TWI686476B - 用於視網膜及ｃｎｓ基因療法之ａａｖ載體 - Google Patents

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珍妮佛 蘇利文
麗莎 史坦艾克
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Abstract

本申請提供改進的rAAV(例如，rAAV2,rAAVrh8R等)用於眼部病症或CNS病症的增強的基因治療，其中該rAAV包含一個或多個與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的胺基酸的取代。本發明提供用於視網膜細胞改進的轉導的方法和用於以rAAV顆粒的改進組成物治療眼部病症的方法。本申請還提供改進的重組腺相關病毒(rAAV)(例如，rAAV2、rAAVrh8R等)用於CNS的病症的增強的基因治療。本發明提供用於將rAAV遞送至CNS的方法，用於以rAAV顆粒的改進組成物治療CNS的病症的方法，和用於將rAAV遞送至CNS和/或治療CNS病症的套組。

Description

用於視網膜及CNS基因療法之AAV載體 相關申請的交叉引用
本申請案係請求2014年5月2日申請的美國臨時申請案序號61/988,131和2015年2月10日申請的美國臨時申請案序號62/114,575的優先權權益，其各自以參考方式整體併入本文。
ASCII文字檔的序列表的提交
ASCII文字檔的以下提交的內容以參考方式整體併入本文：序列表的電腦可讀形式(CRF)(檔案名：159792010440SEQLIST.txt，記錄的日期：2015年4月29日，大小：85KB)。
發明領域
本發明涉及變體重組腺相關病毒(rAAV)載體，其用於改進向眼部和中樞神經系統的遞送，例如，用於改進的視網膜基因治療和改進的CNS基因治療。
視網膜退化性疾病對於腺相關載體(AAV)介導的基因治療是很有希望的集中點。AAV載體能介導視網膜中的長期基因表現和引發最小免疫反應，使得這些載體對於基因遞送至眼睛成為最吸引人的選擇。視網膜是在眼睛的後部的光敏感的組織，其由多種細胞類型包括感光細胞、視網膜色素上皮細胞和視網膜神經節細胞組成。AAV基因治療載體的靶細胞類型和載體遞送路徑會取決於疾病指徵。例如，年齡相關性黃斑變性的I期臨床試驗採用載體的玻璃體內(intravitreally)遞送以實現視網膜神經節細胞的轉導，和最近的用於治療患有萊伯先天性黑蒙2型(一種形式的色素性視網膜炎)的患者的臨床試驗使用RPE65基因的視網膜下遞送以轉導視網膜色素上皮細胞。
鑒於這樣的功用，需要開發新的用於改善AAV遞送至眼部的藥劑和方法。
基於腺相關病毒(AAV)的載體也已成為較佳的載體系統用於神經基因治療，在多個臨床試驗中具有優異的安全記錄(Kaplitt,M.G.等(2007)Lancet 369：2097-2105；Eberling,J.L.等(2008)Neurology 70：1980-1983；Fiandaca,M.S.等(2009)Neuroimage.47 Suppl 2：T27-35)。然而，神經系統病症的有效治療已經在很大程度上受到與將AAV載體遞送至受影響的細胞群體相關問題的阻礙。此遞送問題對於涉及中樞神經系統(CNS)的病症是特別成問題的。因此，存在對於增強AAV遞送至CNS的進一步需要。
在一些方面中，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的眼的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的視網膜下，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%，約至少25%，約至少50%，約至少75%，或約至少100%。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代增加rAAV顆粒對眼部或CNS中細胞的轉導效率。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將rAAV顆粒對眼部或CNS中細胞的轉導效率，例如，與包含野生型AAV衣殼蛋白的參考rAAV衣殼相比增加約至少10%，約至少25%，約至少50%，約至少75%，或約至少100%。在一些具體實例中，所述眼部的細胞是視網膜細胞、感光細胞、視網膜色素上皮細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、Muller細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述CNS的細胞為少突膠質細胞(oligodendrocyte)、星形膠質細胞、神 經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞(ependemal cell)，和/或浦肯野細胞(Purkinje cell)。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，編號基於AAV2的VP1，所述AAV2包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水的胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R532的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代 或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV-2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水性胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙 胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。 在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1、AAV6或AAV9衣殼，且其中所述一個或多個胺基酸取代在位置485、488、528、533、586和/或589，編號基於AAV1、AAV6或AAV9的VP1編號；和/或其中所述rAAV顆粒包含AAV8或AAVrh10衣殼，且其中所述一個或多個胺基酸取代在位置487、490、535、588和/或591，編號基於AAV8或AAVrh10的VP1編號。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含含有一個或 多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和rAAV載體，其包含編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在進一步的具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2,RPE65,AIPL1,GUCY2D,LCA5,CRX,CEP290,MYO 7a,Clarin,,ABCA4,RDH12,IMPDH1,CRB1,LRAT,NMNAT1,TULP1,MERTK,RPGR,RP2,RPGRIP,CNGA3,CNGB3,GNAT2,GDNF,CNTF,FGF2,PEDF,EPO,BCL2,BCL-X,NFκB，內皮他汀(Endostatin)，血管他汀(Angiostatin),sFlt,sPDGF-R,IL10，抗-IL17,sIL17R,IL1-ra，抗-TGFβ,sTNF-R I,sTNF-R II和IL4。 在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在進一步的具體實例中，所述治療性核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸，其中所述異源核酸處於在視網膜中表現的啟動子序列的控制下。 在一些具體實例中，其中所述異源核酸可操作地連接於適於在一個或多個視網膜細胞類型中表現所述治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述視網膜細胞是感光細胞、視網膜色素上皮細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、Muller細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，啟動子為視紫紅激酶(RK)啟動子、視蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和用於將所述異源核酸遞送至個體的視網膜的異源核酸。在一些具體實例中，所述個體是人。在一些具體實例中，所述異源核酸用於治療選自下列組成群組的眼部病症：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(autosomal recessive severe early-onset retinal degeneration)(Leber先天性黑蒙(Leber’s congenital amaurosis))、先天色盲(congenital achromatopsia)、斯塔加特氏病(Stargardt’s disease)、Best氏病(Best’s disease)、Doyne氏病(Doyne’s disease)、錐體營養不良(cone dystrophy)、色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa)、X連鎖視網膜劈裂症(X-linked retinoschisis)、亞瑟症候群(Usher’s syndrome)、年齡相關性黃斑變性(age related macular degeneration)、萎縮性年齡相關黃斑變性(atrophic age related macular degeneration)、新生血管性AMD(neovascular AMD)、 糖尿病性黃斑病變(diabetic maculopathy)、增殖性糖尿病性視網膜病(proliferative diabetic retinopathy)(PDR)、囊樣黃斑水腫(cystoid macular oedema)、中心性漿液性視網膜病(central serous retinopathy)、視網膜剝離(retinal detachment)、眼內炎(intra-ocular inflammation)、青光眼(glaucoma)和後葡萄膜炎(posterior uveitis)。
在一些方面中，本發明提供與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比改進在將rAAV顆粒視網膜下遞送至個體的眼部後細胞的rAAV轉導的方法，所述方法包括AAV衣殼蛋白中的一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。
在其他方面中，本發明提供改進在將rAAV顆粒視網膜下遞送至個體的眼後異源核酸的表現的方法，所述方法包括在AAV衣殼蛋白中併入一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核 酸表現之rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核酸表現之rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列 同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV-2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核酸表現之rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列之AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶 正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水性胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。 在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核酸表現的rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或 588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和rAAV載體，其包含編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在進一步的具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2,RPE65,AIPL1,GUCY2D,LCA5,CRX,CEP290,MYO 7a,Clarin,,ABCA4,RDH12,IMPDH1,CRB1,LRAT,NMNAT1,TULP1,MERTK,RPGR,RP2,RPGRIP,CNGA3,CNGB3,GNAT2,GDNF,CNTF,FGF2,PEDF,EPO,BCL2,BCL-X,NFκB，內皮他汀(Endostatin)，血管他汀(Angiostatin),sFlt,sPDGF-R,IL10，抗-IL17,sIL17R,IL1-ra，抗-TGFβ,sTNF-R I,sTNF-R II和IL4。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在進一步的具體實例中，所述治療性核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核酸表現的rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸，所述異源核酸處於在視網膜中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，其中所述異源核酸可操作地連接於適於在一個或多個視網膜細胞類 型中表現所述治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述視網膜細胞是感光細胞、視網膜色素上皮細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是視紫紅激酶(RK)啟動子、視蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一些具體實例中，具有改進的轉導和/或改進的異源核酸表現之rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和用於將所述異源核酸遞送至個體的視網膜的異源核酸。在一些具體實例中，所述個體是人。在一些具體實例中，所述異源核酸用於治療選自下列組成群組的眼部病症：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(Leber先天性黑蒙)、先天色盲、斯塔加特氏病、Best氏病、Doyne氏病、錐體營養不良、色素性視網膜炎、X連鎖視網膜劈裂症、亞瑟症候群、年齡相關性黃斑變性、萎縮性年齡相關黃斑變性、新生血管性AMD、糖尿病性黃斑病變、增殖性糖尿病性視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫、中心性漿液性視網膜病、視網膜剝離、眼內炎、青光眼和後葡萄膜炎。
在一些方面中，本發明提供在個體(例如，人)中治療眼部病症的方法，其包括將包含rAAV顆粒的組成物遞送至個體的視網膜，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代， 所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症，其中所述rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585 和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV-2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症，其中所述rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的 AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。 在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。 在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%， 至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症；和包含一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在進一步的具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2，RPE65，AIPL1，GUCY2D，LCA5，CRX，CEP290，MYO 7a，Clarin，ABCA4，RDH12，IMPDH1，CRB1，LRAT，NMNAT1，TULP1，MERTK，RPGR，RP2，RPGRIP，CNGA3，CNGB3，GNAT2，GDNF，CNTF，FGF2，PEDF，EPO，BCL2，BCL-X，NFκB，內皮他汀(Endostatin)，血管他汀(Angiostatin)，sFlt，sPDGF-R，IL10，抗-IL17，sIL17R，IL1-ra，抗-TGFβ，sTNF-R I，sTNF-R II和IL4。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在進一步的具體實例中，所述治療性核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症；和包含一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中所述異源核酸處於在視網膜中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，其中所述異源核酸可操作地連接於適於在一個或多個視網膜細胞類型中表現所述治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述視網膜細胞是感光細胞、視網膜色素上皮細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是視紫紅激酶(RK)啟動子、視蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送rAAV顆粒，所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症；和包含一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中所述眼部病症選自下列組成群組：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(Leber先天性黑蒙)、先天色盲、斯塔加特氏病、Best氏病、Doyne氏病、錐體營養不良、色素性視網膜炎、X連鎖視網膜劈裂症、亞瑟症候群、年齡相關性黃斑變性、萎縮性年齡相關黃斑變性、新生血管性AMD、糖 尿病性黃斑病變、增殖性糖尿病性視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫、中心性漿液性視網膜病、視網膜剝離、眼內炎、青光眼和後葡萄膜炎。
在一些具體實例中，所述方法包括視網膜下遞送包含rAAV顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含編碼異源核酸的rAAV載體，其用於在個體(例如，人)中治療眼部病症；和包含一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述組成物中顆粒的濃度為約1 x 106DRP/ml至約1 x 1014DRP/ml。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒的組成物在治療個體的視覺功能中是有效的。在一些具體實例中，視覺功能通過微視野檢查法、暗適應視野檢查法、視覺活動性評估、視敏度、ERG或閱讀評估來評價。在一些具體實例中，所述方法導致個體的視覺功能的改進。在一些具體實例中，所述方法預防人的視覺功能由於眼部病症的進展而導致的衰退或減緩所述衰退的進展。
在一些方面中，本發明提供用於將載體視網膜下遞送至個體的眼的系統，其包含a)含有有效量的rAAV顆粒的組成物，其中i)所述rAAV顆粒的衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和ii)所述載體包 含編碼治療性多肽或治療性RNA的異源核酸和至少一個AAV末端重複；和b)用於視網膜遞送所述rAAV的裝置。在一些具體實例中，所述裝置包含細口徑套管和注射器，其中所述細口徑套管為27至45Gauge。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒的組成物容納於注射器內。在一些具體實例中，所述套管附接於注射器。在一些具體實例中，所述組成物中顆粒的濃度為約1 x 106DRP/ml至約1 x 1014DRP/ml。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的AAV2衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代增加rAAV顆粒對眼部或CNS中細胞的轉導效率。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將rAAV顆粒對眼或CNS中細胞的轉導效率增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%，例如，與包含野生型AAV衣殼蛋白的參考rAAV衣殼相比。在一些具體實例中，眼的細胞是視網膜細胞、感光細胞、視網膜色素上皮細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、Muller細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述CNS的細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞(ependemal cell)， 和/或浦肯野細胞(Purkinje cell)。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的AAV2衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代， 編號基於AAV2的VP1。在進一步的具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV-2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的AAV2衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水性胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於 AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。 在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和包含異源核酸的rAAV載體。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在進一步的具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2，RPE65，AIPL1，GUCY2D，LCA5，CRX，CEP290，MYO 7a，Clarin，，ABCA4，RDH12，IMPDH1，CRB1，LRAT，NMNAT1，TULP1，MERTK，RPGR，RP2，RPGRIP，CNGA3， CNGB3，GNAT2，GDNF，CNTF，FGF2，PEDF，EPO，BCL2，BCL-X，NFκB，內皮他汀(Endostatin)，血管他汀(Angiostatin)，sFlt，sPDGF-R，IL10，抗-IL17，sIL17R，IL1-ra，抗-TGFβ，sTNF-R I，sTNF-R II和IL4。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在進一步的具體實例中，所述治療性核酸是siRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和包含異源核酸的rAAV載體，其中所述異源核酸處於在視網膜中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，其中所述異源核酸可操作地連接於適於在一個或多個視網膜細胞類型中表現所述治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述視網膜細胞是感光細胞、視網膜色素上皮細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是視紫紅激酶(RK)啟動子、視蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。
在一些具體實例中，所述系統的rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變HSPG結合(例如，降低或去除結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和包含異源核酸的rAAV載體，其用於將所述異源核酸遞送至 個體的視網膜。在一些具體實例中，所述個體是人。在一些具體實例中，所述異源核酸用於治療選自下列組成群組的眼部病症：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(Leber先天性黑蒙)、先天色盲、斯塔加特氏病、Best氏病、Doyne氏病、錐體營養不良、色素性視網膜炎、X連鎖視網膜劈裂症、亞瑟症候群、年齡相關性黃斑變性、萎縮性年齡相關黃斑變性、新生血管性AMD、糖尿病性黃斑病變、增殖性糖尿病性視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫、中心性漿液性視網膜病、視網膜剝離、眼內炎、青光眼和後葡萄膜炎。
在一些方面中，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些方面中，本發明提供一種與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比改進在個體的中樞神經系統(CNS)中細胞的rAAV轉導的方法，所述方法包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至所述個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、 487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在進一步的方面中，本發明提供一種改進異源核酸在個體的中樞神經系統(CNS)中表現的方法，所述方法包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至所述個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在還進一步的方面中，本發明提供一種治療個體的中樞神經系統(CNS)的病症的方法，所述方法包括將有效量的包含rAAV顆粒的組成物施用至所述個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸以與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒的異源核酸的表現水平相比增加之表現水平表現。在一些具體實例中，將所述核酸的表現增加至少大約10%，至少大約25%，至少大約50%，至少 大約75%，或至少大約100%。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒引起與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒相比降低的神經炎症。在一些具體實例中，將神經炎症減少至少大約10%，至少大約25%，至少大約50%，至少大約75%，或至少大約100%。 在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，與包含參考衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含野生型rAAV衣殼或衣殼蛋白。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含缺乏一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼或衣殼蛋白，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代增加rAAV顆粒對眼或CNS中細胞的轉導效率。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將rAAV顆粒對眼或CNS中細胞的轉導效率增加約至少10%、約至少25%、 約至少50%、約至少75%或約至少100%，例如，與包含野生型AAV衣殼蛋白的參考rAAV衣殼相比。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述施用包含直接脊髓注射和/或腦內施用。在一些具體實例中，所述腦內施用在選自下列組成群組的位點：大腦、延髓、腦橋(pons)、小腦、顱內腔、圍繞大腦的脊膜、硬腦膜(dura mater)、蛛網膜(arachnoid mater)、軟腦膜(pia mater)、圍繞腦的蛛網膜下腔的腦脊髓液(CSF)、小腦的小腦深部核、腦室系統、蛛網膜下腔、紋狀體(striatum)、皮層、隔膜(septum)、丘腦、下丘腦、和腦的實質(parenchyma of the brain)。在一些具體實例中，所述施用為腦室內注射入至少一個大腦側腦室。在一些具體實例中，所述施用為鞘內注射於頸、胸和/或腰區。在一些具體實例中，所述施用是紋狀體內注射。在一些具體實例中，所述施用是丘腦內注射。在一些具體實例中，所述施用是(腦)實質內注射。 在一些具體實例中，所述施用包含直接脊髓注射、顱內和/或腦內施用。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒在單一位點施用。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒通過立體定向遞送(stereotactic delivery)來遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由對流增強遞送來遞送。在一些具體實例中，使用CED遞送系統施用所述rAAV顆粒。在一些 具體實例中，CED遞送系統包含套管和/或泵。在一些具體實例中，所述套管為抗回流套管或階梯形套管。在一些具體實例中，泵為手動泵。在一些具體實例中，泵為滲透泵。在一些具體實例中，泵為輸液泵。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在CNS的一種或多種細胞上表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在神經元上表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸在CNS的一種或多種細胞中表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述異源核酸在神經元中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸僅僅在神經元中表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在448、451、484、487、527、532、585和/或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中， 用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R347、R350、K390、K395、R448、R451、R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R347A、R350A、K390A、K395A、R448A、R451A、R484A、R487A、K527A、K532A、R585A和/或R588A取代，編號基於AAV2的VP1。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代K532A，編號基於AAV2 的VP1。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白， 所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼CNS-相關的基因。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：酶、神經營養因子、在患有CNS相關的病症的個體中缺乏或突變的多肽、抗氧化劑、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子、α-突觸核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(GBA)、β-半乳糖苷酶-1(GLB1)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)、半乳糖基神經醯胺酶(GALC)、甘露糖苷酶、α-D-甘露糖苷酶(MAN2B1)、β-甘露糖苷酶(MANBA)、假芳基硫酸酯酶A(ARSA)、N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶(GNPTAB)、酸性鞘磷脂酶(ASM)、尼曼-皮克C蛋白(NPC1)、酸α-1,4-葡糖苷酶(GAA)、胺基己糖苷酶β次單元、HEXB、N-硫葡糖胺硫水解酶(MPS3A)、N-α-乙醯葡糖胺糖苷酶(NAGLU)、肝素乙醯-CoA、α-胺基葡萄糖苷酶N-乙醯轉移酶(MPS3C)、N-乙醯胺基葡糖-6-硫酸酯酶(GNS)、α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶(NAGA)、β-葡糖醛酸酶(GUSB)、胺基己糖苷酶α次單元(HEXA)、亨廷頓蛋白(HTT)、溶酶體酸性脂肪酶(LIPA)、天冬氨醯胺基葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、棕櫚醯蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶 體跨膜蛋白、半胱胺酸轉運蛋白、酸性神經醯胺酶、酸性α-L-岩藻糖苷酶、組織蛋白酶A、α-L-艾杜糖醛酸糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、芳基硫酸酯酶A、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯、酸性β-半乳糖苷酶或α-神經胺酸苷酶。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：神經元細胞凋亡抑制蛋白(NAIP)、神經生長因子(NGF)、神經膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦源性生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP環水解酶(GTPCH)、胺基酸脫羧酶(AADC)、抗氧化劑，抗血管生成多肽、抗炎多肽，和天冬胺酸醯基酶(ASPA)。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在一些具體實例中，所述治療性核酸為siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述異源核酸處於在CNS的一種或多種細胞中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，所述異源核酸處於選自下列組成群組的啟動子序列的控制下：巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子，RSV LTR，MoMLV LTR，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子，猿猴病毒40(SV40)啟動子，CK6啟動子，轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)，TK啟動子，四環素回應啟動子(TRE)，HBV啟動子，hAAT啟動子，LSP啟動子，嵌合肝特異性啟動子(LSP)，E2F啟動子，端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β球蛋白啟動子(CAG)啟動子，延伸因子1-α啟動子(EF1-alpha)啟動子，人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，逆轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子，二氫葉酸還原酶啟動子，和13-肌動蛋 白啟動子。在一些具體實例中，所述異源核酸可操作地連接於適於在CNS的一種或多種細胞中表現治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞包含一種或多種腦細胞。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述腦細胞是神經元。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼所述異源核酸的第一核酸序列和編碼所述核酸的互補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其全長或長度的大部分形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAVITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述個體是人。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸編碼用於治療CNS的病症的治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述CNS的病症為溶酶體貯積病(LSD)、亨廷頓氏病、癲癇、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、中風、皮質基底變性(CBD)、皮質基底神經節變性(CBGD)、額顳葉癡呆(FTD)、多系統萎縮症(MSA)、進行性核上麻痹(PSP)或腦癌。在一些具體實例中，所述病症為選自下列組成群組的溶酶體貯積病： Aspartylglusoaminuria、法布裡病、嬰兒巴登氏病(CNL1)、經典的嬰兒後期巴登氏病(CNL2)、幼年巴登氏病(CNL3)、巴登氏病形式CNL4、巴登氏病形式CNL5、巴登氏病形式CNL6、巴登氏病形式CNL7、巴登氏病形式CNL8、胱胺酸貯積病、法伯氏病、岩藻糖苷貯積症、半乳糖苷貯積症(Galactosidosialidosis)、高歇氏病1型、高歇氏病2型、高歇氏病3型、GM1神經節苷脂貯積病、亨特病、克拉伯病、α甘露糖苷貯積症、β甘露糖苷貯積症、馬-拉病、異染性腦白質營養不良症、莫爾丘病A、莫爾丘病B、粘脂貯積病II/III、尼曼-皮克病A、尼曼-皮克病B、尼曼-皮克病C、龐貝氏症、桑德霍夫病、聖菲利柏氏症(Sanfillipo)A、聖菲利柏氏症B、聖菲利柏氏症C、聖菲利柏氏症D、辛德勒病(Schindlerdisease)、辛德勒-神崎病(Schindler-Kanzaki)、涎酸貯積症、史萊氏症(Sly disease)、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)和沃爾曼病(Wolman disease)。在一些具體實例中，所述CNS的病症是亨廷頓氏病或帕金森氏病。
在一些方面中，本發明提供在個體中治療亨廷頓氏病的方法，其包括將有效量的包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒的組成物施用於個體的紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末 端重複。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述治療性多肽是亨廷頓蛋白多肽或其片段。在一些具體實例中，所述亨廷頓蛋白多肽或其片段是功能性亨廷頓蛋白多肽或其功能片段。在一些具體實例中，所述治療性核酸包含定向於亨廷頓蛋白的RNAi。在一些具體實例中，所述RNAi是miRNA。
在一些方面中，本發明提供在個體中治療帕金森氏病的方法，其包括將有效量的包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒的組成物施用於個體的紋狀體，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述治療性多肽為TH、GTPCII、GDNF、BDNF和/或AADC；或其片段。在一些具體實例中，所述治療性多肽為AADC或其片段。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸以與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒的異源核酸的表現水平相比增加之表現水平表現。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒引起與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒相比降低的神經炎症。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取 代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，與包含參考衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含野生型rAAV衣殼或衣殼蛋白。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含缺乏一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼或衣殼蛋白，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由立體定向遞送來遞送。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒藉由對流增強遞送來遞送。在一些具體實例中，使用CED遞送系統施用所述rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述套管是抗回流套管或階梯形套管。在一些具體實例中，所述CED遞送系統包含套管和/或泵。在一些具體實例中，使用CED遞送系統施用所述rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述泵是手動泵。在一些具體實例中，所述泵是滲透泵。在一些具體實例中，所述泵是輸液泵。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在CNS的一種或多種細胞上表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在神經元上表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸在CNS的一種或多種細胞中表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述異源核酸在神經元中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸僅僅在神經元中表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列的AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R347、R350、K390、K395、R448、R451、R484、R487、K527、K532、R585和/或R588 的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R347A、R350A、K390A、K395A、R448A、R451A、R484A、R487A、K527A、K532A、R585A和/或R588A取代，編號基於AAV2的VP1。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代K532A，編號基於AAV2的VP1。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528或533，編號基於AAVrh8R的 VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至 少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸處於在CNS的一種或多種細胞中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，所述異源核酸處於選自下列組成群組的啟動子序列的控制下：巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子，RSVLTR，MoMLV LTR，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子，猿猴病毒40(SV40)啟動子，CK6啟動子，轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)，TK啟動子，四環素回應啟動子(TRE)，HBV啟動子，hAAT啟動子，LSP啟動子，嵌合肝特異性啟動子(LSP)，E2F啟動子，端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β球蛋白啟動子(CAG)啟動子，延伸因子1-α啟動子(EF1-alpha)啟動子，人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，逆轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子，二氫葉酸還原酶啟動子，和13-肌動蛋白啟動子。在一些具體實例中，所述異源核酸可操作地連接於適於在CNS的一種或多種細胞中表現治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞包含一種或多種腦細胞。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中， 所述腦細胞是神經元。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼所述異源核酸的第一核酸序列和編碼所述核酸的互補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其全長或長度的大部分形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述個體是人。
在一些方面中，本發明提供用於任何上述具體實例的套組，其包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些方面中，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)的套組，其包含含有重組腺相關病毒(rAAV)顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含a)rAAV衣殼，其包含rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其 包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些方面中，本發明提供用於治療個體中的中樞神經系統(CNS)病症的套組，其包含含有重組腺相關病毒(rAAV)顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其包含用於治療CNS病症的所述異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述CNS病症為亨廷頓氏病。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述治療性多肽是亨廷頓蛋白多肽或其片段。在一些具體實例中，所述亨廷頓蛋白多肽或其片段是功能性亨廷頓蛋白多肽或其功能片段。在一些具體實例中，所述治療性核酸包含定向於亨廷頓蛋白的RNAi。在一些具體實例中，所述RNAi是miRNA。在一些具體實例中，所述CNS病症為帕金森氏病。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。在一些具體實例中，所述治療性多肽是TH、GTPCII、GDNF、BDNF和/或AADC；或其片段。在一些具體實例中，所述治療性多肽是AADC或其片段。
在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於任何上述具體實例。在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋 白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於治療個體的中樞神經系統(CNS)的病症，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於治療個體中的亨廷頓氏病，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複，其中所述rAAV顆粒經配製用於遞送至紋狀體。在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於治療個體中的帕金森氏病，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代， 所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複，其中所述rAAV顆粒經配製用於遞送至紋狀體。在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於治療個體中的亨廷頓氏病，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複，其中所述rAAV顆粒經配製用於單一位點遞送(例如，至個體的CNS)。 在一些方面中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，用於治療個體中的帕金森氏病，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複，其中所述rAAV顆粒經配製用於單一位點遞送(例如，至個體的CNS)。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸以與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒的異源核酸的表現水平 相比增加之表現水平表現。在一些具體實例中，與包含含有參考衣殼的rAAV衣殼的rAAV顆粒相比，所述rAAV顆粒引起降低的神經炎症。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，與包含參考rAAV衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，與包含參考衣殼的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含野生型rAAV衣殼或衣殼蛋白。在一些具體實例中，參考rAAV衣殼包含缺乏一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼或衣殼蛋白，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在CNS的一種或多種細胞上表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝 素蛋白多糖在神經元上表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸在CNS的一種或多種細胞中表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述異源核酸在神經元中表現。在一些具體實例中，所述異源核酸僅僅在神經元中表現。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置484、487、527、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R347、R350、K390、K395、R448、R451、R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%， 至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R347A、R350A、K390A、K395A、R448A、R451A、R484A、R487A、K527A、K532A、R585A和/或R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R484和R487或在位置R585和R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代K532A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具 體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於AAVrh8R的VP1，所述AAVrh8R包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置R485、R488、R533或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：11的rAAV衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白與SEQ ID NO：11具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。在一些具體實例中，所述一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述異源核酸處於在CNS的一種或多種細胞中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，所述異源核酸處於選自下列組成群組的啟動子序列的控制下：巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子，RSV LTR，MoMLV LTR，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子，猿猴病 毒40(SV40)啟動子，CK6啟動子，轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)，TK啟動子，四環素回應啟動子(TRE)，HBV啟動子，hAAT啟動子，LSP啟動子，嵌合肝特異性啟動子(LSP)，E2F啟動子，端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β球蛋白啟動子(CAG)啟動子，延伸因子1-α啟動子(EF1-alpha)啟動子，人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子，雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子，逆轉錄病毒勞氏肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子，二氫葉酸還原酶啟動子，和13-肌動蛋白啟動子。在一些具體實例中，所述異源核酸可操作地連接於適於在CNS的一種或多種細胞中表現治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞包含一種或多種腦細胞。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞為少突膠質細胞、星形膠質細胞、神經元、腦實質細胞、小神經膠質細胞、室管膜細胞，和/或浦肯野細胞。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼所述異源核酸的第一核酸序列和編碼所述核酸的互補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其全長或長度的大部分形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述個體是人。
在上述方面和具體實例的一些具體實例中，所述rAAV顆粒在組成物中。在一些具體實例中，所述組成物包含緩衝液和/或藥學可接受的賦形劑。在一些具體實例中，所述套組或rAAV顆粒進一步包含用於將所述rAAV顆粒的組成物遞送至CNS的說明書。在一些具體實例中，所述套組或rAAV顆粒進一步包含用於將所述rAAV顆粒的組成物遞送至紋狀體的說明書。
在一些方面中，本發明提供包含AAVrh8R衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAVrh8R衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAVrh8R衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合，或其中所述一個或多個胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置586，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於AAVrh8R的VP1，所述AAVrh8R包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置A586的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含A586R或A586K取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：10的rAAV衣殼蛋白。
在一些方面中，本發明提供增加包含AAVrh8R衣殼蛋白的rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合的方法，其包括將一個或多個胺基酸取代引入衣殼蛋白，其中與包含野生型AAVrh8R衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，所述胺基酸取代在位置586，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含在位置A586的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述胺基酸取代包含A586R或A586K取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：10的rAAV衣殼蛋白。
在一些方面中，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的視網膜的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒玻璃體內施用至個體，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重 複。在一些方面中，本發明提供改進在將rAAV顆粒經玻璃體內遞送至個體的眼後與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比細胞的rAAV轉導的方法，所述方法包括將一個或多個胺基酸取代併入AAV衣殼蛋白中，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。 在一些方面中，本發明提供改進在將rAAV顆粒玻璃體內遞送至個體的眼後異源核酸的表現的方法，所述方法包括將一個或多個胺基酸取代併入AAV衣殼蛋白中，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些方面中，本發明提供治療個體內的眼部病症的方法，其包括將包含rAAV顆粒的組成物經玻璃體內遞送至個體的視網膜，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白的rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些方面中，本發明提供用於將載體經玻璃體內遞 送至個體眼部的系統，其包含a)含有有效量的rAAV顆粒的組成物，其中i)所述rAAV顆粒的衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，和ii)載體，其包含編碼治療性多肽或治療性RNA的異源核酸和至少一個AAV末端重複；和b)用於玻璃體內遞送所述rAAV的裝置。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAVrh8R、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9或AAVrh10血清型衣殼。在一些方面中，本發明提供用於治療眼部病症的套組，其包含a)含有rAAV顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含i)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，和ii)rAAV載體，其包含用於治療眼部病症的異源核酸和至少一個AAV反向末端重複；和b)適於玻璃體內施用的藥物賦形劑。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAVrh8R、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9或AAVrh10衣殼。在一些方面中，本發明提供包含AAV1衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV1衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAV1衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒至眼部中細胞的轉導效率，或其中所述一個或多個胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個 位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些方面中，本發明提供包含AAV6衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV6衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAV6衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒至眼部中細胞的轉導效率，或其中所述一個或多個胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些方面中，本發明提供包含AAV8衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV8衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAV8衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒至眼部中細胞的轉導效率，或其中所述一個或多個胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些方面中，本發明提供包含AAV9衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV9衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAV9衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒至眼部中細胞的轉導效率，或其中所述一個或多個胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些方面中，本發明提供包含AAVrh10衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAVrh10衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，其中與包含野生型AAVrh10衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒至眼部中細胞的轉導效率，或其中所述一個或多個胺基酸 取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些方面中，本發明提供包含AAV3衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV3衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。在一些具體實例中，所述轉導效率增加至少大約10%，至少大約25%，至少大約50%，至少大約75%，或至少大約100%。
在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代增加所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，與包含野生型AAVrh8R衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒對於眼部或中樞神經系統中的細胞的轉導效率增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，眼的細胞是視網膜細胞、感光細胞、視網膜色素上皮細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、Muller細胞和/或神經節細胞。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，所述 帶正電的胺基酸殘基代替疏水性胺基酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。 在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置A586和/或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A586R或A586K取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R或T589K取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。 在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV1的VP1編號。在一些具體實例中，所述AAV1的VP1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或T589的取代，編號基於AAV1的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含S586R或S586K取代，編號基於AAV1的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R或T589K取代，編號基於AAV1的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清 型6(AAV6)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV6的VP1編號。 在一些具體實例中，所述編號基於所述AAV6的VP1包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或T589的取代，編號基於AAV6的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含S586R取代，編號基於AAV6的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R或T589K取代，編號基於AAV6的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型8(AAV8)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置588和/或591，編號基於AAV8的VP1編號。在一些具體實例中，所述AAV8的VP1包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置Q588和/或T591的取代，編號基於AAV8的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含Q588R或Q588K取代，編號基於AAV8的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T591R取代，編號基於AAV8的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型9(AAV9)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV9的VP1編號。在一些具體實例中，所述AAV9的VP1包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或A589的取代，編號基於AAV9的VP1編號。在一些具體實例中，所述 一個或多個胺基酸取代包含S586R或S586K取代，編號基於AAV9的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A589R或A589K取代，編號基於AAV9的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型rh10(AAVrh10)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置588和/或591，編號基於AAVrh10的VP1編號。 在一些具體實例中，所述AAVrh10的VP1包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置Q588和/或A591的取代，編號基於AAVrh10的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含Q588R或Q588K取代，編號基於AAVrh10的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A591R或A591K取代，編號基於AAVrh10的VP1。在一些具體實例中，本發明提供包含AAV3衣殼蛋白的rAAV顆粒，其中所述AAV3衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，與包含野生型AAVrh8R衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒對於眼或中樞神經系統中細胞的轉導效率增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV1衣殼、AAV2衣殼、AAV3衣殼、AAV6衣殼、AAV8衣殼、AAVrh8R衣殼、AAV9衣殼或AAVrh10衣殼。 在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核 酸。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在進一步的具體實例中，所述異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2，RPE65，AIPL1，GUCY2D，LCA5，CRX，CEP290，MYO 7a，Clarin，，ABCA4，RDH12，IMPDH1，CRB1，LRAT，NMNAT1，TULP1，MERTK，RPGR，RP2，RPGRIP，CNGA3，CNGB3，GNAT2，GDNF，CNTF，FGF2，PEDF，EPO，BCL2，BCL-X，NFκB，內皮他汀(Endostatin)，血管他汀(Angiostatin)，sFlt，sPDGF-R，IL10，抗-IL17，sIL17R，IL1-ra，抗-TGFβ，sTNF-R I，sTNF-R II和IL4。在其他具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在進一步的具體實例中，所述治療性核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含含有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變與HSPG的結合(例如，降低或去除與HSPG的結合)或在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號；和編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸，其中所述異源核酸處於在視網膜中表現的啟動子序列的控制下。在一些具體實例中，其中所述異源核酸可操作地連接於適於在一個或多個視網膜細胞類型中表現所述治療性多肽或治療性核酸的啟動子。在一些具體實例中，所述視網膜細胞是感光細胞、視網膜色素上皮細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞、Muller細胞和/或神經節 細胞。在一些具體實例中，所述啟動子是視紫紅激酶(RK)啟動子、視蛋白啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子。在一些具體實例中，所述個體是人。在一些具體實例中，所述異源核酸用於治療選自下列組成群組的眼部病症：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(Leber先天性黑蒙)、先天色盲、斯塔加特氏病、Best氏病、Doyne氏病、錐體營養不良、色素性視網膜炎、X連鎖視網膜劈裂症、亞瑟症候群、年齡相關性黃斑變性、萎縮性年齡相關黃斑變性、新生血管性AMD、糖尿病性黃斑病變、增殖性糖尿病性視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫、中心性漿液性視網膜病、視網膜剝離、眼內炎、青光眼和後葡萄膜炎。在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。在一些具體實例中，所述載體包含編碼所述異源核酸的第一核酸序列和編碼所述核酸的互補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其全長或長度的大部分形成鏈內鹼基對。在一些具體實例中，所述第一核酸序列和所述第二核酸序列通過突變的AAV ITR連接，其中所述突變的AAV ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列的突變。在一些具體實例中，所述個體是人。 在一些具體實例中，與包含野生型AAVrh8R衣殼蛋白的AAV顆粒相比，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒對於眼或中樞神經系統中的細胞的轉導效率增加約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。
本文引用的所有參考資料(包括專利申請案和出版物)係以參考方式整體併入。
發明詳述
如本申請中所述，本發明的發明人令人驚奇地發現：rAAV顆粒中對應於胺基酸484、487、532、585和/或588，編號基於AAV2的VP1編號的修飾表明施用至受試者的眼或CNS後增加的細胞轉導。不希望受限於任何理論，認為這些rAAV顆粒具有降低的或去除的與HSPG的結合或在衣殼上具有修飾的電荷使得所述rAAV顆粒的施用導致受試者的眼或CNS中增加的細胞轉導。因此，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的眼或CNS的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的眼或CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。
在一些方面中，本發明提供用於將異源核酸遞送個體眼部的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的視網膜下，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
在一些方面中，本發明提供與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比改進在將rAAV顆粒視網膜下遞送至個體的眼後 細胞的rAAV轉導的方法，所述方法包括在AAV衣殼蛋白中併入一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。 在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
在一些方面中，本發明提供改進在將rAAV顆粒視網膜下遞送至個體的眼部後異源核酸的表現的方法，所述方法包括在AAV衣殼蛋白中併入一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
在一些方面中，本發明提供改進在將rAAV顆粒視網膜下 遞送至個體的眼後異源核酸的表現的方法，所述方法包括在AAV衣殼蛋白中併入一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置；其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，所述rAAV載體包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。所述改進是與包含野生型衣殼的rAAV顆粒相比的轉導。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。 在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2衣殼的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
在一些方面中，本發明提供在個體中治療眼部病症的方法，其包括將包含有效量的rAAV顆粒的組成物遞送至個體的視網膜，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
本發明還提供用於將載體視網膜下遞送至個體的眼的系統，其包含a)含有有效量的rAAV顆粒的組成物，其中i)所述rAAV顆粒的衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和ii)載體，其包含編碼治療性多肽或治療性RNA的異源核酸和至少一個AAV末端重複；和b)用於視網膜遞送所述rAAV的裝置。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
在一些方面中，本發明還提供用於將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用於個體的CNS。所述rAAV顆粒包含(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。這些方法顯現在將rAAV顆粒遞送至個體的CNS後改進的細胞的異源核酸表現和/或rAAV轉導，例如，與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比。而且，本發明的方法能夠感染特定的細胞(例如，神經元)同時仍實現普遍的和穩固的轉導效率。所述rAAV顆粒和方法 適用於治療CNS病症，包括但不限於亨廷頓氏病。在一些具體實例中，所述胺基酸取代導致降低的或去除的與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含rAAV2的R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1(SEQ ID NO：1)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含衣殼，所述衣殼包含AAVrh8R的A586R和/或R533A取代，編號基於AAVrh8R的VP1(SEQ ID NO：9)。
本發明還提供含有rAAV顆粒或包含rAAV顆粒的組成物的套組，所述rAAV顆粒具有(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。這些套組用於將異源核酸遞送至個體的眼部或CNS，以及用於治療個體中的眼部或CNS病症(例如，治療視網膜病或亨廷頓氏病)。
I.一般技術
本領域的技術人員一般地充分理解並使用常規方法通常地採用本申請所描述或涉及的技術和步驟，如，例如，如下文獻中描述的廣泛利用的方法：Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Sambrook等，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，等編，2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor編，1995)；Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane編，1988)；Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique和Specialized Applications(R.I.Freshney，第6版，J.Wiley和Sons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，Academic Press,1998)；Introduction to Cell和Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell和Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell編，J.Wiley和Sons,1993-8)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編，1996)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，J.Wiley和Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等，2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)；和Cancer：Principles和Practice of Oncology(V.T.DeVita等編，J.B.Lippincott Company,2011)。
II.定義
如本申請中使用的，“載體”指重組質體或病毒，其包含待體外或體內遞送入宿主細胞的核酸。
如本申請中使用的術語“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，此術語包括但不限於單-、雙-或多-鏈DNA或RNA、基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜合體或包含嘌呤和嘧啶鹼基的聚合物，或其他天然的、化學或生物化學修飾的、非天然或衍生化的核苷酸鹼基。多核苷酸的骨架能夠包含糖和磷酸基團(如通常可在RNA或DNA中找到的)，或修飾的或取代的糖或磷酸基團。可替換地，多核苷酸的骨架能夠包含合成的次單元如亞磷醯胺(phosphoramidate)的聚合物，並由此能夠為寡去氧核苷亞磷醯胺(P-NH2)或混合的亞磷醯胺-磷酸二酯(phosphoramidate-phosphodiester)寡聚物。此外，雙鏈多核苷酸能夠從化學合成的單鏈多核苷酸產物通過合成互補鏈並在適當的條件下退火所述鏈或者通過使用DNA聚合酶以適當的引物從頭合成互補鏈來獲得。
術語“多肽”和“蛋白質”可互換使用以指胺基酸殘基的聚合物，並不限於最小長度。所述胺基酸殘基的聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基，並包括但不限於肽、寡肽、胺基酸殘基的二聚體、三聚體和多聚體。所述定義涵蓋全長蛋白質和其片段兩者。所述術語還包括多肽的表現後修飾，例如，糖基化 (glycosylation)、唾液酸化(sialylation)、乙醯化(acetylation)、磷酸化(phosphorylation)等。此外，就本發明而言，“多肽”指蛋白質，其包括對於天然序列的修飾，如缺失、添加和取代(通常在性質上是保守的)，只要所述蛋白質維持所期望的活性。 這些修飾可為故意的，如通過定位誘變(site-directed mutagenesis)，或可為意外的，如通過產生所述蛋白質的宿主的突變或由於PCR擴增的錯誤得到的。
“重組病毒載體”指重組多核苷酸載體，其包含一個或多個異源序列(即，非病毒來源的核酸序列)。在重組AAV載體的情況中，重組核酸側翼為至少一個反向末端重複序列(ITR)。在一些具體實例中，重組核酸側翼為兩個ITR。
“重組AAV載體(rAAV載體)”指多核苷酸載體，其包含一個或多個異源序列(即，非AAV來源的核酸序列)，其側翼為至少一個AAV末端反向重複序列(ITR)。所述rAAV載體當存在於已用合適的輔助病毒感染的(或者正在表現合適的協助工具的)以及正在表現AAV rep和cap基因產物(即AAV Rep和Cap蛋白質)的宿主細胞中時可複製並包裝入感染性病毒顆粒。當將rAAV載體併入較大的多核苷酸(例如，於染色體中或於另一載體，如用於選殖或轉染的質體中)時，則rAAV載體可稱為“pro-載體”，其能夠通過在AAV包裝功能和合適的協助工具的存在下複製和衣殼化而被“拯救”。rAAV載體可為多種形式中的任一種，包括但不限於質體、線性人工染色體、與脂質複合、包囊於脂質體內和在病毒顆粒(例如，AAV顆粒)中衣殼化。可將rAAV載體包裝入AAV病毒衣殼以生成“重組腺相關 病毒顆粒(rAAV顆粒)”。
“rAAV病毒”或“rAAV病毒顆粒”指由至少一個AAV衣殼蛋白和衣殼化的rAAV載體基因組組成的病毒顆粒。
“異源”意指源自與和其比較的或引入或併入其的實體的其餘部分在基因型上截然不同的實體。例如，通過基因工程技術引入不同細胞類型的多核苷酸是異源多核苷酸(而且，當表現時，能夠編碼異源多肽)。類似地，併入病毒載體的細胞序列(例如，基因或其部分)是相對於所述載體的異源核苷酸序列。
術語“轉殖基因”指引入細胞並能夠被轉錄成RNA且任選地在適當條件下轉譯和/或表現的多核苷酸。在一些方面，它賦予它所引入的細胞期望的性質或以其他方式導致期望的治療或診斷結果。在另一個方面，它可轉錄成介導RNA干擾的分子，如miRNA、siRNA或shRNA。
如涉及病毒效價使用的術語“基因組顆粒(gp)”、“基因組等同物”或“基因組拷貝”指含有重組AAV DNA基因組的病毒體的數目，而無論感染性或功能性。特定載體製備物中的基因組顆粒的數目能夠藉由如本文實施例中，或例如Clark等(1999)Hum.Gene Ther.,10：1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6：272-278中所述的步驟來測量。
如本申請使用的術語“載體基因組(vg)”可指一個或多個多核苷酸，其包含載體(例如病毒載體)的一組多核苷酸序列。載體基因組可衣殼化在病毒顆粒中。依賴於特定的病毒載體，載體基因組可包含單鏈DNA、雙鏈DNA或單鏈RNA或雙鏈RNA。 載體基因組可包括與特定病毒載體相關聯的內源序列和/或通過重組技術插入特定病毒載體的任何異源序列。例如，重組AAV載體基因組可包括至少一個ITR序列，其在啟動子、填充片段(stuffer)、感興趣的序列(例如，RNAi)和聚腺苷酸化序列的側翼。完全的載體基因組可包括載體的完整的多核苷酸序列組。在一些具體實例中，病毒載體的核酸效價可以vg/mL測量。適於測量此效價的方法是本領域已知的(例如，定量PCR)。
如涉及病毒效價使用的術語“感染單位(iu)”、“感染顆粒”或“複製單位”指如通過感染中心測定法(也稱為複製中心測定法，如，例如，McLaughlin等(1988)J.Virol.,62：1963-1973中所述)測量的感染性的和有複製能力的(replication-competent)重組AAV載體顆粒的數目。
如涉及病毒效價使用的術語“轉導單位(tu)”指如在功能測定法(如本文實施例中，或例如，Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144：113-124中；或Fisher等(1996)J.Virol.,70：520-532(LFU測定法)中描述的)中測量的導致功能性轉殖基因產物產生的感染性的重組AAV載體顆粒的數目。
“反向末端重複”或“ITR”序列是本領域中充分理解的術語並指見於病毒基因組末端的處於反方向的相對短的序列。
本領域中充分理解的術語“AAV反向末端重複(ITR)”序列是大約145-核苷酸的序列，其存在於天然單鏈AAV基因組的兩個末端。ITR的最外側的125個核苷酸能夠以兩個可選方向的任一個存在，這導致不同AAV基因組之間和單AAV基因組的兩末端之間的異質性。最外側的125個核苷酸也含有自互補 性的幾個較短區(定名為A、A'、B、B'、C、C'和D區)，允許鏈內鹼基配對在ITR的此部分內發生。
“末端解析序列”或“trs”是AAV ITR的D區中的序列，其在病毒DNA複製過程中通過AAV rep蛋白質切割。突變體末端解析序列難以受到(refractory to)AAV rep蛋白質的切割。
AAV的“輔助病毒”指允許AAV(其為缺陷性細小病毒(defective parvovirus))被宿主細胞複製並包裝的病毒。已鑑定了多個這樣的輔助病毒，包括腺病毒(adenoviruses)、皰疹病毒(herpesviruses)和痘病毒(poxviruses)如牛痘(vaccinia)。腺病毒涵蓋多個不同的亞組，儘管亞組C的腺病毒5型(Ad5)是最通常使用的。人、非人哺乳動物和禽來源的多種腺病毒是已知的，並可由保藏機構如ATCC得到。還可由保藏機構如ATCC得到的皰疹家族的病毒包括，例如，單純皰疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、巨細胞病毒(CMV)和假狂犬病病毒(pseudorabies viruses)(PRV)。
相對於參考多肽或核酸序列的“百分比(%)序列同一性”定義為在比對序列並引入缺口(如果需要)以實現最大百分比序列同一性而不考慮任何保守取代作為序列同一性的部分後，候選序列中胺基酸殘基或核苷酸與參考多肽或核酸序列中的胺基酸殘基或核苷酸相同的百分比。出於確定百分比胺基酸或核酸序列同一性目的的比對能夠以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如，使用公眾可獲得的電腦軟體程式，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編，1987),Supp.30,7.7.18節，表7.7.1中所述的那些，並包括BLAST、BLAST-2、 ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。比對程式的一個實例是ALIGN Plus(Scientific和Educational Software,Pennsylvania)。 本領域的技術人員能夠確定測量比對的適當的參數，其包括實現被比較的序列的全長上的最大對齊所需要的任何演算法。就本文的目的而言，給定胺基酸序列A對、與或針對給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(其能夠可選地措辭為對、與或針對給定胺基酸序列B具有或包含一定%胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)計算如下：100乘以分數X/Y，其中X是A和B的該程式比對中由序列比對程式計分為同一匹配的胺基酸殘基的數目，和其中Y是B中胺基酸殘基的總數。可理解的是其中胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度，A對B的%胺基酸序列同一性不等於B對A的%胺基酸序列同一性。就本文的目的而言，給定核酸序列C對、與或針對給定核酸序列D的%核酸序列同一性(其能夠可選地措辭為對、與或針對給定核酸序列D具有或包含一定%核酸序列同一性的給定核酸序列C)計算如下：100乘以分數W/Z，其中W是C和D的該程式比對中由序列比對程式計分為同一匹配的核苷酸的數目，和其中Z是D中核苷酸的總數。可理解的是其中核酸序列C的長度不等於核酸序列D的長度，C對D的%核酸序列同一性不等於D對C的%核酸序列同一性。
“分離的”分子(例如，核酸或蛋白質)或細胞意指它已被鑑定和分離和/或從其天然環境的組分回收。
“有效量”是足以實現有益或期望的結果，包括臨床結果(例如，改善症狀，實現臨床終點等)的量。有效量可以在一個或 多個施用中施用。就疾病狀態而言，有效量是足以改善、穩定、或延遲疾病發展的量。
“個體”或“受試者”是哺乳動物。哺乳動物包括，但不限於，馴養動物(例如，牛，羊，貓，狗，和馬)，靈長類動物(例如，人和非人靈長類動物如猴)，兔，和齧齒類動物(例如，小鼠和大鼠)。在某些具體實例中，個體或受試者是人。
如本申請中使用的，“治療”是用於獲得有益或期望的臨床結果的方法。對於本發明的目的，有益的或期望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕，疾病程度的降低，穩定(例如，不惡化)疾病狀態，防止疾病的傳播(例如，轉移)，疾病進展的延遲或減緩，疾病狀態的改善或減輕，和緩解(無論部分或全部)，無論可檢測或不可檢測的。“治療”也能意味著與如果不接受治療預期的存活相比延長的存活。
如本申請中使用的，術語“預防處理”指處理/治療，其中個體已知或疑似患有病症或處於患有病症的風險但未顯示病症的症狀或顯示最少症狀(minimal symptoms)。經歷預防處理的個體可在症狀發作前得到處理/治療。
如本申請中使用的，“治療”劑(例如，治療性多肽、核酸或轉殖基因)是一種藥劑，其提供有益的或所欲的臨床結果，如上述的例示性臨床結果。如此，治療劑可用於如上所述的治療。
如本申請中使用的術語“中央視網膜”指外黃斑(outer macula)和/或內黃斑(inner macula)和/或凹(fovea)。如本申請中使用的術語“中央視網膜細胞類型”指中央視網膜的細胞類型， 如，例如RPE和感光細胞。
術語“黃斑”指靈長類中中央視網膜中的區，其含有與外周視網膜相比更高相對濃度的感光細胞，特別是視桿細胞和視錐細胞。如本申請中使用的術語“外黃斑”還可稱為“外周黃斑”。如本申請中使用的術語“內黃斑”還可稱為“中央黃斑”。
術語“凹”指靈長類的中央視網膜中的社區，直徑約等於或小於0.5mm，其含有與外周視網膜和黃斑相比更高相對濃度的感光細胞，特別是視錐細胞。
如本申請中使用的術語“視網膜下空間”指視網膜中感光細胞和視網膜色素上皮細胞之間的部位。視網膜下空間可為潛在的空間，如在流體的任何視網膜下注射之前。視網膜下空間還可含有注射入潛在空間的流體。在此情況中，所述流體“與視網膜下空間接觸”。“與視網膜下空間接觸”的細胞包括毗連視網膜下空間邊界的細胞，如RPE和感光細胞。
如本申請中使用的術語“泡(bleb)”指眼的視網膜下空間內的流體空間。本發明的泡可通過如下產生：將流體單次注射入單個空間，將一種或多種流體多次注射入相同空間，或多次注射入多個空間，其當復位時產生用於對視網膜下空間的期望的部分實現治療效果的全流體空間(total fluid space)。
“視紫紅激酶(RK)啟動子”指源自視紫紅激酶基因(例如，人RK，由GenBank Entrez Gene ID 6011代表)的多核苷酸序列，其特異性驅動視桿和視錐感光細胞以及視網膜細胞系如WERI Rb-1中的表現。如本申請中使用的，“視紫紅激酶啟動子”可指整個啟動子序列或所述啟動子足以驅動光感受器特異 性表現的片段，如Khani,S.C.，等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48(9)：3954-61和Young,J.E.，等(2003)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.44(9)：4076-85中所述的序列。在一些具體實例中，RK啟動子跨越-112至+180，相對於轉錄起始位點。
“雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子”指源自雞β-肌動蛋白基因(例如，原雞(Gallus gallus)β-肌動蛋白，由GenBank Entrez Gene ID 396526代表)的多核苷酸序列。如本申請中使用的，“雞β-肌動蛋白啟動子”可指啟動子，其含有巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件、雞β-肌動蛋白基因的啟動子和第一外顯子和內含子，和兔β-球蛋白基因的剪接受體，如Miyazaki,J.，等(1989)Gene 79(2)：269-77中所述的序列。如本申請中使用的，可與術語“CAG啟動子”互換使用。如本申請中使用的，可與術語“CMV早期增強子/雞β-肌動蛋白(CAG)啟動子”互換使用。
本申請提及值或參數的“約”包括(和描述)涉及該值或參數本身的具體實例。例如，提及“約X”的描述包括“X”的描述。如本申請中使用的，物品的單數形式“一個/一種”和“該”包括複數指稱，除非另外指示。
可理解的是，本申請所述本發明的方面和具體實例包括“包含”、“由...組成”和/或“基本上由...組成”。
III.病毒顆粒
硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)是本領域已知的以充當AAV2顆粒的細胞受體(Summerford,C.和Samulski,R.J.(1998)J.Virol.72(2)：1438-45)。AAV2顆粒和細胞膜處HSPG之間的 結合用於將顆粒附接於細胞。其他細胞表面蛋白質如成纖維細胞生長因子受體和αvβ5整聯蛋白亦可促進細胞感染。在結合之後，AAV2顆粒可藉由包括受體介導的胞吞作用的機制經由網格蛋白小窩(clathrin-coated pit)進入細胞。AAV2顆粒可在內涵體酸化(endosomal acidification)後從細胞內小泡釋放。這允許AAV2顆粒行至核周區然後至細胞核。還已知AAV3顆粒結合乙醯肝素(Rabinowitz,J.E.，等(2002)J.Virol.76(2)：791-801)。
眼的病症的基因治療規程需要將載體局部遞送至眼部中的細胞(例如，視網膜的細胞)。可作為這些疾病中治療靶物的細胞可包括尤其是眼部的一種或多種細胞(例如，光感受器、眼神經元等)。本發明的方法和套組基於，至少部分基於如下發現：特定的rAAV衣殼(例如，包含rAAV衣殼蛋白的那些，所述衣殼蛋白在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置包含一個或多個胺基酸取代)允許在眼部細胞中廣布的載體分佈。如此，這些衣殼可特別有利地用於將異源核酸遞送至個體的眼部、改善在將rAAV顆粒遞送至個體的眼後細胞的rAAV轉導、改善將rAAV顆粒遞送至個體的眼後異源核酸的表現、和/或使用rAAV顆粒治療個體的眼部病症。
同樣地，CNS的病症的基因治療規程需要將載體局部遞送至CNS中的細胞。可作為這些疾病中治療靶物的細胞可包括尤其是一種或多種腦細胞(例如，神經元)。本發明的方法和套組基於，至少部分基於如下發現：特定的rAAV衣殼(例如，包含rAAV衣殼蛋白的那些，所述衣殼蛋白在與硫酸乙醯肝素 蛋白多糖相互作用的一個或多個位置包含一個或多個胺基酸取代)允許在CNS的細胞中廣布的載體分佈。如此，這些衣殼可特別有利地用於將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)、改善在將rAAV顆粒遞送至個體的CNS後細胞的rAAV轉導、改善將rAAV顆粒遞送至個體的CNS後異源核酸的表現、和/或使用rAAV顆粒治療個體的CNS的病症。
AAV(例如，AAV2,AAVrh8R等)的衣殼已知包括三種衣殼蛋白：VP1、VP2和VP3。這些蛋白質含有顯著量的重疊胺基酸序列和獨特的N-末端序列。AAV2衣殼包括通過二十面體對稱安排的60個次單元(Xie,Q.，等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.99(16)：10405-10)。已發現VP1、VP2和VP3以1：1：10比例存在。
AAV2衣殼蛋白和HSPG之間的結合已知經由鹼性AAV2衣殼蛋白殘基和帶負電的糖胺聚糖殘基之間的靜電相互作用發生(Opie,SR等，(2003)J.Virol.77：6995-7006；Kern,A等，(2003)J.Virol.77：11072-11081)。這些相互作用中牽涉的特定衣殼殘基包括R484、R487、K532、R585和R588。已顯示這些殘基中的突變可降低AAV2與Hela細胞和乙醯肝素自身的結合(Opie,SR等，(2003)J.Virol.77：6995-7006；Kern,A等，(2003)J.Virol.77：11072-11081；WO 2004/027019 A2、美國專利號7,629,322)。此外，不希望受限於理論，認為在一個或多個對應於胺基酸484、487、532、585或588的殘基的胺基酸取代(編號基於AAV2的VP1編號)可調節不結合HSPG的AAV衣殼類型的轉導性質，或可不依賴於其結合HSPG的能力調節 AAV衣殼類型的轉導性質。
本發明的一些方面涉及將異源核酸遞送至個體的眼部或中樞神經系統(CNS)，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的眼部或CNS。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含含有rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述衣殼蛋白在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置包含一個或多個胺基酸取代。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼。
如本申請中所述，在衣殼蛋白中在與HSPG相互作用的殘基或在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個殘基(編號基於AAV2的VP1編號)具有突變的rAAV顆粒顯示有利的性質，如增強的表現和/或降低的神經炎症。因此，在一些具體實例中，遞送後由rAAV載體編碼的異源核酸以與包含含有參考rAAV衣殼蛋白(例如，野生型rAAV衣殼蛋白)的rAAV衣殼的rAAV顆粒的異源核酸的表現水平相比增加的表現水平表現。在一些具體實例中，核酸的表現增加至少大約10%，至少大約25%，至少大約50%，至少大約75%或至少大約100%。在一些具體實例中，遞送後所述rAAV顆粒引起與包含參考rAAV衣殼蛋白(例如，野生型rAAV衣殼蛋白)的rAAV顆粒相比降低的神經炎症。在一些具體實例中，將神經炎症減少至少大約10%，至少大約25%，至少大約50%，至少大約75%，或至少大約100%。合適的參考rAAV衣殼蛋白可包括任何衣殼蛋白，其在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的 一個或多個位置缺少一個或多個胺基酸取代(參考衣殼可由此含有一個或多個“背景”取代，其不改變與HSPG的結合)。
在一些具體實例中，本發明提供用於將異源核酸遞送至個體眼部的方法，其包括將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的視網膜下空間，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV2的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代，其中所述胺基取代改變所述rAAV顆粒與HSPG的相互作用(例如，降低或去除與HSPG的結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP1 AAV2的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP2AAV2的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP3 AAV2的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV2的VP1、VP2和VP3的組合的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV2的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是SEQ ID NO：1、3和/或5的衣殼蛋白的任一者的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含SEQ ID NO：2、4和/或6的衣殼蛋白。
在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型3(AAV3)衣殼。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV3的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代，其中所述胺基取代改變所述rAAV顆粒與HSPG的相互作用(例如，降低或去除與HSPG的結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP1 AAV3的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP2AAV3的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP3 AAV3的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV3的VP1、VP2和VP3的組合的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAV3的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是對應於SEQ ID NO：7的衣殼蛋白的胺基酸殘基的取代。
在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼，例如，如U.S.PG Pub.No.20090317417中所述。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAVrh8R的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代，其中所述胺基取代改變所述rAAV顆粒與HSPG的相互作用(例如，降低或去除與HSPG的結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP1 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP2 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中， 所述一個或多個胺基酸取代是VP3 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAVrh8R的VP1、VP2和VP3的組合的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAVrh8R的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是由SEQ ID NO：9例示的衣殼蛋白的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含SEQ ID NO：10和/或11的衣殼蛋白。
在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少25%、約至少50%、約至少75%或約至少100%。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低約至少10%、約至少15%、約至少20%、約至少25%、約至少30%、約至少35%、約至少40%、約至少45%、約至少50%、約至少55%、約至少60%、約至少65%、約至少70%、約至少75%、約至少80%、約至少85%、約至少90%、約至少95%，或約至少100%(與包含野生型衣殼的rAAV顆粒的結合相比)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代將所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合降低下述任一者：約10%至約100%、約20%至約100%、約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約10%至約90%、約20%至約90%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約 90%、約70%至約90%、約80%至約90%、約10%至約80%、約20%至約80%、約30%至約80%、約40%至約80%、約50%至約80%、約60%至約80%、約70%至約80%、約10%至約70%、約20%至約70%、約30%至約70%、約40%至約70%、約50%至約70%、約60%至約70%、約10%至約60%、約20%至約60%、約30%至約60%、約40%至約60%、約50%至約60%、約10%至約50%、約20%至約50%、約30%至約50%、約40%至約50%、約10%至約40%、約20%至約40%、約30%至約40%、約10%至約30%、約20%至約30%或約10%至約20%(與包含野生型衣殼的rAAV顆粒的結合相比)。在一些具體實例中，與野生型rAAV顆粒的結合相比，所述一個或多個胺基酸取代導致無可檢測的所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。測量AAV顆粒與HSPG的結合的手段是本領域已知的；例如，結合於硫酸乙醯肝素層析介質或結合於已知在其表面表現HSPG的細胞。例如，參見Opie,SR等，(2003)J.Virol.77：6995-7006和Kern,A等，(2003)J.Virol.77：11072-11081。
在一些具體實例中，本發明提供rAAV顆粒用於視網膜下遞送治療性核酸，其中所述rAAV顆粒包含衣殼蛋白的一個或多個胺基酸取代，其降低或去除所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合，其中所述一個或多個胺基酸取代在位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的VP1的位置484、487、532、585或588。在一些具體實例中， 所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的VP2的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的VP3的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的VP1、AAV2的VP2和/或AAV2的VP3的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，rAAV2的VP1包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV3的VP1的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV3的VP2的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV3的VP3的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV3的VP1、AAV3的VP2和/或AAV3的VP3的位置484、487、532、585或588，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，rAAV2的VP1包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
在一些具體實例中，本發明的AAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基 酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用疏水性胺基酸殘基取代所述帶正電的胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水性胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置R533和/或A586的取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在進一步的具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代A586R和/或R533A，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：10和/或11的rAAV衣殼蛋白。
在本發明的一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用不帶正電的胺基酸殘基(例如，不含有帶正電的側鏈的胺基酸)取代帶正電的胺基酸殘基(例如，具有帶正電的側鏈的胺基酸)。帶正電的胺基酸包括精胺酸、組胺酸和賴胺酸。不帶正電的胺基酸殘基的實例包括帶負電的胺基酸(天冬胺酸和谷胺酸)、具有不帶電荷的極性側鏈的胺基酸(絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺和穀胺醯胺)、具有疏水側鏈的胺基酸(丙胺酸、纈胺 酸、異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸)、甘胺酸、半胱胺酸和脯胺酸。在一些具體實例中，AAV衣殼的一個或多個帶正電的胺基酸殘基用疏水性胺基酸殘基取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含精胺酸或賴胺酸殘基的取代。在進一步的具體實例中，一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。在其他具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用帶正電的胺基酸殘基取代不帶正電的胺基酸殘基。在一些具體實例中，用帶正電的胺基酸殘基取代疏水性胺基酸殘基。在進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含丙胺酸殘基的取代。在又進一步的具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。
在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含VP1、VP2和/或VP3在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV2的VP1、VP2和/或VP3在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV2的VP1、VP2和/或VP3在位置R484、R487、K527、K532和/或R588的取代，編號基於SEQ ID NO：1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV2的VP1、VP2和/或VP3的R484A、R487A、R585A和/或R588A的一個或多個取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV3的VP1、VP2和/ 或VP3在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV3的VP1、VP2和/或VP3的R484A、R487A、R585A和/或R588A的一個或多個取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NOs：2、4和/或6的rAAV衣殼蛋白。
在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含VP1、VP2和/或VP3在位置R485、R488、R533、A586和/或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含VP1、VP2和/或VP3的在位置R485、R488、R533、A586和/或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1，編號基於SEQ ID NO：9。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含AAV2的VP1、VP2和/或VP3的R533A和/或A586R的一個或多個取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含SEQ ID NO：10和/或11的rAAV衣殼蛋白。
在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與HSPG相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在降低或去除與HSPG的結合的一個或多個位置。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸取代，其降低或去除與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述AAV衣殼具有一、二、三、四、五、六、七、八、九或十個胺基酸取代，其 降低或去除與HSPG的結合。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含在位置R484和R487的取代，編號基於rAAV2的VP1。 在一些具體實例中，所述AAV衣殼具有在位置R484和R487的取代，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含在位置R585和R588的取代，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼具有在位置R585和R588的取代，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含取代R484A和R487A，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼具有取代R484A和R487A，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含取代R585A和R588A，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼具有取代R585A和R588A，編號基於rAAV2的VP1。
已知硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPGs)在遍及身體的多個組織中表現，並在細胞外基質、細胞黏附和細胞信號傳導中起重要的作用。在一些具體實例中，所述硫酸乙醯肝素蛋白多糖在CNS的一種或多種細胞上表現。在一些具體實例中，所述CNS的一種或多種細胞是神經元。
在一些具體實例中，本發明提供rAAV顆粒用於CNS遞送治療性核酸，其中所述rAAV顆粒包含衣殼蛋白的一個或多個胺基酸取代，其降低或去除所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588，編號基於AAV2的VP1。如本申請中使 用的，“編號基於AAV2的VP1”指所述衣殼蛋白的胺基酸對應於AAV2的VP1的所述胺基酸。例如，如果一個或多個胺基酸取代在位置347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588，編號基於AAV2的VP1，則所述一個或多個胺基酸取代在所述衣殼蛋白對應於AAV2的VP1的胺基酸347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588的胺基酸處。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置R347、R350、K390、K395、R448、R451、R484、R487、K527、K532、R585和/或R588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的位置484、487、532、585或588。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在AAV2的VP1、AAV2的VP2和/或AAV2的VP3的位置484、487、532、585或588，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV2的VP1(例如，rAAV2)包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。
在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含在位置R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於RAAV2的VP1。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含SEQ ID NO：2、4和/或6的衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含在位置R484和R487或R585和R588的取代，編號基於rAAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代R585A和R588A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例 中，所述AAV衣殼包含胺基酸取代K532A，編號基於AAV2的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含R347A、R350A、K390A、K395A、R448A、R451A、R484A、R487A、K527A、K532A、R585A和/或R588A取代，編號基於AAV2的VP1。
在一些具體實例中，本發明提供rAAV顆粒用於CNS遞送治療性核酸，其中所述rAAV顆粒包含衣殼蛋白的一個或多個胺基酸取代，其降低或去除所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼，例如，如U.S.PG Pub.No.20090317417中所述。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代為AAVrh8R的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代，其中所述胺基取代改變所述rAAV顆粒與HSPG的相互作用(例如，降低或去除與HSPG的結合)。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP1 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP2 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代是VP3 AAVrh8R的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAVrh8R的VP1、VP2和VP3的組合的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是AAVrh8R的VP1、VP2和/或VP3的任一者的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，一個或多個胺基酸取代是由SEQ ID NO：9例示的衣殼蛋白的胺基酸殘基的取代。在一些具體實例中，本發明的rAAV顆粒包 含SEQ ID NO：10和/或11的衣殼蛋白。
在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述編號基於包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列的AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置A586和/或T589的取代，編號基於AAVrh8R的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A586R取代，編號基於AAVrh8R的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R或T589K取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
如上所討論的，不希望受限於理論，認為在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個殘基的胺基酸取代(編號基於AAV2的VP1編號)可調節不結合HSPG的AAV衣殼類型的轉導性質，或可不依賴於其結合HSPG的能力調節AAV衣殼類型的轉導性質。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含對應於圖20中所示的胺基酸的一個或多個胺基酸。例如，在一些具體實例中，在對應於胺基酸585和/或588(編號基於AAV2的VP1)的位置的一個或多個胺基酸被精胺酸殘基替代(例如，AAV1或AAV6的S586和/或T589；AAV9的S586和/或A589；AAVrh8R的A586和/或T589；AAV8的Q588和/或T591；和AAVrh10的Q588和/或A591)。這些修飾的衣殼可用於，尤其是，改善靶向視網膜的玻璃體內轉導。在其他具體實例中，在對應於胺基酸484,487,527和/或532 (編號基於AAV2的VP1)的位置的一個或多個胺基酸(例如，精胺酸或賴胺酸)被不帶正電的胺基酸如丙胺酸替代(例如，AAV1或AAV6的R485、R488、K528和/或K533；AAV9或AAVrh8R的R485、R488、K528和/或R533；和AAV8或AAVrh10的R487、R490、K530和/或R535)。這些修飾的衣殼可用於，尤其是，改善視網膜下或CNS轉導。
在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型1(AAV1)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV1的VP1編號。在一些具體實例中，所述AAV1的VP1包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或T589的取代，編號基於AAV1的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含S586R或S586K取代，編號基於AAV1的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R取代，編號基於AAV1的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型6(AAV6)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV6的VP1編號。在一些具體實例中，編號基於包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的AAV6的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或T589的取代，編號基於AAV6的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含S586R或S586K取代，編號基於AAV6的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T589R 取代，編號基於AAV6的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型8(AAV8)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置588和/或591，編號基於AAV8的VP1編號。在一些具體實例中，編號基於包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列的AAV8的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置Q588和/或T591的取代，編號基於AAV8的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含Q588R或Q588K取代，編號基於AAV8的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含T591R取代，編號基於AAV8的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型9(AAV9)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置586和/或589，編號基於AAV9的VP1編號。在一些具體實例中，編號基於包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列的AAV9的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置S586和/或A589的取代，編號基於AAV9的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含S586R或S586K取代，編號基於AAV9的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A589R或A589K取代，編號基於AAV9的VP1。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含AAV血清型rh10(AAVrh10)衣殼。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代在位置588和/或591，編號基於AAVrh10的VP1編號。在一些具體實例中，編號基於AAVrh10的VP1，所述AAVrh10包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列。在一些具體實例 中，所述一個或多個胺基酸取代包含在位置Q588和/或A591的取代，編號基於AAVrh10的VP1編號。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含Q588R或Q588K取代，編號基於AAVrh10的VP1。在一些具體實例中，所述一個或多個胺基酸取代包含A591R取代，編號基於AAVrh10的VP1。
IV.治療方法
用於視網膜疾病如LCA、色素性視網膜炎和與年齡相關的黃斑退化性改變的基因治療規程需要將載體局部遞送至視網膜中的細胞。在這些疾病中作為治療靶物的細胞為視網膜中的感光細胞或感覺神經性視網膜下的(underlying the neurosensory retina)RPE的細胞。將基因治療載體遞送至這些細胞需要注射入視網膜和RPE之間的視網膜下空間。在一些具體實例中，本發明提供將rAAV基因治療載體遞送至視網膜的細胞的方法，其中所述rAAV載體在AAV衣殼中衣殼化，所述AAV衣殼包含與HSPG相互作用的一個或多個胺基酸殘基的取代。
在一些方面中，本發明提供治療個體的CNS的病症的方法，其包括將包含rAAV顆粒的組成物遞送至個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包括所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。此外，本申請所述的用於將異源核酸遞送至個體的中樞 神經系統(CNS)的方法、改進在將rAAV顆粒遞送至個體的CNS後細胞的rAAV轉導的方法和改進在將rAAV顆粒遞送至個體的CNS後異源核酸的表現的方法可用於遞送，例如，異源核酸，如編碼治療性多肽或治療性核酸的異源核酸。這些方法可用於，尤其是，治療CNS的病症。在一些具體實例中，所述個體是人。
治療載體
本發明提供眼部病症的基因治療的方法，其中將包含治療載體的rAAV顆粒遞送至個體的視網膜。視網膜的細胞的改善的轉導可通過將rAAV載體在rAAV衣殼(例如，rAAV2、rAAVrh8R等顆粒)中衣殼化來實現，其中衣殼的與HSPG相互作用的一個或多個胺基酸被取代使得所述rAAV顆粒與HSPG的結合降低或去除。所述載體可包含編碼多肽(例如，治療性或診斷性多肽)的異源核酸和/或治療性核酸。編碼治療性或診斷性多肽的核酸和/或治療性核酸能夠使用本領域已知的方法使用標準的合成和重組方法來生成。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼診斷性多肽。編碼治療性多肽的核酸的非限制性實例包括：用於替換已知引起視網膜疾病的丟失或突變的基因的核酸，例如Prph2、RPE65、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3和GNAT2。編碼治療性多肽的核酸的其他非限制性實例包括編碼神經營養因子(如GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO)、抗凋亡基因(anti-apoptotic genes)(如BCL2、BCL-X、 NFκB)、抗血管生成因子(如內皮他汀(Endostatin)、血管他汀(Angiostatin)、sFlt)和抗炎因子(如IL10、IL1-ra、TGFβ、IL4)的那些。用於眼部病症的其他治療性多肽包括但不限於Myo7a、ABCA4、REP1、GUCY2D、PDE6C、RS1、RPGRIP、Lpcat1、AIPL1、RDH12、CHM。在一些具體實例中，編碼的多肽是多肽的人變體。
本發明的核酸可編碼多肽，所述多肽為細胞內蛋白質、錨定於細胞膜中、保持在細胞內，或由用本發明的載體轉導的細胞分泌。對於由接受載體的細胞分泌的多肽；所述多肽可為可溶的(即，不附接於細胞)。例如，可溶的多肽缺乏跨膜區並從細胞分泌。鑑定並移出編碼跨膜域的核酸序列的技術是本領域已知的。
可根據本發明施用的載體還包括包含核酸的載體，所述核酸編碼RNA(例如，RNAi、核酶、miRNA、siRNA、反義RNA)，所述RNA當從載體的核酸轉錄時可通過干擾與本發明的疾病狀態相關的異常或過量蛋白質的轉譯或轉錄來治療眼部病症。例如，本發明的核酸可編碼RNA，所述RNA通過高度特異性消除或減少編碼所述異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療疾病。治療性RNA序列包括RNAi、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和/或核酶(如錘頭核酶和髮夾核酶)，其可通過高度特異性消除或減少編碼所述異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療疾病，所述蛋白質如遺傳的視網膜退化的多種形式中存在的那些。可通過治療性RNA序列治療的眼部病症的非限制性實例包括，例如，體染色體顯性色素性視網膜炎(ADRP)和 糖尿病視網膜病。可用於本發明的治療性RNA序列和編碼這些序列的核酸的實例包括例如，美國專利號6,225,291中所述的那些，其公開的內容係以參考方式整體併入本文。在一些具體實例中，所述治療性RNA序列是miR-708。在一些具體實例中，miR-708與編碼野生型視紫紅質的核酸組合使用，作為相同rAAV載體的部分或者作為第二rAAV載體的部分。在一些具體實例中，編碼所述野生型視紫紅質的核酸缺乏位於視紫紅質基因的3’非轉譯區的miR-708靶序列。編碼miR-708和/或視紫紅質的rAAV載體由美國臨時專利申請案序號No.61/969,027提供，其以參考方式整體併入本文。
本發明的一些方面涉及rAAV顆粒(例如，治療載體)的用途，所述rAAV顆粒包含(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽或治療性核酸。如本申請中使用的，治療性核酸可表現本公開的任何治療性核酸或編碼本公開的治療性多肽的任何核酸。例如，可使用治療性核酸以減輕病症的症狀、防止或延遲病症的進展和/或提供病症的治療(所述病症例如本申請所述的病症)。
CNS的細胞的改進的轉導可藉由將rAAV載體在rAAV衣殼(例如，rAAV2、rAAVrh8R等)中衣殼化來實現，其中所述衣殼的與HSPG相互作用的一個或多個胺基酸被取代，使得所 述rAAV顆粒與HSPG的結合降低或去除。所述載體可包含編碼多肽(例如，治療性或診斷性多肽)的異源核酸和/或治療性核酸。編碼治療性或診斷性多肽的核酸和/或治療性核酸可使用本領域已知的方法使用標準的合成和重組方法生成。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼診斷性多肽。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼CNS-相關的基因。
在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性核酸。在一些具體實例中，治療性核酸可包括而不限於siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。如此，治療性核酸可編碼RNA，所述RNA當從所述載體的核酸轉錄時可通過干擾與本發明的病症相關的異常或過量蛋白質的轉錄或轉譯來治療本發明的病症(例如，CNS的病症)。例如，本發明的核酸可編碼RNA，所述RNA通過高度特異性消除或減少編碼所述異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療病症。治療性RNA序列包括RNAi、小抑制RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和/或核酶(如錘頭核酶和髮夾核酶)，其可通過高度特異性消除或減少編碼所述異常和/或過量蛋白質的mRNA來治療病症。
在一些具體實例中，所述異源核酸編碼治療性多肽。治療性多肽可例如供給多肽和/或酶活性，其不存在或以降低的水平存在於細胞或生物體。可替換地，治療性多肽可供給多肽和/或酶活性，其間接地抵銷細胞或生物體中的不平衡。例如，用於涉及由代謝酶或活性的缺乏而引起的代謝物的積累的病症的治療性多肽可供給丟失的代謝酶或活性，或其可供給導致 代謝物減少的替換的代謝酶或活性。治療性多肽還可用於通過充當例如，顯性負性(dominant-negative)多肽來降低多肽的活性(例如，過表現的、被功能獲得型突變啟動的、或其活性以其他方式誤調節的(misregulated)。
在一些具體實例中，所述異源核酸編碼選自如下的多肽：酶、神經營養因子、在患CNS-相關病症的個體中缺乏或突變的多肽、抗氧化劑、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。所述多肽可用於通過如下來治療CNS的病症：例如，供給在CNS的病症中減少、不存在或誤調節的多肽和/或酶活性，改善CNS病症的病因和/或症狀，和/或減緩由CNS病症引起的對CNS的損害(例如，細胞凋亡、炎症或其他形式的細胞死亡)。編碼治療性多肽的核酸的非限制性實例包括：用於替換丟失或突變的已知引起CNS的病症的基因的核酸，例如Prph2、RPE65、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3和GNAT2。編碼治療性多肽的核酸的其他非限制性實例包括編碼如下的那些：神經營養因子(如GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO)、抗凋亡基因(如BCL2、BCL-X、NFκB)、抗血管生成因子(如內皮他汀(Endostatin)、血管他汀(Angiostatin)、sFlt)和抗炎因子(如IL10、IL1-ra、TGFβ、IL4)。用於CNS病症的其他治療性多肽包括但不限於Myo7a、ABCA4、REP1、GUCY2D、PDE6C、RS1、RPGRIP、Lpcat1、AIPL1、RDH12、CHM。在一些具體實例中，編碼的多肽是所述多肽的人變體。在一些具體實例中，所述異源核酸編碼神經元細胞凋亡抑制蛋白(NAIP)、神經生長因子(NGF)、神經膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦源性生長因 子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP環水解酶(GTPCH)、胺基酸脫羧酶(AADC)、抗氧化劑、抗血管生成多肽、抗炎多肽和天冬胺酸醯基酶(ASPA)。抗氧化劑的實例包括而不限於SOD1；SOD2；過氧化氫酶；Sirtuins 1、3、4或5；NRF2；PGC1a；GCL(催化次單元)；GCL(修飾次單元)；脂聯素；谷胱甘肽過氧化物酶1；和神經球蛋白。抗血管生成多肽的實例包括而不限於血管抑素、內皮抑素、PEDF、可溶性VEGF受體和可溶性PDGF受體。抗炎多肽的實例包括而不限於IL-10、可溶性IL17R、可溶性TNF-R、TNF-R-Ig、IL-1抑制劑和IL18抑制劑。可用於治療CNS的病症的這些類型的其他例示性多肽在下文提供。
本發明的核酸可編碼多肽，所述多肽為細胞內蛋白質、錨定於細胞膜中、保持在細胞內，或由用本發明的載體轉導的細胞分泌。對於由接受載體的細胞分泌的多肽；所述多肽可為可溶的(即，不附接於細胞)。例如，可溶的多肽缺乏跨膜區並從細胞分泌。鑑定並移出編碼跨膜域的核酸序列的技術是本領域已知的。
在一些具體實例中，所述異源核酸可操作地連接於啟動子。 例示性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子、猿猴病毒40(SV40)啟動子、CK6啟動子、轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)、TK啟動子、四環素回應啟動子(TRE)、HBV啟動子、hAAT啟動子、LSP啟動子、嵌合肝特異性啟動子(LSP)、E2F啟動子、端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β- 肌動蛋白/兔β球蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等，Gene,1991,108(2)：193-9)、延伸因子1-α啟動子(EF1-alpha)啟動子(Kim等，Gene,1990,91(2)：217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9)：802-10)。在一些具體實例中，所述啟動子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子或與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子連接的巨細胞病毒增強子。所述啟動子可為組成型、誘導性或阻抑啟動子。 在一些具體實例中，本發明提供重組載體，其包含可操作地連接於CBA啟動子的編碼本公開的異源轉殖基因的核酸。例示性啟動子和描述可見於例如，U.S.PG Pub.20140335054中。
組成型啟動子的實例包括而不限於逆轉錄病毒Rous肉瘤病毒(RSV)LTR啟動子(任選地與RSV增強子一起)、巨細胞病毒(CMV)啟動子(任選地與CMV增強子一起)[參見，例如，Boshart等，Cell,41：521-530(1985)]、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、13-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子和EF1a啟動子[Invitrogen]。
誘導型啟動子允許調節基因表現並能夠經由如下來調節：外源供給的化合物，環境因子如溫度，或特定生理狀態的存在，例如，急性期、細胞的特定分化狀態或僅在正在複製的細胞中。 誘導型啟動子和誘導型系統可由多種商業來源得到，包括而不限於Invitrogen、Clontech和Ariad。本領域的技術人員已描述並能夠容易地選擇許多其他系統。由外源供給的啟動子調節的誘導型啟動子的實例包括鋅誘導的羊金屬硫蛋白(MT)啟動子、地塞米松(Dex)誘導型小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、T7聚合酶啟動子系統(WO 98/10088)；昆蟲蛻皮激素啟動子(No 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93：3346-3351(1996))、四環素阻遏系統(Gossen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：5547-5551(1992))、四環素誘導系統(Gossen等，Science,268：1766-1769(1995)，另見Harvey等，Curr.Opin.Chem.Biol.,2：512-518(1998))、RU486-誘導系統(Wang等，Nat.Biotech.,15：239-243(1997)和Wang等，Gene Ther.,4：432-441(1997))和雷帕黴素-誘導系統(Magari等，J.Clin.Invest.,100：2865-2872(1997))。可用於此語境的其他類型的誘導性啟動子是由特定的生理狀態(例如，溫度、急性期、細胞的特定分化狀態或僅在正在複製的細胞中)調節的那些。
在另一個具體實例中，使用轉殖基因的天然啟動子或其片段。當轉殖基因的表現應模擬天然表現為所欲時，可使用所述天然啟動子。當轉殖基因的表現必須暫時地、發育地、或以組織特異性方式、或回應於特定的轉錄刺激物受調節時，可使用所述天然啟動子。在又一個具體實例中，還可使用其他天然表現調控元件，如增強子元件、多腺苷酸化位點或Kozak共有序列以模擬天然表現。
在一些具體實例中，調節序列賦予組織特異性基因表現能力。在一些情況中，所述組織特異性調節序列結合組織特異性轉錄因子，其以組織特異性方式誘導轉錄。所述組織特異性調節序列(例如，啟動子、增強子等)是本領域熟知的。例示的組織特異性調節序列包括但不限於如下列組成群組織特異性啟動子：神經元的如神經元-特異性烯醇化酶(NSE)啟動子(Andersen等，Cell.Mol.Neurobiol.,13：503-15(1993))、神經絲 輕鏈基因啟動子(Piccioli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88：5611-5(1991))和神經元-特異性vgf基因啟動子(Piccioli等，Neurons,15：373-84(1995))。在一些具體實例中，所述組織特異性啟動子是選自如下的基因的啟動子：神經元核(NeuN)、膠質纖維酸性蛋白質(GFAP)、腺瘤性結腸息肉病(APC)和離子化鈣結合銜接分子1(Iba-1)。其他適當的組織特異性啟動子對於技術人員會是顯而易見的。在一些具體實例中，所述啟動子是雞Beta-肌動蛋白啟動子。
在一些具體實例中，所述異源核酸處於在CNS的一種或多種細胞中表現的啟動子序列的控制下。本領域已知上面列出的許多啟動子序列(例如，CBA啟動子)在CNS的一種或多種細胞中表現。在一些具體實例中，所述啟動子序列可在生物體中遍在地表現，且因而可在CNS的一種或多種細胞中藉由其遞送至CNS來表現。在其他具體實例中，可使用在CNS或一種或多種CNS細胞的亞組中特異性表現的啟動子序列。在一些具體實例中，所述異源核酸可操作地連接於適於在CNS的一種或多種細胞中表現治療性多肽或治療性核酸的啟動子。如此，在一些具體實例中，本發明的治療性多肽或治療性核酸可用於治療CNS的病症。
在一些具體實例中，所述啟動子在腦細胞中表現所述異源核酸。腦細胞可指本領域已知的任何腦細胞，包括而不限於神經元(如感覺神經元、運動神經元、中間神經元、多巴胺能神經元、中型多棘神經元、膽鹼能神經元、GABA能神經元、錐體神經元等)、神經膠質細胞(如小膠質、大膠質、星形膠質細 胞、少突膠質細胞、室管膜細胞、放射狀膠質等)、腦實質細胞、小膠質細胞，室管膜細胞和/或浦肯野細胞。在一些具體實例中，所述啟動子在神經元中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述異源核酸在神經元中唯一地表現(例如，在神經元中表現而不在CNS的其他細胞如膠質細胞中表現)。
在一些方面中，本發明提供rAAV載體用於在哺乳動物中預防或治療一個或多個基因缺陷(例如，遺傳的基因缺陷、體細胞基因改變等)，例如，導致受試者中多肽缺乏或多肽過量的基因缺陷的方法，或用於在顯示與細胞和組織中所述多肽的缺陷連鎖的CNS-相關病症的受試者中治療或降低缺陷的嚴重性或程度的方法。在一些具體實例中，方法涉及將藥學上可接受的載體中編碼一個或多個治療性肽、多肽、功能性RNA、抑制核酸、shRNA、微RNA、反義核苷酸等的rAAV載體施用於受試者，其施用的量和時間足以在患有或疑似患有CNS-相關病症的受試者中治療所述病症。
rAAV載體可包含轉殖基因、編碼蛋白質或功能性RNA的核酸，其調節或治療CNS-相關病症。如下是與CNS-相關病症相關的基因的非限制性列表：神經元細胞凋亡抑制蛋白(NAIP)、神經生長因子(NGF)、神經膠質衍生的生長因子(GDNF)、腦源性生長因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、酪胺酸羥化酶(TH)、GTP環水解酶(GTPCH)、天冬胺酸醯基酶(ASPA)、超氧化物歧化酶(SOD1)、抗氧化劑，抗血管生成多肽、抗炎多肽，和胺基酸脫羧酶(AADC)。例如，在帕金森氏病的治療中有用的轉殖基因編碼TH，其為多巴胺的合成中的 速度限制酶。在帕金森氏病的治療中還可使用編碼GTPCII的轉殖基因，其生成TII輔因子四氫生物蝶呤。編碼GDNF或BDNF或AADC的轉殖基因還可用於治療帕金森氏病，其促進L-Dopa至DA的轉化。對於ALS的治療，有用的轉殖基因可編碼：GDNF、BDNF或CNTF。還對於ALS的治療，有用的轉殖基因可編碼功能性RNA，例如，shRNA、miRNA，其抑制SOD1的表現。對於缺血的治療，有用的轉殖基因可編碼NAIP或NGF。編碼β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的轉殖基因可用於治療一些溶酶體貯積症(例如，粘多糖病類型VII(MPS VII))。 編碼前藥啟動基因(例如，HSV-胸苷激酶，其將更昔洛韋(ganciclovir)轉化為破壞DNA合成並導致細胞死亡的毒性核苷酸)的轉殖基因可用於治療一些癌症，例如，當與所述前藥組合施用時。編碼內源性類鴉片(opioid)，如β-內啡肽的轉殖基因可用於治療疼痛。抗氧化劑的實例包括而不限於SOD1；SOD2；過氧化氫酶；Sirtuins 1、3、4或5；NRF2；PGC1a；GCL(催化次單元)；GCL(修飾次單元)；脂聯素；谷胱甘肽過氧化物酶1；和神經球蛋白。抗血管生成多肽的實例包括而不限於血管抑素、內皮抑素、PEDF、可溶性VEGF受體和可溶性PDGF受體。抗炎多肽的實例包括而不限於IL-10、可溶性IL17R、可溶性TNF-R、TNF-R-Ig、IL-1抑制劑和IL18抑制劑。 可用於本發明的rAAV載體的轉殖基因的其他實例對於技術人員是顯而易見的(參見，例如，Costantini L C，等，Gene Therapy(2000)7,93-109)。
在一些具體實例中，所述治療性多肽或治療性核酸用於治 療CNS的病症。不希望受限於理論，認為治療性多肽或治療性核酸可用於減少或消除多肽的表現和/或活性，所述多肽的功能獲得已與病症相關，或用於增強多肽的表現和/或活性以補足與病症相關的缺陷(例如，其表現顯示相似或相關活性的基因中的突變)。可通過本發明的治療性多肽或治療性核酸治療的本發明的病症的非限制性實例(對於每種病症，可被靶向或供給的例示性基因提供於括弧中)包括卒中(例如，半胱天冬酶-3、Beclin1、Ask1、PAR1、HIF1α、PUMA和/或Fukuda,A.M.和Badaut,J.(2013)Genes(Basel)4：435-456中所述的任何基因)、亨廷頓氏病(突變體HTT)、癲癇(例如，SCN1A、NMDAR、ADK和/或Boison,D.(2010)Epilepsia 51：1659-1668中所述的任何基因)、帕金森氏病(α-突觸核蛋白)、Lou Gehrig病(亦稱為肌萎縮側索硬化；SOD1)、阿爾茨海默氏病(tau，澱粉樣前體蛋白質)、皮質基底神經節變性或CBD(tau)、皮質基底神經節變性或CBGD(tau)、額顳葉癡呆或FTD(tau)、進行性核上麻痹或PSP(tau)、多系統萎縮或MSA(α-突觸核蛋白)、腦的癌症(例如，腦癌中牽涉的突變或過表現的癌基因)，和溶酶體貯積病(LSD)。本發明的病症可包括涉及大面積的皮質，例如，皮質多於一個功能區域、皮質多於一個波瓣(lobe)和/或整個皮質者。本發明的病症的其他非限制性實例可由本發明的治療性多肽或治療性核酸治療，其包括外傷性腦損傷、酶功能障礙病症，精神病症(包括創傷後應激症候群)、神經退化性疾病和認知病症(包括癡呆症、自閉症和抑鬱症)。酶功能障礙病症包括而不限於腦白質營養不良(包括卡納萬氏病(Canavan’s disease)) 和下述的任何溶酶體貯積病。
在一些具體實例中，所述治療性多肽或治療性核酸用於治療溶酶體貯積病。如本領域中通常已知的，溶酶體貯積病是罕見的、特徵為溶酶體功能缺陷的遺傳性代謝病症。所述病症常常由正常的粘多糖、糖蛋白和/或脂質代謝所需的酶的缺乏引起，導致溶酶體儲存的細胞材料的病理學積累。可由本發明的治療性多肽或治療性核酸治療的本發明的溶酶體貯積病的非限制性實例(對於每種病症，可被靶向或供給的例示性基因提供於括弧中)包括高歇氏病2型或3型(酸性β-葡糖苷酶，GBA)、GM1神經節苷脂貯積症(β-半乳糖苷酶-1，GLB1)、亨特病(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，IDS)、克拉伯病(半乳糖基神經醯胺酶，GALC)、甘露糖苷貯積症(甘露糖苷酶，如α-D-甘露糖苷酶，MAN2B1)、β甘露糖苷貯積症(β-甘露糖苷酶，MANBA)、異染性腦白質營養不良症(假芳基硫酸酯酶A，ARSA)、粘脂病II/III疾病(N-乙醯葡糖胺-1-磷酸轉移酶，GNPTAB)、尼-皮二氏病A(酸性鞘磷脂酶，ASM)、尼-皮二氏病C(尼曼-匹克C蛋白質，NPC1)、龐貝氏症(酸性α-1,4-葡糖苷酶，GAA)、桑德霍夫病(胺基己糖苷酶β次單元，HEXB)、聖菲利柏氏症A(N-磺基胺基葡糖磺基水解酶(N-sulfoglucosamine sulfohydrolase)，MPS3A)、聖菲利柏氏症B(N-α-乙醯胺基葡糖苷酶，NAGLU)、聖菲利柏氏症C(肝素乙醯CoA：α-胺基葡糖苷酶N-乙醯轉移酶，MPS3C)、聖菲利柏氏症D(N-乙醯胺基葡糖-6-硫酸酯酶，GNS)、辛德勒病(α-N-乙醯胺基半乳糖苷酶，NAGA)、史萊氏症(β-葡糖醛酸糖苷酶，GUSB)、泰-薩克斯病(胺基己糖苷酶α次單元，HEXA) 和沃爾曼病(溶酶體酸性脂肪酶，LIPA)。
另外的溶酶體貯積症以及與每個疾病相關的缺陷的酶列於下表1中。在一些具體實例中，下表中所列的疾病通過本發明的治療性多肽或治療性核酸治療，其補足或以其他方式補償相應的酶缺陷。
Figure 104114126-A0202-12-0109-1
Figure 104114126-A0202-12-0110-2
亨廷頓氏病
所述載體可為有利的疾病的一個實例是亨廷頓氏病(HD)，其由編碼突變體亨廷頓蛋白蛋白質(mHTT)中擴展的聚穀胺醯胺(polyQ)重複的CAG重複擴展突變引起。HD對於基於DNA和RNA的治療是有吸引力的靶物，因為它是由單個等位基因的突變引起的體染色體顯性疾病。AAV載體可為核酸治療劑提供理想的遞送系統並允許這些亨廷頓蛋白降低分子在腦中的持久和連續表現。
如本申請中所述，顱內施用rAAV顆粒(例如，治療性載體)得到普遍的神經元轉導，所述顆粒具有rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。 因此，本發明的方法提供使用本申請所述用於治療亨廷頓氏病的重組病毒顆粒將異源核酸遞送至中樞神經系統的方法。在一些具體實例中，本發明提供方法和組成物用於治療個體中的亨廷頓氏病，其包括向哺乳動物施用本公開的藥學組成物(例如，包含本公開的變體病毒顆粒的藥學組成物)。在一些方面中，本發明提供方法和組成物用於抑制htt在患有亨廷頓氏病的哺乳動物中的表現，其包括向所述個體施用本公開的藥學組成物(例如，包含本公開的變體病毒顆粒的藥學組成物)。在一些方面中，本發明提供方法和組成物用於抑制htt在患有亨廷頓氏病的個體的細胞中的累積，其包括向所述個體施用本案揭示的藥學組成物(例如，包含本案揭示的變體病毒顆粒的藥學組成物)。
在一些方面中，本發明提供方法和組成物用於改善個體中的HD的症狀，其包括向個體的CNS施用有效量的重組病毒顆粒，其包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，其中所述rAAV顆粒包含編碼RNAi的載體，所述RNAi抑制HTT在個體中的表現和/或積累。在一些具體實例中，HD的症狀包括但不限於舞蹈病(chorea)、僵直(rigidity)、無法控制的身體動作、肌肉失去控制、缺乏協調、躁動、眼部運動減緩、姿態異常、不穩(instability)、共濟失調步態(ataxic gait)、異常的表情、言語障礙、咀嚼和/或吞咽困難、睡眠障礙、癲癇發作、癡呆、認知缺陷(例如，關於規劃、抽象思維、靈活性、規則獲取、人際關係敏感、自我控制、注意力、學習、記憶的能力減退)、 抑鬱、焦慮、人格改變、侵略、強制行為、強迫行為、性欲亢進、精神病、情感淡漠(apathy)、煩躁、自殺的念頭、減重、肌肉萎縮、心臟衰竭、糖耐量降低、睾丸萎縮和骨質疏鬆。
在一些方面中，本發明提供方法以預防HD或延遲HD的進展。體染色體顯性HD是一種能夠被基因分型的遺傳疾病。 例如，HTT中的CAG重複的數目可通過基於PCR的重複大小分析(repeat sizing)來確定。這種類型的診斷可以通過直接檢測幼年或成年(例如，連同臨床症狀的呈現)、產前篩查或產前排除測試(例如，通過絨毛取樣或羊膜穿刺術)或胚胎的植入前篩選而在生命的任何階段進行。此外，HD可以通過腦成像、尋找尾狀核和/或殼核的收縮和/或腦室擴大來進行診斷。這些症狀，與HD家族史和/或臨床症狀組合，可指示HD。
用於確定的HD症狀改善的手段是本領域已知的。例如，統一亨廷頓氏病評定量表(UHDRS)可用於評估運動功能、認知功能、行為異常度和功能的能力(參見，例如，Huntington Study Group(1996)Movement Disorder 11：136-42)。該量表經開發而為疾病病理多個方面提供統一的、全面的測試，併入來自測試的因素，所述測試如HD活動和日常生活量表、馬斯登和奎因氏舞蹈病嚴重性量表、肢體殘疾和獨立性量表、HD運動評定量表(HDMRS)、HD功能的能力量表(HDFCS)和定量的神經學檢查(QNE)。用於確定HD症狀的改善的其他測試可包括而不限於蒙特利爾認知評估(Montreal Cognitive Assessment)、腦成像(例如，MRI)，類別流暢性測試(Category Fluency Test)、連線測試(Trail Making Test)、地圖搜索(Map Search)、斯特魯字 閱讀測試(Stroop Word Reading Test)，加快輕觸任務(Speeded Tapping Task)和符號數位模式測試(Symbol Digit Modalities Test)。
在本發明的一些方面中，方法和組成物用於治療患有HD的人。如上所述，HD以體染色體顯性方式遺傳並由HTT基因中的CAG重複擴張引起。青少年發病HD最經常從父系方繼承。亨廷頓病-樣表型也與其它遺傳基因座相關，如HDL1、PRNP、HDL2、HDL3和HDL4。認為其它遺傳基因座可修飾HD症狀的顯現，包括GRIN2A、GRIN2B、MSX1、GRIK2和APOE基因中的突變。
rAAV組成物
在一些方面中，本發明提供包含任何本文所述的rAAV顆粒的組成物。通常，用於本發明的方法和系統的組成物包含有效量的rAAV顆粒，其包含編碼多肽和/或RNA的rAAV載體，任選地在藥學可接受的賦形劑中。所述病毒顆粒包含AAV衣殼(例如，AAV2或AAVrh8R衣殼)，其中與HSPG相互作用的一個或多個胺基酸被取代使得rAAV顆粒與HSPG的結合被減少或去除。如本領域中熟知的，藥學上可接受的賦形劑為相對惰性的物質，其促進藥理學有效的物質的施用並可作為液體溶液或懸浮物，作為乳劑，或作為使用前適於溶解或懸浮於液體中的固體形式供給。例如，賦形劑可給予形式或稠度，或充當稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕劑和乳化劑、用於改變滲透性的鹽、包囊劑、pH緩衝物質和緩衝液。所述 賦形劑包括適於直接遞送至眼的任何藥劑，其可被施用而無過度的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括但不限於山梨醇，多種TWEEN化合物中的任何，和液體如水、鹽水、甘油和乙醇。 藥學上可接受的鹽可包括在其中，例如，無機酸鹽如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機酸的鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥學上可接受的賦形劑的全面討論可在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中得到。
通常，這些組成物經配製用於通過視網膜下注射施用。因此，這些組成物可與藥學上可接受的運載體如鹽水、林格氏平衡鹽溶液(Ringer’s balanced salt solution)(pH 7.4)等組合。雖然並非必需的，所述組成物可任選地以適於施用精確量的單位劑量形式供給。
視網膜下遞送rAAV的方法
視網膜下遞送的方法是本領域已知的。例如，參見WO 2009/105690，其通過提述併入本文。簡單地，用於將rAAV顆粒(例如，rAAV2、rAAVrh8R等顆粒)遞送至黃斑和凹的視網膜下的一般方法可通過如下簡單概要來說明。此實施例僅僅意欲說明所述方法的某些特徵，而並非意欲為限制性的。
通常，可將所述rAAV載體以眼內(視網膜下)注射的組成物的形式在使用手術顯微鏡(operating microscope)的直接觀察下遞送。在一些具體實例中，所述載體在rAAV顆粒中衣殼化，其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼，所述rAAV衣殼包含含 有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼蛋白，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用(例如，抑制或去除HSPG結合)的一個或多個位置；和rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。此步驟可涉及玻璃體切割術，之後使用精細套管通過一個或多個小視網膜切開術將rAAV載體懸浮物注射入視網膜下空間後。
簡要地說，可以在適當位置縫合輸注套管以通過在整個操作中輸注(例如，鹽水)維持正常的球體積。使用適當孔尺寸的套管(例如20至27Gauge)進行玻璃體切割術，其中移出的玻璃體凝膠的所述體積通過輸注來自輸注套管的鹽水或其他等滲溶液替代。有利的進行玻璃體切割術，因為(1)去除它的皮質(玻璃樣後膜)促進通過所述套管的視網膜滲透；(2)其去除和用流體(例如，鹽水)替換創造了空間以容納載體的眼內注射，和(3)其受控去除降低視網膜撕裂和未計畫的視網膜剝離的可能性。
在一些具體實例中，通過利用適當孔徑(例如，27-45Gauge)的套管將所述rAAV組成物直接注射入中央視網膜外的視網膜下空間，因而在視網膜下空間創建泡(bleb)。在其他具體實例中，視網膜下注射rAAV組成物之前為將小體積(例如，約0.1至約0.5ml)的適當的流體(如鹽水或林格氏溶液)視網膜下注射入中央視網膜外的視網膜下空間。此初始注射入視網膜下空間建立視網膜下空間內的初始流體泡，引起在初始泡的位置局部的視網膜剝離。此初始流體泡能夠促進將rAAV組成物靶向遞送至視網膜下空間(通過在rAAV遞送前限定注射平面(plane of injection)，並使可能的rAAV施用入脈絡膜(choroid)和rAAV注射或回流入玻璃體腔的可能性最小化。在一些具體實例中，該初始流體泡可被進一步注射流體，其包含一個或多個的rAAV組成物和/或一種或多種另外的治療劑，這通過將這些流體用相同或額外的細口徑套管直接施用到初始流體泡來進行。
眼內施用所述rAAV組成物和/或初始小體積的流體可使用附接於注射器的細口徑套管(例如，27-45gauge)來進行。在一些具體實例中，此注射器的柱塞可由機械化的設備，如通過腳踏踏板的下壓驅動。所述細口徑套管穿過鞏膜前進，穿過玻璃體腔並根據被靶向的視網膜的區域(但在中央視網膜外)進入視網膜處於每個受試者中預先確定的位點。在直接目測下，用自密封非膨脹性視網膜切開術將載體懸浮物機械注入感覺神經性視網膜，引起局部的視網膜剝離。如上所述，可將所述rAAV組成物直接注射入創建中央視網膜外泡的視網膜下空間或者可將所述載體注射入中央視網膜外的初始泡，引起其膨脹(並使視網膜剝離的區域擴展)。在一些具體實例中，注射rAAV組成物之後是將另一流體注射入所述泡。
不希望受限於理論，視網膜下注射的速率和位置可導致能夠損害黃斑、凹和/或下方RPE細胞的局部化剪切力。所述視網膜下注射可以使剪切力最小化或避免剪切力的速率進行。在一些具體實例中，所述rAAV組成物在約15-17分鐘注射。在一些具體實例中，所述載體在約17-20分鐘注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物在約20-22分鐘注射。在一些具體 實例中，所述rAAV組成物以約35至約65μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約35μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約40μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約45μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約50μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約55μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約60μl/min的速率注射。在一些具體實例中，所述rAAV組成物以約65μl/min的速率注射。本領域的普通技術人員可認識到，泡的注射的速率和時間可受如下指導：例如，創建足夠視網膜剝離以接近中央視網膜的細胞所需的泡的大小或rAAV組成物的體積、用於遞送所述rAAV組成物的套管的大小和安全地維持本發明的套管的位置的能力。
在本發明的一些具體實例中，注射至視網膜的視網膜下空間的組成物的體積為大於約1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL的任一者，或其之間的任何量。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至眼(例如，通過視網膜下和/或玻璃體內施用)，所述病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，還包含編碼異源核酸的載體。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10× 1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012或50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012，或50×1012至100×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至10×1012、10×1012至25×1012，或25×1012至50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109，或50×109至100×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109，或25×109至50×109轉導單位/mL中的任何。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010或50×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實 例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010，或50×1010至100×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010，或25×1010至50×1010感染單位/mL中的任一者。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至個體(例如，人)的眼(例如，通過視網膜下和/或玻璃體內施用)，所述病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，施用至所述個體的病毒顆粒的劑量為至少大約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。在一些具體實例中，施用至所述個體的病毒顆粒的劑量為約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。
一個或多個(例如，2、3或更多個)泡可以被創建。通常，由本發明的系統和方法創建泡的總體積不能超過眼睛的流體體積，例如在典型的人受試者中為約4ml。每個單獨泡的總體積可為至少大約0.3ml，或至少約0.5ml以促進足夠尺寸的視網膜剝離以暴露中央視網膜的細胞類型並創建對於最佳操縱有足夠依賴性的泡。本領域的普通技術人員會理解，在根據本發明的系統和方法創建泡時必須維持適當的眼內壓以避免對 眼結構的損壞。每個個體泡的大小可為，例如，約0.5至約1.2ml，約0.8至約1.2ml，約0.9至約1.2ml，約0.9至約1.0ml，約1.0至約2.0ml，約1.0至約3.0ml。因此，在一個實例中，為了注射總共3ml的rAAV組成物懸浮物，可建立每個約1ml的3個泡。組合中所有泡的總體積可為，例如，約0.5至約3.0ml，約0.8至約3.0ml，約0.9至約3.0ml，約1.0至約3.0ml，約0.5至約1.5ml，約0.5至約1.2ml，約0.9至約3.0ml，約0.9至約2.0ml，約0.9至約1.0ml。
為了安全地和有效地轉導泡的原始位置的邊緣以外的靶視網膜的區域(例如，中央視網膜)，可操縱泡以將泡重定位於轉導的目的地區域。泡的操縱可經由由泡的體積、含有泡的眼的重定位、具有含有一個或多個泡的眼睛的人的頭部的重定位和/或經由流體空氣交換創建的泡的依賴性發生。這與中央視網膜特別相關，因為此區域通常通過視網膜下注射而抵抗剝離。 在一些具體實例中，流體-空氣交換被用來重定位泡；來自輸注套管的流體暫時被空氣置換，例如，由空氣吹到視網膜的表面上。隨著空氣的體積從視網膜的表面置換玻璃體腔流體，玻璃體腔中的流體可流出套管。臨時缺乏來自玻璃體腔流體的壓力使泡移動並受重力作用吸引至眼的從屬部分。藉由適當定位眼球，視網膜下rAAV組成物的泡被操縱以涉及到鄰近地區(例如，黃斑和/或凹)。在一些情況中，所述泡的品質足以導致其受重力作用吸引，即使沒有使用流體-空氣交換。可藉由改變受試者的頭的位置以允許所述泡受重力作用吸引至眼的所欲位置來進一步促進泡移動至所需位置。一旦實現泡的所需配置， 流體返回到玻璃體腔。該流體是適當的流體，例如，新鮮的鹽水。通常，視網膜下rAAV組成物可留在原位而無需對於視網膜切開術的視網膜黏結術和眼內填充(intraocular tamponade)，而視網膜會自發在約48小時內重新附接。
通過安全而有效地用包含治療性多肽或RNA序列的載體轉導眼細胞(例如，例如黃斑和/或凹的RPE和/或感光細胞)，本發明的方法可用於治療患有眼部病症的個體；例如，人，其中所述轉導的細胞以足以治療所述眼部病症的量產生治療性多肽或RNA序列。在一些具體實例中，眼細胞的轉導可通過使用包含AAV衣殼蛋白的rAAV顆粒(例如，rAAV2、rAAVrh8R等顆粒)來改進，所述AAV衣殼蛋白包含胺基酸的一個或多個取代，所述胺基酸與HSPG相互作用(例如，抑制或去除與HSPG的結合)。在一些具體實例中，所述rAAV顆粒顯示降低的與HSPG的結合；例如，降低大於約10%、25%、50%、75%、100%或其間任何數目。在一些具體實例中，rAAV與HSPG的結合降低約5%至約100%，約10%至約50%，約10%至約30%，約25%至約75%，約25%至約50%或約30%至約50%。
取決於治療的目的，施用有效量的rAAV(在一些具體實例中為顆粒的形式)。例如，當低百分比的轉導能實現所欲的治療效果時，則治療的目的通常在於滿足或超過此轉導水平。在一些情況中，此轉導水平可通過僅轉導約1至5%的靶細胞，在一些具體實例中期望的組織類型的至少大約20%的細胞，在一些具體實例中至少大約50%，在一些具體實例中至少大約80%， 在一些具體實例中至少大約95%，在一些具體實例中期望的組織類型的至少大約99%的細胞來實現。如上面所討論的，rAAV衣殼的與HSPG相互作用的一個或多個胺基酸的取代改進rAAV轉導。作為指導，每次注射施用的顆粒的數目通常為介於約1x106-約1x1014顆粒，約1x107-1x1013顆粒，約1x109-1x1012顆粒或約1x1011顆粒。所述rAAV組成物可通過在相同的步驟過程中或間隔數天、數周、數月或數年的一次或多次視網膜下注射來施用。在一些具體實例中，多個載體可用於治療人。
在一些具體實例中，將有效量的rAAV病毒顆粒施用至視網膜在施用位點或其附近轉導感光細胞，所述病毒顆粒包含rAAV衣殼，其具有與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。在一些具體實例中，多於約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%中任何的感光細胞被轉導。在一些具體實例中，約5%至約100%、約10%至約50%、約10%至約30%、約25%至約75%、約25%至約50%或約30%至約50%的感光細胞被轉導。 鑑定被AAV病毒顆粒轉導的感光細胞的方法是本領域已知的，所述病毒顆粒包含rAAV衣殼，其具有與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代；例如，免疫組織化學或使用標記物，如增強的綠色螢光蛋白可用於檢測病毒顆粒的轉導，所述病毒顆粒包含rAAV衣殼，其具有與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。
在本發明的一些具體實例中，所述方法包括將有效量的rAAV病毒顆粒施用至哺乳動物的視網膜下(例如，視網膜下空 間)用於治療患眼部病症的個體；例如，患眼部病症的人，所述病毒顆粒包含rAAV衣殼，其具有與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。在一些具體實例中，將所述組成物注射至視網膜下中的一個或多個位置以允許在感光細胞中表現異源核酸。在一些具體實例中，將所述組成物注射入視網膜下的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或多於十個位置中的任一者。
在一些具體實例中，將所述rAAV病毒顆粒同時或順序施用於多於一個位置，所述病毒顆粒包含rAAV衣殼，其具有與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。在一些具體實例中，rAAV病毒顆粒的多次注射間隔不多於一小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、六小時、九小時、十二小時或24小時。
玻璃體內注射的方法
用於玻璃體內注射的一般方法可通過如下簡要概述來說明。此實例僅僅意欲說明本方法的一些特徵，並且不意欲為限制性的。用於玻璃體內注射的步驟是本領域已知的(參見，例如，Peyman,G.A.，等(2009)Retina 29(7)：875-912和Fagan,X.J.和Al-Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5)：500-7)。
簡言之，玻璃體內注射的受試者可準備瞳孔擴張、眼的消毒和施用麻醉的步驟。本領域已知的任何合適的散瞳劑可用於瞳孔擴張。可在治療前證實充分散瞳。滅菌可通過消毒的眼治 療例如，含碘溶液如聚維酮碘(BETADINE BETADINE®)實現。 相似的方案也可以用來清潔眼瞼、睫毛和附近的任何其他組織(例如，皮膚)。可以任何適當的濃度使用任何合適的麻醉，如利多卡因或丙美卡因。麻醉可由本領域已知的任何方法施用，包括但不限於局部滴劑(drop)、凝膠(gel)或膠狀物(jelly)，和麻醉的結膜下施用。
在注射前，可將滅菌的眼瞼窺器用於清除(clear)所述區域的睫毛。注射的位元點可用注射器標記。注射的位點可基於患者的晶狀體(lens)選擇。例如，注射位元點可距離人工晶狀體眼或無晶狀體眼患者中的(角膜)緣(limbus)3-3.5mm，和距有晶狀體眼患者中的(角膜)緣3.5-4mm。所述患者可看向注射位點相反的方向。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至眼部(例如，藉由視網膜下和/或玻璃體內施用)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，還包含編碼異源核酸的載體。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012或50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30 ×1012至50×1012或50×1012至100×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至10×1012、10×1012至25×1012，或25×1012至50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109，或50×109至100×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109，或25×109至50×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010或50×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010，或50×1010至100×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所 述組成物的病毒效價為至少約5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010，或25×1010至50×1010感染單位/mL中的任一者。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至個體(例如，人)的眼(例如，經由視網膜下和/或玻璃體內施用)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，施用至所述個體的病毒顆粒的劑量為至少大約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。在一些具體實例中，施用至所述個體的病毒顆粒的劑量為約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。
在注射過程中，可將針垂直插入鞏膜和指向眼的中央。可插入針使得尖端結束於玻璃體而非視網膜下空間。可使用本領域已知用於注射的任何合適的體積。注射後，可用殺菌劑如抗生素處理眼。還可沖洗眼以移出過量的殺菌劑。
視網膜的結構和測定rAAV遞送的有效性的手段
已知視網膜含有多層。視網膜中的細胞層可包括內界膜、神經纖維、神經節細胞、內網、內核、外網、外核、外界膜、感光細胞和視網膜色素上皮層。最接近玻璃體的層是內界膜。 此層可含有Müller細胞，其為一類神經膠質細胞。神經纖維層可含有來自形成視神經的神經節細胞的軸突。神經節細胞層可包括神經節細胞和無長突細胞。內網層可含有神經節和無長突 細胞的樹突之間的突觸和雙極細胞的軸突。內核層可含有無長突、雙極和水平細胞的細胞核。外網層可含有水平細胞樹突和感光細胞突起物(projections)之間的突觸。外核層可含有感光細胞體。外部或外界膜可包括Müller細胞頂突過程中和這些過程與感光細胞內段之間的細胞聯繫，如黏附連接和橋粒。感光細胞層也稱為視桿細胞和視錐細胞和Jacob膜層，其可含有感光細胞，包括視桿細胞和視錐細胞。視網膜層距玻璃體最遠的是視網膜色素上皮(RPE)，其可包括含有色素顆粒的六角形的上皮細胞的層。
還已知視網膜含有許多不同的細胞類型。視網膜神經元可包括感光細胞、雙極細胞、神經節細胞、無長突細胞和水平細胞。感光細胞是對光敏感的。它們可感受光並藉由將信號藉由雙極細胞和神經節細胞傳遞至視神經來回應。感光細胞可包括視桿細胞(其一般在低光條件下感受光)和視錐細胞(其一般感受顏色和更明亮的光感)。雙極細胞可接收來自感光細胞和無長突細胞或神經節細胞上的突觸的輸入。神經節細胞可接收來自無長突細胞或水平細胞的資訊，而且它們的軸突形成視神經。 水平細胞可整合來自多個感光細胞的輸入並幫助在光水平調節。無長突細胞是中間神經元，其幫助調節雙極細胞並將輸入提供至神經節細胞。神經膠質視網膜的細胞可包括Müller細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞。
通過視網膜下或玻璃體內注射的rAAV遞送效果可藉由如本文所述的幾個標準監測。例如，使用本發明的方法在受試者中處理後，可通過一個或多個臨床參數包括本文所述的那些評 估受試者的例如，在疾病狀態的一個或多個跡象或症狀的改善和/或穩定和/或進展延遲。所述測試的實例是本領域已知的，且包括客觀和主觀(例如，受試者報告的)量度。例如，為了測量治療對受試者的視覺功能的有效性，可以評價如下的一個或多個：受試者的主觀視覺品質或改進的中央視覺功能(例如，受試者流暢閱讀和識別面孔的能力的改進)，受試者的視覺活動性(例如，通行迷宮所需的時間減少)，視敏度/視力(例如，受試者的logMAR評分的改善)，微視野檢查(例如，受試者的dB評分的改善)，暗適應檢查(例如，受試者的dB評分的改善)，精細矩陣映射(例如，受試者的dB評分的改善)，Goldmann視野檢查(例如，減少盲點區域(即盲區)的大小來解析較小目標的能力的改進)，閃爍的敏感性(例如，Hertz的改進)，自發螢光，和電生理測量(例如，ERG的改進)。在一些具體實例中，藉由受試者的視覺活動性測量視覺功能。在一些具體實例中，藉由受試者的視敏度/視力測量視覺功能。在一些具體實例中，藉由微視野檢查測量視覺功能。在一些具體實例中，藉由暗適應檢查測量視覺功能。在一些具體實例中，藉由ERG測量視覺功能。在一些具體實例中，藉由受試者的主觀視覺品質測量視覺功能。
在導致進展的退化性視覺功能的疾病的情況下，在早期治療受試者不僅可導致減慢或停止疾病進展，它也可以改善或防止由於後天弱視導致的視覺功能損失。弱視可為兩類。在非人靈長類動物和小貓的研究中，它們從出生直到幾個月齡保持在完全黑暗中，所述動物即使後續暴露於光也成為功能上不可逆 的失明，儘管有由視網膜發送的功能信號。此失明的發生是因為神經連接和對皮層的“教育”由於刺激停止而從出生開始就在發育上停止。這個功能是否能恢復是未知的。在視網膜退化疾病的情況下，正常的視覺皮層回路最初是“學習的”或發育上適當的，直到退化創建的顯著功能障礙的點。在功能障礙的眼的信號傳導中視覺刺激的損失創建“獲得的”或“習得的”功能障礙(“後天弱視”)，導致大腦無法解釋信號，或“使用”該眼。 在“後天弱視”的這些情況中未知的是，作為弱視眼的基因治療的結果，改進的來自視網膜的信號傳導除了使疾病狀態穩定或減慢其進展之外，是否可導致更多正常功能的獲得。在一些具體實例中，治療的人小於30歲。在一些具體實例中，治療的人小於20歲。在一些具體實例中，治療的人小於18歲。在一些具體實例中，治療的人小於15歲。在一些具體實例中，治療的人小於14歲。在一些具體實例中，治療的人小於13歲。 在一些具體實例中，治療的人小於12歲。在一些具體實例中，治療的人小於10歲。在一些具體實例中，治療的人小於8歲。 在一些具體實例中，治療的人小於6歲。
在一些眼部病症中，存在“護士細胞”現象，其中一類細胞的功能的改進可改進另一類細胞的功能。例如，通過本發明的rAAV轉導中央視網膜的RPE可以改進視桿細胞的功能，而視桿細胞功能的改進又導致視錐細胞功能的改進。因此，對一個細胞類型的治療可導致另一個中功能的改進。
特定的rAAV載體和組成物的選擇取決於許多不同的因素，包括，但不限於，個體人的病史、和被治療的病況和個體的特 徵。這些特徵的評價和適當的治療方案的設計最終是處方醫師的責任。
在一些具體實例中，待治療的人患有遺傳的眼部病症但還未顯示臨床的跡象或症狀。在一些具體實例中，待治療的人患有眼部病症。在一些具體實例中，待治療的人顯示眼部病症的一個或多個跡象或症狀。
可通過本發明的系統和方法治療的眼部病症的非限制性實例包括：體染色體隱性遺傳性早發型重度視網膜變性(Leber先天性黑蒙)、先天色盲、斯塔加特氏病、Best氏病、Doyne氏病、錐體營養不良、色素性視網膜炎、X連鎖視網膜劈裂症、亞瑟症候群、年齡相關性黃斑變性、萎縮性年齡相關黃斑變性、新生血管性AMD、糖尿病性黃斑病變、增殖性糖尿病性視網膜病(PDR)、囊樣黃斑水腫、中心性漿液性視網膜病、視網膜剝離、眼內炎、青光眼、後葡萄膜炎、無脈絡膜症(choroideremia)，和Leber遺傳性視神經病變。
本發明的組成物(例如，用於視網膜下或玻璃體內遞送AAV病毒顆粒，所述AAV病毒顆粒包含AAV衣殼，所述AAV衣殼具有胺基酸的一個或多個取代，所述胺基酸與HSPG相互作用或在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個位置)可單獨或與用於治療眼部病症的一種或多種另外的治療劑組合使用。順序施用之間的間隔可以至少(或可替換地少於)數分鐘、數小時或數天為單位。
在一些具體實例中，一種或多種另外的治療劑可施用於視網膜下或玻璃體(例如，通過玻璃體內施用)。另外的治療劑的 非限制性實例包括多肽神經營養因子(例如，GDNF、CNTF、BDNF、FGF2、PEDF、EPO)，多肽抗血管生成因子(例如，sFlt、血管他汀、內皮他汀)，抗血管生成核酸(例如，siRNA、miRNA、核酶)，例如針對VEGF的抗血管生成核酸，抗血管生成嗎啉代，例如針對VEGF的抗血管生成嗎啉代，抗血管生成抗體和/或抗體片段(例如，Fab片段)，例如針對VEGF的抗血管生成抗體和/或抗體片段。
用於CNS遞送的方法
在一些具體實例中，施用有效量的本公開的重組病毒顆粒(例如，AAV2、AAVrh8R顆粒等)在施用位點處或附近轉導神經元(例如，紋狀體神經元，如棘神經元)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在硫酸乙醯肝素蛋白多糖與相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，多於約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或100%中的任何的神經元被轉導。在一些具體實例中，約5%至約100%，約10%至約50%，約10%至約30%，約25%至約75%，約25%至約50%，或約30%至約50%的神經元被轉導。鑑定通過表現異源核酸的重組病毒顆粒轉導的神經元的方法是本領域已知的；例如，可使用免疫組織化學、RNA檢測(例如，qPCR、Northern印跡、RNA-seq、原位雜交等)或使用共表現的標記物如增強的綠色螢光蛋白來檢測表現。
在本發明的一些具體實例中，所述方法包括將有效量的本 案揭示的重組病毒顆粒施用至哺乳動物的腦用於治療哺乳動物(例如，人)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，將所述組成物注射至腦的一個或多個位置以允許本案揭示的異源核酸在至少神經元中表現。在一些具體實例中，將所述組成物注射入腦中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或多於十個位置中的任一者。 在一些具體實例中，將所述組成物注射入紋狀體。在一些具體實例中，將所述組成物注射入背側紋狀體。在一些具體實例中，將所述組成物注射入殼核(putamen)。在一些具體實例中，將所述組成物注射入尾狀核(caudate nucleus)。在一些具體實例中，將所述組成物注射入殼核並注射入尾狀核。在一些具體實例中，將所述重組病毒顆粒通過立體定位注射施用至個體的CNS(例如紋狀體)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，將所述重組病毒顆粒通過對流增強遞送(CED)施用至個體的CNS(例如CED至紋狀體)，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。
所述rAAV顆粒的施用可經由多種途徑進行。在一些具體實例中，所述施用包括直接脊髓注射和/或腦內施用。在一些具體實例中，所述施用處於選自如下的位點：大腦、延髓、腦橋、小腦、顱內腔、圍繞大腦的脊膜、硬腦膜、蛛網膜、軟腦膜、圍繞腦的蛛網膜下腔的腦脊髓液(CSF)、小腦的小腦深部 核、腦室系統、蛛網膜下腔、紋狀體、皮層、隔膜、丘腦、下丘腦、和腦的實質。在一些具體實例中，所述施用包含腦室內注射入至少一個大腦側腦室。在一些具體實例中，所述施用包含鞘內注射到頸、胸和/或腰區中。在一些具體實例中，所述施用包含紋狀體內注射。在一些具體實例中，所述施用包含丘腦內注射。適於這些施用途徑的多種技術和設備在本文中描述，例如，CED和/或立體定位注射。
在一些具體實例中，將所述重組病毒顆粒施用至腦的一個半球，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，將所述重組病毒顆粒施用至腦的兩個半球。
在一些具體實例中，將所述重組病毒顆粒同時或順序施用至多於一個位置，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，重組病毒顆粒的多次注射間隔不多於一小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、六小時、九小時、十二小時或24小時。
在一些具體實例中，本發明提供用於治療患有CNS的病症的人的方法，其通過施用有效量的本公開的藥學組成物以治療CNS的病症，所述藥學組成物包含重組病毒顆粒，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，所述藥學組成物包含一個或多個藥學上可接受的賦 形劑。
通常，可遞送約1μL至約1mL的本發明的組成物(例如，約100μL至約500μL的組成物)。在本發明的一些具體實例中，注射至紋狀體的重組病毒顆粒的體積為約或多於約1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL中的任一者，或其間的任何量，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。
在一些具體實例中，將第一體積的重組病毒顆粒注射入腦的第一區，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，且將第二體積的變體rAAV顆粒注射入腦的第二區。 例如，在一些具體實例中，將第一體積的變體rAAV顆粒注射入尾狀核，且將第二體積的所述組成物注射入殼核。在一些具體實例中，將1X體積的變體rAAV顆粒注射入尾狀核，且將1.5X、2X、2.5X、3X、3.5X或4X體積的所述組成物注射入殼核，其中X是約或多於約1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL中的任一者，或其間任何量的體積。
本發明的組成物(例如，本公開的重組病毒顆粒，其包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋 白多糖相互作用的一個或多個位置)可單獨或與用於治療CNS的病症(例如，HD)的一種或多種治療劑組合使用。順序施用之間的間隔可以至少(或，可替換地少於)數分鐘、數小時或數天為單位。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至CNS，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，還包含編碼異源核酸的載體。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、10×1012、11×1012、15×1012、20×1012、25×1012、30×1012或50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。 在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至6×1012、6×1012至7×1012、7×1012至8×1012、8×1012至9×1012、9×1012至10×1012、10×1012至11×1012、11×1012至15×1012、15×1012至20×1012、20×1012至25×1012、25×1012至30×1012、30×1012至50×1012或50×1012至100×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×1012至10×1012、10×1012至25×1012或25×1012至50×1012基因組拷貝/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少大約5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、10×109、11×109、15×109、20×109、25×109、30×109或50×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至6×109、6×109至7×109、7×109至8×109、8×109至9×109、9×109 至10×109、10×109至11×109、11×109至15×109、15×109至20×109、20×109至25×109、25×109至30×109、30×109至50×109，或50×109至100×109轉導單位/mL中的任一者。 在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為約5×109至10×109、10×109至15×109、15×109至25×109或25×109至50×109轉導單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、10×1010、11×1010、15×1010、20×1010、25×1010、30×1010、40×1010或50×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010至6×1010、6×1010至7×1010、7×1010至8×1010、8×1010至9×1010、9×1010至10×1010、10×1010至11×1010、11×1010至15×1010、15×1010至20×1010、20×1010至25×1010、25×1010至30×1010、30×1010至40×1010、40×1010至50×1010，或50×1010至100×1010感染單位/mL中的任一者。在一些具體實例中，所述組成物的病毒效價為至少約5×1010至10×1010、10×1010至15×1010、15×1010至25×1010，或25×1010至50×1010感染單位/mL中的任一者。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至個體(例如，人)的CNS，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，施用至個體的病毒顆粒的劑量為至少大約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。在一些具體實例中，施用至個體的病 毒顆粒的劑量為約1×108至約1×1013基因組拷貝/kg體重中的任一者。
在一些具體實例中，所述方法包括將有效量的重組病毒顆粒施用至個體(例如，人)的CNS，所述重組病毒顆粒包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，施用至個體的病毒顆粒的總量為至少大約1×109至約1×1014基因組拷貝中的任一者。在一些具體實例中，施用至個體的病毒顆粒的總量為約1×109至約1×1014基因組拷貝中的任一者。
V.表現構築體
在一些方面中，本發明提供通過視網膜下遞送rAAV載體將異源核酸遞送至眼部的方法，所述rAAV載體包含所述異源核酸和其中所述rAAV載體在rAAV衣殼(例如，rAAV2衣殼、rAAVrh8R衣殼等)中衣殼化，所述rAAV衣殼包含與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。在一些方面中，本發明提供治療個體的CNS的病症的方法，其包括將包含rAAV顆粒的組成物遞送至個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV末端重複。在一些具體實例中，所述異源核酸(例如，轉殖基因)可操作地連接於啟動子。例示性啟動子包括但不限於巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子， RSV LTR，MoMLV LTR，磷酸甘油酸激酶-1(PGK)啟動子，猿猴病毒40(SV40)啟動子和CK6啟動子，轉甲狀腺素蛋白啟動子(TTR)，TK啟動子，四環素回應啟動子(TRE)，HBV啟動子，hAAT啟動子，LSP啟動子，嵌合肝特異性啟動子(LSP)，E2F啟動子，端粒酶(hTERT)啟動子；巨細胞病毒增強子/雞β-肌動蛋白/兔β球蛋白啟動子(CAG啟動子；Niwa等，Gene,1991,108(2)：193-9)和延伸因子1-α啟動子(EF1-alpha)啟動子(Kim等，Gene,1990,91(2)：217-23和Guo等，Gene Ther.,1996,3(9)：802-10)。在一些具體實例中，所述啟動子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶啟動子或與雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子連接的巨細胞病毒增強子。所述啟動子可為組成型、誘導性或阻抑啟動子。 在一些具體實例中，所述啟動子能夠在眼的細胞中表現所述異源核酸。在一些具體實例中，所述啟動子能夠在感光細胞或RPE中表現所述異源核酸。在具體實例中，所述啟動子是視紫紅激酶(RK)啟動子；例如，人RK啟動子。在一些具體實例中，所述啟動子是視蛋白啟動子；例如，人視蛋白啟動子或小鼠視蛋白啟動子。
本發明涵蓋使用重組病毒基因組引入編碼治療性多肽和/或核酸的一個或多個核酸序列，以包裝入包含與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代的rAAV病毒顆粒。所述重組病毒基因組可包括建立所述治療性多肽和/或核酸的表現的任何元件，例如，啟動子、ITR、核糖體結合元件、終止子、增強子、選擇標記、內含子、多聚A信號(poly A signal)和/或複製起點。
在一些具體實例中，所述rAAV載體是自身-互補的rAAV載體，例如，包含重組自互補的(術語“自身-互補的在本文中可互換使用)基因組的rAAV載體。具有自互補的基因組的AAV病毒顆粒和使用自互補的AAV基因組的方法在美國專利號6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及Wang Z.，等，(2003)Gene Ther 10：2105-2111中描述，其每一篇以參考方式整體併入本文。包含自互補的基因組的rAAV憑藉其部分互補序列(例如，轉殖基因的互補的編碼和非編碼鏈)會迅速地形成雙鏈DNA分子。在一些具體實例中，所述載體包含編碼所述異源核酸的第一核酸序列和編碼所述核酸的互補體的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列可與第二核酸序列沿其全長或長度的大部分形成鏈內鹼基對。
在一些具體實例中，所述第一異源核酸序列和所述第二異源核酸序列經由突變的ITR(例如，正確的(right)ITR)連接。在一些具體實例中，所述ITR包含多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO：8)。所述突變的ITR包含D區的缺失並包含末端解析序列。結果，在AAV病毒基因組的複製中，所述rep蛋白質不會在突變的ITR切割病毒基因組並由此，以5'至3'順序包含如下的重組病毒基因組可被包裝在病毒衣殼中：AAV ITR、包括調節序列的第一異源多核苷酸序列、突變的AAV ITR、與第一異源多核苷酸方向相反的第二異源多核苷酸 和第三AAV ITR。
VI.病毒顆粒和產生病毒顆粒的方法 rAAV病毒顆粒
在一些方面中，本發明提供經由視網膜下遞送rAAV載體而將異源核酸遞送至眼部的方法，所述rAAV載體包含所述異源核酸和其中所述rAAV載體在rAAV衣殼(例如，rAAV2、rAAVrh8R等)中衣殼化，所述rAAV衣殼包含與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。在一些方面中，本發明提供關於將rAAV顆粒遞送至個體的CNS的方法和套組。
在一些具體實例中，所述rAAV顆粒包含rAAV載體。在一些具體實例中，所述病毒顆粒是包含核酸的重組AAV顆粒，所述核酸包含側翼為一個或兩個AAV末端反向重複(ITRs)的異源轉殖基因。所述核酸在AAV顆粒中衣殼化。所述AAV顆粒還包含衣殼蛋白。在一些具體實例中，所述核酸包含目標編碼序列(例如，異源轉殖基因)，以轉錄的方向操作性連接的組分，調控序列包括轉錄起始和終止序列，由此形成表現盒。
所述表現盒在5'和3'端側翼為至少一個功能性AAV ITR序列。“功能性AAV ITR序列”是指ITR序列發揮如預期的功能，用於AAV病毒體的拯救、複製和包裝。參見Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等，J.Virol.,2003,77(12)：7034-40；和Pechan等，Gene Ther.,2009,16：10-16，其所有係以參考方式整體併入本文。為了實施本發明的一些方面，所述重組載體至少包含對於衣殼化和rAAV感染的物理結構必 需的全部AAV序列。用於本發明的載體的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5：793-801中所述)，並可通過核苷酸的插入、缺失或取代而改變或者所述AAV ITR可源自幾個AAV血清型中的任何。目前已知AAV的多於40個血清型，而且新的血清型和存在的血清型的變體繼續得以鑑定。參見Gao等，PNAS,2002,99(18)：11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10)：6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12)：6799-810。
任何AAV血清型的使用在本發明的範圍內被考慮。在一些具體實例中，rAAV載體是源自AAV血清型的載體，包括而不限於AAV ITR為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、羊AAV、牛AAV或小鼠AAV ITR等。在一些具體實例中，所述AAV中的核酸包含AAV ITR的ITR，其為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等。在一些具體實例中，所述AAV中的核酸包含AAV2 ITR。如上文所述，所述rAAV顆粒可進一步包含含有rAAV衣殼蛋白的衣殼，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。
在一些具體實例中，載體可包括填充核酸。在一些具體實例中，所述填充核酸可編碼綠色螢光蛋白。在一些具體實例中， 所述填充核酸可位於啟動子和編碼所述RNAi的核酸之間。
不同的AAV血清型用於優化特定靶細胞的轉導或靶向特定靶組織(例如，CNS組織)內特定的細胞類型。rAAV顆粒可包含相同血清型或混合的血清型的病毒蛋白質和病毒核酸。例如，在一些具體實例中，rAAV顆粒可包含本發明的AAV2衣殼蛋白和至少一個AAV2 ITR或其可包含AAV2衣殼蛋白和至少一個AAV1 ITR。用於產生rAAV顆粒的AAV血清型的任何組合在本文中提供，如同各組合已明確地在本文敘述。在一些具體實例中，本發明提供包含本發明的AAV2衣殼的rAAV顆粒。在一些具體實例中，本發明提供包含本發明的AAVrh8R衣殼的rAAV顆粒。
AAV顆粒的產生
本領域已知許多方法用於生產rAAV載體，包括轉染、穩定的細胞系的生產，和感染性雜合病毒生產系統(其包括腺病毒-AAV雜合體、皰疹病毒-AAV雜合體(Conway,JE等，(1997)J.Virology 71(11)：8780-8789)和桿狀病毒-AAV雜合體。用於產生rAAV病毒顆粒的rAAV生產培養物都需要；1)合適的宿主細胞，包括，例如，源自人的細胞系如HeLa細胞、A549或293細胞，或源自昆蟲的細胞系如SF-9，在桿狀病毒生產系統的情況下；2)合適的輔助病毒功能，其由野生型或突變體腺病毒(如溫度敏感的腺病毒)、皰疹病毒、桿狀病毒或提供協助工具的質體構築體提供；3)AAV rep和cap基因和基因產物；4)轉殖基因(如治療性轉殖基因)，其側翼為至少一個AAV ITR 序列；和5)合適的培養基和培養基組分以支持rAAV生產。本領域中已知的合適培養基可用於產生rAAV載體。這些培養基包括而不限於由Hyclone Laboratories和JRH生產的培養基，包括改良的Eagle培養基(MEM)，Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM)中，定制的配製物如美國專利號6,566,118中所述的那些，和如美國專利號6,723,551中所述的SF-900 II SFM培養基，其每一篇係以參考方式整體併入本文，特別是關於用於產生重組AAV載體的定制的培養基配製物。
所述rAAV顆粒能夠使用本領域中已知的方法來產生。參見，例如，美國專利號6,566,118；6,989,264和6,995,006。在本發明的實施中，用於產生rAAV顆粒的宿主細胞包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、微生物和酵母。宿主細胞也可為包裝細胞，其中所述AAV rep和cap基因被穩定地保持在宿主細胞或生產細胞中，其中所述AAV載體基因組被穩定地保持。例示性的包裝和生產細胞源自293、A549或HeLa細胞。使用本領域已知的標準技術純化和配製AAV載體。
在一些具體實例中，rAAV顆粒可由三重轉染方法來生產，如示例性三重轉染方法在下文提供。簡言之，可將含有rep基因和衣殼基因的質體以及輔助腺病毒質體轉染(例如，使用磷酸鈣法)入細胞系(例如，HEK-293細胞)，並可收集和任選地純化病毒。
在一些具體實例中，rAAV顆粒可藉由生產細胞系方法產生，如下文提供的例示的生產細胞系方法(另見(Martin等，(2013)Human Gene Therapy Methods 24：253-269中引用的)。簡 言之，細胞系(例如，HeLa細胞系)可用含有rep基因、衣殼基因和啟動子-轉殖基因序列的質體穩定地轉染。可篩選細胞系以選擇引導選殖用於rAAV生產，然後可將其擴展到生產生物反應器並以作為輔助者的腺病毒(例如，野生型腺病毒)感染以啟動rAAV生產。隨後可收穫病毒，腺病毒可以被滅活(例如，通過加熱)和/或移出，且可純化所述rAAV顆粒。
在一些方面中，提供了用於產生如本文揭示的任何rAAV顆粒的方法，其包括：(a)在產生rAAV顆粒的條件下培養宿主細胞，其中所述宿主細胞包含(i)一個或多個AAV包裝基因，其中每個所述AAV包裝基因編碼AAV複製和/或衣殼化蛋白質；(ii)rAAV pro-載體，其包含編碼如本文所述的治療性多肽和/或核酸的核酸，所述核酸側翼為至少一個AAV ITR，和(iii)AAV協助工具；和(b)回收由宿主細胞產生的rAAV顆粒。在一些具體實例中，所述至少一個AAV ITR是選自下列組成群組的AAV ITR：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、羊AAV、牛AAV或小鼠AAV等。在一些具體實例中，所述衣殼化蛋白質包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置。在一些具體實例中，所述衣殼化蛋白質是AAV2衣殼化蛋白質。在一些具體實例中，所述衣殼化蛋白質是AAVrh8R衣殼化蛋白質。
本發明的合適的rAAV生產培養基可以0.5%-20%(v/v或w/v)的水平補充血清或血清來源的重組蛋白質。或是，如本領 域已知的，rAAV載體可在無血清條件下產生，其也可稱為無動物來源產品的培養基。本領域的普通技術人員可理解，經設計以支持rAAV載體產生的商用或定制培養基也可以補充有本領域已知的一個或多個細胞培養組分，包括但不限於葡萄糖、維生素、胺基酸和或生長因子，以增加生產培養物中rAAV的滴度(titer)。
rAAV生產培養物可以在適於正使用的特定宿主細胞的多種條件(在寬的溫度範圍，進行不同長度的時間等)下生長。如本領域已知的，rAAV生產培養包括附接依賴性培養，其可在合適的附接依賴性容器如，例如，滾瓶、中空纖維濾器、微載體和填充床或流化床生物反應器中進行培養。rAAV載體生產培養物還可包括適應懸浮液的宿主細胞如HeLa細胞、293和SF-9細胞，其可以多種方式，包括，例如，旋轉瓶、攪拌罐生物反應器和一次性系統如Wave袋系統進行培養。
本發明的rAAV載體顆粒可從rAAV生產培養物藉由裂解所述生產培養物的宿主細胞或藉由從生產培養物收穫用過的培養基來收穫，只要將細胞在本領域中已知的條件下培養以引起rAAV顆粒從完整細胞釋放入培養基，如更充分地美國專利號6,566,118中所描述的)。裂解細胞的合適方法也是本領域中已知的且包括例如多個凍/融循環、音波處理、微流化，和用化學品(如洗滌劑和/或蛋白酶)處理。
在進一步的具體實例中，純化所述rAAV顆粒。如本文所用的術語“純化”包括製備缺乏至少一些其它組分的rAAV顆粒，所述其它組分還可能存在於天然存在的或由其起始製備的 rAAV顆粒。因此，例如，分離的rAAV顆粒可使用純化技術從源混合物(如培養裂解物或生產培養物上清液)富集它來製備。 富集可以多種方式測量，如，例如，通過存在於溶液中的DNA酶抗性顆粒(DRPs)或基因組拷貝(gc)的比例，或通過感染性，或它可相對於源混合物中存在的第二、潛在的干擾物質而測量，所述干擾物質如污染物，包括生產培養污染物或過程中的污染物，包括輔助病毒，培養基組分等。
在一些具體實例中，將所述rAAV生產培養收穫物澄清以除去宿主細胞碎片。在一些具體實例中，生產培養收穫物通過一系列的深度篩檢程式(包括，例如，等級(grade)DOHC Millipore Millistak+ HC Pod篩檢程式、等級A1HC Millipore Millistak+ HC Pod篩檢程式，和0.2微米濾器Opticap XL1O Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane篩檢程式)通過過濾澄清。澄清也可以通過多種本領域已知的其它標準技術來實現，如，離心或通過本領域中已知的0.2微米或更大孔尺寸的任何醋酸纖維素濾膜過濾。
在一些具體實例中，將所述rAAV生產培養收穫物進一步用Benzonase®處理以消化所述生產培養物中存在任何高分子量DNA。在一些具體實例中，所述Benzonase®消化在本領域已知的標準條件下進行，包括，例如，終濃度為1-2.5單位/ml的Benzonase®在環境至37℃的溫度進行30分鐘至數小時的時間。
可使用一個或多個如下純化步驟分離或純化rAAV顆粒：平衡離心；流過陰離子交換過濾；用於濃縮所述rAAV顆粒的 切向流過濾(TFF)；通過磷灰石色譜的rAAV捕獲；輔助病毒的熱滅活；通過疏水相互作用色譜的rAAV捕獲；通過大小排阻色譜(SEC)的緩衝液交換；奈米過濾；和通過陰離子交換層析、陽離子交換層析或親和層析的rAAV捕獲。這些步驟可以單獨、以多種組合，或以不同的順序使用。在一些具體實例中，所述方法包括以如下所述的順序的所有步驟。純化rAAV顆粒的方法見於，例如，Xiao等，(1998)Journal of Virology 72：2224-2232；美國專利號6,989,264和8,137,948；和WO 2010/148143中。
本申請還提供包含rAAV顆粒和藥學上可接受的載體的藥學組成物，所述rAAV顆粒包含編碼治療性多肽和/或治療性核酸的異源核酸，其中所述rAAV顆粒包含rAAV衣殼，所述rAAV衣殼包含與HSPG相互作用的胺基酸的一個或多個取代。所述藥學組成物可適於本文所述的任何施用方式；例如，經由視網膜下施用。
在一些具體實例中，包含本文所述的rAAV和藥學上可接受的載體的藥學組成物適於施用至人。所述載體是本領域熟知的(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，pp.1035-1038和1570-1580)。在一些具體實例中，包含本申請所述的rAAV和藥學上可接受的載體的藥學組成物適於眼注射。所述藥學上可接受的載體可為無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油等中的那些。鹽水溶液和含水右旋糖、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用於可注射溶液。所述藥學組成物可 進一步包含另外的成分，例如防腐劑、緩衝液、等滲劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子型潤濕或澄清劑，增粘劑等。本文所述的藥學組成物可以包裝於單個單位劑量或多劑量形式中。所述組成物通常配製為無菌和基本上等滲的溶液。
VII.系統和套組
如本申請所述的rAAV組成物可包含於經設計用於如本申請所述的本發明的方法之一的系統。
視網膜下遞送
在一些具體實例中，本發明提供用於將載體視網膜下遞送至個體的眼部之系統，其包含a)包含有效量的rAAV顆粒的組成物，其中i)所述rAAV顆粒的衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和ii)所述載體包含編碼治療性多肽或治療性RNA的異源核酸和至少一個AAV末端重複；和b)用於視網膜遞送所述rAAV的裝置。
通常，所述系統包含細口徑套管(其中所述套管為27至45Gauge)、一個或多個注射器(例如，1、2、3、4或更多)和適用於本發明的方法的一種或多種流體(例如，1、2、3、4或更多)。
所述細口徑套管適於將載體懸浮物和/或待注射的其他流體視網膜下注射入視網膜下空間。在一些具體實例中，所述套管為27至45Gauge。在一些具體實例中，所述細口徑套管為35-41Gauge。在一些具體實例中，所述細口徑套管為40或41 Gauge。在一些具體實例中，所述細口徑套管為41-Gauge。所述套管可為任何合適的套管類型，例如，de-Juan®套管或Eagle®套管。
所述注射器可為任何合適的注射器，條件是它能夠連接於用於遞送流體的套管。在一些具體實例中，所述注射器是Accurus®系統注射器。在一些具體實例中，所述系統具有一個注射器。在一些具體實例中，所述系統具有兩個注射器。在一些具體實例中，所述系統具有三個注射器。在一些具體實例中，所述系統具有四個或更多注射器。
所述系統可進一步包含自動化的注射泵，其可通過例如踏板啟動。
適用於本發明的方法的流體包括本申請所述的那些，例如，各包含有效量的如本申請所述的一個或多個載體的一種或多種流體，用於創建起始泡的一種或多種流體(例如，鹽水或其他適當的流體)，和包含一個或多個治療劑的一種或多種流體。
適用於本發明的方法的流體包括本申請所述的那些，例如，各包含有效量的如本申請所述的一個或多個載體的一種或多種流體，用於創建起始泡的一種或多種流體(例如，鹽水或其他適當的流體)，和包含一個或多個治療劑的一種或多種流體。
在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為至少大約0.9ml。在一些具體實例中，包含有效量的載 體之流體的體積為至少大約1.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為至少大約1.5ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為至少大約2.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8至約3.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8至約2.5ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8至約2.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8至約1.5ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為大於約0.8至約1.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約0.9至約3.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約0.9至約2.5ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約0.9至約2.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約0.9至約1.5ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約0.9至約1.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約1.0至約3.0ml。在一些具體實例中，包含有效量的載體之流體的體積為約1.0至約2.0ml。
用於創建起始泡的流體可為例如約0.1至約0.5ml。在一些具體實例中，系統中所有流體的總體積為約0.5至約3.0ml。在一些具體實例中，所述系統包含單一流體(例如，包含有效量的載體的流體)。在一些具體實例中，所述系統包含2種流體。在一些具體實例中，所述系統包含3種流體。在一些具體實例中，所述系統包含4種或更多流體。
本發明的系統可進一步包裝入套組中，其中所述套組可進一步包含使用說明。在一些具體實例中，所述套組進一步包含用於視網膜下遞送rAAV顆粒的組成物的裝置。在一些具體實例中，所述使用說明包括根據本申請所述的方法之一的說明。在一些具體實例中，所述使用說明包括用於視網膜下遞送rAAV顆粒的說明，所述rAAV顆粒包含具有一個或多個胺基酸取代的衣殼，所述胺基酸取代改變、降低或去除所述rAAV顆粒與HSPG的結合。
CNS遞送
本發明提供用於將異源核酸遞送至個體的CNS的套組，其包含含有rAAV顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含(a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。本文進一步提供的是用於在個體中治療CNS病症的套組，其包含含有rAAV顆粒的組成物，其中所述rAAV顆粒包含(a)rAAV衣殼，其包含rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白含有一個或多個胺基酸取代，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置，和(b)rAAV載體，其包含用於治療CNS病症的異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
所述套組可包含本發明的任何rAAV顆粒或rAAV顆粒組成物。例如，所述套組可包括具有rAAV衣殼的rAAV顆粒， 所述rAAV衣殼包含含有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼蛋白，所述胺基酸取代在與硫酸乙醯肝素蛋白多糖相互作用的一個或多個位置(例如，降低所述rAAV顆粒與硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合的一個或多個胺基酸取代，如在R484、R487、K527、K532、R585和/或R588的取代，編號基於AAV2的VP1)；和rAAV載體，其包含所述異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
在一些具體實例中，所述套組進一步包含用於CNS遞送所述rAAV顆粒的組成物的裝置。用於CNS遞送(例如，用於遞送包含rAAV顆粒的組成物)的裝置是本領域已知的並可利用泵(例如，滲透泵和/或輸液泵，如下所述)和注射裝置(例如，導管、套管等)。任選地，成像技術可用於指導注射裝置和/或監測輸注物(例如，包含rAAV顆粒的組成物)的遞送。CNS遞送可包括通過立體定位注射或通過對流增強遞送(CED)的遞送。 可將所述注射裝置插入受試者中的CNS組織。本領域的技術人員能夠確定用於將注射裝置定位於靶CNS組織中的合適的座標。在一些具體實例中，定位通過例如由受試者的腦的CT和/或MRI成像獲得的解剖圖譜完成以將注射裝置引導至靶CNS組織。
在一些具體實例中，可進行遞送的術中磁共振成像(iMRI)和/或即時成像。在一些具體實例中，該裝置用於通過本發明的方法將rAAV顆粒施用至哺乳動物。本領域已知iMRI作為用於在手術過程中患者的基於MRI的成像的技術，這有助於證實成功的手術過程(例如，將rAAV顆粒遞送至中樞神經系 統)和降低損傷組織的其它部分的風險(對於進一步的描述，參見，例如，Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35)。 在一些具體實例中，追蹤劑(例如，MRI造影增強劑)可與輸注物(例如，包括rAAV顆粒的組成物)共遞送以提供輸注物的組織分佈的即時監測。參見例如Fiandaca等，(2009)Neuroimage 47 Suppl.2：T27-35；U.S.PG Pub 2007/0259031；和美國專利號7,922,999。使用追蹤劑可以通知遞送的停止。本領域已知的其他跟蹤和成像手段技術也可用於跟蹤輸注物分佈。
在一些具體實例中，rAAV顆粒可以藉由標準的立體定位(術語“立體定向”在本文中可互換使用)注射使用本領域中已知的用於遞送rAAV顆粒的裝置和方法施用。通常，這些方法可以使用注射裝置，用於將靶向遞送組織的區域轉換成一系列座標(例如，沿側(latero-lateral)，背腹(dorso-ventral)，和尾(rostro-caudal)軸的參數)的規劃系統，和根據計畫的座標用於立體定位的裝置(例如，立體定位裝置，任選地包括探頭和用於將頭固定在與坐標系對齊的位置的結構)。可用於MRI引導手術和/或立體定向注射的系統的非限制性例子是ClearPoint®系統(MRI Interventions,Memphis,TN)。
用於將rAAV顆粒遞送至CNS的另一個例示性和非限制性方法是對流增強遞送(CED)。如本申請中使用的，術語“對流增強遞送(CED)”可涉及將治療劑通過輸注以靜水壓力導致對流分佈的速率遞送至CNS。在一些具體實例中，輸注以大於0.5μL/min的速率完成。然而，可使用任何合適的流速使得顱內壓保持在合適的水平從而不會傷害腦組織。例如，可通過使 用合適的導管或套管(例如，分步設計無回流(step-design reflux-free)套管)藉由將套管的尖端定位於至少靠近靶CNS組織(例如，將尖端插入CNS組織)來完成CED。定位套管後，將其連接至泵，所述泵將治療劑經由套管尖端遞送至靶CNS組織。可在輸注過程中保持來自套管尖端的壓力梯度。在一些具體實例中，可通過由成像方法如術中MRI(iMRI)或另外的即時MRI技術可檢測的追蹤劑來監測輸注。
CED基於將輸注物(例如，含有rAAV顆粒的組成物)在組織間流體的靜水壓力得到克服的壓力下泵送入CNS。這使得所述輸注物與CNS血管周(perivasculature)接觸，其被用作泵以將所述輸注物通過對流分佈並增強其遞送的程度(參見，例如，Hadaczek等，(2006)Hum.Gene Ther.17：291-302；Bankiewicz等，(2000)Exp.Neurol.164：2-14；Sanftner,LM等，(2005)Exp.Neurol.194(2)：476-483；Forsayeth,JR等，(2006)Mol.Ther.14(4)：571-577；美國專利號6,953,575；美國專利申請公開號2002/0141980；美國專利申請公開號2007/0259031；和WO 2010/088560)。
在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包含滲透泵和/或輸液泵。滲透泵和/或輸液泵是商業上可得到的(例如，由ALZET® Corp.,Hamilton Corp.,ALZA Inc.於Palo Alto,CA)。泵系統可為可植入的。例示的泵系統可見於，例如，美國專利Nos.7,351,239；7,341,577；6,042,579；5,735,815；和4,692,147中。用於CED的例示裝置，包括抗回流和階梯形套管，可見於WO 99/61066和WO 2006/042090，其在此係以參考方式整體併入。
在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包含抗回流套管(例如，無回流分步設計套管)。抗回流套管的進一步描述和例示可見於，例如，Krauze等，(2009)Methods Enzymol.465：349-362；U.S.PG Pub 2006/0135945；U.S.PG Pub 2007/0088295；和PCT/US08/64011中。在一些具體實例中，僅使用一個套管。在其他具體實例中，使用多於一個套管。在一些具體實例中，用於對流增強遞送的裝置包含與泵連接的抗回流套管，所述泵產生足夠的壓力以引起輸注物以受控的速率藉由套管流至靶組織。可使用任何合適的流速使得顱內壓保持在合適的水平從而不會傷害腦組織。
在一些具體實例中，輸注物的滲透通過使用促進劑而進一步擴大。促進劑能夠進一步促進輸注物遞送至靶組織(例如，CNS靶組織)。促進劑的非限制性實例是低分子量肝素(參見，例如，美國專利號7,922,999)。
在一些具體實例中，所述套組進一步包含用於CNS遞送所述rAAV顆粒的組成物的說明書。本申請所述的套組可進一步包括由商業和用戶立場出發所欲的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和具有用於實施本文所述的任何方法的說明的包裝說明書(package inserts)。還可包括合適的包裝材料且其可為本領域已知的任何包裝材料，例如，小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、柔性包裝(例如，密封的Mylar或塑膠包)等。這些製造物品可進一步滅菌和/或密封。在一些具體實例中，所述套組包含使用本文所述的任何方法和/或rAAV顆粒治療本文所述的CNS的病症的說明書。所述套 組可包括適於注射入個體的CNS的藥學上可接受的載體，和如下的一種或多種：緩衝液、稀釋劑、濾器、針頭、注射器和具有用於實施注射入個體的CNS的說明的包裝說明書。
賦形劑
在涉及視網膜下和/或CNS遞送的一些具體實例中，所述套組進一步含有緩衝液和/或藥學上可接受的賦形劑。如本領域中熟知的，藥學上可接受的賦形劑是相對惰性的物質，其促進藥理學有效物質的施用並可作為液體溶液或懸浮物、作為乳劑或作為適於在使用前在液體中溶解或懸浮的固體形式供給。例如，賦形劑可給予形式或稠度(consistency)或充當稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限於穩定劑、潤濕或乳化劑、用於改變滲透壓的鹽、包囊劑、pH緩衝物質和緩衝液。所述賦形劑包括任何適於直接遞送至眼的藥劑，其可被施用而無過度的毒性。藥學上可接受的賦形劑包括但不限於山梨糖醇、任何多種TWEEN化合物，和液體如水、鹽水、甘油和乙醇。藥學上可接受的鹽可包括於其中，例如，無機酸鹽如氫氯化物、氫溴化物、磷酸鹽、硫酸鹽等；和有機酸的鹽如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽等。藥學上可接受的賦形劑的全面討論可在REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中得到。
在涉及視網膜下和/或CNS遞送的一些具體實例中，藥學上可接受的賦形劑可包括藥學上可接受的載體。所述藥學上可接受的載體可為滅菌的液體，如水和油，包括，包括石油、動 物、植物或合成來源的，如花生油、大豆油、礦物油等中的那些。鹽水溶液和含水右旋糖、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液體載體，特別是用於可注射溶液。還可使用另外的成分，例如防腐劑、緩衝液、等滲劑、抗氧化劑和穩定劑、非離子型潤濕或澄清劑，增粘劑等。本文所述的套組可以包裝於單個單位劑量或多劑量形式中。所述套組的內容物通常配製為無菌和基本上等滲的溶液。
附圖簡述
圖1指示硫酸乙醯肝素蛋白多糖結合中涉及的衣殼殘基和引入以生成AAV2 HBKO突變體的突變。編號基於VP1胺基酸序列。
圖2顯示與野生型AAV2顆粒(AAV2 CBA-sFLT02)相比，以HBKO突變體AAV2顆粒觀察到的培養物中293細胞的轉導的減少(AAV2 HBKO CBA-sFLT02)。藉由在用野生型或攜帶使用CBA啟動子以驅動Flt表現的載體的HBKO突變體AAV2顆粒注射後48小時測量細胞培養基中存在的可溶性Flt(sFLT)之量來測定轉導。
圖3顯示與野生型AAV2顆粒(AAV2 CBA-GFP)相比，以HBKO突變體AAV2顆粒(AAV2 HBKO CBA-GFP)觀察到的培養物中293和Hela細胞的轉導的減少。藉由在用野生型或攜帶使用CBA啟動子以驅動EGFP表現的載體的HBKO突變體AAV2顆粒注射後48小時取得的細胞的螢光成像(fluorescence imaging)來測定轉導。
圖4A & 4B顯示玻璃體內(圖4A)或視網膜下(圖4B)注射野生型AAV2或HBKO突變體AAV2顆粒後觀察到的轉導。藉由用編碼Flt的載體轉導後可溶性Flt(sFLT)的表現來測定轉導。對於每個實驗指示注射的載體基因組的數目(108或109vg)。
圖5顯示在玻璃體內注射後HBKO突變體AAV2顆粒未能轉導小鼠眼。給予小鼠玻璃體內注射的野生型(AAV2 CBA-GFP)或攜帶使用CBA啟動子以驅動EGFP表現的載體的HBKO突變體(AAV2 HBKO CBA-GFP)AAV2顆粒，且藉由螢光顯微術成像切片(sections)。
圖6顯示在視網膜下注射後HBKO突變體AAV2顆粒(AAV2 CBA HBKO)與野生型顆粒(AAV2 CBA)相比引起轉導的顯著增加。藉由在用攜帶使用CBA啟動子以驅動Flt的表現的載體的AAV2顆粒注射後表現可溶性Flt(sFLT)來測定轉導。指示注射的載體基因組的數目(108或109vg)。
圖7顯示與野生型顆粒(AAV2 CBA-GFP)相比，HBKO突變體AAV2顆粒(AAV2 HBKO CBA-GFP)在視網膜下注射後引起感光細胞(如標記的)的轉導的顯著增加。藉由在用攜帶使用CBA啟動子以驅動EGFP表現的載體的AAV2顆粒轉導後GFP表現的螢光成像來測量轉導。
圖8顯示與野生型顆粒(AAV2 RK)相比，HBKO突變體AAV2顆粒(AAV2 RK HBKO)在視網膜下注射後引起光感受器的轉導的顯著增加。藉由在用攜帶使用視紫紅激酶(RK)啟動子 以驅動Flt表現的載體的AAV2顆粒注射後可溶性Flt(sFLT)的表現來測定轉導。指示注射的載體基因組的數目(108或109vg)。
圖9A&9B顯示與野生型小鼠中的AAV2-EGFP(圖9B)相比，在紋狀體內注射AAV2HBKO-EGFP(圖9A)後30天小鼠腦中EGFP的表現。在每個圖面中，EGFP的表現通過CBA啟動子驅動，並使用螢光顯微術顯現。
圖10A&10B顯示與YAC128 HD小鼠中AAV1-miRNA-Htt-GFP(圖10B)相比，在紋狀體內注射AAV2HBKO-miRNA-Htt-GFP(圖10A)後30天小鼠腦中GFP的表現。所述miRNA-Htt-GFP載體指表現靶向人Htt的人工miRNA和GFP報告蛋白的構築體。在每個圖面中，GFP的表現通過CBA啟動子驅動，並使用螢光顯微術以三個不同的放大倍數(4X、10X和20X，如標記的)顯現。
圖11A顯示與未處理的對照相比，注射AAV1-miRNA-Htt和AAV2HBKO-miRNA-Htt後30天紋狀體小鼠腦穿孔物中人HTT mRNA水平的qPCR分析。
圖11B顯示與未處理的對照相比，注射AAV1-miRNA-Htt和AAV2HBKO-miRNA-Htt後30天皮質小鼠腦穿孔物中人Htt蛋白質水平的Western印跡分析。
圖12A-12C顯示與未處理的對照(圖12A)相比，以AAV2HBKO-miRNA-Htt-GFP(圖12B)或AAV1-miRNA-Htt-GFP(圖12C)注射後30天YAC128小鼠紋狀體中Iba1的表現。
圖13A-13C顯示與未處理的對照(圖13A)相比，以AAV2HBKO-miRNA-Htt-GFP(圖13B)或AAV1-miRNA-Htt-GFP(圖13C)注射後30天YAC128小鼠紋狀體中GFP的表現。
圖14比較AAV2和AAVrh8R衣殼之間硫酸乙醯肝素蛋白多糖結合中涉及的衣殼殘基。編號基於VP1胺基酸序列。
圖15顯示AAV2和AAVrh8R在負責AAV2的乙醯肝素結合的殘基處的胺基酸比對。圈出AAVrh8R精胺酸衣殼修飾的位置。
圖16A顯示與野生型AAVrh8R相比，由AAVrh8R A586R突變體顯現的HeLa細胞的改進的體外轉導。藉由用AAVrh8R或AAVrh8R精胺酸修飾的載體感染後48小時培養基中的sFLT02監測轉導。
圖16B顯示與野生型AAVrh8R相比，由AAVrh8R R533A突變體顯現的HeLaRC32細胞的減少的體外轉導。藉由用AAVrh8R或AAVrh8R精胺酸修飾的載體感染後48小時培養基中的sFLT02監測轉導。
圖17A-17D顯示與野生型AAVrh8R相比，由AAVrh8R A586R和R533A突變體顯現的體外轉導水平。與野生型AAVrh8R(圖17A)相比，AAVrh8R A586R突變體(圖17B)顯示NS1細胞的增加的體外轉導。AAVrh8R R533A突變體(圖17D)顯示與野生型AAVrh8R(圖17C)相比，HeLa細胞的減少的體外轉導。通過用AAVrh8R或AAVrh8R精胺酸修飾的載體感染後48小時細胞中的EGFP表現監測轉導。
圖18A & 18B顯示由AAVrh8R A586R和R533A突變體顯現的C57Bl6小鼠中視網膜下轉導的水平。(圖18A)AAVrh8R A586R突變體顯示與野生型AAVrh8R相比減少的視網膜下轉導。還測試了AAV2載體。(圖18B)AAVrh8R R533A突變體顯示與野生型AAVrh8R和初次接受試驗的小鼠(naïve mice)相比增加的視網膜下轉導。藉由視網膜下施用AAVrh8R或AAVrh8R精胺酸修飾的載體後30天C57Bl6小鼠的視網膜裂解物(lysate)中的sFLT02監測轉導。
圖19顯示玻璃體內施用AAV2、AAVrh8R或AAVrh8R-A586R載體後30天C57Bl6小鼠的視網膜裂解物中的sFLT02的水平。
圖20顯示負責AAV2的AAV2與AAVrh8R以及AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10中的乙醯肝素結合的殘基處的胺基酸比對。
實施例
通過參考如下實施例可更加充分地理解本發明。然而，它們不應被解釋為限制本發明的範圍。可理解的是本申請所述的實施例和具體實例僅為說明目的，而且在其啟示下的多種修飾或變化會暗示於本領域的技術人員並包括在此申請案的精神和視野以及所附請求項的範圍之內。
實施例1：用於HSPG結合所需的精胺酸殘基的突變在培養的 細胞系中降低AAV2-介導的轉導
AAV2基因治療載體目前用於眼適應症的臨床試驗。這些載體可經由玻璃體內施用路徑遞送，其在小鼠和非人靈長類中導致視網膜神經節細胞和Müller細胞的轉導，或經由視網膜下施用路徑遞送，其靶向視網膜色素上皮細胞和感光細胞。不同血清型的AAV使用不同的細胞表面受體和共受體用於感染。已知AAV2的初級細胞表面受體是硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)(Summerford,C.和Samulski,R.J.(1998)J.Virol.72(2)：1438-45)。理解AAV2轉導視網膜的機制對於進一步開發AAV基因治療載體是重要的。
為了研究HSPG結合在視網膜的AAV2轉導中的作用，生成了具有衣殼蛋白的AAV2載體，所述衣殼蛋白在已知用於HSPG結合所需的精胺酸殘基中攜帶突變(AAV2 HBKO)。這些載體導致與野生型AAV2相比對293和HeLa細胞在培養物中顯著降低的轉導。令人驚訝地，視網膜下遞送至小鼠眼的AAV2HBKO載體導致轉導與野生型AAV2相比的2-log增加。然而，當玻璃體內遞送AAV2HBKO載體時，沒有明顯的轉導。這些結果指示在AAV2顆粒的視網膜下注射後，相對於玻璃體內注射，HSPG結合所需的胺基酸中的突變對於轉導效率具有相反的作用。
方法 構建AAV2精胺酸突變體質體
使用Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis 套組(Agilent Technologies)將所述AAV2 rep/cap質體pIM45BD突變。設計PCR突變引物以引入精胺酸585和588至丙胺酸的變化。通過測序證實陽性突變體。
生成rAAV載體
使用pIM45BD或pIM45BDR585A/R588A rep/cap質體和pAdHelper藉由293細胞的三重轉染產生表現增強的綠色螢光蛋白(EGFP)或可溶的VEGF受體雜合體(sFLT02)的重組AAV載體。轉殖基因處於雞β-肌動蛋白(CBA)或人視紫紅激酶啟動子(RK)的控制下。
體外轉導測定法
將293或HeLa細胞鋪板入24孔板(1-2 x105個細胞/孔)。鋪板後24小時，以1 x 103vg/細胞(+)Ad5ts149感染細胞。感染後48小時通過EGFP螢光或通過ELISA以定量培養基中的sFLT02(通過R&D Systems的人可溶性VEGF R1 ELISA)來測量轉導效率。
動物
購買由Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)獲得的成年C57BL/6小鼠並維持在Genzyme的動物飼養室(vivarium)。在研究期間給予所述動物自由接觸食物和水。所有步驟在由動物保護和利用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的規程下進行。
玻璃體內注射
使用經由鼻錐(nose cone)遞送至動物的800mL/分鐘的氧氣中運載的3.5%異氟醚誘導並保持麻木(torpor)。使用裝配有33Gauge斜式針頭(beveled needle)的Hamilton注射器(Hamilton Co.,Reno,NV)將一微升的測試物品注入玻璃狀液(vitreous humor)。引導針頭在(角膜)緣(limbus)的大約2mm下通過鞏膜並小心地前進至玻璃體腔以避免接觸晶狀體。將測試物品在1-2秒的時間遞送。注射後，將針頭保持在原位約五秒然後抽出。允許動物從麻醉恢復然後回到它的籠。
視網膜下注射
局部施用托吡卡胺(Tropicamide)(Alcon,Fort Worth,TX)誘導瞳孔散大和睫狀肌麻痹。使用經由鼻錐遞送至動物的800mL/分鐘的氧氣中運載的3.5%異氟醚誘導並保持麻木。使用環頭鉗(ring tipped forceps)(World Precision Instruments,Sarasota,FL)固定眼，且使用30Gauge針頭將試點切口置於(角膜)緣的大約2mm下的鞏膜上。通過切口導入33Gauge鈍尖針頭並向後進針直到尖端穿透後視網膜神經上皮層(posterior neurosensory retina)。將一微升的測試物品在1秒遞送。將針頭保持在原位約五秒然後抽出。允許動物從麻醉恢復然後回到它的籠。
EGFP的組織學
使用落射螢光顯微鏡(epifluorescence microscope)在福馬林固定的石蠟包埋處理的眼上觀察到原EGFP信號。
結果
如圖1中所描繪，已顯示五個衣殼殘基對於AAV2與HSPG的結合是關鍵的。構建AAV2突變體，其在這些殘基中攜帶兩個胺基酸取代：R585A和R588A(編號基於VP1胺基酸序列)。此突變體稱為HBKO，測試其在培養物中轉導細胞的能力。
人細胞系在培養物中生長並用野生型或HBKO突變體AAV2顆粒轉導。為了測量轉導效率，將兩種AAV2顆粒的病毒基因組使用驅動可溶性Flt(人VEGF受體1)的表現的遍在CBA啟動子進行修飾以包括轉殖基因。轉導後48小時，使用可定量產生的Flt的量的基於ELISA的免疫測定法測量轉導效率。圖2證明HBKO突變體顯示在培養物中轉導人293細胞的能力大大降低。使用相等數目的AAV2顆粒和293細胞，所述HBKO突變體相比於野生型顯示轉導效率降低99.6%。
為了在多種人細胞系中測量此效果，如上所述轉導293和Hela細胞。對於這些測定法，修飾所述載體以從CBA啟動子表現EGFP而不是Flt。圖3顯示野生型AAV2能夠轉導兩種細胞系，如通過EGFP螢光所測量的。相對而言，HBKO突變體在兩種細胞系的轉導中具有引人注目的降低。這些結果證實HBKO突變體在培養物中轉導人胚腎和宮頸癌細胞系的能力顯著降低。
實施例2：用於HSPG結合所需的精胺酸殘基的突變對於玻璃體內相對於視網膜下注射後的AAV2-介導的轉導具有相反的作用
在小鼠中測試了玻璃體內和視網膜下注射後HBKO突變體AAV2顆粒轉導眼細胞的能力。圖4A & 4B比較玻璃體內或視網膜下注射後野生型和HBKO AAV2顆粒的轉導效率。對於這些實驗，通過測量用攜帶轉殖基因的AAV2顆粒轉導後可溶性Flt(sFLT)的表現而測定轉導效率，所述轉殖基因使用遍在CBA啟動子以驅動Flt的表現。使用玻璃體內注射，HBKO突變體顯示轉導細胞的能力大大降低(圖4A)。
令人驚訝地，HBKO突變體顯示了在視網膜下注射後轉導增強(圖4B)。當注射的AAV2載體基因組的量變化10-倍(108和109vg，如標記的)時，此增加可始終觀察到。這些結果與在培養的細胞系中和在玻璃體內注射後觀察到的那些形成對比。這些資料指向HSPG結合能力在介導通過不同類型的眼內注射轉導不同眼細胞類型和視網膜層中的重要性。
為了使視網膜細胞的轉導視覺化，使用攜帶由遍在CBA啟動子表現EGFP的轉殖基因的野生型或HBKO突變體AAV2顆粒。如圖5中所示，野生型AAV2顆粒在玻璃體內注射後能夠轉導視網膜，如通過GFP螢光所證明者。然而，AAV2 HBKO突變體顆粒在玻璃體內注射後不顯示可檢測的GFP螢光。這些結果與圖4A中顯示者相一致。
圖6定量了視網膜下注射後野生型(AAV2 CBA)和HBKO突變體(AAV2 CBA HBKO)AAV2顆粒的轉導效率。為了測量 轉導，兩種AAV2顆粒具有載體基因組，其包含使用遍在CBA啟動子表現Flt的轉殖基因。將兩種量的載體基因組用於注射，如圖6中指示。這些結果證實圖4B中所示的觀察結果，並證明令人驚訝的發現，即突變用於HSPG結合所需的殘基增加了在視網膜下注射後AAV2轉導細胞的能力。
為了使轉導視覺化，使用攜帶由遍在CBA啟動子表現EGFP的轉殖基因的野生型或HBKO突變體AAV2顆粒。如圖7中所示，視網膜中的GFP螢光在用HBKO突變體AAV2顆粒轉導後與野生型相比得到增強。
因為已知視網膜下注射靶向具有感光細胞的細胞層，研究了HBKO突變體AAV2顆粒轉導感光細胞的能力。在眼中，已知視紫紅激酶(RK)啟動子特異性驅動感光細胞如視桿細胞和視錐細胞中的表現(Khani,S.C.，等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48(9)：3954-61)。因此，生成了具有載體基因組的野生型和HBKO突變體AAV2顆粒，所述基因組攜帶使用RK啟動子驅動Flt的表現的轉殖基因。如圖8所示，HBKO突變體AAV2顆粒在視網膜下注射後與野生型相比顯示感光細胞的轉導的增強。此觀察結果在用10-倍不同量的載體基因組(108和109vg，如標記的)注射後始終觀察到。這些結果證明了令人驚訝的結果，即，突變用於HSPG結合所需的殘基增強視網膜下注射後AAV2顆粒轉導視網膜感光細胞的能力。這些殘基的突變代表為AAV2-介導的基因治療增強感光細胞轉導的潛在方式。
AAV是單鏈、無包膜的DNA病毒，其為細小病毒家族的 成員。AAV的不同血清型包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6等顯示不同的組織分佈概貌。這些AAV衣殼的不同的組織向性使基於AAV的載體用於肝、骨骼肌、腦、視網膜、心和脊髓的體外和體內的普遍的基因轉移應用成為可能(Wu,Z.，等，(2006)Molecular Therapy,14：316-327)。病毒附接於宿主細胞需要病毒衣殼與細胞受體分子的特異性相互作用。先前已顯示AAV2衣殼使用硫酸乙醯肝素蛋白多糖(HSPG)、V 5整聯蛋白和人成纖維細胞生長因子受體1作為初級和次級受體以介導基於AAV2的基因治療載體的細胞進入(Summerford,C.和R.J.Samulski(1998)J.Virology,72：1438-1445；Summerford,C.等，(1999)Nat.Medicine,5：78-82；Qing,K.，等，(1999)Nat.Medicine,5：71-77)。AAV2衣殼蛋白的突變分析已顯示一組鹼性胺基酸，即精胺酸R484、R487、R585、R588和賴胺酸K532有助於AAV2載體的乙醯肝素結合和對細胞的體外轉導和體內肝轉導。這些胺基酸殘基中的突變導致基於AAV2的載體通過靜脈內施用路徑的肝轉導大大降低和心及骨骼肌基因轉移的增加(Kern,A.等，(2003)J.Virology,77：11072-11081；Muller,O.J.等，(2006)Cardiovascular Research,70：70-78)。
研究了這些鹼性胺基酸對於AAV2載體通過載體施用的玻璃體內路徑和視網膜下路徑兩者在視網膜中的轉導的作用。 R585和R588的突變顯著地消除了HEK293細胞和Hela細胞的體外轉導(圖2和3)。Dalkara D等，((2009)Molecular Therapy,17：2096-2102)表明玻璃體內遞送的AAV2載體由於與視網膜的內界膜中富含的硫酸乙醯肝素蛋白多糖的結合而未能穿透 入外視網膜。如本實施例所示，在玻璃體內遞送後，R585/R588突變的載體與野生型AAV2載體相比轉導內視網膜的能力較差(圖4A和5)，這表明與HSPG的結合對於視網膜的玻璃體內轉導是重要的。視網膜下遞送基於AAV2的載體主要導致視網膜色素上皮(RPE)轉導和一些感光細胞轉導。令人驚訝地，發現R585/R588突變的載體轉導外視網膜比野生型AAV2載體好至少10倍(圖4B,6和7)。使用感光細胞特異性視紫紅激酶啟動子(RK)，感光細胞中的轉殖基因表現以AAV2 R585/R588突變體載體顯著增加(圖8)。這些基於AAV2衣殼上的鹼性胺基酸殘基中的突變的載體會高度有益於外視網膜特別是感光細胞的轉導，用於治療多種視網膜病症。
實施例3：紋狀體內AAV2HBKO載體遞送後普遍的GFP表現
經由定位突變引入至AAV2衣殼，生成不能結合肝素的AAV2 HBKO突變體載體。此HBKO載體的轉導概貌在野生型小鼠和HD小鼠模型(YAC128)兩者中使用單一紋狀體內注射評價。
方法 AAV2精胺酸突變體質體的構建
使用Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis套組(Agilent Technologies)突變AAV2 rep/cap質體pIM45BD。設計PCR突變引物以在殘基585和588引入精胺酸至丙胺酸的變化。通過測序證實陽性突變體。
AAV載體的產生
藉由人胚腎癌瘤293細胞(HEK-293)的三重轉染(使用磷酸鈣)產生重組AAV載體，如先前所述(Xiao等(1998)J.Virol.72：2224-2232)。簡單地，使用含有來自血清型2的rep基因和來自血清型1或2的衣殼基因的質體連同輔助腺病毒質體(Stratagene,Palo Alto,CA)。轉殖基因處於雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子的控制下。轉染後72小時收集病毒並如先前所述進行柱純化(Xiao等(1998)J.Virol.72：2224-2232)。
動物
使用由動物保護和利用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的規程在Genzyme(建新)，賽諾菲公司(Sanofi Company)(衛生和人類服務部(Department of Health and Human Services),NIH Publication 86-23)進行所有步驟。使用的小鼠包括YAC128小鼠(在純FVB/NJ背景上攜帶全長人突變體HTT轉殖基因及128 CAG重複的酵母人工染色體)和野生型FVB/NJ同窩小鼠(Slow等(2003)Hum.Mol.Genet.12：1555-1567；Van Raamsdonk等(2005)Hum.Mol.Genet.14：3823-3835)。YAC128小鼠和FVB/NJ同窩小鼠兩者從位於查理斯河實驗室(Charles River Laboratories)的Genzyme群落獲得。小鼠維持在12h光/暗循環，食物和水隨意可得。所述行為測試在動物的光循環期間(在8am-4pm的時間)進行。所有實驗的N-值示於下表2和3中。
Figure 104114126-A0202-12-0171-3
Figure 104114126-A0202-12-0171-4
手術步驟
將動物用3%異氟醚麻醉並置於立體定位架。顱內注射如先前所述進行(Stanek等(2014)Hum.Gene Ther.25：461-474)。 簡單地，使用10μl Hamilton注射器以0.5μl/min的速率將3微升的重組病毒載體注入紋狀體(AP,+0.50；ML,±2.00；DV,-2.5從前囟和硬腦膜；門牙棒(incisor bar),0.0)。完成輸注後將針在原處保留1分鐘。手術前一小時和手術後24小時，對該小鼠經皮下施用酮洛芬(ketoprofen)(5mg/kg)用於止痛。
動物灌注和組織收集
用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)通過心臟灌注小鼠以除去所有血 液。對於實驗1，將腦沿冠狀面切割，後固定於4%多聚甲醛，然後是30%蔗糖。使用低溫恒溫器切割20-μm冠狀切片。對於實驗2，沿中線矢狀切割腦，並將左半球進行後固定於4%多聚甲醛然後是30%蔗糖，然後使用低溫恒溫器切片成20-μm切片。使用小鼠腦模具(matrix)(Harvard Apparatus,Holliston,MA)將右半球(用於生化測定法)沿冠狀軸線切割，並使用3mm的活檢穿孔器解剖紋狀體和皮質區。然後將腦組織在液氮中速凍並儲存在-80℃直至使用。
定量即時PCR(TaqMan)
藉由定量即時RT-PCR測量RNA水平。紋狀體穿孔物用於所有RT-PCR分析。使用QIAGEN RNeasy Mini套組提取總RNA，然後根據製造商的說明使用TaqMan®One-Step RT-PCR Master Mix套組(Applied Biosystems)反轉錄和擴增。進行TaqMan定量RT-PCR反應並在ABIPRISM® 7500即時PCR系統(Applied Biosystems)上進行分析。HTT mRNA的表現水平進行歸一化到次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶1(HPRT1)mRNA水平。使用小鼠腦cDNA的5倍連續稀釋物生成標準曲線。每個樣品一式兩份運行。通過使用標準曲線或△△CT方法並歸一化到HPRT1 mRNA水平來確定相對基因表現。對於人HTTHTT的檢測，使用如下引物：5’CTCCGTCCGGTAGACATGCT 3’和5’CCATTTTGAGGGTTCTGATTTCC 3’。對於小鼠HTTHTT的檢測，使用如下引物：5’TGCTACACCTGACAGCGAGTCT 3’和5’ATCCCTTGCGGATCCTATCA 3’。
Western印跡
通過Western印跡分析測量蛋白質水平。皮質穿孔物用於所有Western印跡分析。將組織(以T-Per裂解緩衝液(Pierce)中的50mg/ml的終濃度並含有完全蛋白酶抑制劑混合物(Roche))勻漿。將勻漿物通過在4℃以10,000×g離心6分鐘澄清。通過使用BSA測定法(Pierce)測量蛋白質濃度。將二十至三十微克的勻漿物在3-8% Novex Tris-醋酸凝膠上解析和然後轉移至硝酸纖維素膜。將膜用小鼠抗亨廷頓蛋白單選殖抗體(Mab2166；1：2,000稀釋，Millipore)和兔多選殖抗β-微管蛋白抗體(1：750稀釋，Santa Cruz Biotechnology)探測。然後將膜與紅外第二抗體(1：20,000稀釋，Rockland)溫育，並使用Odyssey(LI-COR Biosciences)通過定量螢光使所述蛋白質視覺化。為了控制載入量差異，將Htt蛋白質標準化到β微管蛋白並表示為未處理的或鹽水處理的動物的百分比。分子量標記物用於驗證蛋白質的身份。
免疫組織化學
將冷凍腦切片用兔抗GFAP抗體染色以染色星形膠質細胞(1：2,500；DAKO,Glostrup,Germany)或用抗Iba1抗體染色以使小膠質細胞(1：500；WAKO Chemicals USA,Richmond,VA)視覺化。所用的次級抗體是接合有FITC或Cy3的驢抗物種特異性抗體。使用Nikon Eclipse E800螢光顯微鏡(Nikon,Melville,NY)使切片視覺化。
統計學
將平均值用於統計學分析。資料表示為平均值±SEM。對於使用兩組的研究，將Student t-檢驗用於統計學比較。對於超過兩個組的比較，使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，然後是Tukey多重比較事後(post-hoc)檢驗(Prism GraphPad)。將p<0.05看作統計學上顯著的差異。
結果
如上所述，在實驗1中將AAV2-eGFP和AAV2HBKO-GFP載體注入野生型小鼠(表2)。注射後30天處死所有動物。螢光顯微術揭示AAV2和AAV2HBKO載體兩者驅動GFP轉殖基因在轉導的神經元中的表現(圖9A&9B)。對於AAV2，GFP表現受限於注射路徑(track)，具有最小的超過注射位點的擴展(圖9B)。然而，當與傳統AAV2相比時，AAV2HBKO驅動更穩固而廣泛的GFP表現，具有在遠超注射位點觀察到的表現(圖9A)。這些結果證明使用AAV2HBKO載體遞送至CNS的轉殖基因的穩固而普遍的表現。
實施例4：在紋狀體內注射入YAC128小鼠腦後比較AAV2HBKO-和AAV1-介導的GFP表現
如上所述，在實驗2中將AAV2HBKO和AAV1血清型載體注入YAC128小鼠(表3)。這些載體驅動靶向人HTT和GFP報告蛋白的人工miRNA的表現。AAV1和AAV2HBKO載體 兩者在注射入紋狀體後30天顯示穩固的GFP分佈(圖10A&10B)。然而，GFP表現的圖樣在兩種載體血清型之間似乎明顯不同。GFP的AAV1表現(圖10A)比AAV2HBKO GFP表現(圖10B)更雜湊(patchy)且較不均一。載體轉導在AAV2HBKO腦中看起來僅是神經元的，相比於AAV1血清型其轉導神經元和神經膠質細胞兩者，主要是星形膠質細胞。這些結果證明當與傳統AAV1相比時AAV2HBKO顯示非常不同的表現和轉導概貌。
實施例5：AAV2HBKO-miRNA-Htt注射入YAC128小鼠導致HTT mRNA的減少
接下來，評估AAV1和AAV2HBKO載體血清型在YAC128小鼠紋狀體表現使HTT表現沉默的miRNA的能力。成年YAC128小鼠接受雙側紋狀體內注射AAV2/1-miRNA-Htt或AAV2HBKO-miRNA-Htt，並在處理後30天分析腦。在用AAV2/1-miRNA-Htt和AAV2HBKO-miRNA-Htt注射的小鼠中突變體人HTT mRNA的紋狀體水平與未處理的對照相比顯著降低(圖11A)。皮質腦穿孔物的Western印跡分析顯示兩個治療組中趨向Htt降低的趨勢；然而，未處理的對照樣品中的變異性使得資料未到達統計學顯著性(圖11B)。這些結果證明使用AAV1和AAV2HBKO載體通過RNAi進行基因敲低的功效。
實施例6：AAV2HBKO-miRNAHtt注射入YAC128小鼠不引起 神經炎症
為確定是否AAV的注射賦予神經炎症，在處理後30天檢查了神經炎性標誌物膠質纖維酸性蛋白質(GFAP，星形膠質細胞的標記物)和Iba1(小膠質細胞的標誌物)的水平。在AAV2HKO處理後與未處理的腦相比，未觀察到Iba1水平的顯著增加(參考圖12A和12B)。然而AAV2/1處理確實導致Iba1水平在注射位點的增加(圖12C)，這先前已觀察。在注射後30天任何處理的腦中與未處理的對照相比未觀察到GFAP水平的顯著增加(圖13A-13C)。這些結果指示，當與AAV1血清型相比，AAV2HBKO能夠驅動與定向於人HTT的miRNA的表現並在缺乏小膠質細胞活化的情況下生成HTT還原(reduction)。
結論
當前AAV載體血清型在單一位元點施用後顯示腦中有限的分佈(例如，Christine,C.W.等(2009)Neurology 73：1662-1669；Mandel,R.J.(2010)Curr.Opin.Mol.Ther.12：240-247)。如在本文中詳細討論的，本發明人已發現與在細胞表面的硫酸乙醯肝素蛋白聚糖(HSPG)結合降低的AAV載體的施用增強了CNS中的AAV轉導。這些結果證明具有修飾的HSPG結合的AAV用於CNS基因治療的用途，其中廣泛的載體分佈是所欲的。而且，本發明人還發現HSPG結合降低的AAV2載體呈現理想的安全概貌(因為它們僅靶向神經元)，同時實現普遍而穩固的轉導效率。因此所述載體可用於需要來自(腦)實質內遞送的普遍的神經元轉導的CNS適應症。
實施例7：AAVrh8R和AAVrh8R突變體載體的體外和視網膜下轉導 方法 AAVrh8R精胺酸修飾的質體的構建
使用Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis套組(Agilent Technologies)突變AAVrh8R rep/cap質體。設計PCR誘變引物以引入丙胺酸586至精胺酸(AAVrh8R-A586R)或精胺酸533至丙胺酸(AAVrh8R-R533A)的變化。通過測序證實陽性突變體。
rAAV載體的生成
使用pAAVrh8R、pAAVrh8R-A586R或pAAVrh8R-R533A rep/cap質體和pAdHelper通過293細胞的三重轉染產生表現增強的綠色螢光蛋白(EGFP)或可溶的VEGF受體雜合體(sFLT02)的重組AAV載體。轉殖基因處於雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子的控制下。
體外轉導測定法
將HeLa、HeLaRC32或NS1細胞鋪板入24孔板(1-2 x105個細胞/孔)。鋪板後24小時，以1 x 104vg/細胞-1 x 105vg/細胞(+)Ad5ts149感染細胞。感染後48小時通過EGFP螢光或通過ELISA以定量培養基中的sFLT02(通過R&D Systems的人可溶性VEGF R1 ELISA)來測量轉導效率。
動物
購買由Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)獲得的成年C57BL/6小鼠並維持在動物飼養室中。在研究期間給予所述動物自由接觸食物和水。所有步驟在由動物保護和利用委員會批准的規程下進行。
視網膜下注射
局部施用托吡卡胺(Alcon,Fort Worth,TX)誘導瞳孔散大和睫狀肌麻痹。使用經由鼻錐遞送至動物的800mL/分鐘的氧氣中運載的3.5%異氟醚誘導並保持麻木。使用環頭鉗(World Precision Instruments,Sarasota,FL)固定眼，且使用30Gauge針頭將試點切口置於(角膜)緣的大約2mm下的鞏膜上。通過切口導入33Gauge鈍尖針頭並向後進針直到尖端穿透後視網膜神經上皮層。將一微升的測試物品在1秒遞送。將針頭保持在原位約五秒然後抽出。允許動物從麻醉恢復然後回到它的籠。
視網膜裂解物中sFLT02的定量
使用R&D Systems的人可溶性VEGF R1 ELISA套組測量小鼠視網膜裂解物中的sFLT02。
結果
為了研究衣殼表面精胺酸殘基在視網膜的AAVrh8轉導中的作用，生成具有衣殼蛋白的AAVrh8載體，所述衣殼蛋白在對應於涉及HSPG結合的AAV2精胺酸的殘基中攜帶突變。圖 14比較了對於AAV2與HSPG的結合關鍵的五個衣殼殘基與AAVrh8R中的回應殘基。如圖15中所示，構建兩個AAVrh8R突變體，每個在這些殘基攜帶胺基酸取代：A586R和R533A(編號基於VP1胺基酸序列)。
為了評估將精胺酸殘基添加至AAVrh8R衣殼對於體外轉導的作用，以AAVrh8R-sFLT02或在位置A586添加有精胺酸(AAVrh8R A586R)的修飾的AAVrh8R-A586R-sFLT02載體感染HeLa細胞，均以1 x 104DRP/細胞進行。感染後48小時，藉由測量細胞培養基中的sFLT02而評估轉導效率。AAVrh8R-A586R呈現與未修飾的AAVrh8R相比幾倍高的轉導(圖16A)。
為了評價去除衣殼精胺酸對體外轉導的作用，以AAVrh8R或AAVrh8R-R533A載體(均以1 x 104DRP/細胞)感染HeLaRC32細胞。當與AAVrh8R相比時，AAVrh8R-R533A具有顯著降低的轉導(圖16B)。
使用EGFP表現作為轉導效率的量度進行類似的實驗。AAVrh8R-A586R-EGFP與AAVrh8R相比呈現基本上改進的NS1細胞的轉導(將圖17B與圖17A相比)。反之，AAVrh8R-R533A-EGFP載體與AAVrh8R相比對於HeLa細胞具有降低的轉導(將圖17D與圖17C相比)。
這些實驗共同表明將精胺酸添加至AAVrh8R衣殼改進AAVrh8R體外轉導，而從AAVrh8R衣殼去除精胺酸則削弱體外轉導。這些結果證明AAVrh8R的體外轉導被衣殼上的精胺酸殘基強烈地影響。
為了確定精胺酸對於AAVrh8R視網膜下轉導的作用，以1 x 108DRP的由CBA啟動子表現sFLT02的AAVrh8R、AAVrh8R-A586R或AAVrh8R-R533A注射C57Bl6小鼠。載體施用後30天將小鼠處死，並在視網膜裂解物中測量sFLT02。
與AAVrh8R相比，小鼠視網膜的AAVrh8R-A586R轉導大幅降低，而且實際上與AAV2相當，其在此相同的位置R585也具有精胺酸(圖18A)。與AAVrh8R相比，小鼠視網膜的AAVrh8R-R533A轉導得到改進(圖18B)。
這些資料凸顯衣殼精胺酸對於AAVrh8R的視網膜下轉導的影響並表明通過從AAVrh8R衣殼去除精胺酸改進了視網膜下轉導。這些結果證明AAVrh8R的視網膜下轉導被衣殼上的精胺酸殘基強烈的影響。
實施例8：通過在位置586添加精胺酸改進AAVrh8R的玻璃體內轉導 方法 玻璃體內注射
使用經由鼻錐遞送至動物的800mL/分鐘的氧氣中運載的3.5%異氟醚誘導並保持麻木。使用裝配有33Gauge斜式針頭的Hamilton注射器(Hamilton Co.,Reno,NV)將一微升的測試物品注入玻璃狀液。引導針頭在(角膜)緣(limbus)的大約2mm下通過鞏膜並小心地前進至玻璃體腔以避免接觸晶狀體。將測試物品在1-2秒的時間遞送。注射後，將針頭保持在原位約五 秒然後抽出。允許動物從麻醉恢復然後回到它的籠。
視網膜裂解物中sFLT02的定量
使用R&D Systems的人可溶性VEGF R1 ELISA套組測量小鼠視網膜裂解物中的sFLT02。
結果
為了評價將精胺酸添加至AAV衣殼對於玻璃體內轉導的作用，用1 x 109DRP的AAV2、AAVrh8R或AAVrh8R-A586R注射C57Bl6小鼠，各自攜帶由CBA啟動子表現sFLT02的構築體。載體施用30天后將小鼠處死，並在視網膜裂解物中測量sFLT02。與AAVrh8R相比，小鼠視網膜的AAVrh8R-A586R轉導得到改進，而且實際上與AAV2相當，其在此相同的位置R585也具有精胺酸(圖19)。此資料指示可藉由將精胺酸添加至AAV衣殼而改進視網膜的玻璃體內轉導。基於這些結果和AAV衣殼中的序列同源性(圖20)，由攜帶AAV1、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10衣殼的AAV顆粒的視網膜的玻璃體內轉導可類似地改善視網膜轉導。
序列
所有多肽序列以N-末端至C-末端提供，除非另外指出。所有核酸序列以5’至3’提供，除非另外指出。
AAV2 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0182-5
Figure 104114126-A0202-12-0182-6
(SEQ ID NO：1)
AAV2 VP1 HBKO胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0182-7
Figure 104114126-A0202-12-0183-8
Figure 104114126-A0202-12-0183-9
(SEQ ID NO：2)
AAV2 VP2胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0183-10
Figure 104114126-A0202-12-0183-11
(SEQ ID NO：3)
AAV2 VP2 HBKO胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0184-12
Figure 104114126-A0202-12-0184-13
(SEQ ID NO：4)
AAV2 VP3胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0184-14
Figure 104114126-A0202-12-0185-15
Figure 104114126-A0202-12-0185-16
(SEQ ID NO：5)
AAV2 VP3 HBKO胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0185-17
Figure 104114126-A0202-12-0185-18
(SEQ ID NO：6)
AAV3 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0185-19
Figure 104114126-A0202-12-0186-20
Figure 104114126-A0202-12-0186-21
(SEQ ID NO：7)
scAAV載體的突變的ITR
Figure 104114126-A0202-12-0186-22
Figure 104114126-A0202-12-0186-24
(SEQ ID NO：8)
AAVrh8R VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0186-25
Figure 104114126-A0202-12-0187-26
Figure 104114126-A0202-12-0187-27
(SEQ ID NO：9)
AAVrh8R A586R突變體VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0187-29
Figure 104114126-A0202-12-0187-30
(SEQ ID NO：10)
AAVrh8R R533A突變體VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0188-31
Figure 104114126-A0202-12-0188-32
(SEQ ID NO：11)
AAV1 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0188-33
Figure 104114126-A0202-12-0189-34
Figure 104114126-A0202-12-0189-35
(SEQ ID NO：12)
AAV6 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0189-36
Figure 104114126-A0202-12-0189-37
(SEQ ID NO：13)
AAV8 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0190-38
Figure 104114126-A0202-12-0190-39
(SEQ ID NO：14)
AAV9 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0190-40
Figure 104114126-A0202-12-0191-41
Figure 104114126-A0202-12-0191-42
(SEQ ID NO：15)
AAVrh10 VP1胺基酸序列
Figure 104114126-A0202-12-0191-43
Figure 104114126-A0202-12-0191-44
(SEQ ID NO：16)
<110> 建臻公司(Genzyme Corporation) Scaria,Abraham Sullivan,Jennifer Stanek,Lisa M.
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<212> PRT
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Figure 104114126-A0202-12-0196-49
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<212> PRT
<213> 腺伴隨病毒
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Figure 104114126-A0202-12-0197-51
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成的構築體
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Figure 104114126-A0202-12-0198-53
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<212> PRT
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Figure 104114126-A0202-12-0199-55
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<400> 9
Figure 104114126-A0202-12-0202-62
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Figure 104114126-A0202-12-0204-64
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 104114126-A0202-12-0204-66
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<212> PRT
<213> 人工序列
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Figure 104114126-A0202-12-0205-70
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Figure 104114126-A0202-12-0207-72
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<213> 腺伴隨病毒
<400> 12
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Figure 104114126-A0202-12-0208-75
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<212> PRT
<213> 腺伴隨病毒
<400> 13
Figure 104114126-A0202-12-0208-77
Figure 104114126-A0202-12-0209-78
Figure 104114126-A0202-12-0210-79
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<212> PRT
<213> 腺伴隨病毒
<400> 14
Figure 104114126-A0202-12-0210-80
Figure 104114126-A0202-12-0211-81
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<212> PRT
<213> 腺伴隨病毒
<400> 15
Figure 104114126-A0202-12-0211-82
Figure 104114126-A0202-12-0212-83
Figure 104114126-A0202-12-0213-84
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<212> PRT
<213> 腺伴隨病毒
<400> 16
Figure 104114126-A0202-12-0213-85
Figure 104114126-A0202-12-0214-86

Claims (27)

  1. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造將異源核酸遞送至個體的眼部的藥劑，其中該藥劑經配製用於將該重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至個體的視網膜下，其中該rAAV顆粒包含：a)rAAV衣殼，其包含含有一個或多個胺基酸取代之rAAV衣殼蛋白，該胺基酸取代係在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
  2. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造藥劑，該藥劑具有與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比在將該rAAV顆粒經視網膜下遞送至個體的眼部後改進之細胞的rAAV轉導或改進之異源的核酸表現，其中該方法包括在AAV衣殼蛋白中併入一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代係在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，其中該rAAV顆粒包含rAAV衣殼蛋白和rAAV載體，該rAAV載體包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。
  3. 一種包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之組成物，其用於製造在個體中治療眼部病症的方法之藥劑，其中該藥劑經配製用於將該組成物遞送至該個體的視網膜，其中該rAAV顆粒包含a)rAAV衣殼，其包含含有一個或多個胺基酸取代之rAAV衣殼蛋白，該胺基酸取代係在對應於胺基酸484、487、527、532、585 或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。
  4. 一種用於將載體視網膜下遞送至個體的眼的系統，其包含a)組成物，其包含有效量的rAAV顆粒，其中i)該rAAV顆粒包含rAAV衣殼，該rAAV衣殼包含含有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼蛋白，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和ii)該載體包含異源核酸，該異源核酸編碼治療性多肽或治療性RNA和至少一個AAV末端重複；和b)用於視網膜下遞送rAAV的裝置。
  5. 一種用於製造治療眼部病症的藥劑之套組，包含a)包含rAAV顆粒之組成物，其中該rAAV顆粒包含i)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和ii)rAAV載體，其包含用於治療眼部病症的異源核酸和至少一個AAV反向末端重複；和b)適於視網膜下施用的藥物賦形劑。
  6. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)的的藥劑，其中該藥劑經配製用於將該重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用於該個體的CNS，其中所述rAAV顆粒包含a)rAAV衣殼，其包含rAAV衣殼蛋白，所述rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含該異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
  7. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造藥劑，該藥劑用於與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比改進在個體的中樞神經系統(CNS)中細胞的rAAV轉導或改進異源的核酸表現，其中該藥劑經配製用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒施用至該個體的CNS，其中該rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
  8. 一種包含重組腺相關病毒(rAAV)顆粒之組成物，其用於製造治療個體的中樞神經系統(CNS)病症之藥劑，其中該藥劑經配製用 於將有效量的該組成物施用至該個體的CNS，其中該rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。
  9. 一種用於製造將異源核酸遞送至個體的中樞神經系統(CNS)或用於治療個體CNS病症的藥劑之套組，其包含含有重組腺相關病毒(rAAV)顆粒的組成物，其中該rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
  10. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造治療個體中的亨廷頓氏病或帕金森氏病之藥劑，其中該rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一或多個胺基酸取代包含用疏水性胺基酸殘基取代帶正電的胺基酸殘基，和 b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複，其中該rAAV顆粒經配製用於遞送至紋狀體及/或經配製用於單一位點遞送。
  11. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該一或多個胺基酸取代包含用丙胺酸殘基取代精胺酸或賴胺酸殘基。
  12. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該rAAV顆粒包含AAV血清型2(AAV2)衣殼。
  13. 如請求項12使用的rAAV顆粒、使用的組成物、系統或套組，其中該一個或多個胺基酸取代包含R484A和R487A取代或R585A和R588A取代或K532A取代，編號基於AAV2的VP1。
  14. 如請求項13使用的rAAV顆粒、使用的組成物、系統或套組，其中該rAAV顆粒包含一個或多個rAAV衣殼蛋白，該衣殼蛋白與SEQ ID NOs：2、4和/或6具有至少大約90%，至少大約91%，至少大約92%，至少大約93%，至少大約94%，至少大約95%，至少大約96%，至少大約97%，至少大約98%，至少大約99%，或100%序列同一性。
  15. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼。
  16. 如請求項15使用的rAAV顆粒、使用的組成物、系統或套組，其中一個胺基酸取代包含R533A取代，編號基於AAVrh8R的 VP1。
  17. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：抗氧化劑、神經營養因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子，任選地其中該異源核酸編碼選自下列組成群組的多肽：Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL-X、NFκB、內皮他汀(Endostatin)、血管他汀(Angiostatin)、sFlt、sPDGF-R、IL10、抗-IL17、sIL17R、IL1-ra、抗-TGFβ、sTNF-R I、sTNF-R II和IL4。
  18. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該異源核酸編碼治療性核酸，任選地其中該治療性核酸是siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、反義RNA、核酶或DNA酶。
  19. 如請求項1-2及6-7中任一項使用的rAAV顆粒、如請求項3或8使用的組成物、如請求項4的系統或如請求項5或9的套組，其中該rAAV載體是自身-互補的rAAV載體。
  20. 一種rAAV顆粒，其包含AAVrh8R衣殼蛋白、AAV3衣殼蛋白、AAV1衣殼蛋白、AAV6衣殼蛋白、AAV8衣殼蛋白、AAV9衣殼蛋白或AAVrh10衣殼蛋白，其中衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸484、487、527、532、585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號。
  21. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造將異源核酸遞送至個體的視網膜的藥劑，其中該藥劑經配製用於將重組腺相關病毒(rAAV)顆粒經玻璃體內施用於該個體，其中所述rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV反向末端重複。
  22. 一種重組腺相關病毒(rAAV)顆粒，其用於製造藥劑，該藥劑用於與用包含野生型衣殼的rAAV轉導細胞相比改進在將該rAAV顆粒經玻璃體內遞送至個體的眼部後細胞的rAAV轉導或改進異源核酸的表現，其中該方法包括將一個或多個胺基酸取代併入AAV衣殼蛋白中，該胺基酸取代在對應於胺基酸585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基；其中該rAAV顆粒包含該rAAV衣殼蛋白和含有異源核酸和至少一個AAV末端重複的rAAV載體。
  23. 一種包含rAAV顆粒之組成物，其用於製造治療個體中眼部病症的藥劑，其中該藥劑經配製用於將該組成物經玻璃體內遞送至該個體的視網膜，其中該rAAV顆粒包含a)包含rAAV衣殼蛋白之rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸585或588 的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基，和b)rAAV載體，其包含異源核酸和至少一個AAV末端重複。
  24. 一種用於將載體經玻璃體內遞送至個體眼部的系統，其包含a)組成物，其包含有效量的rAAV顆粒，其中i)該rAAV顆粒包含rAAV衣殼，該rAAV衣殼包含含有一個或多個胺基酸取代的rAAV衣殼蛋白，該胺基酸取代在對應於胺基酸585或588的一個或多個位置，其中該一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基，和ii)該載體包含異源核酸，該異源核酸編碼治療性多肽或治療性RNA和至少一個AAV末端重複；和b)用於玻璃體內遞送所述rAAV的裝置。
  25. 一種用於製造治療眼部病症的藥劑之套組，其包含a)包含rAAV顆粒的組成物，其中眼病症rAAV顆粒包含i)包含rAAV衣殼蛋白的rAAV衣殼，該rAAV衣殼蛋白包含一個或多個胺基酸取代，該胺基酸取代在對應於胺基酸585或588的一個或多個位置，編號基於AAV2的VP1編號，其中該一個或多個胺基酸取代包含用精胺酸或賴胺酸殘基取代丙胺酸、絲胺酸、穀胺醯胺或蘇胺酸殘基，和ii)rAAV載體，其包含用於治療眼部病症的異源核酸和至少一個AAV反向末端重複；和 b)適於玻璃體內施用的藥物賦形劑。
  26. 如請求項21或22使用的rAAV顆粒、如請求項23使用的組成物、如請求項24的系統或如請求項25的套組，其中該rAAV顆粒包含AAV血清型rh8R(AAVrh8R)衣殼。
  27. 如請求項26使用的rAAV顆粒、使用的組成物、系統或套組，其中：(i)該一個或多個胺基酸取代包含A586R或A586K取代，編號基於AAVrh8R的VP1；及/或(ii)該一個或多個胺基酸取代包含T589R或T589K取代，編號基於AAVrh8R的VP1。
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