BR112020009828A2

BR112020009828A2 - vetores virais que compreendem regiões de codificação de rdh12 e métodos para tratar distrofias retinais

Info

Publication number: BR112020009828A2
Application number: BR112020009828-0A
Authority: BR
Inventors: Debra A. Thompson; Robin R. Ali; Alexander J. Smith
Original assignee: The Regents Of The University Of Michigan; Ucl Business Ltd
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2018-11-15
Publication date: 2020-11-17
Also published as: SG11202004527YA; IL308645A; CN111886340A; AU2018367606A1; EA202091194A1; EP4364803A2; PH12020551319A1; EP4364803A3; EP3710590A1; EP3710590B1; IL274609B1; EP3710590A4; JP2023133434A; MX2020005008A; CA3082586A1; IL274609B2; IL274609A; JP2021502978A; US20230190884A1; CN117752822A

Abstract

A presente invenção se refere a materiais, métodos e usos para tratar uma condição oftalmológica, tal como a Amaurose Congênita de Leber, administrando-se uma quantidade eficaz de um vírus associado ao adeno AAV2, sorotipo 5 (AAV 2/5) ou AAV-5 que compreende uma região de codificação expressível para RDH12 humana.

Description

“VETORES VIRAIS QUE COMPREENDEM REGIÕES DE CODIFICAÇÃO DE RDH12 E MÉTODOS PARA TRATAR DISTROFIAS RETINAIS”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Provisório nº US 62/586.624, depositado em 15 de novembro de 2017, incorporado ao presente documento a título de referência.

INCORPORAÇÃO DE MATERIAIS ENVIADOS ELETRONICAMENTE A TÍTULO DE REFERÊNCIA

[0002] Este pedido contém, como uma parte separada da divulgação, uma Listagem de Sequências em formato legível por computador (nome do arquivo: 51914A_Seqlisting.txt; criado em 9 de novembro de 2018;

5.230 bytes - arquivo de texto em ASCII) a qual é incorporada ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

CAMPO

[0003] A divulgação se refere a métodos de tratamento médico, tais como métodos para tratar um sujeito humano com uma condição oftalmológica, por exemplo, amaurose congênita de Leber, devido a pelo menos uma mutação de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12), em que o método compreende administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um ácido nucleico que compreende um vetor viral adeno-associado que compreende um DNA complementar a RDH12 humana (cDNA).

ANTECEDENTES

[0004] A doença hereditária da retina (IRD) é uma das principais causas de cegueira legal em crianças. A amaurose congênita de Leber (ACV) e a distrofia retiniana grave de início precoce (EOSRD) resultam em grave comprometimento visual, começando no nascimento até alguns anos de idade, e juntas representam 5% ou mais de todas as IRDs (Koenekoop et al. 2004). As ACV/EOSRD estão associadas a modos de herança autossômicos dominantes e autossômicos recessivos, que envolvem o epitélio pigmentar da retina e os fotorreceptores de bastonetes e cones como alvos principais (Weleber et al. 2013). Aproximadamente 10% de LCA/EOSRD são causados por mutações no gene que codifica RDH12 (Kumaran et al. 2017). Dado o papel de RDH12 no ciclo visual que fornece cromóforo às células fotorreceptoras (Haeseleer et al. 2002; Chen et al. 2012), e que constitui um alvo terapêutico crítico, a RDH12 é um dos genes mais importantes de LCA.

[0005] Apesar da prevalência de condições oftalmológicas, como doença hereditária da retina em seres humanos e mamíferos não humanos, e o conhecimento de genes que codificam retinol desidrogenases, bem como o efeito de algumas mutações nesses genes, não há tratamento conhecido para LCA causada por uma ou mais mutações em RDH12. Consequentemente, continua a existir uma necessidade na técnica de materiais e métodos úteis no tratamento de distrofias da retina, tal como LCA, bem como materiais e métodos úteis na correção de anomalias genéticas que podem levar a essas distrofias.

SUMÁRIO

[0006] A invenção fornece um vetor de vírus adeno- associado (AAV) que compreende uma região de codificação para o produto gênico do gene de RDH12, um gene que codifica uma enzima retinol desidrogenase. O vetor AAV que compreende RDH12 é útil no tratamento de distúrbios da distrofia retiniana, tal como a Amaurose Congênita de Leber (LCA), fornecendo um construto recombinante em que uma região codificadora de RDH12 é colocada sob o controle de um promotor regulável ou controlável, tal como um promotor heterólogo, para fornecer retinol desidrogenase complementar a sujeitos sem níveis do tipo selvagem de atividade de RDH12, tal como resultaria de mutações em RDH12. Apesar das vantagens do tamanho de genoma relativamente pequeno, da tendência relativamente baixa de se integrar ao DNA hospedeiro e do perfil imunogênico relativamente baixo, constatou-se de modo surpreendente que algumas combinações de sorotipos de

AAV, ou pseudotipos, produzem níveis de expressão para o produto de RDH12 codificado que não é terapeuticamente eficaz e/ou que exibe toxicidade indesejável no contexto de administração a sujeitos para tratar distrofias retinianas.

Coincidente com essa constatação é a constatação de que determinados pseudotipos, tal como o pseudotipo de AAV2/5, demonstram níveis de expressão inesperados e surpreendentemente eficazes e perfis de toxicidade compatíveis com o uso terapêutico para tratar distrofias retinianas.

Os sujeitos que podem ser tratados pelos métodos atuais podem incluir aqueles que têm perda de função visual (por exemplo, resposta prejudicada no teste de eletrorretinograma (ERG)), mas que retêm algumas células fotorreceptoras, conforme determinado pela tomografia de coerência óptica (OCT). Assim, em um aspecto, a divulgação fornece um método para tratar um sujeito humano que tem uma condição oftalmológica, tal como Amaurose Congênita de Leber, ou LCA, ou outra condição oftalmológica clinicamente definida, devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12). Mais particularmente, um aspecto da divulgação fornece um método para tratar um sujeito humano que tem uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12), em que o método compreende administrar a pelo menos um olho do sujeito um vetor viral adeno- associado que compreende um ácido nucleico, em que o ácido nucleico compreende DNA de RDH12 humana, por exemplo, cDNA de RDH12 humana e em que o DNA de RDH12 (por exemplo, DNA de RDH12 humana) codifica uma proteína que é pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% idêntica ao comprimento total da SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, a condição oftalmológica é Amaurose Congênita de Leber (LCA). Em algumas modalidades mencionadas acima, a condição oftalmológica é Amaurose Congênita de Leber (LCA). Em algumas modalidades, o DNA de RDH12, por exemplo, cDNA de RDH12, está sob o controle de expressão de um promotor de rodopsina quinase 1 humana (hGRK1), tal como em que o promotor de hGRK1 compreende ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o vetor viral adeno-associado é AAV-2, sorotipo-5 (AAV2/5) ou AAV-5. Em algumas modalidades, o DNA de RDH12, por exemplo, cDNA de RDH12, compreende uma sequência que é pelo menos 60% ou 70% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é administrado em um título de cerca de 2 x 1010 genomas virais por mililitro (vg/ml) a cerca de 2 x 10 12 vg/ml, por exemplo, um título de cerca de 2 x 1010 genomas virais por mililitro (vg/ml) a cerca de 2 x 1012 vg/ml, tal como cerca de 2 x 1011 vg/ml ou cerca de 2 x 1012 vg/ml. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é administrado no espaço sub- retiniano, por exemplo, em que uma cânula de microinjeção é inserida no espaço sub-retiniano.

[0007] Outro aspecto da divulgação é delineado para um ácido nucleico que codifica um DNA de RDH12 humana, por exemplo, um cDNA de RDH12 humana, em que o DNA de RDH12 (por exemplo, DNA de RDH12 humana, tal como cDNA) codifica uma proteína que é pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% idêntica ao comprimento total da SEQ ID NO: 2, em que o DNA de RDH12 está sob o controle de um promotor de rodopsina quinase 1 humana (hGRK1). Em algumas modalidades, o promotor de hGRK1 compreende ou consiste essencialmente em SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o DNA de RDH12 humana, por exemplo, cDNA de RDH12 humana, codifica uma proteína que compreende SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o DNA de RDH12 humana, por exemplo, cDNA de RDH12 humana, é pelo menos 60% ou 70% idêntico ao comprimento total da SEQ ID NO: 1.

[0008] Ainda outro aspecto da divulgação é um ácido nucleico conforme divulgado no presente documento para uso no tratamento de um sujeito humano que tem uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12). Em algumas modalidades, a condição oftalmológica é Amaurose Congênita de Leber (LCA).

[0009] Ainda outro aspecto da divulgação é um vetor viral que compreende um ácido nucleico que codifica RDH12, conforme divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor viral adeno-associado. Em algumas modalidades, o vetor viral adeno- associado é AAV-2, sorotipo-5 (AAV2/5) ou AAV-5.

[0010] Outro aspecto da divulgação é um vetor viral conforme divulgado no presente documento para uso no tratamento de um sujeito humano que tem uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12). Em algumas modalidades, a condição oftalmológica é Amaurose Congênita de Leber (LCA).

[0011] Outro aspecto da divulgação se refere a uma célula hospedeira isolada que compreende um vetor viral conforme divulgado no presente documento, ou um ácido nucleico conforme divulgado no presente documento. Em algumas modalidades, a célula hospedeira isolada expressa uma proteína RDH12 humana.

[0012] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado como comumente entendido por um indivíduo versado na técnica à qual esta invenção pertence. Métodos e materiais são descritos no presente documento para uso na presente invenção; outros métodos e materiais adequados conhecidos na técnica também podem ser usados. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes, sequências, entradas em bancos de dados e outras referências mencionadas no presente documento são incorporados a título de referência em sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá.

[0013] Outros recursos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e figuras a seguir e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0014] FIGURA 1. Atividade de RDH no ciclo visual e nas células fotorreceptoras. (A) O ciclo visual converte a vitamina A em 11-cis retinal, o cromóforo dos pigmentos visuais e recicla all-trans retinal liberado após o clareamento. (B) O fluxo retinoide mostrado para um par de células fotorreceptoras de RPE. A RDH8 no segmento externo pode reduzir all-trans retinal. A RDH12 no segmento interno pode reduzir all-trans retinal, 11-cis retinal, e outros aldeídos de cadeia curta tóxicos. Abreviações: 11cRAL, 11-cis retinal; 11cROL, 11-cis retinol; AtRAL, all-trans retinal; AtROL, all-trans retinol; RCHO, aldeído de cadeia curta; RCHOH, álcool de cadeia curta; Rh, rodopsina; MRh, metarrodopsina.

[0015] FIGURA 2. Expressão e localização de RDH12 recombinante em camundongos injetados com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. (A) Esquema do construto de terapia gênica com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 em que um cDNA de RDH12 humana é clonado a jusante de um promotor de rodopsina quinase humana, entre sequências repetidas terminais invertidas derivadas do genoma de AAV2. (B, C) Expressão da proteína RDH12 humana em retinas de camundongo 6 semanas após a injeção sub-retiniana de AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg) ou PBS, avaliada com o uso de anticorpos específicos para Rdh12 de camundongo ou RDH12 humana. (B) Análise Western de lisados da retina de camundongos C57BL/6J, camundongos Rdh12- /- injetados com PBS e camundongos Rdh12-/- injetados com AAV2/5- hGRK1p.hRDH12. (C) A análise imuno-histoquímica mostra a localização do camundongo nativo Rdh12 (cinza escuro) para o IS, ONL e OPL da retina em camundongos C57BL/6J, mas não em camundongos Rdh12-/-, enquanto a RDH12 humana recombinante (cinza claro) resultante de injeção de AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 mostra localização similar tanto à de camundongos C57BL/6J quanto de Rdh12-/-. Imagens de contraste de fase (esquerda). Abreviações: ITR, repetição terminal invertida; hGRK1, promotor de rodopsina quinase humana; SD/SA, local de doador de splice/aceitador de splice de vírus Símio 40; hRDH12, cDNA de RDH12 humana; poliA, sinal de poliadenilação de vírus Símio 40; RPE,

epitélio pigmentar da retina; OS, segmentos externos; IS, segmentos internos; ONL, camada nuclear externa; OPL, camada plexiforme externa; INL, camada nuclear interna; IPL, camada plexiforme interna; GCL, camada de células ganglionares.

[0016] FIGURA 3. A terapia de substituição gênica de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 restaura a função de RDH12 em camundongos com deficiência em Rdh12. (A) Análise por HPLC de atividade de retinal redutase em retinas de camundongos C57BL/6J e Rdh12-/- injetados com AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg) ou PBS, ou não injetados. 6 semanas após a injeção, quantificou-se a formação de all-trans retinol em ensaios com all-trans retinal como substrato. Cada ponto de dados representa a média ± erro padrão para um mínimo de 5 experimentos independentes em que retinas de 3 a 5 camundongos foram agrupadas e testadas em triplicado. C57BL/6J; Rdh12- /- ; Rdh12-/- injetados com PBS; Rdh12-/- injetados com AAV. (B) Imuno- histoquímica de expressão de RDH12 recombinante em uma seção de retina total de camundongo Rdh12 -/- avaliada 16 semanas após a injeção de AAV2/5- hGRK1p.hRDH12. A RDH12 humana (cinza claro) se localiza no IS, ONL e OPL da região injetada da retina (lado direito da imagem).

[0017] FIGURA 4. A terapia de substituição gênica de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 reduz os danos relacionados à luz em camundongos albinos com déficit de Rdh12. A análise ERG foi realizada, uma semana antes e uma semana após a exposição a 5.000 lux por 2 horas, em camundongos nos quais injetou-se AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 em um olho com e não foram injetados no olho contralateral. As respostas escotópicas (isoladas em bastonetes e bastonete-cone combinados) foram quantificadas para grupos de 10 a 13 camundongos, e a porcentagem da resposta de ERG inicial restante após dano leve foi calculada. São mostrados resultados médios com erros padrão, bem como a significância das diferenças entre os olhos injetados e os não injetados, calculados com o uso da análise de teste t pareada bicaudal.

[0018] FIGURA 5. O AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 não afeta significativamente os níveis no estado estacionário de 11-cis retinal na retina. Os camundongos receberam AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg) ou PBS por injeção sub-retiniana ou não foram injetados. Após a adaptação no escuro durante a noite, os retinoides foram extraídos sob luz vermelha escura e quantificados por análise por HPLC. (A) Cromatogramas representativos de cada condição de tratamento; são indicados picos para a oxima de syn-11-cis retinal, oxima de anti-11-cis retinal e oxima de syn-all-trans retinal. Níveis totais de retina (B) 11-cis retinal e (C) all-trans retinal para cada condição de tratamento ± erro padrão ( C57BL/6J não injetado; Rdh12-/- não injetado; Rdh12-/- injetado com AAV; Rdh12-/- injetado com PBS).

[0019] FIGURA 6. A função retiniana não é afetada adversamente por AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. Respostas de eletrorretinograma (ERG) escotópicas (isoladas em bastonetes e bastonete-cone combinados) e fotópicas (mediadas em cone) registradas 6 semanas após o tratamento de camundongos C57BL/6J, não injetado; Rdh12-/- não injetado; e Rdh12-/- injetados com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (até 2 x 109 vg). Os ERGs de um animal representativo em cada grupo de tratamento medidos em 6 semanas após a injeção são mostrados.

[0020] FIGURA 7. A localização de pigmento visual não é perturbada por AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. Localização imuno-histoquímica de rodopsina e opsina de cone em camundongos Rdh12-/- não injetados e injetados (1,3 x 109 vg) avaliados 16 semanas após o tratamento. Expressão de proteína RDH12 humana em IS e ONL (cinza claro). Rodopsina e opsina vermelha/verde (cinza escuro) nos olhos injetados com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. As abreviações são conforme descrito na Figura 2.

[0021] FIGURA 8. A estrutura retiniana não é danificada pela expressão a longo prazo de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12. Análise por tomografia de coerência óptica (OCT) dos olhos de camundongos C57BL/6J e

Rdh12/- avaliados 54 semanas após a injeção de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (até 2 x 109 vg).

[0022] FIGURA 9. Infiltração de macrófagos CD68+ e expressão de RDH12 em retinas injetadas com AAV2/8-hGRK1p.hRDH12. Camundongos Rdh12-/- e C57BL/6J avaliados por análise imuno-histoquímica 8 semanas após a injeção sub-retiniana de AAV2/8-hGRK1p.hRDH12 (2 x 109 vg). Expressão de RDH12 humana em marcações de IS, ONL e OPL (cinza claro) e CD68 de macrófagos (branco). As abreviações são conforme descrito na Figura

2.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0023] A degeneração hereditária da retina é uma causa rara de perda de visão profunda, que é o foco dos esforços atuais para desenvolver terapia genética alvejada. A terapia gênica somática mediada por vetor viral mostrou grande promessa no tratamento de modelos animais de doença degenerativa de retina humana. Até o momento, há uma série de estudos bem-sucedidos que usam a entrega de genes mediada por vírus adeno- associado (AAV) para resgatar a degeneração de fotorreceptores em modelos animais pequenos (Ali et al. 2000; Pang et al. 2012; Pawlyk et al. 2010; Pawlyk et al. 2005; Tan et al. 2009) e modelos animais grandes (Acland et al. 2001; Alexander et al. 2007; Beltran et al. 2012; Komaromy et al. 2010; Lheriteau et al. 2009). Nesses casos, o epitélio pigmentar da retina (RPE) ou fotorreceptores têm sido os principais alvos para a expressão de transgene. Além disso, ensaios clínicos de fase I que envolvem terapia gênica para pacientes com Amaurose Congênita de Leber (LCA) que alveja o RPE (Bainbridge et al. 2008; Cideciyan et al. 2008; Maguire et al. 2008) e, mais recentemente, coroideremia (Maclaren et al. 2014), já obtiveram algum sucesso. Atualmente, não há ensaios clínicos que usam terapia de substituição gênica mediada por AAV para o tratamento de pacientes com degeneração hereditária da retina causada por mutações em RDH12.

[0024] Com interesse no desenvolvimento de terapia gênica mediada por AAV para o tratamento de indivíduos com mutações em RDH12, gerou-se vetores de vírus adeno-associados que transportam cDNA de RDH12 humana em que a expressão está sob o controle de um promotor de rodopsina quinase. No estudo divulgado de vetores com capsídeos derivados de sorotipo 5 de AAV ou sorotipo 8 de AAV, mostrou-se que a entrega sub-retiniana de AAV2/5-hGRK1p.RDH12 em camundongos com deficiência em Rdh12 (Rdh12/-) resulta na expressão de RDH12 humana recombinante estável, corretamente localizada, reconstitui a atividade de retinal redutase, reduz a suscetibilidade a danos relacionados à luz e não causa a toxicidade da retina observada com AAV2/8-hGRK1p.hRDH12. Esse construto de AAV2/5- hGRK1p.RDH12 fornece um produto para terapia de substituição gênica de RDH12. RDH12

[0025] Mutações no gene que codifica a retinol desidrogenase 12 (RDH12) causam degeneração retiniana grave de início precoce, mais frequentemente diagnosticada como amaurose congênita de Leber (LCA) ou distrofia retiniana grave de início precoce (EOSRD). Membro da família de desidrogenases/redutases de cadeia curta, a RDH12 é essencial para reduzir os retinaldeídos que são gerados pela atividade do ciclo visual de vitamina A, que é essencial para a resposta luminosa das células fotorreceptoras. Quando os pigmentos visuais que contêm o cromóforo de 11- cis retinal absorvem um fóton de luz, 11-cis retinal é isomerizado em all-trans retinal, iniciando, assim, uma cascata de transdução de sinal que regula a sinalização sináptica. A inativação de pigmento visual envolve a liberação de all- trans retinal, sua redução para all-trans retina e o retorno ao epitélio pigmentar da retina (RPE) para regeneração do cromóforo de 11-cis retinal (Figura 1A). Quando essas reações de reciclagem são ineficientes ou interrompidas, por exemplo, pelo envelhecimento ou doença hereditária, os retinaldeídos e os produtos de condensação de retinaldeídos se acumulam nos fotorreceptores e no epitélio pigmentar da retina, resultando em danos profundos na retina externa (Ben-Shabat et al. 2001; Thompson et al. 2003; Sparrow, 2010; Chen et al. 2012).

[0026] Para proteger contra a toxicidade, uma série de proteínas e enzimas de ligação a retinoides são expressas na retina. RDH12 é um membro da família de desidrogenases/redutases de cadeia curta que utiliza NADPH para reduzir uma ampla gama de substratos, incluindo cis- e trans- retinaldeídos (Haeseleer et al. 2002), C9 aldeídos gerados como resultado da foto-oxidação lipídica (Belyaeva et al. 2005; Lee et al. 2008; Marchette et al. 2010) e substratos de esteroides (Keller et al. 2007). Indivíduos com mutações de perda de função no gene de RDH12 exibem um fenótipo severo de degeneração da retina frequentemente diagnosticado como amaurose congênita de Leber (LCA) (Janecke et al. 2004; Thompson et al. 2005; Perrault et al. 2004; den Hollander et al. 2008; Mackay et al. 2011), para o qual atualmente não há tratamentos ou curas. A RDH12 se localiza nos segmentos internos de células fotorreceptoras de bastonetes e cones (Haeseleer et al. 2002; Maeda et al. 2006) em que a mesma se protege contra danos induzidos pela luz causados, pelo menos em parte, por retinaldeídos reativos (Maeda et al. 2006). Demonstrou-se que all-trans retinal gerado após a exposição à luz vaza de segmentos externos de fotorreceptores para os segmentos internos, e sua eliminação eficaz de células fotorreceptoras requer a atividade tanto de RDH8 presente nos segmentos externos quanto de RDH12 presente nos segmentos internos (Chen et al. 2012) (Figura 1B). Sendo assim, a RDH12 também tem potencial para desempenhar um papel importante na redução de 11-cis retinal, além do necessário para a biossíntese de opsina, que pode entrar no segmento interno a partir do espaço sub-retiniano (Chen et al. 2012).

[0027] Para investigar o potencial de terapia de substituição gênica para LCA/EOSRD devido a mutações de RDH12, gerou-se vetores de vírus adeno-associados que transportam um cDNA de RDH12 humana, no qual a expressão está sob o controle de um promotor de rodopsina quinase que direciona a expressão específica de células fotorreceptoras (Khani et al. 2007; Sun et al. 2010; Young et al. 2003). O construto de DNA foi empacotado com um capsídeo derivado de sorotipo 8 de AAV que medeia a transdução eficiente e robusta de células fotorreceptoras (Allocca et al. 2007; Natkunarajah et al. 2008; Vandenberghe et al. 2011; Vandenberghe et al. 2013) ou com um capsídeo de sorotipo 5 de AAV que medeia a transdução de fotorreceptores, mas com cinética mais lenta e expressão menos robusta em comparação com o capsídeo de serotipo 8 de AAV (Yang et al. 2002; Lotery et al. 2003; Allocca et al. 2007; Lebherz et al. 2008).

[0028] Em estudos comparativos realizados em um modelo de camundongo com deficiência de Rdh12 (Rdh12-/-) (Kurth et al. 2007), o trabalho mostrou que os dois vetores têm perfis de segurança significativamente diferentes, em que AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 demonstra níveis de expressão inesperados e surpreendentemente eficazes e perfis de toxicidade compatíveis com o uso terapêutico para tratar distrofias de retina. SEQUÊNCIA DE RDH12 HUMANA

[0029] A sequência de um cDNA de RDH12 humana exemplificativo, que consiste em nucleotídeos -10 a +980 em relação ao local de início de tradução, que codifica todos os sete éxons de RDH12 traduzidos (GenBank nº NM_152443) é fornecida na SEQ ID NO: 1.

[0030] A sequência de proteína RDH12 humana completa é fornecida na SEQ ID NO: 2. PROMOTOR DE RODOPSINA QUINASE (HGRK1P)

[0031] Em algumas modalidades dos métodos descritos no presente documento, um construto de gene de substituição é usado no qual um cDNA de RDH12 humana, conforme descrito no presente documento, é colocado sob o controle de um promotor de rodopsina quinase humana (hGRK1). Em algumas modalidades, o promotor de hGRK1 tem aproximadamente 200 pares de base (bp) de comprimento, que contêm um pequeno promotor derivado do gene de hGRK1 de rodopsina quinase (RK), que demonstrou conduzir expressão específica de célula em bastonetes e cones (Khani et al. 2007; Sun et al. 2010; Young et al. 2003). Uma sequência de promotores de hGRK1 exemplificativa contém nucleotídeos -112 a +87 de SEQ ID NO: 3 (Khani et al. 2007).

VETOR DE ENTREGA VIRAL

[0032] O cDNA de RDH12 humana abreviado, conforme descrito acima, é empacotado em um vetor de entrega, por exemplo, um vetor de AAV5 ou AAV2/5.

[0033] Os genes de substituição (cDNA) podem ser administrados em qualquer carreador eficaz, por exemplo, qualquer formulação ou composição com capacidade para entregar de modo eficaz o gene componente às células in vivo. As abordagens incluem a inserção do gene em vetores virais não patogênicos e não replicantes, incluindo retrovírus recombinantes, adenovírus, vírus adeno-associado, lentivírus e vírus de herpes simplex do tipo 1 ou plasmídeos bacterianos ou eucarióticos recombinantes. Os vetores virais transfectam células diretamente; o DNA de plasmídeo pode ser entregue nu ou com a ajuda de, por exemplo, lipossomas catiônicos (lipofectamina) ou derivatizados (por exemplo, conjugado com anticorpo), conjugados de polilisina, gramacidina S, envelopes virais artificiais ou outros carreadores intracelulares, bem como injeção direta do construto de gene ou precipitação de Ca3(PO4)2 realizada in vivo.

[0034] Uma abordagem preferencial para a introdução in vivo de ácido nucleico em uma célula é pelo uso de um vetor viral que contém ácido nucleico, por exemplo, um cDNA. A infecção de células com um vetor viral tem a vantagem de que uma grande proporção das células alvejadas pode receber o ácido nucleico. Além disso, as moléculas codificadas no vetor viral, por exemplo, por um cDNA contido no vetor viral, são expressas de modo eficiente em células que absorveram o ácido nucleico de vetor viral. Os vetores de retrovírus e vetores derivados de adenovírus podem ser usados como um sistema de entrega de genes recombinantes para a transferência de genes exógenos in vivo, particularmente para seres humanos, em vários tipos de células. No entanto, os mesmos não realizam a transdução das células fotorreceptoras com eficiência suficiente para tornar as mesmas úteis para este pedido.

[0035] Ainda outro sistema de vetor viral útil para a entrega de ácidos nucleicos é o vírus adeno-associado (AAV). O vírus adeno- associado é um vírus defeituoso de ocorrência natural que requer outro vírus, tal como um adenovírus ou um vírus de herpes, como um vírus auxiliar para replicação eficiente e um ciclo de vida produtivo (Muzyczka et al. 1992). É também um dos poucos vírus que podem integrar seu DNA em células não divisíveis e exibe uma alta frequência de integração estável (consultar, por exemplo, Flotte et al. 1992; Samulski et al. 1989; e McLaughlin et al. 1988). Vetores que contêm apenas 300 pares de base de AAV podem ser empacotados e integrados. O espaço para o DNA exógeno é limitado a cerca de 4,5 kb. Um vetor de AAV como o descrito em Tratschin et al., 1985, pode ser usado para introduzir DNA nas células. Uma variedade de ácidos nucleicos foi introduzida em diferentes tipos de células com o uso de vetores de AAV (consultar, por exemplo, Hermonat et al. 1984; Tratschin et al. 1984a; Tratschin et al. 1984b; Wondisford et al. 1988; e Flotte et al. 1993).

[0036] Em modalidades preferenciais, o vetor de entrega viral é um vírus de AAV2/5 recombinante. Antes da administração, o produto final pode sofrer uma série de etapas de ultrapurificação para atender aos critérios de grau clínico.

SELEÇÃO DE SUJEITOS

[0037] Os sujeitos que são candidatos aos presentes métodos de tratamento incluem aqueles que têm um diagnóstico de LCA causado por mutações no gene que codifica RDH12. Os sujeitos que sofrem de outras condições oftalmológicas clinicamente definidas causadas por mutações no gene que codifica RDH12, por exemplo, retinite pigmentosa de início precoce, também podem ser tratadas com o uso dos métodos descritos no presente documento. Um diagnóstico de LCA ou outra condição oftalmológica causada por mutações no gene que codifica RDH12 pode ser feito com o uso de métodos conhecidos na técnica.

[0038] Os métodos descritos no presente documento podem incluir identificar um sujeito, por exemplo, uma criança, um adolescente ou um adulto jovem, que tenha LCA ou outra condição oftalmológica causada por uma ou mais mutações no gene que codifica RDH12, ou que esteja com suspeita de ter LCA ou outra condição oftalmológica causada por uma ou mais mutações no gene que codifica RDH12 (por exemplo, com base na presença de sintomas da condição e nenhuma outra causa óbvia), e obter uma amostra que compreende DNA genômico do sujeito, detectar a presença de mutações em RDH12 com o uso de métodos biológicos moleculares conhecidos e selecionar um paciente com mutações nos alelos de RDH12 que causam LCA ou outra condição. Os sintomas da condição incluem atrofia macular, afinamento foveal e rompimento de arquitetura laminar, resultando em perda precoce da visão central e progressão para a visão LP. Os campos visuais são restritos nos primeiros anos de vida medidos e as respostas ao ERG se tornam irrecuperáveis no início da idade adulta. A detecção de mutações em RDH12 pode incluir a sequenciação de todo ou parte do gene de RDH12 em um sujeito e a comparação da sequência com uma sequência de referência (por exemplo, Nº de Acesso ao GenBank NG_008321.1) para detectar uma mutação. Mutações de mudança de estrutura, mutações de truncamento, mutações que alteram um aminoácido conservado, mutações que afetam o splicing de transcrição ou mutações que afetam uma região reguladora (por exemplo, promotor) são consideradas mutações que podem causar LCA ou outra condição oftalmológica, conforme descrito no presente documento; uma alteração na função pode ser confirmada expressando-se o mutante in vitro (por exemplo, em células cultivadas) e analisando-se, por exemplo, a função enzimática. Mutações exemplificativas no estado homozigótico incluem: Glu127X, Gln189X, Tyr226Cys, Ala269GlyfsX1 e Leu274Pro (todas as referências de posição se referem à sequência de proteínas RDH12 de SEQ ID NO:2). Mutações exemplificativas no estado heterozigótico do composto incluem: Thr49Met/Arg62X; Arg65X/Ala269GlyfsX1; His151D/Thr155Ile; His151D/Arg269GlyfsX1 (Janecke et al. 2004; Schuster et al. 2007). (As posições se referem à sequência de proteínas de SEQ ID NO: 2).

[0039] Pacientes com LCA ou outra condição oftalmológica devido a pelo menos uma mutação de RDH12 que pode ser tratada com o uso de um método descrito no presente documento retêm, de preferência, alguns fotorreceptores e função visual, por exemplo, conforme medido pela função visual padrão ou testes de campo e/ou Tomografia de Coerência Óptica (OCT, por exemplo, Domínio Espectral-OCT (SD-OCT)). Os métodos descritos no presente documento podem incluir identificar sujeitos que foram diagnosticados com LCA ou outra condição oftalmológica devido a pelo menos uma mutação de RDH12, que têm pelo menos uma mutação confirmada em RDH12 que causa sua condição, e testar sua capacidade visual e detectar a presença de fotorreceptores centrais residuais.

EXEMPLOS

[0040] A matéria divulgada e reivindicada é adicionalmente descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrita nas reivindicações.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0041] Os materiais e métodos a seguir foram usados nos experimentos divulgados nos Exemplos apresentados abaixo.

ANIMAIS

[0042] A geração e a análise de camundongos Rdh12-/- foram descritas anteriormente (Kurth et al. 2007). Os camundongos Rdh12-/- usados neste estudo foram criados a partir de acasalamento entre machos e fêmeas nulízigos mantidos em nossas instalações institucionais para animais. Os camundongos do tipo selvagem usados no estudo foram C57BL/6 de The Jackson Laboratory (Wilmington, MA).

[0043] Camundongos transgênicos dos seguintes genótipos foram usados para os estudos divulgados no presente documento: camundongos Rdh12 -/- em homozigotos de fundo de C57BL/6J para a variante Rpe65-Met450 (M/M) (Kurth, 2007) e camundongos albinos Rdh12-/- em homozigotos de fundo de BALB/c para a variante Rpe65-Leu450 (L/L) (Chrispell, 2009), que foram obtidos por meio de reprodução. Os camundongos foram criados em um ciclo de 12 horas (no claro)/12 horas (no escuro) e foram sacrificados por inalação de CO2 seguida por pneumotórax bilateral.

CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEO E PRODUÇÃO DE AAV2/5 E AAV2/8 RECOMBINANTES

[0044] O cDNA de RDH12 humano foi amplificado a partir de cDNA de retina humana por PCR, com o uso de iniciadores projetados para abranger toda a região de codificação de RDH12, clonados e sequenciados para verificar a fidelidade, conforme descrito anteriormente (Janecke et al. 2004). Para construir os vetores de AAV, os cDNAs de RDH12 foram inseridos no local de clonagem múltipla do vetor de pAAV-hGRK1-hrGFP parental. O vetor de pAAV-hGRK1-Rdh12 resultante foi empacotado em AAV. Os vetores pseudotipados de AAV2/5 e AAV2/8 foram gerados por meio de transfecção bipartida: (1) plasmídeo de vetor de AAV que codifica o gene de interesse, (2) plasmídeo auxiliar de AAV que codifica proteínas Rep de AAV de sorotipo 2 e proteínas Cap de sorotipo 5 ou sorotipo 8, e o auxiliar de adenovírus funciona em células 293T. A transfecção e a purificação foram realizadas com o uso de um protocolo publicado (Nishiguchi et al. 2015). Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas por ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Após a eliminação inicial de resíduos celulares, o componente de ácido nucleico das células produtoras de vírus foi removido por tratamento com Benzonase. As partículas de vetor de AAV recombinante foram purificadas por cromatografia de afinidade com o uso de uma matriz de AVB, lavadas em 1x PBS e concentradas até um volume de 100 a 150 ml com o uso de concentradores de Vivaspin 4 (10 kDa). Os vetores foram titulados por amplificação de qPCR.

INJEÇÕES SUB-RETINIANAS

[0045] Coortes de camundongos com aproximadamente 4 semanas de idade foram colocadas sob anestesia geral com uma injeção intraperitoneal de cetamina (90 mg/kg)/xilazina (9 mg/kg). Uma solução de proparacaína a 0,5% foi aplicada à córnea como anestésico tópico. As pupilas foram dilatadas com aplicação tópica de tropicamida (0,5%). Sob um microscópio cirúrgico oftalmológico, uma pequena incisão foi feita através da córnea adjacente ao limbo com o uso de uma agulha de calibre 30. Uma agulha romba de calibre 34 encaixada em uma seringa de Hamilton foi inserida através da incisão atrás da lente e empurrada através da retina. Todas as injeções foram feitas por via sub-retiniana em um local dentro do quadrante nasal da retina. Cada olho recebeu até 2 x 109 vg de AAV2/5-(hGRK1)-hRDH12 em um volume de até 2 μl. O vetor de codificação de RDH12 foi administrado separadamente a um olho de cada camundongo que recebeu tratamento, e os olhos contralaterais não foram injetados. O exame de fundo do olho após a injeção constatou mais de 30% da retina descolou na maioria dos casos, confirmando a entrega sub- retiniana bem-sucedida.

ANTICORPOS

[0046] Os anticorpos primários utilizados foram: um anticorpo policlonal de coelho anti-Rdh12 (CSP) específico para a proteína de camundongo (contra 252SPFFKSTSQGAQ263, SEQ ID NO: 4) e um anticorpo monoclonal de camundongo anti-RDH12 (2C9) específico para a proteína humana (contra C-284DCKRTWVSPRARNNKT299; SEQ ID NO: 5) (Kurth et al. 2007); um anticorpo monoclonal anti-RHO de camundongo (1D4) (MacKenzie et al. 1984); um anticorpo policlonal anti-RHO de coelho gerado contra a proteína desnaturada; e um anticorpo policlonal de opsina de cone antivermelho/verde de coelho (Millipore cat nº AB5405).

ANÁLISE POR IMUNOTRANSFERÊNCIA

[0047] As proteínas nos homogenatos da retina foram separadas por SDS-PAGE, transferidas para membranas de nitrocelulose que foram, então, bloqueadas, incubadas com anticorpo primário durante a noite, lavadas, incubadas com anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina e desenvolvidas com o uso de 5-bromo-4-cloro-3’-indolilfosfato p-toluidina e cloreto de nitro-azul tetrazólio.

HISTOLOGIA E IMUNOFLUORESCÊNCIA

[0048] Os camundongos foram sacrificados, os olhos marcados para orientação e, então, enucleados. Para as criosseções, a lente e os segmentos anteriores foram removidos, olhos fixados brevemente com paraformaldeído a 4%, lavados com PBS, transferidos para sacarose/OCT, congelados rapidamente e seccionados com uma espessura de 10 µm. Para a preparação de substituição por congelamento, os olhos inteiros foram congelados rapidamente em isopentano resfriado com gelo seco por 30 segundos e, então, transferidos para metanol resfriado com gelo seco contendo ácido acético glacial a 3%. Os olhos foram incubados a 80 °C por 48 horas, depois durante a noite a -20 °C, embebidos em parafina e seccionados a uma espessura de 6 µm. As seções de parafina foram desparafinadas e os antígenos recuperados por incubação em EDTA a 1 mM, Tween 20 a 0,05%, pH a 8,0, a 90 °C durante 30 minutos antes da rotulagem imunológica, conforme a seguir. Em suma, os cortes transversais de retina foram lavados com PBS e permeabilizados com PBS-T (Triton X-100 a 0,3%); bloqueados com albumina sérica bovina a 1%, soro de cabra normal a 10% e Triton X-100 a 0,3%; e incubados com anticorpos primários durante a noite a 4 °C, lavados e depois incubados com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo por 1 hora à temperatura ambiente. As seções foram descobertas com o uso de um suporte de gel ProLong Gold que contém 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Invitrogen) e fotografadas com o uso de um microscópio de fluorescência Leica DM6000.

REGISTRO DE ERG

[0049] Os ERGs foram realizados conforme descrito anteriormente (Thompson, 2012) com o uso do sistema de registro Espion e2 (Diagnosys, Lowell, MA). Resumidamente, os ratos foram adaptados no escuro durante a noite e anestesiados com uma injeção intraperitoneal de Cetamina (93 mg/kg) e Xilazina (8 mg/kg). As pupilas foram dilatadas com tropicamida tópica (a 0,5%). A temperatura corporal foi mantida a 37 °C com uma almofada de aquecimento. Os ERGs da córnea foram registrados em ambos os olhos, com o uso de alças de fio de ouro com anestesia tópica de tetracaína a 0,5% e uma queda de metilcelulose a 2% para hidratação da córnea. Uma alça de fio de ouro colocada na boca foi usada como referência, e um eletrodo de aterramento estava na cauda. O protocolo de ERG consiste no registro de respostas adaptadas ao escuro (escotópicas) a breves flashes brancos (-2,31 log cd.sm–2 para ondas B isoladas em bastonetes; 1,09 log cd.sm–2 para ondas A e B de bastonentes-cones combinados). Os ERGs (fotópicos) adaptados à luz foram registrados após 10 minutos de adaptação a um fundo branco de supressão de bastonetes de 32 cd.m–2 em resposta a flashes de intensidade de 1,09 log cd.sm– 2 (para ondas B isoladas em cone). As respostas foram amplificadas com ganho de 1.000 a 1,25 a 1.000 Hz e digitalizadas a uma taxa de 2.000 Hz. Um filtro de entalhe foi usado para remover o ruído de linha de 60 Hz. As respostas foram calculadas em média por computador e registradas em intervalos de 3 a 60 segundos, dependendo da intensidade de estímulo. Para análise estatística, testes t pareados foram usados para determinar se as amplitudes de ERG nos olhos tratados eram significativamente diferentes dos olhos não tratados.

ANÁLISE DE DANO INDUZIDO POR LUZ

[0050] Camundongos Rdh12-/- albinos foram injetados em um olho com AV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg), ou com um volume igual de PBS, e olhos contralaterais não foram injetados. 6 semanas após a injeção, a análise por ERG foi realizada e as respostas escotópicas foram quantificadas, conforme descrito acima. Uma semana depois, os camundongos foram adaptados no escuro durante a noite, suas pupilas foram dilatadas com tropicamida (a 0,5%) e depois colocadas em uma caixa de luz em bandejas transparentes individuais. Os camundongos foram expostos a 5.000 lux por 2 horas e depois retornaram ao compartimento do viveiro (12 horas no escuro/12 horas na luminosidade (<20 lux)) por 7 dias, após o que a análise por ERG foi repetida. A porcentagem de resposta de ERG original restante após danos leves foi calculada para cada olho e as médias plotadas com erros padrão mostrados. Testes t pareados bicaudais foram usados para determinar se as amplitudes de ERG nos olhos tratados eram significativamente diferentes das de olhos não tratados.

TOMOGRAFIA POR COERÊNCIA ÓPTICA

[0051] Os camundongos foram anestesiados e as pupilas dilatadas com tropicamida a 0,5%. Um sistema de tomografia de coerência óptica de domínio espectral (OCT) (sistema Bioptigen Envisu R2200 SD-OCT (Durham, NC, EUA)), com um tamanho de análise de volume de 1,4 x 1,4 mm, foi centralizado na parte principal do nervo óptico. Gotas lubrificantes de Systane (Alcon) foram usadas durante todo o processo de geração de imagens.

ANÁLISE DE TEOR DE RETINOIDE

[0052] All-trans retinal e 11-cis retinal nos olhos de camundongo foram extraídos com o uso de uma modificação de um método descrito anteriormente (Bligh and Dyer, 1959). Camundongos pós-injeção de seis semanas foram adaptados no escuro durante a noite, depois sob luz vermelha escura, sacrificados por overdose de CO2 e os olhos enucleados e congelados em N2 líquido. Sob luz vermelha fraca e gelo, cada olho foi homogeneizado em 1 ml de clorofórmio: metanol: hidroxilamina (a 2 M) (3:6:1) e incubado à temperatura ambiente por 2 minutos. Em seguida, foram adicionados 200 μl de clorofórmio e 240 μl de água, e cada amostra foi submetida a vórtex e centrifugada a 14.000 rpm por 5 minutos. A fase inferior foi coletada, o solvente foi evaporado sob nitrogênio e a amostra foi dissolvida em hexano. Os retinoides nos extratos foram identificados e quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com o uso de um módulo de separação Waters Alliance e um detector de arranjo de fotodiodos com uma coluna Supelcosil LC-31 (de 25 cm por 4,6 mm por 3 μm) desenvolvida com 1,4-dioxano a 5% em hexano. A identificação de pico foi realizada por comparação com os tempos de retenção de compostos padrão e avaliação de comprimentos de onda máximos. A análise quantitativa foi feita pela comparação de áreas dos picos a 347 e 351 nm para oxima syn- e anti-11-cis retinal, respectivamente, e a 357 e 361 nm para oxima syn- e anti-all-trans retinal, respectivamente (Kurth et al. 2007).

ENSAIO DE ATIVIDADE DE REDUTASE DE RETINA

[0053] Os homogenatos de retina de camundongo foram analisados quanto à atividade de redutase de retina 6 semanas após a injeção. Os camundongos adaptados à luz foram sacrificados e cada retina foi homogeneizada individualmente em 125 μl de sacarose a 0,25 M, Tris-acetato a 25 mM, pH 7, ditiotreitol a 1 mM. Os homogenatos foram centrifugados a 1.000 × g por 5 minutos para remover células intactas e, em seguida, os sobrenadantes foram sonicados com uma sonda de microponta (30 vezes por 1 segundo cada) em gelo. As concentrações de proteína foram determinadas por uma modificação do procedimento de Lowry (Peterson et al. 1977), e os níveis de RDH12 foram avaliados por Western blot. Amostras similares foram agrupadas e 20 µg de cada lisado agrupado foram analisados (em triplicado) em tampão que contém all- trans retinal e NADPH a 200 μM em tampão HEPES (pH 8); as reações foram incubadas por 0 a 45 minutos em banho-maria a 37 °C (uma temperatura de reação que minimizou a isomerização térmica dos substratos de retinoide, bem como a inativação enzimática). A formação de all-trans retinol foi quantificada com o uso de análise de HPLC em fase normal com comparação com padrões conhecidos (Chrispell et al. 2009). EXEMPLO 1 EXPRESSÃO MEDIADA POR AAV DE RDH12 HUMANA

[0054] Uma variedade de vetores para a terapia de substituição de RDH12 foi desenvolvida e testada. O construto ideal de vetor de RDH12 é mostrado na Figura 2A. O mesmo compreende o cDNA de RDH12 humana sob controle de um fragmento de promotor de Rodopsina Quinase humana (GRK1). O construto é empacotado em um sorotipo de AAV2/5. O capsídeo de sorotipo 5 de AAV demonstrou mediar a transdução de fotorreceptores, mas com cinética mais lenta e expressão menos robusta em comparação com o capsídeo de AAV8 (Yang et al. 2002; Lotery et al. 2003; Allocca et al. 2007; Lebherz et al. 2008). A expressão da proteína RDH12 humana em retinas de camundongo 6 semanas após a injeção sub-retiniana de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg) foi avaliada com o uso de anticorpos específicos para as proteínas Rdh12 de camundongo ou RDH12 humana. Os níveis fornecidos por vetores de RDH12 humana parecem ser aproximadamente comparáveis à quantidade de Rdh12 de camundongo (Figura 2B). A imagem de imunofluorescência indireta nas seções de retina foi usada para avaliar Rdh12 de camundongo nativo e RDH12 humana recombinante, com o uso de anticorpos específicos da espécie. A localização de RDH12 endógena e recombinante parece ser idêntica, indicando que a proteína está sendo processada normalmente (Figura 2C).

[0055] A capacidade de retinas de camundongos Rdh12-/- para reduzir retinaldeídos exógenos é significativamente reduzida em comparação com de camundongos do tipo selvagem (Chrispell et al. 2009). Seis semanas após a injeção sub-retiniana de 1,3 x 109 vg de AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 em camundongos Rdh12-/-, homogenatos de retina foram analisados quanto à atividade de redutase de retina in vitro. A formação de retinol all-trans foi quantificada com o uso de análise por HPLC em fase normal. Cada ponto de dados representa a média ± erro padrão para um mínimo de 5 experimentos independentes em que retinas de 3 a 5 camundongos foram agrupadas e testadas em triplicado. As taxas iniciais de formação de all-trans retinol em retinas de camundongos Rdh12-/- e C57BL/6J não injetados foram de 0,013 pmol por minuto-1 µg de proteína-1 e 0,071 pmol por minuto-1 µg de proteína-1, respectivamente (Figura 3A). A atividade residual presente nos camundongos Rdh12-/- reflete a presença de outras isoformas de RDH que têm a capacidade de reduzir all-trans retinal (Rattner et al. 2000; Haeseleer et al. 2002). Em camundongos Rdh12-/- injetados com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12, a taxa de formação de all-trans retinol de 0,046 pmol por minuto-1 por µg de proteína-1 foi significativamente maior do que para camundongos Rdh12-/- injetados com PBS (0,016 pmol por minuto-1 por µg de proteína-1). A recuperação de atividade de redutase de retina (cerca de 50%) é consistente com a transdução parcial da retina (cerca de 30%) e indicou que o vetor restaurava os níveis normais de atividade em fotorreceptores transduzidos. O transgene foi expresso por mais de 12 meses (período mais longo examinado). A marcação por imunofluorescência mostrou a extensão de transdução de retina e expressão recombinante de RDH12 em um camundongo Rdh12-/- avaliado 16 semanas após a injeção, cobrindo aproximadamente um terço da superfície da retina (Figura 3B).

[0056] O efeito de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 sobre a suscetibilidade a danos induzidos por luz foi avaliado em camundongos Rdh12- /- albinos que foram injetados em um olho com 1,3 x 10 9 vg ou um volume igual de PBS e não receberam tratamento no olho contralateral. A análise por ERG de atividade escotópica de retina (isolada por bastonete e bastonete-cone combinados) foi realizada 1 semana antes e 1 semana depois, submetendo-se os camundongos a níveis de luz que causam danos significativos na retina em animais albinos (5.000 lux por 2 horas). A porcentagem de atividade retiniana remanescente nos olhos tratados com vetor foi significativamente maior do que a remanescente nos olhos não tratados (p ≤ 0,0168) (Figura 4). Em contrapartida, em animais de controle injetados com PBS, a porcentagem de atividade escotópica de retina remanescente nos olhos não injetados não foi significativamente maior do que a dos olhos não tratados (p ≥ 0,2255). Essas constatações são consistentes com a proteção mediada por AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 contra o aumento de suscetibilidade a danos induzidos por luz associados à deficiência de RDH12.

[0057] A toxicidade do vetor foi avaliada através do efeito direto de atividade de RDH12 humana sobre o metabolismo de retinoide e dos efeitos indiretos sobre a estrutura e função de retina, conforme descrito na passagem a seguir.

[0058] A ampla especificidade de substrato de RDH12, que permite a redução tanto de 11-cis retinal quanto de all-trans retinal criou o potencial de superexpressão ou localização incorreta de proteína recombinante, afetando negativamente a função de ciclo visual. A análise por HPLC de teor de retinoide foi usada para avaliar a atividade de ciclo visual em olhos de camundongos Rdh12-/- injetados com AAV2/5-hGRK1p.hRDH12, ou com PBS, ou com controles de C57BL/6J não injetados. A análise de retinoides 6 semanas após a injeção sub-retiniana de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg) em camundongos Rdh12-/- mostrou que a expressão de hRDH12 não afetou significativamente os níveis retinais de 11-cis no estado estacionário da retina (Figura 5A). Um cromatograma representativo mostra vários controles com tempos de eluição para vários retinoides indicados. Os níveis retinianos totais de 11-cis retinal e all-trans retinal representam valores médios ± erro padrão para um mínimo de 5 experimentos independentes (Figuras 5B, C). As respostas de ERG de atividade retiniana foram medidas em camundongos C57BL/6J e Rdh12- /- que receberam 1,3 x 109 vg de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 e foram mantidos em alojamento de viveiro (12 horas de no escuro/12 horas na luminosidade (< 20 lux)). ERGs escotópicos (isolados em bastonete -2,3 log cd.sm–2), de bastonete- cone combinados (estímulo de 1,09 log cd.sm –2) e fotópicos (respostas mediadas por cone, respostas de 1,09 log cd.sm–2) de um animal representativo em cada grupo de tratamento medido 6 semanas após a injeção não mostrou efeito significativo de expressão de RDH12 humana sobre a função da retina (Figura 6).

[0059] A má localização de rodopsina e cone opsina é um indicador bem-caracterizado de viabilidade celular diminuída de fotorreceptores (Adamian et al. 2006; Turney et al. 2007; Brunner et al. 2010; Lopes et al. 2010). A localização imuno-histoquímica de rodopsina e opsina vermelha/verde foi avaliada em camundongos Rdh12-/- que não foram injetados ou foram injetados com AAV2/5- hGRK1p.hRDH12 (1,3 x 109 vg). Em camundongos que exibem expressão robusta de transgene, não foram observados decréscimos nos níveis de expressão de opsina ou evidência de localização incorreta de opsina de bastonete e cone 16 semanas após o tratamento; a estrutura retiniana permaneceu intacta 54 semanas após a injeção (Figura 7).

[0060] A análise por tomografia de coerência óptica (OCT) de camundongos C57BL/6J e Rdh12-/- avaliados 54 semanas após a injeção de AAV2/5-hGRK1p.hRDH12 (2 x 109 vg) não mostrou alterações brutas em laminação retiniana em uma área ampla incluindo os dois lados do nervo óptico. A estrutura retiniana ficou estável por pelo menos um ano após a injeção quando comparada aos olhos contralaterais não injetados (Figura 8). EXEMPLO 2. DANOS NA RETINA CAUSADOS POR AAV2/8

DANOS NA RETINA EM CAMUNDONGOS INJETADOS COM AAV2/8-HGRK1P.HRDH12.

[0061] Demonstrou-se que um capsídeo derivado de sorotipo 8 de AAV medeia a transdução eficiente e robusta de células fotorreceptoras (Allocca et al. 2007; Natkunarajah et al. 2008; Vandenberghe et al. 2011; Vandenberghe et al. 2013). Os estudos iniciais foram realizados com um sorotipo de AAV2/8 que contém o construto de vetor descrito acima. Os camundongos Rdh12-/- tratados por injeção sub-retiniana de AAV2/8- hGRK1p.hRDH12 em doses de 108 a 109 genomas virais (vg) resultaram em expressão robusta de proteína RDH12 humana recombinante. No entanto, os olhos injetados desenvolveram danos significativos na retina a partir de 3 semanas após a injeção e, em quase todos os casos, 6 semanas após a injeção. A infiltração de macrófagos foi observada na maioria dos casos pela presença de células CD68+ (Figura 9). O dano retiniano não foi mitigado pela administração sistêmica de ciclosporina (Borel et al. 1976) em camundongos Rdh12-/- continuamente desde o momento do desmame até o momento do sacrifício, indicando que as respostas imunes contra o vetor ou o transgene não foram a causa do dano. Essa visão é consistente com os resultados obtidos em camundongos C57BL/6J do tipo selvagem injetados com construtos que codificam RDH12 humana (AAV2/8-hGRK1p.hRDH12) ou Rdh12 de camundongo (AAV2/8-hGRK1p.mRdh12), em que afinamento significativo da retina e a infiltração de macrófagos também ocorreram 6 semanas após a injeção.

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[0062] Cada uma das referências citadas no presente documento é incorporada a título de referência em sua totalidade ou em parte relevante, conforme ficará evidente a partir do contexto da citação.

[0063] Deve ser entendido que, embora a matéria reivindicada tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição acima mencionada visa ilustrar e não limitar o escopo dessa matéria reivindicada, que é definida pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para tratar um sujeito humano que tenha uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12), em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende administrar a pelo menos um olho do sujeito um vetor viral associado ao adeno que compreende um ácido nucleico, em que o ácido nucleico compreende o DNA de RDH12 humano e em que o DNA de RDH12 humano codifica uma proteína que é pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% idêntica ao comprimento total da SEQ ID NO: 2.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a condição oftalmológica é a Amaurose Congênita de Leber (LCA).

3. Método, de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA de RDH12 está sob o controle de expressão de um promotor de rodopsina quinase humana 1 (hGRK1).

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o promotor hGRK1 compreende a SEQ ID NO: 3.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor viral associado ao adeno é AAV-2, sorotipo-5 (AAV2/5) ou AAV-5.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o DNA de RDH12 compreende uma sequência que é pelo menos 60% ou 70% idêntica à SEQ ID NO: 1.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende administrar o ácido nucleico a um título de cerca de 2 x 1010 genomas virais por mililitro (vg/ml) a um título de cerca de 2 x 1012 vg/ml.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é administrado no espaço sub-retinal.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que uma cânula de microinjeção é inserida no espaço sub-retinal.

10. Ácido nucleico caracterizado pelo fato de que codifica um DNA de RDH12 humano, em que o DNA de RDH12 humano codifica uma proteína que é pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% idêntica ao comprimento total da SEQ ID NO: 2, em que o DNA de RDH12 está sob o controle de um promotor de rodopsina quinase humana 1 (hGRK1).

11. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o promotor de hGRK1 compreende a SEQ ID NO:

3.

12. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o DNA de RDH12 humano codifica uma proteína que compreende a SEQ ID NO: 2.

13. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o DNA de RDH12 humano é pelo menos 60% ou 70% idêntico ao comprimento total da SEQ ID NO: 1.

14. Ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um sujeito humano que tem uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12).

15. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a condição oftalmológica é a Amaurose Congênita de Leber (LCA).

16. Vetor viral caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15.

17. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é um vetor viral associado ao adeno.

18. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o vetor viral associado ao adeno é AAV-2, sorotipo-5 (AAV2/5) ou AAV-5.

19. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de um sujeito humano que tenha uma condição oftalmológica devido a uma ou mais mutações de perda de função no gene que codifica a proteína Retinol Desidrogenase 12 (RDH12).

20. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a condição oftalmológica é a Amaurose Congênita de Leber (LCA).

21. Célula hospedeira isolada caracterizada pelo fato de que compreende o vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, ou o ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15.

22. Célula hospedeira isolada, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a célula expressa uma proteína RDH12 humana.