JP2020164540A - 網膜およびｃｎｓ遺伝子治療用ａａｖベクター - Google Patents

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Abstract

【課題】個体の眼に異種核酸を送達する際に使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の提供。【解決手段】組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子は、個体の眼に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を硝子体投与するために製剤化され、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／またはＴ５８９のアルギニンまたはリシンによるアミノ酸置換を含むＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含む、ｒＡＡＶカプシド、およびｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年５月２日に出願した米国特許仮出願第６１／９８８，１３１号および２０１５年２月１０日に出願した米国特許仮出願第６２／１１４，５７５号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている：コンピュータ読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１５９７９２０１０４４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、データ記録日：２０１５年４月２９日、サイズ：８５ＫＢ）。
本発明は、眼およびＣＮＳへの送達向上のための；例えば、網膜遺伝子治療向上およびＣＮＳ遺伝子療法向上のための、変異型組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターに関する。
網膜変性疾患は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子治療の有望な的である。ＡＡＶベクターは、網膜における長期遺伝子発現を媒介することができ、惹起しうる免疫応答が極小であるため、これらのベクターは眼への遺伝子送達の魅力的な選択肢となっている。網膜は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞および網膜神経節細胞をはじめとする様々な細胞タイプで構成されている、眼球の後ろ側にある光を感知する組織である。ＡＡＶ遺伝子治療ベクターの標的細胞タイプおよびベクター送達経路は、疾患の兆候に依存することになる。例えば、加齢性黄斑変性の第Ｉ相治験では、網膜神経節細胞への形質導入を実現するためにベクターの硝子体内送達が利用されており、網膜色素変性の１形態であるレーバー先天黒内障２型を有する患者の処置の最近の治験では、網膜色素性上皮細胞への形質導入にＲＰＥ６５遺伝子の網膜下送達が用いられている。
Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｍ．Ｇ．ら（２００７）Ｌａｎｃｅｔ ３６９：２０９７〜２１０５頁 Ｅｂｅｒｌｉｎｇ，Ｊ．Ｌ．ら（２００８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７０：１９８０〜１９８３頁 Ｆｉａｎｄａｃａ，Ｍ．Ｓ．ら（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ．４７ 補遺２：Ｔ２７〜３５頁
そのような有用性にかんがみて、眼へのＡＡＶ送達を向上させるための新規薬剤および方法を開発する必要がある。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターは、神経遺伝子治療に好まれるベクター系にもなってきており、優れた安定性が複数の治験で記録されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。しかし、神経障害の有効な処置は、罹患細胞集団へのＡＡＶベクターの送達に関連する問題によって大きく妨げられてきた。この送達の問題点は
、中枢神経系（ＣＮＳ）が関わる障害について特に問題になっている。したがって、ＣＮＳへのＡＡＶ送達を向上させることがさらに必要である。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼に異種核酸を送達する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体の網膜下に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を増加させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を、例えば、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む参照ｒＡＡＶカプシドと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、眼の細胞は、網膜細胞、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、Ｒ５３２位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。さらなる実施形態において、１つま
たはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６および／もしくは５８９位におけるものであり；ならびに／またはｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０、５３５、５８８および／もしくは５９１位におけるものである
。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする：Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、クラリン、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩ、およびＩＬ４。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドもしくは治療用核酸をコードする異種核酸を含み、前記異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および個体の網膜への異種核酸の送達のための異種核酸を含む。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択される眼障害を処置するために使用される：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。
他の態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の異種核酸発現を向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−
２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、異種核
酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする：Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、クラリン、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩ、およびＩＬ４。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドもしくは治療用核酸をコードする異種核酸を含み、前記異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。
いくつかの実施形態において、形質導入が向上されたおよび／または異種核酸の発現が向上されたｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および個体の網膜への異種核酸の送達のための異種核酸を含む。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択される眼障害を処置するために使用される：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。
いくつかの態様において、本発明は、個体（例えばヒト）の眼障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の個体の網膜への送達を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低
減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基に
よる置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ｒＡＡＶ粒子の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクター、およびＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする：Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、クラリン、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩ、およびＩＬ４。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ｒＡＡＶ粒子の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクター、およびＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシドを含み、前記異種核酸配列は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、１つまたはそれ
以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ｒＡＡＶ粒子の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクター、およびＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシドを含み、前記眼障害は、次のものからなる群から選択される：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の網膜下送達を含み、前記ｒＡＡＶ粒子は、個体（例えばヒト）の眼障害の処置に使用される異種核酸をコードするｒＡＡＶベクター、およびＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の組成物は、個体の視覚機能の処置に有効である。いくつかの実施形態において、視覚機能は、微小視野測定、暗順応視野測定、視覚の動きの評価、視力、ＥＲＧ、または読字評価によって評価される。いくつかの実施形態において、前記方法は、個体の視覚機能の向上をもたらす。いくつかの実施形態において、前記方法は、眼障害の進行に起因するヒトの視覚機能低下の進行の予防または減速をもたらす。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのベクターの網膜下送達のためのシステムであって、ａ）有効量のｒＡＡＶ粒子を含む組成物［ここで、ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ｉｉ）該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含む］；およびｂ）該ｒＡＡＶの網膜送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。いくつかの実施形態において、デバイスは、細径カニューレおよび注射器を含み、前記細径カニューレは、２７〜４５ゲージである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の組成物は、注射器内に収容されている。いくつかの実施形態において、カニューレは、注射器に取り付けられている。いくつかの実施形態において、組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである。
いくつかの実施形態において、システムのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧ結合を改変する（例えば、結合を低減または除去する）１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を増加させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を、例えば、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む参照ｒＡＡＶカプシドと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、眼の細胞は、網膜細胞、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。
いくつかの実施形態において、システムのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧ結合を改変する（例えば、結合を低減または除去する）１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
いくつかの実施形態において、システムのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧ結合を改変する（例えば、結合を低減または除去する）１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、
ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態において、システムのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧ結合を改変する（例えば、結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシド、および異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。さらなる実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする：Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、クラリン、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩ、およびＩＬ４。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。
いくつかの実施形態において、システムのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧ結合を改変する（
例えば、結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシド、および異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含み、前記異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。
いくつかの実施形態において、ＨＳＰＧ結合を改変する（例えば、結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を有するＡＡＶカプシド、および異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを含むシステムのｒＡＡＶ粒子は、個体の網膜への該異種核酸の送達に使用される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択される眼障害を処置するために使用される：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。
いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体のＣＮＳに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体のＣＮＳに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）における異種核酸の発現を向上させる方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体のＣＮＳに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つの
ＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。なおさらなる態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の有効量を該個体のＣＮＳに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される。いくつかの実施形態において、核酸の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす。いくつかの実施形態において、神経炎症は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照カプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、野生型ｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がないｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を増加させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼またはＣＮＳの細胞へのｒＡＡＶ粒子による形質導入効率を、例えば、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質を含む参照ｒＡＡＶカプシドと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、投与は、直接脊髄注射および／または脳内投与を含む。いくつかの実施形態において、脳内投与は、大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、脳を覆っている髄膜、硬膜、くも膜、脳軟膜、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）、小脳の深部小脳核、大脳の脳室系、くも膜下腔、線条体、皮質、中隔、視床、視床下部、および脳実質からなる群から選択される部位に対するものである。いくつかの実施形態において、投与は、少なくとも１つの大脳側脳室への側脳室内注
射である。いくつかの実施形態において、投与は、頸部、胸部および／または腰部におけるくも髄腔内注射である。いくつかの実施形態において、投与は、線条体内注射である。いくつかの実施形態において、投与は、視床内注射である。いくつかの実施形態において、投与は、実質内注射である。いくつかの実施形態において、投与は、直接脊髄注射、頭蓋内および／または脳内投与を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、単一部位に対して投与される。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態において、ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む。いくつかの実施形態において、カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである。いくつかの実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。いくつかの実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。いくつかの実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ニューロン上で発現される。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて発現される。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ３４７、Ｒ３５０、Ｋ３９０、Ｋ３９５、Ｒ４４８、Ｒ４５１、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なく
とも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ３４７Ａ、Ｒ３５０Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｒ４４８Ａ、Ｒ４５１Ａ、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｋ５２７Ａ、Ｋ５３２Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む。
１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰナンバリング１に基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳ関連遺伝子をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連障害を有する個体において欠乏または突然変異ポリペプチド、抗酸化物質、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子、α−シヌクレイン、酸性β−グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、β−ガラクトシダーゼ−１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２−
スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、偽アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン・ピックＣタンパク質（ＮＰＣ１）、酸性α−１，４−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼβサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ−α−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ）、ヘパリンアセチル−ＣｏＡ、α−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼαサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペンチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、カテプシンＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、またはα−ノイラミダーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、抗酸化物質、抗血管新生性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、およびアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、脳の細胞はニューロンである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基
対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、個体はヒトである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの障害を処置するために使用される治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統委縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、または脳の癌である。いくつかの実施形態において、障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、小児性バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的遅発型小児性バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性バッテン病（ＣＮＬ３）、ＣＮＬ４型バッテン、ＣＮＬ５型バッテン、ＣＮＬ６型バッテン、ＣＮＬ７型バッテン、ＣＮＬ８型バッテン、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシドシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス症、βマンノシドーシス症、マロトー・ラミー、異染性白質ジストロフィー症、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシス症ＩＩ／ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホッフ病、サンフィリポ病Ａ型、サンフィリポ病Ｂ型、サンフィリポＣ型、サンフィリポＤ型、シンドラー病、シンドラー・神崎、シアリドーシス、スライ病、テイ・サックス病、およびウォルマン病からなる群から選択されるリソソーム蓄積症である。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの障害は、ハンチントン病またはパーキンソン病である。
いくつかの態様において、本発明は、個体のハンチントン病を処置する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態において、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片は、機能性ハンチンチンポリペプチドまたはその機能性断片である。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、ハンチンチンに対するＲＮＡｉを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである。
いくつかの態様において、本発明は、個体のパーキンソン病を処置する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードす
る。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ＴＨ、ＧＴＰＣＩＩ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよび／もしくはＡＡＤＣ；またはその断片である。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ＡＡＤＣまたはその断片である。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照カプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、野生型ｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がないｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態において、カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである。いくつかの実施形態において、ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して投与される。いくつかの実施形態において、ポンプは、手動ポンプである。いくつかの実施形態において、ポンプは、浸透圧ポンプである。いくつかの実施形態において、ポンプは、注入ポンプである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ニューロン上で発現される。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて発現される。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される。
１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリ
ングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ３４７、Ｒ３５０、Ｋ３９０、Ｋ３９５、Ｒ４４８、Ｒ４５１、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ３４７Ａ、Ｒ３５０Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｒ４４８Ａ、Ｒ４５１Ａ、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｋ５２７Ａ、Ｋ５３２Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８または５３３位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８
ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、脳の細胞はニューロンである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの態様において、本発明は、上記態様のいずれかにおいて使用するためのキットであって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ
）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記キットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達するためのキットであって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記キットを提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するためのキットであって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）ＣＮＳ障害を処置するための異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記キットを提供する。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ＣＮＳ障害は、ハンチントン病である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態において、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片は、機能性ハンチンチンポリペプチドまたはその機能性断片である。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、ハンチンチンに対するＲＮＡｉを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＣＮＳ障害は、パーキンソン病である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ＴＨ、ＧＴＰＣＩＩ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよび／もしくはＡＡＤＣ；またはその断片である。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ＡＡＤＣまたはその断片である。
いくつかの態様において、本発明は、上記実施形態のいずれかにおいて使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のハンチントン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロ
テオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含み、線条体への送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含み、線条体への送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のハンチントン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含み、（例えば個体のＣＮＳへの）単一部位送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含み、（例えば個体のＣＮＳへの）単一部位送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、参照カプシドを含むｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、参照カプシドを含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、野生型ｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、参照ｒＡＡＶカプシドは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がないｒＡＡＶカプシドまたはカプシドタンパク質を含む
。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞上で発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ニューロン上で発現される。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて発現される。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される。
１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ３４７、Ｒ３５０、Ｋ３９０、Ｋ３９５、Ｒ４４８、Ｒ４５１、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ３４７Ａ、Ｒ３５０Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｒ４４８Ａ、Ｒ４５１Ａ、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｋ５２７Ａ、Ｋ５３２Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして、Ｒ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、１つアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、個体はヒトである。
上記態様および実施形態のいくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、組成物中のものである。いくつかの実施形態において、組成物は、緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、キットまたはｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子の組成物のＣＮＳへの送達のための説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットまたはｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ粒子の組成物の線条体への送達のための説明書をさらに含む。
いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６位における置換を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を増加させる方法であって、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を該カプシドタンパク質に導入することを含み、該１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングしてＡ５８６位における置換を含む。いくつかの実施形態において
、アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの態様において、本発明は、個体の網膜に異種核酸を送達する方法であって、該個体に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を硝子体内投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の硝子体内送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の硝子体内送達後の異種核酸発現を向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；前記ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の眼障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を個体の網膜に硝子体内送達することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのベクターの硝子体内送達のためのシステムであって、ａ）有効量のｒＡＡＶ粒子を含む組成物［ここで、ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ｉｉ）該ベクターは、治療量ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含む］；およびｂ）該ｒＡＡＶの硝子体内送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０血清型カプシドを含む。いくつかの態様において、本発明は、眼障害を処置するためのキットであって、ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物［ここで、該ｒＡＡＶ粒子は、ｉ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置にまたはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およ
びｉｉ）眼障害を処置するための異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む］；およびｂ）硝子体内投与に好適な医薬品賦形剤を含む、前記キットを提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ１カプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子の眼の細胞への形質導入効率を、野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ６カプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子の眼の細胞への形質導入効率を、野生型ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ８カプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子の眼の細胞への形質導入効率を、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ９カプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子の眼の細胞への形質導入効率を、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質は１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、該ｒＡＡＶ粒子の眼の細胞への形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して増加させる、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ３カプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。いくつかの実施形態において、形質導入効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加される。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子の
ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を増加させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、眼の細胞は、網膜細胞、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ１のＶＰ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ８のＶＰ１は、
配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／Ｔ５９１位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９のＶＰ１は、配列番号１５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／Ａ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９ＲまたはＡ５８９Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／Ａ５９１位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１ＲまたはＡ５９１Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ３カプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
さらなる実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする：Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、クラリン、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩ、およびＩＬ４。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは
ＤＮＡザイムである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減もしくは除去する）１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含み、前記異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択される眼障害を処置するために使用される：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、前記突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる。
特許出願および公報を含めて、本明細書に引用するすべての参考文献は、それら全体が参照によって組み入れられている。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合に関与するカプシド残基、およびＡＡＶ２ ＨＢＫＯ突然変異体を生じさせるために導入した突然変異を示す図である。ナンバリングは、ＶＰ１アミノ酸配列に基づく。 野生型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＣＢＡ−ｓＦＬＴ０２）と比較して、ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ ＣＢＡ−ｓＦＬＴ０２）で観察された培養中の２９３細胞への形質導入が減少したことを示す図である。ＣＢＡプロモーターを使用してＦｌｔの発現を駆動するベクターを有する野生型またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子を注射した４８時間後に培養培地中に存在する可溶性Ｆｌｔ（ｓＦＬＴ）の量を測定することによって形質導入をアッセイした。 野生型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＣＢＡ−ＧＦＰ）と比較して、ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ ＣＢＡ−ＧＦＰ）で観察された培養中の２９３およびヒーラ細胞への形質導入が減少したこと示す図である。ＣＢＡプロモーターを使用してＥＧＦＰの発現を駆動するベクターを有する野生型またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子を注射した４８時間後に行った細胞の蛍光イメージングによって形質導入をアッセイした。 図４Ａおよび４Ｂは、野生型ＡＡＶ２またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子の硝子体内注射（図４Ａ）または網膜下注射（図４Ｂ）時に観察された形質導入を示す図である。Ｆｌｔをコードするベクターの形質導入後の可溶性Ｆｌｔ（ｓＦＬＴ）の発現によって形質導入をアッセイした。注射したベクターゲノムの数を実験ごとに示す（１０８または１０９ｖｇ）。 ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子が硝子体内注射後にマウスの眼に形質導入できないことを示す図である。ＣＢＡプロモーターを使用してＥＧＦＰの発現を駆動するベクターを有する野生型（ＡＡＶ２ ＣＢＡ−ＧＦＰ）またはＨＢＫＯ突然変異型（ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ ＣＢＡ−ＧＦＰ）ＡＡＶ２粒子の硝子体内注射をマウスに施し、蛍光顕微鏡法によって切片をイメージングした。 ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＣＢＡ ＨＢＫＯ）が、網膜下注射後、野生型粒子（ＡＡＶ２ ＣＢＡ）と比較して形質導入の有意な増加をもたらすことを示す図である。ＣＢＡプロモーターを使用してＦｌｔの発現を駆動するベクターを有するＡＡＶ２粒子の注射後の可溶性Ｆｌｔ（ｓＦＬＴ）の発現によって形質導入をアッセイした。注射したベクターゲノムの数を示す（１０８または１０９ｖｇ）。 ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ ＣＢＡ−ＧＦＰ）が、網膜下注射後、野生型粒子（ＡＡＶ２ ＣＢＡ−ＧＦＰ）と比較して、（表示を付けた通り）光受容器細胞への形質導入の有意な増加をもたらすことを示す図である。ＣＢＡプロモーターを使用してＥＧＦＰの発現を駆動するベクターを有するＡＡＶ２粒子での形質導入後のＧＦＰ発現の蛍光画像によって形質導入を測定した。 ＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子（ＡＡＶ２ ＲＫ ＨＢＫＯ）が、網膜下注射後、野生型粒子（ＡＡＶ２ ＲＫ）と比較して光受容器への形質導入の有意な増加をもたらすことを示す図である。ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターを使用してＦｌｔの発現を駆動するベクターを有するＡＡＶ２粒子の注射後の可溶性Ｆｌｔ（ｓＦＬＴ）の発現によって形質導入をアッセイした。注射したベクターゲノムの数を示す（１０８または１０９ｖｇ）。 図９Ａおよび９Ｂは、野生型マウスにおいてＡＡＶ２−ＥＧＦＰ（図９Ｂ）と比較した、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ＥＧＦＰ（図９Ａ）の線条体内注射３０日後のマウス脳におけるＥＧＦＰ発現を示す図である。各パネルにおけるＥＧＦＰの発現をＣＢＡプロモーターによって駆動し、蛍光顕微鏡法を用いて可視化した。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＹＡＣ１２８ＨＤマウスにおいてＡＡＶ１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１０Ｂ）と比較した、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１０Ａ）の線条体内注射３０日後のマウス脳におけるＧＦＰ発現を示す図である。ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰベクターは、ヒトＨｔｔを標的にする人工ｍｉＲＮＡとＧＦＰレポーターとを発現する構築物を指す。各パネルにおけるＧＦＰの発現をＣＢＡプロモーターによって駆動し、蛍光顕微鏡法を用いて３つの異なる倍率（表示を付けた通り、４Ｘ、１０Ｘおよび２０Ｘ）で可視化した。 未処置対照と比較して、ＡＡＶ１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔおよびＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射３０日後の線条体マウス脳パンチ片におけるヒトＨＴＴ ｍＲＮＡレベルのｑＰＣＲ分析を示す図である。 未処置対照と比較して、ＡＡＶ１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔおよびＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔの注射３０日後の皮質マウス脳パンチ片におけるヒトＨｔｔタンパク質レベルのウエスタンブロット分析を示す図である。 図１２Ａ〜１２Ｃは、未処置対照（図１２Ａ）と比較した、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１２Ｂ）またはＡＡＶ１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１２Ｃ）の注射３０日後のＹＡＣ１２８マウス線条体におけるＩｂａ１の発現を示す図である。 図１３Ａ〜１３Ｃは、未処置対照（図１３Ａ）と比較した、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１３Ｂ）またはＡＡＶ１−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ−ＧＦＰ（図１３Ｃ）の注射３０日後のＹＡＣ１２８マウス線条体におけるＧＦＰの発現を示す図である。 ヘパラン硫酸プロテオグリカン結合に関与するカプシド残基をＡＡＶ２カプシドとＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド間で比較する図である。ナンバリングは、ＶＰ１アミノ酸配列に基づく。 ＡＡＶ２のヘパラン結合に関与している残基でのＡＡＶ２およびＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸アライメントを示す図である。ＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニンカプシド修飾の位置を丸で囲む。 図１６Ａは、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体によって示されたヒーラ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入向上を示す図である。ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニン修飾ベクターでの感染４８時間後の培養培地中のｓＦＬＴ０２によって形質導入モニターした。図１６Ｂは、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体によって示されたＨｅＬａＲＣ３２細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入減少を示す図である。ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニン修飾ベクターでの感染４８時間後の培養培地中のｓＦＬＴ０２によって形質導入モニターした。 図１７Ａ〜１７Ｄは、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６ＲおよびＲ５３３Ａ突然変異体によって示されたｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入レベルを示す図である。ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体（図１７Ｂ）は、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒ（図１７Ａ）と比較して、ＮＳ１細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入増加を示す。ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体（図１７Ｄ）は、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒ（図１７Ｃ）と比較して、ヒーラ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入減少を示す。ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニン修飾ベクターでの感染４８時間後の細胞におけるＥＧＦＰ発現によって形質導入モニターした。 図１８Ａおよび１８Ｂは、ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６ＲおよびＲ５３３Ａ突然変異体によって示されたＣ５７Ｂｌ６マウスにおける網膜下形質導入のレベルを示す図である。（図１８Ａ）ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異体は、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して網膜下形質導入減少を示す。ＡＡＶ２ベクターも試験した。（図１８Ｂ）ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ突然変異体は、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒおよびナイーブマウスと比較して網膜下形質導入増加を示す。ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニン修飾ベクターの網膜下投与３０日後にＣ５７Ｂｌ６マウスの網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２によって形質導入をモニターした。 ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒベクターの硝子体内注射３０日後のＣ５７Ｂｌ６マウスの網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２のレベルを示す図である。 ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０とＡＡＶ２のヘパラン結合に関与する残基でのアミノ酸アラインメントを示す図である。
本明細書に記載するように、本発明者は、驚くべきことに、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５および／または５８８に対応するｒＡＡＶ粒子の修飾が、対象の眼またはＣＮＳへの投与後の細胞への形質導入増加を明示することを発見した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合が低減もしくは除去された、またはカプシドの電荷が修飾さたので、該ｒＡＡＶ粒子の投与によって対象の眼もしくはＣＮＳの細胞への形質導入が増加される結果となると考えられる。したがって、本発明は、個体の眼またはＣＮＳに異種核酸を送達する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体の眼またはＣＮＳに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）
ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼に異種核酸を送達する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体の網膜下に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
ｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の異種核酸の発現を向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置に１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の異種核酸の発現を向上させる方法であって、ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することを含み；該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。形質導入の向上は、野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子に匹敵する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２カプシドのＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
いくつかの態様において、本発明は、個体の眼障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物の個体の網膜への送達を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
本発明はまた、個体の眼へのベクターの網膜下送達のためのシステムであって、ａ）ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物［ここで、ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ｉｉ）該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含む］；およびｂ）該ｒＡＡＶの網膜送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
いくつかの態様において、本発明は、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達する方法であって、該個体のＣＮＳに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含む前記方法をさらに提供する。ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。これらの方法は、個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達後、例えば野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して、細胞の異種核酸発現および／または細胞へのｒＡＡＶ形質導入の向上を示す。さらに、本発明の方法は、特定の細胞（例えば、ニューロン）を感染させることができ、その上、広範かつ強い形質導入効率をなお達成することができる。そのようなｒＡＡＶ粒子および方法は、ハンチントン病を含む（しかしこれに限定されない）ＣＮＳ障害の処置に好適である。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、ＨＳＰＧとの結合の低減または除去をもたらす。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２のＶＰ１（配列番号１）に基づいてナンバリングして、ｒＡＡＶ２のＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含むカプシドを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１（配列番号９）に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＡ５８６Ｒおよび／またはＲ５３３Ａ置換を含むカプシドを含む。
本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含むキットまたはｒＡＡＶ粒子を含有する組成物を含むキットであって、該ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを有する、前記キットも提供する。これらのキットは、個体の眼またはＣＮＳへの異種核酸の送達に有用であることはもちろん、個
体の眼またはＣＮＳ障害の処置（例えば、網膜症またはハンチントン病の処置）にも有用である。
Ｉ．一般技術
本明細書に記載するまたは本明細書中で参照する技術および手順は一般によく理解されており、当業者によって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第４版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ編、１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、第６版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、１９９３〜８頁）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら、２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、２０１１）のような従来の方法論を用いて一般に利用される。
ＩＩ．定義
「ベクター」は、本明細書で用いる場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのい
ずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で用いる場合、任意の長さの重合体形態のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖もしくは多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学もしくは生化学修飾、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む重合体を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの主鎖は、（ＲＮＡもしくはＤＮＡにおいて通常見いだされるように）糖およびリン酸エステル基を含むことがあり、または修飾もしくは置換されている糖もしくはリン酸エステル基を含むこともある。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、ホスホルアミデートなどの合成サブユニットの重合体を含むことがあり、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ−ＮＨ２）または混合ホスホルアミデート−ホスホジエステルオリゴマーであることがある。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド生成物から、相補鎖の合成およびそれらの鎖の適切な条件下でのアニーリングによって、またはＤＮＡポリメラーゼと適切なプライマーを使用する相補鎖のデノボ合成によって、得ることができる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指すために同義で用いており、最小長に限定されない。アミノ酸残基のそのような重合体は、天然アミノ酸残基を含有することもあり、または非天然アミノ酸残基を含有することもあり、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および多量体を含むがこれらに限定されない。完全長タンパク質とそれらの断片の両方がこの定義に包含される。これらの用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的では、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する修飾、例えば欠失、付加および置換（一般に、本質的に保存的なもの）を含むタンパク質を指すが、ただし、該タンパク質が所望の活性を維持することを条件とする。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであることもあり、または偶然なもの、例えば、タンパク質を生産する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーであることもある。
「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス由来でない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合、組換え核酸には少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している。いくつかの実施形態において、組換え核酸には２つのＩＴＲが隣接している。
「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」は、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ由来でない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。そのようなｒＡＡＶベクターは、好適なヘルパーウイルスに感染しており（または好適なヘルパー機能を発現しており）、かつ、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現している宿主細胞中に存在する場合、複製され、感染性ウイルス粒子にパッケージングされる。ｒＡＡＶベクターが、より大きいポリヌクレオチドに（例えば、染色体におけるもの、または別のベクター、例えば、クローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミドにおけるもの）に組み込まれている場合には、そのｒＡＡＶベクターは「プロベクター」と呼ばれることもがあり、該プロベクターは、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびカプシド封入によって「レスキュー」される。ｒＡＡＶベクターは、プラスミド、直鎖状人工染色体を含む（しかしこれらに限定されない）多数の形態のいずれであってもよく、ｒＡＡＶベクターを脂質と複合体化することができ、リポソームに封入することができ、およびウイ
ルス粒子、例えばＡＡＶ粒子、のカプシドに封入することができる。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルスカプシドにパッケージングして、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（ｒＡＡＶ粒子）」を生じさせることができる。
「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質とカプシドに封入されたｒＡＡＶベクターゲノムとで構成されているウイルス粒子を指す。
「異種」には、比較されるまたは導入されるもしくは組み込まれる実体の残部のものと遺伝子型的に異なる実体に由来するという意味がある。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞タイプに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（および、発現されたとき、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞配列（例えば、遺伝子またはその一部分）は、そのベクターに対して異種ヌクレオチド配列である。
用語「導入遺伝子」は、細胞に導入されるポリヌクレオチドであって、ＲＮＡに転写されること、ならびに場合により、適切な条件下で翻訳および／または発現されることが可能である前記ポリヌクレオチドを指す。複数の態様において、導入遺伝子は、その導入遺伝子が導入される細胞に所望の特性を付与するか、または所望の治療もしくは診断アウトカムを別様にもたらす。別の態様において、導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどの、ＲＮＡ干渉を媒介する分子に翻訳されることもある。
ウイルス力価に関して用いる場合の用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム当量」または「ゲノムコピー」は、感染性または機能性に関係なく、組換えＡＡＶ ＤＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター製剤中のゲノム粒子の数は、本明細書の実施例に記載のもの、または例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１０３１〜１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、６：２７２〜２７８頁に記載のものなどの手順によって測定することができる。
用語「ベクターゲノム（ｖｇ）」は、本明細書で用いる場合、ベクター、例えばウイルスベクター、の一連のポリヌクレオチド配列を含む１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを指すことができる。ベクターゲノムは、ウイルス粒子のカプシドに封入されていることもある。個々のウイルスベクターに依存して、ベクターゲノムは、一本鎖ＤＮＡを含むこともあり、二本鎖ＤＮＡを含むこともあり、または一本鎖ＲＮＡもしくは二本鎖ＲＮＡを含むこともある。ベクターゲノムは、特定のウイルスベクターと会合している内在性配列を含むこともあり、および／または組換え技術によって特定のウイルスベクターに挿入された異種配列を含むこともある。例えば、組換えＡＡＶベクターゲノムは、プロモーター、スタッファー、目的の配列（例えば、ＲＮＡｉ）、およびポリアデニル化配列に隣接している、少なくとも１つのＩＴＲ配列を含むことがある。完全ベクターゲノムは、ベクターのポリヌクレオチド配列の完全セットを含むことができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターの核酸力価を単位ｖｇ／ｍＬで測定することもある。この力価の測定に好適な方法は、当技術分野において公知である（例えば、定量的ＰＣＲ）。
ウイルス力価に関して用いる場合の用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染粒子」または「複製単位」は、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３〜１９７３頁に記載されているような複製中心アッセイとしても公知の、感染中心アッセイによって測定されるような、感染性かつ複製可能な組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
ウイルス力価に関して用いる場合の用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、本明細書の実施
例に記載のもの、または例えば、Ｘｉａｏら（１９９７）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１４４：１１３〜１２４頁に記載のもの；もしくはＦｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０〜５３２頁に記載のもの（ＬＦＵアッセイ）などの機能性アッセイで測定されるような、機能性導入遺伝子産物の生産をもたらす感染性組換えＡＡＶベクター粒子の数を指す。
「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」配列は、当技術分野において十分に理解されている用語であり、反対向きであるウイルスゲノムの末端に見られる比較的短い配列を指す。
当技術分野において十分に理解されている用語、「ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）」配列は、ネイティブ一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおおよそ１４５ヌクレオチドの配列である。ＩＴＲの最も外側の１２５ヌクレオチドは、異なるＡＡＶゲノム間および単一のＡＡＶゲノムの２つの末端間の異質性をもたらす、２つの二者択一配向のいずれかで存在することができる。最も外側の１２５ヌクレオチドは、自己相補性のいくつかのより短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と呼ばれる）も含有し、これらの領域が、ＩＴＲのこの部分の中での鎖内塩基対合の発生を可能にする。
「末端切断配列」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中にＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域内の配列である。突然変異型末端切断配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断を受けにくい。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、（欠陥パルボウイルスである）ＡＡＶの複製および宿主細胞によるパッケージングを可能にするウイルスを指す。多数のそのようなヘルパーウイルスが同定されており、それらにはアデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス、例えばワクシニアが含まれる。アデノウイルスは、多数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最もよく使用されている。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類由来の非常の多くのアデノウイルスが公知であり、ＡＴＣＣなどの寄託機関から入手可能である。ＡＴＣＣなどの寄託機関から同じく入手可能であるヘルペス科のウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられる。
参照ポリペプチドまたは核酸配列に対する「配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを達成するためにギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、該参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義する。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、例えば、公的に入手可能なコンピューターソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、補遺３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されているものを使用する、およびＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを含む、当技術分野における技術の範囲内の様々な方法で達成することができる。アライメントプログラムの例は、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）である。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的では、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸同一性％（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対しての、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するまたは含む所与の
アミノ酸配列Ａと表現することができる）を次のように算出する：１００×分数Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのＡとＢのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと同一でない場合、Ｂに対してのＡのアミノ酸配列同一性％が、Ａに対してのＢのアミノ酸配列同一性％と同一にならないことは理解されるであろう。本明細書の目的では、所与の核酸配列Ｄに対しての、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Ｃの核酸同一性％（あるいは、所与の核酸配列Ｄに対しての、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性％を有するまたは含む所与の核配列Ｃと表現することができる）を次のように算出する：１００×分数Ｗ／Ｚ（ここで、Ｗは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのＣとＤのアライメントで同一マッチとしてスコアされるヌクレオチドの数であり、Ｚは、Ｄ中のヌクレオチドの総数である）。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと同一でない場合、Ｄに対してのＣの核酸配列同一性％が、Ｃに対してのＤの核酸配列同一性％と同一にならないことは理解されるであろう。
「単離された」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞は、それが、その天然の環境の成分から同定および分離および／または回収されたことを意味する。
「有効量」は、臨床結果（例えば、症状の改善、臨床エンドポイントの達成など）を含む、有益なまたは所望の結果を達成するために十分な量である。有効量を１回またはそれ以上の投与で投与することができる。病状の点からは、有効量は、疾患の改善、安定化、または発症遅延に十分な量である。
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、および齧歯動物（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、個体または対象はヒトである。
本明細書で用いる場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であろうと、検出不能であろうと、症状の軽減、疾患の程度の低下、安定化された（例えば、悪化しない）病状、疾患の拡大（転移）の予防、疾患進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、および寛解（部分寛解であろうと、完全寛解であろうと）を含むが、これらに限定されない。「処置」は、処置を受けていない場合に予期される生存期間と比較して生存期間の延長も意味することができる。
本明細書で用いる場合、用語「予防的処置」は、個体が障害を有することまたは障害を有するリスクがあることが分かっているまたは疑われるが、その障害の症状をまったくまたは軽微にしか示していない場合の処置を指す。予防的処置を受ける個体は、症状発症前に処置されるだろう。
本明細書で用いる場合、「治療」剤（例えば、治療用ポリペプチド、核酸または導入遺伝子）は、有益なまたは所望の臨床結果、例えば、上に記載した例示的臨床結果をもたらすものである。したがって、治療剤を上記の処置に使用することができる。
用語「中心網膜」は、本明細書で用いる場合、外黄斑および／または内黄斑および／または中心窩を指す。用語「中心網膜細胞タイプ」は、本明細書で用いる場合、例えばＲＰＥおよび光受容器細胞などの、中心網膜の細胞タイプを指す。
用語「黄斑」は、周辺網膜と比較して高い相対濃度の光受容器細胞、特に杆体および錐
体を含有する、霊長類の中心網膜領域を指す。本明細書で用いる場合の用語「外黄斑」は、「周辺黄斑」も指すことがある。本明細書で用いる場合の用語「内黄斑」は、「中心黄斑」も指すことがある。
用語「中心窩」は、周辺網膜および黄斑と比較して高い相対濃度の光受容器細胞、特に錐体を含有する、直径がおおよそ０．５ｍｍ以下の、霊長類の中心網膜内の小領域を指す。
用語「網膜下腔」は、本明細書で用いる場合、網膜内の光受容器細胞と網膜色素上皮細胞の間の位置を指す。網膜下腔は、流体の任意の網膜下注射前などの、潜在空隙であることもある。網膜下腔は、潜在空隙に注射される流体を含有することもある。この場合、流体は、「網膜下腔と接触している」。「網膜下腔と接触している」細胞としては、ＲＰＥおよび光受容器細胞などの、網膜下腔に隣接する細胞が挙げられる。
用語「ブレブ」は、本明細書で用いる場合、眼の網膜下腔内の液腔を指す。本発明のブレブは、単一の腔への流体の単回注射によって形成されることもあり、同じ腔への１つもしくはそれ以上の流体の複数回の注射によって形成されることもあり、複数の腔への複数回の注射によって形成されることもあり、または再配置されたときに網膜下腔の所望の部分に対する治療効果の達成に有用な全液腔を生じさせる、複数の腔への複数回の注射によって形成されることもある。
「ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター」は、杆体および錐体光受容器細胞、ならびに網膜細胞株、例えばＷＥＲＩ Ｒｂ−１における発現を特異的に駆動する、ロドプシンキナーゼ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ ６０１１によって表されるヒトＲＫ）に由来するポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いる場合、「ロドプシンキナーゼプロモーター」は、Ｋｈａｎｉ，Ｓ．Ｃ．ら（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８（９）：３９５４〜６１頁およびＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｅ．ら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４（９）：４０７６〜８５頁に記載されている配列などの、光受容器特異的発現を駆動するために十分な全プロモーター配列またはプロモーター配列の断片を指すこともある。いくつかの実施形態において、ＲＫプロモーターは、転写開始部位を基準にして−１１２〜＋１８０に及ぶ。
「ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター」は、ニワトリβ−アクチン遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ３９６５２６によって表されるニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）βアクチン）に由来するポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で用いる場合、「ニワトリβ−アクチンプロモーター」は、Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら（１９８９）Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９〜７７頁に記載されている配列などの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素とニワトリβ−アクチン遺伝子のプロモーターならびに第１エクソンおよびイントロンとウサギβ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含有するプロモーターを指すこともある。本明細書で用いる場合、用語「ＣＡＧプロモーター」を同義で用いることがある。本明細書で用いる場合、用語「ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリβアクチン（ＣＡＧ）プロモーター」を同義で用いることがある。
本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータそれ自体に関する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本明細書で用いる場合、単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別段の指
示がない限り、複数の言及対象を包含する。
本明細書に記載する本発明の態様および実施形態が、「含む」、「からなる」および／または「から本質的になる」態様および実施形態を包含することは理解される。
ＩＩＩ．ウイルス粒子
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、ＡＡＶ２粒子の細胞受容体として作用することは当技術分野において公知である（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．およびＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４３８〜４５頁）。ＡＡＶ２粒子と細胞膜のＨＳＰＧとの結合は、該粒子を該細胞に付けるのに役立つ。他の細胞表面タンパク質、例えば、線維芽細胞増殖因子受容体およびαｖβ５インテグリンも細胞感染を助長することができる。結合後、ＡＡＶ２粒子は、クラスリン被覆ピットによる受容体依存性エンドサイトーシスをはじめとするメカニズムによって細胞に侵入することができる。ＡＡＶ２粒子は、エンドソーム酸性化によって細胞内小胞から放出される。これによって、ＡＡＶ２粒子は核周囲領域に、そしてその後、細胞核に移動することが可能になる。ＡＡＶ３粒子がヘパランに結合することも公知である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ら（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（２）：７９１〜８０１頁）。
眼の障害のための遺伝子治療プロトコールは、眼の細胞（例えば、網膜の細胞）へのベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患において処置標的になる細胞としては、とりわけ、眼の１つまたはそれ以上の細胞（例えば、光受容器、眼のニューロンなど）を挙げることができる。本発明の方法およびキットは、特定のｒＡＡＶカプシド（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むもの）によって眼の細胞間での広範なベクターの分布が可能になるという発見に少なくとも一部は基づく。したがって、これらのカプシドは、個体の眼への異種核酸の送達、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入の向上、個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の送達後の異種核酸の発現の向上、および／またはｒＡＡＶ粒子を使用する個体の眼の障害の処置に、特に有利であるだろう。
同様に、ＣＮＳの障害の遺伝子治療プロトコールは、ＣＮＳの細胞へのベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患において処置標的になる細胞としては、とりわけ、脳の１つまたはそれ以上の細胞（例えば、ニューロン）を挙げることができる。本発明の方法およびキットは、特定のｒＡＡＶカプシド（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むもの）によってＣＮＳの細胞間での広範なベクターの分布が可能になるという発見に少なくとも一部は基づく。したがって、これらのカプシドは、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）への異種核酸の送達、個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入の向上、個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達後の異種核酸の発現の向上、および／またはｒＡＡＶ粒子を使用する個体のＣＮＳの障害の処置に、特に有利であるだろう。
ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ８Ｒなど）のカプシドが次の３つのカプシドタンパク質を含むことは公知である：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３。これらのタンパク質は、有意な量の重複アミノ酸配列および固有のＮ−末端配列を含有する。ＡＡＶ２カプシドは、正二十面体対称に基づいて配置された６０のサブユニットを含む（Ｘｉｅ，Ｑ．ら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９（１６）：１０４０５〜１０頁）。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は、１：１：１０比で存在することが判明している。
ＡＡＶ２カプシドタンパク質とＨＳＰＧとの結合が塩基性ＡＡＶ２カプシドタンパク質
残基と負電荷を有するグルコサミノグリカン残基との静電相互作用によって起こることは公知である（Ｏｐｉｅ，ＳＲら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁；Ｋｅｒｎ，Ａら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁）。これらの相互作用に関与する具体的なカプシド残基としては、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５３２、Ｒ５８５およびＲ５８８が挙げられる。これらの残基の突然変異がヒーラ細胞およびヘパランそれ自体とのＡＡＶ２結合を低減させることは証明されている（Ｏｐｉｅ，ＳＲら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁；Ｋｅｒｎ，Ａら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁；ＷＯ２００４／０２７０１９
Ａ２、米国特許第７，６２９，３２２号）。さらに、理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５または５８８に対応する残基の１つまたはそれ以上におけるアミノ酸置換は、ＨＳＰＧと結合しないＡＡＶカプシドタイプの形質導入特性を修飾することもあり、またはＡＡＶカプシドタイプの形質導入特性をＨＳＰＧに結合するそれらの能力とは無関係に修飾することもあると考えられる。
本発明の特定の態様は、個体の眼または中枢神経系（ＣＮＳ）への異種核酸の送達であって、該個体の眼またはＣＮＳに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含む前記送達に関する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む。
本明細書に記載するように、カプシドタンパク質が、ＨＳＰＧと相互作用する残基において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５もしくは５８８の１つまたはそれ以上の対応する残基において突然変異しているｒＡＡＶ粒子は、有利な特性、例えば、発現向上および／または神経炎症低減を示す。したがって、いくつかの実施形態では、送達されたとき、ｒＡＡＶベクターによってコードされている異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、野生型ｒＡＡＶカプシドタンパク質）を含むｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される。いくつかの実施形態において、核酸の発現は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加される。いくつかの実施形態において、送達されたとき、ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、野生型ｒＡＡＶカプシドタンパク質）を含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす。いくつかの実施形態において、神経炎症は、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減される。好適な参照ｒＡＡＶカプシドタンパク質としては、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換がない任意のカプシドタンパク質を挙げることができる（したがって、参照カプシドは、ＨＳＰＧとの結合を改変しない１つまたはそれ以上の「バックグラウンド」置換を有することがある）。
いくつかの実施形態において、本発明は、個体の眼に異種核酸を送達する方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を該個体の網膜下腔に投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換であり、該アミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子とＨＳＰＧの相互作用を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する）。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１ ＡＡＶ２のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ２ ＡＡＶ２のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ３ ＡＡＶ２のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３の組み合わせのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号１、３および／または５のカプシドタンパク質のいずれか１つのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ３のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換であり、該アミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子とＨＳＰＧの相互作用を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する）。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１ ＡＡＶ３のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ２ ＡＡＶ３のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ３ ＡＡＶ３のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ３のＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３の組み合わせのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ３のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号７のカプシドタンパク質に対応するアミノ酸残基の置換である。
いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、例えば、米国特許登録前出願公開第２００９０３１７４１７号に記載されているような、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換であり、該アミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子とＨＳＰＧの相互作用を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する）。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ２ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ３ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３の組み合わせのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号９によって例示されるカプシドタンパク質のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０および／または１１のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を（野生型カプシドを含むｒＡＡＶ粒子の結合と比較して）約１０％〜約１００％、約２０％〜約１００％、約３０％〜約１００％、約４０％〜約１００％、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約９０％、約３０％〜約９０％、約４０％〜約９０％、約５０％〜約９０％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約９０％、約８０％〜約９０％、約１０％〜約８０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約８０％、約４０％〜約８０％、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％、約７０％〜約８０％、約１０％〜約７０％、約２０％〜約７０％、約３０％〜約７０％、約４０％〜約７０％、約５０％〜約７０％、約６０％〜約７０％、約１０％〜約６０％、約２０％〜約６０％、約３０％〜約６０％、約４０％〜約６０％、約５０％〜約６０％、約１０％〜約５０％、約２０％〜約５０％、約３０％〜約５０％、約４０％〜約５０％、約１０％〜約４０％、約２０％〜約４０％、約３０％〜約４０％、約１０％〜約３０％、約２０％〜約３０％、または約１０％〜約２０％のうちのいずれか１つの％、低減させる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ｒＡＡＶ粒子の結合と比較して、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの検出可能な結合をもたらさない。ＡＡＶ粒子のＨＳＰＧとの結合を測定する手段は当技術分野において公知である；例えば、ヘパラン硫酸クロマトグラフィー媒体と結合させる手段、またはＨＳＰＧをその表面で発現することが公知の細胞と結合させる手段。例えば、Ｏｐｉｅ，ＳＲら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：６９９５〜７００６頁およびＫｅｒｎ，Ａら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１０７２〜１１０８１頁を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療用核酸の網膜下送達のためのｒＡＡＶ粒子であって、該ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減または除去するカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、該１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ２の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ３の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＡＡＶ２のＶＰ２、および／またはＡＡＶ２のＶＰ３の、４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ２のＶＰ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ１の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ２の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ３の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ１、ＡＡＶ３のＶＰ２、および／またはＡＶＶ３のＶＰ３の、４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ２のＶＰ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３、５８６または５８９位におけるものである１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含む。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ５３３および／Ａ５８６位における置換を含む。さらなる実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ａ５８６ＲおよびＲ５３３Ａを含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０および／または１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
本発明のいくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸（例えば、正電荷を有する側鎖を含有しないアミノ酸）での、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、正電荷を有する側鎖を有するアミノ酸）の置換を含む。正電荷を有するアミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンが挙げられる。正電荷を有さないアミノ酸残基の例としては、負電荷を有するアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）、電荷を有さない極性側鎖を有するアミノ酸（セリン、トレオニン、アスパラギンおよびグルタミン）、疎水性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン）、グリシン、システインおよびプロリンが挙げられる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドの正電荷を有する１つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。他の実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有
さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む。いくつかの実施形態において、疎水性アミノ酸残基は、正電荷を有するアミノ酸残基により置換されている。さらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン残基の置換を含む。さらにさらなる実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の置換Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａの１つまたはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ３のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の置換Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａの１つまたはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３、Ａ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号９に基づいてナンバリングして、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のＲ４８５、Ｒ４８８、Ｒ５３３、Ａ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３の置換Ｒ５３３Ａおよび／またはＡ５８６Ｒの１つまたはそれ以上を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０および／または１１のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＨＳＰＧと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位における置換を有する。いくつかの実施形
態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ５８５およびＲ５８８位における置換を有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、置換Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、置換Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａを有する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを有する。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）が体中の多くの組織において発現されることならびに細胞外マトリックス、細胞接着および細胞シグナル伝達において重要な役割を果たすことは公知である。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞上で発現される。特定の実施形態において、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞はニューロンである。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療用核酸のＣＮＳ送達のためのｒＡＡＶ粒子であって、該ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減または除去するカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８位におけるものである。本明細書で用いる場合、「ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング」は、ＡＡＶ２のＶＰ１の列挙されているアミノ酸に対応する列挙されているカプシドタンパク質のアミノ酸を指す。例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換が、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８位におけるものである場合には、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸３４７、３５０、３９０、３９５、４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８に対応する、列挙されているカプシドタンパク質のアミノ酸におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ３４７、Ｒ３５０、Ｋ３９０、Ｋ３９５、Ｒ４４８、Ｒ４５１、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２の４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、ＡＡＶ２のＶＰ１、ＡＡＶ２のＶＰ２、および／またはＡＡＶ２のＶＰ３の、４８４、４８７、５３２、５８５または５８８位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ２（例えば、ｒＡＡＶ２）のＶＰ１は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ｒＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７、またはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む。いくつかの実施形態
において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ３４７Ａ、Ｒ３５０Ａ、Ｋ３９０Ａ、Ｋ３９５Ａ、Ｒ４４８Ａ、Ｒ４５１Ａ、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｋ５２７Ａ、Ｋ５３２Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ置換を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、治療用核酸のＣＮＳ送達のためのｒＡＡＶ粒子であって、該ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減または除去するカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、例えば、米国特許登録前出願公開第２００９０３１７４１７号に記載されているような、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換であり、該アミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子とＨＳＰＧの相互作用を改変する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を低減または除去する）。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ１ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ２ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＶＰ３ ＡＡＶｒｈ８Ｒのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３の組み合わせのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３のいずれか１つのアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、配列番号９によって例示されるカプシドタンパク質のアミノ酸残基の置換である。いくつかの実施形態において、本発明のｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０および／または１１のカプシドタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／Ｔ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む。
上で論じたように、理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５または５８８に対応する残基における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＨＳＰＧと結合しないＡＡＶカプシドタイプの形質導入特性を修飾することもあり、またはＡＡＶカプシドタイプの形質導入特性をＨＳＰＧに結合するそれらの能力とは無関係に修飾することもあると考えられる。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、図２０に示すアミノ酸に対応する１つまたはそれ以上のアミノ酸を含む。例えば、いくつかの実施形態において、アミノ酸５８５および／または５８８（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング）に対応する位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、アルギニン残基に
よって置き換えられている（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６についてはＳ５８６および／またはＴ５８９；ＡＡＶ９についてはＳ５８６および／またはＡ５８９；ＡＡＶｒｈ８ＲについてはＡ５８６および／またはＴ５８９；ＡＡＶ８についてはＱ５８８および／またはＴ５９１；ならびにＡＡＶｒｈ１０についてはＱ５８８および／またはＡ５９１）。これらの修飾カプシドは、とりわけ、網膜を標的にする硝子体内形質導入の改善に使用することができる。他の実施形態において、アミノ酸４８４、４８７、５２７および／または５３２（ＡＡＶ２のＶＰ１に基づくナンバリング）に対応する位置の１つまたはそれ以上のアミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシン）は、正電荷を有さないアミノ酸、例えばアラニンによって置き換えられている（例えば、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６については、Ｒ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＫ５３３；ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ８Ｒについては、Ｒ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８および／またはＲ５３３；ならびにＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０についてはＲ４８７、Ｒ４９０、Ｋ５３０および／またはＲ５３５）。これらの修飾カプシドは、とりわけ、網膜下またはＣＮＳ形質導入の向上に使用することができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ１のＶＰ１は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／Ｔ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／Ｔ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ８のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／Ｔ５９１位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバ
リングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／Ａ５８９位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９ＲまたはＡ５８９Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）カプシドを含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである。いくつかの実施形態において、前記ナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づく。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上アミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／Ａ５９１位における置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む。いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１Ｒ置換を含む。
ＩＶ．処置方法
網膜疾患、例えば、ＬＣＡ、網膜色素変性および加齢性黄斑変性のための遺伝子治療プロトコールは、網膜の細胞へのベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患において処置標的となる細胞は、網膜の光受容器細胞であるか、または網膜神経感覚上皮の下にあるＲＰＥの細胞である。これらの細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、網膜とＲＰＥ間の網膜下腔への注射を必要とする。いくつかの実施形態において、本発明は、ｒＡＡＶ遺伝子治療ベクターを網膜の細胞に送達する方法であって、ｒＡＡＶベクターが、ＨＳＰＧと相互作用する１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含むＡＡＶカプシドに封入されている、前記方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、個体のＣＮＳの障害を処置する方法であって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の該個体のＣＮＳへの送達を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。さらに、本明細書に記載する、個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達する方法、個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を向上させる方法、および個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達後の異種核酸の発現を向上させる方法は、例えば、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードするものなどの異種核酸を送達するために使用することができる。これらの方法は、とりわけ、ＣＮＳの障害の処置に使用することができる。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
治療用ベクター
本発明は、眼障害の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むｒＡＡＶ粒子が個体の網膜に送達される、前記方法を提供する。ｒＡＡＶカプシド（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒなどの粒子）であって、ＨＳＰＧと相互作用する該カプシドの１つまたはそれ以上のアミノ酸はｒＡＡＶ粒子のＨＳＰＧとの結合を低減または除去するように置換されている、前記ｒＡＡＶカプシドへのｒＡＡＶベクターの封入によって、網膜の細胞への形質導入向上を達成することができる。ベクターは、ポリペプチド（例えば、治療用もしくは診断用ポリペプチド）および／または治療用核酸をコードする、異種核酸を含むことがある。治療用もしくは診断用ポリペプチドおよび／または治療用核酸をコードする核酸は、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて
、生じさせることができる。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、診断用ポリペプチドをコードする。治療用ポリペプチドをコードする核酸の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：網膜疾患の原因となることが公知の欠損または突然変異遺伝子の置換のための核酸、例えば、Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３およびＧＮＡＴ２。治療用ポリペプチドをコードする核酸の他の非限定的な例としては、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、抗アポトーシス遺伝子（例えば、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ）、抗血管新生因子（例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ）、および抗炎症因子（例えば、ＩＬ１０、ＩＬ１−ｒａ、ＴＧＦβ、ＩＬ４）をコードするものが挙げられる。眼障害のための他の治療用ポリペプチドとしては、Ｍｙｏ７ａ、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＰＤＥ６Ｃ、ＲＳ１、ＲＰＧＲＩＰ、Ｌｐｃａｔ１、ＡＩＰＬ１、ＲＤＨ１２、ＣＨＭが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、ポリペプチドのヒト変異体である。
本発明の核酸は、細胞内タンパク質であるポリペプチド、細胞膜に固定されているポリペプチド、細胞内に残存するポリペプチド、または本発明のベクターで形質導入された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードすることがある。ベクターを受け取った細胞によって分泌されるポリペプチドについては；該ポリペプチドは、可溶性であることができる（すなわち、細胞に付着していない）。例えば、可溶性ポリペプチドは、膜貫通領域を欠き、細胞から分泌される。膜貫通ドメインをコードする核酸配列を同定および除去する技術は、当技術分野において公知である。
本発明に従って投与することができるベクターには、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）をコードする核酸を含むベクターであって、該ＲＮＡが、該ベクターの核酸から転写されたとき、本発明の病状に関連する異常なまたは過剰なタンパク質の翻訳または転写に干渉することによって眼障害を処置することができる、前記ベクターも含まれる。例えば、本発明の核酸は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって疾患を処置するＲＮＡをコードすることもある。治療用ＲＮＡ配列としては、様々な型の遺伝性網膜変性の際に発生するものなどの、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって疾患を処置することができる、ＲＮＡｉ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および／またはリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピンリボザイム）が挙げられる。治療用ＲＮＡ配列によって処置することができる眼障害の非限定的な例としては、例えば、常染色体優性網膜色素変性（ＡＤＲＰ）および糖尿病性網膜症が挙げられる。本発明において使用することができる治療用ＲＮＡ配列およびこれらの配列をコードする核酸の例としては、例えば米国特許第６，２２５，２９１号に記載されているものが挙げられ、前記特許文献の開示は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。いくつかの実施形態において、治療用ＲＮＡ配列は、ｍｉＲ−７０８である。いくつかの実施形態において、ｍｉＲ−７０８は、野生型ロドプシンをコードする核酸と、同じｒＡＡＶベクターの一部としてまたは第２のｒＡＡＶベクターの一部として、併用される。いくつかの実施形態において、野生型ロドプシンをコードする核酸には、ロドプシン遺伝子の３’非翻訳領域内に位置するｍｉＲ−７０８標的配列がない。ｍｉＲ−７０８および／またはロドプシンをコードするｒＡＡＶベクターは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている米国特許仮出願第６１／９６９，０２７号によって提供されている。
本発明の特定の態様は、ｒＡＡＶ粒子（例えば、治療用ベクター）の使用に関し、該ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を
含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。本明細書で用いる場合、治療用核酸は、本開示のいずれかの治療用核酸を発現することがあり、または本開示の治療用ポリペプチドをコードするいずれかの核酸を発現することがある。治療用核酸を使用して、例えば、障害（例えば、本明細書に記載する障害）の症状を改善すること、該障害の進行を予防もしくは遅延すること、および／または該障害の処置を行うことができる。
ｒＡＡＶカプシド（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒなどの）であって、ＨＳＰＧと相互作用する該カプシドの１つまたはそれ以上のアミノ酸はｒＡＡＶ粒子のＨＳＰＧとの結合を低減または除去するように置換されている、前記ｒＡＡＶカプシドへのｒＡＡＶベクターの封入によって、ＣＮＳの細胞への形質導入向上を達成することができる。ベクターは、ポリペプチド（例えば、治療用もしくは診断用ポリペプチド）および／または治療用核酸をコードする、異種核酸を含むことがある。治療用もしくは診断用ポリペプチドおよび／または治療用核酸をコードする核酸は、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、生じさせることができる。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、診断用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳ関連遺伝子をコードする。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、治療用核酸としては、限定ではないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムを挙げることができる。したがって、治療用核酸は、ベクターの核酸から転写されたとき、本発明の障害に関連する異常なまたは過剰なタンパク質の翻訳または転写に干渉することによって本発明の障害（例えば、ＣＮＳの障害）を処置することができるＲＮＡをコードすることもある。例えば、本発明の核酸は、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって障害を処置するＲＮＡをコードすることもある。治療用ＲＮＡ配列としては、異常なおよび／または過剰なタンパク質をコードするｍＲＮＡの高特異的除去または低減によって障害を処置することができる、ＲＮＡｉ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および／またはリボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピンリボザイム）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。治療用ポリペプチドは、例えば、細胞内または生物体内に不在であるまたは低減されたレベルで存在するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することがある。あるいは、治療用ポリペプチドは、細胞内または生物体内での不均衡を間接的に解消するポリペプチドおよび／または酵素活性を供給することもある。例えば、代謝酵素または活性の欠乏に起因する代謝物の蓄積に関連した障害のための治療用ポリペプチドは、欠損している代謝酵素もしくは活性を供給することがあり、または代謝物の低減をもたらす代替代謝酵素もしくは活性を供給することもある。治療用ポリペプチドは、例えばドミナントネガティブポリペプチドとして作用することによって、ポリペプチド（例えば、過発現されるもの、機能獲得型突然変異によって活性化されるもの、またはその活性が別様に誤調節されるもの）の活性を低減させるために使用されることもある。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連障害を有する個体における欠乏または突然変異ポリペプチド、抗酸化物質、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子から選択されるポリペプチドをコードする。そのようなポリペプチドを使用して、例えば、ＣＮＳの障害の際に低減される、不在である、もしくは誤調節されるポリペプチドおよび／もしくは酵素活性を供給すること、ＣＮＳ障害の
原因および／もしくは症状を改善すること、ならびに／またはＣＮＳ障害に起因するＣＮＳへの損傷（例えば、アポトーシス、炎症または他のタイプの細胞死）を軽減することによって、ＣＮＳの障害を処置することができる。治療用ポリペプチドをコードする核酸の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：ＣＮＳの障害の原因となることが公知の欠損または突然変異遺伝子の置換のための核酸、例えば、Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３およびＧＮＡＴ２。治療用ポリペプチドをコードする核酸の他の非限定的な例としては、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、抗アポトーシス遺伝子（例えば、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ）、抗血管新生因子（例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ）、および抗炎症因子（例えば、ＩＬ１０、ＩＬ１−ｒａ、ＴＧＦβ、ＩＬ４）をコードするものが挙げられる。ＣＮＳ障害のための他の治療用ポリペプチドとしては、Ｍｙｏ７ａ、ＡＢＣＡ４、ＲＥＰ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＰＤＥ６Ｃ、ＲＳ１、ＲＰＧＲＩＰ、Ｌｐｃａｔ１、ＡＩＰＬ１、ＲＤＨ１２、ＣＨＭが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、ポリペプチドのヒト変異体である。いくつかの実施形態において、異種核酸は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、抗酸化物質、抗血管新生性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、および／またはアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードする。抗酸化物質の例としては、限定ではないが、ＳＯＤ１；ＳＯＤ２；カタラーゼ；サーチュイン１、３、４または５；ＮＲＦ２；ＰＧＣ１ａ；ＧＣＬ（触媒性サブユニット）；ＧＣＬ（修飾因子サブユニット）；アディポネクチン；グルタチオンペルオキシダーゼ１；およびニューログロビンが挙げられる。抗血管新生性ポリペプチドの例としては、限定ではないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＰＥＤＦ、可溶性ＶＥＧＦ受容体、および可溶性ＰＤＧＦ受容体が挙げられる。抗炎症性ポリペプチドの例としては、限定ではないが、ＩＬ−１０、可溶性ＩＬ１７Ｒ、可溶性ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇ、ＩＬ−１阻害剤、およびＩＬ１８阻害剤が挙げられる。ＣＮＳの障害を処置するために使用することができるこれらのクラスの他の例示的ポリペプチドは、下で提供する。
本発明の核酸は、細胞内タンパク質であるポリペプチド、細胞膜に固定されているポリペプチド、細胞内に残存するポリペプチド、または本発明のベクターで形質導入された細胞によって分泌されるポリペプチドをコードすることがある。ベクターを受け取った細胞によって分泌されるポリペプチドについては；該ポリペプチドは、可溶性であることができる（すなわち、細胞に付着していない）。例えば、可溶性ポリペプチドは、膜貫通領域を欠き、細胞から分泌される。膜貫通ドメインをコードする核酸配列を同定および除去する技術は、当技術分野において公知である。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３〜９頁）および伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７〜２３頁およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２〜１０頁）が挙げられるが、こ
れらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＢＡプロモーターに作動可能に連結されている本開示の異種導入遺伝子をコードする核酸を含む組換えベクターを提供する。例示的プロモーターおよび説明は、例えば、米国特許登録前出願公開第２０１４０３３５０５４号において見つけることができる。
構成的プロモーターの例としては、限定ではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサーを伴う）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０頁（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、１３−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられる。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の調節を可能にし、外部から供給される化合物によって、温度などの環境因子によって、もしくは特異的生理状態、例えば、急性期、細胞の特定の分化状態の存在によって、または複製細胞においてのみ、調節される。誘導性プロモーターおよび誘導性システムは、限定ではないがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含む、様々な商業的供給源から入手することができる。多くの他のシステムが記載されており、当業者はそれらのシステムを容易に選択することができる。外部から供給されるプロモーターによって調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターシステム（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：３３４６〜３３５１頁（１９９６））、テトラサイクリン抑制性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１頁（１９９２））、テトラサイクリン誘導性システム（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６〜１７６９頁（１９９５）、またＨａｒｖｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、２：５１２〜５１８頁（１９９８）も参照されたい）、ＲＵ４８６誘導性システム（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５：２３９〜２４３頁（１９９７）およびＷａｎｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、４：４３２〜４４１頁（１９９７））およびラパマイシン誘導性システム（Ｍａｇａｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００：２８６５〜２８７２頁（１９９７））が挙げられる。これに関連して有用であるだろうさらに他のタイプの誘導性プロモーターは、特異的生理状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞においてのみ調節されるものである。
別の実施形態では、導入遺伝子のネイティブプロモーターまたはその断片が使用されることになる。導入遺伝子の発現がネイティブ発現を模倣することを所望する場合、ネイティブプロモーターを使用することができる。ネイティブプロモーターは、導入遺伝子の発現を時間的にもしくは発生的に、または組織特異的様式で、または特異的転写刺激に反応して調節しなければならない場合に使用されることもある。さらなる実施形態において、他のネイティブ発現制御要素、例えば、エンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列も、ネイティブ発現を模倣するために使用されることがある。
いくつかの実施形態において、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的様式で転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー
など）は、当技術分野において周知である。例示的組織特異的調節配列には次の組織特異的プロモーターが含まれるがこれらに限定されない：ニューロンプロモーター、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、１３：５０３〜１５頁（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：５６１１〜５頁（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、Ｎｅｕｒｏｎ、１５：３７３〜８４頁（１９９５））。いくつかの実施形態において、組織特異的プロモーターは、次のものから選択される遺伝子のプロモーターである：ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）。他の適切な組織特異的プロモーターは、当業者には明らかであるだろう。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ−アクチンプロモーターである。
いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある。上に列挙したプロモーター配列の多く（例えば、ＣＢＡプロモーター）がＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されることは当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、プロモーター配列は、生物において遍在発現され、したがって、ＣＮＳへのその送達によってＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現することができる。他の実施形態では、ＣＮＳにおいてまたは１つもしくはそれ以上のＣＮＳ細胞のサブセットにおいて特異的に発現するプロモーター配列が使用されることもある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸を使用して、ＣＮＳの障害を処置することができる。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、脳細胞において異種核酸を発現する。脳細胞は、限定ではないが、ニューロン（例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン、介在ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、中型有棘ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、錐体ニューロンなど）、グリア細胞（例えば、ミクログリア、マクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、放射状グリアなど）、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞を含む、当技術分野において公知のあらゆる脳細胞を指すことがある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ニューロンにおいて異種核酸を発現する。いくつかの実施形態において、異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される（例えば、ニューロンにおいて発現され、ＣＮＳの他の細胞、例えばグリア細胞では発現されない）。
いくつかの態様において、本発明は、例えば結果として対象がポリペプチド欠乏もしくはポリペプチド過多になる遺伝子欠損のような、哺乳動物における１つもしくはそれ以上の遺伝子欠損（例えば、遺伝性遺伝子欠損、体細胞遺伝子変異など）を予防もしくは処置する方法、または細胞および組織中のそのようなポリペプチドの欠乏に関連づけられるＣＮＳ関連障害を明示する対象の欠乏を処置するもしくは欠乏の重症度もしくは程度を低減させるための方法において使用するためのｒＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施形態において、方法は、医薬的に許容される担体中の、１つまたはそれ以上の治療用ペプチド、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、阻害性核酸、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードするｒＡＡＶベクターを、ＣＮＳ関連障害を有するまたは有することが疑われる対象のＣＮＳ関連障害を処置するために十分な量で、十分な時間期間、対象に投与することを含む。
ｒＡＡＶベクターは、ＣＮＳ関連障害を調節または処置するタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする核酸を導入遺伝子として含むことがある。次のものは、ＣＮＳ関連障害に関連する遺伝子の非限定的なリストである：神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、スーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ１）、抗酸化物質、抗血管新生性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、およびアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。例えば、パーキンソン病の処置に有用な導入遺伝子は、ドーパミン合成の律速酵素であるＴＨをコードする。ＴＩＩ補因子テトラヒドロビオプテリンを生成するＧＴＰＣＩＩをコードする導入遺伝子もパーキンソン病の処置に使用されることがある。ＧＤＮＦもしくはＢＤＮＦをコードする、またはＬ−ドーパのＤＡへの変換を助長するＡＡＤＣをコードする導入遺伝子もパーキンソン病の処置に使用されることがある。ＡＬＳの処置に有用な導入遺伝子は、次のものをコードすることがある：ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦまたはＣＮＴＦ。また、ＡＬＳの処置に有用な導入遺伝子は、ＳＯＤ１の発現を阻害する機能性ＲＮＡ、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードすることがある。虚血の処置に有用な導入遺伝子は、ＮＡＩＰまたはＮＧＦコードすることがある。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする導入遺伝子は、特定のリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳ ＶＩＩ））の処置に有用であるだろう。プロドラッグ活性化遺伝子、例えば、ＤＮＡ合成を中断させ、細胞死をもたらす毒性ヌクレオチドにガンシクロビルを変換するＨＳＶ−チミジンキナーゼ、をコードする導入遺伝子は、特性の癌の処置に、例えば、前記プロドラッグと併用で投与すると、有用であるだろう。β−エンドルフィンなどの内因性オピオイドをコードする導入遺伝子は、疼痛の処置に有用であるだろう。抗酸化物質の例としては、限定ではないが、ＳＯＤ１；ＳＯＤ２；カタラーゼ；サーチュイン１、３、４または５；ＮＲＦ２；ＰＧＣ１ａ；ＧＣＬ（触媒性サブユニット）；ＧＣＬ（修飾因子サブユニット）；アディポネクチン；グルタチオンペルオキシダーゼ１；およびニューログロビンが挙げられる。抗血管新生性ポリペプチドの例としては、限定ではないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＰＥＤＦ、可溶性ＶＥＧＦ受容体、および可溶性ＰＤＧＦ受容体が挙げられる。抗炎症性ポリペプチドの例としては、限定ではないが、ＩＬ−１０、可溶性ＩＬ１７Ｒ、可溶性ＴＮＦ−Ｒ、ＴＮＦ−Ｒ−Ｉｇ、ＩＬ−１阻害剤、およびＩＬ１８阻害剤が挙げられる。本発明のｒＡＡＶベクターに使用することができる導入遺伝子の他の例は、当業者には明らかであるだろう（例えば、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉ Ｌ Ｃら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７、９３〜１０９頁を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、ＣＮＳの障害を処置するために使用される。理論に拘束されることを望むものではないが、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、その機能獲得が障害と関連しているポリペプチドの発現および／もしくは活性を低減もしくは除去するために、またはポリペプチドの発現および／もしくは活性を向上させて、障害（例えば、その発現が同様のもしくは関連した活性を示す遺伝子の突然変異）と関連している欠損を補完するために使用することができると考えられる。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置することができる発明の障害の非限定的な例（標的にされるまたは供給される例示的遺伝子を各障害のカッコ内に提供する）としては、脳卒中（例えば、カスパーゼ−３、Ｂｅｃｌｉｎ１、Ａｓｋ１、ＰＡＲ１、ＨＩＦ１α、ＰＵＭＡ、および／またはＦｕｋｕｄａ，Ａ．Ｍ．およびＢａｄａｕｔ、Ｊ．（２０１３）Ｇｅｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）４：４３５〜４５６頁に記載されている遺伝子のいずれか）、ハンチントン病（突然変異型ＨＴＴ）、てんかん（例えば、ＳＣＮ１Ａ、ＮＭＤＡＲ、ＡＤＫ、および／またはＢｏｉｓｏｎ，Ｄ．（２０１０）Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ ５１：１６５９〜１６６８頁に記載されている遺伝子のいずれか）、パーキンソン病（α−シヌクレイン）、ルー・ゲーリック病（筋萎縮性側索硬化症としても公知；ＳＯＤ１）、アルツハイマー病（タウ、アミロイド前駆体タンパク質）、大脳皮質基底
核変性症またはＣＢＤ（タウ）、大脳皮質基底核神経節変性症またはＣＢＧＤ（タウ）、前頭側頭型認知症またはＦＴＤ（タウ）、進行性核上性麻痺またはＰＳＰ（タウ）、多系統委縮症またはＭＳＡ（α−シヌクレイン）、脳の癌（例えば、脳癌に関与する突然変異型または過発現癌遺伝子）、およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）が挙げられる。本発明の障害は、皮質の大領域、例えば、皮質の１つより多くの機能性領域、皮質の１つより多くの葉、および／または皮質全体が関与するものを含むことがある。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置することができる本発明の障害の他の非限定的な例としては、外傷性脳損傷、酵素機能不全障害、精神障害（外傷後ストレス症候群を含む）、神経変性疾患、および認知障害（認知症、自閉症およびうつ病を含む）が挙げられる。酵素的機能不全障害としては、限定ではないが、白質ジストロフィー（カナバン病を含む）、および下に記載するリソソーム蓄積症のいずれかが挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸は、リソソーム蓄積症を処置するために使用される。当技術分野において一般に知られているように、リソソーム蓄積症は、リソソーム機能の欠損を特徴とするまれな遺伝性代謝障害である。そのような障害は、リソソームに蓄えられる細胞物質の病的蓄積につながる、適切なムコ多糖類、糖タンパク質および／または脂質代謝に必要な酵素の欠損に起因することが多い。本発明の治療用ポリペプチドまたは治療用核酸によって処置することができる本発明のリソソーム蓄積症の非限定的な例（標的にされるまたは供給される例示的遺伝子を各障害のカッコ内に提供する）としては、ゴーシェ病２型または３型（酸性β−グルコシダーゼ、ＧＢＡ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（β−ガラクトシダーゼ−１、ＧＬＢ１）、ハンター病（イズロン酸２−スルファターゼ、ＩＤＳ）、クラッベ病（ガラクトシルセラミダーゼ、ＧＡＬＣ）、マンノシドーシス症（マンノシダーゼ、例えばα−Ｄ−マンノシダーゼ、ＭＡＮ２Ｂ１）、βマンノシドーシス症（β−マンノシダーゼ、ＭＡＮＢＡ）、異染性白質ジストロフィー症（偽アリールスルファターゼＡ、ＡＲＳＡ）、ムコリピドーシス症ＩＩ／ＩＩＩ型（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡＢ）、ニーマン・ピック病Ａ型（酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＡＳＭ）、ニーマン・ピック病Ｃ型（ニーマン・ピックＣタンパク質、ＮＰＣ１）、ポンペ病（酸性α−１，４−グルコシダーゼ、ＧＡＡ）、サンドホッフ病（ヘキソサミニダーゼβサブユニット、ＨＥＸＢ）、サンフィリポ病Ａ型（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＭＰＳ３Ａ）、サンフィリポ病Ｂ型（Ｎ−α−アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＬＵ）、サンフィリポ病Ｃ型（へパリンアセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ、ＭＰＳ３Ｃ）、サンフィリポ病Ｄ型（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ、ＧＮＳ）、シンドラー病（α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、ＮＡＧＡ）、スライ病（β−グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ）、テイ・サックス病（ヘキソサミニダーゼαサブユニット、ＨＥＸＡ）、およびウォルマン病（リソソーム酸性リパーゼ、ＬＩＰＡ）が挙げられる。
さらなるリソソーム蓄積症、ならびに各疾患に関連する欠損酵素を下の表１に収載する。いくつかの実施形態において、下の表に収載する疾患は、対応する酵素欠損を補完するまたは別様に補償する本発明の治療用ペプチドまたは治療用核酸によって処置される。
ハンチントン病
上記のベクターが有利であるだろう疾患の一例は、突然変異型ハンチンチンタンパク質（ｍＨＴＴ）の伸長ポリグルタミン（ポリＱ）反復配列をコードするＣＡＧ反復配列伸長突然変異によって引き起こされるハンチントン病（ＨＤ）である。ＨＤは、単一対立遺伝子の突然変異の結果として生じる常染色体優性疾患であるので、ＤＮＡベースおよびＲＮＡベースの治療の魅力的な標的である。ＡＡＶベクターは、核酸治療に理想的な送達システムを提供することができ、脳内のこれらのハンチンチン低下分子の長期にわたる継続的発現を可能にするであろう。
本明細書に記載するように、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含有するｒＡＡＶカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子（例えば、治療用ベクター）の頭蓋内投与は、広範なニューロン形質導入を生じさせる。したがって、本発明の態様は、ハンチントン病の処置のために本明細書に記載する組換えウイルス粒子を使用して中枢神経系に異種核酸を送達する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、個体のハンチントン病を処置するための方法および組成物であって、本開示の医薬組成物（例えば、本開示の変異型ウイルス粒子を含む医薬組成物）を哺乳動物に投与することを含む前記方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ハンチントン病を有する哺乳動物におけるｈｔｔの発現を阻害するための方法および組成物であって、本開示の医薬組成物（例えば、本開示の変異型ウイルス粒子を含む医薬組成物）を個体に投与することを含む前記方法および組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、ハンチントン病を有する個体の細胞におけるｈｔｔの蓄積を阻害するための方法および組成物であって、本開示の医薬組成物（例えば、本開示の変異型ウイルス粒子を含む医薬組成物）を個体に投与することを含む前記方法および組成物を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、個体のＨＤの症状を改善する方法および組成物であって、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を該個体のＣＮ
Ｓに投与することを含み、該ｒＡＡＶ粒子は、該個体におけるＨＴＴの発現および／または蓄積を阻害するＲＮＡｉをコードするベクターを含む、前記方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＤの症状としては、舞踏病、硬直、制御できない体の動き、筋肉制御不能、協調運動障害、不穏状態、緩慢な目の動き、姿勢異常、不安定、失調性歩行、異常な表情、会話障害、咀嚼および／または嚥下困難、睡眠障害、発作、認知症、失認（例えば、計画、抽象思考、柔軟性、ルール習得、対人感受性、自己制御、注意、学習および記憶に関係する能力の低下）、うつ状態、不安、人格の変化、攻撃性、強制行動、強迫行動、性行動亢進、精神病、感情鈍麻、易怒性、自殺念慮、体重減少、筋萎縮、心不全、耐糖能低下、精巣萎縮および骨粗鬆症が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、本発明は、ＨＤの進行を予防または遅延させる方法を提供する。常染色体優性ＨＤは、遺伝子型判定することができる遺伝疾患である。例えば、ＨＴＴのＣＡＧ反復配列の数をＰＣＲベースの反復配列サイズ測定によって判定してもよい。このタイプの診断は、（例えば、臨床症状の提示とともに）若年者もしくは成人の直接試験によって、（例えば、絨毛膜絨毛サンプリングもしくは羊水穿刺による）親スクリーニングもしくは親除外試験によって、または胎児の着床前スクリーニングによって、人生の任意の段階で行うことができる。加えて、脳をイメージングし、尾状核および／もしくは被殻の萎縮ならびに／または心室の肥大を探すことによって、ＨＤを診断してもよい。ＨＤの家族歴および／または臨床症状と併せて、これらの症状は、ＨＤを示すだろう。
ＨＤの症状の改善を判定する手段は、当技術分野において公知である。例えば、統一ハンチントン病評価尺度（ＵＨＤＲＳ）を用いて、運動機能、認知機能、行動異常性、および機能的能力を評価してもよい（例えば、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（１９９６）Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １１：１３６〜４２頁を参照されたい）。この評価尺度は、ＨＤ動作および日常生活尺度、マースデンおよびクインの舞踏病重症度尺度、身体障害および独立尺度、ＨＤ運動評価尺度（ＨＤＭＲＳ）、ＨＤ機能的能力尺度（ＨＤＦＣＳ）ならびに定量化神経学的検査（ＱＮＥ）などの試験からの要素が組み込んで疾患病理の複数の面についての統一された包括的試験を提供するために開発された。ＨＤ症状改善の判定に有用な他の試験としては、限定ではないが、モントリオール認知評価、脳イメージング（例えば、ＭＲＩ）、カテゴリー流暢性試験、トレイルメーキングテスト、マップサーチ、ストループ単語読み取り試験、加速タッピング課題、および記号数字モダリティー試験が挙げられる。
本発明のいくつかの態様において、前記方法および組成物は、ＨＤを有するヒトの処置に使用される。上で説明したように、ＨＤは、常染色体優性様式で遺伝され、ＨＴＴ遺伝子のＣＡＧ反復配列伸長によって引き起こされる。若年発症性ＨＤは、ほとんどの場合、父方側からの遺伝である。ハンチントン病様表現型は、他の遺伝子座、例えば、ＨＤＬ１、ＰＲＮＰ、ＨＤＬ２、ＨＤＬ３およびＨＤＬ４との相関関係も証明されている。ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＭＳＸ１、ＧＲＩＫ２およびＡＰＯＥ遺伝子の突然変異をはじめとする他の遺伝子座は、ＨＤ症状の顕在化を変更することもあると考えられる。
ｒＡＡＶ組成物
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載するｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。一般に、本発明の方法およびシステムに使用するための組成物は、場合により、医薬的に許容される賦形剤中の、ポリペプチドおよび／またはＲＮＡをコードするｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子の有効量を含む。これらのウイルス粒子は、ＨＳＰＧと相互作用する１つまたはそれ以上のアミノ酸が、ＨＳＰＧとのｒＡＡＶ粒子結合を低減または除去するように置換されている、ＡＡＶカプシド（例えば、ＡＡＶ２またはＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド）を含む。当技術分野において周知であるように、医薬的に許
容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手することができる。
一般に、これらの組成物は、網膜下注射による投与用に製剤化される。したがって、これらの組成物を医薬的に許容されるビヒクル、例えば食塩水、リンゲル平衡塩類溶液（ｐＨ７．４）などと併用することができる。必須ではないが、場合によっては、前記組成物を、正確な量の投与に好適な単位剤形で供給してもよい。
ｒＡＡＶの網膜下送達方法
網膜下送達方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れられているＷＯ２００９／１０５６９０を参照されたい。簡単に言うと、ｒＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒなどの粒子）を黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。
一般に、ｒＡＡＶベクターは、手術用顕微鏡を使用して直接観察しながら眼内（網膜下）注射される組成物の形態で送達することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子のカプシドに封入され、該ｒＡＡＶ粒子は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する（例えば、ＨＳＰＧ結合を阻害または減少させる）１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む。この手順は、硝子体切開、続いての、網膜下腔への１回またはそれ以上の小さい網膜切開によって細いカニューレを使用するｒＡＡＶベクター懸濁液の注射を含む。
簡単に言うと、注入カニューレを所定の位置に縫合して、手術の間ずっと（例えば食塩水の）注入により正常眼球容積を維持することができる。硝子体切除は、適切な口径（例えば、２０〜２７ゲージ）のカニューレを使用して行われ、除去される硝子体ゲルの容量は、注入カニューレからの食塩水または他の等張液の注入によって置換される。硝子体切除は、（１）その皮質（後部硝子体膜）の除去がカニューレによる網膜の貫通を助長する；（２）その除去および流体（例えば食塩水）による置換が、ベクターの眼内注射に適応する腔を形成する、および（３）その制御された除去が、網膜裂孔および予定外の網膜剥離の可能性を低減させるため、行うと有利である。
いくつかの実施形態では、適切な口径（例えば、２７〜４５ゲージ）のカニューレを利用して、中心網膜の外側の網膜下腔にｒＡＡＶ組成物を直接注射し、かくして網膜下腔にブレブを形成する。他の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の網膜注射の前に、少量（例えば
、約０．１〜約０．５ｍｌ）の適切な流体（例えば、食塩水またはリンゲル液）を中心網膜の外側の網膜下腔に網膜下注射する。網膜下腔へのこの初回注射によって網膜下腔内に最初のブレブが構築され、これに起因してその最初のブレブの位置に網膜剥離が限局される。この最初の流体ブレブは、（ｒＡＡＶ送達前に注射面を規定することにより）網膜下腔へのｒＡＡＶ組成物の標的送達を助長することができ、可能性のある脈絡膜へのｒＡＡＶ投与を最小にすることができ、硝子体腔へのｒＡＡＶ注射または逆流の可能性を最小にすることができる。いくつかの実施形態では、１つもしくはそれ以上のｒＡＡＶ組成物および／または１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤を含む流体を最初の流体ブレブに、同じまたはさらなる細径カニューレいずれかでの最初の流体ブレブへのこれらの流体の直接投与よって、さらに注射することができる。
ｒＡＡＶ組成物および／または最初の少量の流体の眼内投与は、注射器に取り付けられた細径カニューレ（例えば、２７〜４５ゲージ）を使用して行うことができる。いくつかの実施形態では、この注射器のプランジャーは、機械化デバイスによって、例えば、足踏みペダルを押し下げることによって駆動することができる。細径カニューレを、強膜切開により、硝子体腔を横断して、標的となる網膜の領域に従って各対象の網膜の所定の部位（しかし中心網膜の外側）に進ませる。直接見えるようにしながら、自然に閉じる拡大しない網膜切開で網膜剥離を限局させてベクター懸濁液を網膜神経感覚上皮下に機械的に注射する。上で述べたように、ｒＡＡＶ組成物を網膜下腔に直接注射して中心網膜の外側のブレブを形成することができ、または該ベクターを中心網膜の外側の最初のブレブに注射してそのブレブを膨張させる（そして網膜剥離領域を拡大する）ことができる。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の注射後に別の流体がブレブに注射される。
理論に拘束されることを望むものではないが、網膜下注射の速度および位置によって、黄斑、中心窩および／または下にあるＲＰＥ細胞を損傷させることがある局所的剪断力が生じる結果となることがある。剪断力を最小にするまたは回避する速度で網膜下注射を行ってもよい。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約１５〜１７分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約１７〜２０分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約２０〜２２分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約３５〜約６５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約３５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約４０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約４５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約５０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約５５μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約６０μｌ／分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、約６５μｌ／分の速度で注射される。ブレブの注射速度および時間が、例えば、中心網膜の細胞に接近するのに十分な網膜剥離を生じさせるために必要なｒＡＡＶ組成物の容量またはブレブのサイズ、ｒＡＡＶ組成物を送達するために使用されるカニューレのサイズ、および本発明のカニューレの位置を安全に維持する能力によって左右されることがあることは、当業者には理解されるであろう。
本発明のいくつかの実施形態において、網膜の網膜下腔に注射される組成物の容量は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬのいずれか１つより多いか、またはそれらの間の任意の量である。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用
する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子であって、異種核酸をコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を、眼に（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜６×１０１２、６×１０１２〜７×１０１２、７×１０１２〜８×１０１２、８×１０１２〜９×１０１２、９×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜１１×１０１２、１１×１０１２〜１５×１０１２、１５×１０１２〜２０×１０１２、２０×１０１２〜２５×１０１２、２５×１０１２〜３０×１０１２、３０×１０１２〜５０×１０１２、または５０×１０１２〜１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜２５×１０１２、または２５×１０１２〜５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜７×１０９、７×１０９〜８×１０９、８×１０９〜９×１０９、９×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１１×１０９、１１×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２０×１０９、２０×１０９〜２５×１０９、２５×１０９〜３０×１０９、３０×１０９〜５０×１０９、または５０×１０９〜１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２５×１０９、または２５×１０９〜５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜６×１０１０、６×１０１０〜７×１０１０、７×１０１０〜８×１０１０、８×１０１０〜９×１０１０、９×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１１×１０１０、１１×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２０×１０１０、２０×１０１０〜２５×１０１０、２５×１０１０〜３０×１０１０、３０×１０１０〜４０×１０１０、４０×１０１０〜５０×１０１０、または５０×１０１０〜１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２５×１０１０、または２５×１０１０〜５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を、個体（例えばヒト）の眼に（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり少なくとも約、１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり約１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。
１つまたは複数（例えば、２、３もしくはそれ以上の）ブレブを形成することができる
。一般に、本発明の方法およびシステムによって形成されるブレブの全容量は、眼の流体容量、例えば典型的なヒト対象では約４ｍｌ、を超えることができない。個々のブレブ各々の合計容量は、中心網膜の細胞タイプを暴露するのに十分なサイズの網膜剥離を助長するために、および最適な操作に十分な依存度のブレブを生成するために、少なくとも約０．３ｍｌ、または少なくとも約５ｍｌであることができる。本発明の方法およびシステムに従ってブレブを生成する際、眼の構造に対する損傷を回避するために適切な眼圧を維持しなければならないことは、当業者には理解されるであろう。個々のブレブ各々のサイズは、例えば、約０．５〜約１．２ｍｌ、約０．８〜約１．２ｍｌ、約０．９〜約１．２ｍｌ、約０．９〜約１．０ｍｌ、約１．０〜約２．０ｍｌ、約１．０〜約３．０ｍｌであることがある。したがって、一例では、合計３ｍｌのｒＡＡＶ組成物懸濁液を注射するために、各々約１ｍｌの３個のブレブを構築することができる。併せてすべてのブレブの合計容量は、例えば、約０．５〜約３．０ｍｌ、約０．８〜約３．０ｍｌ、約０．９〜約３．０ｍｌ、約１．０〜約３．０ｍｌ、約０．５〜約１．５ｍｌ、約０．５〜約１．２ｍｌ、約０．９〜約３．０ｍｌ、約０．９〜約２．０ｍｌ、約０．９〜約１．０ｍｌとなるだろう。
ブレブの原位置の縁部の外側の標的網膜（例えば、中心網膜）領域に安全かつ効率的に形質導入するために、ブレブを操作して形質導入の標的領域にブレブを再配置してもよい。このブレブの操作は、ブレブの容量が生じさせるブレブの依存性によって、眼のブレブを有する位置を変えることによって、ヒトの頭と眼または１つもしくはそれ以上のブレブを有する眼とを位置合わせし直すことによって、および／または液空気置換を用いて行うことができる。これは、特に、中心網膜に関する。この領域は通常は網膜下注射による剥離に耐えるからである。いくつかの実施形態では、流空気置換を用いてブレブを再配置し；注入カニューレからの流体を空気によって、例えば、網膜表面への吹き込み空気によって、一時的に置換する。大量の空気が網膜表面から硝子体腔液を追い出すので、その硝子体腔内の流体はカニューレから流出することができる。硝子体腔液からの圧力の一時的な欠如に起因して、ブレブは移動し、眼の依存部に引き寄せられる。眼球を適切に配置することによって、隣接領域（例えば、黄斑および／または中心窩）を含むように網膜下ｒＡＡＶ組成物のブレブを操作する。場合によっては、ブレブの大部分は、流空気置換を使用しなくてもブレブを引き寄せさせるのに十分なものである。眼内の所望の位置にブレブを引き寄せさせるように対象の頭の位置を変えることによって、所望の位置へのブレブの移動をさらに助長してもよい。ブレブの所望の立体配置を達成したら、流体を硝子体腔に戻す。この流体は、適切な流体、例えば、作りたての食塩水である。一般に、網膜下ｒＡＡＶ組成物を網膜切開に対する網膜裂孔閉鎖術なしで、および眼内タンポナーデなしで、生体内原位置に放置してもよく、網膜は約４８時間以内に自然に再付着することになる。
治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ配列を含むベクターの眼細胞（例えば黄斑および／または中心窩の、例えばＲＰＥおよび／または光受容器細胞）への安全かつ効率的形質導入によって、形質導入された細胞が眼障害の処置に十分な量の治療用ポリペプチドまたはＲＮＡ配列を生成する本発明の方法は、眼障害を有する個体；例えばヒト、を処置するために使用することができる。いくつかの実施形態において、眼細胞への形質導入は、ＨＳＰＧと相互作用する（例えば、ＨＳＰＧとの結合を阻害または除去する）アミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒなどの粒子）を使用することによって向上される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＨＳＰＧとの結合低減；例えば、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％を超える、またはこれらの間の任意の数まで低減される前記結合低減を明示する。いくつかの実施形態において、ＨＳＰＧとのｒＡＡＶ結合は、約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、約１０％〜約３０％、約２５％〜約７５％、約２５％〜約５０％、または約３０％〜約５０％低減される。
ｒＡＡＶ（いくつかの実施形態では、粒子の形態のもの）の有効量が治療目的に応じて投与される。例えば、低い形質導入パーセンテージによって所望の治療効果が達成できる場合には、処置の目的は、一般に、この形質導入レベルを満たすまたは超えることである。いくつかの例では、この形質導入レベルを、標的細胞のたった約１〜５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約２０％、いくつかの実施形態では少なくとも約５０％、いくつかの実施形態では少なくとも約８０％、いくつかの実施形態では少なくとも約９５％、いくつかの実施形態では所望の組織タイプの細胞の少なくとも約９９％に形質導入することによって達成することができる。上で論じたように、ＨＳＰＧと相互作用するｒＡＡＶカプシドの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換は、ｒＡＡＶ形質導入を向上させる。参考のために、１回の注射で投与される粒子の数は、一般に、粒子約１×１０６〜１×１０１４の間、粒子約１×１０７〜１×１０１３の間、粒子約１×１０９〜１×１０１２の間、または粒子約１×１０１１である。ｒＡＡＶ組成物は、同じ手技の間に、または数日、数週間、数カ月もしくは数年間隔を空けて、１回またはそれ以上の網膜下注射によって投与されることがある。いくつかの実施形態では、複数のベクターを使用してヒトを処置することもある。
いくつかの実施形態では、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶウイルス粒子の有効量の網膜への投与は、投与部位のまたは付近の光受容器細胞への形質導入を生じさせる。いくつかの実施形態では、光受容器細胞の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。いくつかの実施形態では、光受容器細胞の約５％〜約１００％、１０％〜約５０％、約１０％〜約３０％、約２５％〜約７５％、約２５％〜約５０％、または約３０％〜約５０％が形質導入される。ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルス粒子によって形質導入された光受容器細胞を同定する方法は、当技術分野において公知であり；例えば、免疫組織化学、または高感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を用いて、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子の形質導入を検出することができる。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、眼障害を有する個体；例えば、眼障害を有するヒト、を処置するために、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むウイルス粒子であるＡＡＶウイルス粒子の有効量を、哺乳動物の網膜下（例えば、網膜下腔）に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物を網膜下の１カ所またはそれ以上の位置に注射して、光受容器細胞において異種核酸を発現させる。いくつかの実施形態において、組成物は、網膜下の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所または１０カ所より多くの位置のいずれかの１つに注射される。
いくつかの実施形態において、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を有するｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶウイルス粒子は、１カ所より多くの位置に同時にまたは逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、９時間、１２時間または２４時間を超えて間隔を空けない。
硝子体内注射の方法
硝子体内注射の一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。硝子体内注射の手技は、当技術分野において公知である（例えば、Ｐｅｙｍａｎ，Ｇ．Ａ．ら（２００９）Ｒｅｔｉｎａ ２９（７）：８７５〜９１２
頁、ならびにＦａｇａｎ，Ｘ．Ｊ．およびＡｌ−Ｑｕｒｅｓｈｉ，Ｓ．（２０１３）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．４１（５）：５００〜７頁を参照されたい）。
簡単に言うと、硝子体内注射の対象に、瞳孔拡大、眼の消毒、および麻酔薬の投与によってその手技のための準備を施すことができる。当技術分野において公知のいずれの好適な散瞳薬を瞳孔拡大に使用してもよい。十分な瞳孔拡大を確認した後、処置することができる。消毒は、眼の消毒処置薬、例えば、ポビドン−ヨード（ＢＥＴＡＤＩＮＥ（登録商標））などのヨウ素含有溶液を適用することによって果たすことができる。まぶた、まつげおよび任意の他の周囲の組織（例えば、皮膚）を清浄にするために同様の溶液を使用してもよい。いずれの好適な麻酔薬、例えばリドカインまたはプロパラカインを、いずれの好適な濃度で使用してもよい。麻酔薬は、限定ではないが、局所滴剤、ゲルまたはゼリー、および麻酔薬の結膜下適用をはじめとする、当技術分野において公知の任意の方法によって投与することができる。
注射に先立ち、消毒した開瞼器を使用して、その領域からまつげをなくす。注射部位に注射器で印をつけてもよい。注射部位を患者の水晶体に基づいて選択してもよい。例えば、注射部位は、偽水晶体または無水晶体患者の場合は縁から３〜３．５ｍｍ、有水晶体患者の場合は縁から３．５〜４ｍｍであることがある。患者は、注射部位とは反対の方を見ることができる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子であって、異種核酸をコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を、眼に（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜６×１０１２、６×１０１２〜７×１０１２、７×１０１２〜８×１０１２、８×１０１２〜９×１０１２、９×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜１１×１０１２、１１×１０１２〜１５×１０１２、１５×１０１２〜２０×１０１２、２０×１０１２〜２５×１０１２、２５×１０１２〜３０×１０１２、３０×１０１２〜５０×１０１２、または５０×１０１２〜１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜２５×１０１２、または２５×１０１２〜５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜７×１０９、７×１０９〜８×１０９、８×１０９〜９×１０９、９×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１１×１０９、１１×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２０×１０９、２０×１０９〜２５×１０９、２５×１０９〜３０×１０９、３０×１０９〜５０×１０９、または５０×１０９〜１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２５×１０９、または２５×１０９〜５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０
１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜６×１０１０、６×１０１０〜７×１０１０、７×１０１０〜８×１０１０、８×１０１０〜９×１０１０、９×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１１×１０１０、１１×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２０×１０１０、２０×１０１０〜２５×１０１０、２５×１０１０〜３０×１０１０、３０×１０１０〜４０×１０１０、４０×１０１０〜５０×１０１０、または５０×１０１０〜１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２５×１０１０、または２５×１０１０〜５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を、個体（例えばヒト）の眼に（例えば、網膜下および／または硝子体内投与によって）投与することを含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり少なくとも約、１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり約１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。
注射中に、針を強膜に垂直に挿入し、眼の中心に向けてもよい。針を、先端が網膜下腔ではなく硝子体腔内で終わるように挿入してもよい。当技術分野において公知のいずれの好適な注射量を使用してもよい。注射後、眼を抗生物質などの消毒薬で処置してもよい。眼をすすいで過剰な消毒薬を除去してもよい。
網膜の構造およびｒＡＡＶ送達の有効性を判定するための手段
網膜が複数の層を有することは公知である。網膜の細胞層としては、内境界膜、神経線維、神経節細胞、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、光受容器、および網膜色素上皮層を挙げることができる。硝子体の最近位にある層は、内境界膜である。この層は、グリアの１類である、ミュラー細胞を含有することができる。神経線維層は、視神経を構成する神経節細胞からの軸索を含有することができる。神経節細胞層は、神経節細胞およびアマクリン細胞を含むことができる。内網状層は、神経節およびアマクリン細胞の樹状突起と双極細胞の軸索の間のシナプスを含有することができる。内顆粒層は、アマクリン、双極および水平細胞の細胞核を含有することができる。外網状層は、水平細胞樹状突起と光受容器細胞突起の間のシナプスを含有することができる。外顆粒層は、光受容器細胞体を含有することができる。外または外部境界膜は、ミュラー細胞先端突起間およびこれらの突起と光受容器細胞内部セグメントの間の細胞結合、例えば接着結合およびデスモソームを含むことができる。杆体錐体層およびヤコブ膜としても公知である、光受容器層は、杆体および錐体を含む光受容細胞を含有することができる。硝子体の最遠位にある網膜層は、色素顆粒を含有する六角形の上皮細胞の層を含むことができる網膜色素上皮（ＲＰＥ）である。
網膜が多くの異なる細胞タイプを含有することも公知である。網膜ニューロンは、光受容器細胞、双極細胞、神経節細胞、アマクリン細胞および水平細胞を含むことができる。光受容器細胞は、光感受性である。それらの細胞は光を感知し、双極細胞および神経節細胞によって視神経にシグナルを伝達することによって応答することができる。光受容器細胞は、一般に微光条件で光を感知する杆体細胞、および一般に色を感知し、より明るい光を知覚する錐体細胞を含みうる。双極細胞は、光受容器細胞からの、およびアマクリンまたは神経節細胞上へのシナプスからの、インプットを受信することができる。神経節細胞
は、アマクリン細胞または水平細胞、および視神経からの軸索から、情報を受け取ることができる。水平細胞は、複数の光受容器からのインプットを統合し、光のレベルを調整することができる。アマクリン細胞は、双極細胞の調節を助け、神経節細胞へのインプットをもたらす、介在ニューロンである。網膜のグリア細胞は、ミュラー細胞、アストログリアおよびミクログリアを含むことができる。
網膜下または硝子体内注射によるｒＡＡＶ送達の有効性を、本明細書に記載のいくつかの基準によってモニターすることができる。例えば、本発明の方法を使用して対象の処置を行った後、本明細書に記載するものを含む１つまたはそれ以上の臨床パラメータによって、例えば、病状の１つまたはそれ以上の兆候または症状の改善および／もしくは安定化ならびに／または進行遅延について、対象を評価してもよい。そのような試験の例は当技術分野において公知であり、客観的測定はもちろん、主観的（例えば、対象によって報告される）測定も含む。例えば、対象の視覚機能に対する処置の有効性を測定するために、次のうちの１つまたはそれ以上を評価してもよい：対象の主観的な見え方の質または中心視機能の向上（例えば、対象の流暢に読む能力および顔を認識する能力の向上）、対象の視覚の動き（例えば、迷路を進むために必要な時間の減少）、視力（例えば、対象のＬｏｇＭＡＲスコアの向上）、微小視野測定（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、暗順応視野測定（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、微細マトリックスマッピング（例えば、対象のｄＢスコアの向上）、ゴールドマン視野測定（例えば、暗点領域（すなわち盲領域）のサイズ低減およびより小さい標的を解像する能力の向上）、フリッカー感度（例えば、ヘルツの向上）、自発蛍光、および電気生理学測定（例えば、ＥＲＧの向上）。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の視覚の動きによって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の視力によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、微小視野測定によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、暗順応視野測定によって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、ＥＲＧによって測定される。いくつかの実施形態において、視覚機能は、対象の主観的な見え方の質によって測定される。
進行性変性視覚機能をもたらす疾患の場合、若年時に対象を処置することは、結果として疾患の進行を減速または静止させることができるばかりでなく、後天性弱視に起因する視覚機能低下を改善または予防することもできる。弱視は、２つのタイプのものであるだろう。たとえ数カ月の月齢まででも誕生時から全暗状態に置かれている非ヒト霊長類および子猫に関する研究において、動物は、後に光に曝露されたときでさえ、網膜によって送信される機能シグナルを有するにもかからわず、機能的に不可逆的に盲目である。この盲目は、神経連絡および皮質の「教育」が、刺激停止に起因して誕生時から発達が停止しているために起こる。この機能が回復することがあるのかどうかは不明である。網膜変性疾患の場合、正常視覚皮質回路網は、最初に「学習された」、または変性が有意な機能障害を生じさせる時点まで、発達上、適切であった。機能障害の眼におけるシグナル伝達の点から、視覚刺激の低下は、結果として脳がシグナルを解釈するまたはその眼を「使用する」ことができなくなる「後天性」または「学習性」機能障害（「後天性弱視」）を生じさせる。「後天性弱視」のこれらの症例では、進行の減速または病状の安定化に加えてより正常な機能の獲得をかつてはもたらすことができた弱視の眼の遺伝子治療の結果として網膜からのシグナル伝達改善があるのかどうかは不明である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢３０歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢２０歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１８歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１５歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１４歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１３歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１２歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢１０歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒト
は、年齢８歳未満である。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、年齢６歳未満である。
一部の眼障害には、あるタイプの細胞の機能向上が別のタイプの細胞の機能を向上させる「ナース細胞」現象がある。例えば、本発明のｒＡＡＶによる中心網膜のＲＰＥへの形質導入は杆体の機能を向上させることができ、そしてまた、向上された杆体機能が、錐体機能向上をもたらす。したがって、あるタイプの細胞の処置は、別のタイプの細胞に関する機能向上をもたらすことができる。
特定のｒＡＡＶベクターおよび組成物の選択は、個々のヒトの病歴ならびに処置される状態および個体の特徴を含むがこれらに限定されない、多数の異なる因子に依存する。そのような特徴の評価および適切な治療レジメンの設計は、最終的には、処方する医師の責任である。
いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、遺伝性眼障害を有するが、臨床兆候または症状をまだ示していない。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、眼障害を有する。いくつかの実施形態において、処置されるヒトは、眼障害の１つまたはそれ以上の兆候または症状を示している。
本発明のシステムおよび方法によって処置することができる目障害の非限定的な例としては、次のものが挙げられる：常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障、後部ぶどう膜炎、全脈絡膜萎縮、およびレーバー遺伝性視神経委縮症。
本発明の組成物（例えば、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つもしくはそれ以上の置換またはアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上の置換を有するＡＡＶカプシドを含む、網膜下または硝子体内送達のためのＡＡＶウイルス粒子）を単独で使用することができ、または眼障害を処置するための１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤と併用することができる。逐次投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間もしくは数日（または、代替的に、数分、数時間もしくは数日未満）単位であることができる。
いくつかの実施形態において、１つまたはそれ以上のさらなる治療剤は、網膜下または硝子体に（例えば、硝子体内投与によって）投与されることがある。さらなる治療剤の非限定的な例としては、ポリペプチド神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ）、ポリペプチド抗血管新生因子（例えば、ｓＦｌｔ、アンジオスタチン、エンドスタチン）抗血管新生性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性核酸、抗血管新生性モルホリノ、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生性モルホリノ、抗血管新生抗体および／または抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）、例えば、ＶＥＧＦに対する抗血管新生抗体および／または抗体断片が挙げられる。
ＣＮＳ送達のための方法
いくつかの実施形態において、本開示のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ８Ｒなどの粒子）の有効量の投与は、投与部位のまたは付近のニューロン（例えば、線条体ニューロン、例えば有棘ニューロン）への形
質導入を生じさせる。いくつかの実施形態では、ニューロンの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または１００％のいずれかより多くが形質導入される。いくつかの実施形態では、ニューロンの約５％〜約１００％、１０％〜約５０％、約１０％〜約３０％、約２５％〜約７５％、約２５％〜約５０％、または約３０％〜約５０％が形質導入される。異種核酸を発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当技術分野において公知である；例えば、免疫組織化学、ＲＮＡ検出（例えば、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ−ｓｅｑ、インサイツハイブリダイゼーションなど）、または高感度緑色蛍光タンパク質等の共発現マーカーの使用を用いて、発現を検出することができる。
本発明のいくつかの実施形態において、前記方法は、哺乳動物、例えばヒト、を処置するために、本開示のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を哺乳動物の脳に投与することを含む。いくつかの実施形態では、組成物を脳内の１カ所またはそれ以上の位置に注射して、少なくともニューロにおいて本開示の異種核酸を発現させる。いくつかの実施形態において、組成物は、脳内の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所または１０カ所より多くの位置のいずれかの１つに注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、線条体に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、背部線条体に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、被殻に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、尾状核に注射される。いくつかの実施形態において、組成物は、被殻におよび尾状核に注射される。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子は、定位固定注射によって個体のＣＮＳに、例えば線条体に投与される。いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子は、対流強化送達（ＣＥＤ）；例えば、線条体へのＣＥＤ、によって個体のＣＮＳに投与される。
ｒＡＡＶ粒子の投与を様々な経路によって行うことができる。いくつかの実施形態において、投与は、直接脊髄注射、および／または脳内投与を含む。いくつかの実施形態において、投与は、大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、脳を覆っている髄膜、硬膜、くも膜、脳軟膜、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）、小脳の深部小脳核、大脳の脳室系、くも膜下腔、線条体、皮質、中隔、視床、視床下部、および脳実質から選択される部位に対するものである。いくつかの実施形態において、投与は、少なくとも１つの大脳側脳室への側脳室内注射を含む。いくつかの実施形態において、投与は、頸部、胸部および／または腰部におけるくも髄腔内注射を含む。いくつかの実施形態において、投与は、線条体内注射を含む。いくつかの実施形態において、投与は、視床内注射を含む。これらの投与経路に好適な様々な技術およびデバイス、例えばＣＥＤおよび／または定位固定注射、を本明細書に記載する。
いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子は、脳の一方の半球に投与される。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子は、脳の両方の半球に投与される。
いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子は、１カ所より多くの位置に同時にまたは逐次的に投与される。いくつかの実施形態において、組換えウイルス粒子の複数回の注射は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間
、６時間、９時間、１２時間または２４時間を超えて間隔を空けない。
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＮＳの障害を処置するための本開示のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子を含む医薬組成物の有効量を投与することによってＣＮＳの障害を有するヒトを処置する方法を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１つまたはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。
一般に本発明の組成物約１μＬ〜約１ｍＬ（例えば、組成物約１００μＬ〜約５００μＬ）を送達することができる。本発明のいくつかの実施形態において、線条体に注射される、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の容量は、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬのいずれか１つもしくはそれより多いか、またはそれらの間の任意の量である。
いくつかの実施形態において、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の第１の容量は脳の第１の領域に注射され、その変異型ｒＡＡＶ粒子の第２の容量は脳の第２の領域に注射される。例えば、いくつかの実施形態において、変異型ｒＡＡＶ粒子の第１の量は尾状核に注射され、組成物の第２の容量は被殻に注射される。いくつかの実施形態において、変異型ｒＡＡＶ粒子の１Ｘ容量は尾状核に注射され、変異型ｒＡＡＶ粒子の１．５Ｘ、２Ｘ、２．５Ｘ、３Ｘ、３．５Ｘまたは４Ｘ容量は被殻に注射され、ここでのＸは、約１μｌ、２μｌ、３μｌ、４μｌ、５μｌ、６μｌ、７μｌ、８μｌ、９μｌ、１０μｌ、１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、５０μｌ、７５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌもしくは１ｍＬのいずれか１つもしくはそれより多い容量であるか、またはそれらの間の任意の量である。
本発明の組成物（例えば、本開示のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子）を単独で使用することができ、またはＣＮＳの障害（例えば、ＨＤ）を処置するための１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤と併用することができる。逐次投与間の間隔は、少なくとも数分、数時間もしくは数日（または、代替的に、数分、数時間もしくは数日未満）単位であることができる。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子であって、異種核酸をコードするベクターを含む組換えウイルス粒子の有効量を、ＣＮＳに投与することを含む。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２、または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜６×１０１２、６×１０１２〜７×１０１２、７×１０１２〜８×１０１２、８×１０１２〜９×１０１２、９×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜１１×１０１２、１１×１０１２〜１５×１０１２、１５×１０１２〜２０×１０１２、２０×１０１２〜２５×１０１２、２５×１０１２〜３０×１０１２、３０×１０１２〜５０×１０１２、または５０×１０１２〜１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形
態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０１２〜１０×１０１２、１０×１０１２〜２５×１０１２、または２５×１０１２〜５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも約、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９、または５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜６×１０９、６×１０９〜７×１０９、７×１０９〜８×１０９、８×１０９〜９×１０９、９×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１１×１０９、１１×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２０×１０９、２０×１０９〜２５×１０９、２５×１０９〜３０×１０９、３０×１０９〜５０×１０９、または５０×１０９〜１００×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、約５×１０９〜１０×１０９、１０×１０９〜１５×１０９、１５×１０９〜２５×１０９、または２５×１０９〜５０×１０９形質導入単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０、４０×１０１０、または５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜６×１０１０、６×１０１０〜７×１０１０、７×１０１０〜８×１０１０、８×１０１０〜９×１０１０、９×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１１×１０１０、１１×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２０×１０１０、２０×１０１０〜２５×１０１０、２５×１０１０〜３０×１０１０、３０×１０１０〜４０×１０１０、４０×１０１０〜５０×１０１０、または５０×１０１０〜１００×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。いくつかの実施形態において、組成物のウイルス力価は、少なくとも、約５×１０１０〜１０×１０１０、１０×１０１０〜１５×１０１０、１５×１０１０〜２５×１０１０、または２５×１０１０〜５０×１０１０感染単位／ｍＬのいずれかである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を、個体（例えばヒト）のＣＮＳに投与することを含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり少なくとも約、１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、体重のｋｇ当たり約１×１０８〜約１×１０１３ゲノムコピーのいずれかである。
いくつかの実施形態において、前記方法は、個体に対するヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子の有効量を、個体（例えばヒト）のＣＮＳに投与することを含む。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、少なくとも約、１×１０９〜約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。いくつかの実施形態において、個体に投与されるウイルス粒子の総量は、約１×１０９〜約１×１０１４ゲノムコピーのいずれかである。
Ｖ．発現構築物
いくつかの態様において、本発明は、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達する方法であって、該ｒＡＡＶベクターは、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶカプシド（例えば、ｒＡＡＶ２カプシド、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドなど）に封入されている、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のＣＮＳの障害を処置する方法であって、該個
体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子を含む組成物の送達を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸（例えば、導入遺伝子）は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターおよびＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧプロモーター；Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１９９１、１０８（２）：１９３〜９頁）および伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター（Ｋｉｍら、Ｇｅｎｅ、１９９０、９１（２）：２１７〜２３頁およびＧｕｏら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９６、３（９）：８０２〜１０頁）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、眼の細胞において異種核酸を発現する能力がある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光受容器細胞またはＲＰＥにおいて異種核酸を発現する能力がある。実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、例えば、ヒトＲＫプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、オプシンプロモーター、例えば、ヒトオプシンプロモーターまたはマウスオプシンプロモーターである。
本発明は、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶウイルス粒子へのパッケージングのために治療用ポリペプチドおよび／または核酸をコードする１つまたはそれ以上の核酸配列を導入するための組換えウイルスゲノムの使用を企図している。組換えウイルスゲノムとしては、治療用ポリペプチドおよび／または核酸の発現を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、ＩＴＲ、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリＡシグナル、および／または複製起点を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクター、例えば、組換え自己相補性（本明細書では用語「自己相補型」と同義で用いることがある）ゲノムを含むものである。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子、および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用方法は、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号；同第７，４６５，５８３号；同第７，７８５，８８８号；同第７，７９０，１５４号；同第７，８４６，７２９号；同第８，０９３，０５４号；および同第８，３６１，４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．ら、（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５〜２１１１頁に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分相補性配列（例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することになる。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる。
いくつかの実施形態において、第１の異種核酸配列と第２の異種核酸配列は、突然変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結されている。いくつかの実施形態において、ＩＴＲは、ポリヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３’（配列番号８）を含む。突然変異ＩＴＲは、末端切断配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製中に、ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムを突然変異ＩＴＲで切断しないことになり、したがって、５’から３’の順序で以下のものを含む組換えウイルスゲノムは、ウイルスカプシドにパッケージングされることになる：ＡＡＶ ＩＴＲ、調節配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ヌクレオチドに対して逆向きの第２のポリヌクレオチド配列、そして第３のＡＡＶ ＩＴＲ。
ＶＩ．ウイルス粒子およびウイルス粒子の生産方法
ｒＡＡＶウイルス粒子
いくつかの態様において、本発明は、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達する方法であって、該ｒＡＡＶベクターは、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶカプシド（例えば、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶｒｈ８Ｒなど）に封入されている、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子の送達に関する方法およびキットを提供する。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接している異種導入遺伝子を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子のカプシドに封入されている。ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質も含む。いくつかの実施形態において、核酸は、転写方向に成分が作動可能に連結されている目的（例えば、異種導入遺伝子）のコード配列、転写開始配列と転写終結配列とを含む制御配列を含み、それによって発現カセットを形成する。
発現カセットは、その５’および３’末端に少なくとも１つの機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」は、該ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングのために意図した通りに機能することを意味する。Ｄａｖｉｄｓｏｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７（７）３４２８〜３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：７０３４〜４０頁；およびＰｅｃｈａｎら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２００９、１６：１０〜１６頁を参照されたい。これらの参考文献のすべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。本発明のいくつかの態様を実施するために、組換えベクターは、カプシド封入に不可欠なＡＡＶの配列のすべておよびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を少なくとも含む。本発明のベクターに使用するためのＡＡＶ ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要がなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１９９４、５：７９３〜８０１頁に記載の通り）、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって改変されていてもよく、またはいくつかのＡＡＶ血清型のいずれに由来するものであってもよい。ＡＡＶの４０より多くの血清型が今では公知であり、新たな血清型、および既存の血清型の変異体が同定され続けている。Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００２、９９（１８）：１１８５４〜６頁；Ｇａｏら、ＰＮＡＳ、２００３、１００（１０）：６０８１〜６頁；およびＢｏｓｓｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２００３、７７（１２）：６７９９〜８１０頁を参照されたい。
任意のＡＡＶ血清型の使用が本発明の範囲内で考えられる。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ
６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶ ＩＴＲなどであるＡＡＶ ＩＴＲを限定ではないが含む、ＡＡＶ血清型に由来するベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶなどであるＡＡＶ ＩＴＲのＩＲを含む。特定の実施形態において、ＡＡＶ中の核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。上で説明したように、ｒＡＡＶ粒子は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むカプシドをさらに含むことがある。
いくつかの実施形態において、ベクターは、スタッファー核酸を含むことがある。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸は、緑色蛍光タンパク質をコードすることがある。いくつかの実施形態において、スタッファー核酸は、プロモーターと、ＲＮＡｉをコードする核酸との間に位置することがある。
異なるＡＡＶ血清型を使用して、特定の標的細胞への形質導入を最適化する、または特定の標的組織（例えば、ＣＮＳ組織）内の特定の細胞タイプを標的化する。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本発明のＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むことができ、またはＡＡＶ２カプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲを含むことができる。ｒＡＡＶ粒子の生産のためのＡＡＶ血清型のあらゆる組み合わせを、各々の組み合わせを本明細書においてはっきりと述べたかのごとく、本明細書において提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶ２カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明のＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。
ＡＡＶ粒子の生産
トランスフェクション、安定した細胞株生産、ならびにアデノウイルス−ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス−ＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０〜８７８９頁）およびバキュロウイルス−ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス生産系をはじめとする、ｒＡＡＶベクターを生産するための非常に多くの方法が当技術分野において公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の生産のためのｒＡＡＶ生産培養はすべて次のものを必要とする；１）例えば、ヒト由来細胞株、例えばヒーラ、Ａ５４９もしくは２９３細胞、またはバキュロウイルス生産系の場合は昆虫由来細胞株、例えばＳＦ−９を含む、安定した宿主細胞；２）野生型もしくは突然変異型アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子および遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している導入遺伝子（例えば、治療用導入遺伝子）；および５）ｒＡＡＶ生産を支援する好適な培地および培地成分。当技術分野において公知の好適な培地をｒＡＡＶベクターの生産に使用してもよい。これらの培地としては、限定ではないが、変性イーグル培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ変性エーグル培地（ＤＭＥＭ）、特注配合物、例えば、米国特許第６，５６６，１１８号に記載されているもの、および米国特許６，７２３，５５１に記載されているようなＳＦ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産されている培地が挙げられ、前記特許文献の各々は、その全体が、特に
、組換えＡＡＶベクターの生産に使用するための特注培地配合物に関して、参照によって本明細書に組み入れられている。
ｒＡＡＶ粒子は、当技術分野において公知の方法を用いて生産することができる。例えば、米国特許６，５６６，１１８号；同第６，９８９，２６４号；および同第６，９９５，００６号を参照されたい。本発明を実施する場合、ｒＡＡＶ粒子を生産する宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物細胞および酵母が挙げられる。宿主細胞は、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子が宿主細胞内に安定的に維持されるパッケージング細胞、またはＡＡＶベクターゲノムが安定的に維持されるプロデューサー細胞である場合もある。例示的パッケージングおよびプロデューサー細胞は、２９３、Ａ５４９またはヒーラ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当技術分野において公知の標準的技術を用いてを精製され、製剤化される。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、トリプルトランスフェクション法、例えば、下で提供する例示的トリプルトランスフェクション法によって生産されることがある。簡単に言うと、ｒｅｐ遺伝子およびカプシド遺伝子を含有するプラスミドをヘルパーアデノウイルスプラスミドと共に細胞株（例えば、ＨＥＫ−２９３細胞）に（例えば、リン酸カルシウム法を用いて）トランスフェクトすることができ、ウイルスを採取し、場合により精製することができる。
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、プロデューサー細胞株法、例えば、下で提供する例示的プロデューサー細胞株法（Ｍａｒｔｉｎら（２０１３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２５３〜２６９頁において言及されているものも参照されたい）によって生産されることもある。簡単に言うと、細胞株（例えば、ヒーラ細胞）に、ｒｅｐ遺伝子、カプシド遺伝子およびプロモーター−導入遺伝子配列を含むプラスミドを安定的にトランスフェクトすることができる。細胞株をスクリーニングして、ｒＡＡＶ生産のためのリードクローンを選択することができ、次いでそれを生産バイオリアクターに拡大し、ヘルパーとしてのアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルス）に感染させてｒＡＡＶ生産を開始させることができる。その後、ウイルスを回収することができ、アデノウイルスを（例えば熱によって）不活性化することができ、および／または除去することができ、ｒＡＡＶ粒子を精製することができる。
いくつかの態様では、本明細書に開示の任意のｒＡＡＶ粒子を生産する方法を提供し、この方法は、（ａ）ｒＡＡＶ粒子が生産される条件下で宿主細胞を培養する工程であって、該宿主細胞は、（ｉ）１つまたはそれ以上のＡＡＶパッケージ遺伝子［ここで、該ＡＡＶパッケージング遺伝子の各々は、ＡＡＶ複製および／またはカプシド封入タンパク質をコードする］と；（ｉｉ）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲが隣接している本明細書に記載の治療用ポリペプチドおよび／または核酸をコードする核酸を含むｒＡＡＶプロベクターと、（ｉｉｉ）ＡＡＶヘルパー機能とを含む、前記工程；および（ｂ）前記宿主細胞によって生産されたｒＡＡＶ粒子を回収する工程を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ ＤＪ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶまたはマウスＡＡＶなどであるＡＡＶ ＩＴＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記カプシド封入タンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、カプシド封入タンパク質は、ＡＡＶ２カプシド封入タンパク質である。いくつかの実施形態において、カプシド封入タンパク質は、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド封入タンパク質である。
本発明の好適なｒＡＡＶ生産培養培地に、血清または血清由来組換えタンパク質を０．５％〜２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで補足してもよい。あるいは、当技術分野において公知であるように、ｒＡＡＶベクターを、動物由来産物を含有しない培地と言われることもある無血清条件で生産してもよい。ｒＡＡＶベクターの生産を支援するように設計された商用または特注培地に、限定ではないがグルコース、ビタミン、アミノ酸および／または増殖因子を含む、当技術分野において公知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分を補足して、生産培養物中のｒＡＡＶの力価を増大させることもできることは、当業者には理解されるだろう。
ｒＡＡＶ生産培養物を、用いる特定の宿主細胞に好適な様々な条件下（広い温度範囲にわたって、様々な時間長にわたってなど）で増殖させることができる。当技術分野において公知であるように、ｒＡＡＶ生産培養物は、例えばローラーボトル、中空繊維フィルター、マイクロキャリアおよび充填層または流動層バイオリアクターなどの、好適な付着依存性容器で培養することができる付着依存性培養物を含む。ｒＡＡＶベクター生産培養物は、例えばスピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクターおよび使い捨てシステム（例えば、Ｗａｖｅバッグシステム）をはじめとする様々な方法で培養することができる懸濁適応宿主細胞、例えばヒーラ、２９３およびＳＦ−９細胞も含むことがある。
本発明のｒＡＡＶベクター粒子をｒＡＡＶ生産培養物から、該生産培養物の宿主細胞の溶解によって回収してもよいし、または該生産培養物からの使用済み培地の回収によって回収してもよいが、ただし、米国特許第６，５６６，１１８号においてより十分に説明されているような、インタクト細胞から培地にｒＡＡＶ粒子を放出させる当技術分野において公知の条件下で、細胞を培養することを条件とする。細胞を溶解する好適な方法も当技術分野において公知であり、例えば、多重凍結／融解サイクル、超音波処理、顕微溶液化、ならびに化学物質、例えば界面活性剤／プロテアーゼ、での処理を含む。
さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を精製する。用語「精製された」は、本明細書で用いる場合、ｒＡＡＶ粒子が天然に存在するまたは元はそこから調製された場所に存在することもある他の成分の少なくとも一部がないｒＡＡＶ粒子の製品を含む。したがって、例えば、ソース混合物、例えば培養溶解物または生産培養上清、からｒＡＡＶ粒子を濃縮する精製技術を用いて、単離されたｒＡＡＶ粒子を製造してもよい。濃縮は、様々な方法で、例えば、溶液中に存在するＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）もしくはゲノムコピー（ｇｃ）の比率よって、または感染力よって、測定することができ、またはソース混合物中に存在する第２の、干渉する可能性のある物質、例えば、不純物［生産培養不純物もしくは工程内不純物（ヘルパーウイルス、培地成分などを含む）を含む］に関して測定することができる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生産培養回収物を清澄化して、宿主細胞片を除去する。いくつかの実施形態において、生産培養回収物は、例えば、グレードＤＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルター、グレードＡ１ＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ ＨＣ Ｐｏｄフィルター、および０．２μｍフィルターＯｐｔｉｃａｐ ＸＬ１０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルターを含む、一連のデプスフィルターによる濾過によって清澄化される。当技術分野において公知の様々な他の標準的技術、例えば、遠心分離、または当技術分野において公知の０．２μｍまたはそれより大きい孔径の任意の酢酸セルロースフィルターによる濾過によって、清澄化を果たすこともできる。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ生産培養回収物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）でさらに処理して、生産培養物中に存在する一切の高分子量ＤＮＡを消化する。いくつかの実施形態において、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、最終濃度１〜２
．５単位／ｍＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を周囲温度〜３７℃の範囲の温度で３０分〜数時間の期間を含む、当技術分野において公知の標準条件下で行われる。
ｒＡＡＶ粒子を、次の精製工程の１つまたはそれ以上を用いて単離または精製してもよい：平衡遠心分離；フロースルー陰イオン交換濾過；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノ濾過；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらの工程を単独で用いてもよく、様々な組み合わせで用いてもよく、または異なる順序で用いてもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、下記の順序ですべての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、Ｘｉａｏら、（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４〜２２３２頁；米国特許第６，９８９，２６４号および同第８，１３７，９４８号；ならびにＷＯ２０１０／１４８１４３において見つけられる。
治療用ポリペプチドおよび／または治療用核酸をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶ粒子であって、ＨＳＰＧと相互作用するアミノ酸の１つまたはそれ以上の置換を含むｒＡＡＶカプシドを含む前記ｒＡＡＶ粒子、ならびに医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も本明細書において提供する。前記医薬組成物は、本明細書に記載する任意の投与方式；例えば網膜下投与によるもの、に好適であるだろう。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するｒＡＡＶと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物は、ヒトへの投与に好適である。そのような担体は、当技術分野において周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載するｒＡＡＶと医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物は、眼注射に好適である。そのような医薬的に許容される担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油などを含む）であることができる。食塩溶液ならびにデキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール水溶液も、特に注射用溶液のために、液体担体として用いることができる。医薬組成物は、さらなる成分、例えば、保存薬、緩衝剤、等張化剤、抗酸化物質および安定剤、非イオン性湿潤または清澄化剤、増粘剤などをさらに含むことがある。本明細書に記載する医薬組成物を単一単位剤形でまたは複数投与量形態で包装することができる。前記組成物は、一般に、無菌かつ実質的に等張性の溶液として製剤化される。
ＶＩＩ．システムおよびキット
本明細書に記載のｒＡＡＶ組成物を、本明細書に記載の発明の方法の１つで使用するために設計されたシステム内に含めてもよい。
網膜下送達
いくつかの実施形態において、本発明は、個体の眼へのベクターの網膜下送達のためのシステムであって、ａ）ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物［ここで、ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ｉｉ）該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含む］；およびｂ）該ｒＡＡＶの網膜送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。
一般に、前記システムは、２７〜４５ゲージである細径カニューレと、１本またはそれ以上の（例えば、１、２、３、４またはそれ以上の）注射器と、本発明の方法での使用に好適な１つまたはそれ以上（例えば、１、２、３、４つまたはそれ以上）の流体とを含む。
細径カニューレは、網膜下腔に注射されるベクター懸濁液および／または他の流体の網膜下注射に好適である。いくつかの実施形態において、カニューレは２７〜４５ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは３５〜４１ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは４０または４１ゲージである。いくつかの実施形態において、細径カニューレは４１ゲージである。前記カニューレは、いずれの好適なタイプのカニューレであってもよく、例えば、ｄｅ−Ｊｕａｎ（登録商標）カニューレまたはＥａｇｌｅ（登録商標）カニューレであってもよい。
注射器は、いずれの好適な注射器であってもよいが、ただし、流体送達のためのカニューレへの接続が可能であることを条件とする。いくつかの実施形態において、注射器は、Ａｃｃｕｒｕｓ（登録商標）システム注射器である。いくつかの実施形態において、システムは、１本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、２本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、３本の注射器を有する。いくつかの実施形態において、システムは、４本またはそれ以上の注射器を有する。
システムは、例えばフットペダルによって作動させることができる、自動インジェクションポンプをさらに含むことがある。
本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量を各々が含む１つまたはそれ以上の流体、最初のブレブを形成するための１つまたはそれ以上の流体（例えば、食塩水または他の適切な流体）、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。
本発明の方法での使用に好適な流体としては、本明細書に記載するもの、例えば、本明細書に記載の１つまたはそれ以上のベクターの有効量を各々含む１つまたはそれ以上の流体、最初のブレブを形成するための１つまたはそれ以上の流体（例えば、食塩水または他の適切な流体）、および１つまたはそれ以上の治療剤を含む１つまたはそれ以上の流体が挙げられる。
いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８ｍｌより大きい。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約０．９ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超〜約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超〜約２．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超〜約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超〜約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．８超〜約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９〜約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９〜約２．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約
０．９〜約２．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９〜約１．５ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約０．９〜約１．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約１．０〜約３．０ｍｌである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約１．０〜約２．０ｍｌである。
最初のブレブを形成するための流体は、例えば、約０．１〜約０．５ｍｌであることがある。いくつかの実施形態において、システム内のすべての流体の合計容量は、約０．５〜約３．０ｍｌである。
いくつかの実施形態において、システムは、単一の流体（例えば、ベクターの有効量を含む流体）を含む。いくつかの実施形態において、システムは、２つの流体を含む。いくつかの実施形態において、システムは、３つの流体を含む。いくつかの実施形態において、システムは、４つまたはそれ以上の流体を含む。
本発明のシステムは、さらにキットに包装されることがあり、該キットは、使用説明書をさらに含むことがある。いくつかの実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物の網膜下送達のためのデバイスをさらに含む。いくつかの実施形態において、使用説明書は、本明細書に記載する方法の１つに準じた説明書を含む。いくつかの実施形態において、使用説明書は、ｒＡＡＶ粒子のＨＳＰＧへの結合を改変、低減または除去する１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有するカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の網膜下送達のための説明書を含む。
ＣＮＳ送達
本発明は、個体のＣＮＳに異種核酸を送達するためのキットであって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、（ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および（ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記キットを提供する。個体のＣＮＳ障害を処置するためのキットであって、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を含み、該ｒＡＡＶ粒子は、ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、およびｂ）ＣＮＳ障害を処置するための異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記キットを本明細書においてさらに提供する。
キットは、本発明のいずれのｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子組成物を含んでもよい。例えば、キットは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換（例えば、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとのｒＡＡＶ粒子の結合を低減させる１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、例えば、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８における置換）を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを有する、ｒＡＡＶ粒子を含むことがある。
いくつかの実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物のＣＮＳ送達のためのデバイスをさらに含む。ＣＮＳ送達用（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の送達用）のデバイスは、当技術分野において公知であり、ポンプ（例えば、下で説明する、浸透圧および／または注入ポンプ）および注射デバイス（例えば、カテーテル、カニューレなど）
を用いることがある。場合により、イメージング技術を用いて、注射デバイスを誘導してもよく、および／または注入剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物）の送達をモニターしてもよい。ＣＮＳ送達は、定位固定注射による送達または対流強化送達（ＣＥＤ）を含むことがある。注射デバイスを対象のＣＮＳ組織に挿入することもある。当業者には、標的ＣＮＳ組織内の注射デバイスの位置決めに好適な座標を決定することが可能である。いくつかの実施形態では、例えば、対象の脳のＣＴおよび／またはＭＲＩイメージングによって得られる解剖学的マップによって位置決めを遂行して、標的ＣＮＳ組織に注射デバイスを誘導する。
いくつかの実施形態では、術中磁気共鳴イメージング（ｉＭＲＩ）および／または送達のリアルタイムイメージングを行うこともある。いくつかの実施形態では、デバイスを使用して、本発明の方法によってｒＡＡＶ粒子を哺乳動物に投与する。ｉＭＲＩは、手術中の患者のＭＲＩベースのイメージング技術として当技術分野において公知であり、（例えば、ｒＡＡＶ粒子をＣＮＳに送達するための）手術手技成功の確認に役立ち、組織の他の部分を損傷させるリスクを低減させる（さらな説明については、例えば、Ｆｉａｎｄａｃａら（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ ４７ 補遺２：Ｔ２７〜３５頁を参照されたい）。いくつかの実施形態では、注入剤の組織分布をリアルタイムでモニターするために追跡剤（例えば、ＭＲＩ造影補助剤）を注入剤（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物）と共送達することもある。例えば、Ｆｉａｎｄａｃａら、（２００９）Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ
４７ 補遺２：Ｔ２７〜３５頁；米国特許登録前出願公開第２００７／０２５９０３１号；および米国特許第７，９２２，９９９を参照されたい。追跡剤の使用によって送達中止の情報を得ることができる。当技術分野において公知の他の追跡およびイメージング手段を用いて注入剤分布を追跡調査してもよい。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の送達のための当技術分野において公知のデバイスおよび方法を用いて標準的定位固定（本明細書では用語「定位」を同義で用いることがある）注射によってｒＡＡＶ粒子を投与することがある。一般に、これらの方法は、注射デバイス、送達の標的となる組織領域を一連の座標（例えば、左右、背腹、および前後軸に沿ったパラメータ）に翻訳するための計画システム、および計画された座標に従って定位固定局在化するためのデバイス（例えば、プローブと、座標系との整列させる際に頭を所定の位置に固定するための構造とを場合により含む、定位固定デバイス）を使用することがある。ＭＲＩ誘導手術および／または定位固定注射に有用であるだろうシステムの非限定的な例は、ＣｌｅａｒＰｏｉｎｔ（登録商標）システム（ＭＲＩ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）である。
ＣＮＳへのｒＡＡＶ粒子送達の別の例および非限定的方法は、対流強化送達（ＣＥＤ）である。本明細書で用いる場合、用語「対流強化送達（ＣＥＤ）」は、静水圧が対流分布をもたらす速度での注入によるＣＮＳへの治療剤の送達を指すことができる。いくつかの実施形態において、注入は、０．５μＬ／分より高い速度で行われる。しかし、頭蓋内圧が脳組織を傷つけないように好適なレベルで維持されるような任意の好適な流速を用いることができる。例えば、好適なカテーテルまたはカニューレ（例えば、段設計の逆流しないカニューレ）を使用することにより、標的ＣＮＳ組織の少なくとも直近にカニューレの先端を位置決めする（例えば、該先端をＣＮＳ組織に挿入する）ことによって、ＣＥＤを遂行してもよい。カニューレを位置決めした後、ポンプに接続し、このポンプによって、治療剤はカニューレ先端を通って標的ＣＮＳ組織に送達される。注入の間、カニューレの先端からの圧力勾配が維持される。いくつかの実施形態では、イメージング法、例えば、術中ＭＲＩ（ｉＭＲＩ）または別のリアルタイムＭＲＩ技術により検出可能な追跡剤によって注入をモニターすることもある。
ＣＥＤは、間質液の静水圧に打ち勝つ圧力下でのＣＮＳへの注入剤（例えば、ｒＡＡＶ
粒子を含有する組成物）のポンピングに基づく。これは、注入剤をＣＮＳ周囲脈管構造と接触させ、該ＣＮＳ周囲脈管構造が同様にポンプを利用して、注入剤を対流によって分配し、その送達度を向上させる（例えば、Ｈａｄａｃｚｅｋら、（２００６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１７：２９１〜３０２頁；Ｂａｎｋｉｅｗｉｃｚら、（２０００）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６４：２〜１４頁；Ｓａｎｆｔｎｅｒ，ＬＭら、（２００５）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９４（２）：４７６〜４８３頁；Ｆｏｒｓａｙｅｔｈ，ＪＲら（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４（４）：５７１〜５７７頁；米国特許第６，９５３，５７５号；米国特許出願公開第２００２／０１４１９８０号；米国特許出願公開第２００７／０２５９０３１号；およびＷＯ２０１０／０８８５６０を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、浸透圧ポンプおよび／または注入ポンプを含む。浸透圧および／または注入ポンプは（例えば、ＡＬＺＥＴ（登録商標）Ｃｏｒｐ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｒｐ．、ＡＬＺＡ Ｉｎｃ．、在Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａから）市販されている。ポンプシステムは、埋め込み可能であることもある。例示的ポンプシステムは、例えば、米国特許第７，３５１，２３９号；同第７，３４１，５７７号；同第６，０４２，５７９号；同第５，７３５，８１５号；および同第４，６９２，１４７号において見つけることができる。逆流防止および段付きカニューレを含む、ＣＥＤ用の例示的デバイスは、ＷＯ９９／６１０６６およびＷＯ２００６／０４２０９０において見つけることができ、これらの特許文献は、それら全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
いくつかの実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、逆流防止カニューレ（例えば、逆流しない段設計カニューレ）を含む。さらなる説明および例示的逆流防止カニューレは、例えば、Ｋｒａｕｚｅら、（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４６５：３４９〜３６２頁；米国特許登録前出願公開第２００６／０１３５９４５号；米国特許登録前出願公開第２００７／００８８２９５号；およびＰＣＴ／ＵＳ０８／６４０１１において見つけることができる。いくつかの実施形態では、１本のカニューレしか使用しない。他の実施形態では、１本より多くのカニューレを使用する。いくつかの実施形態において、対流強化送達のためのデバイスは、カニューレを通して標的組織に注入剤を制御された速度で流入させるのに十分な圧力を生じさせるポンプと連結された逆流防止カニューレを含む。頭蓋内圧が脳組織を傷つけないように好適なレベルで維持されるような任意の好適な流速を用いることができる。
いくつかの実施形態では、促進剤の使用によって注入剤の浸透がさらに増される。促進剤は、標的組織（例えば、ＣＮＳ標的組織）への注入剤の送達をさらに促進することができる。促進剤の非限定的な例は、低分子量ヘパリンである（例えば、米国特許第７，９２２，９９９号を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、キットは、ｒＡＡＶ粒子の組成物のＣＮＳ送達のための説明書をさらに含む。本明細書に記載するキットは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および本明細書に記載するいずれかの方法を行うための説明書を伴う添付文書をはじめとする、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含むことがある。好適な包装材料も含むことがあり、該包装材料は、例えばバイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、可撓性包装（例えば、密封マイラーまたはプラスチックバッグ）などをはじめとする、当技術分野において公知のいずれの包装材料であってもよい。これらの製造物品は、さらに滅菌および／または密封されることもある。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載する方法および／またはｒＡＡＶ粒子のいずれかを使用して、本明細書に記載するＣＮＳの障害を処置するための説明書を含む。キットは、個体のＣＮＳへの注射に好適な医薬的に許容される担体、ならびに次のものの１つまたはそれ以上を含むことがある：緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、
注射器、および個体のＣＮＳへの注射を行うための説明書を伴う添付文書。
賦形剤
網膜下および／またはＣＮＳ送達に関するいくつかの実施形態において、キットは、緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤をさらに含有する。当技術分野において周知であるように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、ｐＨ緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なＴＷＥＥＮ化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手することができる。
網膜下および／またはＣＮＳ送達に関するいくつかの実施形態において、医薬的に許容される賦形剤は、医薬的に許容される担体を含むことがある。そのような医薬的に許容される担体は、滅菌液、例えば、水および油（石油、動物、植物または合成由来のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油などを含む）であることができる。食塩溶液ならびにデキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびグリセロール溶液も、特に注射用溶液のための、液体担体として用いることができる。さらなる成分、例えば、保存薬、緩衝剤、等張化剤、抗酸化物質および安定剤、非イオン性湿潤または清澄化剤、増粘剤なども使用されることがある。本明細書に記載するキットを単一単位剤形でまたは複数投与量形態で包装することができる。キットの内容物は、一般に、無菌かつ実質的に等張性の溶液として製剤化される。
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに十分に理解されるであろう。しかし、これらの実施例を、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。本明細書に記載する実施例および実施形態が単に説明を目的としたものであること、ならびに様々な修飾または変更が、それらの実施例および実施形態を踏まえて当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に記載の範囲に含まれるはずであることが理解される。
ＨＳＰＧ結合に必要なアルギニン残基の突然変異は培養細胞株へのＡＡＶ２媒介形質導入を減少させる
ＡＡＶ２遺伝子治療ベクターを眼の適応症の治験で現在使用中である。これらのベクターは、マウスおよび非ヒト霊長類において網膜神経節細胞およびミュラー細胞への形質導入を生じさせる結果となる硝子体内投与経路によって送達することができ、または網膜色素性上皮細胞および光受容器細胞を標的にする網膜下投与経路によって投与することができる。ＡＡＶの血清型によって、感染に使用される細胞表面受容体および共受容体が異なる。ＡＡＶ２の初代細胞表面受容体がヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）であることは公知である（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．およびＳａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．（１
９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（２）：１４３８〜４５頁）。ＡＡＶ２によって網膜が形質導入されるメカニズムを理解することは、ＡＡＶ遺伝子治療ベクターのさらなる開発のために重要である。
網膜へのＡＡＶ２形質導入におけるＨＳＰＧ結合の役割を調査するために、ＨＳＰＧ結合に必要であることが公知であるアルギニン残基の突然変異を有するカプシドタンパク質を用いてＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ）を生成した。これらのベクターは、野生型ＡＡＶ２と比較して、培養中の２９３およびヒーラ細胞への形質導入を有意に低減させる結果となった。驚くべきことに、マウスの眼に網膜下送達したＡＡＶ２ＨＢＫＯベクターは、野生型ＡＡＶ２と比較して形質導入の２−ｌｏｇの増加をもたらした。しかし、ＡＡＶ２ＨＢＫＯベクターを硝子体内送達したとき、明らかな形質導入はなかった。これらの結果は、ＨＳＰＧ結合に必要なアミノ酸の突然変異にはＡＡＶ２粒子の硝子体内注射後の形質導入に対して網膜下注射後の形質導入効率に逆の効果があることを示す。
方法
ＡＡＶ２アルギニン突然変異型プラスミドの構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＡＡＶ２ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド、ｐＩＭ４５ＢＤ、を突然変異させた。アルギニン５８５および５８８のアラニンへの変化を導入するためのＰＣＲ突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
ｒＡＡＶベクターの生成
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または可溶性ＶＥＧＦ受容体ハイブリッド（ｓＦＬＴ０２）を発現する組換えＡＡＶベクターを、ｐＩＭ４５ＢＤまたはｐＩＭ４５ＢＤＲ５８５Ａ／Ｒ５８８Ａ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドおよびｐＡｄＨｅｌｐｅｒを使用する２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって作製した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）またはヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ＲＫ）いずれかの制御下にあった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイ
２９３またはヒーラ細胞を２４ウェルプレートにプレーティングした（１〜２×１０５細胞／ウェル）。プレーティングの２４時間後、細胞を１×１０３ｖｇ／細胞（＋）Ａｄ５ｔｓ１４９に感染させた。感染４８時間後、ＥＧＦＰ蛍光またはＥＬＩＳＡいずれかによって形質導入効率を測定して、培地中のｓＦＬＴ０２を定量した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによるヒト可溶性ＶＥＧＦ Ｒ１ ＥＬＩＳＡ）。
動物
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得られる成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入し、Ｇｅｎｚｙｍｅのビバリウムで維持した。研究継続期間中、動物が食餌および水に自由に近づけるようにした。すべての手順は、施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画のもとで行った。
硝子体内注射
酸素８００ｍＬ／分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う３．５％イソルフランの使用によって、非活動状態を誘導し、維持した。３３ゲージ斜角針が取り付けられたＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して、被験物質１マイクロリットルを硝子体液に注射した。強膜を通して縁のおおよそ２ｍｍ下に針を誘導し、硝子体房に注意深く進ませて水晶体との接触を回避した。被験物質を１〜２秒間にわたって送達した。注射後、針を、抜き取る前におおよそ５秒間、適所に保持した
。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
網膜下注射
散瞳および調節麻痺をトロピカミド（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）の局所適用で誘導した。酸素８００ｍＬ／分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う３．５％イソルフランの使用によって、非活動状態を誘導し、維持した。リング状の先端を有する鉗子（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用して眼を固定し、３０ゲージ針を使用して強膜内の強膜の縁のおおよそ２ｍｍ下を予備切開した。切開部を通して３３ゲージ鈍先端針を誘導し、先端が後ろの網膜神経感覚上皮を貫通するまで後方に進めた。被験物質１マイクロリットルを１秒にわたって送達した。針を、抜き取る前におおよそ５秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
ＥＧＦＰの組織学的検査
エピ蛍光顕微鏡を使用して、パラフィン包埋のために処理したホルマリン固定眼に関する生ＥＧＦＰシグナルを観察した。
結果
図１に示したような５つのカプシド残基はＨＳＰＧとのＡＡＶ２結合にとって重要であることが証明されている。これらの残基に次の２つのアミノ酸置換を有するＡＡＶ２突然変異体を構築した：Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ（ナンバリングは、ＶＰ１アミノ酸配列に基づく）。この突然変異体をＨＢＫＯと呼び、培養中の細胞へのその形質導入能力を試験した。
ヒト細胞株を培養で増殖させ、野生型またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子で形質導入した。形質導入効率を測定するために、偏在性ＣＢＡプロモーターを使用して可溶性Ｆｌｔ（ヒトＶＥＧＦ受容体１）の発現を駆動する導入遺伝子を含むように両方のタイプのＡＡＶ２粒子のウイルスゲノムを修飾した。形質導入の４８時間後、ＥＬＩＳＡベースの免疫測定法を用いて形質導入効率を測定して、生産されたＦｌｔの量を定量した。図２は、ＨＢＫＯ突然変異体が、培養中のヒト２９３細胞への大きく減少した形質導入能力を示したことを明示している。同数のＡＡＶ２粒子と２９３細胞を使用すると、ＨＢＫＯ突然変異体は、野生型と比較して形質導入効率の９９．６％低減を示した。
複数のヒト細胞株においてこの効果を測定するために、上で説明したように２９３およびヒーラ細胞に形質導入した。これらのアッセイのために、ＣＢＡプロモーターからＦｌｔではなくＥＧＦＰを発現するようにベクターを修飾した。図３は、ＥＧＦＰ蛍光によって測定して、野生型ＡＡＶ２が両方の細胞株に形質導入することができたことを示す。対照的に、ＨＢＫＯ突然変異体は、両方の細胞株への形質導入の劇的な減少を有した。これらの結果は、ＨＢＫＯ突然変異体が、培養中のヒト胚性腎および子宮頸癌細胞株への形質導入能力の劇的な低減を有することを確証する。
ＨＳＰＧ結合に必要なアルギニン残基の突然変異には、網膜下注射後のＡＡＶ２媒介形質導入に対して硝子体内注射後のＡＡＶ２媒介形質導入に逆の効果がある
硝子体内および網膜下注射したときに眼細胞に形質導入するＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子の能力をマウスで試験した。図４Ａおよび４Ｂは、硝子体内または網膜下注射時の野生型およびＨＢＫＯ ＡＡＶ２粒子の形質導入効率を比較する図である。これらの実験については、遍在性ＣＢＡプロモーターを使用してＦｌｔの発現を駆動する、導入遺伝子を有するＡＡＶ２粒子での形質導入時の可溶性Ｆｌｔ（ｓＦＬＴ）発現を測定することによって、形質導入効率をアッセイした。硝子体内注射を使用すると、ＨＢＫＯ突然変異体
は、細胞への形質導入能力の大きな低減を示した（図４Ａ）。
驚くべきことに、ＨＢＫＯ突然変異体は、網膜下注射後に形質導入増進を示した（図４Ｂ）。この増加は、注射したＡＡＶ２ベクターゲノムの量を１０倍変化（表示を付けたとおり、１０８および１０９ｖｇ）させたときにも一貫して観察された。これらの結果は、培養細胞株でおよび硝子体内注射時に観察されたものとは対照的である。これらのデータは、異なるタイプの眼内注射による異なる眼細胞タイプおよび網膜層への形質導入を媒介する点でのＨＳＰＧ結合能力の重要性を示している。
網膜細胞への形質導入を可視化するために、偏在性ＣＢＡプロモーターからのＥＧＦＰを発現する導入遺伝子を有する野生型またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子を使用した。図５に示すように、野生型ＡＡＶ２粒子は、ＧＦＰ蛍光によって実証されるように、硝子体内注射後に網膜に形質導入することができた。しかし、ＡＡＶ２ ＨＢＫＯ突然変異体粒子は、硝子体内注射しても検出可能なＧＦＰ蛍光を示さなかった。これらの結果は、図４Ａに提示したものと一致している。
図６は、網膜下注射したときの野生型（ＡＡＶ２ ＣＢＡ）およびＨＢＫＯ突然変異型（ＡＡＶ２ ＣＢＡ ＨＢＫＯ）ＡＡＶ２粒子の形質導入効率を定量したものである。形質導入を測定するために、両方のＡＡＶ２粒子は、偏在性ＣＢＡプロモーターを使用してＦｌｔを発現する導入遺伝子を含むベクターゲノムを有した。図６に示すように、ベクターゲノムの２つの量を注射に使用した。これらの結果は、図４Ｂに示した観察を確証し、またＨＳＰＧ結合に必要な残基を突然変異させることによって網膜下注射後の細胞へのＡＡＶ２の形質導入能力が増加されるという驚くべき発見を実証するものである。
形質導入を可視化するために、偏在性ＣＢＡプロモーターからＥＧＦＰを発現する導入遺伝子を有する野生型またはＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子を使用した。図７に示すように、網膜のＧＦＰ蛍光は、野生型と比較してＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子で形質導入すると強化される。
網膜下注射が光受容器細胞を有する細胞層を標的にすることは公知であるので、光受容器へのＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子の形質導入能力を研究した。眼では、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーターが、特異的に杆体および錐体細胞などの光受容器細胞における発現を駆動することは公知である（Ｋｈａｎｉ，Ｓ．Ｃ．ら（２００７）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４８（９）：３９５４〜６１頁）。したがって、ＲＫプロモーターを使用してＦｌｔの発現を駆動する導入遺伝子を有するベクターゲノムを用いて野生型およびＨＢＫＯ突然変異型ＡＡＶ２粒子を生成した。図８に示したように、ＨＢＫＯ突然変異型ＶＡＡ２粒子は、野生型と比較して、網膜下注射後の光受容器細胞への形質導入増進を示した。この観察は、１０倍異なる量（表示を付けたとおり、１０８および１０９ｖｇ）のベクターゲノムを注射したときにも一貫して観察された。これらの結果は、ＨＳＰＧ結合に必要な残基を突然変異させることによって、網膜注射後の網膜光受容器細胞へのＡＡＶ２粒子の形質導入能力が向上されるという驚くべき結果を実証するものである。これらの残基の突然変異は、ＡＡＶ２媒介遺伝子治療のための光受容器細胞への可能性のある形質導入増進方法と言える。
ＡＡＶは、パルボウイルス科のメンバーである、一本鎖、非包膜ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６などを含む、ＡＡＶの異なる血清型は、異なる組織分布プロファイルを明示する。これらのＡＡＶカプシドの多様な組織親和性が、肝臓、骨格筋、脳、網膜、心臓および脊髄へのｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏ両方の広範な遺伝子導入用途にＡＡＶベースのベクターを使用することを可能にした（Ｗｕ，Ｚ．ら、（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、１４：３１６〜３２
７頁）。宿主細胞へのウイルスの接着には、ウイルスカプシドと細胞受容体分子の特異的相互作用が必要である。ＡＡＶ２カプシドがＡＡＶ２ベースの遺伝子治療用ベクターの細胞侵入を媒介するために一次および二次受容体としてヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、Ｖ５インテグリンおよびヒト線維芽細胞増殖因子受容体１を使用することは以前に証明されている（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．およびＲ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７２：１４３８〜１４４５頁；Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ，Ｃ．ら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５：７８〜８２頁；Ｑｉｎｇ，Ｋ．ら、（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５：７１〜７７頁）。ＡＡＶ２カプシドタンパク質の突然変異分析によって、塩基性アミノ酸、すなわちアルギニンＲ４８４、Ｒ４８７、Ｒ５８５、Ｒ５８８およびリシンＫ５３２、の１群は、ヘパラン結合、および細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入、およびＡＡＶ２ベクターのｉｎ ｖｉｖｏ肝臓形質導入に寄与することが証明されている。これらのアミノ酸残基の突然変異は、静脈内投与経路によるＡＡＶ２ベースのベクターの肝臓形質導入の大きな減少、ならびに心臓および骨格筋遺伝子導入の増加をもたらした（Ｋｅｒｎ，Ａ．ら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７７：１１０７２〜１１０８１頁；Ｍｕｌｌｅｒ，Ｏ．Ｊ．ら、（２００６）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７０：７０〜７８頁）。
ベクターの硝子体内投与経路と網膜下投与経路の両方による網膜へのＡＡＶ２ベクターの形質導入を用いて、これらの塩基性アミノ酸の役割を調査した。Ｒ５８５およびＲ５８８の突然変異は、ＨＥＫ２９３細胞およびヒーラ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を有意に排除した（図２および３）。Ｄａｌｋａｒａ Ｄら（（２００９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７：２０９６〜２１０２頁）は、硝子体内送達されたＡＡＶ２ベクターは、網膜の内境界膜に大量に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンと結合するため、外網膜に浸透することができないことを示唆している。本実施例によって示すように、硝子体内送達したとき、Ｒ５８５／Ｒ５８８突然変異ベクターは、野生型ＡＡＶ２ベクターと比較して内網膜への形質導入能力が低く（図４Ａおよび５）、これは、ＨＳＰＧとの結合が網膜の硝子体内形質導入にとって重要であることを示唆している。ＡＡＶ２ベースのベクターの網膜下送達は、主として網膜色素上皮（ＲＰＥ）形質導入をもたらし、光受容器細胞形質導入を多少もたらす。驚くべきことに、Ｒ５８５／Ｒ５８８突然変異ベクターは、野生型ＡＡＶ２ベクターより少なくとも１０倍良好に外網膜に形質導入することが判明した（図４Ｂ、６および７）。光受容器特異的ロドプシンキナーゼプロモーター（ＲＫ）を使用すると、光受容器における導入遺伝子発現は、ＡＡＶ２ Ｒ５８５／Ｒ５８８突然変異型ベクターで有意に増加される（図８）。ＡＡＶ２カプシド上の塩基性アミノ酸残基の突然変異に基づくこれらのベクターは、様々な網膜障害の処置のための外網膜、特に光受容器細胞への形質導入に非常に有益であるだろう。
線条体内ＡＡＶ２ＨＢＫＯベクター送達後の広範なＧＦＰ発現
ＡＡＶ２カプシドに導入された部位特異的突然変異によって、ヘパリンと結合することができないＡＡＶ２ ＨＢＫＯ突然変異型ベクターを生成した。このＨＢＫＯベクターの形質導入プロファイルを野生型マウスモデルとＨＤマウスモデル（ＹＡＣ１２８）の両方において単回線条体内注射を使用して評価した。
方法
ＡＡＶ２アルギニン突然変異型プラスミドの構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＡＡＶ２ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミド、ｐＩＭ４５ＢＤ、を突然変異させた。残基５８５および５８８のアルギニンのアラニンへの変化を導入するためのＰＣＲ突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
ＡＡＶベクターの生産
以前に記載された（Ｘｉａｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４〜２２３２頁）ようなヒト胎性腎癌２９３細胞（ＨＥＫ−２９３）の（リン酸カルシウムを使用する）トリプルトランスフェクションよって、組換えＡＡＶベクターを作製した。簡単に言うと、血清型２からのｒｅｐ遺伝子と血清型１または２のいずれかからのカプシド遺伝子を含有するプラスミドをヘルパーアデノウイルスプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）とともに使用した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にあった。ウイルスをトランスフェクションの７２時間後に収集し、以前に記載された（Ｘｉａｏら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４〜２２３２頁）ようにカラム精製した。
動物
すべての手順は、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｓａｎｏｆｉ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ８６〜２３）の施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画を用いて行った。使用したマウスは、ＹＡＣ１２８マウス（純粋なＦＢＶ／ＮＪバックグラウンドの１２８ＣＡＧ反復配列を有する完全長ヒト突然変異型ＨＴＴ導入遺伝子を内部に持つ酵母人口染色体）および野生型ＦＶＢ／ＮＪ同腹子マウス（Ｓｌｏｗら（２００３）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１５５５〜１５６７頁；Ｖａｎ Ｒａａｍｓｄｏｎｋら（２００５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３８２３〜３８３５頁）を含んだ。ＹＡＣ１２８マウスおよびＦＶＢ／ＮＪ同腹子は、両方とも、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにおいて飼育されたＧｅｎｚｙｍｅコロニーから得た。食餌および水を自由に入手できる昼夜１２時間サイクルでマウスを維持した。すべての行動試験は、動物の昼サイクル中（ＡＭ８時〜ＰＭ４時の間）に行った。すべての実験についてのｎ値を下の表２および３に示す。
外科手術手技
３％イソフルランを使用して動物を麻酔し、定位固定枠内に配置した。以前に記載された（Ｓｔａｎｅｋら（２０１４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２５：４６１〜４７４頁）ように、頭蓋内注射を行った。簡単に言うと、１０μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器を使用して、線条体（十字縫合および硬膜から、ＡＰ、＋０．５０；ＭＬ、±２．００；ＤＶ、−２．５；切歯棒、０．０）に０．５μｌ／分の速度で組換えウイルスベクター ３μ
ｌを注射した。注入完了後１分間、針を所定の位置に残した。手術前１時間および手術後２４時間、鎮痛のためにマウスにケトプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与した。
動物灌流および組織採取
マウスの心臓をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で灌流させて血液を除去した。実験１については、脳を４％パラホルムアルデヒド、続いて３０％スクロースで固定した後、冠状面に沿って切断した。クリオスタットを使用して、２０μｍ冠状切片を切断した。実験２については、脳を正中線に沿って切断し、左半球を４％パラホルムアルデヒド、続いて３０％スクロースで固定し、次いでクリオスタットを使用して２０μｍ切片にした。マウス脳マトリックス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して冠状軸に沿って（生化学アッセイに使用するための）右半球を切断し、３ｍｍ生検パンチを使用して線条体および皮質領域を解剖した。その後、脳組織を液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−８０℃で保存した。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）
ＲＮＡレベルを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。すべてのＲＴ−ＰＣＲ分析に線条体パンチ片を使用した。ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥａｓｙミニキットを使用して全ＲＮＡを抽出し、その後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をその製造業者の説明書に従って使用して逆転写し、増幅した。ＴａｑＭａｎ定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行って分析した。ＨＴＴ ｍＲＮＡの発現レベルをヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）ｍＲＮＡレベルに正規化した。マウス脳ｃＤＮＡの５倍系列希釈物を使用して検量線を生成した。各試料を二度繰り返して実行した。検量線またはΔΔＣＴ法を用いることによって相対遺伝子発現を判定し、ＨＰＲＴ１ ｍＲＮＡレベルに正規化した。ヒトＨＴＴの検出については、次のプライマーを使用した：５’ＣＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＡＧＡＣＡＴＧＣＴ３’および５’ＣＣＡＴＴＴＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＣＣ３’。マウスＨＴＴの検出については、次のプライマーを使用した：５’ＴＧＣＴＡＣＡＣＣＴＧＡＣＡＧＣＧＡＧＴＣＴ３’および５’ＡＴＣＣＣＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡ３’。
ウエスタンブロッティング
タンパク質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した。すべてのウエスタンブロット分析に皮質パンチ片を使用した。Ｔ−Ｐｅｒ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）中５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度の組織であって、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含有する前記組織をホモジナイズした。１０，０００×ｇで６分間、４℃での遠心分離によってホモジネートを清澄にした。ＢＳＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによってタンパク質濃度を測定した。ホモジネート２０〜３０マイクログラムを３〜８％Ｎｏｖｅｘトリス−酢酸ゲルで分割し、次いでニトロセルロース膜に転写した。膜をマウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体（Ｍａｂ２１６６；１：２，０００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）およびウサギポリクローナル抗β−チューブリン抗体（１：７５０希釈、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でプローブした。その後、膜を赤外二次抗体（１：２０，０００希釈、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）とともにインキュベートし、Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して定量的蛍光によってタンパク質を可視化した。負荷変動を制御するために、Ｈｔｔタンパク質をβ−チューブリンに正規化し、未処置または食塩水処置動物に対するパーセンテージとして表した。分子量マーカーを使用してタンパク質の同一性を検証した。
免疫組織化学
凍結脳切片を、アストロサイトを染色するためのウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（１：２，５０
０；ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはミクログリアを可視化するための抗Ｉｂａ１抗体（１：５００；ＷＡＫＯ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）で染色した。使用した二次抗体は、ＦＩＴＣまたはＣｙ３と結合しているロバ抗種特異的抗体であった。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）を使用して切片を可視化した。
統計
平均値を統計解析に使用した。データを平均±ＳＥＭとして表した。２群を使用した研究については、スチューデントｔ検定を統計比較に用いた。２群より多くの群の比較については、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてチューキー多重比較事後検定（Ｐｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた。ｐ＜０．０５を統計的有意差とみなした。
結果
上に記載したように、実験１では野生型マウスにＡＡＶ２−ｅＧＦＰおよびＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ＧＦＰベクターを注射した（表２）。すべての動物を注射３０日後に屠殺した。経口顕微鏡検査は、ＡＡＶ２ベクターとＡＡＶ２ＨＢＫＯベクターは両方とも形質導入ニューロンにおいてＧＦＰ導入遺伝子の発現を駆動することを明示した（図９Ａおよび９Ｂ）。ＧＦＰ発現は、ＡＡＶ２の注射跡に限定され、ごくわずかしか注射部位を超えて広がらなかった（図９Ｂ）。しかし、旧来のＡＡＶ２と比較すると、ＡＡＶ２ＨＢＫＯは、より強く広範囲にわたるＧＦＰ発現を駆動し、注射部位を十分に超えて発現が観察された（図９Ａ）。これらの結果は、ＡＡＶ２ＨＢＫＯを使用してＣＮＳに送達される導入遺伝子の強く広範な発現を実証するものである。
ＹＡＣ１２８マウス脳への線条体内注射後のＡＡＶ２ＨＢＫＯ媒介ＧＦＰ発現とＡＡＶ１媒介ＧＦＰ発現の比較
上に記載したように、実験２ではＹＡＣ１２８マウスにＡＡＶ２ＨＢＫＯおよびＡＡＶ１血清型ベクターを注射した（表３）。これらのベクターは、ヒトＨＴＴを標的にする人工ｍｉＲＮＡ、およびＧＦＰレポーターの発現を駆動した。ＡＡＶ１ベクターおよびＡＡＶ２ＨＢＫＯベクターは両方とも、線条体への注射３０日後に強いＧＦＰ分布を示した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。しかし、ＧＦＰ発現パターンは、これら２つのベクター血清型間で顕著に異なるように見えた。ＧＦＰのＡＡＶ１発現（図１０Ａ）は、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ ＧＦＰ発現（図１０Ｂ）よりまだらで、均一性が低かった。ベクター形質導入は、ニューロンとグリア細胞、主としてアストロサイト、の両方に形質導入するＡＡＶ１血清型と比較して、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ脳では排他的にニューロンへの形質導入であるように見えた。これらの結果は、ＡＡＶ２ＨＢＫＯが、旧来のＡＡＶ１と比較して、非常に異なる発現および形質導入プロファイルを示したことを実証するものである。
ＹＡＣ１２８マウスへのＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔ注射はＨＴＴ ｍＲＮＡの減少をもたらす
次に、ＹＡＣ１２８マウスの線条体におけるＨＴＴ発現を発現停止させるｍｉＲＮＡを発現するＡＡＶ１およびＡＡＶ２ＨＢＫＯベクター血清型の能力を評価した。成体ＹＡＣ１２８マウスにＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔまたはＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−ＨＴＴいずれかの両側線条体内注射を施し、処置３０日後に脳を分析した。突然変異型ヒトＨＴＴ ｍＲＮＡの線条体内レベルは、ＡＡＶ２／１−ｍｉＲＮＡ−ＨｔｔおよびＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡ−Ｈｔｔを注射したマウスにおいて、未処置対象と比較して、有意に低減された（図１１Ａ）。皮質脳パンチ片のウエスタンブロット分析は、両方の処置群においてＨｔｔ低減傾向を示した；しかし、未処置対照試料のばらつきがデータの統計的有意性への到達を妨げた（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＡＡＶ１およびＡＡＶ２
ＨＢＫＯベクターを使用するＲＮＡｉによる遺伝子ノックダウンの効能を実証するものである。
ＹＡＣ１２８マウスへのＡＡＶ２ＨＢＫＯ−ｍｉＲＮＡＨｔｔ注射は神経炎症を引き起こさない
ＡＡＶの注射が神経炎症をもたらすかどうかを判定するために、神経炎症マーカーグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、アストロサイトのマーカー）およびＩｂａ１（ミクログリアのマーカー）のレベルを処置３０日後に検査した。ＡＡＶ２ＨＫＯ処置後、未処置の脳と比較して、Ｉｂａ１レベルの著しい増加は観察されなかった（図１２Ａおよび１２Ｂを参照されたい）。しかし、ＡＡＶ２／１処置は、以前に観察された注射部位でのＩｂａ１レベルの増加を引き起こした（図１２Ｃ）。注射３０日後、処置した脳のいずれにおいても、未処置対照と比較して著しいＧＦＡＰレベルの増加は観察されなかった（図１３Ａ〜１３Ｃ）。これらの結果は、ＡＡＶ２ＨＢＫＯがヒトＨＴＴに対するｍｉＲＮＡの発現を駆動することができたこと、およびミクログリア活性化の不在下でＡＡＶ１血清型と比較してＨＴＴ低減を生じさせることができたことを示す。
結論
現行のＡＡＶベクター血清型は、単一部位投与後に脳内での限定的分布を示す（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ，Ｃ．Ｗ．ら（２００９）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ７３：１６６２〜１６６９頁；Ｍａｎｄｅｌ，Ｒ．Ｊ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：２４０〜２４７頁）。本明細書の中で詳細に論じているように、本発明者らは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との結合が低減されたＡＡＶベクターの投与がＣＮＳへのＡＡＶ形質導入を増進することを発見した。これらの結果は、広範なベクター分布が望まれるＣＮＳ遺伝子治療に対する、ＨＳＰＧ結合が修飾されたＡＡＶの有用性を、実証するものである。さらに、本発明者らは、ＨＳＰＧ結合が低減されたＡＡＶ２ベクターが（排他的にニューロンを標的にするので）理想的な安全性プロファイルを示す上に、広範で強い形質導入効率を達成することも発見した。したがって、そのようなベクターは、実質内送達からの広範なニューロン形質導入を必要とするＣＮＳ適応症に有用である。
ＡＡＶｒｈ８ＲおよびＡＡＶｒｈ８Ｒ突然変異型ベクターによるｉｎ ｖｉｔｒｏおよび網膜下形質導入
方法
ＡＡＶｒｈ８Ｒアルギニン修飾プラスミドの構築
Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＡＡＶｒｈ８Ｒ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドを突然変異させた。アラニン５８６のアルギニンへの変化（ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒ）またはアルギニン５３３のアラニンへの変化（ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａ）を誘導するためのＰＣＲ突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
ｒＡＡＶベクターの生成
高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）または可溶性ＶＥＧＦ受容体ハイブリッド（ｓＦＬＴ０２）を発現する組換えＡＡＶベクターを、ｐＡＡＶｒｈ８Ｒ、ｐＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６ＲまたはｐＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａ ｒｅｐ／ｃａｐプラスミドおよびｐＡｄＨｅｌｐｅｒを使用する２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって作製した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下にあった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入アッセイ
ヒーラ、ＨｅＬａＲＣ３２またはＮＳ１細胞を２４ウェルプレートにプレーティングした（１〜２×１０５細胞／ウェル）。プレーティングの２４時間後、細胞を１×１０４ｖｇ／細胞〜１×１０５ｖｇ／細胞（＋）Ａｄ５ｔｓ１４９に感染させた。感染４８時間後、ＥＧＦＰ蛍光またはＥＬＩＳＡいずれかによって形質導入効率を測定して、培地中のｓＦＬＴ０２を定量した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによるヒト可溶性ＶＥＧＦ Ｒ１ ＥＬＩＳＡ）。
動物。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得られる成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入し、ビバリウムで維持した。研究継続期間中、動物が食餌および水に自由に近づけるようにした。すべての手順は、施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画のもとで行った。
網膜下注射。
散瞳および調節麻痺をトロピカミド（Ａｌｃｏｎ、Ｆｏｒｔ Ｗｏｒｔｈ、ＴＸ）の局所適用で誘導した。酸素８００ｍＬ／分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う３．５％イソルフランの使用によって非活動状態を誘導し、維持した。リング状の先端を有する鉗子（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）を使用して眼を固定し、３０ゲージ針を使用して強膜内の強膜の縁のおおよそ２ｍｍ下を予備切開した。切開部を通して３３ゲージ鈍先端針を誘導し、先端が後ろの網膜神経感覚上皮を貫通するまで後方に進めた。被験物質１マイクロリットルを１秒にわたって送達した。針を、抜き取る前におおよそ５秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２の定量。
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによるヒト可溶性ＶＥＧＦ Ｒ１ ＥＬＩＳＡキットを使用して、マウス網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２を測定した。
結果
網膜へのＡＡＶｒｈ８形質導入におけるカプシド表面アルギニン残基の役割を調査するために、ＨＳＰＧ結合に関与するＡＡＶ２アルギニンに対応する残基の突然変異を有するカプシドタンパク質を用いてＡＡＶｒｈ８ベクターを生成した。図１４は、ＨＳＰＧとのＡＡＶ２結合にとって重要な５つのカプシド残基をＡＡＶｒｈ８Ｒ中の対応する残基と比較するものである。図１５に示したように、これらの残基のアミノ酸置換：Ａ５８６ＲおよびＲ５３３Ａ（ナンバリングは、ＶＰ１アミノ酸ナンバリングに基づく）を各々が有する２つのＡＡＶｒｈ８Ｒ突然変異体を構築した。
ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドへのアルギニン残基の付加の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入に対する効果を評価するために、ヒーラ細胞をＡＡＶｒｈ８Ｒ−ｓＦＬＴ０２ベクター、またはＡ５８６位に付加されたアルギニン（ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ）を有する修飾ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒ−ｓＦＬＴ０２ベクターのいずれかに、両方とも１×１０４ＤＲＰ／細胞で感染させた。感染４８時間後、細胞培養培地中のｓＦＬＴ０２を測定することによって形質導入効率を評価した。ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒは、未修飾ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して数倍高い形質導入を示した（図１６Ａ）。
カプシドアルギニン除去のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入に対する効果を評価するために、ＨｅＬａＲＣ３２細胞をＡＡＶｒｈ８ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａベクターに（両方とも１×１０４ＤＲＰ／細胞）で感染させた。ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａは、ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して有意に低減された形質導入を有した（図１６Ｂ）。
形質導入効率の尺度としてＥＧＦＰ発現を用いて同様の実験を行った。ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒ−ＥＧＦＰは、ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較してＮＳ１細胞への実質的に向上された形質導入を示した（図１７Ｂを図１７Ａと比較されたい）。逆に、ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａ−ＥＧＦＰベクターは、ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較してヒーラ細胞に対して低減された形質導入を有した（図１７Ｄを図１７Ｃと比較されたい）。
まとめると、これらの実験は、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドへのアルギニンの付加はＡＡＶｒｈ８Ｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を向上させるが、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドからのアルギニンの除去はｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を損なわせることを示唆している。これらの結果は、ＡＡＶｒｈ８Ｒによるｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入がカプシド上のアルギニン残基による影響を強く受けることを実証するものである。
ＡＡＶｒｈ８Ｒ網膜下形質導入に対するアルギニンの効果を判定するために、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ＣＢＡプロモーターからｓＦＬＴ０２を発現するＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６ＲまたはＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａを１×１０８ＤＲＰ注射した。ベクター投与３０日後にマウスを屠殺し、網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２を測定した。
マウス網膜へのＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒ形質導入は、ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して実質的に低減され、実際には、この同じ位置（Ｒ５８５）に同様にアルギニンを有するＡＡＶ２に匹敵した（図１８Ａ）。マウス網膜へのＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ｒ５３３Ａ形質導入は、ＡＡＶｒｈ８Ｒと比較して向上された（図１８Ｂ）。
これらのデータは、ＡＡＶｒｈ８Ｒの網膜下形質導入に対するカプシドアルギニンの影響を強調し、網膜下形質導入がＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドからのアルギニンの除去によって向上されることを示唆している。これらの結果は、ＡＡＶｒｈ８Ｒによる網膜下形質導入がカプシド上のアルギニン残基による影響を強く受けることを実証するものである。
ＡＡＶｒｈ８Ｒの硝子体内形質導入は５８６位でのアルギニンの付加によって向上される方法
硝子体内注射
酸素８００ｍＬ／分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う３．５％イソルフランの使用によって非活動状態を誘導し、維持した。３３ゲージ斜角針が取り付けられたＨａｍｉｌｔｏｎ注射器（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して、被験物質１マイクロリットルを硝子体液に注射した。強膜を通して縁のおおよそ２ｍｍ下に針を誘導し、硝子体房に注意深く進ませて水晶体との接触を回避した。被験物質を１〜２秒間にわたって送達した。注射後、針を、抜き取る前におおよそ５秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２の定量
Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによるヒト可溶性ＶＥＧＦ Ｒ１ ＥＬＩＳＡキットを使用して、マウス網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２を測定した。
結果
ＡＡＶカプシドへのアルギニン付加の、硝子体内形質導入に対する効果を評価するために、Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、ＣＢＡプロモーターからｓＦＬＴ０２を発現する構築物を各々が有する、ＡＡＶ２、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、またはＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒを１×１０９ＤＲＰ注射した。ベクター投与３０日後にマウスを屠殺し、網膜溶解物中のｓＦＬＴ０２を測定した。マウス網膜へのＡＡＶｒｈ８Ｒ−Ａ５８６Ｒ形質導入は、ＡＡＶｒｈ８Ｒ
と比較して向上され、実際には、この同じ位置（Ｒ５８５）に同様にアルギニンを有するＡＡＶ２に匹敵した（図１９）。このデータは、網膜への硝子体内形質導入をＡＡＶカプシドへのアルギニンの付加によって向上させることができることを示している。これらの結果およびＡＡＶカプシド間の配列相同性（図２０）に基づくと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０カプシドを有するＡＡＶ粒子による網膜への硝子体内形質導入は、網膜形質導入を同様に向上させる可能性がある。
配列
別段の断り書きがない限り、すべてのポリペプチド配列をＮ末端からＣ末端へと提示する。別段の断り書きがない限り、すべての核酸配列を５’から３’へと提示する。
ＡＡＶ２ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１）
ＡＡＶ２ ＶＰ１ ＨＢＫＯアミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＡＧＮＡＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶ
ＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号２）
ＡＡＶ２ ＶＰ２アミノ酸配列
ＭＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号３）
ＡＡＶ２ ＶＰ２ ＨＢＫＯアミノ酸配列
ＭＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＡＧＮＡＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号４）
ＡＡＶ２ ＶＰ３アミノ酸配列
ＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰ
ＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号５）
ＡＡＶ２ ＶＰ３ ＨＢＫＯアミノ酸配列
ＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＡＧＮＡＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号６）
ＡＡＶ３ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＶＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＲＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＩＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＤＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＶＧＫＳＧＫＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＴＳＬＧＳＮＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＫＬＳＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＮＲＴＱＧＴＴＳＧＴＴＮＱＳＲＬＬＦＳＱＡＧＰＱＳＭＳＬＱＡＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＬＳＫＴＡＮＤＮＮＮＳＮＦＰＷＴＡＡＳＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＭＨＧＮＬＩＦＧＫＥＧＴＴＡＳＮＡＥＬＤＮＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＴＶＡＮＮＬＱＳＳＮＴＡＰＴＴＲＴＶＮＤＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＭＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＴＴＦＳＰＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号７）
ｓｃＡＡＶベクターの突然変異ＩＴＲ
ＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧ（配列番号８）
ＡＡＶｒｈ８Ｒ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤ
ＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＬＧＰＮＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＬＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＶＲＴＱＴＴＧＴＧＧＴＱＴＬＡＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＲＮＷＶＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＴＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＡＫＦＫＬＮＧＲＤＳＬＭＮＰＧＶＡＭＡＳＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＤＧＶＤＹＳＱＶＬＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＡＶＡＩＮＮＱＡＡＮＴＱＡＱＴＧＬＶＨＮＱＧＶＩＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＬＴＦＮＱＡＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号９）
ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ａ５８６Ｒ突然変異型ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＬＧＰＮＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＬＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＶＲＴＱＴＴＧＴＧＧＴＱＴＬＡＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＲＮＷＶＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＴＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＡＫＦＫＬＮＧＲＤＳＬＭＮＰＧＶＡＭＡＳＨＫＤＤＥＤＲＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＤＧＶＤＹＳＱＶＬＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＡＶＡＩＮＮＱＲＡＮＴＱＡＱＴＧＬＶＨＮＱＧＶＩＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＬＴＦＮＱＡＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１０）
ＡＡＶｒｈ８Ｒ Ｒ５３３Ａ ｍｕｔａｎｔ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＬＧＰＮＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＬＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦ
ＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＶＲＴＱＴＴＧＴＧＧＴＱＴＬＡＦＳＱＡＧＰＳＳＭＡＮＱＡＲＮＷＶＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＴＮＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＡＫＦＫＬＮＧＲＤＳＬＭＮＰＧＶＡＭＡＳＨＫＤＤＥＤＡＦＦＰＳＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＡＧＮＤＧＶＤＹＳＱＶＬＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＡＶＡＩＮＮＱＡＡＮＴＱＡＱＴＧＬＶＨＮＱＧＶＩＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＬＴＦＮＱＡＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１１）
ＡＡＶ１ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＴＰＡＡＶＧＰＴＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＡＳＴＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＥＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧＴＡＭＡＳＨＫＤＤＥＤＫＦＦＰＭＳＧＶＭＩＦＧＫＥＳＡＧＡＳＮＴＡＬＤＮＶＭＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＲＦＧＴＶＡＶＮＦＱＳＳＳＴＤＰＡＴＧＤＶＨＡＭＧＡＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＮＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＡＥＦＳＡＴＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＶＱＹＴＳＮＹＡＫＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬＹＴＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＰＬ（配列番号１２）
ＡＡＶ６ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＦＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＳＧＩＧＫＴＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＴＰＡＡＶＧＰＴＴＭＡＳＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＡＳＴＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＮＤＧＶＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＳＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＮＲＴＱＮＱＳＧＳＡＱＮＫＤＬＬＦＳＲＧＳＰＡＧＭＳＶＱＰＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＫＴＤＮＮＮＳＮＦＴＷＴＧＡＳＫＹＮＬＮＧＲＥＳＩＩＮＰＧＴＡＭＡＳＨＫＤＤＫＤＫＦＦＰＭＳＧＶＭＩＦＧＫＥＳＡＧＡＳＮＴＡＬＤＮＶＭＩＴＤＥＥＥＩＫＡＴＮＰＶＡＴＥＲＦＧＴＶＡＶＮＬＱＳＳＳＴＤＰＡＴＧＤＶＨＶＭＧＡＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＰＡＥＦＳＡＴＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＶＱＹＴＳＮＹＡＫＳＡＮＶＤＦＴＶＤＮＮＧＬ
ＹＴＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＰＬ（配列番号１３）
ＡＡＶ８ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＱＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＬＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＰＮＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＡＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＳＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＴＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＴＴＧＧＴＡＮＴＱＴＬＧＦＳＱＧＧＰＮＴＭＡＮＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＴＧＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＡＧＴＫＹＨＬＮＧＲＮＳＬＡＮＰＧＩＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＮＧＩＬＩＦＧＫＱＮＡＡＲＤＮＡＤＹＳＤＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＥＹＧＩＶＡＤＮＬＱＱＱＮＴＡＰＱＩＧＴＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＮＱＳＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＳＶＤＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１４）
ＡＡＶ９ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＬＬＥＰＬＧＬＶＥＥＡＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＱＳＰＱＥＰＤＳＳＡＧＩＧＫＳＧＡＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＴＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＡＰＳＧＶＧＳＬＴＭＡＳＧＧＧＡＰＶＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＱＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＳＴＳＧＧＳＳＮＤＮＡＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＤＮＮＧＶＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＤＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＥＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＤＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＱＦＳＹＥＦＥＮＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＫＴＩＮＧＳＧＱＮＱＱＴＬＫＦＳＶＡＧＰＳＮＭＡＶＱＧＲＮＹＩＰＧＰＳＹＲＱＱＲＶＳＴＴＶＴＱＮＮＮＳＥＦＡＷＰＧＡＳＳＷＡＬＮＧＲＮＳＬＭＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＥＧＥＤＲＦＦＰＬＳＧＳＬＩＦＧＫＱＧＴＧＲＤＮＶＤＡＤＫＶＭＩＴＮＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＳＹＧＱＶＡＴＮＨＱＳＡＱＡＱＡＱＴＧＷＶＱＮＱＧＩＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＭＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＡＦＮＫＤＫＬＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＮＮＶＥＦＡＶＮＴＥＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１５）
ＡＡＶｒｈ１０ ＶＰ１アミノ酸配列
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲＥＷＷＤＬＫＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＫＱＤＤＧＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＲＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＱＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＧＡＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＰＳＰＱＲＳＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＱＱＰＡＫＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＳＥＳＶＰＤＰＱＰＩＧＥＰＰＡＧＰＳＧＬＧ
ＳＧＴＭＡＡＧＧＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＳＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＬＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＮＧＴＳＧＧＳＴＮＤＮＴＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＥＧＴＫＴＩＡＮＮＬＴＳＴＩＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＩＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＦＳＹＱＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＱＳＴＧＧＴＡＧＴＱＱＬＬＦＳＱＡＧＰＮＮＭＳＡＱＡＫＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＴＴＬＳＱＮＮＮＳＮＦＡＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＶＡＭＡＴＨＫＤＤＥＥＲＦＦＰＳＳＧＶＬＭＦＧＫＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳＶＭＬＴＳＥＥＥＩＫＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＶＶＡＤＮＬＱＱＱＮＡＡＰＩＶＧＡＶＮＳＱＧＡＬＰＧＭＶＷＱＮＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＮＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＤＰＰＴＴＦＳＱＡＫＬＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＹＫＳＴＮＶＤＦＡＶＮＴＤＧＴＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ（配列番号１６）

Claims (547)

  1. 個体の眼に異種核酸を送達する方法であって、
    該個体の網膜下に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  2. 個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；
    該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  3. 個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の網膜下送達後の異種核酸の発現を向上させる方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；
    該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  4. 個体の眼障害を処置する方法であって、
    ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を個体の網膜に送達することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  5. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも
    約７５％、または少なくとも約１００％低減させる、請求項５に記載の方法。
  7. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項７に記載の方法。
  9. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む、請求項１に記載の方法。
  12. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７または５３２位におけるものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項１２に記載の方法。
  14. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項１〜１１および１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  16. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  17. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  18. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  19. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  20. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  21. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位におけるものである、請求項２０に記載の方法。
  22. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項２１に記載の方法。
  23. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位における置換を含む、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位における置換を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
  30. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項２９に記載の方法。
  31. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項１〜３
    ０のいずれか１項に記載の方法。
  32. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項３２に記載の方法。
  34. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 個体はヒトである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項３６に記載の方法。
  38. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項３８に記載の方法。
  40. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ｒＡＡＶ粒子は、医薬組成物中にある、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 医薬組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである、請求項４１に記載の方法。
  43. ｒＡＡＶ粒子の医薬組成物は、個体の視覚機能の処置に有効である、請求項４１または４２に記載の方法。
  44. 視覚機能は、微小視野測定、暗順応視野測定、視覚の動きの評価、視力、ＥＲＧ、または読字評価によって評価される、請求項４３に記載の方法。
  45. 個体の視覚機能を向上させる結果となる、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 眼障害の進行に起因するヒトの視覚機能低下の進行の予防または減速する結果となる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 個体の眼にベクターを網膜下送達するためのシステムであって、
    ａ）ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物であって、
    ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、
    ｉｉ）該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復とを含む、前記組成物；および
    ｂ）前記ｒＡＡＶの網膜下送達のためのデバイス
    を含む前記システム。
  48. デバイスは、細径カニューレおよび注射器を含み、該細径カニューレは、２７〜４５ゲージである、請求項４７に記載のシステム。
  49. ｒＡＡＶ粒子の組成物は、注射器内に収容されている、請求項４８に記載のシステム。
  50. カニューレは、注射器に取り付けられている、請求項４８または４９に記載のシステム。
  51. 組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載のシステム。
  52. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載のシステム。
  53. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項４７〜５２のいずれか１項に記載のシステム。
  54. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる、請求項５３に記載のシステム。
  55. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項４７〜５４のいずれか１項に記載のシステム。
  56. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項５５に記載のシステム。
  57. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項４７〜５６のいずれか１項に記載のシステム。
  58. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項４７〜５７のいずれか１項に記載のシステム。
  59. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７または５３２位におけるものである、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載のシステム。
  60. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項５９に記載のシステム。
  61. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項４７〜５８および６０のいずれか１項に記載のシステム。
  62. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載のシステム。
  63. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載のシステム。
  64. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載のシステム。
  65. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載のシステム。
  66. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載のシステム。
  67. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位におけるものである、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載のシステム。
  68. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項６７に記載のシステム。
  69. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位における置換を含む、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位における置換を含む、請求項６７または６８に記載のシステム。
  70. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む
    、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のシステム。
  71. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載のシステム。
  72. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項４７〜７１のいずれか１項に記載のシステム。
  73. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４７〜７２のいずれか１項に記載のシステム。
  74. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４７〜７３のいずれか１項に記載のシステム。
  75. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項４７〜７２のいずれか１項に記載のシステム。
  76. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項７５に記載のシステム。
  77. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項４７〜７６のいずれか１項に記載のシステム。
  78. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４７〜７７のいずれか１項に記載のシステム。
  79. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項７８に記載のシステム。
  80. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項７９に記載のシステム。
  81. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項７７〜８０のいずれか１項に記載のシステム。
  82. 個体はヒトである、請求項４７〜８１のいずれか１項に記載のシステム。
  83. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シ
    ュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項８２に記載のシステム。
  84. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項４７〜８３のいずれか１項に記載のシステム。
  85. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項８４に記載のシステム。
  86. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項８５に記載のシステム。
  87. 眼障害を処置するためのキットであって、
    ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ｉ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｉｉ）眼障害を処置するための異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む前記組成物；ならびに
    ｂ）網膜下投与に好適な医薬品賦形剤
    を含む前記キット。
  88. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、請求項８７に記載のキット。
  89. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項８７または８８に記載のキット。
  90. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる、請求項８９に記載のキット。
  91. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載のキット。
  92. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項９１に記載のキット。
  93. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請
    求項８７〜９２のいずれか１項に記載のキット。
  94. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項８７〜９３のいずれか１項に記載のキット。
  95. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７または５３２位におけるものである、請求項８７〜９４のいずれか１項に記載のキット。
  96. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項９５に記載のキット。
  97. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項８７〜９４および９６のいずれか１項に記載のキット。
  98. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項８７〜９７のいずれか１項に記載のキット。
  99. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項８７〜９７のいずれか１項に記載のキット。
  100. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む、請求項８７〜９７のいずれか１項に記載のキット。
  101. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項８７〜９７のいずれか１項に記載のキット。
  102. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ−２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項８７〜９７のいずれか１項に記載のキット。
  103. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位におけるものである、請求項８７〜９４のいずれか１項に記載のキット。
  104. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項１０３に記載のキット。
  105. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位における置換を含む、または該１つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位における置換を含む、請求項１０３または１０４に記載のキット。
  106. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１０３〜１０５のいずれか１項に記載のキット。
  107. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項１０３〜１０６のいずれか１項に記載のキット。
  108. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項８７〜１０７のいずれか１項に記載のキット。
  109. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項８７〜１０８のいずれか１項に記載のキット。
  110. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項８７〜１０９のいずれか１項に記載のキット。
  111. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項８７〜１０８のいずれか１項に記載のキット。
  112. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項１１１に記載のキット。
  113. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項８７〜１１２のいずれか１項に記載のキット。
  114. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項８７〜１１３のいずれか１項に記載のキット。
  115. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項１１４に記載のキット。
  116. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項１１４に記載のキット。
  117. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項１１４〜１１６のいずれか１項に記載のキット。
  118. 個体はヒトである、請求項８７〜１１７のいずれか１項に記載のキット。
  119. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項１１８に記載のキット。
  120. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、シュタルガルト病、網膜色素変性、アッシャー症候群および加齢性黄斑変性
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項１１８に記載のキット。
  121. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項８７〜１２０のいずれか１項に記載のキット。
  122. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項１２１に記載のキット。
  123. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項１２２に記載のキット。
  124. ｒＡＡＶ粒子の組成物の網膜下送達のためのデバイスをさらに含む、請求項８７〜１２３のいずれか１項に記載のキット。
  125. ｒＡＡＶ粒子の組成物の網膜下送達のための説明書をさらに含む、請求項８７〜１２４のいずれか１項に記載のキット。
  126. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達する方法であって、
    該個体のＣＮＳに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  127. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
    該個体のＣＮＳに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  128. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）における異種核酸の発現を向上させる方法であって、
    該個体のＣＮＳに組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  129. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）の障害を処置する方法であって、
    ｒＡＡＶ粒子を含む組成物の有効量を該個体のＣＮＳに投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  130. 異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項１２６〜１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項１２６〜１３０のいずれか１項に記載の方法。
  132. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、ＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、請求項１２６〜１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、場合により少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％低減させる、請求項１２６〜１３２のいずれか１項に記載の方法。
  134. 投与は、直接脊髄注射、頭蓋内および／または脳内投与を含む、請求項１２６〜１３３のいずれか１項に記載の方法。
  135. 脳内投与は、大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、脳を覆っている髄膜、硬膜、くも膜、脳軟膜、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）、小脳の深部小脳核、大脳の脳室系、くも膜下腔、線条体、皮質、中隔、視床、視床下部、および脳実質からなる群から選択される部位に対するものである、請求項１３４に記載の方法。
  136. 投与は、少なくとも１つの大脳側脳室への側脳室内注射である、請求項１２６〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 投与は、頸部、胸部および／または腰部におけるくも髄腔内注射である、請求項１２６〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  138. 投与は線条体内注射である、請求項１２６〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  139. 投与は視床内注射である、請求項１２６〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  140. 投与は実質内注射である、請求項１２６〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
  141. ｒＡＡＶ粒子は、単一部位に対して投与される、請求項１２６〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される、請求項１３５に記載の方法。
  143. ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項１３５または１４２に記載の方法。
  144. ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項１４３に記載の方法。
  145. ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項１４４に記載の方法。
  146. カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである、請求項１４５に記載の方法。
  147. ポンプは、手動ポンプである、請求項１４５または１４６に記載の方法。
  148. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項１４５または１４６に記載の方法。
  149. ポンプは、注入ポンプである、請求項１４５または１４６に記載の方法。
  150. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項１２６〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
  151. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項１５０に記載の方法。
  152. 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項１２６〜１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項１５２に記載の方法。
  154. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項１２６〜１５３のいずれか１項に記載の方法。
  155. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項１５４に記載の方法。
  156. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項１２６〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
  157. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８位におけるものである、請求項１２６〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
  159. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７または５３２位におけるものである、請求項１５８に記載の方法。
  160. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項１５８または１５９に記載の方法。
  161. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４４８、Ｒ４５１、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項１２６〜１５８および１６０のいずれか１項に記載の方法。
  162. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７および／またはＫ５３２位における置換を含む、請求項１２６〜１６１のいずれか１項に記載の方法。
  163. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  164. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４Ａ、Ｒ４８７Ａ、Ｋ５２７Ａ、Ｋ５３２Ａ、Ｒ５８５Ａおよび／またはＲ５８８Ａ置換を含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  165. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４およびＲ４８７位におけるまたはＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  166. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして
    、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  167. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  168. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項１２６〜１６２のいずれか１項に記載の方法。
  169. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位におけるものである、請求項１２６〜１５７のいずれか１項に記載の方法。
  170. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項１６９に記載の方法。
  171. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位におけるものである、請求項１６９または１７０に記載の方法。
  172. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１６９〜１７１のいずれか１項に記載の方法。
  173. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項１６９〜１７２のいずれか１項に記載の方法。
  174. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項１２６〜１７３のいずれか１項に記載の方法。
  175. 異種核酸は、ＣＮＳ関連遺伝子をコードする、請求項１２６〜１７４のいずれか１項に記載の方法。
  176. 異種核酸は、酵素、神経栄養因子、ＣＮＳ関連障害を有する個体において欠乏または突然変異ポリペプチド、抗酸化物質、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子、α−シヌクレイン、酸性β−グルコシダーゼ（ＧＢＡ）、β−ガラクトシダーゼ−１（ＧＬＢ１）、イズロン酸２−スルファターゼ（ＩＤＳ）、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、マンノシダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ（ＭＡＮ２Ｂ１）、β−マンノシダーゼ（ＭＡＮＢＡ）、偽アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼ（ＧＮＰＴＡＢ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、ニーマン・ピックＣタンパク質（ＮＰＣ１）、酸性α−１，４−グルコシダーゼ（ＧＡＡ）、ヘキソサミニダーゼβサブユニット、ＨＥＸＢ、Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＭＰＳ３Ａ）、Ｎ−α−アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧ
    ＬＵ）、ヘパリンアセチル−ＣｏＡ、α−グルコサミニダーゼＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭＰＳ３Ｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼ（ＧＮＳ）、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ（ＮＡＧＡ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、ヘキソサミニダーゼαサブユニット（ＨＥＸＡ）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＩＰＡ）、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペンチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性α−Ｌ−フコシダーゼ、カテプシンＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、アリールスルファターゼＢ、アリールスルファターゼＡ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、またはα−ノイラミダーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１２６〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
  177. 異種核酸は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア細胞由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）、抗酸化物質、抗血管新生性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、およびアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１７６に記載の方法。
  178. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項１２６〜１７５のいずれか１項に記載の方法。
  179. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項１７８に記載の方法。
  180. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項１２６〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
  181. 異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項１２６〜１８０のいずれか１項に記載の方法。
  182. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１８０に記載の方法。
  183. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項１８０に記載の方法。
  184. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニュ
    ーロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項１８２または１８３に記載の方法。
  185. ＣＮＳの細胞はニューロンである、請求項１８２〜１８４のいずれか１項に記載の方法。
  186. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項１２６〜１８５のいずれか１項に記載の方法。
  187. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項１８６に記載の方法。
  188. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項１８７に記載の方法。
  189. 個体はヒトである、請求項１２６〜１８８のいずれか１項に記載の方法。
  190. 異種核酸は、ＣＮＳの障害を処置するために使用される治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項１２６〜１８９のいずれか１項に記載の方法。
  191. ＣＮＳの障害は、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核神経節変性症（ＣＢＧＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、多系統委縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、または脳の癌である、請求項１９０に記載の方法。
  192. 障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、小児性バッテン病（ＣＮＬ１）、古典的遅発型小児性バッテン病（ＣＮＬ２）、若年性バッテン病（ＣＮＬ３）、ＣＮＬ４型バッテン、ＣＮＬ５型バッテン、ＣＮＬ６型バッテン、ＣＮＬ７型バッテン、ＣＮＬ８型バッテン、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシドシアリドーシス、ゴーシェ病１型、ゴーシェ病２型、ゴーシェ病３型、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス症、βマンノシドーシス症、マロトー・ラミー、異染性白質ジストロフィー症、モルキオＡ型、モルキオＢ型、ムコリピドーシス症ＩＩ／ＩＩＩ型、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型、ポンペ病、サンドホッフ病、サンフィリポ病Ａ型、サンフィリポ病Ｂ型、サンフィリポＣ型、サンフィリポＤ型、シンドラー病、シンドラー・神崎、シアリドーシス、スライ病、テイ・サックス病、およびウォルマン病からなる群から選択されるリソソーム蓄積症である、請求項１９１に記載の方法。
  193. ＣＮＳの障害は、ハンチントン病またはパーキンソン病である、請求項１９１に記載の方法。
  194. 個体のハンチントン病を処置する方法であって、
    組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位
    置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  195. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項１９４に記載の方法。
  196. 治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である、請求項１９５に記載の方法。
  197. 治療用核酸は、ハンチンチンに対するＲＮＡｉを含む、請求項１９５に記載の方法。
  198. ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである、請求項１９７に記載の方法。
  199. 個体のパーキンソン病を処置する方法であって、
    組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  200. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項１９９に記載の方法。
  201. 治療用ポリペプチドは、ＴＨ、ＧＴＰＣＩＩ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよび／もしくはＡＡＤＣ；またはその断片である、請求項２００に記載の方法。
  202. 治療用ポリペプチドは、ＡＡＤＣまたはその断片である、請求項２００または請求項２０１に記載の方法。
  203. 異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項１９４〜２０２のいずれか１項に記載の方法。
  204. ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項１９４〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
  205. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）カプシドを含む、請求項１９４〜２０４のいずれか１項に記載の方法。
  206. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を増加させる、請求項１９４〜２０５のいずれか１項に記載の方法。
  207. １つまたはそれ以上の置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約１００％低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項２０６に記載の方法。
  208. ｒＡＡＶ粒子は、定位送達によって送達される、請求項１９４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
  209. ｒＡＡＶ粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項１９４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
  210. ｒＡＡＶ粒子は、ＣＥＤ送達システムを使用して送達される、請求項２０９に記載の方法。
  211. ＣＥＤ送達システムは、カニューレおよび／またはポンプを含む、請求項２１０に記載の方法。
  212. カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである、請求項２１１に記載の方法。
  213. ポンプは、手動ポンプである、請求項２１１または２１２に記載の方法。
  214. ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項２１１または２１２に記載の方法。
  215. ポンプは、注入ポンプである、請求項２１１または２１２に記載の方法。
  216. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項１９４〜２１５のいずれか１項に記載の方法。
  217. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項２１６に記載の方法。
  218. 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項１９４〜２１７のいずれか１項に記載の方法。
  219. 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項２１８に記載の方法。
  220. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項１９４〜２１９のいずれか１項に記載の方法。
  221. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項２２０に記載の方法。
  222. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項１９４〜２２１のいずれか１項に記載の方法。
  223. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項２２２に記載の方法。
  224. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８におけるものである、請求項１９４〜２２３のいずれか１項に記載の方法。
  225. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７、５２７または５３２位におけるものである、請求項２２４に記載の方法。
  226. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項２２４または２２５に記載の方法。
  227. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項１９４〜２２４および２２６のいずれか１項に記載の方法。
  228. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４、Ｒ４８７および／またはＫ５３２位における置換を含む、請求項１９４〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
  229. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  230. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４およびＲ４８７位における置換を含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  231. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  232. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換を含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  233. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  234. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項１９４〜２２８のいずれか１項に記載の方法。
  235. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位における
    ものである、請求項１９４〜２２３のいずれか１項に記載の方法。
  236. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項２３５に記載の方法。
  237. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位における置換であるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位における置換である、請求項２３５または２３６に記載の方法。
  238. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２３５〜２３７のいずれか１項に記載の方法。
  239. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項２３５〜２３８のいずれか１項に記載の方法。
  240. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項１９４〜２３９のいずれか１項に記載の方法。
  241. 異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある、請求項１９４〜２３９のいずれか１項に記載の方法。
  242. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２４０に記載の方法。
  243. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項２４０に記載の方法。
  244. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項２４２または２４３に記載の方法。
  245. 脳の細胞はニューロンである、請求項２４３に記載の方法。
  246. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項１９４〜２４５のいずれか１項に記載の方法。
  247. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項２４６に記載の方法。
  248. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項２４７に記載の方法。
  249. 個体はヒトである、請求項３７〜４６および１９０〜２４８のいずれか１項に記載の方法。
  250. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、請求項１〜４６および１２６〜２４９のいずれか１項に記載の方法において使用するためのキット。
  251. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）に異種核酸を送達するためのキットであって、
    組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記キット。
  252. 個体の中枢神経系（ＣＮＳ）障害を処置するためのキットであって、
    組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物を含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）ＣＮＳ障害を処置するための異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記キット。
  253. ＣＮＳ障害は、ハンチントン病である、請求項２５１または２５２に記載のキット。
  254. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項２５１〜２５３のいずれか１項に記載のキット。
  255. 治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である、請求項２５４に記載のキット。
  256. 治療用核酸は、ハンチンチンに対するＲＮＡｉを含む、請求項２５４に記載のキット。
  257. ＲＮＡｉは、ｍｉＲＮＡである、請求項２５６に記載のキット。
  258. ＣＮＳ障害は、パーキンソン病である、請求項２５１または２５２に記載のキット。
  259. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項２５８に記載のキット。
  260. 治療用ポリペプチドは、ＴＨ、ＧＴＰＣＩＩ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよび／もしくはＡＡＤＣ；またはその断片である、請求項２５９に記載のキット。
  261. 治療用ポリペプチドは、ＡＡＤＣまたはその断片である、請求項２５９または請求項２６０に記載のキット。
  262. 請求項１〜４６および１２６〜２４９のいずれか１項に記載の方法において使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  263. 請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法における、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の使用。
  264. 請求項１２６〜２４９のいずれか１項に記載の方法において使用するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  265. 個体のハンチントン病またはパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含み、
    線条体への送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子。
  266. 個体のハンチントン病またはパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子であって、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒ
    ＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含み、
    単一部位送達用に製剤化される、前記ｒＡＡＶ粒子。
  267. 異種核酸は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項２５０〜２６１のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２６６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  268. ｒＡＡＶ粒子は、参照ｒＡＡＶカプシドを含むｒＡＡＶ粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項２５０〜２６１および２６７のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２６７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  269. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、請求項２５０〜２６１、２６７および２６８のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２６８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  270. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を増加させる、請求項２５０〜２６１および２６７〜２６９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２６９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  271. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶ粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約１００％低減させるか、または細胞への形質導入を少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約１００％増加させる、請求項２７０に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  272. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７１のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  273. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項２７２に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  274. 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７３のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  275. 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項２７４に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  276. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７５のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  277. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項２７６に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  278. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７７のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  279. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項２７８に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  280. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４４８、４５１、４８４、４８７、５２７、５３２、５８５および／または５８８におけるものである、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  281. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８４、４８７または５３２位におけるものである、請求項２８０に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  282. ナンバリングは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２のＶＰ１に基づく、請求項２８０または２８１に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  283. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５２７、Ｋ５３２、Ｒ５８５および／またはＲ５８８位における置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８０および２８２のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８０および２８２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  284. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４、Ｒ４８７および／またはＫ５３２位における置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８３のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  285. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号２、４および／または６に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  286. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４およびＲ４８７位における置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  287. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ５８５およびＲ５８８位における置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  288. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてＲ４８４ＡおよびＲ４８７Ａ置換またはＲ５８５ＡおよびＲ５８８Ａ置換を含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  289. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてアミノ酸置換Ｒ５８５ＡおよびＲ５８８Ａを含む、請求項１１４〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜１４９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  290. ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ２のＶＰ１に基づいてナンバリングしてアミノ酸置換Ｋ５３２Ａを含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜２８４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２８４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  291. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８、５３３もしくは５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５２８もしくは５３３位におけるものである、請求項２５０〜２６１および２６７〜２７９のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２７９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  292. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項２９１に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  293. １つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８、Ｒ５３３もしくはＴ５８９位におけるものであるか、または該１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＲ４８５、Ｒ４８８、Ｋ５２８もしくはＲ５３３位におけるものである、請求項２９１または２９２に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  294. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１１に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項２９１〜２９３のいずれか１項に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  295. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｒ５３３Ａ置換を含む、請求項２９１〜２９４のいずれか１項に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  296. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項２５０〜２６１および２６７〜２９５のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２９５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  297. 異種核酸は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ＣＫ６プロモーター、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、ＴＫプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター（ＴＲＥ）、ＨＢＶプロモーター、ｈＡＡＴプロモーター、ＬＳＰプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、Ｅ２Ｆプロモーター、テロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモータ
    ー；サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン／ウサギβ−グロビンプロモーター（ＣＡＧ）プロモーター、伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および１３−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある、請求項２５０〜２６１および２６７〜２９５のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜２９５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  298. 異種核酸は、ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２９６に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  299. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、脳の１つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項２９６に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  300. ＣＮＳの１つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および／またはプルキンエ細胞である、請求項２９８または請求項２９９に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  301. 脳の細胞はニューロンである、請求項２９９に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  302. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項２５０〜１２７および２６７〜３０１のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜３０１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  303. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項３０２に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  304. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項３０３に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  305. 個体はヒトである、請求項２５０〜２６１および２６７〜３０４のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜３０４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  306. ｒＡＡＶ粒子は、組成物中にある、請求項２５０〜２６１および２６７〜３０５のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜３０５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  307. 組成物は、緩衝剤および／または医薬的に許容される賦形剤を含む、請求項３０６に記載のキットまたはｒＡＡＶ粒子。
  308. ｒＡＡＶ粒子の組成物をＣＮＳに、場合により線条体に、送達のための説明書をさらに含む、請求項２５０〜２６１および２６７〜３０７のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜３０７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  309. ｒＡＡＶ粒子の組成物をＣＮＳ内の単一部位に送達のための説明書をさらに含む、請求
    項２５０〜２６１および２６７〜３０８のいずれか１項に記載のキットまたは請求項２６２〜３０８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  310. ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  311. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３１０に記載のｒＡＡＶ粒子。
  312. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６位におけるものである、請求項３１０または３１１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  313. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項３１２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  314. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６位おける置換を含む、請求項３１２または３１３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  315. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして、Ａ５８６Ｒ置換を含む、請求項３１２〜３１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  316. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項３１０〜３１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  317. ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を増加させる方法であって、
    該カプシドタンパク質に、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することを含み、
    該１つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を増加させる、前記方法。
  318. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３１７に記載の方法。
  319. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６位におけるものである、請求項３１７または３１８に記載の方法。
  320. ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項３１７〜３１９のいずれか１項に記載の方法。
  321. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６位おける置換を含む、請求項３１７〜３２０のいずれか１項に記載の方法。
  322. １つのアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして、Ａ５８６Ｒ置換を含む、請求項３１７〜３２１のいずれか１項に記載の方法。
  323. ｒＡＡＶ粒子は、配列番号１０に対して少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％配列同一性を有する１つまたはそれ以上のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含む、請求項３１７〜３２２のいずれか１項に記載の方法。
  324. ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ１カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  325. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３２４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  326. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３２４または３２５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  327. ナンバリングは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ１のＶＰ１に基づく、請求項３２６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  328. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項３２６または３２７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  329. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６Ｒ置換を含む、請求項３２６〜３２８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  330. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９Ｒ置換を含む、請求項３２６〜３２９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  331. ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ６カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  332. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶ６カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３３１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  333. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３３１または３３２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  334. ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく、請求項３３３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  335. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項３３３または３３４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  336. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６Ｒ置換を含む、請求項３３３〜３３５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  337. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９Ｒ置換を含む、請求項３３３〜３３６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  338. ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ８カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  339. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３３８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  340. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項３３８または３３９に記載のｒＡＡＶ粒子。
  341. ナンバリングは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ８のＶＰ１に基づく、請求項３３８〜３４０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  342. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＴ５９１位における置換を含む、請求項３４０または３４１に記載のｒＡＡＶ粒子。
  343. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８Ｒ置換を含む、請求項３４０〜３４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  344. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１Ｒ置換を含む、請求項３４０〜３４３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  345. ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ９カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  346. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の
    形質導入効率を、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３４５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  347. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３４５または３４６に記載のｒＡＡＶ粒子。
  348. ナンバリングは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９のＶＰ１に基づく、請求項３４７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  349. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＡ５８９位における置換を含む、請求項３４７または３４８に記載のｒＡＡＶ粒子。
  350. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６Ｒ置換を含む、請求項３４７〜３４９のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  351. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９Ｒ置換を含む、請求項３４７〜３５０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  352. ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  353. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３５２に記載のｒＡＡＶ粒子。
  354. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項３５２または３５３に記載のｒＡＡＶ粒子。
  355. ナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づく、請求項３５４に記載のｒＡＡＶ粒子。
  356. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＡ５９１位における置換を含む、請求項３５４または３５５に記載のｒＡＡＶ粒子。
  357. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８Ｒ置換を含む、請求項３５４〜３５６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  358. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１Ｒ置換を含む、請求項３５４〜３５７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  359. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５３３、５８６および／もしくは５８９位におけるものであり、ならびに／または
    ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０、５３５、５８８および／もしくは５９１位におけるものである、請求項１〜４６および１２６〜２４９のいずれか１項に記載の方法。
  360. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５３３、５８６および／もしくは５８９位におけるものであり、ならびに／または
    ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０、５３５、５８８および／もしくは５９１位におけるものである、請求項４７〜８６のいずれか１項に記載のシステム。
  361. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５３３、５８６および／もしくは５８９位におけるものであり、ならびに／または
    ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０、５３５、５８８および／もしくは５９１位におけるものである、請求項８７〜１２５および２５０〜２６１のいずれか１項に記載のキット。
  362. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６もしくはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８、５３３、５８６および／もしくは５８９位におけるものであり、ならびに／または
    ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含み、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０、５３５、５８８および／もしくは５９１位におけるものである、請求項２６２〜３１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ粒子。
  363. ＡＡＶ１、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、
    該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８５、４８８または５３３位における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  364. ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、
    該カプシドタンパク質は、ＡＡＶ８またはＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして４８７、４９０または５３５位における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  365. 個体の網膜に異種核酸を送達する方法であって、
    該個体に組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を硝子体内投与することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置にお
    ける、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  366. 個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の硝子体内送達後の細胞へのｒＡＡＶ形質導入を、野生型カプシドを含むｒＡＡＶでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；
    該ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  367. 個体の眼へのｒＡＡＶ粒子の硝子体内送達後の異種核酸発現を向上させる方法であって、
    ＡＡＶカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置において、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置において、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み；
    前記ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクターを含む、前記方法。
  368. 個体の眼障害を処置する方法であって、
    ｒＡＡＶ粒子を含む組成物を個体の網膜に硝子体内送達することを含み、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ａ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｂ）異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む、前記方法。
  369. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の電荷を改変する、請求項３６５〜３６８のいずれか１項に記載の方法。
  370. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項３６５〜３６９のいずれか１項に記載の方法。
  371. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項３６５〜３７０のいずれか１項に記載の方法。
  372. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項３７１に記載の方法。
  373. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項３６５〜３７２のいずれか１項に記載の方法。
  374. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項３６５〜３７３のいずれか１項に記載の方法。
  375. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ８Ｒ（ＡＡＶｒｈ８Ｒ）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４のいずれか１項に記載の方法。
  376. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３７５に記載の方法。
  377. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項３７６に記載の方法。
  378. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項３７５〜３７７のいずれか１項に記載の方法。
  379. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む、請求項３７５〜３７８のいずれか１項に記載の方法。
  380. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項３７５〜３７９のいずれか１項に記載の方法。
  381. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４のいずれか１項に記載の方法。
  382. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３８１に記載の方法。
  383. ナンバリングは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ１のＶＰ１に基づく、請求項３８２に記載の方法。
  384. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項３８１〜３８３のいずれか１項に記載の方法。
  385. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項３８１〜３８４のいずれか１項に記載の方法。
  386. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項３８１〜３８５のいずれか１項に記載の方法。
  387. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４のいずれか１項に記載の方法。
  388. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３８７に記載の方法。
  389. ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく、請求項３８８に記載の方法。
  390. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項３８７〜３８９のいずれか１項に記載の方法。
  391. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項３８７〜３９０のいずれか１項に記載の方法。
  392. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項３８７〜３９１のいずれか１項に記載の方法。
  393. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４のいずれか１項に記載の方法。
  394. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項３９３に記載の方法。
  395. ナンバリングは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ８のＶＰ１に基づく、請求項３９４に記載の方法。
  396. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＴ５９１位における置換を含む、請求項３９３〜３９５のいずれか１項に記載の方法。
  397. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項３９３〜３９６のいずれか１項に記載の方法。
  398. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１ＲまたはＴ５９１Ｋ置換を含む、請求項３９３〜３９７のいずれか１項に記載の方法。
  399. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４
    のいずれか１項に記載の方法。
  400. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項３９９に記載の方法。
  401. ナンバリングは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９のＶＰ１に基づく、請求項４００に記載の方法。
  402. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＡ５８９位における置換を含む、請求項３９９〜４０１のいずれか１項に記載の方法。
  403. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項３９９〜４０２のいずれか１項に記載の方法。
  404. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９ＲまたはＡ５８９Ｋ置換を含む、請求項３９９〜４０３のいずれか１項に記載の方法。
  405. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）カプシドを含む、請求項３６５〜３７４のいずれか１項に記載の方法。
  406. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項４０５に記載の方法。
  407. ナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づく、請求項４０６に記載の方法。
  408. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＡ５９１位における置換を含む、請求項４０５〜４０７のいずれか１項に記載の方法。
  409. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項４０５〜４０８のいずれか１項に記載の方法。
  410. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１ＲまたはＡ５９１Ｋ置換を含む、請求項４０５〜４０９のいずれか１項に記載の方法。
  411. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項３６５〜４１０のいずれか１項に記載の方法。
  412. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項３６５〜４１１のいずれか１項に記載の方法。
  413. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項３６５〜４１２のいずれか１項に記載の方法。
  414. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項３６５〜４１１のいずれか１項に記載の方法。
  415. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項４１４に記載の方法。
  416. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項３６５〜４１５のいずれか１項に記載の方法。
  417. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項３６５〜４１６のいずれか１項に記載の方法。
  418. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項４１７に記載の方法。
  419. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項４１７または４１８に記載の方法。
  420. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項４１６〜４１９のいずれか１項に記載の方法。
  421. 個体はヒトである、請求項３６５〜４２０のいずれか１項に記載の方法。
  422. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項４２１に記載の方法。
  423. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項３６５〜４２２のいずれか１項に記載の方法。
  424. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項４２３に記載の方法。
  425. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項４２４に記載の方法。
  426. ｒＡＡＶ粒子は、医薬組成物中にある、請求項３６５〜４２５のいずれか１項に記載の方法。
  427. 医薬組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである、請求項４２６に記載の方法。
  428. ｒＡＡＶ粒子の医薬組成物は、個体の視覚機能の処置に有効である、請求項４２６または４２７に記載の方法。
  429. 視覚機能は、微小視野測定、暗順応視野測定、視覚の動きの評価、視力、ＥＲＧ、または読字評価によって評価される、請求項４２８に記載の方法。
  430. 個体の視覚機能を向上させる結果となる、請求項４２８または４２９に記載の方法。
  431. 眼障害の進行に起因するヒトの視覚機能低下の進行の予防または減速する結果となる、請求項３６５〜４３０のいずれか１項に記載の方法。
  432. 個体の眼にベクターを硝子体内送達するためのシステムであって、
    ａ）ｒＡＡＶ粒子の有効量を含む組成物であって、
    ｉ）該ｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、
    ｉｉ）該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用ＲＮＡをコードする異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ末端反復とを含む、前記組成物；および
    ｂ）ｒＡＡＶの硝子体内送達のためのデバイス
    を含む前記システム。
  433. デバイスは、細径カニューレおよび注射器を含み、該細径カニューレは、２７〜４５ゲージである、請求項４３２に記載のシステム。
  434. ｒＡＡＶ粒子の組成物は、注射器内に収容されている、請求項４３３に記載のシステム。
  435. カニューレは、注射器に取り付けられている、請求項４３３または４３４に記載のシステム。
  436. 組成物中の粒子の濃度は、約１×１０６ＤＲＰ／ｍｌ〜約１×１０１４ＤＲＰ／ｍｌである、請求項４３２〜４３５のいずれか１項に記載のシステム。
  437. ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１カプシド、ＡＡＶ２カプシド、ＡＡＶ３カプシド、ＡＡＶ６カプシド、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシド、ＡＡＶ９カプシド、またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、請求項４３２〜４３６のいずれか１項に記載のシステム。
  438. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の電荷を改変する
    、請求項４３２〜４３７のいずれか１項に記載のシステム。
  439. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項４３８に記載のシステム。
  440. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項４３２〜４３９のいずれか１項に記載のシステム。
  441. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項４４０に記載のシステム。
  442. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項４３２〜４４１のいずれか１項に記載のシステム。
  443. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項４３２〜４４２のいずれか１項に記載のシステム。
  444. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４３２〜４４３のいずれか１項に記載のシステム。
  445. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項４４４に記載のシステム。
  446. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項４３２〜４４５のいずれか１項に記載のシステム。
  447. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む、請求項４３２〜４４６のいずれか１項に記載のシステム。
  448. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項４３２〜４４７のいずれか１項に記載のシステム。
  449. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４３２〜４４８のいずれか１項に記載のシステム。
  450. ナンバリングは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ１のＶＰ１に基づく、請求項４４９に記載のシステム。
  451. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項４４９または請求項４５０に記載のシステム。
  452. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項４４９〜４５１のいずれか１項に記載のシステム。
  453. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項４４９〜４５２のいずれか１項に記載のシステム。
  454. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４３２〜４４８のいずれか１項に記載のシステム。
  455. ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく、請求項４５４に記載のシステム。
  456. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項４５４または請求項４５５のいずれか１項に記載のシステム。
  457. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項４５４〜４５６のいずれか１項に記載のシステム。
  458. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項４５４〜４５７のいずれか１項に記載のシステム。
  459. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項４３２〜４４８のいずれか１項に記載のシステム。
  460. ナンバリングは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ８のＶＰ１に基づく、請求項４５９に記載のシステム。
  461. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＴ５９１位における置換を含む、請求項４５９または４６０に記載のシステム。
  462. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項４５９〜４６１のいずれか１項に記載のシステム。
  463. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１ＲまたはＴ５９１Ｋ置換を含む、請求項４５９〜４６２のいずれか１項に記載のシステム。
  464. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４３２〜４４８のいずれか１項に記載のシステム。
  465. ナンバリングは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９のＶＰ１に基づく、請求項４６４に記載のシステム。
  466. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＡ５８９位における置換を含む、請求項４６４または４６５に記載のシステム。
  467. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項４６４〜４６６のいずれか１項に記載のシステム。
  468. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９ＲまたはＡ５８９Ｋ置換を含む、請求項４６４〜４６７のいずれか１項に記載のシステム。
  469. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項４３２〜４４８のいずれか１項に記載のシステム。
  470. ナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づく、請求項４６９に記載のシステム。
  471. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＡ５９１位における置換を含む、請求項４６９または４７０に記載のシステム。
  472. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項４６９〜４７１のいずれか１項に記載のシステム。
  473. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１ＲまたはＡ５９１Ｋ置換を含む、請求項４６９〜４７２のいずれか１項に記載のシステム。
  474. 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項４３２〜４７３のいずれか１項に記載のシステム。
  475. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４３２〜４７４のいずれか１項に記載のシステム。
  476. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４３２〜４７５のいずれか
    １項に記載のシステム。
  477. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項４３２〜４７４のいずれか１項に記載のシステム。
  478. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項４７７に記載のシステム。
  479. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項４３２〜４７８のいずれか１項に記載のシステム。
  480. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４３２〜４７９のいずれか１項に記載のシステム。
  481. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項４８０に記載のシステム。
  482. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項４８１に記載のシステム。
  483. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項４７９〜４８２のいずれか１項に記載のシステム。
  484. 個体はヒトである、請求項４３２〜４８３のいずれか１項に記載のシステム。
  485. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項４８４に記載のシステム。
  486. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項４３２〜４８５のいずれか１項に記載のシステム。
  487. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項４８６に記載のシステム。
  488. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項４８７に記載のシステム。
  489. 請求項３６５〜４３１のいずれか１項に記載の方法において使用するためのキット。
  490. 眼障害を処置するためのキットであって、
    ａ）ｒＡＡＶ粒子を含む組成物であって、
    該ｒＡＡＶ粒子は、
    ｉ）ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する１つもしくはそれ以上の位置における、またはＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５もしくは５８８に対応する１つもしくはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶカプシド、および
    ｉｉ）眼障害を処置するための該異種核酸と少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復配列とを含むｒＡＡＶベクター
    を含む前記組成物；ならびに
    ｂ）硝子体内投与に好適な医薬品賦形剤
    を含み、
    場合により、該ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０カプシドを含む、前記キット。
  491. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ｒＡＡＶカプシドタンパク質の電荷を改変する、請求項４８９または４９０に記載のキット。
  492. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項４９１に記載のキット。
  493. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項４８９〜４９２のいずれか１項に記載のキット。
  494. 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項４９３に記載のキット。
  495. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項４８９〜４９４のいずれか１項に記載のキット。
  496. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項４８９〜４９５のいずれか１項に記載のキット。
  497. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  498. ナンバリングは、配列番号９のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づく、請求項４９７に記載のキット。
  499. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＡ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項４８９〜４９８のいずれか１項に記載のキット。
  500. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８６ＲまたはＡ５８６Ｋ置換を含む、請求項４８９〜４９９のいずれか１項に記載のキット。
  501. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ８ＲのＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項４８９〜５００のいずれか１項に記載のキット。
  502. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  503. ナンバリングは、配列番号１２のアミノ酸配列を含むＡＡＶ１のＶＰ１に基づく、請求項５０２に記載のキット。
  504. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項５０２または５０３に記載のキット。
  505. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項５０２〜５０４のいずれか１項に記載のキット。
  506. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ１のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項５０２〜５０５のいずれか１項に記載のキット。
  507. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  508. ナンバリングは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ６のＶＰ１に基づく、請求項５０７に記載のキット。
  509. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＴ５８９位における置換を含む、請求項５０７または５０８に記載のキット。
  510. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項５０７〜５０９のいずれか１項に記載のキット。
  511. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ６のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５８９ＲまたはＴ５８９Ｋ置換を含む、請求項５０７〜５１０のいずれか１項に記載のキット。
  512. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  513. ナンバリングは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＡＡＶ８のＶＰ１に基づく、請求項５１２に記載のキット。
  514. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＴ５９１位における置換を含む、請求項５１２または５１３に記載のキット。
  515. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項５１２〜５１４のいずれか１項に記載のキット。
  516. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ８のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｔ５９１ＲまたはＴ５９１Ｋ置換を含む、請求項５１２〜５１５のいずれか１項に記載のキット。
  517. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８６および／または５８９位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  518. ナンバリングは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＡＡＶ９のＶＰ１に基づく、請求項５１７に記載のキット。
  519. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＳ５８６および／またはＡ５８９位における置換を含む、請求項５１７または５１８に記載のキット。
  520. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｓ５８６ＲまたはＳ５８６Ｋ置換を含む、請求項５１７〜５１９のいずれか１項に記載のキット。
  521. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶ９のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５８９ＲまたはＡ５８９Ｋ置換を含む、請求項５１７〜５２０のいずれか１項に記載のキット。
  522. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングして５８８および／または５９１位におけるものである、請求項４８９〜４９６のいずれか１項に記載のキット。
  523. ナンバリングは、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づく、請求項５２２に記載のキット。
  524. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてＱ５８８および／またはＡ５９１位における置換を含む、請求項５２２または５２３に記載のキット。
  525. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ｑ５８８ＲまたはＱ５８８Ｋ置換を含む、請求項５２２〜５２４のいずれか１項に記載のキット。
  526. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、ＡＡＶｒｈ１０のＶＰ１に基づいてナンバリングして、Ａ５９１ＲまたはＡ５９１Ｋ置換を含む、請求項５２２〜５２５のいずれか１項に記載のキット。
  527. 異種核酸は、
    治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
    をコードする、請求項４８９〜５２６のいずれか１項に記載のキット。
  528. 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４８９〜５２７のいずれか１項に記載のキット。
  529. 異種核酸は、次のもの：
    Ｐｒｐｈ２、ＲＰＥ６５、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＣＡ５、ＣＲＸ、ＣＥＰ２９０、ＭＹＯ ７ａ、Ｃｌａｒｉｎ、ＡＢＣＡ４、ＲＤＨ１２、ＩＭＰＤＨ１、ＣＲＢ１、ＬＲＡＴ、ＮＭＮＡＴ１、ＴＵＬＰ１、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲ、ＲＰ２、ＲＰＧＲＩＰ、ＣＮＧＡ３、ＣＮＧＢ３、ＧＮＡＴ２、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＦＧＦ２、ＰＥＤＦ、ＥＰＯ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ−Ｘ、ＮＦκＢ、エンドスタチン、アンジオスタチン、ｓＦｌｔ、ｓＰＤＧＦ−Ｒ、ＩＬ１０、抗ＩＬ１７、ｓＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１−ｒａ、抗ＴＧＦβ、ｓＴＮＦ−Ｒ Ｉ、ｓＴＮＦ−Ｒ ＩＩおよびＩＬ４
    からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項４８９〜５２８のいずれか１項に記載のキット。
  530. 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項４８９〜５２７のいずれか１項に記載のキット。
  531. 治療用核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたはＤＮＡザイムである、請求項５３０に記載のキット。
  532. 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項４８９〜５３１のいずれか１項に記載のキット。
  533. 異種核酸は、１つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項４８９〜５３２のいずれか１項に記載のキット。
  534. 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および／または神経節細胞である、請求項５３３に記載のキット。
  535. 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項５３４に記載のキット。
  536. プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである、請求項５３２〜５３５のいずれか１項に記載のキット。
  537. 個体はヒトである、請求項４８９〜５３６のいずれか１項に記載のキット。
  538. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、Ｘ連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生ＡＭＤ、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項５３７に記載のキ
    ット。
  539. 異種核酸は：
    常染色体劣性重症早期発症型網膜変性（レーバー先天黒内障）、シュタルガルト病、網膜色素変性、アッシャー症候群および加齢性黄斑変性
    からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項５３８に記載のキット。
  540. ｒＡＡＶベクターは、自己相補型ｒＡＡＶベクターである、請求項４８９〜５３９のいずれか１項に記載のキット。
  541. ベクターは、異種核酸をコードする第１の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第２の核酸配列とを含み、該第１の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第２の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項５４０に記載のキット。
  542. 第１の核酸配列および第２の核酸配列は、突然変異ＡＡＶ ＩＴＲによって連結されており、該突然変異ＡＡＶ ＩＴＲは、Ｄ領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項５４１に記載のキット。
  543. ｒＡＡＶ粒子の組成物の硝子体内送達のためのデバイスをさらに含む、請求項４８９〜５４２のいずれか１項に記載のキット。
  544. ｒＡＡＶ粒子の組成物の硝子体内送達のための説明書をさらに含む、請求項４８９〜５４３のいずれか１項に記載のキット。
  545. 個体はヒトである、請求項４２２〜４３１のいずれか１項に記載の方法または請求項５３８〜５４４のいずれか１項に記載のキット。
  546. ＡＡＶ３カプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子であって、該ＡＡＶ３カプシドタンパク質は、ＡＡＶ２のＶＰ１ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸４８４、４８７、５２７、５３２、５８５または５８８に対応する１つまたはそれ以上の位置における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記ｒＡＡＶ粒子。
  547. １つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのｒＡＡＶ粒子の形質導入効率を、野生型ＡＡＶｒｈ８Ｒカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約１００％増加させる、請求項５４６に記載のｒＡＡＶ粒子。
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