JP2021502978A - 網膜ジストロフィーを治療するｒｄｈ１２コード領域を含むウイルスベクターおよび方法 - Google Patents

Abstract

ヒトＲＤＨ１２についての発現可能なコード領域を含むアデノ随伴ウイルスＡＡＶ２、血清型５（ＡＡＶ２／５）、またはＡＡＶ−５の有効量を投与することによって、レーバー先天性黒内障などの眼科的状態を治療するための材料、方法、および使用法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月１５日に提出された米国特許仮出願番号６２／５８６，６２４の優先的な利益を主張し、参照により本明細書に組み込まれる。

電子的に提出された資料の参照による組込み
本出願には、本開示の別の部分として、コンピュータ可読形式のシーケンスリスト（ファイル名：５１９１４Ａ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０１８年１１月９日作成、５，２３０バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル）が含まれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、レチノール脱水素酵素１２タンパク質（ＲＤＨ１２）をコードする遺伝子における少なくとも１つの機能喪失変異に起因する眼科的状態、例えば、レーバー先天性黒内障を有するヒト対象を治療する方法などの治療方法に関し、この方法は、ヒトＲＤＨ１２相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む有効量の核酸を対象に投与することを含む。

遺伝性網膜疾患（ＩＲＤ）は、子供における法律上の失明の主な原因である。レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）と早期発症重症網膜ジストロフィー（ＥＯＳＲＤ）は、出生時から数歳までに重度の視覚障害を引き起こし、すべてのＩＲＤの５％以上を占める（Ｋｏｅｎｅｋｏｏｐ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＬＣＡ／ＥＯＳＲＤは、網膜色素上皮ならびに桿体光受容体および錐体光受容体を主要な標的として含む、常染色体優性および常染色体劣性の遺伝様式に関連する（Ｗｅｌｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１３）。ＬＣＡ／ＥＯＳＲＤの約１０％は、ＲＤＨ１２をコードする遺伝子の変異に起因する（Ｋｕｍａｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。光受容体細胞に発色団を提供し、重要な治療標的を構成する視覚サイクルにおけるＲＤＨ１２の役割（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）を考慮すると、ＲＤＨ１２は最も重要なＬＣＡ遺伝子の１つである。

ヒトおよび非ヒト哺乳動物における遺伝性網膜疾患などの眼科的状態の有病率、およびレチノール脱水素酵素をコードする遺伝子の知識、ならびにそれらの遺伝子の一部の変異が及ぼす影響にもかかわらず、ＲＤＨ１２における１つ以上の変異に起因するＬＣＡの治療法は知られていない。したがって、ＬＣＡなどの網膜ジストロフィーを治療する際に有用な材料および方法、ならびにそのようなジストロフィーに繋がり得る遺伝的異常を矯正する際に有用な材料および方法の存在が、当該技術分野で引き続き必要とされている。

本発明は、レチノール脱水素酵素をコードする遺伝子であるＲＤＨ１２遺伝子の遺伝子産物についてのコード領域を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。ＲＤＨ１２を含むＡＡＶベクターは、ＲＤＨ１２コード領域が異種プロモーターなどの調節可能または制御可能なプロモーターの制御下に置かれる組換え構築物を提供することにより、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）などの網膜ジストロフィー障害を治療して、ＲＤＨ１２の変異に起因するようなＲＤＨ１２活性の野生型レベルを欠く対象に相補的レチノール脱水素酵素を提供するのに有用である。比較的小さなゲノムサイズ、比較的低い宿主ＤＮＡへの統合傾向、および比較的低い免疫原性プロファイルの利点にもかかわらず、驚くほどの発見は、いくつかのＡＡＶ血清型の組み合わせ、または偽型が、網膜ジストロフィーを治療するために対象に投与する状況において治療的に有効ではないおよび／または望ましくない毒性を示すコード化されたＲＤＨ１２産物に対して発現レベルをもたらすことであった。その発見は、ＡＡＶ２／５偽型などの特定の偽型が、網膜ジストロフィーを治療するための治療的使用と互換性のある予想外のかつ驚くほど効果的な発現レベルおよび毒性プロファイルを示す発見と一致している。本方法により治療できる対象には、視覚機能の喪失（例えば、網膜電図（ＥＲＧ）検査での応答障害）を有するが、光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）で判定されるような光受容細胞の一部が残っている対象が含まれ得る。したがって、一態様では、本開示は、レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異に起因する、リーバー先天性黒内障、すなわちＬＣＡなどの眼科的状態、または別の臨床的に定義された眼科的状態を有するヒト対象を治療する方法を提供する。より具体的には、本開示の一態様は、レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異に起因する眼科的状態を有するヒト対象を治療する方法を提供し、この方法は、対象の少なくとも片方の目に核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含み、核酸は、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡを含み、ＲＤＨ１２ＤＮＡ（例えば、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ）は、配列番号２の全長と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、眼科的状態はレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。上記のいくつかの実施形態では、眼科的状態はレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ＲＤＨ１２ｃＤＮＡは、ヒトロドプシンキナーゼ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターの発現制御下にあり、例えば、ｈＧＲＫ１プロモーターは、配列番号３を含むか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ−２、血清型−５（ＡＡＶ２／５）またはＡＡＶ−５である。いくつかの実施形態では、ＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ＲＤＨ１２ｃＤＮＡは、配列番号１と少なくとも６０％または７０％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ミリリットル当たり約２×１０^１０ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）から約２×１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価、例えば、約２×１０^１１ｖｇ／ｍＬまたは約２×１０^１２ｖｇ／ｍＬなどのミリリットル当たり約２×１０^１０ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）から約２×１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価で投与される。いくつかの実施形態では、核酸は、網膜下腔内に投与され、例えば、マイクロ注入カニューレが、網膜下腔内に挿入される。

本開示の別の態様は、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡをコードする核酸に関し、ＲＤＨ１２ ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡなどのヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ）は、配列番号２の全長と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードし、ＲＤＨ１２ＤＮＡは、ヒトロドプシンキナーゼ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、ｈＧＲＫ１プロモーターは、配列番号３を含むか、または本質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡは、配列番号２を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡ、例えば、ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡは、配列番号１の全長と少なくとも６０％または７０％同一である。

本開示のさらに別の態様は、レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異に起因する眼科的状態を有するヒト対象の治療に使用するための、本明細書に開示されている核酸である。いくつかの実施形態では、眼科的状態はレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。

本開示のさらに別の態様は、本明細書に開示されるようなＲＤＨ１２をコードする核酸を含むウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ−２、血清型−５（ＡＡＶ２／５）またはＡＡＶ−５である。

本開示の別の態様は、レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異に起因する眼科的状態を有するヒト対象の治療に使用するための、本明細書に開示されているウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、眼科的状態はレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。

本開示の別の態様は、本明細書に開示されているウイルスベクター、または本明細書に開示されている核酸を含む単離された宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、単離された宿主細胞はヒトＲＤＨ１２タンパク質を発現する。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法および材料が本明細書に記載されている。当該技術分野で知られている他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及する全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリおよび他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書が、定義を含め、優先される。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

視覚サイクルおよび視細胞におけるＲＤＨ活性。（Ａ）視覚サイクルは、ビタミンＡを１１−シスレチナール、すなわち、視物質の発色団に変換し、漂白後に放出されるオールトランスレチナールを再循環する。（Ｂ）ＲＰＥ−視細胞ペアに対して示されるレチノイドフロー。外側セグメントにおけるＲＤＨ８はオールトランスレチナールを還元し得る。内部セグメントにおけるＲＤＨ１２は、オールトランスレチナール、１１−シスレチナール、および他の有毒な短鎖アルデヒドを還元し得る。略語：１１ｃＲＡＬ、１１−シスレチナール。１１ｃＲＯＬ、１１−シスレチノール。ＡｔＲＡＬ、オールトランスレチナール。ＡｔＲＯＬ、オールトランスレチノール。ＲＣＨＯ、短鎖アルデヒド。ＲＣＨＯＨ、短鎖アルコール。Ｒｈ、ロドプシン。ＭＲｈ、メタロドプシン。 ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２注入マウスにおける組換えＲＤＨ１２の発現および局在。（Ａ）ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡが、ヒトロドプシンキナーゼプロモーターの下流で、ＡＡＶ２ゲノムに由来する末端逆位反復配列間で、クローニングされる、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２遺伝子治療構築物の概略図。（Ｂ、Ｃ）マウスＲｄｈ１２またはヒトＲＤＨ１２に特異的な抗体を使用して評価された、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）またはＰＢＳの網膜下注入後６週間のマウス網膜におけるヒトＲＤＨ１２タンパク質の発現。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、ＰＢＳ注入Ｒｄｈ１２^−／−マウス、およびＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２注入Ｒｄｈ１２^−／−マウスからの網膜溶解物のウエスタン分析。（Ｃ）免疫組織化学分析では、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにあるがＲｄｈ１２^−／−マウスにない網膜のＩＳ、ＯＮＬ、およびＯＰＬに対するネイティブマウスＲｄｈ１２（濃い灰色）の局在が示されている一方、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の注入からもたらされる組換えヒトＲＤＨ１２（薄い灰色）では、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＲｄｈ１２^−／−マウス両方に同様の局在が示されている。位相コントラスト画像（左）。略語：ＩＴＲ、末端逆位反復。ｈＧＲＫ１、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター。ＳＤ／ＳＡ、シミアンウイルス４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位。ｈＲＤＨ１２、ヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡ。ｐｏｌｙＡ、シミアンウイルス４０ポリアデニル化シグナル。ＰＲＥ、網膜色素上皮。ＯＳ、外側セグメント。ＩＳ、内部セグメント。ＯＮＬ、外顆粒層。ＯＰＬ、外網状層。ＩＮＬ、内顆粒層。ＩＰＬ、内網状層。ＧＣＬ、神経節細胞層。 ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２遺伝子置換療法は、ＲＤＨ１２欠損マウスのＲＤＨ１２機能を回復させる。（Ａ）ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）またはＰＢＳを注入されたまたは注入されていないＣ５７ＢＬ／６ＪおよびＲｄｈ１２^−／−マウスの網膜における網膜還元酵素活性のＨＰＬＣ分析。注入後６週間で、基質としてオールトランスレチナールを用いたアッセイでオールトランスレチノール形成を定量化した。各データポイントは、３〜５匹のマウスの網膜がプールされ、３回測定された、最低５回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。 （Ｂ）Ｒｄｈ１２^−／−マウスの全網膜切片における組換えＲＤＨ１２発現の免疫組織化学を、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の注入後１６週間で評価した。ヒトＲＤＨ１２（薄い灰色）は、網膜の注入された領域（画像の右側）のＩＳ、ＯＮＬ、およびＯＰＬに局在化している。
ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２遺伝子置換療法は、アルビノＲｄｈ１２欠損マウスの光損傷を軽減する。ＥＲＧ分析を、片方の眼にＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２を注入し、反対側の眼には注入しなかったマウスで、５，０００ルクスへの２時間の曝露の１週間前および１週間後に行った。暗所（桿体分離および桿体錐体組み合わせ）の応答を１０〜１３匹のマウスの群に対して定量化し、光損傷後に残った初期のＥＲＧ応答の割合を計算した。標準誤差を伴う平均化した結果、および両側の対応のあるｔ検定分析を使用して計算された、注入された眼と注入されていない眼との間の差の有意性を示す。 ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２は、網膜における１１−シスレチナールの定常レベルに大きな影響を与えない。マウスは、網膜下注入を介してＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）もしくはＰＢＳを投与されたか、または注入されなかった。一晩の暗順応に続いて、レチノイドを薄赤色光の下で抽出し、ＨＰＬＣ分析によって定量化した。（Ａ）各処理条件からの代表的なクロマトグラム。シン−１１−シスレチナールオキシム、アンチ−１１−シスレチナールオキシム、シン−オールトランスレチナールオキシムについてのピークを示す。 に対する（Ｂ）１１−ｃｉｓレチナール、および（Ｃ）ａｌｌ−ｔｒａｎｓレチナールの総レチナールレベル。
網膜機能は、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２によって悪影響を受けない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから治療後６週間で記録された暗所（桿体分離および組み合わされた桿体錐体）および明所（錐体媒介）網膜電図（ＥＲＧ）応答、非注入；Ｒｄｈ１２^−／−、非注入；ならびにＲｄｈ１２^−／−ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２注入マウス（最大２×１０^９ｖｇ）。注入後６週間で測定された各治療群の代表的な動物からのＥＲＧを示す。 視物質の局在化はＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２によって乱されない。非注入および注入（１．３×１０^９ｖｇ）Ｒｄｈ１２^−／−マウスにおけるロドプシンおよび錐体オプシンの免疫組織化学的局在が、治療後１６週間で評価された。ＩＳおよびＯＮＬにおけるヒトＲＤＨ１２タンパク質の発現（薄い灰色）。ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２を注入した眼のロドプシンおよび赤／緑オプシン（濃い灰色）。略語は図２について説明した通りである。 網膜構造は、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の長期発現によって損傷されない。Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＲｄｈ１２^−／−の眼の光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）の分析は、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（最大２×１０^９ｖｇ）の注入後５４週間で評価された。 ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２を注入した網膜における浸透ＣＤ６８＋マクロファージおよびＲＤＨ１２発現。Ｒｄｈ１２^−／−およびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（２×１０^９ｖｇ）の網膜下注入後８週間で免疫組織化学分析によって評価された。ＩＳ、ＯＮＬ、およびＯＰＬにおけるヒトＲＤＨ１２発現（薄い灰色）およびマクロファージのＣＤ６８ラベリング（白）。略語は、図２について説明した通りである。

遺伝性網膜変性は、標的遺伝子治療を開発するための現在の努力の焦点である、深刻な視力喪失のまれな原因である。ウイルスベクターを介した体細胞遺伝子治療は、ヒト網膜変性疾患の動物モデルの治療において大いに有望であることを示している。これまでに、小動物モデル（Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｐａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｐａｗｌｙｋ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｐａｗｌｙｋ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．２００９）および大型動物モデル（Ａｃｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２００１、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１２、Ｋｏｍａｒｏｍｙ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｌｈｅｒｉｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．２００９）で視細胞変性を救うためにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を介した遺伝子送達を使用した多くの成功した研究がある。これらの場合では、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または視細胞が導入遺伝子発現の主な標的となっている。さらに、ＲＰＥ（Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．２００８）、および最近では脈絡膜血症（Ｍａｃｌａｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１４）を標的化するレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）についての遺伝子治療を含む第Ｉ相臨床試験がすでにいくつかの成功を収めている。現在、ＲＤＨ１２の変異に起因する遺伝性網膜変性症の患者の治療にＡＡＶを介した遺伝子置換療法を使用した臨床試験はない。

ＲＤＨ１２における変異を有する個人の治療のためのＡＡＶを介した遺伝子治療の開発における関心により、本発明者らは、発現がロドプシンキナーゼプロモーターの制御下にあるヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡを担持するアデノ随伴ウイルスベクターを生成した。ＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型８に由来するキャプシドを有するベクターの開示された研究では、Ｒｄｈ１２欠損（Ｒｄｈ１２^−／−）マウスにおけるＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の網膜下送達が、安定して正しく局在化され、網膜還元酵素活性を再構成し、光損傷感受性を低減し、ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２で見られる網膜毒性を引き起こさない組換えヒトＲＤＨ１２の発現をもたらすことを示した。このＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ＲＤＨ１２構築物は、ＲＤＨ１２遺伝子置換療法のための産物を提供する。

ＲＤＨ１２
レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）をコードする遺伝子の変異は、多くの場合、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）または早期発症型重症網膜ジストロフィー（ＥＯＳＲＤ）と診断される深刻な早期発症型網膜変性を引き起こす。短鎖脱水素酵素／還元酵素のファミリーのメンバーであるＲＤＨ１２は、視細胞の光応答に不可欠なビタミンＡ視覚サイクル活性によって生成されるレチンアルデヒドを還元するために不可欠である。１１−シスレチナール発色団を含む視物質が光子を吸収すると、１１−シスレチナールはオールトランスレチナールに異性化され、したがって、シナプス型シグナル伝達を調節するシグナル伝達カスケードを開始する。視物質の不活性化には、１１−シスレチナール発色団の再生のための、オールトランスレチナールの放出、オールトランスレチノールへの還元、および網膜色素上皮（ＲＰＥ）への戻りが含まれる（図１Ａ）。これらのリサイクル反応が、例えば、老化または遺伝性疾患によって、非効率的であるかまたは破壊されると、レチンアルデヒドおよびレチンアルデヒド縮合産物が視細胞および網膜色素上皮に蓄積し、その結果、網膜外層に深刻な損傷が生じる（Ｂｅｎ−Ｓｈａｂａｔ ｅｔ ａｌ．２００１、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００３、Ｓｐａｒｒｏｗ ２０１０、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。

毒性から保護するために、多くのレチノイド結合タンパク質および酵素が網膜で発現される。ＲＤＨ１２は、ＮＡＤＰＨを使用して、シス−およびトランス−レチンアルデヒド（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）、脂質光酸化の結果として生成されたＣ９アルデヒド（Ｂｅｌｙａｅｖａ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｍａｒｃｈｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１０）、およびステロイド基質（Ｋｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）を含む広範囲の基質を還元する短鎖脱水素酵素／還元酵素のファミリーのメンバーである。ＲＤＨ１２遺伝子に機能喪失変異を有する個人は、現在処置法または治療法がない、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）としばしば診断される重度の網膜変性表現型を示す（Ｊａｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２００５、Ｐｅｒｒａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．２００４、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｍａｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．２０１１）。ＲＤＨ１２が、桿体および錐体視細胞の内側セグメントに局在し（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．２００６）、少なくとも一部において反応性レチンアルデヒドによって引き起こされる光誘発性損傷から保護する（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．２００６）。光曝露後に生成されたオールトランスレチナールは、視細胞の外側セグメントから内側セグメントに漏れることが示され、視細胞からの有効隙間は、外側セグメントに存在するＲＤＨ８および内側セグメントに存在するＲＤＨ１２の両方の活性を必要とする（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）（図１Ｂ）。そのため、ＲＤＨ１２は、網膜下腔から内側セグメントに入ることができるオプシン生合成に必要な量を超える１１−シスレチナールの還元に重要な役割を果たす可能性も有する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１２）。

ＲＤＨ１２変異によるＬＣＡ／ＥＯＳＲＤの遺伝子置換療法の可能性を調査するために、発現が視細胞特異的発現を指示するロドプシンキナーゼプロモーターの制御下にあるヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡを担持するアデノ随伴ウイルスベクターを生成した（Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＤＮＡ構築物は、視細胞の効率的で強力な形質導入を媒介するＡＡＶ血清型８由来のキャプシド（Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｎａｔｋｕｎａｒａｊａｈ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）、または視細胞の伝達を媒介するＡＡＶ血清型５キャプシドでパッケージングされるが、ＡＡＶ血清型８キャプシドと比較して反応速度は遅く、発現も強力ではない（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｌｏｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ．２００３、Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｌｅｂｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．２００８）。

Ｒｄｈ１２欠損症（Ｒｄｈ１２^−／−）のマウスモデルで行われた比較研究（Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００７）では、２つのベクターの安全性プロファイルが大きく異なり、ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２が網膜ジストロフィーを治療するための治療的使用に適合する予測を超えかつ驚くほど効果的な発現レベルと毒性プロファイルを示した。

ヒトＲＤＨ１２配列
翻訳開始部位に対してヌクレオチド−１０〜＋９８０からなり、７つすべての翻訳されたＲＤＨ１２エクソン（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＭ＿１５２４４３）をコードする、例示的なヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡの配列が、配列番号１で提供される。

完全長のヒトＲＤＨ１２タンパク質配列が、配列番号２で提供される。

ロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１ｐ）
本明細書に記載している方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載しているヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターの制御下に置かれる置換遺伝子構築物が使用される。一部の実施形態では、ｈＧＲＫ１プロモーターは、ロドプシンキナーゼ（ＲＫ）ｈＧＲＫ１遺伝子に由来する短いプロモーターを含む長さが約２００塩基対（ｂｐ）であり、桿体および錐体における細胞特異的発現を駆動することが示されている（Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３）。例示的なｈＧＲＫ１プロモーター配列は、配列番号３のヌクレオチド−１１２〜＋８７を含む（Ｋｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００７）。

ウイルス送達ベクター
上記のように、短縮されたヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡは、送達ベクター、例えば、ＡＡＶ５またはＡＡＶ２／５ベクターにパッケージングされる。

置換遺伝子（ｃＤＮＡ）は、成分遺伝子をインビボで細胞に効果的に送達することができる任意の有効な担体、例えば、任意の製剤または組成物で投与することができる。アプローチには、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、または組換え細菌もしくは真核生物プラスミドを含む非病原性、非複製性ウイルスベクターへの遺伝子の挿入が含まれる。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクトし、プラスミドＤＮＡは、裸で、または、例えば、カチオン性リポソーム（リポフェクタミン）または誘導体化（例えば、抗体複合化）、ポリリジン複合体、グラマシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、もしくは他のそのような細胞内担体、ならびに遺伝子構築物の直接注入またはインビボで実行されるＣａ_３（ＰＯ_４）_２沈殿の助けを得て送達することができる。

細胞への核酸のインビボ導入のための好ましいアプローチは、核酸、例えば、ｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用によるものである。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を受け取ることができるという利点を有する。さらに、例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡによって、ウイルスベクター内でコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現される。レトロウイルスベクターおよびアデノウイルス由来ベクターは、多くの細胞種において、インビボで、特にヒトへの外来遺伝子の導入のための組換え遺伝子送達システムとして使用され得る。しかしながら、それらは、この用途に有用になるように十分な効率で視細胞を変換しない。

核酸の送達に有用なさらに別のウイルスベクターシステムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを、効率的な複製および生産的なライフサイクルのためのヘルパーウイルスとして必要とする天然に存在する欠陥ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ．１９９２）。それはまた、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込む可能性のある数少ないウイルスの１つであり、高頻度で安定した組み込みを示す（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．１９８９、およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８８を参照されたい）。わずか３００塩基対のＡＡＶを含むベクターをパッケージングでき、かつ統合できる。外来性ＤＮＡのためのスペースは約４．５ｋｂに制限されてる。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８５に記載されているＡＡＶベクターを使用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶベクターを使用して、様々な核酸が様々な細胞種に導入されてきている（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．１９８４、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８４ａ、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．１９８４ｂ、Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８８、およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９３を参照されたい）。

好ましい実施形態では、ウイルス送達ベクターは、組換えＡＡＶ２／５ウイルスである。投与前に、最終産物は一連の超精製ステップを経て、臨床グレードの基準を満たすことができる。

対象選択
本治療法のための候補者である対象には、ＲＤＨ１２をコードする遺伝子における変異によって引き起こされるＬＣＡの診断を受ける対象が含まれる。ＲＤＨ１２をコードする遺伝子における変異によって引き起こされる他の眼科的に臨床的に規定された状態、例えば、早期発症網膜色素変性症に苦しむ対象も、本明細書に記載の方法を使用して治療することができる。ＲＤＨ１２をコードする遺伝子における変異によって引き起こされるＬＣＡまたは別の眼科的状態の診断は、当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる。

本明細書に記載の方法は、ＬＣＡまたはＲＤＨ１２をコードする遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる別の眼科的状態を有する、またはＬＣＡまたはＲＤＨ１２をコードする遺伝子の１つ以上の変異によって引き起こされる別の眼科的状態を有する疑いのある（例えば、子供の症状の存在に基づき、かつ他の明らかな原因がなく）対象、例えば、子供、青年、または若年成人対象を特定することと、ならびに、対象からゲノムＤＮＡを含む試料を取得することと、既知の分子生物学的方法を使用してＲＤＨ１２の変異の存在を検出することと、ＬＣＡまたは別の状態を引き起こす両方のＲＤＨ１２対立遺伝子における変異を有する患者を選択することと、を含み得る。状態の症状には、黄斑萎縮、中心窩の薄層化、および層状構造の破壊が含まれ、その結果、早期の中心視力喪失およびＬＰ視力への進行がもたらされる。測定された最も早い年齢で視野が狭窄し、ＥＲＧの応答が成人初期までに記録できなくなる。ＲＤＨ１２の変異を検出することには、対象におけるＲＤＨ１２遺伝子のすべてまたは一部をシーケンシングすることと、その配列を参照配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＧ＿００８３２１．１）と比較して、変異を検出することとが含まれる。フレームシフト変異、トランケーション変異、保存されたアミノ酸を変更する変異、転写体のスプライシングに影響を与える変異、または調節（例えば、プロモーター）領域に影響を与える変異は、本明細書に記載のＬＣＡまたは別の眼科的状態を引き起こし得る変異と見なされ、機能における変化は、変異体をインビトロで（例えば、培養細胞で）発現させ、例えば、酵素機能をアッセイすることによって確認することができる。ホモ接合状態の例示的な突然変異には、Ｇｌｕ１２７Ｘ、Ｇｌｎ１８９Ｘ、Ｔｙｒ２２６Ｃｙｓ、Ａｌａ２６９ＧｌｙｆｓＸ１、およびＬｅｕ２７４Ｐｒｏが含まれる（すべての位置参照は、配列番号２のＲＤＨ１２タンパク質配列を指す）。複合ヘテロ接合状態における例示的な突然変異には、ＴＨｒ４９Ｍｅｔ／Ａｒｇ６２Ｘ、Ａｒｇ６５Ｘ／Ａｌａ２６９ＧｌｙｆｓＸ１、Ｈｉｓ１５１Ｄ／Ｔｈｒ１５５Ｉｌｅ、Ｈｉｓ１５１Ｄ／Ａｒｇ２６９ＧｌｙｆｓＸ１（Ｊａｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．２００４、Ｓｃｈｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００７）が含まれる。（位置とは、配列番号２のタンパク質配列を指す。）

本明細書に記載の方法を使用して治療することができる少なくとも１つのＲＤＨ１２変異に起因するＬＣＡまたは別の眼科的状態を有する患者は、例えば、標準的な視覚機能またはフィールド試験および／または光干渉断層撮影法（ＯＣＴ、例えば、スペクトラルドメイン−ＯＣＴ（ＳＤ−ＯＣＴ））によって測定されるように、いくつかの視細胞および視覚機能を保持することが好ましい。本明細書に記載の方法は、少なくとも１つのＲＤＨ１２変異によりＬＣＡまたは別の眼科的状態と診断されていて、それらの状態を引き起こすＲＤＨ１２に少なくとも１つの確認された変異を有する対象を特定することと、対象の視覚能力を試験し、残存する中心視細胞の存在を検出することと、を含み得る。

本開示は、以下の実施例においてさらに説明され、これは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

材料および方法
以下に示す実施例に開示されている実験では、以下の材料および方法を使用した。

動物
ＲＤＨ１２^−／−マウスの生成と分析については以前に記載されている（Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００７）。この研究で使用したＲｄｈ１２^−／−マウスを、機関の動物施設で飼育しているヌル欠損の雄と雌との間の兄妹交配から育成した。この研究で使用したＷＴマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（マサチューセッツ州ウィルミントン）のＣ５７ＢＬ／６であった。

本明細書に開示している研究のために使用した遺伝子型のトランスジェニックマウスは、繁殖によって得られた、Ｒｐｅ６５−Ｍｅｔ４５０（Ｍ／Ｍ）変異についてホモ接合型のＣ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドのＲｄｈ１２^−／−マウス（Ｋｕｒｔｈ，２００７）、およびＲｐｅ６５−Ｌｅｕ４５０（Ｌ／Ｌ）についてホモ接合型のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのアルビノＲｄｈ１２^−／−マウス（Ｃｈｒｉｓｐｅｌｌ，２００９）である。マウスは、１２時間（明）／１２時間（暗）サイクルで飼育され、ＣＯ_２吸入に続き、両側気胸で安楽死させた。

組換えＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８のプラスミド構築および産生
以前に記載されているように、ＲＤＨ１２コード領域全体を包含するように設計されたプライマーを使用してＰＣＲによりヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡをヒト網膜ｃＤＮＡから増幅し、クローン化し、シーケンシングして、忠実度を検証した（Ｊａｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．２００４）。ＡＡＶベクターを構築するために、ＲＤＨ１２ｃＤＮＡを親ｐＡＡＶ−ｈＧＲＫ１−ｈｒＧＦＰベクターのマルチクローニングサイトに挿入した。得られたｐＡＡＶ−ｈＧＲＫ１−Ｒｄｈ１２ベクターをＡＡＶにパッケージングした。ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／８偽型ベクターは、二部トランスフェクション、すなわち、（１）目的の遺伝子をコードするＡＡＶベクタープラスミドと、（２）血清型２からのＡＡＶＲｅｐタンパク質、および血清型５または血清型８からのＣａｐタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに２９３Ｔ細胞へのアデノウイルスヘルパー機能と、によって生成された。トランスフェクションおよび精製は、公表されているプロトコルを使用して実行された（Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１５）。トランスフェクション後の２日で、凍結および解凍のサイクルを繰り返して細胞を溶解した。細胞残屑を最初に除去した後、ウイルス産生細胞の核酸成分をベンゾナーゼ処理により除去した。組換えＡＡＶベクター粒子は、ＡＶＢマトリックスを使用するアフィニティクロマトグラフィーで精製し、１×ＰＢＳで洗浄し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ４（１０ｋＤａ）コンセントレータを使用して１００〜１５０ｍｌの容量に濃縮した。ベクターは、ｑＰＣＲ増幅により力価測定された。

網膜下注入
約４週齢のマウスのコホートをケタミン（９０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（９ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入により全身麻酔下に置いた。局所麻酔薬として、０．５％プロパラカイン溶液を角膜に塗布した。瞳孔がトロピカミド（０．５％）の局所塗布で拡張された。眼科手術用顕微鏡下で、３０ゲージの針を使用して、角膜輪部に隣接する角膜に小さな切開を入れた。ハミルトン注入器に取り付けられた３４ゲージの鈍針をレンズの後ろの切開部から挿入して、網膜に押し込んだ。すべての注入を、網膜の鼻側四半部内の位置で網膜下に行った。各眼には、最大２μＬの容量で最大２×１０^９ｖｇＡＡＶ２／５−（ｈＧＲＫ１）−ｈＲＤＨ１２が投与された。ＲＤＨ１２をコードするベクターを、治療を受ける各マウスの片方の眼に別々に投与し、反対側の眼には注入しなかった。注入後の眼底検査では、殆どの場合、網膜の３０％以上が剥離していることがわかり、網膜下送達の成功が確認された。

抗体
使用した一次抗体は、マウスタンパク質に特異的なウサギアンチＲｄｈ１２ポリクローナル抗体（ＣＳＰ）（２５２ＳＰＦＦＫＳＴＳＱＧＡＱ２６３、配列番号４に対して）、およびヒトタンパク質に特異的なマウスアンチＲＤＨ１２モノクローナル抗体（２Ｃ９）（Ｃ−２８４ＤＣＫＲＴＷＶＳＰＲＡＲＮＮＫＴ２９９、配列番号５に対して）（Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００７）、マウスアンチＲＨＯモノクローナル抗体（１Ｄ４）（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．１９８４）、変性タンパク質に対して生成されたウサギアンチＲＨＯポリクローナル抗体、およびウサギアンチ赤／緑錐体オプシンポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃａｔ＃ＡＢ５４０５）であった。

イムノブロッティング分析
網膜ホモジネート中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に転写し、その後ブロックし、一次抗体と共に一晩インキュベートし、洗浄し、アルカリホスファターゼ結合二次抗体と共にインキュベートし、５−ブロモ−４−クロロ−３’インドリルりん酸ｐ−トルイジン塩およびニトロブルテトラゾリウムクロリドを使用して発現した。

組織学および免疫蛍光法
マウスを安楽死させ、目を方向付けのために採点し、次に除核した。凍結切片の場合、レンズと眼球前区を取り除き、４％パラホルムアルデヒドで目を簡単に固定し、ＰＢＳで洗浄し、スクロース／ＯＣＴに移行させ、瞬間凍結し、厚さ１０μｍに切片化した。凍結置換の準備のために、目全体をドライアイスで冷却したイソペンタン中で３０秒間瞬間凍結し、次に氷酢酸３％を含むドライアイスで冷却したメタノールに移した。眼を８０℃で４８時間、次に−２０℃で一晩インキュベートし、パラフィンに包埋し、厚さ６μｍに切片化した。次のように免疫標識化する前に、パラフィン切片を脱パラフィン化し、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ツイン２０、ｐＨ８．０で９０℃において３０分間インキュベートして抗原を回収した。簡潔に述べると、網膜断面をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ（０．３％トリトンＸ−１００）で透過化し、１％ウシ血清アルブミン、１０％正常ヤギ血清、および０．３％トリトンＸ−１００でブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、洗浄した後、フルオロフォア結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；インビトロジェン）を含むＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄゲルマウントを使用して切片を封入処理し、Ｌｅｉｃａ ＤＭ６０００蛍光顕微鏡を使用して画像形成した。

ＥＲＧ記録
ＥＲＧを、Ｅｓｐｉｏｎ ｅ２記録システム（Ｄｉａｇｎｏｓｙｓ、マサチューセッツ州ローウェル）を使用して、以前に説明されているように（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ．２０１２）実行した。簡潔に述べると、マウスを一晩暗順応させ、ケタミン（９３ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入で麻酔をかけた。瞳孔をトロピカミド（０．５％）の局所投与で拡張した。体温は、加熱パッドで３７℃に維持した。角膜ＥＲＧは、０．５％テトラカイン局所麻酔および角膜水和のための一滴の２％メチルセルロースを含む金ワイヤループを使用して、両目から記録された。口内に置かれた金ワイヤループを基準として使用し、接地電極が尾にあった。ＥＲＧプロトコルは、短い白色フラッシュに対する暗順応（暗所）応答の記録で構成されていた（桿体分離Ｂ波の場合は、−２．３１ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ^−２、桿体錐体組み合わせＡ−およびＢ−波の場合は１．０９ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ^−２）。光順応（明所）ＥＲＧは、１．０９ｌｏｇ ｃｄ．ｓ．ｍ^−２強度フラッシュ（錐体分離Ｂ波の場合）に応じて、白色の３２ｃｄ．ｍ^−２桿体抑制バックグラウンドに対し１０分間順応した後に記録された。応答は、１．２５〜１０００Ｈｚで１，０００ゲインで増幅され、２０００Ｈｚのレートでデジタル化された。ノッチフィルタを使用して、６０Ｈｚのラインノイズを除去した。応答はコンピュータで平均化され、刺激強度に応じて３〜６０秒間隔で記録された。統計解析では、対応のあるｔ検定を使用して、治療した眼のＥＲＧ振幅が未治療の眼と有意に異なるかどうかを判断した。

光誘発性損傷の分析
アルビノＲｄｈ１２^−／−マウスの片眼にＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）、または等しい溶量のＰＢＳを注入し、反対側の眼には注入しなかった。注入後６週間で、ＥＲＧ分析を実行し、暗所応答を上記のように定量化した。１週間後、マウスを一晩暗順応させ、その瞳孔をトロピカミド（０．５％）で拡張し、個別の透明なトレイのライトボックス内に入れた。マウスを５，０００ルクスに２時間曝した後、７日間飼育室に戻し（１２時間暗／１２時間明（＜２０ルクス））、その後ＥＲＧ分析を繰り返した。光損傷後に残った元のＥＲＧ応答の割合が各目に対して計算され、平均がプロットされ、標準誤差が示された。両側の対応のあるｔ検定を使用して、治療した眼のＥＲＧ振幅が未治療の眼と有意に異なるかどうかを判定した。

光干渉断層撮影法
マウスを麻酔し、瞳孔を０．５％トロピカミドで拡張した。ボリューム分析サイズが１．４×１．４ｍｍのスペクトラルドメイン光干渉断層撮影（ＯＣＴ）システム（Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｅｎｖｉｓｕ Ｒ２２００ＳＤ−ＯＣＴ ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ，ＵＳＡ））は、視神経頭を中心とした。Ｓｙｓｔａｎｅ（Ａｌｃｏｎ）潤滑剤滴が、画像形成プロセス全体で使用された。

レチノイド含有量の分析
以前に記載された方法（Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ，１９５９）の修正を使用して、マウスの眼におけるオールトランス網膜および１１−シス網膜を抽出した。注入後６週間のマウスを一晩暗順応させ、その後薄暗い赤色光の下で、ＣＯ_２過剰摂取により安楽死させ、眼球を摘出し、液体Ｎ_２で凍結した。薄赤色光の下で氷上で、各目を１ｍＬのクロロホルム、すなわち、メタノール、ドロキシルアミン（２Ｍ）（３：６：１）で均質化し、室温で２分間インキュベートした。次に、２００μＬのクロロホルムおよび２４０μＬの水を加え、各試料をボルテックスし、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。下相を収集し、溶媒を窒素中で蒸発させ、試料をヘキサンに溶解した。キサン中の５％１，４−ジオキサンで発現されたＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−３１カラム（２５ｃｍ×４．６ｍｍ×３μｍ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ分離モジュールおよびフォトダイオードアレイ検出器を使用して、抽出物中のレチノイドを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって識別および定量化した。標準化合物の保持時間との比較および最大波長の評価により、ピークの同定を行った。定量分析は、シン−およびアンチ−１１−シスレチナールオキシムについて、それぞれ、３４７および３５１ｎｍ、ならびにシン−およびアンチ−オールトランスレチナールオキシムについて、それぞれ、３５７および３６１ｎｍでのピーク面積を比較することによって行われた（Ｋｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．２００７）。

網膜還元酵素活性のアッセイ
マウス網膜ホモジネートを、注入後６週間で網膜還元酵素活性についてアッセイした。光に順応したマウスを安楽死させ、各網膜を、１２５μＬの０．２５Ｍスクロース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７、１ｍＭジチオスレイトールで個別にホモジナイズした。ホモジネートを１０００ｘｇで５分間遠心分離して、破壊していない細胞を除去し、次に上清を氷上でマイクロチッププローブ（各１秒間に３０回）で超音波処理した。タンパク質濃度は、ローリー法の修正（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９７７）によって判定され、ＲＤＨ１２のレベルは、ウエスタンブロットによって評価された。同様の試料がプールされ、プールされた各ライセートの２０μｇが、ＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ８）に２００μＭオールトランスレチナールおよび２００μＭＮＡＤＰＨを含むバッファで（３組で）アッセイされ、反応を３７℃の水浴（レチノイド基質の熱異性化および酵素の不活性化を最小限に抑える反応温度）で０〜４５分間インキュベートした。オールトランスレチノール形成は、既知の標準と比較して順相ＨＰＬＣ分析を使用して定量化された（Ｃｈｒｉｓｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００９）。

実施例１
ヒトＲＤＨ１２のＡＡＶを介した発現
ＲＤＨ１２置換療法のための様々なベクターが発現され、試験された。最適なＲＤＨ１２ベクター構築物を図２Ａに示す。これは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター断片の制御下でヒトＲＤＨ１２ｃＤＮＡを含む。構築物はＡＡＶ２／５血清型にパッケージングされる。ＡＡＶ血清型５キャプシドは、視細胞の伝達を媒介することを示しているが、ＡＡＶ８キャプシドと比較して反応速度は遅く、発現の堅牢性は低くなる（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００２、Ｌｏｔｅｒｙ ｅｔ ａｌ．２００３、Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｌｅｂｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ．２００８）。ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）の網膜下注入後６週間のマウス網膜におけるヒトＲＤＨ１２タンパク質発現を、マウスＲｄｈ１２またはヒトＲＤＨ１２タンパク質に特異的な抗体を使用して評価した。ヒトＲＤＨ１２のベクター送達レベルは、マウスＲｄｈ１２の量にほぼ匹敵するように見える（図２Ｂ）。種特異的抗体を使用して、ネイティブマウスＲｄｈ１２および組換えヒトＲＤＨ１２を評価するために、網膜切片の間接免疫蛍光イメージングを使用した。内在性および組換えＲＤＨ１２の局在は同一であるように見え、タンパク質が正常に処理されていることを示している（図２Ｃ）。

Ｒｄｈ１２^−／−マウスの網膜が外因性レチンアルデヒドを還元する能力は、野生型マウスと比較して大幅に低下している（Ｃｈｒｉｓｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００９）。Ｒｄｈ１２^−／−マウスへの１．３×１０^９ｖｇＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の網膜下注入後６週間で、網膜ホモジネートをインビボの網膜還元酵素活性についてアッセイした。オールトランスレチノール形成を順相ＨＰＬＣ分析を使用して定量化した。各データポイントは、３〜５匹のマウスの網膜をプールして、３回測定した、最低５回の独立した実験の平均±標準誤差を表す。注入されていないＲＤＨ１２^−／−マウスおよびＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの網膜におけるオールトランスレチノール形成の初期速度は、それぞれ０．０１３ｐｍｏｌ ｍｉｎｕｔｅ^−１μｇタンパク質^−１、および０．０７１ｐｍｏｌ ｍｉｎｕｔｅ^−１μｇタンパク質^−１であった（図３Ａ）。ＲＤＨ１２^−／−マウスに存在する残存活性は、オールトランス型レチナールを還元することができる他のＲＤＨアイソフォームの存在を反映している（Ｒａｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２）。ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２を注入されたＲＤＨ１２^−／−マウスにおいて、０．０４６ｐｍｏｌ ｍｉｎｕｔｅ^−１μｇタンパク質^−１のオールトランスレチノール形成の速度は、ＰＢＳが注入されたＲｄｈ１２^−／−マウス（０．０１６ｐｍｏｌ ｍｉｎｕｔｅ^−１μｇタンパク質^−１）より有意に大きかった。網膜還元酵素活性の回復（約５０％）は、網膜の部分的形質導入（約３０％）と一致し、ベクターが形質導入された視細胞の正常レベルの活性を回復したことを示している。導入遺伝子は１２ヶ月以上（調査された最も長い時点）発現した。免疫蛍光標識は、網膜表面の約３分の１をカバーする注入後１６週間で評価されたＲｄｈ１２^−／−マウスにおける網膜形質導入および組換えＲＤＨ１２発現の程度を示した（図３Ｂ）。

光誘発性損傷に対する感受性へのＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の効果は、１．３×１０^９ｖｇまたは同量のＰＢＳを片方の眼に注入され、反対側の眼には治療を受けなかったアルビノＲｄｈ１２^−／−マウスで評価された。暗所網膜活動（桿体分離および桿体錐体組み合わせ）のＥＲＧ分析を１週間前および１週間後に行い、マウスをアルビノ動物に重大な網膜損傷を引き起こす光レベル（５，０００ルクスで２時間）に曝した。ベクター処理した眼に残っている網膜活動の割合は、未処理の眼に残っている網膜活動よりも有意に高かった（ｐ≦０．０１６８）（図４）。対照的に、ＰＢＳを注入された対照動物では、注入されていない眼に残っている暗所網膜活動の割合は、治療されていない眼よりも有意に高くなかった（ｐ≧０．２２５５）。これらの調査結果は、ＲＤＨ１２欠乏に関連する光誘発性損傷に対する感受性の増加に対するＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２を媒介した保護と一致している。

ベクターの毒性を、レチノイド代謝に対するヒトＲＤＨ１２活性の直接的な影響を通じて、および次の節で説明するように、網膜構造および網膜機能に対する間接的な影響について、評価した。

１１−シスレチナールおよびオールトランスレチナールの両方の還元を可能にするＲＤＨ１２の広範な基質特異性は、視覚サイクル機能に悪影響を与える組換えタンパク質の過剰発現または誤局在の可能性を生み出した。ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２もしくはＰＢＳを注入したＲｄｈ１２^−／−マウス、または注入していないＣ５７ＢＬ／６Ｊ制御からの眼の視覚サイクル活動を評価するために、レチノイド含有量のＨＰＬＣ分析を使用した。ＲＤＨ１２^−／−マウスへのＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）の網膜下注入後６週間でのレチノイドの分析は、ｈＲＤＨ１２発現が、網膜において定常状態の１１−シスレチナールレベルに有意な影響を及ぼさないことを示した（図５Ａ）。代表的なクロマトグラムは、示されている様々なレチノイドの溶出時間とともに様々な制御を示す。１１−シスレチナールおよびオールトランスレチナールの総レチナールレベルは、最低５つの独立した実験の平均値±標準誤差を表す（図５Ｂ、Ｃ）。（ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の１．３×１０^９ｖｇを受け、ビバリウム（ｖｉｖａｒｉｕｍ）ハウジング（１２時間暗／１２時間明（＜２０ルクス））で維持したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＲｄｈ１２^−／−マウスで網膜活動のＥＲＧ応答を測定した。注入後６週間で測定された各治療群の代表的な動物の暗所（桿体分離−２．３ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ^−２刺激）、桿体錐体組み合わせ（１．０９ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ^−２刺激）、および明所（錐体媒介応答、１．０９ｌｏｇ ｃｄ．ｓｍ^−２刺激）ＥＲＧは、網膜機能に対するヒトＲＤＨ１２発現の有意な影響を示さなかった（図６）。

ロドプシンと錐体オプシンの局在異常は、視細胞の生存率の低下をよく特徴付ける指標である（Ａｄａｍｉａｎ ｅｔ ａｌ．２００６、Ｔｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｌｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ロドプシンおよび赤／緑オプシンの免疫組織化学的局在を、非注入の、またはＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（１．３×１０^９ｖｇ）を注入したＲｄｈ１２^−／−マウスで評価した。強力な導入遺伝子発現を示すマウスでは、治療後１６週間で、オプシン発現レベルの低下または桿体および錐体オプシンの局在異常の証拠は観察されず、網膜構造は、注入後５４週間に前の状態のままであった（図７）。

ＡＡＶ２／５−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２（２×１０^９ｖｇ）の注入後５４週間で評価したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスおよびＲｄｈ１２^−／−マウスの光干渉断層撮影（ＯＣＴ）分析は、視神経の両側を含む広範囲にわたって網膜層の全体的な変化を示さなかった。網膜構造は、注入されていない反対側の眼と比較すると、注入後少なくとも１年間は安定していた（図８）。

実施例２．ＡＡＶ２／８に起因する網膜損傷
ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２が注入されたマウスの網膜損傷。
ＡＡＶ血清型８に由来するキャプシドは、視細胞の効率的かつ強力な形質導入を媒介することが示された（Ａｌｌｏｃｃａ ｅｔ ａｌ．２００７、Ｎａｔｋｕｎａｒａｊａｈ ｅｔ ａｌ．２００８、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）。最初の研究は、上記のベクター構築物を担持するＡＡＶ２／８血清型を用いて行われた。１０^８〜１０^９のウイルスゲノム（ｖｇ）の用量でＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２の網膜下注入によって処置したＲＤＨ１２^−／−マウスは、組換えヒトＲＤＨ１２タンパク質の強い発現をもたらした。しかしながら、注入された眼は、注入後３週間という早い時期から始まり、殆どすべての場合に注入後６週間までに、重大な網膜損傷を発症した。マクロファージ浸潤は、ＣＤ６８^＋細胞の存在によって大部分の場合に観察された（図９）。離乳時から屠殺時まで継続的にＲｄｈ１２^−／−マウスにシクロスポリン（Ｂｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．１９７６）の全身投与で、網膜の損傷は軽減されず、ベクターまたは導入遺伝子に対する免疫応答が損傷の原因ではなかったことが示された。このビューは、有意な網膜の薄化およびマクロファージ浸潤も注入後６週間までに発生した、ヒトＲＤＨ１２（ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｈＲＤＨ１２）またはマウスＲｄｈ１２（ＡＡＶ２／８−ｈＧＲＫ１ｐ．ｍＲＤＨ１２）のいずれかをコードする構築物を注入された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスで得られた結果と合致した。

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ＮＡＴＫＵＮＡＲＡＪＡＨ Ｍ，ＴＲＩＴＴＩＢＡＣＨ Ｐ，ＭＣＩＮＴＯＳＨ Ｊ，ＤＵＲＡＮ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｏｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ２／８．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １５，４６３−７．
ＮＩＳＨＩＧＵＣＨＩ ＫＭ，ＣＡＲＶＡＬＨＯ ＬＳ，ＲＩＺＺＩ Ｍ，ＰＯＷＥＬＬ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）．Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｖｉｓｉｏｎ ｉｎ ｒｄ１ ｍｉｃｅ ａｆｔｅｒ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ａ ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｇｐｒ１７９．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６，６００６．ＰＡＮＧ ＪＪ，ＬＥＩ Ｌ，ＤＡＩ Ｘ，ＳＨＩ Ｗ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ １２，３１６−３０．
ＰＡＷＬＹＫ ＢＳ，ＳＭＩＴＨ ＡＪ，ＢＵＣＨ ＰＫ，ＡＤＡＭＩＡＮ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｃｕｅｓ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ ｌａｃｋｉｎｇ ＲＰＧＲＩＰ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４６，３０３９−４５．
ＰＡＷＬＹＫ ＢＳ，ＢＵＬＧＡＫＯＶ ＯＶ，ＬＩＵ Ｘ，ＸＵ Ｘ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｈｕｍａｎ ＲＰＧＲＩＰｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｌｏｗｓ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１，９９３−１００４．
ＰＥＲＲＡＵＬＴ Ｉ，ＨＡＮＥＩＮ Ｓ，ＧＥＲＢＥＲ Ｓ，ＢＡＲＢＥＴ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ １２（ＲＤＨ１２） ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ７５，６３９−４６．
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ＴＨＯＭＰＳＯＮ ＤＡ，ＧＡＬ Ａ．（２００３）．Ｖｉｔａｍｉｎ Ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ｇｅｎｅｓ，ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ ２２，６８３−７０３．
ＴＨＯＭＰＳＯＮ ＤＡ，ＪＡＮＥＣＫＥ ＡＲ，ＬＡＮＧＥ Ｊ，ＦＥＡＴＨＥＲＳ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．（２００５）．Ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＤＨ１２ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｒｏｍ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ １１−ｃｉｓ ｒｅｔｉｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｓｕａｌ ｃｙｃｌｅ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４，３８６５−７５．
ＴＨＯＭＰＳＯＮ ＤＡ，ＫＨＡＮ ＮＷ，ＯＴＨＭＡＮ ＭＩ，ＣＨＡＮＧ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｒｄ９ ｉｓ ａ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｒｍ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＲＰＧＲ−ＯＲＦ１５．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７，ｅ３５８６５．
ＴＲＡＴＳＣＨＩＮ ＪＤ，ＷＥＳＴ ＭＨ，ＳＡＮＤＢＡＮＫ Ｔ，ＣＡＲＴＥＲ ＢＪ．（１９８４ａ）．Ａ ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ，ａｓ ａ ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｖｅｃｔｏｒ：ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４，２０７２−８１．
ＴＲＡＴＳＣＨＩＮ ＪＤ，ＭＩＬＬＥＲ ＩＬ，ＣＡＲＴＥＲ ＢＪ．（１９８４ｂ）．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａｎ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ５１，６１１−９．
ＴＲＡＴＳＣＨＩＮ ＪＤ，ＭＩＬＬＥＲ ＩＬ，ＳＭＩＴＨ ＭＧ，ＣＡＲＴＥＲ ＢＪ．（１９８５）．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５，３２５１−６０．
ＴＵＲＮＥＹ Ｃ，ＣＨＯＮＧ ＮＨ，ＡＬＥＸＡＮＤＥＲ ＲＡ，ＨＯＧＧ ＣＲ，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｃａｎｉｎｅ ｃｏｎｅ−ｒｏｄ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｌｏｎｇｈａｉｒｅｄ ｄａｃｈｓｈｕｎｄ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８，４２４０−９．
ＶＡＮＤＥＮＢＥＲＧＨＥ ＬＨ，ＢＥＬＬ Ｐ，ＭＡＧＵＩＲＥ ＡＭ，ＣＥＡＲＬＥＹ ＣＮ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｄｏｓａｇｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ ｆｏｒ ＡＡＶ２ ａｎｄ ＡＡＶ８ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｏｎｋｅｙ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３，８８ｒａ５４．
ＶＡＮＤＥＮＢＥＲＧＨＥ ＬＨ，ＢＥＬＬ Ｐ，ＭＡＧＵＩＲＥ ＡＭ，ＸＩＡＯ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＡＡＶ９ ｔａｒｇｅｔｓ ｃｏｎｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｒｅｔｉｎａ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８，ｅ５３４６３．
ＸＩＡＯ Ｘ，ＬＩ Ｊ，ＳＡＭＵＬＳＫＩ ＲＪ．（１９９８）．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｌｐｅｒ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２，２２２４−３２．
ＹＡＮＧ ＧＳ，ＳＣＨＭＩＤＴ Ｍ，ＹＡＮ Ｚ，ＬＩＮＤＢＬＯＯＭ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｉｎａ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６，７６５１−６０．
ＹＯＵＮＧ ＪＥ，ＶＯＧＴ Ｔ，ＧＲＯＳＳ ＫＷ，ＫＨＡＮＩ ＳＣ．（２００３）．Ａ ｓｈｏｒｔ，ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４４，４０７６−８５．
ＷＥＬＥＢＥＲ ＲＧ，ＦＲＡＮＣＩＳ ＰＪ，ＴＲＺＵＰＥＫ ＫＭ，ＢＥＡＴＴＩＥ Ｃ．（２００４）．Ｌｅｂｅｒ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｍａｕｒｏｓｉｓ．Ｉｎ：ＰＡＧＯＮ ＲＡ，ＡＤＡＭ ＭＰ，ＡＲＤＩＮＧＥＲ ＨＨ，ＷＡＬＬＡＣＥ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（登録商標）［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．Ｓｅａｔｔｌｅ（ＷＡ）：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ；１９９３−２０１７．［ｕｐｄａｔｅｄ ２０１３ Ｍａｙ ２］．
ＷＯＮＤＩＳＦＯＲＤ ＦＥ，ＵＳＡＬＡ ＳＪ，ＤＥＣＨＥＲＮＥＹ ＧＳ，ＣＡＳＴＲＥＮ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（１９８８）．Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ｂｅｔａ−ｓｕｂｕｎｉｔ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ ａｆｔｅｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２，３２−９．

本明細書で引用している参考文献のそれぞれは、引用の文脈から明らかであるように、その全体または関連部分が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示をその詳細な説明と併せて記載しえいるが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲を例示し、これを限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (22)

1. レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異により眼科的状態を有するヒト対象を治療する方法であって、前記対象の少なくとも片方の眼に核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターを投与することを含み、前記核酸が、ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡを含み、前記ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡが、配列番号２の全長と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードする、方法。
2. 前記眼科的状態が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＲＤＨ１２ＤＮＡが、ヒトロドプシンキナーゼ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターの発現制御下にある、請求項１に記載の方法。
4. 前記ｈＧＲＫ１プロモーターが、配列番号３を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ−２、血清型−５（ＡＡＶ２／５）、またはＡＡＶ−５である、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＲＤＨ１２ＤＮＡが、配列番号１と少なくとも６０％または７０％同一である配列を含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記核酸を約２×１０^１０ウイルスゲノム／ミリリットル（ｖｇ／ｍＬ）〜約２×１０^１２ｖｇ／ｍＬの力価で投与することを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記核酸が、網膜下腔内に投与される、請求項１に記載の方法。
9. マイクロ注入カニューレが、前記網膜下腔内に挿入される、請求項８に記載の方法。
10. ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡをコードする核酸であって、前記ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡが、配列番号２の全長と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一であるタンパク質をコードし、前記ＲＤＨ１２ＤＮＡが、ヒトロドプシンキナーゼ１（ｈＧＲＫ１）プロモーターの制御下にある、核酸。
11. 前記ｈＧＲＫ１プロモーターが、配列番号３を含む、請求項１０に記載の核酸。
12. 前記ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡが、配列番号２を含むタンパク質をコードする、請求項１０に記載の核酸。
13. 前記ヒトＲＤＨ１２ＤＮＡが、配列番号１の全長と少なくとも６０％または７０％同一である、請求項１０に記載の核酸。
14. レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異により眼科的状態を有するヒト対象の治療に使用するための、請求項１０〜１３に記載の核酸。
15. 前記眼科的状態が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である、請求項１４に記載の核酸。
16. 請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の核酸を含むウイルスベクター。
17. アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項１６に記載のウイルスベクター。
18. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、ＡＡＶ−２、血清型−５（ＡＡＶ２／５）、またはＡＡＶ−５である、請求項１７に記載のウイルスベクター。
19. レチノール脱水素酵素１２（ＲＤＨ１２）タンパク質をコードする遺伝子における１つ以上の機能喪失変異による眼科的状態を有するヒト対象の治療に使用するための、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
20. 前記眼科的状態が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である、請求項１９に記載のウイルスベクター。
21. 単離された宿主細胞であって、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のウイルスベクター、または請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
22. 前記細胞が、ヒトＲＤＨ１２タンパク質を発現する、請求項２１に記載の単離された宿主細胞。