫耳比率將06AOV(CD27)及01APN(Fab)在4℃下分別培育48小時來形成CD27/131AVH6VL6Fab複合物。然後將反應混合物加載於Superdex 200 HiLoad 16/600(120mL)管柱上且基於SEC-UPLC分析彙集餾分。然後針對25mM Tris。100mM pH 8.0 NaCl透析複合物池。離心透析材料並藉由22um注射器過濾器進行過濾。

CD27+Fab結晶程序

藉由將6.25uL 40mM氯化鎘儲備液添加至於由25mM pH=8.0 Tris及100mM氯化鈉組成之緩衝液中之25uL等分試樣之CD27-Fab複合物來製備結晶用試樣。最終試樣蛋白質濃度為12.6mg/ml且氯化鎘濃度為8.0mM。將試樣在處理之前在室溫下保持大約1小時。

使用Topaz自由界面擴散微流體系統、Topaz 4.96晶片(Fluidigm)及市售篩實施初始篩選。將晶片設定於室溫下且隨後保持於18℃下。選擇下列條件以用於轉變成蒸氣擴散系統：篩：Rigaku Wizard Cryo 1-2(目錄編號1008649)

條件：0.1M pH=8.0咪唑+40% v/v PEG 400

篩：Jena Bioscience Classic HTS1(目錄編號CS-201L)

條件：0.1M pH=8.5 Tris+30% v/v PEG 3000+0.2M硫酸鋰

使用坐滴蒸氣擴散方法產生用於X射線繞射研究之晶體。使用調配器(Formulatrix)分配由100mM pH 8.0 Tris-8.5及30-50% v/v PEG 400組成之板孔條件。在室溫下使用Oryx4(Douglas Instruments)分配由等體積之孔及蛋白質(0.22uL+0.22uL)組成之滴液且隨後保持於18℃下。使晶體生長一個月時段。

亦藉由添加在由100mM pH=8.5 Tris及40% v/v PEG 400組成之緩衝液中製得之晶種儲備液來產生晶體。在室溫下使用Oryx4(Douglas Instruments)分配由0.30uL蛋白質+0.20uL孔+0.1uL晶種儲備液組成之滴液且隨後保持於18℃下。使晶體生長一個月時段。

晶體收穫及數據收集

使用0.3mm網目Litholoop(Molecular Dimensions Ltd,Suffold,UK)自結晶滴液收穫來自結晶試驗4482號液滴F 1之晶體且低溫冷凍於液氮中。在Argonne National實驗室(ANL,Lemont,IL)於先進光子源(Advanced Photon Source，APS)之工業大分子晶體學協會(Industrial Macromolecular Crystallography Association，IMCA)光束線扇區17下實施數據收集。在1.0Å波長下使用Pilatus 6M檢測器(Dectris AG,Baden-Dättwil,Switzerland)收集數據。使用autoPROC自動化處理軟體藉助XDS(用於索引及積分)、AIMLESS(用於縮放)、POINTLESS(用於數據分析)及STARANISO(用於施加各向異性繞射限制)來處理數據。晶胞參數為a=114.20，b=126.10，c=131.600，α=90°，ß=90°，γ=90°，空間群C222(1)。

結構闡釋及細化

藉由分子置換(Molecular Replacement)使用MOLREP程式來解析結構。PDB條目2XTJ及5TLS分別用作Fab及抗原之搜尋探針。使用預設參數，首先定位VH+VL區(Rf/σ=7.91,TF/σ=10.83)，然後使用可變區作為轉譯之固定輸入模型來定位CH1+CL片段(Rf/σ=11.56,TF/σ=23.70)。然而，在此階段，抗原不能明確放置(最佳「解決方案」Rf=4.73,Tf/σ=3.77)。然後使用autoBUSTER軟體細化該模型。儘管R_free及R_work之值較高(分別為41.4%及38.4%)，但電子密度圖展示與用作探針之Fab與最終結構之間之大部分序列取代及插入或缺失一致。使用程式COOT校正該等值。使用autoBUSTER將所得結構再次細化至R_free及R_work分別為34.3%及30.8%。使用此模型作為固定坐標再次嘗試分子代替，此產生用於轉譯功能之明確解決方案(TF/σ=17.67)。額外重建及細化步驟產生R_free及R_work分別為22.4%及20.0%之最終值。最終模型含有CD27殘基6至88及94至100、Fab輕鏈殘基1至212、Fab重鏈殘基1至131及137至217、6個鎘陽離子、一個PEG 400分子及288個水。並未發現有序醣基化位點。

Fab-抗原相互作用之分析

下表列示Fab與抗原之間之所有接觸(H鍵以粗體「H」表示，鹽橋以粗斜體(「SB」)表示，將3.30Å之截止值用於極性相互作用)：

除諸多凡得瓦(van der Waals)接觸外，在界面中具有若干H鍵及鹽橋。互補位涉及來自每一輕鏈及重鏈之所有3個互補測定區(CDR)。然而，該表位限於第1富半胱胺酸結構域(CRD)。除靠近N-末端、殘基8至11及殘基17之區段外，所有接觸皆涉及殘基34至38(參見圖11及12)。在形成抗原-抗體複合物後埋入之表面總量分別係CD27及Fab溶劑可及表面之679Å²及616Å²(參見圖11)。

實例14：抗CD27抗體結合至hCD27之競爭研究

將穩定表現hCD27之CHO-K1細胞以4×10⁴個細胞接種於96孔板(Nunc,167008)中/孔且在37℃及5% CO₂下於加濕培育器中進行培育。使抗hCD27抗體之連續稀釋液在37℃及5% CO₂下結合2小時。接下來，以固定濃度添加第二抗hCD27抗體且在37℃及5% CO₂下培育1小時。使用 ELx405 BioTEK洗滌器在DPBS/0.05% Tween中洗滌細胞三次。藉由添加山羊抗人類-IgG-HRP(Jackson Immuno Research,109-035-088，1：1000稀釋度)或山羊抗小鼠-IgG-HRP(Southern Biotech,1030-05，1：5000稀釋度)來檢測以固定濃度添加之抗hCD27抗體之結合。如上所述，將板在37℃及5% CO₂下培育1小時並洗滌三次。添加TMB穩定之色原體(Invitrogen,SB02)且將細胞在室溫下培育大約10分鐘。藉由添加等體積之0.5M H₂SO₄來終止反應。最後，使用iEMS讀數儀MF(Labsystems)或Envision讀板儀(Perkin Elmer)量測460nm及620nm下之吸光度。

為測定小鼠hCD27.131A及小鼠hCD27.15是否能夠與1F5IgG1交叉競爭結合至hCD27，實施基於細胞之競爭ELISA。使1F5IgG1之連續稀釋液結合至表現於CHO-K1細胞上之hCD27。接下來，檢測小鼠hCD27.131A或小鼠hCD27.15之結合。亦實施逆向性實驗，其中使小鼠hCD27.131A或小鼠hCD27.15之連續稀釋液進行結合，隨後檢測1F5IgG1之結合。如圖13中所展示，小鼠hCD27.131A不干擾1F5IgG1之結合，從而指示該兩種抗體結合至hCD27上之不同表位。針對小鼠hCD27.15獲得類似數據，其展示不與1F5IgG1競爭結合至hCD27。僅在容許1F5IgG1首先結合時，可在高濃度下觀察到小鼠hCD27.15結合之中等損失。

本申請案主張美國臨時申請案第62/399,837號及美國臨時申請案第62/546,214號之優先權，該等申請案之全部內容以引用方式併入本文中。本文所引用之所有參考文獻皆以引用方式併入，其併入程度如同每一個別出版物、資料庫條目(例如基因庫序列或GeneID條目)、專利申請案或專利皆特別且個別地指示以引用方式併入一般。申請者意欲依照37 C.F.R.§1.57(b)(1)使以引用方式併入之此聲明涉及每一及所有個別出版物、資料庫條目(例如基因庫序列或GeneID條目)、專利申請案或專利(其每一者皆按照37 C.F.R.§1.57(b)(2)明確鑑別)，即使該引用未緊隨以引用方式併入之專用聲明。以引用方式併入之專用闡述(若存在)包含在說明書內並不以任一方式減弱以引用方式併入之此一般闡述。本文中參考文獻之引用並不意欲承認參考文獻係相關先前技術，其亦不欲構成對該等出版物或文件之內容或日期之任何承認。就參考文獻提供所主張術語之與本說明書所提供定義衝突之定義而言，本說明書中所提供之定義應用於詮釋所主張發明。

本發明在範圍上並不受限於本文所闡述之特定實施例。實際上，除本文中所闡述之修改外，熟習此項技術者依據前述說明及附圖亦將明瞭本發明之各種修改。該等修改意欲屬隨附申請專利範圍之範圍。

認為前述書面說明足以使得熟習此項技術者能夠實踐本發明。除本文所展示及闡述者外，熟習此項技術者根據上述說明將明瞭本發明之各種修改，且該等修改屬隨附申請專利範圍之範圍內。

<110> 美商默沙東藥廠(MERCK SHARP & DOHME CORP.) 荷蘭商默沙東荷蘭藥廠(MERCK SHARP & DOHME B.V.)

<120> 抗CD27抗體

<140> TW106132858

<141> 2017-09-25

<150> US 62,546,214

<151> 2017-08-16

<150> US 62/399,837

<151> 2016-09-26

<160> 78

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)..(4)

<223> /代替=「V」或「L」或「I」或「G」或「A」或「S」或「T」

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(5)

<223> /注意：「序列中所給出之變體殘基相對於變體位置之注釋中之彼等殘基並無優先性」

<400> 1

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(6)

<223> 除M或C外之任一胺基酸

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> 除C外之任一胺基酸

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (9)..(9)

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(2)

<223> 除M或C外之任一胺基酸

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> 除M或C外之任一胺基酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(5)

<223> 除M、C或P外之任一胺基酸

<400> 6

<210> 7

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 8

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 智人

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<223> 除M或C外之任一胺基酸

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<221> MOD_RES

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<223> 除M或C外之任一胺基酸

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<221> MOD_RES

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<223> 除M,C或P外之任一胺基酸

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<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(106)

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<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(116)

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

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<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> VARIANT

<222> (77)..(77)

<223> /代替=「M」或「V」或「I」

<220>

<221> VARIANT

<222> (78)..(78)

<223> /代替=「Q」

<220>

<221> VARIANT

<222> (79)..(79)

<223> /代替=「P」

<220>

<221> VARIANT

<222> (82)..(82)

<223> /代替=「V」或「L」或「I」或「T」或「A」

<220>

<221> VARIANT

<222> (84)..(84)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> VARIANT

<222> (90)..(90)

<223> /代替=「Y」

<220>

<221> VARIANT

<222> (91)..(91)

<223> /代替=「Q」

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(106)

<400> 35

<210> 36

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 36

<210> 37

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 37

<210> 38

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 38

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (20)..(20)

<223> /代替=「I」

<220>

<221> VARIANT

<222> (38)..(38)

<223> /代替=「R」

<220>

<221> VARIANT

<222> (76)..(76)

<223> /代替=「A」

<220>

<221> VARIANT

<222> (77)..(77)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> VARIANT

<222> (81)..(81)

<223> /代替=「L」

<220>

<221> VARIANT

<222> (83)..(83)

<223> /代替=「I」

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(116)

<400> 39

<210> 40

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(1)

<223> /代替=「D」

<220>

<221> VARIANT

<222> (3)..(3)

<223> /代替=「Q」

<220>

<221> VARIANT

<222> (9)..(9)

<223> /代替=「S」

<220>

<221> VARIANT

<222> (13)..(13)

<223> /代替=「A」

<220>

<221> VARIANT

<222> (15)..(15)

<223> /代替=「V」

<220>

<221> VARIANT

<222> (17)..(17)

<223> /代替=「D」

<220>

<221> VARIANT

<222> (19)..(19)

<223> /代替=「V」

<220>

<221> VARIANT

<222> (21)..(21)

<223> /代替=「I」

<220>

<221> VARIANT

<222> (22)..(22)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> VARIANT

<222> (41)..(41)

<223> /代替=「K」

<220>

<221> VARIANT

<222> (69)..(69)

<223> /代替=「S」

<220>

<221> VARIANT

<222> (71)..(71)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> VARIANT

<222> (77)..(77)

<223> /代替=「M」

<220>

<221> VARIANT

<222> (78)..(78)

<223> /代替=「Q」

<220>

<221> VARIANT

<222> (84)..(84)

<223> /代替=「T」

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(106)

<400> 40

<210> 41

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 41

<210> 42

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 42

<210> 43

<211> 164

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 43

<210> 44

<211> 224

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 44

<210> 45

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 45

<210> 46

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多核苷酸」

<400> 46

<210> 47

<211> 1398

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多核苷酸」

<400> 47

<210> 48

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 48

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 49

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 50

<210> 51

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 51

<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 52

<210> 53

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 53

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 55

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 56

<210> 57

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 57

<210> 58

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 58

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 60

<210> 61

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 61

<210> 62

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 62

<210> 63

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 63

<210> 64

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 64

<210> 65

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 65

<210> 66

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 66

<210> 67

<211> 70

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 67

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 68

<210> 69

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 69

<210> 70

<211> 83

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 70

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 71

<210> 72

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 72

<210> 73

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 73

<210> 74

<211> 81

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 74

<210> 75

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 75

<210> 76

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 76

<210> 77

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成肽」

<400> 77

<210> 78

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> source

<223> /注意：「人工序列之說明：合成多肽」

<400> 78

Claims

一種結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括：a.重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；b.重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；c.重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；d.輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；e.輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；及f.輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S。
一種結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括：a.重鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：1之胺基酸序列，其中X₁=M；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；b.重鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：2之胺基酸序列，其中X₁=N，X₂=T，X₃=N且X₄=T；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；c.重鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：3之胺基酸序列，其中X₁=M；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；d.輕鏈可變區CDR1，其包括SEQ ID NO：4之胺基酸序列，其中X₁=M；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；e.輕鏈可變區CDR2，其包括SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中X₁=D且X₂=T；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列；及f.輕鏈可變區CDR3，其包括SEQ ID NO：6之胺基酸序列，其中X₁=W，X₂=N且X₃=S；或與該序列相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列。
一種結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其包括選自由以下組成之群之輕鏈免疫球蛋白可變區、重鏈免疫球蛋白可變區或輕鏈及重鏈免疫球蛋白可變區二者：a.包括含有SEQ ID NO：7之胺基酸序列或與SEQ ID NO：7相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列或與SEQ ID NO：8相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；b.包括選自由SEQ ID NO：10至13組成之群或與SEQ ID NO：10至13中一者相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或選自由SEQ ID NO：15至18中任一者組成之群或與SEQ ID NO：15至18中一者相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段； c.包括含有SEQ ID NO：10之胺基酸序列或與SEQ ID NO：10相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變重鏈及/或包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列或與SEQ ID NO：15相差1、2或3個保守取代之胺基酸序列之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；d.包括與SEQ ID NO：10至13中之任一者至少90%一致性之可變重鏈及/或包括與SEQ ID NO：15至18中之任一者至少90%一致性之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；e.包括與SEQ ID NO：10至13中之任一者至少90%一致性之可變重鏈及/或包括與SEQ ID NO：15至18中之任一者包括至少90%一致性之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段，其中任一序列變化發生於該抗體或其抗原結合片段之框架區中；f.包括相對於SEQ ID NO：10至13中之任一者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之可變重鏈及/或包括相對於SEQ ID NO：15至18中之任一者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段；及g.包括相對於SEQ ID NO：10至13中之任一者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之可變重鏈及/或包括相對於SEQ ID NO：15至18中之任一者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代之可變輕鏈的抗體或其抗原結合片段，其中該等胺基酸取代發生於該抗體或其抗原結合片段之框架區中。
如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其包括選自由以下組成之群之可變輕鏈區及可變重鏈區： a.包括SEQ ID NO：7之胺基酸序列之可變重鏈及包括SEQ ID NO：8之胺基酸序列之可變輕鏈；b.選自由SEQ ID NO：10至13組成之群之可變重鏈及選自由SEQ ID NO：15至18組成之群之可變輕鏈；及c.包括SEQ ID NO：10之胺基酸序列之可變重鏈及包括SEQ ID NO：15之胺基酸序列之可變輕鏈。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區及輕鏈可變區。
如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段具有至少一個下列特性：a)在細胞ELISA分析中以小於100pM之EC₅₀結合至人類CD27；b)在細胞ELISA分析中以小於150pM之EC₅₀結合至人類CD27(A59T)；及c)在細胞ELISA分析中以小於100pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27。
如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段具有至少一個下列特性：a)以約5nM至10nM之二價KD值結合至人類CD27及人類CD27(A59T)，如藉由表面電漿共振所測定；b)在細胞ELISA分析中以小於200pM之EC₅₀結合至人類CD27；c)在細胞ELISA分析中以小於250pM之EC₅₀結合至人類CD27 (A59T)；d)在細胞ELISA分析中以小於150pM之EC₅₀結合至恆河猴CD27；e)與食蟹猴(cynomolgus monkey)或恆河猴CD27交叉反應；f)阻斷人類CD27結合至人類CD70；及g)增加T細胞活化。
如請求項1至4中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其片段具有至少一個下列特性：a)當該抗體或其片段呈可溶性形式時以小於5nM之EC₅₀誘導人類CD27表現細胞中之NF-κB活化；b)當該抗體或其片段呈可溶性形式時以小於10nM之EC₅₀誘導人類CD27A59T表現細胞中之NF-κB活化；c)當該抗體或其片段呈可溶性形式時以小於1nM之EC₅₀誘導恆河猴CD27表現細胞中之NF-κB活化；d)對於結合至CD8+或CD4+ T細胞上之人類CD27具有小於0.5nM之EC50；e)以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；及f)增加人類腫瘤培養中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。
一種結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：10之可變重鏈及SEQ ID NO：15之可變輕鏈。
如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：10至12中任一者之可變重鏈及SEQ ID NO：15至17中任一者之可變輕鏈；或包括SEQ ID NO：13之可變重鏈及SEQ ID NO：18之可變輕鏈。
如請求項9之抗體或其抗原結合片段，其中當結合至人類CD27時，其結合至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO：19之Leu18、Asp34、Gln35及Lys38。
如請求項11之抗體或其抗原結合片段，其中當結合至人類CD27時，其結合至少一個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO：19之Gln35及Lys38。
如請求項11或12之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段進一步結合一或多個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO：19之Pro8、Glu9、His11、Lys17、His36及Arg37。
如請求項11或12之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段進一步結合一或多個選自由以下組成之群之殘基：SEQ ID NO：19之Glu9、Lys17、His36及Arg37。
如請求項11之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合SEQ ID NO：19之殘基Pro8、Glu9、His11、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37及Lys38。
如請求項11之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段結合SEQ ID NO：19之殘基Glu9、Lys17、Leu18、Asp34、Gln35、His36、Arg37及Lys38。
如請求項9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其以可溶性形式增加CD8+ T細胞活化；或增加人類腫瘤培養中之抗CD3誘導之IFN_γ產生。
如請求項1至4、9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係包括兩條重鏈及兩條輕鏈之人類化抗體，且係IgG。
如請求項1至4、9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係IgG1同型(isotype)之抗體。
如請求項1至4、9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其係IgG4同型之抗體。
如請求項1至4、9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包括SEQ ID NO：30之重鏈恆定域。
如請求項1至4、9至12、15及16中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包括SEQ ID NO：28之重鏈恆定域。
一種結合至人類CD27之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係由兩條輕鏈及兩條重鏈組成，其中每一輕鏈係由SEQ ID NO：36組成；且每一重鏈係由SEQ ID NO：37組成。
如請求項1至4、9至12、15、16及23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括由哺乳動物細胞表現之醣基化模式特徵。
如請求項1至4、9至12、15、16及23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包括由CHO細胞表現之醣基化模式特徵。
一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段。
一種經分離之核酸，其包括SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：47或二者。
一種表現載體，其包括如請求項26或27之經分離之核酸。
一種宿主細胞，其包括如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項26或27之經分離之核酸或如請求項28之表現載體。
如請求項29之宿主細胞，其係細菌細胞、哺乳動物細胞、畢赤酵母屬(Pichia)細胞或植物細胞。
如請求項30之宿主細胞，其係人類細胞、HEK293細胞或中國倉鼠卵巢細胞。
一種組合物，其包括如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑或稀釋劑。
如請求項32之組合物，其進一步包括選自由以下組成之群之藥劑：a.抗LAG3抗體或其抗原結合片段；b.抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；c.抗VISTA抗體或其抗原結合片段；d.抗BTLA抗體或其抗原結合片段；e.抗TIM3抗體或其抗原結合片段；f.抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；g.抗HVEM抗體或其抗原結合片段；h.抗CD70抗體或其抗原結合片段；i.抗OX40抗體或其抗原結合片段；j.抗CD28抗體或其抗原結合片段；k.抗PD1抗體或其抗原結合片段；l.抗PDL1抗體或其抗原結合片段；m.抗PDL2抗體或其抗原結合片段；n.抗GITR抗體或其抗原結合片段； o.抗ICOS抗體或其抗原結合片段；p.抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；q.抗ILT2抗體或其抗原結合片段；r.抗ILT3抗體或其抗原結合片段；s.抗ILT4抗體或其抗原結合片段；t.抗ILT5抗體或其抗原結合片段；u.抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；v.抗NK2GA抗體或其抗原結合片段；w.抗NK2GC抗體或其抗原結合片段；x.抗NK2GE抗體或其抗原結合片段；y.抗TSLP抗體或其抗原結合片段；及z.抗IL10抗體或其抗原結合片段。
如請求項33之組合物，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：派姆單抗(pembrolizumab)或其抗原結合片段及納武單抗(nivolumab)或其抗原結合片段。
一種產生抗體或其抗原結合片段之方法，其包括：a.培養包括編碼如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段之重鏈及/或輕鏈之多核苷酸之宿主細胞在有利於表現該多核苷酸之條件下；及b.視情況自該宿主細胞及/或培養基回收該抗體或其抗原結合片段。
如請求項1至4、9至12、15、16及23中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於：a.治療癌症；或b.治療感染或感染性疾病。
一種如請求項1至25中任一項之抗體或其抗原結合片段、如請求項28之表現載體、如請求項29至31中任一項之宿主細胞或如請求項32至34中任一項之組合物之用途，其係用以製造用於增加免疫細胞活化、治療癌症或治療感染或感染性疾病之藥劑。
如請求項37之用途，其中該藥劑係與另一治療劑或治療程序聯合使用。
如請求項38之用途，其中該治療劑係選自由以下組成之群：a.抗LAG3抗體或其抗原結合片段；b.抗TIGIT抗體或其抗原結合片段；c.抗VISTA抗體或其抗原結合片段；d.抗BTLA抗體或其抗原結合片段；e.抗TIM3抗體或其抗原結合片段；f.抗CTLA4抗體或其抗原結合片段；g.抗HVEM抗體或其抗原結合片段；h.抗CD70抗體或其抗原結合片段；i.抗OX40抗體或其抗原結合片段； j.抗CD28抗體或其抗原結合片段；k.抗PD1抗體或其抗原結合片段；l.抗PDL1抗體或其抗原結合片段；m.抗PDL2抗體或其抗原結合片段；n.抗GITR抗體或其抗原結合片段；o.抗ICOS抗體或其抗原結合片段；p.抗SIRPα抗體或其抗原結合片段；q.抗ILT2抗體或其抗原結合片段；r.抗ILT3抗體或其抗原結合片段；s.抗ILT4抗體或其抗原結合片段；t.抗ILT5抗體或其抗原結合片段；u.抗4-1BB抗體或其抗原結合片段；v.抗NK2GA抗體或其抗原結合片段；w.抗NK2GC抗體或其抗原結合片段；x.抗NK2GE抗體或其抗原結合片段；y.抗TSLP抗體或其抗原結合片段；z.抗IL10抗體或其抗原結合片段；aa.STING激動劑；bb.CXCR2拮抗劑；及cc.PARP抑制劑。
如請求項38之用途，其中該藥劑係聯合抗PD1抗體或其抗原結合片段投與。
如請求項40之用途，其中該抗PD1抗體或其抗原結合片段係派姆單抗、納武單抗或其抗原結合片段。