JP2017518271A - 網膜およびcns遺伝子治療用aavベクター - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年5月2日に出願した米国特許仮出願第61/988,131号および2015年2月10日に出願した米国特許仮出願第62/114,575号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている:コンピュータ読み取り可能な形式(CRF)の配列表(ファイル名:159792010440SEQLIST.txt、データ記録日:2015年4月29日、サイズ:85KB)。
さらなる実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択されるポリペプチドをコードする:Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、クラリン、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R II、およびIL4。他の実施形態において、異種核酸は、治療用核酸をコードする。さらなる実施形態において、治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである。いくつかの実施形態において、rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである。いくつかの実施形態において、本発明のAAV粒子は、HSPGとの結合を改変する(例えば、HSPGとの結合を低減もしくは除去する)1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含むカプシド、および治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする異種核酸を含み、前記異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある。いくつかの実施形態において、異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、異種核酸は、次のものからなる群から選択される眼障害を処置するために使用される:常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎。いくつかの実施形態において、rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる。いくつかの実施形態において、第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、前記突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる。
本明細書に記載するまたは本明細書中で参照する技術および手順は一般によく理解されており、当業者によって、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら、2003);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson、B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、1995);Antibodies、A Laboratory Manual(Harlow and Lane編、1988);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney、第6版、J.Wiley and Sons、2010);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、Academic Press、1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、Plenum Press、1998);Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、J.Wiley and Sons、1993〜8頁);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1996);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullisら編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、J.Wiley and Sons、2002);Immunobiology(C.A.Janewayら、2004);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.HarlowおよびD.Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);およびCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVitaら編、J.B.Lippincott Company、2011)のような従来の方法論を用いて一般に利用される。
「ベクター」は、本明細書で用いる場合、in vitroまたはin vivoのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)は、AAV2粒子の細胞受容体として作用することは当技術分野において公知である(Summerford,C.およびSamulski,R.J.(1998)J.Virol.72(2):1438〜45頁)。AAV2粒子と細胞膜のHSPGとの結合は、該粒子を該細胞に付けるのに役立つ。他の細胞表面タンパク質、例えば、線維芽細胞増殖因子受容体およびαvβ5インテグリンも細胞感染を助長することができる。結合後、AAV2粒子は、クラスリン被覆ピットによる受容体依存性エンドサイトーシスをはじめとするメカニズムによって細胞に侵入することができる。AAV2粒子は、エンドソーム酸性化によって細胞内小胞から放出される。これによって、AAV2粒子は核周囲領域に、そしてその後、細胞核に移動することが可能になる。AAV3粒子がヘパランに結合することも公知である(Rabinowitz,J.E.ら(2002)J.Virol.76(2):791〜801頁)。
網膜疾患、例えば、LCA、網膜色素変性および加齢性黄斑変性のための遺伝子治療プロトコールは、網膜の細胞へのベクターの局所的送達を必要とする。これらの疾患において処置標的となる細胞は、網膜の光受容器細胞であるか、または網膜神経感覚上皮の下にあるRPEの細胞である。これらの細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、網膜とRPE間の網膜下腔への注射を必要とする。いくつかの実施形態において、本発明は、rAAV遺伝子治療ベクターを網膜の細胞に送達する方法であって、rAAVベクターが、HSPGと相互作用する1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を含むAAVカプシドに封入されている、前記方法を提供する。
本発明は、眼障害の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むrAAV粒子が個体の網膜に送達される、前記方法を提供する。rAAVカプシド(例えば、rAAV2、rAAVrh8Rなどの粒子)であって、HSPGと相互作用する該カプシドの1つまたはそれ以上のアミノ酸はrAAV粒子のHSPGとの結合を低減または除去するように置換されている、前記rAAVカプシドへのrAAVベクターの封入によって、網膜の細胞への形質導入向上を達成することができる。ベクターは、ポリペプチド(例えば、治療用もしくは診断用ポリペプチド)および/または治療用核酸をコードする、異種核酸を含むことがある。治療用もしくは診断用ポリペプチドおよび/または治療用核酸をコードする核酸は、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、生じさせることができる。いくつかの実施形態において、異種核酸は、治療用ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、診断用ポリペプチドをコードする。治療用ポリペプチドをコードする核酸の非限定的な例としては、次のものが挙げられる:網膜疾患の原因となることが公知の欠損または突然変異遺伝子の置換のための核酸、例えば、Prph2、RPE65、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3およびGNAT2。治療用ポリペプチドをコードする核酸の他の非限定的な例としては、神経栄養因子(例えば、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO)、抗アポトーシス遺伝子(例えば、BCL2、BCL−X、NFκB)、抗血管新生因子(例えば、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt)、および抗炎症因子(例えば、IL10、IL1−ra、TGFβ、IL4)をコードするものが挙げられる。眼障害のための他の治療用ポリペプチドとしては、Myo7a、ABCA4、REP1、GUCY2D、PDE6C、RS1、RPGRIP、Lpcat1、AIPL1、RDH12、CHMが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、コードされるポリペプチドは、ポリペプチドのヒト変異体である。
上記のベクターが有利であるだろう疾患の一例は、突然変異型ハンチンチンタンパク質(mHTT)の伸長ポリグルタミン(ポリQ)反復配列をコードするCAG反復配列伸長突然変異によって引き起こされるハンチントン病(HD)である。HDは、単一対立遺伝子の突然変異の結果として生じる常染色体優性疾患であるので、DNAベースおよびRNAベースの治療の魅力的な標的である。AAVベクターは、核酸治療に理想的な送達システムを提供することができ、脳内のこれらのハンチンチン低下分子の長期にわたる継続的発現を可能にするであろう。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載するrAAV粒子のいずれかを含む組成物を提供する。一般に、本発明の方法およびシステムに使用するための組成物は、場合により、医薬的に許容される賦形剤中の、ポリペプチドおよび/またはRNAをコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子の有効量を含む。これらのウイルス粒子は、HSPGと相互作用する1つまたはそれ以上のアミノ酸が、HSPGとのrAAV粒子結合を低減または除去するように置換されている、AAVカプシド(例えば、AAV2またはAAVrh8Rカプシド)を含む。当技術分野において周知であるように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、pH緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なTWEEN化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.、N.J.1991)において入手することができる。
網膜下送達方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れられているWO2009/105690を参照されたい。簡単に言うと、rAAV粒子(例えば、rAAV2、rAAVrh8Rなどの粒子)を黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。
硝子体内注射の一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。硝子体内注射の手技は、当技術分野において公知である(例えば、Peyman,G.A.ら(2009)Retina 29(7):875〜912頁、ならびにFagan,X.J.およびAl−Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500〜7頁を参照されたい)。
網膜が複数の層を有することは公知である。網膜の細胞層としては、内境界膜、神経線維、神経節細胞、内網状層、内顆粒層、外網状層、外顆粒層、外境界膜、光受容器、および網膜色素上皮層を挙げることができる。硝子体の最近位にある層は、内境界膜である。この層は、グリアの1類である、ミュラー細胞を含有することができる。神経線維層は、視神経を構成する神経節細胞からの軸索を含有することができる。神経節細胞層は、神経節細胞およびアマクリン細胞を含むことができる。内網状層は、神経節およびアマクリン細胞の樹状突起と双極細胞の軸索の間のシナプスを含有することができる。内顆粒層は、アマクリン、双極および水平細胞の細胞核を含有することができる。外網状層は、水平細胞樹状突起と光受容器細胞突起の間のシナプスを含有することができる。外顆粒層は、光受容器細胞体を含有することができる。外または外部境界膜は、ミュラー細胞先端突起間およびこれらの突起と光受容器細胞内部セグメントの間の細胞結合、例えば接着結合およびデスモソームを含むことができる。杆体錐体層およびヤコブ膜としても公知である、光受容器層は、杆体および錐体を含む光受容細胞を含有することができる。硝子体の最遠位にある網膜層は、色素顆粒を含有する六角形の上皮細胞の層を含むことができる網膜色素上皮(RPE)である。
いくつかの実施形態において、本開示のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む組換えウイルス粒子(例えば、AAV2、AAVrh8Rなどの粒子)の有効量の投与は、投与部位のまたは付近のニューロン(例えば、線条体ニューロン、例えば有棘ニューロン)への形質導入を生じさせる。いくつかの実施形態では、ニューロンの約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%または100%のいずれかより多くが形質導入される。いくつかの実施形態では、ニューロンの約5%〜約100%、10%〜約50%、約10%〜約30%、約25%〜約75%、約25%〜約50%、または約30%〜約50%が形質導入される。異種核酸を発現する組換えウイルス粒子によって形質導入されたニューロンを同定する方法は、当技術分野において公知である;例えば、免疫組織化学、RNA検出(例えば、qPCR、ノーザンブロッティング、RNA−seq、インサイツハイブリダイゼーションなど)、または高感度緑色蛍光タンパク質等の共発現マーカーの使用を用いて、発現を検出することができる。
いくつかの態様において、本発明は、異種核酸を含むrAAVベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達する方法であって、該rAAVベクターは、HSPGと相互作用するアミノ酸の1つまたはそれ以上の置換を含むrAAVカプシド(例えば、rAAV2カプシド、rAAVrh8Rカプシドなど)に封入されている、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のCNSの障害を処置する方法であって、該個体のCNSへのrAAV粒子を含む組成物の送達を含み、該rAAV粒子は、(a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および(b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸(例えば、導入遺伝子)は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーターおよびCK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAGプロモーター;Niwaら、Gene、1991、108(2):193〜9頁)および伸長因子1−αプロモーター(EF1−α)プロモーター(Kimら、Gene、1990、91(2):217〜23頁およびGuoら、Gene Ther.、1996、3(9):802〜10頁)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、眼の細胞において異種核酸を発現する能力がある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光受容器細胞またはRPEにおいて異種核酸を発現する能力がある。実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、例えば、ヒトRKプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、オプシンプロモーター、例えば、ヒトオプシンプロモーターまたはマウスオプシンプロモーターである。
rAAVウイルス粒子
いくつかの態様において、本発明は、異種核酸を含むrAAVベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達する方法であって、該rAAVベクターは、HSPGと相互作用するアミノ酸の1つまたはそれ以上の置換を含むrAAVカプシド(例えば、rAAV2、rAAVrh8Rなど)に封入されている、前記方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、個体のCNSへのrAAV粒子の送達に関する方法およびキットを提供する。
トランスフェクション、安定した細胞株生産、ならびにアデノウイルス−AAVハイブリッド、ヘルペスウイルス−AAVハイブリッド(Conway,JEら(1997)J.Virology 71(11):8780〜8789頁)およびバキュロウイルス−AAVハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス生産系をはじめとする、rAAVベクターを生産するための非常に多くの方法が当技術分野において公知である。rAAVウイルス粒子の生産のためのrAAV生産培養はすべて次のものを必要とする;1)例えば、ヒト由来細胞株、例えばヒーラ、A549もしくは293細胞、またはバキュロウイルス生産系の場合は昆虫由来細胞株、例えばSF−9を含む、安定した宿主細胞;2)野生型もしくは突然変異型アデノウイルス(例えば、温度感受性アデノウイルス)、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、好適なヘルパーウイルス機能;3)AAV repおよびcap遺伝子および遺伝子産物;4)少なくとも1つのAAV ITR配列が隣接している導入遺伝子(例えば、治療用導入遺伝子);および5)rAAV生産を支援する好適な培地および培地成分。当技術分野において公知の好適な培地をrAAVベクターの生産に使用してもよい。これらの培地としては、限定ではないが、変性イーグル培地(MEM)、ダルベッコ変性エーグル培地(DMEM)、特注配合物、例えば、米国特許第6,566,118号に記載されているもの、および米国特許6,723,551に記載されているようなSF−900 II SFM培地を含む、Hyclone LaboratoriesおよびJRHによって生産されている培地が挙げられ、前記特許文献の各々は、その全体が、特に、組換えAAVベクターの生産に使用するための特注培地配合物に関して、参照によって本明細書に組み入れられている。
本明細書に記載のrAAV組成物を、本明細書に記載の発明の方法の1つで使用するために設計されたシステム内に含めてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、個体の眼へのベクターの網膜下送達のためのシステムであって、a)rAAV粒子の有効量を含む組成物[ここで、i)該rAAV粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、ii)該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用RNAをコードする異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含む];およびb)該rAAVの網膜送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。
本発明は、個体のCNSに異種核酸を送達するためのキットであって、rAAV粒子を含む組成物を含み、該rAAV粒子は、(a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および(b)異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記キットを提供する。個体のCNS障害を処置するためのキットであって、rAAV粒子を含む組成物を含み、該rAAV粒子は、a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、およびb)CNS障害を処置するための異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記キットを本明細書においてさらに提供する。
網膜下および/またはCNS送達に関するいくつかの実施形態において、キットは、緩衝剤および/または医薬的に許容される賦形剤をさらに含有する。当技術分野において周知であるように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、pH緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なTWEEN化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.、N.J.1991)において入手することができる。
AAV2遺伝子治療ベクターを眼の適応症の治験で現在使用中である。これらのベクターは、マウスおよび非ヒト霊長類において網膜神経節細胞およびミュラー細胞への形質導入を生じさせる結果となる硝子体内投与経路によって送達することができ、または網膜色素性上皮細胞および光受容器細胞を標的にする網膜下投与経路によって投与することができる。AAVの血清型によって、感染に使用される細胞表面受容体および共受容体が異なる。AAV2の初代細胞表面受容体がヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)であることは公知である(Summerford,C.およびSamulski,R.J.(1998)J.Virol.72(2):1438〜45頁)。AAV2によって網膜が形質導入されるメカニズムを理解することは、AAV遺伝子治療ベクターのさらなる開発のために重要である。
AAV2アルギニン突然変異型プラスミドの構築
Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)を使用してAAV2 rep/capプラスミド、pIM45BD、を突然変異させた。アルギニン585および588のアラニンへの変化を導入するためのPCR突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)または可溶性VEGF受容体ハイブリッド(sFLT02)を発現する組換えAAVベクターを、pIM45BDまたはpIM45BDR585A/R588A rep/capプラスミドおよびpAdHelperを使用する293細胞のトリプルトランスフェクションによって作製した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン(CBA)またはヒトロドプシンキナーゼプロモーター(RK)いずれかの制御下にあった。
293またはヒーラ細胞を24ウェルプレートにプレーティングした(1〜2×105細胞/ウェル)。プレーティングの24時間後、細胞を1×103vg/細胞(+)Ad5ts149に感染させた。感染48時間後、EGFP蛍光またはELISAいずれかによって形質導入効率を測定して、培地中のsFLT02を定量した(R&D Systemsによるヒト可溶性VEGF R1 ELISA)。
Jackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から得られる成体C57BL/6マウスを購入し、Genzymeのビバリウムで維持した。研究継続期間中、動物が食餌および水に自由に近づけるようにした。すべての手順は、施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画のもとで行った。
酸素800mL/分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う3.5%イソルフランの使用によって、非活動状態を誘導し、維持した。33ゲージ斜角針が取り付けられたHamilton注射器(Hamilton Co.、Reno、NV)を使用して、被験物質1マイクロリットルを硝子体液に注射した。強膜を通して縁のおおよそ2mm下に針を誘導し、硝子体房に注意深く進ませて水晶体との接触を回避した。被験物質を1〜2秒間にわたって送達した。注射後、針を、抜き取る前におおよそ5秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
散瞳および調節麻痺をトロピカミド(Alcon、Fort Worth、TX)の局所適用で誘導した。酸素800mL/分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う3.5%イソルフランの使用によって、非活動状態を誘導し、維持した。リング状の先端を有する鉗子(World Precision Instruments、Sarasota、FL)を使用して眼を固定し、30ゲージ針を使用して強膜内の強膜の縁のおおよそ2mm下を予備切開した。切開部を通して33ゲージ鈍先端針を誘導し、先端が後ろの網膜神経感覚上皮を貫通するまで後方に進めた。被験物質1マイクロリットルを1秒にわたって送達した。針を、抜き取る前におおよそ5秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
エピ蛍光顕微鏡を使用して、パラフィン包埋のために処理したホルマリン固定眼に関する生EGFPシグナルを観察した。
図1に示したような5つのカプシド残基はHSPGとのAAV2結合にとって重要であることが証明されている。これらの残基に次の2つのアミノ酸置換を有するAAV2突然変異体を構築した:R585AおよびR588A(ナンバリングは、VP1アミノ酸配列に基づく)。この突然変異体をHBKOと呼び、培養中の細胞へのその形質導入能力を試験した。
硝子体内および網膜下注射したときに眼細胞に形質導入するHBKO突然変異型AAV2粒子の能力をマウスで試験した。図4Aおよび4Bは、硝子体内または網膜下注射時の野生型およびHBKO AAV2粒子の形質導入効率を比較する図である。これらの実験については、遍在性CBAプロモーターを使用してFltの発現を駆動する、導入遺伝子を有するAAV2粒子での形質導入時の可溶性Flt(sFLT)発現を測定することによって、形質導入効率をアッセイした。硝子体内注射を使用すると、HBKO突然変異体は、細胞への形質導入能力の大きな低減を示した(図4A)。
AAV2カプシドに導入された部位特異的突然変異によって、ヘパリンと結合することができないAAV2 HBKO突然変異型ベクターを生成した。このHBKOベクターの形質導入プロファイルを野生型マウスモデルとHDマウスモデル(YAC128)の両方において単回線条体内注射を使用して評価した。
AAV2アルギニン突然変異型プラスミドの構築
Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)を使用してAAV2 rep/capプラスミド、pIM45BD、を突然変異させた。残基585および588のアルギニンのアラニンへの変化を導入するためのPCR突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
以前に記載された(Xiaoら(1998)J.Virol.72:2224〜2232頁)ようなヒト胎性腎癌293細胞(HEK−293)の(リン酸カルシウムを使用する)トリプルトランスフェクションよって、組換えAAVベクターを作製した。簡単に言うと、血清型2からのrep遺伝子と血清型1または2のいずれかからのカプシド遺伝子を含有するプラスミドをヘルパーアデノウイルスプラスミド(Stratagene、Palo Alto、CA)とともに使用した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターの制御下にあった。ウイルスをトランスフェクションの72時間後に収集し、以前に記載された(Xiaoら(1998)J.Virol.72:2224〜2232頁)ようにカラム精製した。
すべての手順は、Genzyme、Sanofi Company(Department of Health and Human Services、NIH Publication 86〜23)の施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画を用いて行った。使用したマウスは、YAC128マウス(純粋なFBV/NJバックグラウンドの128CAG反復配列を有する完全長ヒト突然変異型HTT導入遺伝子を内部に持つ酵母人口染色体)および野生型FVB/NJ同腹子マウス(Slowら(2003)Hum.Mol.Genet.12:1555〜1567頁;Van Raamsdonkら(2005)Hum.Mol.Genet.14:3823〜3835頁)を含んだ。YAC128マウスおよびFVB/NJ同腹子は、両方とも、Charles River Laboratoriesにおいて飼育されたGenzymeコロニーから得た。食餌および水を自由に入手できる昼夜12時間サイクルでマウスを維持した。すべての行動試験は、動物の昼サイクル中(AM8時〜PM4時の間)に行った。すべての実験についてのn値を下の表2および3に示す。
3%イソフルランを使用して動物を麻酔し、定位固定枠内に配置した。以前に記載された(Stanekら(2014)Hum.Gene Ther.25:461〜474頁)ように、頭蓋内注射を行った。簡単に言うと、10μl Hamilton注射器を使用して、線条体(十字縫合および硬膜から、AP、+0.50;ML、±2.00;DV、−2.5;切歯棒、0.0)に0.5μl/分の速度で組換えウイルスベクター 3μlを注射した。注入完了後1分間、針を所定の位置に残した。手術前1時間および手術後24時間、鎮痛のためにマウスにケトプロフェン(5mg/kg)を皮下投与した。
マウスの心臓をリン酸緩衝食塩水(PBS)で灌流させて血液を除去した。実験1については、脳を4%パラホルムアルデヒド、続いて30%スクロースで固定した後、冠状面に沿って切断した。クリオスタットを使用して、20μm冠状切片を切断した。実験2については、脳を正中線に沿って切断し、左半球を4%パラホルムアルデヒド、続いて30%スクロースで固定し、次いでクリオスタットを使用して20μm切片にした。マウス脳マトリックス(Harvard Apparatus、Holliston、MA)を使用して冠状軸に沿って(生化学アッセイに使用するための)右半球を切断し、3mm生検パンチを使用して線条体および皮質領域を解剖した。その後、脳組織を液体窒素で急速冷凍し、使用するまで−80℃で保存した。
RNAレベルを定量的リアルタイムRT−PCRによって測定した。すべてのRT−PCR分析に線条体パンチ片を使用した。QIAGEN RNEasyミニキットを使用して全RNAを抽出し、その後、TaqMan(登録商標)One−Step RT−PCR Master Mix Kit(Applied Biosystems)をその製造業者の説明書に従って使用して逆転写し、増幅した。TaqMan定量的RT−PCR反応をABI PRISM(登録商標)7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)で行って分析した。HTT mRNAの発現レベルをヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT1)mRNAレベルに正規化した。マウス脳cDNAの5倍系列希釈物を使用して検量線を生成した。各試料を二度繰り返して実行した。検量線またはΔΔCT法を用いることによって相対遺伝子発現を判定し、HPRT1 mRNAレベルに正規化した。ヒトHTTの検出については、次のプライマーを使用した:5’CTCCGTCCGGTAGACATGCT3’および5’CCATTTTGAGGGTTCTGATTTCC3’。マウスHTTの検出については、次のプライマーを使用した:5’TGCTACACCTGACAGCGAGTCT3’および5’ATCCCTTGCGGATCCTATCA3’。
タンパク質レベルをウエスタンブロット分析によって測定した。すべてのウエスタンブロット分析に皮質パンチ片を使用した。T−Per溶解緩衝液(Pierce)中50mg/mlの最終濃度の組織であって、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)を含有する前記組織をホモジナイズした。10,000×gで6分間、4℃での遠心分離によってホモジネートを清澄にした。BSAアッセイ(Pierce)を使用することによってタンパク質濃度を測定した。ホモジネート20〜30マイクログラムを3〜8%Novexトリス−酢酸ゲルで分割し、次いでニトロセルロース膜に転写した。膜をマウス抗ハンチンチンモノクローナル抗体(Mab2166;1:2,000希釈、Millipore)およびウサギポリクローナル抗β−チューブリン抗体(1:750希釈、Santa Cruz Biotechnology)でプローブした。その後、膜を赤外二次抗体(1:20,000希釈、Rockland)とともにインキュベートし、Odyssey(LI−COR Biosciences)を使用して定量的蛍光によってタンパク質を可視化した。負荷変動を制御するために、Httタンパク質をβ−チューブリンに正規化し、未処置または食塩水処置動物に対するパーセンテージとして表した。分子量マーカーを使用してタンパク質の同一性を検証した。
凍結脳切片を、アストロサイトを染色するためのウサギ抗GFAP抗体(1:2,500;DAKO、Glostrup、Germany)またはミクログリアを可視化するための抗Iba1抗体(1:500;WAKO Chemicals USA、Richmond、VA)で染色した。使用した二次抗体は、FITCまたはCy3と結合しているロバ抗種特異的抗体であった。Nikon Eclipse E800蛍光顕微鏡(Nikon、Melville、NY)を使用して切片を可視化した。
平均値を統計解析に使用した。データを平均±SEMとして表した。2群を使用した研究については、スチューデントt検定を統計比較に用いた。2群より多くの群の比較については、一元配置ANOVA、続いてチューキー多重比較事後検定(Prism GraphPad)を用いた。p<0.05を統計的有意差とみなした。
上に記載したように、実験1では野生型マウスにAAV2−eGFPおよびAAV2HBKO−GFPベクターを注射した(表2)。すべての動物を注射30日後に屠殺した。経口顕微鏡検査は、AAV2ベクターとAAV2HBKOベクターは両方とも形質導入ニューロンにおいてGFP導入遺伝子の発現を駆動することを明示した(図9Aおよび9B)。GFP発現は、AAV2の注射跡に限定され、ごくわずかしか注射部位を超えて広がらなかった(図9B)。しかし、旧来のAAV2と比較すると、AAV2HBKOは、より強く広範囲にわたるGFP発現を駆動し、注射部位を十分に超えて発現が観察された(図9A)。これらの結果は、AAV2HBKOを使用してCNSに送達される導入遺伝子の強く広範な発現を実証するものである。
上に記載したように、実験2ではYAC128マウスにAAV2HBKOおよびAAV1血清型ベクターを注射した(表3)。これらのベクターは、ヒトHTTを標的にする人工miRNA、およびGFPレポーターの発現を駆動した。AAV1ベクターおよびAAV2HBKOベクターは両方とも、線条体への注射30日後に強いGFP分布を示した(図10Aおよび10B)。しかし、GFP発現パターンは、これら2つのベクター血清型間で顕著に異なるように見えた。GFPのAAV1発現(図10A)は、AAV2HBKO GFP発現(図10B)よりまだらで、均一性が低かった。ベクター形質導入は、ニューロンとグリア細胞、主としてアストロサイト、の両方に形質導入するAAV1血清型と比較して、AAV2HBKO脳では排他的にニューロンへの形質導入であるように見えた。これらの結果は、AAV2HBKOが、旧来のAAV1と比較して、非常に異なる発現および形質導入プロファイルを示したことを実証するものである。
次に、YAC128マウスの線条体におけるHTT発現を発現停止させるmiRNAを発現するAAV1およびAAV2HBKOベクター血清型の能力を評価した。成体YAC128マウスにAAV2/1−miRNA−HttまたはAAV2HBKO−miRNA−HTTいずれかの両側線条体内注射を施し、処置30日後に脳を分析した。突然変異型ヒトHTT mRNAの線条体内レベルは、AAV2/1−miRNA−HttおよびAAV2HBKO−miRNA−Httを注射したマウスにおいて、未処置対象と比較して、有意に低減された(図11A)。皮質脳パンチ片のウエスタンブロット分析は、両方の処置群においてHtt低減傾向を示した;しかし、未処置対照試料のばらつきがデータの統計的有意性への到達を妨げた(図11B)。これらの結果は、AAV1およびAAV2HBKOベクターを使用するRNAiによる遺伝子ノックダウンの効能を実証するものである。
AAVの注射が神経炎症をもたらすかどうかを判定するために、神経炎症マーカーグリア線維性酸性タンパク質(GFAP、アストロサイトのマーカー)およびIba1(ミクログリアのマーカー)のレベルを処置30日後に検査した。AAV2HKO処置後、未処置の脳と比較して、Iba1レベルの著しい増加は観察されなかった(図12Aおよび12Bを参照されたい)。しかし、AAV2/1処置は、以前に観察された注射部位でのIba1レベルの増加を引き起こした(図12C)。注射30日後、処置した脳のいずれにおいても、未処置対照と比較して著しいGFAPレベルの増加は観察されなかった(図13A〜13C)。これらの結果は、AAV2HBKOがヒトHTTに対するmiRNAの発現を駆動することができたこと、およびミクログリア活性化の不在下でAAV1血清型と比較してHTT低減を生じさせることができたことを示す。
現行のAAVベクター血清型は、単一部位投与後に脳内での限定的分布を示す(例えば、Christine,C.W.ら(2009)Neurology 73:1662〜1669頁;Mandel,R.J.(2010)Curr.Opin.Mol.Ther.12:240〜247頁)。本明細書の中で詳細に論じているように、本発明者らは、細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカン(HSPG)との結合が低減されたAAVベクターの投与がCNSへのAAV形質導入を増進することを発見した。これらの結果は、広範なベクター分布が望まれるCNS遺伝子治療に対する、HSPG結合が修飾されたAAVの有用性を、実証するものである。さらに、本発明者らは、HSPG結合が低減されたAAV2ベクターが(排他的にニューロンを標的にするので)理想的な安全性プロファイルを示す上に、広範で強い形質導入効率を達成することも発見した。したがって、そのようなベクターは、実質内送達からの広範なニューロン形質導入を必要とするCNS適応症に有用である。
方法
AAVrh8Rアルギニン修飾プラスミドの構築
Quikchange Lightning Multi Site Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technologies)を使用してAAVrh8R rep/capプラスミドを突然変異させた。アラニン586のアルギニンへの変化(AAVrh8R−A586R)またはアルギニン533のアラニンへの変化(AAVrh8R−R533A)を誘導するためのPCR突然変異誘発プライマーを設計した。陽性突然変異体をシークエンシングによって確認した。
高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)または可溶性VEGF受容体ハイブリッド(sFLT02)を発現する組換えAAVベクターを、pAAVrh8R、pAAVrh8R−A586RまたはpAAVrh8R−R533A rep/capプラスミドおよびpAdHelperを使用する293細胞のトリプルトランスフェクションによって作製した。導入遺伝子は、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターの制御下にあった。
ヒーラ、HeLaRC32またはNS1細胞を24ウェルプレートにプレーティングした(1〜2×105細胞/ウェル)。プレーティングの24時間後、細胞を1×104vg/細胞〜1×105vg/細胞(+)Ad5ts149に感染させた。感染48時間後、EGFP蛍光またはELISAいずれかによって形質導入効率を測定して、培地中のsFLT02を定量した(R&D Systemsによるヒト可溶性VEGF R1 ELISA)。
Jackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から得られる成体C57BL/6マウスを購入し、ビバリウムで維持した。研究継続期間中、動物が食餌および水に自由に近づけるようにした。すべての手順は、施設内動物実験委員会によって承認された実験実施計画のもとで行った。
散瞳および調節麻痺をトロピカミド(Alcon、Fort Worth、TX)の局所適用で誘導した。酸素800mL/分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う3.5%イソルフランの使用によって非活動状態を誘導し、維持した。リング状の先端を有する鉗子(World Precision Instruments、Sarasota、FL)を使用して眼を固定し、30ゲージ針を使用して強膜内の強膜の縁のおおよそ2mm下を予備切開した。切開部を通して33ゲージ鈍先端針を誘導し、先端が後ろの網膜神経感覚上皮を貫通するまで後方に進めた。被験物質1マイクロリットルを1秒にわたって送達した。針を、抜き取る前におおよそ5秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
R&D Systemsによるヒト可溶性VEGF R1 ELISAキットを使用して、マウス網膜溶解物中のsFLT02を測定した。
網膜へのAAVrh8形質導入におけるカプシド表面アルギニン残基の役割を調査するために、HSPG結合に関与するAAV2アルギニンに対応する残基の突然変異を有するカプシドタンパク質を用いてAAVrh8ベクターを生成した。図14は、HSPGとのAAV2結合にとって重要な5つのカプシド残基をAAVrh8R中の対応する残基と比較するものである。図15に示したように、これらの残基のアミノ酸置換:A586RおよびR533A(ナンバリングは、VP1アミノ酸ナンバリングに基づく)を各々が有する2つのAAVrh8R突然変異体を構築した。
硝子体内注射
酸素800mL/分をノーズコーン経由で動物に送達しながら行う3.5%イソルフランの使用によって非活動状態を誘導し、維持した。33ゲージ斜角針が取り付けられたHamilton注射器(Hamilton Co.、Reno、NV)を使用して、被験物質1マイクロリットルを硝子体液に注射した。強膜を通して縁のおおよそ2mm下に針を誘導し、硝子体房に注意深く進ませて水晶体との接触を回避した。被験物質を1〜2秒間にわたって送達した。注射後、針を、抜き取る前におおよそ5秒間、適所に保持した。動物を麻酔から回復させた後、その動物のケージに戻した。
R&D Systemsによるヒト可溶性VEGF R1 ELISAキットを使用して、マウス網膜溶解物中のsFLT02を測定した。
AAVカプシドへのアルギニン付加の、硝子体内形質導入に対する効果を評価するために、C57Bl6マウスに、CBAプロモーターからsFLT02を発現する構築物を各々が有する、AAV2、AAVrh8R、またはAAVrh8R−A586Rを1×109DRP注射した。ベクター投与30日後にマウスを屠殺し、網膜溶解物中のsFLT02を測定した。マウス網膜へのAAVrh8R−A586R形質導入は、AAVrh8Rと比較して向上され、実際には、この同じ位置(R585)に同様にアルギニンを有するAAV2に匹敵した(図19)。このデータは、網膜への硝子体内形質導入をAAVカプシドへのアルギニンの付加によって向上させることができることを示している。これらの結果およびAAVカプシド間の配列相同性(図20)に基づくと、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9およびAAVrh10カプシドを有するAAV粒子による網膜への硝子体内形質導入は、網膜形質導入を同様に向上させる可能性がある。
別段の断り書きがない限り、すべてのポリペプチド配列をN末端からC末端へと提示する。別段の断り書きがない限り、すべての核酸配列を5’から3’へと提示する。
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MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYQFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTDGTYSEPRPIGTRYLTRNL(配列番号16)
Claims (547)
- 個体の眼に異種核酸を送達する方法であって、
該個体の網膜下に組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)該異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 個体の眼へのrAAV粒子の網膜下送達後の細胞へのrAAV形質導入を、野生型カプシドを含むrAAVでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
AAVカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置において、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み;
該rAAV粒子は、rAAVカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の眼へのrAAV粒子の網膜下送達後の異種核酸の発現を向上させる方法であって、
AAVカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置において、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み;
該rAAV粒子は、rAAVカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の眼障害を処置する方法であって、
rAAV粒子を含む組成物を個体の網膜に送達することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%低減させる、請求項5に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項7に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型2(AAV2)カプシドを含む、請求項1に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487または532位におけるものである、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項12に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項1〜11および13のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484およびR487位におけるまたはR585およびR588位における置換を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484AおよびR487A置換またはR585AおよびR588A置換を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換K532Aを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型rh8R(AAVrh8R)カプシドを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項20に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項21に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位における置換を含む、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位における置換を含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項20〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項20〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。 - 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項29に記載の方法。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項1〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項32に記載の方法。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項32または33に記載の方法。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項31〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 個体はヒトである、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項36に記載の方法。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項1〜37のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項38に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項39に記載の方法。
- rAAV粒子は、医薬組成物中にある、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 医薬組成物中の粒子の濃度は、約1×106DRP/ml〜約1×1014DRP/mlである、請求項41に記載の方法。
- rAAV粒子の医薬組成物は、個体の視覚機能の処置に有効である、請求項41または42に記載の方法。
- 視覚機能は、微小視野測定、暗順応視野測定、視覚の動きの評価、視力、ERG、または読字評価によって評価される、請求項43に記載の方法。
- 個体の視覚機能を向上させる結果となる、請求項43または44に記載の方法。
- 眼障害の進行に起因するヒトの視覚機能低下の進行の予防または減速する結果となる、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の眼にベクターを網膜下送達するためのシステムであって、
a)rAAV粒子の有効量を含む組成物であって、
i)該rAAV粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、
ii)該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用RNAをコードする異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復とを含む、前記組成物;および
b)前記rAAVの網膜下送達のためのデバイス
を含む前記システム。 - デバイスは、細径カニューレおよび注射器を含み、該細径カニューレは、27〜45ゲージである、請求項47に記載のシステム。
- rAAV粒子の組成物は、注射器内に収容されている、請求項48に記載のシステム。
- カニューレは、注射器に取り付けられている、請求項48または49に記載のシステム。
- 組成物中の粒子の濃度は、約1×106DRP/ml〜約1×1014DRP/mlである、請求項47〜50のいずれか1項に記載のシステム。
- rAAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV6カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8Rカプシド、AAV9カプシド、またはAAVrh10カプシドを含む、請求項47〜51のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項47〜52のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%低減させる、請求項53に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項47〜54のいずれか1項に記載のシステム。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項55に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項47〜56のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項47〜57のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487または532位におけるものである、請求項47〜58のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項59に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項47〜58および60のいずれか1項に記載のシステム。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項47〜61のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484およびR487位におけるまたはR585およびR588位における置換を含む、請求項47〜61のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484AおよびR487A置換またはR585AおよびR588A置換を含む、請求項47〜61のいずれか1項に記載のシステム。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項47〜61のいずれか1項に記載のシステム。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換K532Aを含む、請求項47〜61のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項47〜58のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項67に記載のシステム。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位における置換を含む、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位における置換を含む、請求項67または68に記載のシステム。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項67〜69のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項67〜70のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項47〜71のいずれか1項に記載のシステム。 - 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項47〜72のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項47〜73のいずれか1項に記載のシステム。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項47〜72のいずれか1項に記載のシステム。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項75に記載のシステム。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項47〜76のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項47〜77のいずれか1項に記載のシステム。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項78に記載のシステム。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項79に記載のシステム。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項77〜80のいずれか1項に記載のシステム。
- 個体はヒトである、請求項47〜81のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項82に記載のシステム。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項47〜83のいずれか1項に記載のシステム。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項84に記載のシステム。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項85に記載のシステム。
- 眼障害を処置するためのキットであって、
a)rAAV粒子を含む組成物であって、
該rAAV粒子は、
i)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
ii)眼障害を処置するための異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む前記組成物;ならびに
b)網膜下投与に好適な医薬品賦形剤
を含む前記キット。 - rAAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV6カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8Rカプシド、AAV9カプシド、またはAAVrh10カプシドを含む、請求項87に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させる、請求項87または88に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%低減させる、請求項89に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項87〜90のいずれか1項に記載のキット。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項91に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項87〜92のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項87〜93のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487または532位におけるものである、請求項87〜94のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項95に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項87〜94および96のいずれか1項に記載のキット。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項87〜97のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484およびR487位におけるまたはR585およびR588位における置換を含む、請求項87〜97のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484AおよびR487A置換またはR585AおよびR588A置換を含む、請求項87〜97のいずれか1項に記載のキット。
- AAVカプシドは、AAV−2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項87〜97のいずれか1項に記載のキット。
- AAVカプシドは、AAV−2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換K532Aを含む、請求項87〜97のいずれか1項に記載のキット。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項87〜94のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項103に記載のキット。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位における置換を含む、または該1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位における置換を含む、請求項103または104に記載のキット。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項103〜105のいずれか1項に記載のキット。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項103〜106のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項87〜107のいずれか1項に記載のキット。 - 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項87〜108のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項87〜109のいずれか1項に記載のキット。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項87〜108のいずれか1項に記載のキット。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項111に記載のキット。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項87〜112のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項87〜113のいずれか1項に記載のキット。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項114に記載のキット。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項114に記載のキット。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項114〜116のいずれか1項に記載のキット。
- 個体はヒトである、請求項87〜117のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項118に記載のキット。 - 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、シュタルガルト病、網膜色素変性、アッシャー症候群および加齢性黄斑変性
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項118に記載のキット。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項87〜120のいずれか1項に記載のキット。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項121に記載のキット。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項122に記載のキット。
- rAAV粒子の組成物の網膜下送達のためのデバイスをさらに含む、請求項87〜123のいずれか1項に記載のキット。
- rAAV粒子の組成物の網膜下送達のための説明書をさらに含む、請求項87〜124のいずれか1項に記載のキット。
- 個体の中枢神経系(CNS)に異種核酸を送達する方法であって、
該個体のCNSに組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)該異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 個体の中枢神経系(CNS)の細胞へのrAAV形質導入を、野生型カプシドを含むrAAVでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
該個体のCNSに組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の中枢神経系(CNS)における異種核酸の発現を向上させる方法であって、
該個体のCNSに組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の中枢神経系(CNS)の障害を処置する方法であって、
rAAV粒子を含む組成物の有効量を該個体のCNSに投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 異種核酸は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項126〜129のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項126〜130のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV6カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8Rカプシド、AAV9カプシド、AAVrh10カプシドを含む、請求項126〜131のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を、場合により少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%低減させる、請求項126〜132のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は、直接脊髄注射、頭蓋内および/または脳内投与を含む、請求項126〜133のいずれか1項に記載の方法。
- 脳内投与は、大脳、髄質、脳橋、小脳、頭蓋内腔、脳を覆っている髄膜、硬膜、くも膜、脳軟膜、脳を取り囲むくも膜下腔の脳脊髄液(CSF)、小脳の深部小脳核、大脳の脳室系、くも膜下腔、線条体、皮質、中隔、視床、視床下部、および脳実質からなる群から選択される部位に対するものである、請求項134に記載の方法。
- 投与は、少なくとも1つの大脳側脳室への側脳室内注射である、請求項126〜135のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は、頸部、胸部および/または腰部におけるくも髄腔内注射である、請求項126〜135のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は線条体内注射である、請求項126〜135のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は視床内注射である、請求項126〜135のいずれか1項に記載の方法。
- 投与は実質内注射である、請求項126〜135のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、単一部位に対して投与される、請求項126〜140のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、定位送達によって送達される、請求項135に記載の方法。
- rAAV粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項135または142に記載の方法。
- rAAV粒子は、CED送達システムを使用して送達される、請求項143に記載の方法。
- CED送達システムは、カニューレおよび/またはポンプを含む、請求項144に記載の方法。
- カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである、請求項145に記載の方法。
- ポンプは、手動ポンプである、請求項145または146に記載の方法。
- ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項145または146に記載の方法。
- ポンプは、注入ポンプである、請求項145または146に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項126〜149のいずれか1項に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項150に記載の方法。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項126〜151のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項152に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項126〜153のいずれか1項に記載の方法。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項154に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項126〜155のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項156に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487、527、532、585および/または588位におけるものである、請求項126〜157のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487、527または532位におけるものである、請求項158に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項158または159に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R448、R451、R484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項126〜158および160のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487、K527および/またはK532位における置換を含む、請求項126〜161のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484A、R487A、K527A、K532A、R585Aおよび/またはR588A置換を含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484およびR487位におけるまたはR585およびR588位における置換を含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484AおよびR487A置換またはR585AおよびR588A置換を含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換K532Aを含む、請求項126〜162のいずれか1項に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項126〜157のいずれか1項に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項169に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位におけるものである、請求項169または170に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項169〜171のいずれか1項に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項169〜172のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項126〜173のいずれか1項に記載の方法。 - 異種核酸は、CNS関連遺伝子をコードする、請求項126〜174のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、酵素、神経栄養因子、CNS関連障害を有する個体において欠乏または突然変異ポリペプチド、抗酸化物質、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子、α−シヌクレイン、酸性β−グルコシダーゼ(GBA)、β−ガラクトシダーゼ−1(GLB1)、イズロン酸2−スルファターゼ(IDS)、ガラクトシルセラミダーゼ(GALC)、マンノシダーゼ、α−D−マンノシダーゼ(MAN2B1)、β−マンノシダーゼ(MANBA)、偽アリールスルファターゼA(ARSA)、N−アセチルグルコサミン−1−ホスホトランスフェラーゼ(GNPTAB)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、ニーマン・ピックCタンパク質(NPC1)、酸性α−1,4−グルコシダーゼ(GAA)、ヘキソサミニダーゼβサブユニット、HEXB、N−スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ(MPS3A)、N−α−アセチルグルコサミニダーゼ(NAGLU)、ヘパリンアセチル−CoA、α−グルコサミニダーゼN−アセチルトランスフェラーゼ(MPS3C)、N−アセチルグルコサミン−6−スルファターゼ(GNS)、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGA)、β−グルクロニダーゼ(GUSB)、ヘキソサミニダーゼαサブユニット(HEXA)、ハンチンチン(HTT)、リソソーム酸性リパーゼ(LIPA)、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α−ガラクトシダーゼA、パルミトイルタンパク質チオエステラーゼ、トリペンチジルペプチダーゼ、リソソーム膜貫通タンパク質、システイン輸送体、酸性セラミダーゼ、酸性α−L−フコシダーゼ、カテプシンA、α−L−イズロニダーゼ、アリールスルファターゼB、アリールスルファターゼA、N−アセチルガラクトサミン−6−スルファターゼ、酸性β−ガラクトシダーゼ、またはα−ノイラミダーゼからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項126〜175のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質(NAIP)、神経成長因子(NGF)、グリア細胞由来成長因子(GDNF)、脳由来成長因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、GTP−シクロヒドロラーゼ(GTPCH)、アミノ酸デカルボキシラーゼ(AADC)、抗酸化物質、抗血管新生性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチド、およびアスパルトアシラーゼ(ASPA)からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項176に記載の方法。
- 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項126〜175のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項178に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項126〜179のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、伸長因子1−αプロモーター(EF1−α)プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および13−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの制御下にある、請求項126〜180のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項180に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、脳の1つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項180に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項182または183に記載の方法。
- CNSの細胞はニューロンである、請求項182〜184のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項126〜185のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項186に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項187に記載の方法。
- 個体はヒトである、請求項126〜188のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの障害を処置するために使用される治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項126〜189のいずれか1項に記載の方法。
- CNSの障害は、リソソーム蓄積症(LSD)ハンチントン病、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、大脳皮質基底核変性症(CBD)、大脳皮質基底核神経節変性症(CBGD)、前頭側頭型認知症(FTD)、多系統委縮症(MSA)、進行性核上性麻痺(PSP)、または脳の癌である、請求項190に記載の方法。
- 障害は、アスパルチルグルコサミン尿症、ファブリー、小児性バッテン病(CNL1)、古典的遅発型小児性バッテン病(CNL2)、若年性バッテン病(CNL3)、CNL4型バッテン、CNL5型バッテン、CNL6型バッテン、CNL7型バッテン、CNL8型バッテン、シスチン症、ファーバー、フコシドーシス、ガラクトシドシアリドーシス、ゴーシェ病1型、ゴーシェ病2型、ゴーシェ病3型、GM1ガングリオシドーシス、ハンター病、クラッベ病、αマンノシドーシス症、βマンノシドーシス症、マロトー・ラミー、異染性白質ジストロフィー症、モルキオA型、モルキオB型、ムコリピドーシス症II/III型、ニーマン・ピック病A型、ニーマン・ピック病B型、ニーマン・ピック病C型、ポンペ病、サンドホッフ病、サンフィリポ病A型、サンフィリポ病B型、サンフィリポC型、サンフィリポD型、シンドラー病、シンドラー・神崎、シアリドーシス、スライ病、テイ・サックス病、およびウォルマン病からなる群から選択されるリソソーム蓄積症である、請求項191に記載の方法。
- CNSの障害は、ハンチントン病またはパーキンソン病である、請求項191に記載の方法。
- 個体のハンチントン病を処置する方法であって、
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項194に記載の方法。 - 治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である、請求項195に記載の方法。
- 治療用核酸は、ハンチンチンに対するRNAiを含む、請求項195に記載の方法。
- RNAiは、miRNAである、請求項197に記載の方法。
- 個体のパーキンソン病を処置する方法であって、
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物の有効量を該個体の線条体に投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項199に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドは、TH、GTPCII、GDNF、BDNFおよび/もしくはAADC;またはその断片である、請求項200に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドは、AADCまたはその断片である、請求項200または請求項201に記載の方法。
- 異種核酸は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項194〜202のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項194〜203のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型2(AAV2)カプシドを含む、請求項194〜204のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を増加させる、請求項194〜205のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上の置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、もしくは少なくとも約100%低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項206に記載の方法。
- rAAV粒子は、定位送達によって送達される、請求項194〜207のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、対流強化送達によって送達される、請求項194〜207のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、CED送達システムを使用して送達される、請求項209に記載の方法。
- CED送達システムは、カニューレおよび/またはポンプを含む、請求項210に記載の方法。
- カニューレは、逆流防止カニューレまたは段付きカニューレである、請求項211に記載の方法。
- ポンプは、手動ポンプである、請求項211または212に記載の方法。
- ポンプは、浸透圧ポンプである、請求項211または212に記載の方法。
- ポンプは、注入ポンプである、請求項211または212に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項194〜215のいずれか1項に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項216に記載の方法。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項194〜217のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項218に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項194〜219のいずれか1項に記載の方法。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項220に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項194〜221のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項222に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487、527、532、585および/または588におけるものである、請求項194〜223のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487、527または532位におけるものである、請求項224に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項224または225に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項194〜224および226のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484、R487および/またはK532位における置換を含む、請求項194〜227のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484およびR487位における置換を含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R585およびR588位における置換を含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、R484AおよびR487A置換を含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングして、アミノ酸置換K532Aを含む、請求項194〜228のいずれか1項に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項194〜223のいずれか1項に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項235に記載の方法。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位における置換であるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位における置換である、請求項235または236に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項235〜237のいずれか1項に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項235〜238のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項194〜239のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、伸長因子1−αプロモーター(EF1−α)プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および13−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある、請求項194〜239のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項240に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、脳の1つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項240に記載の方法。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項242または243に記載の方法。
- 脳の細胞はニューロンである、請求項243に記載の方法。
- rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項194〜245のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項246に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項247に記載の方法。
- 個体はヒトである、請求項37〜46および190〜248のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、請求項1〜46および126〜249のいずれか1項に記載の方法において使用するためのキット。 - 個体の中枢神経系(CNS)に異種核酸を送達するためのキットであって、
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物を含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)該異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記キット。 - 個体の中枢神経系(CNS)障害を処置するためのキットであって、
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を含む組成物を含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)CNS障害を処置するための異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記キット。 - CNS障害は、ハンチントン病である、請求項251または252に記載のキット。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項251〜253のいずれか1項に記載のキット。 - 治療用ポリペプチドは、ハンチンチンポリペプチドまたはその断片である、請求項254に記載のキット。
- 治療用核酸は、ハンチンチンに対するRNAiを含む、請求項254に記載のキット。
- RNAiは、miRNAである、請求項256に記載のキット。
- CNS障害は、パーキンソン病である、請求項251または252に記載のキット。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項258に記載のキット。 - 治療用ポリペプチドは、TH、GTPCII、GDNF、BDNFおよび/もしくはAADC;またはその断片である、請求項259に記載のキット。
- 治療用ポリペプチドは、AADCまたはその断片である、請求項259または請求項260に記載のキット。
- 請求項1〜46および126〜249のいずれか1項に記載の方法において使用するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子。
- 請求項1〜46のいずれか1項に記載の方法における、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の使用。
- 請求項126〜249のいずれか1項に記載の方法において使用するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子。
- 個体のハンチントン病またはパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子であって、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含み、
線条体への送達用に製剤化される、前記rAAV粒子。 - 個体のハンチントン病またはパーキンソン病を処置するための組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子であって、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含み、
単一部位送達用に製剤化される、前記rAAV粒子。 - 異種核酸は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子の異種核酸の発現レベルと比較して増加された発現レベルで発現される、請求項250〜261のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜266のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、参照rAAVカプシドを含むrAAV粒子と比較して低減された神経炎症をもたらす、請求項250〜261および267のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜267のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV6カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8Rカプシド、AAV9カプシド、またはAAVrh10カプシドを含む、請求項250〜261、267および268のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜268のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を低減させるか、または中枢神経系の細胞への形質導入を増加させる、請求項250〜261および267〜269のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜269のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAV粒子のヘパラン硫酸プロテオグリカンとの結合を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、もしくは少なくとも約100%低減させるか、または細胞への形質導入を少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、もしくは少なくとも約100%増加させる、請求項270に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現される、請求項250〜261および267〜271のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜271のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項272に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて発現される、請求項250〜261および267〜273のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜273のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 異種核酸は、ニューロンにおいて排他的に発現される、請求項274に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有するアミノ酸残基の、正電荷を有さないアミノ酸残基による置換を含む、請求項250〜261および267〜275のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜275のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基により置換されている、請求項276に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基の置換を含む、請求項250〜261および267〜277のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜277のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基のアラニン残基による置換を含む、請求項278に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして448、451、484、487、527、532、585および/または588におけるものである、請求項250〜261および267〜279のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜279のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして484、487または532位におけるものである、請求項280に記載のキットまたはrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号1のアミノ酸配列を含むAAV2のVP1に基づく、請求項280または281に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487、K527、K532、R585および/またはR588位における置換を含む、請求項250〜261および267〜280および282のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜280および282のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487および/またはK532位における置換を含む、請求項250〜261および267〜283のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜283のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、配列番号2、4および/または6に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項250〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜284のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484およびR487位における置換を含む、請求項250〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜284のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR585およびR588位における置換を含む、請求項250〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜284のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484AおよびR487A置換またはR585AおよびR588A置換を含む、請求項250〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜284のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてアミノ酸置換R585AおよびR588Aを含む、請求項114〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜149のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVカプシドは、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてアミノ酸置換K532Aを含む、請求項250〜261および267〜284のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜284のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528、533もしくは589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、528もしくは533位におけるものである、請求項250〜261および267〜279のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜279のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項291に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528、R533もしくはT589位におけるものであるか、または該1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてR485、R488、K528もしくはR533位におけるものである、請求項291または292に記載のキットまたはrAAV粒子。
- rAAV粒子は、配列番号11に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項291〜293のいずれか1項に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、R533A置換を含む、請求項291〜294のいずれか1項に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項250〜261および267〜295のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜295のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 異種核酸は、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーター、CK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAG)プロモーター、伸長因子1−αプロモーター(EF1−α)プロモーター、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス(RSV)LTRプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、および13−アクチンプロモーターからなる群から選択されるプロモーター配列の制御下にある、請求項250〜261および267〜295のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜295のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 異種核酸は、CNSの1つまたはそれ以上の細胞における治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項296に記載のキットまたはrAAV粒子。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、脳の1つまたはそれ以上の細胞を含む、請求項296に記載のキットまたはrAAV粒子。
- CNSの1つまたはそれ以上の細胞は、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、ニューロン、脳実質細胞、ミクログリア細胞、上衣細胞、および/またはプルキンエ細胞である、請求項298または請求項299に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 脳の細胞はニューロンである、請求項299に記載のキットまたはrAAV粒子。
- rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項250〜127および267〜301のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜301のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項302に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項303に記載のキットまたはrAAV粒子。
- 個体はヒトである、請求項250〜261および267〜304のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜304のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、組成物中にある、請求項250〜261および267〜305のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜305のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 組成物は、緩衝剤および/または医薬的に許容される賦形剤を含む、請求項306に記載のキットまたはrAAV粒子。
- rAAV粒子の組成物をCNSに、場合により線条体に、送達のための説明書をさらに含む、請求項250〜261および267〜307のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜307のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子の組成物をCNS内の単一部位に送達のための説明書をさらに含む、請求項250〜261および267〜308のいずれか1項に記載のキットまたは請求項262〜308のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAVrh8Rカプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項310に記載のrAAV粒子。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586位におけるものである、請求項310または311に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項312に記載のrAAV粒子。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてA586位おける置換を含む、請求項312または313に記載のrAAV粒子。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして、A586R置換を含む、請求項312〜314のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、配列番号10に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項310〜315のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むrAAV粒子の形質導入効率を増加させる方法であって、
該カプシドタンパク質に、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を導入することを含み、
該1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、野生型AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を増加させる、前記方法。 - 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項317に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586位におけるものである、請求項317または318に記載の方法。
- AAVrh8RのVP1は、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項317〜319のいずれか1項に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてA586位おける置換を含む、請求項317〜320のいずれか1項に記載の方法。
- 1つのアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして、A586R置換を含む、請求項317〜321のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、配列番号10に対して少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%または100%配列同一性を有する1つまたはそれ以上のrAAVカプシドタンパク質を含む、請求項317〜322のいずれか1項に記載の方法。
- AAV1カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAV1カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAV1カプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項324に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項324または325に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号12のアミノ酸配列を含むAAV1のVP1に基づく、請求項326に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項326または327に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、S586R置換を含む、請求項326〜328のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、T589R置換を含む、請求項326〜329のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAV6カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAV6カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAV6カプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項331に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項331または332に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号13のアミノ酸配列を含むAAV6のVP1に基づく、請求項333に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項333または334に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、S586R置換を含む、請求項333〜335のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、T589R置換を含む、請求項333〜336のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAV8カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAV8カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAV8カプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項338に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項338または339に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号14のアミノ酸配列を含むAAV8のVP1に基づく、請求項338〜340のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはT591位における置換を含む、請求項340または341に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、Q588R置換を含む、請求項340〜342のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、T591R置換を含む、請求項340〜343のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAV9カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAV9カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAV9カプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項345に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項345または346に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号15のアミノ酸配列を含むAAV9のVP1に基づく、請求項347に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはA589位における置換を含む、請求項347または348に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、S586R置換を含む、請求項347〜349のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、A589R置換を含む、請求項347〜350のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- AAVrh10カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAVrh10カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAVrh10カプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項352に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項352または353に記載のrAAV粒子。
- ナンバリングは、配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVrh10のVP1に基づく、請求項354に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはA591位における置換を含む、請求項354または355に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、Q588R置換を含む、請求項354〜356のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、A591R置換を含む、請求項354〜357のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- rAAV粒子は、AAV1、AAV6もしくはAAV9カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1、AAV6もしくはAAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、533、586および/もしくは589位におけるものであり、ならびに/または
rAAV粒子は、AAV8もしくはAAVrh10カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8もしくはAAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして487、490、535、588および/もしくは591位におけるものである、請求項1〜46および126〜249のいずれか1項に記載の方法。 - rAAV粒子は、AAV1、AAV6もしくはAAV9カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1、AAV6もしくはAAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、533、586および/もしくは589位におけるものであり、ならびに/または
rAAV粒子は、AAV8もしくはAAVrh10カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8もしくはAAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして487、490、535、588および/もしくは591位におけるものである、請求項47〜86のいずれか1項に記載のシステム。 - rAAV粒子は、AAV1、AAV6もしくはAAV9カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1、AAV6もしくはAAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、533、586および/もしくは589位におけるものであり、ならびに/または
rAAV粒子は、AAV8もしくはAAVrh10カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8もしくはAAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして487、490、535、588および/もしくは591位におけるものである、請求項87〜125および250〜261のいずれか1項に記載のキット。 - rAAV粒子は、AAV1、AAV6もしくはAAV9カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1、AAV6もしくはAAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488、533、586および/もしくは589位におけるものであり、ならびに/または
rAAV粒子は、AAV8もしくはAAVrh10カプシドを含み、1つもしくはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8もしくはAAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして487、490、535、588および/もしくは591位におけるものである、請求項262〜316のいずれか1項に記載のrAAV粒子。 - AAV1、AAV6またはAAV9カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、
該カプシドタンパク質は、AAV1、AAV6またはAAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして485、488または533位における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。 - AAV8またはAAVrh10カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、
該カプシドタンパク質は、AAV8またはAAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして487、490または535位における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。 - 個体の網膜に異種核酸を送達する方法であって、
該個体に組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を硝子体内投与することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)該異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 個体の眼へのrAAV粒子の硝子体内送達後の細胞へのrAAV形質導入を、野生型カプシドを含むrAAVでの細胞への形質導入と比較して向上させる方法であって、
AAVカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置において、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み;
該rAAV粒子は、rAAVカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の眼へのrAAV粒子の硝子体内送達後の異種核酸発現を向上させる方法であって、
AAVカプシドタンパク質に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置において、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置において、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を組み込むことを含み;
前記rAAV粒子は、rAAVカプシドタンパク質、および異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクターを含む、前記方法。 - 個体の眼障害を処置する方法であって、
rAAV粒子を含む組成物を個体の網膜に硝子体内送達することを含み、
該rAAV粒子は、
a)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
b)異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む、前記方法。 - 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAVカプシドタンパク質の電荷を改変する、請求項365〜368のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項365〜369のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項365〜370のいずれか1項に記載の方法。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項371に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項365〜372のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項365〜373のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型rh8R(AAVrh8R)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項375に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項376に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてA586および/またはT589位における置換を含む、請求項375〜377のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、A586RまたはA586K置換を含む、請求項375〜378のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項375〜379のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型1(AAV1)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項381に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号12のアミノ酸配列を含むAAV1のVP1に基づく、請求項382に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項381〜383のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項381〜384のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項381〜385のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型6(AAV6)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項387に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号13のアミノ酸配列を含むAAV6のVP1に基づく、請求項388に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項387〜389のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項387〜390のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項387〜391のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型8(AAV8)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項393に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号14のアミノ酸配列を含むAAV8のVP1に基づく、請求項394に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはT591位における置換を含む、請求項393〜395のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項393〜396のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、T591RまたはT591K置換を含む、請求項393〜397のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型9(AAV9)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項399に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号15のアミノ酸配列を含むAAV9のVP1に基づく、請求項400に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはA589位における置換を含む、請求項399〜401のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項399〜402のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、A589RまたはA589K置換を含む、請求項399〜403のいずれか1項に記載の方法。
- rAAV粒子は、AAV血清型rh10(AAVrh10)カプシドを含む、請求項365〜374のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項405に記載の方法。
- ナンバリングは、配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVrh10のVP1に基づく、請求項406に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはA591位における置換を含む、請求項405〜407のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項405〜408のいずれか1項に記載の方法。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、A591RまたはA591K置換を含む、請求項405〜409のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項365〜410のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項365〜411のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項365〜412のいずれか1項に記載の方法。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項365〜411のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項414に記載の方法。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項365〜415のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項365〜416のいずれか1項に記載の方法。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項417に記載の方法。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項417または418に記載の方法。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項416〜419のいずれか1項に記載の方法。
- 個体はヒトである、請求項365〜420のいずれか1項に記載の方法。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項421に記載の方法。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項365〜422のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項423に記載の方法。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項424に記載の方法。
- rAAV粒子は、医薬組成物中にある、請求項365〜425のいずれか1項に記載の方法。
- 医薬組成物中の粒子の濃度は、約1×106DRP/ml〜約1×1014DRP/mlである、請求項426に記載の方法。
- rAAV粒子の医薬組成物は、個体の視覚機能の処置に有効である、請求項426または427に記載の方法。
- 視覚機能は、微小視野測定、暗順応視野測定、視覚の動きの評価、視力、ERG、または読字評価によって評価される、請求項428に記載の方法。
- 個体の視覚機能を向上させる結果となる、請求項428または429に記載の方法。
- 眼障害の進行に起因するヒトの視覚機能低下の進行の予防または減速する結果となる、請求項365〜430のいずれか1項に記載の方法。
- 個体の眼にベクターを硝子体内送達するためのシステムであって、
a)rAAV粒子の有効量を含む組成物であって、
i)該rAAV粒子のカプシドタンパク質は、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含み、
ii)該ベクターは、治療用ポリペプチドまたは治療用RNAをコードする異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復とを含む、前記組成物;および
b)rAAVの硝子体内送達のためのデバイス
を含む前記システム。 - デバイスは、細径カニューレおよび注射器を含み、該細径カニューレは、27〜45ゲージである、請求項432に記載のシステム。
- rAAV粒子の組成物は、注射器内に収容されている、請求項433に記載のシステム。
- カニューレは、注射器に取り付けられている、請求項433または434に記載のシステム。
- 組成物中の粒子の濃度は、約1×106DRP/ml〜約1×1014DRP/mlである、請求項432〜435のいずれか1項に記載のシステム。
- rAAV粒子は、AAV1カプシド、AAV2カプシド、AAV3カプシド、AAV6カプシド、AAV8カプシド、AAVrh8Rカプシド、AAV9カプシド、またはAAVrh10カプシドを含む、請求項432〜436のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAVカプシドタンパク質の電荷を改変する、請求項432〜437のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項438に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項432〜439のいずれか1項に記載のシステム。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項440に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項432〜441のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項432〜442のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項432〜443のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項444に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてA586および/またはT589位における置換を含む、請求項432〜445のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、A586RまたはA586K置換を含む、請求項432〜446のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項432〜447のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項432〜448のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号12のアミノ酸配列を含むAAV1のVP1に基づく、請求項449に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項449または請求項450に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項449〜451のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項449〜452のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項432〜448のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号13のアミノ酸配列を含むAAV6のVP1に基づく、請求項454に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項454または請求項455のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項454〜456のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項454〜457のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項432〜448のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号14のアミノ酸配列を含むAAV8のVP1に基づく、請求項459に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはT591位における置換を含む、請求項459または460に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項459〜461のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、T591RまたはT591K置換を含む、請求項459〜462のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項432〜448のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号15のアミノ酸配列を含むAAV9のVP1に基づく、請求項464に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはA589位における置換を含む、請求項464または465に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項464〜466のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、A589RまたはA589K置換を含む、請求項464〜467のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項432〜448のいずれか1項に記載のシステム。
- ナンバリングは、配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVrh10のVP1に基づく、請求項469に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはA591位における置換を含む、請求項469または470に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項469〜471のいずれか1項に記載のシステム。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、A591RまたはA591K置換を含む、請求項469〜472のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項432〜473のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項432〜474のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項432〜475のいずれか1項に記載のシステム。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項432〜474のいずれか1項に記載のシステム。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項477に記載のシステム。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項432〜478のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項432〜479のいずれか1項に記載のシステム。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項480に記載のシステム。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項481に記載のシステム。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項479〜482のいずれか1項に記載のシステム。
- 個体はヒトである、請求項432〜483のいずれか1項に記載のシステム。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項484に記載のシステム。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項432〜485のいずれか1項に記載のシステム。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項486に記載のシステム。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項487に記載のシステム。
- 請求項365〜431のいずれか1項に記載の方法において使用するためのキット。
- 眼障害を処置するためのキットであって、
a)rAAV粒子を含む組成物であって、
該rAAV粒子は、
i)ヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用する1つもしくはそれ以上の位置における、またはAAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585もしくは588に対応する1つもしくはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含むrAAVカプシドタンパク質を含むrAAVカプシド、および
ii)眼障害を処置するための該異種核酸と少なくとも1つのAAV逆位末端反復配列とを含むrAAVベクター
を含む前記組成物;ならびに
b)硝子体内投与に好適な医薬品賦形剤
を含み、
場合により、該rAAV粒子は、AAVrh8R、AAV1、AAV6、AAV8、AAV9またはAAVrh10カプシドを含む、前記キット。 - 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、rAAVカプシドタンパク質の電荷を改変する、請求項489または490に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項491に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、正電荷を有さないアミノ酸残基の、正電荷を有するアミノ酸残基による置換を含む、請求項489〜492のいずれか1項に記載のキット。
- 正電荷を有するアミノ酸残基は、疎水性アミノ酸残基を置き換えている、請求項493に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項489〜494のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、アラニン、セリン、グルタミンまたはトレオニン残基のアルギニンまたはリシン残基による置換を含む、請求項489〜495のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号9のアミノ酸配列を含むAAVrh8RのVP1に基づく、請求項497に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてA586および/またはT589位における置換を含む、請求項489〜498のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、A586RまたはA586K置換を含む、請求項489〜499のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh8RのVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項489〜500のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号12のアミノ酸配列を含むAAV1のVP1に基づく、請求項502に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項502または503に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項502〜504のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV1のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項502〜505のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号13のアミノ酸配列を含むAAV6のVP1に基づく、請求項507に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはT589位における置換を含む、請求項507または508に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項507〜509のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV6のVP1に基づいてナンバリングして、T589RまたはT589K置換を含む、請求項507〜510のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号14のアミノ酸配列を含むAAV8のVP1に基づく、請求項512に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはT591位における置換を含む、請求項512または513に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項512〜514のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV8のVP1に基づいてナンバリングして、T591RまたはT591K置換を含む、請求項512〜515のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして586および/または589位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号15のアミノ酸配列を含むAAV9のVP1に基づく、請求項517に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてS586および/またはA589位における置換を含む、請求項517または518に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、S586RまたはS586K置換を含む、請求項517〜519のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAV9のVP1に基づいてナンバリングして、A589RまたはA589K置換を含む、請求項517〜520のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングして588および/または591位におけるものである、請求項489〜496のいずれか1項に記載のキット。
- ナンバリングは、配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVrh10のVP1に基づく、請求項522に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてQ588および/またはA591位における置換を含む、請求項522または523に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、Q588RまたはQ588K置換を含む、請求項522〜524のいずれか1項に記載のキット。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、AAVrh10のVP1に基づいてナンバリングして、A591RまたはA591K置換を含む、請求項522〜525のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、
治療用ポリペプチドまたは治療用核酸
をコードする、請求項489〜526のいずれか1項に記載のキット。 - 異種核酸は、抗酸化物質、神経栄養因子、抗アポトーシス因子、抗血管新生因子、および抗炎症因子からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項489〜527のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、次のもの:
Prph2、RPE65、AIPL1、GUCY2D、LCA5、CRX、CEP290、MYO 7a、Clarin、ABCA4、RDH12、IMPDH1、CRB1、LRAT、NMNAT1、TULP1、MERTK、RPGR、RP2、RPGRIP、CNGA3、CNGB3、GNAT2、GDNF、CNTF、FGF2、PEDF、EPO、BCL2、BCL−X、NFκB、エンドスタチン、アンジオスタチン、sFlt、sPDGF−R、IL10、抗IL17、sIL17R、IL1−ra、抗TGFβ、sTNF−R I、sTNF−R IIおよびIL4
からなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項489〜528のいずれか1項に記載のキット。 - 異種核酸は、治療用核酸をコードする、請求項489〜527のいずれか1項に記載のキット。
- 治療用核酸は、siRNA、shRNA、RNAi、miRNA、アンチセンスRNA、リボザイムまたはDNAザイムである、請求項530に記載のキット。
- 異種核酸は、網膜において発現されるプロモーター配列の制御下にある、請求項489〜531のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は、1つまたはそれ以上の網膜細胞タイプにおける治療用ポリペプチドまたは治療用核酸の発現に好適なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項489〜532のいずれか1項に記載のキット。
- 網膜細胞は、光受容器細胞、網膜色素性上皮細胞、双極細胞、水平細胞、アマクリン細胞、ミュラー細胞および/または神経節細胞である、請求項533に記載のキット。
- 網膜細胞は、光受容器細胞である、請求項534に記載のキット。
- プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、オプシンプロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項532〜535のいずれか1項に記載のキット。
- 個体はヒトである、請求項489〜536のいずれか1項に記載のキット。
- 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、先天性色覚異常、シュタルガルト病、ベスト病、ドイン病、錐体ジストロフィー、網膜色素変性、X連鎖性網膜分離症、アッシャー症候群、加齢性黄斑変性、萎縮性加齢性黄斑変性、血管新生AMD、糖尿病黄斑症、増殖性糖尿病性網膜症(PDR)、嚢胞様黄斑浮腫、中心性漿液性網膜症、網膜剥離、眼内炎症、緑内障および後部ぶどう膜炎
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項537に記載のキット。 - 異種核酸は:
常染色体劣性重症早期発症型網膜変性(レーバー先天黒内障)、シュタルガルト病、網膜色素変性、アッシャー症候群および加齢性黄斑変性
からなる群から選択される眼障害を処置するために使用される、請求項538に記載のキット。 - rAAVベクターは、自己相補型rAAVベクターである、請求項489〜539のいずれか1項に記載のキット。
- ベクターは、異種核酸をコードする第1の核酸配列と、該核酸の相補鎖をコードする第2の核酸配列とを含み、該第1の核酸配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2の核酸配列と鎖間塩基対を形成することができる、請求項540に記載のキット。
- 第1の核酸配列および第2の核酸配列は、突然変異AAV ITRによって連結されており、該突然変異AAV ITRは、D領域の欠失を含み、かつ末端切断配列の突然変異を含む、請求項541に記載のキット。
- rAAV粒子の組成物の硝子体内送達のためのデバイスをさらに含む、請求項489〜542のいずれか1項に記載のキット。
- rAAV粒子の組成物の硝子体内送達のための説明書をさらに含む、請求項489〜543のいずれか1項に記載のキット。
- 個体はヒトである、請求項422〜431のいずれか1項に記載の方法または請求項538〜544のいずれか1項に記載のキット。
- AAV3カプシドタンパク質を含むrAAV粒子であって、該AAV3カプシドタンパク質は、AAV2のVP1ナンバリングに基づいてナンバリングしてアミノ酸484、487、527、532、585または588に対応する1つまたはそれ以上の位置における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、前記rAAV粒子。
- 1つまたはそれ以上のアミノ酸置換は、眼または中枢神経系の細胞へのrAAV粒子の形質導入効率を、野生型AAVrh8Rカプシドタンパク質を含むAAV粒子と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、または少なくとも約100%増加させる、請求項546に記載のrAAV粒子。
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