TWI354676B - - Google Patents

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TWI354676B
TWI354676B TW093130368A TW93130368A TWI354676B TW I354676 B TWI354676 B TW I354676B TW 093130368 A TW093130368 A TW 093130368A TW 93130368 A TW93130368 A TW 93130368A TW I354676 B TWI354676 B TW I354676B
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Kunihiro Hattori
Tetsuo Kojima
Taro Miyazaki
Tetsuhiro Soeda
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Description

1354676 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於替代增強酵素反應之輔因子作用之雙專 一性抗體以及含有該抗體為有效成分之醫藥組合物。 【先前技術】 體因於血液中之安定性高且抗原性低，是被看重的醫 藥品。其中有一種雙專一性抗體，可同時辨識二種類抗原。 雙專一性抗體已被倡導很久了。但到目前為止，僅有以再 • 導向（retargeting)NK細胞、巨噬細胞、τ細胞為目的等之 單純連結一種類抗原之抗體有被報告（參見非專利文獻 7 )。例如，已進行臨床試驗之MDX-21 0只不過是將表現 FcyRI之單核球等再導向至表現HER-2/neu之癌細胞的雙 專一性抗體而已。因此，到目前為止，尚無將雙專一性抗 體利用於替代增強酵素反應之輔因子的例子。 輔因子例如有組織因子（TF )、第V凝血因子（F. V )、 活化第V凝血因子（F. Va )、第VIII凝血因子（F. VIII )、 籲 活化第VIII凝血因子（F. Villa )、凝血酶調節素（TM )、 蛋白質S(PS)、蛋白質Z(PZ)、肝素、補體C4b、補體調 節蛋白質 Η 因子（Complement Regulatory Factor H)、膜輔 因子蛋白質（Membrane Cofactor Protein) ( MCP )、補體受 體 l(Complement Receptor 1) ( CR1 )等。 該等中，F.VIII/F.VIIIa為充分表現第IX凝血因子（F.IXa) 活性所必須之辅因子。Scheiflinger F等人發現某種抗 F.IX/F.IXa抗體在呈色試驗中，F.IXa具有促進第X凝血因子 2125-6598-PF 5 1354676 • (F.X)活性的作用（參見專利文獻1)。但是，於欠缺？ vm 血漿之凝固回復能力測定中’該抗體單獨並不能顯示凝固 回復能力，而僅於添加外來F.IXa的狀態下顯示凝固回復能 力。 已知F_Villa不僅與F.IXa有交互作用，且與F.X亦有交 互作用。（參見非專利文獻5及6 )。基於此點，推測 Scheiflinger F等人的抗體並不能說可充分取代 F.VIII/F.VIIIa之機能，其活性不足夠。 φ 本發明人等經過努力研究的結果，成功地製作了可替 代增強酵素活性之輔因子作用的雙專一性抗體，並完成本 發明。 【專利文獻1】國際公開第01/19992號 【專利文獻2】美國專利第4,474,893號公報 【專利文獻3】EP404,097號 【專利文獻4】國際公開第93/11161號 【專利文獻5】特願2002-112369號公報 • 【專利文獻6】特願2003-012648號公報 【專利文獻7】特開平5-304992號公報 【專利文獻8】特開平2-145 1 87號公報 【專利文獻9】特開平5-2 1 3 775號公報 【專利文獻1〇】特開平1〇_165184號公報 【專利文獻11】特開平^-7^88號公報 【專利文獻12】特表2002-5 18041號公報 【專利文獻13】特表平丨ι·5〇631〇號公報 2125-6598-PF 6 1354676 【專利文獻14】特開平5_丨99894號公報 【專利文獻15】特表平10_5 1 1085號公報 【專利文獻16】特開平5-184383號公報 【非專利文獻1】Nilsson IM等人著、「J. Intern.
Med.」、1992年、Vol.235、p.25-32 【非專利文獻2】Lofqvist T等人著、「J. Intern. Med.」、 1997年、v〇l.241、p.3 95-400 (上述「Lofqvist T」中之「〇」 為含點者） 【非專利文獻3】第24次曰本血栓止血學會學術集會學 術專門部會血友病標準化檢討部會小會、2〇〇 1年、 【非專利文獻4】Medical Bulletin #193 1994 【非專利文獻5】Mertens K等人著、「Thromb.
Haemost·」、1999年、Vol.82、ρ·209-217 【非專利文獻6】Lapan KA 等人著、「Thromb. Haemost,」、1998年、Vol.80、p.41 8-422 【非專利文獻7】Segal DM等人著、「Journal of
Immunological Methods」、2001 年、Vol.248、ρ.1-6 【非專利文獻8】Bos R及Nieuwenhuitzen W著、 「Hybridoma」、1 992年、Vol. 11、No· 1、p.41-5 1 【非專利文獻9】Brennan M等人著、「Science」、1985 年、Vol.229、No.1708、ρ·81-3 【非專利文獻10】Karpovsky B 等人著、「J. Exp. Med·」、1984年、Vol.160、Νο·6、p.1686-701 【非專利文獻11】Suresh MR 等人著、「Methods 2125-6598-PF 7 1354676
Enzymol·」、1 986 年、Vol. 1 2 1、ρ· 2 1 0-28 【非專利文獻12】Massimo YS等人著、「J_ Immunol. Methods」、1997年、Vol_20 1、p.57-66 【非專利文獻13】Brennan M等人著、「Science」、1985 年、Vol.229、p. 81 【非專利文獻14】Shalaby MR等人著、「J. Exp.
Med.」、1992年、Vol.175、p.217-25 【非專利文獻15】Holliner P等人著、「Proc. Natl. Acad. • Sci_ USA」、1993 年、Vol.90、p. 6444-8 # 【非專利文獻16】Ridgway JB 等人著、「Protein Eng·」、1996年、Vol.9、p. 617-21 【非專利文獻17】Hammerling U等人著、「J. Exp.
Med·」、1968年、Vol.128、p.1461-73 【非專利文獻18】Kurokawa T 等人著、 「Bio/Technology」、1989年、Vol.7、 p.1163 【非專利文獻19】Link BK等人著、「Blood」、1993 # 年、Vol.81、p.3343 籲 【非專利文獻20】NittaT等人著、「Lancet」、1990年、
Vol.335、p.368-71 【非專利文獻21】deLeij L等人著、「Foundation Nationale de Transfusion Sanguine, Les Ulis France」、1990 年、p.249-53 【非專利文獻22】Le Doussal JM等人著、「J, Nucl.
Med.」、1993年、Vol_34、p. 1662-71 2125-6598-PF 8 1354676 【非專利文獻23】Stickney DR等人著、「Cancer Res.」' 1991 年、Vol.51、p.6650-5 【非專利文獻24】Weiner LM等人著、「Cancer Res.」、 1993年、v〇l.53、ρ.94·100 【非專利文獻25】Kroesen BJ等人著、「Br. J. Cancer」、 1994年、v〇l.70、p.652-61 【非專利文獻26】Weiner GJ等人著、「j. Immunol.」、 1994年、Vol.152、p.2385 φ 【非專利文獻27】Suresh MR等人著、「proc. Natl. Acad.
Sci. USA」、1986年、Vol.83、p.7989-93 【非專利文獻28】Milstein C及 Cuello AC著、 「Nature」、1983 年、V〇1_305、p_537 【非專利文獻29】Xian gj等人著、「m〇1. Immunol.」、 1990年、Vol.27、p.809 【非專利文獻30】Bebbington CR 等人著、 「Bio/Technology」、1992年、Vol. 1 〇、p i 69 ® 【非專利文獻31】HuseWD等人著、「Science」、1989 年、Vol. 246、ρ.1275 【非專利文獻32】McCafferty J等人著、「Nature」、 1990年、v〇1.348、p_552 【非專利文獻33】Kang AS等人著、「proc. Natl. Acad.
Sci. USA」、1991 年、Vol.88、p. 4363 【發明内容】 (發明欲解決之課題） 2125-6598-PF 9 本發明之目的為提供雙專一性抗體，以代替增強酵素 反應之輔因子的機能。 (用以解決課題之手段） 本發明人等努力研究的結果，成功地發現—種雙專一 •II抗體，甘-τ由 共可專一性結合於F.IX/F.IXa及F.X兩者且可替代 F’VlIIa之輔因子作用，亦即藉由FiXa促進活化 用 "ή* * 。亦即，本發明人等成功地製作了雙專一性抗體，其可
辨識酵素及該酵素之基質兩者，且能替代該酵素之輔因子 的機能。 亦即，本發明係關於一種雙專一性抗體，其係替代增 強酵素反應之輔因子的機能，更具體的說，為： 〔1〕一雙專一性抗體，其可辨識酵素及該酵素之基質兩 者’且可替代增強酵素反應之輔因子的機能； 〔2〕如〔1〕之抗體，其中酵素為蛋白質分解酵素； 〔3〕如〔2〕之抗體，其中蛋白質分解酵素、基質及輔因 子為凝jk纖溶關連因子； 〔4〕如〔3〕之抗體，其中凝血纖溶關連因子之酵素為第 IX凝血因子及/或活化第1；^凝血因子，而基質為第X凝血因 子，且輔因子為第VIII凝血因子及/或活化第νιπ凝血因子； 〔5〕如〔1〕〜〔4〕中任一者之抗體，其中抗第⑻以議 血因子抗體含有由下述（al)或（a2)之CDR3之胺基酸序 列所構成之互補性決定區或與該等在機能上為同等之互補 性決定區，且抗第X凝血因子抗體含有由下述（bl)〜（b9) 中任一者之CDR3之胺基酸序列所構成之互補性決定區或 2125-6598-PF 10 1354676 與該等在機能上為同等之互補性決定區； (al ) Η鏈CDR3為序列識別號：16之胺基酸序列 (a2) Η鏈CDR3為序列識別號：20之胺基酸序列 (bl) Η鏈CDR3為序列識別號：24之胺基酸序列 (b2) Η鏈CDR3為序列識別號：28之胺基酸序列 (b3) Η鏈CDR3為序列識別號：32之胺基酸序列 (b4 ) Η鏈CDR3為序列識別號：36之胺基酸序列 (b5) Η鏈CDR3為序列識別號：40之胺基酸序列 • ( b6) Η鏈CDR3為序列識別號：44之胺基酸序列 (b7) Η鏈CDR3為序列識別號：48之胺基酸序列 (b8 ) Η鏈CDR3為序列識別號：52之胺基酸序列 (b9) Η鏈CDR3為序列識別號：56之胺基酸序列 〔6〕如〔1〕〜〔4〕中任一者之抗體，其中抗第IX/IXa凝 血因子抗體含有由下述（al)或（a2)之CDR之胺基酸序 列所構成之互補性決定區或與該等在機能上為同等之互補 性決定區，且抗第X凝血因子抗體含有由下述（bl)〜（b9) ® 中任一者之CDR之胺基酸序列所構成之互補性決定區或與 該等在機能上為同等之互補性決定區； (al ) Η鏈CDR1，2, 3為序列識別號：14、15、16之 胺基酸序列 (a2 ) Η鏈CDR1，2，3為序列識別號：18、19、2〇之 胺基酸序列 (bl ) Η鏈CDR1，2，3為序列識別號：22、23、24之 胺基酸序列
2125-6598-PF 1354676 (b2) Η 鏈 CDRl， 胺基酸序列 (b3) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 (b4) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 (b5) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 • ( b6) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 (b7) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 (b8) Η 鏈 CDR1， 胺基酸序列 2, 3為序列識別號：26、27、28之 λ ，3為序列識別號：30、31、32之 ，3為序列識別號：34、35、36之 ，3為序列識別號：38、39、40之 2, 3為序列識別號：42、43、44之 2’ 3為序列識別號：46、47、48之 2, 3為序列識別號：50、51、52之 (b9) Η 鏈 CDR1，2, 胺基酸序列 3為序列識別號：54 55 、 56之
〔6〕中任一項之抗體及藥 〔7〕一種組合物，含有〔1 學上可容許之載體； ⑷如m之組合物’其為用於預防及/或治療出血、伴隨 出血之疾病’或者起因於出血之疾病的醫藥組合物； 〔9〕如[8]之組合物，纟中出血、伴隨出血之疾病，或者 起因於出血之疾病係因第νιπ凝血因子及/或活化第viii凝 血因子之活性低落甚至缺損❿導致發病及/或惡化之疾病； 〔10〕如[9]之組合物，其中因第νπι凝血因子及/或活化第
2125-6598-PF 12 1354676 VIII凝血因子之活性低落甚至欠缺而導致發並及/或惡化之 疾病為血友病A ’ 〔11〕如[9]之組合物，其中因第VIII凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子之活性低落甚至缺損而導致發病及/或惡化之 疾病為對於第乂111凝也因子及/或活化第VIII凝血因子出現 抑制子之疾病； 〔12〕如[9]之組合物’其中因第VIII凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子之活性低落甚至缺損而導致發病及/或惡化之 疾病為後天性血友病； 〔13〕如[9]之組合物，其中因第VIII凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子之活性低落甚至缺缺而導致發病及/或惡化之 疾病為類企友病（Von Willebrand); 〔14〕一種預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病，或者起 因於出血之疾病的方法，包含投予〔！〕〜〔6〕中任一者 之抗體或〔7〕〜〔1 3〕中任一者組合物的過程； 〔15〕使用〔1〕〜〔6〕任一者之抗體，以用於製作〔7〕 〜〔1 3〕中任一項組合物； 〔16〕種用於〔14〕之預防及/或治療方法之套組，至少 含有〔1〕〜〔6〕中任一者之抗體或〔7〕之組合物； 〔17〕一種預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病，或者起 因於出血之疾病的方法，包含投予〔4〕〜〔6〕中任一者 之抗體或〔7]〜^ 〔1 3〕中任一者之組合物之過程， 第VIII凝血因子； 歼用 〔18〕提供—種用於〔17〕之預防及/或治療方法之套組，
2125-6598-PF 1354676 至少包含〔4〕〜〔6〕中任一者之抗體或〔7〕之組合物， 且包含第VIII凝血因子。 【實施方式】 (據以發明實施之最佳形態） 本發明中雙專一性抗體（bispecific抗體）為由對於相 異抗原具有專一性之2種抗體或抗體片段所構成之分子。雙 專一性抗體不特別限制，但較佳為單株抗體。 本發明之雙專一性抗體較佳為利用基因重組技術所產 • 生之重組型抗體。（例如，參見BorrebaeckCAK及Larrick JW， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, MACMILLAN PUBLISHERS LTD於英國出版，1990 )。重組 型抗體可藉由選殖編碼為該等之DNA於融合瘤或產生抗體 之相應淋巴球等抗體產生細胞，再嵌入適當之载體並導入 寄主以生產而得到。 再者，本發明中之抗體可為其抗體片段或者抗體修飾 物。抗體片段包含雙體（diabody ; Db)、線狀抗體、單鏈 聲抗體（以下，亦稱scFv )分子等。此處，「Fv」片段為最小 的抗體片段，其包含完整的抗原辨識部位及結合部位。「Fv」 片段為一個重（H)鏈可變區（Vh)及輕（L)鏈可變區（Vl) 藉由非共價鍵而強力連結之結合之二元體（Vh_Vl二元 體）各可變區之二個互補鏈決定區（C〇mplementarity determining region; CDR)會彼此作用，而於 Vh_Vl 二元體 的表面上形成抗原結合部位。6個CDR會於抗體上形成抗原 結合部位。但，即使一個可變區（或抗原上僅含有專一性 2125-6598-PF 14 1354676 的3個CDR之Fv之一半）較全部結合部位其親和性為低，但 仍可辨識抗原，且具有結合能力。 又’ Fab片段（亦稱為F(ab))進一步含有[鏈之固定區 及Η鏈之固定區（CHl)〇Fab，片段在具有含有來自抗體之 鉸鏈區之1個或更多的半胱胺酸之Η鏈CH1區之羧基末端由 來的數個殘基之點上與Fab片段不同。Fab'-SH表示在固定 區之1個或更多半胱胺酸殘基具有游離之硫醇基的Fab，。 F(ab')片段可藉由將F(ab，）2胃蛋白酶分解物之鉸鏈部之半 Φ 耽胺酸中的雙硫鍵切斷以製造。化學鍵結之其他抗體片段 為該產業界者已知的。 雙體係指藉由基因融合所構建的二價（bivaient)抗體片 段（Holliger P 等·，proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097號、W093/11161號等）。雙體為由二條 的多肽鏈所構成之二元體，多肽鏈各不同，同鏈中L鏈可變 區（VL)及Η鏈可變區（VH)藉由彼此無法結合程度之短連結 (例如5個殘基左右）連結。編碼於同一多肽鏈上之^及％ 籲 因之間的連結短，故形成無法構成單鏈可變區片段之二元 體’使雙體具有2個抗原結合部位。 單鏈抗體或scFv抗體片段含有抗體之vH及VL區，且該 等區存在於單一之多肽鏈中。一般而言，Fv#肽尚於vH及 VL區間含有多肽連結’藉此，可使scFv能形成抗原結合所 須的構造（關於scFv之總論參見piuckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibodies』Vol.113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) 2125-6598-PF 15 1354676 ΡΡ·269-3 1 5，1994 ))。本發明中之連結子不特別限定，只要 疋不會阻礙連結其兩端抗體可變區表現者即可。
IgG型雙專一性抗體可藉由融合產生Ig(}抗體之二種融 5瘤所產生之雜交融合瘤（hybrid hybridoma(quadroma))以 分泌（Milstein C et al· Nature 1983, 305: 53 7-540 )。或者， 亦可將構成目標之二種IgG的l鏈及Η鏈的基因，合計4種基 因導入細胞並令其共表現以分泌。 但是’以該等方法所產生之IgG其Η鏈與L鏈之組合 在理論上有10種。由欲1〇種類的IgG純化由目標組合之 Η鏈L鏈構成之IgG有所困難。再者，因目標之組合者的 分泌量較理論顯著為低，故需要大規模培養，在製造成本 會更增加。 此時’藉由於Η鏈之CH3區進行適當之胺基酸取代，可 以優先分泌Η鏈異質組合之IgG ( Ridgway JB et al. Protein Engineering 1996, 9: 617-621 ' Merchant AM et al. Nature
Biotechnology 1998，16: 677-681 )。 又’關於L鏈，因L鏈可變區較H鏈可變區其多樣性 為低’故可期待得到具有兩Η鏈結合能力之共通L鏈。藉 由將該共通L鏈與兩η鏈基因導入細胞内並表現IgG，可 有效表現雙專一性之 IgG (Nature Biotechnology. 1998，16, 677-681)。但任意選擇2種抗體時，含有同L鏈之可能性 低’故實現上述想法是困難的，故有關於選擇對應於任意 之相異Η鏈且能顯示高結合能力之共通L鏈之方法被提案 (W02004/065611)。具有上述變異（Nature Biotechnology, 2125-6598-PF 16 1354676 1998, 16, 677-681) CH3之Η鏈於對側之Η鏈不存在時，幾 乎不會分泌。利用此特性’首先誘導右臂之L鏈與η鏈表 現’停止之後，再藉由誘導左臂之L鏈與η鏈表現，可使 目標組合之IgG其表現比率提高（Pct/JP2004/008585 )。 藉由將Fab’以化學性交聯，亦可製作雙專一性抗體。 例如將由其中之一的抗體調製之Fab，以 〇_PDM(ortho-phenylenedi-maleimide)馬來醯亞胺化，再與 由另一抗體所調製之F ab ’反應，可製作將來自相異抗體 籲 Fab，交聯之雙專—性 F(ab’）2 ( Keler T 等· Cancer Research 1997，57: 4008-4014)。又，將 Fab’-硫代硝基笨曱酸（ΤΝΒ) 衍生物t Fab，-硫醇（SH)等抗體片段以化學性結合之方法 亦為已知的（Brennan M et al. Science 1985, 229: 81-83)。 取化學交聯而代之，亦可使用由來自Fos，Jun等之白 胺酸拉鏈（leucine zipper)。Fos, Jun亦會形成同質二元體， 但利用其優先形成異質二元體的性質。表現調製加成Fos 白胺酸拉鏈之Fab’與加成Jun白胺酸拉鏈之另一 Fab’。藉 鲁 由在溫和條件下將還原之單體Fab’-Fos, Fab，-Jun混合並反 應’可形成雙專一性 F(ab，）2 ( Kostelny SA et al. J 〇f
Immunology，1992, 148: 1547-53 )。該方法不限定於 Fab’， 亦可應用於scFv、 Fv等。 雙體亦可製作雙專一性抗體。雙專一性雙體為二個交 叉（cross-over)的scFv片段的異質二元體。亦即，可利用 將來自二種抗體A，B之VH及VL以5個殘基左右之較短連 結子連結所製作之VH(A)-VL(B)，VH(B)-VL(A)所構成的異 2125-6598-PF 17 1354676 質二元體構成（Holliger P et al. Proc of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448 ) ° 此時，將二種scFv以15個殘基左右的柔軟且較長的 連結子連接（單鏈雙體：Kipriyanov SM等.J 〇f Molecular Biology. 1999, 293: 41-56)，並進行適當胺基酸 取代（knobs-into-holes: Zhu Z 等.Protein Science. 1 997, 6: 781-788)，亦可促進目標的構成。
將二種scFv以15個殘基左右之柔軟且較長連結子連 • 結所製作的sc(Fv)2亦可作為雙專一性抗體（Mallender WD et al. J of Biological Chemistry，1994，269: 199-206 ) 〇 抗體修飾物例如有與聚乙二醇（pEG )等各種分子結 合之抗體等。本發明之抗體修飾物對被結合之物質不限 定。欲得到該種抗體修飾物可藉由將得到之抗體實施化學 性修飾。該等方法在該領域中已被確立。 本發明之抗體可為人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體等， 其由來不限定。又’亦可為嵌合抗體或人類化抗體等基因 Φ 改變抗體。 人類抗體之取得方法為已知，例如，可利用以具有人 類抗體基因之所有基因庫的基因轉殖動物作為目標抗原進 行免疫以取得目標之人類抗體（參見國際專利申請公開編 號 WO 93/12227，WO 92/03918，WO 94/02602，WO 94/25585 ’ W0 96/34096，WO 96/33735 )。 基因改變抗體可利用已知的方法製造。具體而言，例 如嵌合抗體為由免疫動物之抗體的Η鏈及l鏈的可變區及 2125-6598-PF 18 1354676 人類抗體之Η鏈及L鏈的固定區所構成的抗體。將編碼為免 疫動物之抗體可變區的DNA與編碼為人類抗體固定區之 DNA連結，並將該等嵌入表現載體並導入宿主令其生產， 可得到嵌合抗體。 人類化抗體為亦稱為再構成（reshaped )人類抗體之一 種改變抗體。人類化抗體係藉由將免疫動物由來抗體之 CDR移殖至人類抗體互補性決定區以構建。其一般基因重 組方法為已知的。
具體而言’係將設計為使小鼠抗體之CDR與
之框架區（framework region ; FR )連結之dnA序列以PC] 法從製作為使末端具有重疊部分的數個寡核苔酸進行名 成。將付到之DN A與編碼為人類抗體固定區之dnA連結， 再嵌入表現載體，並導入寄主以生產，可得到之（參見爵 洲專利申請案公開編EP 239400、國際專利申請案公開編儀 WO 96/〇2576 )。透過CDR連結之人類抗體其？11選擇互補伯 決疋區以形成良好抗原結合部位。依需要，亦可將抗體之 可變區中框架區之胺基酸取代K吏再構成人類抗體之互 補性決定區形成適當之抗原結合部位（Sato K等，CanceResearch 1 993, 53: 85 1_856)。又，亦可在各人類抗體由來 之框架區進行取代（參見國際專利申請 99/5 1743 )。
其替代辨識酵素及該酵素 本發明提供雙專一性抗體， 基質兩者之輔因子的機能。 要疋作用於酵素且可 本發明之輔因子不特別限定，只
2125-6598-PF 19 素反應者即可。本發明之辅因子例如有蛋白質分 京之輔因子笼。疋i β 蛋白質分解酵素之輔因子之具體例例如有 ΤΜ纖'令關連因子之輔因子（F.VIII/F.VIIIa、F.WRVa、ΡΖ、 TM/PS系統）或補體反應之輔因子（C4b、MCP、CRi、 Η因子）等。 本發明之酵素及該酵素之基質及該酵素之辅因子的具 體例例如有以下之組合β ' (a) 凝血纖溶關連因子之輔因子之例1 酵素：F.IXa
基質：F.X 辅因子：F.VIII/f.Villa 輔因子F.VIIIa藉由結合F.IXa與F.X兩者，可增強F.IXa 造成之F.X活化。上述可辨識酵素F.IXa、基質F.X兩者之雙 專一性抗體中，有可增強F_X活化之作用者。推測該種抗體 有可代替辅因子F.VIII/F.VIIIa作用之機能。
(b) 凝血纖溶關連因子之輔因子之例2 酵素：ZPI
基質：F.X/F.Xa 輔因子：PZ 輔因子PZ藉由結合serpin家族之ZPI與活化第X凝血因 子（F.Xa)，可增強ZPI造成之F.Xa阻礙活性。即，推測可辨 識ZPI與F.X/F.Xa兩者之雙專一性抗體中，具有代替PZ機能 之作用。 (C)凝血纖溶關連因子之輔因子之例3 20
2125-6598-PF 1354676
酵素：凝血酶 基質：TAFI 輔因子：TM 輔因子TM可增強因凝血酶造成之TAFI活化。即，推測 可辨識凝血酶與TAFI兩者之雙專一性抗體，有可代替TM機 能之作用。 (d) 凝血纖溶關連因子之輔因子之例4 酵素：凝血酶
# 基質：PC
輔因子：TM/PS TM/PS系統可增強因凝血酶造成之PC活化。即，推測 可辨識凝血酶與PC兩者之雙專一性抗體，有可代替TM/ps 系統之機能。 (e) 凝血纖溶關連因子之輔因子之例5 酵素：F.Xa 基質：原凝金酶 ® 輔因子：F.V/F.Va 輔因子F.Va可藉由結合F.Xa與原凝血酶兩者，以增 強F.Xa所造成之原凝血酶活化。上述可辨識酵素美
質原凝血酶兩者之雙專一性抗體中具有可增從E 3攻原凝血酶活
化之作用者。推測該種抗體有可代替辅因子F _ v/F.Va 作用 之機能。 (f) 補體反應之輔因子之例1 酵素：Cls 21 2125-6598-pf 1354676 基質：C2 輔因子：C4b C4b具有促進因c 1 s所造成C2之分解作用。即，推測可 辨識Cls與C2兩者之雙專〆性抗體有可替代C4b機能之作 用 (g)補體反應之輔因子之例2 酵素：補體調節蛋白質I因子（Complement Regulatory Factor I ) # 基質：C3b 輔因子：補體調節蛋白質H因子（Complement Regulatory Factor Η ) 膜辅因子蛋白質（Membrane Co factor
Protein (MCP)) 補體受體 l(Complement Receptor 1( CR1 )) 補體調節蛋白質H因子、MCP、CR1可促進補體調節蛋 白質 I 因子（Complement Regulatory Factor I)所造成之 C3b 鲁 分解作用。即’推測可辨識補體調節蛋白質I因子及C3b兩 者之雙專一性抗體，有可替代補體調節蛋白質Η因子、 MCP、CR1機能之作用。 上述輔因子中特別較佳者為F.viII/F.Villa。 F. VIII/F. Villa僅會被凝血酶等蛋白分解酵素所分解，但只 要有F.VIII/F.VIIIa之輔因子活性’則其形態不限。又，關 於變異F.VIII/F.Villa或藉由基因重組技術而人為改變之 F.VIII/F.VIIIa，只要具有F.VIII/F_VIIIa之輔因子活性，亦 2125-6598-PF 22 1354676 包含於 F.VIII/F.VIIIa。 得到本發明之代替輔因子機能之雙專—性抗體的 不特別限；t，可利用任意方法取得。例如，欲得到代 酵素A及基質B之輔因子機能代替雙專_性抗㈣，
疫動物分別以酵素A、„B進行免疫，以取得 體及抗基質B抗體。之後’製作含有抗酵素A抗體之 鏈及抗基質B抗體之Η鏈與以的雙專_性抗體。此處，” 望各得到複數種抗酵素Α抗體與抗基質Β抗體，並較佳為 用該等儘可能製作多數組合之雙專一性抗體。製作雙專— 性抗體後，選擇具有輔因子機能代替活性之抗體。X 對抗酵素或基質之抗體可藉由該產業者所周知的方法 得到。例如，可藉由對免疫動物以抗原進行免疫以調製。 對動物進行免疫之抗原有以具有免疫原性之完全抗原與不 具免疫原性之不完全抗原（包含半抗原（hapten))。本發明 中係將推測作為酵素或基質之肖因子作用之本發明輔因子 機能代替抗體使用為上述抗原（免疫原）。免疫動物例如可 使用小鼠、大鼠、倉鼠、土撥鼠、兔或恆河猴等。對該等 動物以抗原進行免疫時，可使用該產業者所周知的方法。 本發明中較佳者為由被免疫之動物或該動物之細胞回收抗 體之L鏈及Η鏈的可變區。該操作可使用該產業者所—般周 知的技術進行。以抗原免疫之動物會特別在脾臟細胞^表 現對抗該抗原之抗體。故，例如由被免疫動物之脾臟細胞 調製mRNA並利用對應於該動物之可變區的引子， 错由 RT-PCR進行l鏈及η鏈可變區的回收。 2125-6598-PF 23 詳細而言’對㈣分別精素、㈣進行免疫。作為 免疫原之酵素、基質可為蛋白質全體或者該蛋白質之部分 肽鏈。又，用於對動物進行免疫 乂尤疫原依情況，亦可將 作為抗原者與其他分子結合而成為可溶性抗原，又，依情 形，亦可使用該等之片段。 由被免疫之小鼠的脾臟單離脾細胞，並與小鼠骨髓瘤 細胞融合，以製作融合瘤。分別選擇與抗原結合之融合瘤， 並使用對應於可變區之引子’利用RT_PCR，可回收L鏈、 Η鏈之可變區。亦可使用對應於CDR之引子、對應於較 CDR之多樣性為低之框架的引子，或對應於訊息序列與 CH1或對應於L鏈固定區（cL)之引子。 或者，由被免疫動物之脾細胞萃取mRNA，並利用對 應於可變區附近之引子，以RT_PCR回收L鏈、H鏈可變 區之cDNA»或亦可於體外（invitr〇)對淋巴球進行免疫。使 用該等以構建表現scFv或Fab之庫。藉由移位（panning) 可將抗原結合抗體選殖體濃縮及株化’以得到可變區。此 時，亦可以來自人類或未進行免疫之動物的微血管單核 球、脾臟、扁桃腺等之mRNA為材料，使用同樣之庫進行 篩選。 使用該可變區製作抗體表現載體。藉由將抗酵素抗體 表現載體與抗基質抗體表現載體導入同一細胞並表現抗 體’可得到雙專一性抗體。 選擇具有輔因子機能代替活性之抗體例如可藉以下之 方法進行。 2125-6598-PF 24 1354676 (1)使用含有該酵素.該基質之反應系，並藉由以添加該 抗體所產生之該酵素錄（基質分解能力）上升作為指標 以進行選擇。 (2 )測定與該酵素.該基質·該輔因子相關之活體機能或 使用模式系（例如，血漿凝固測定系），並於該輔因子不存 在條件下’以添加該抗體所造成之機能回復活性作為指 標’以進行選擇。 所得到之抗體可純化為均一態。抗體之分離、純化使 用通常蛋白質所使用之分離、純化方法即可。例如，若適 當選擇並組合親和性層析法等層析管柱、過濾器、超過濾、 鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺膠體電泳，可將抗體分離、 純化（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)，但不 限疋於此。親和性層析所使用之管柱例如有蛋白質A管柱、 蛋白質G管柱等。 本發明之雙專一性抗體當例如所代替之輔因子為 F-VIII/F.VIIIa時，即酵素及基質之組合為凝血纖溶關連因 子之F.IXa'及F.X時，較佳為具有含有抗RIXa抗體之可變 區與抗F_X抗體之可變區的構造。 本發明之F.VIII/F.VIIIa機能代替雙專一性抗體係用以 下方法製作。以市售之F.ixa及f_X分別對小鼠皮下進行免 疫。由抗體價上升之免疫小鼠的脾臟單離脾細胞，並與小 鼠月fa瘤細胞融合’以製作融合瘤。分別選擇結合於抗原 (F.IXa、F.X )之融合瘤，並以對應於可變區之引子，藉 2125-6598-PF 25 1354676 RT-PCR法回收L鏈、Η鏈之可變區。各將[鏈可變區嵌入含 有CL之L鏈表現載體、Η鏈可變區嵌入含有Η鏈固定區之η 鏈表現載體。又，由該免疫小鼠之脾臟萃取mRNA，並用對 應於可變區之引子，藉rT_PCr回收L鏈、Η鏈可變區之 cDNA。用該等可變區構建表現scFv之噬菌體庫。藉由移位 (panning)將抗原結合抗體選殖體濃縮.株化，並用該可變 區製作抗體表現載體。將抗F.IXa抗體（Η鏈、[鏈）之表現 載體及F.X抗體（η鏈、L鏈）之表現載體導入同一細胞， 並表現抗體，以得到雙專一性抗體。 對得到之雙專一性抗體’於由F XIa ( F ιχ活化酵素）、 F.IX、F.X、F.Xa之合成基質（s_2222 )、磷脂質所構成之測 定系、F.VIII/F.VIIIa (因F.IXa造成F.X活化之輔因子）進行 代替活性之評價。以該結果，對測定系中顯示〇1以上之類 F.VIIIa活性者進行具有F.vin/F.VIIIa代替活性之雙專一性 抗體的選擇。又，此處所指類F VIIIa活性為將抗體溶液或 抗體表現培養上清於3〇分鐘中或60分鐘中之吸光度變化值 減去溶劑或未表現抗體培養上清於30分鐘中或6〇分鐘中之 吸光度變化值所得到之值。 對上述所選擇之雙專一性抗體或其類似雙專一性抗 體，使用欠缺F. VIII之人類血聚，並使用凝固時間測定系以 測定凝固回復能力。其結果，與未添加抗體時比較，得到 凝固時間縮短之雙專一性抗體。此處所指凝固時間如實施 例7所示’為使用欠缺F. VIII之人類血漿以測定活化部分血 栓形成素時間者。該等雙專一性抗體之中，較佳之雙專一 2125-6598-PP 26 1354676 性抗體為具有1 〇秒以上，更佳之雙專一性抗體為具有20秒 以上，又更佳之雙專一性抗體為具有40秒以上，最佳之雙 專一性抗體為具有50秒以上之凝固時間縮短能力者。
本發明抗體之Η鏈CDR3不特別限定，但具體而言，具 有後述實万包例之 ΧΒ12、ΧΤ04、Α19、Α25、Α31、Α38、Α39、 Α40、Α41、Α44、Α50或Α69之Η鏈CDR3序列（序列識別號： 16、20、60、64、68、72、76、80、84、88、92或96 )中 任一者之胺基酸序列所構成之互補性決定區或與該等為同 等機能互補性決定區，且具有SB04、SB05、SB06、SB07、 SB21、SB30、SB34、SB38、SB42、Β2、Β5、Β9、Β10、 Bll、Β12、Β13、Β14、Β15、Β16、Β18、Β19、Β20、Β21、 Β23、Β25、Β26、Β27、Β31、Β34-1、Β34-2、Β35、Β36、 Β3 8、Β42、SB 1 5或SB27之Η鏈CDR3序列（各序列識別號： 24、28、32、36、40、44、48、52、56、100、104、108、 112 、 116 、 120 、 124 、 128 、 132 、 136 、 140 、 144 、 148 、 152 、 156 、 160 、 164 、 168 、 172 ' 176 、 180 、 184 、 188 、 _ 192、1 96、200或204)中任一者之胺基酸序列所構成之互 補性決定區或與該等為同等機能之互補性決定區。 再者，本發明之上述抗體的具體例較佳為χΒ丨2、 ΧΤ04、Α19、Α25、Α31、Α38、Α39、Α40、Α41、Α44、 Α50 或 Α69 (序列識別號：'14 〜16,、1、8 〜20、58 〜60、62~64、 66〜68、70〜72、74〜76、78〜80、82~84、86〜88、90〜92 或 94〜96 )之Η鏈CDR序列之任一者的胺基酸序列所構成之互 補性決定區或與該等為同等機能之互補性決定區，以及 2125-6598-PF 27 1354676 SB04、SB05 ' SB06、SB07、SB21、SB30、SB34、SB38、 SB42、B2、B5、B9、BIO、Bll ' B12、B13、B14、B15、 B16、B18、B19、B20、B21、B23、B25、B26、B27、B31、 B34-1、B34-2、B35、B36、B38、B42、SB15 或 SB27 之 H 鍵CDR序歹(序歹識另'J號：22〜24、26〜28、30〜32、34〜36 、 38〜40、42〜44、46〜48、50〜52、54〜56、98〜100、102〜104、 106〜108、110〜112、114〜116、118〜120、122〜124、126〜128、
130〜132、134〜136、138〜140' 142〜144、146〜148、150〜152、 154〜156、 158〜160、 162〜164、 166〜168、 170〜172、 174〜176、 178〜180、 182〜184、 186〜188、 190〜192、 194〜196、 198〜200 或202〜204 )中任一者之胺基酸序列所構成的互補性決定 區，或與該等為同等機能之互補性決定區所組成而成之抗 體。 本發明之 XB12、XT04、A19、A25、A31、A38、A39、 A40、A41、A44、A50、A69、SB04、SB05、SB06、SB07、 SB21、SB30、SB34、SB38、SB42、B2、B5、B9、B10、 Bll、B12、B13、B14、B15、B16、B18、B19、B20、B21、 B23、B25、B26、B27、B31、B34-1、B34-2、B35、B36、 B38、B42、SB15或SB27之Η鏈可變區的胺基酸序列係以 序列識別號：13、17、57、61、65、69、73、77、81、85、 89、93、21、25' 29、33、37、41、45、49、53、97、101、 105 、 109 、 113、 117、 121 、 125 、 129 、 133 、 137 、 141 、 145 ' 149 、 153 、 157 、 161 、 165 、 169 、 173 、 177 、 181 、 185、189、193、197 及 201 表示。
2125-6598-PF 28 1354676 本發明之A44' B26、XB12 ' SB04之L鏈可變區的胺 基酸序列係以序列識別號：205、209、2 1 3、2 1 7表示。又， A44、B26、XB 12、SB04之L鏈CDR序列係以序列識別號： 206~208、210~212、214~216、218~220 表示。又，XB12、 SB04、A44、B26之Η鏈CDR的驗基序列（括弧内為該驗 基序列所編碼之胺基酸序列）係以序列識別號：22 1 ( 222 )、 223 ( 224)、22 5 ( 226 )、23 3 ( 234 )、23 5 ( 236 )、23 7 ( 238 )、 245 ( 246 )、247 ( 248 )、249 ( 250 )、25 7 ( 258 )、259 ( 260 )、 26 1 ( 262 )表示，L鏈CDR之鹼基序列係以序列識別號： 227( 228)、229( 23 0)、231( 232)、239( 240 )、241 ( 242 )、 243 ( 244)、25 1 ( 252 )、254 ( 254)、255 ( 256 )、263 ( 264)、 265 ( 266 )、267 ( 268 )表示。 又，序列識別號：58、62、66、70、74、78、82、86、 90、 94、 98、 102、 106、 110、 114、 118、 122、 126、 130、 134 、 138 、 142 、 146 、 150 、 154 、 158 ' 162 、 166 、 170 、 174 、 178 、 182 、 186 、 190 、 194 、 198 、 202 、 206 、 210 、 214 、 218 、 222 、 228 、 234 、 240 、 246 、 252 、 258 、 264 係 表示CDR1。 序列識別號：59、63、67、71、75、79、83、87、91、 95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、 139 、 143 、 147 、 151 、 155 、 159 、 163 、 167 、 171 、 175 、 179 、 183 、 187 、 191 、 195 、 199 、 203 、 207 、 211 、 215 、 219、224、230、236、242、248、254、260、266 表示 CDR2。 序列識別號：60、64' 68' 72、76' 80、84、88、92、
2125-6598-PF 29 1354676 96、100、104' 108、112、116、120、124、128、132 ' 136、 140 、 144 、 148 、 152 、 156 、 160 、 164 、 168 、 172 、 176 、 180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、 220、226、232、238、244、250、256、262、268 表示 CDR3.〇 本發明之抗體不特別限定，但較佳為與上述抗體為相 同或具有相近抗原決定基之抗體，例如有以抗第IXa因子抗 體與抗第X因子抗體組合之雙專一性抗體。此處所指具有相 同或相近抗原決疋基之抗體例如有於競爭性E l IS A等可使 • 結合拮抗之抗體等。該競爭性ELISA之方法不特別限定， _ 但可將第IX/IXa因子或第X因子固定於96孔微孔平盤上，並 同時添加經適當標記之該抗體與欲評價之抗體，以利用標 記檢測出結合之抗體。該標記不特別限定，例如有驗性攝 酸酶標記、過氧化酶標記、生物素標記—鏈徽抗生物素蛋 白結合酶（鹼性磷酸酶標記、過氧化酶等）或FITC等。對 該抗體，若見到欲評價之抗體於達1 〇〇,〇〇〇倍過剩濃度時有 至少50%之競合時，則有抗原決定基存在。 • 使用本發明所揭示之可變區製作全長抗體時，固定區 _ 不特別限定’可使用該產業者所周知的固定區，例如可使 用 Sequences of proteins of immunological interest，（1991)， U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Health ^ An efficient route to human bispecific igGj (1998). Nature Biotechnology v〇l. 16, 677-681等所記載之固定區。 本發明中抗體的1個態樣為具有代替輔因子機能之作 2125-6598-PF 30 1354676 用，故本發明之抗體對於因該輔因子活性（機能）低落所 引起之疾病可期待能作為有效的藥劑。若本發明之抗體 所代替之輔因子為凝血纖溶關連因子時，上述疾病例如可 為出血、伴隨出血之疾病或出血引起之疾病等。特別是， F.VIII/F.VIIIa、F.IX/F.IXa、F.XI/F.XIa之機能低落或欠缺 已知會引起被稱為企友病之出血異常症。 血友病中，因先天性的艮¥111/17.¥1113機能低落或欠缺 造成之出血異常症稱為血友病A。血友病A患者當出血時， • 係進行F_VI11製劑之補充療法。又，激烈運動或遠足當曰， 若頻繁發生關節内出血時，或分類為重度血友病時，有時 會進行F.VIII製劑之預防性投予（參見非專利文獻1及2)。 該F. VIII製劑之預防投予因可大幅減少血友病a患者之出 血次數，故近年來愈來愈普及。減少出血次數不僅可減低 致死性及非致死性之出血危險及所伴隨之痛苦，且可預防 因頻繁之關節内出血所造成之血友病性關節病變。其結 果’可使血友病A患者之QOL大幅提高。 籲 F.VI11製劑之血中半衰期很短，約為12〜16小時左右。 因此，為連續性的預防，必須一週投予3次左右的F VIn製 劑。藉此，可使F.VIII活性大約維持於在1%以上（參見非 專利文獻3及4)。又，出血時之補充療法除了在輕度出血的 情形’為防止再出血及完全止血，必須在固定期間内定期 的追加投予F.VIII製劑。 又’ F. VIII製劑係於靜脈内投予。實施靜脈内投予存在 有技術上的困難度。特別對年輕的患者投予時，因用於投 2125-6598-PF 31 1354676 予之靜脈很細，故困難度更高。 前述F.VIII製劑之預防投予或出血時之緊急投予在許 多情形下係用家庭療法.自我注射。頻繁投予之必要性與 投予時之技術上困難度不僅在投予時造成患者痛苦，且為 妨礙家庭療法.自我注射普及之要因。 因此，與現存之第VIII凝血因子製劑相比較，強烈希 望有技予間隔長的藥劑或投予簡單之藥劑。 再者，對於血友病A患者，特別是重度血友病A患者， • 有時會產生稱為抑制子之對抗抗體。若產生抑制子，F.VIn 製劑之效果會被抑制子妨礙^其結果為患者之止血處理會 變得非常困難。 該等血友病A抑制子患者當發生出血時，通常係使用大 量F.VIII製劑之中和療法或使用複合體製劑（c〇mplex
concentrate )或厂¥„3製劑之繞道療法。但是，中和療法所 才又予之大里F.VIII製劑有時反而會使抑制子（抗f viii抗體） 的力價上升。X ’繞道療法中，複合體製劑或f 乂山製劑之 短血中半衰期（約2〜8小時）會產生問題。此外，該等之 作用機制與F.Vin/F. VIIIa之機能，即因F山造成之f χ活化 的觸媒機能為非依存性’故有的案例會無法順利執行止血 機制’造成無反應。故，企友病入抑制子患者與非抑制子血 友病Α患者相比較’其無法得到充分止血效果的情況為多。 因此，強烈希望能有不受抑制劑存在影響且可代替 F.VIII/F.VIIIa機能之藥劑。 又 F-VIII/F.Villa相關之出血異 常症除血友病、具有 2125-6598-PF 32 1354676 抗F. VIII自我抗體之後天性血友病以外，已知尚有vWF之機 能異常或欠缺所引起之類血友病。vWF不僅為血小板可正 常黏附於血管壁之損傷部位的内皮下組織所必須，且為與 F‘VIII形複合體及保持血漿中正常厂¥111水平所必須。類血 友病患者該等機能低落且止金機能異常。 首先，考慮利用抗體的方法，以創製一種醫藥品，其 ⑴投予間隔長、（ii)投予簡單且（iii)不受抑制子存在影響、 f. vm/F.VI„4依存性的代替其機能。抗體之血^半 衰期-般而言較長，為數日至數週…抗體已知一般係 在皮下投予後移動至血液中。即，—般而纟，抗體醫藥品 滿足上述（i)、（ii)。 本發明提供以本發明抗體為有效成分之醫藥組合物。 例如’若本發明抗體為可辨識F D^F IXa、及fx兩者之抗 體，且能代替F. Villa機能時，可期待該抗體可成為用於預 防或治療出血、伴隨出血之疾病、或出血引起之疾病的的 醫樂品（醫藥組合物）或藥劑。又’若為可辨識F 以、 及原凝血酶兩者且可代替F.Va機能的抗體時’可期待該抗 體可成為用於預防或治療出金 '伴隨出血之疾病、或出血 引起之疾病的的醫藥品（醫藥組合物）或藥劑。 另一方面’與ZPI及F_X結合而具有代替pz機能之抗體 可期待成為具有抗灰栓作用之醫藥品（醫藥組合物）或藥 劑、與凝金酶及ΤΑΠ結合而㈣頂機能之抗體 為 具有止也促進作用之醫藥品（醫藥组合物）或藥劑= 血酶及PC結合以代替PS/TM，、統機能之抗體可期待成為具 2125-6598-PF 33 1354676 有凝固調節作用夕·壁^兹σ _ 之醫樂σσ (醫樂組合物）或藥劑。 又因補體C4之缺陷會引發全身性紅斑性狼瘡（SLE)， 故代，C4b作用之抗體可期待成為具有則發病抑制作用 之醫藥°〇(醫藥組合物）或藥劑。。Η因子之缺陷會引發易 化膿J·生感染病、自我免疫性之絲球體腎炎，故替代Η因子作 用之抗體可期待成為具有該疾病發病抑制作用之醫藥品 (醫藥組合物）或藥劑。 用；。療或預防之含有本發明抗體為有效成分的醫藥 組成可依需要，斜兮·梦、日人 對忒專此合不活性之適當藥學上容許的載 f "貝等以製劑化。例如，有無菌水或生理食鹽水、安 疋劑賦形劑、抗氧化劑（抗壞也酸等）、緩衝劑（麟酸、擰 松酸〃他有機酸等）、防腐齊】、界面活性劑（PEG、Tween 劑(EDTA等)、結合劑。又，亦可含有其他低分子 、血β白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白質、甘 胺酸、谷醯胺、天冬醚胺、精胺酸及離胺酸等胺基酸、多 :及：糖等糖類或碳水化合物、甘露醇或山梨糖醇等糖 ^ 、主射用水溶液時’例如可併用生理食鹽水、含葡 .唐或其他輔助藥之等張液，例如D_山梨糖醇、甘露 Γ甘：醇、氯化納等，適當溶解助劑，例如醇(乙醇等)、 夕 το Sf·(乙—δ?·、ρρΓϊ 榮、 .. 專）、非離子性界面活性劑丨聚 80、HCO-50)等。 不山糸酉文 又^要，亦可將本發明抗體微膠囊化 維素、明膠、聚Γ甲A田* T悉纖 拖戈運送糸心 &甲基丙稀酸]等之微膠囊）或製成勝體 (微脂體、白蛋白微球體、微乳化物、奈米粒
2125-6598-PP 1354676 子及奈米滕囊等）（參見"Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等）。再者，將藥劑製 成緩釋性藥劑之方法亦為周知的，可應用於本發明抗體 (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 267-277 (1981)； Langer，Chemtech. 12: 98-105 (1982);美國專利第 3,773,919 號；歐洲專利申請案公開（EP)第58,481號；sidman et al.，
Biop〇lymers 22: 547-556 (1983) ; EP 第 133,988 號）。 本發明之抗體及醫藥組合物可與第VIII凝血因子併 用。本發明之抗體及或醫藥組合物可與第VIII凝血因子同 籲 時投予，或者，亦可將時間錯開投予。又，本發明之抗體 及醫藥組合物可與第VIII凝血因子組合製成套組以實施。 再者，本發明之抗體及醫藥組合物與第VIII凝血因子併用 時與單獨使用任一者時相比較，可依所欲將各自的投予 量減少。
本發明之醫藥組合物其投予量係考慮劑型種類、投. f法、患者年齡或體重、患者症狀、疾病種類或進行程 等，最後再依醫師之判斷以適當決定，一般而言，大人 日可將(M〜2_mg分成1〜數次進行投予二佳為卜 lOOOmg/日’再更佳為5〇〜5〇〇mg/日最佳為⑽〜則。 /日。該等投予量會依患者之體重或年齡、投予方法等 變動，但該產業者可適當選擇投予量。投予期間亦較佳' 依患者之治癒過程等適當決定。 又， 療用載體 亦可考慮將編碼為 ，以實施基因治療 本發明抗體之基因嵌入基因治 。投予方法除以裸露質體直接
2125-6598-PF 35 1354676 才又予外，亦可包裝於微脂體等，或形成反轉錄病毒、腺病 毒載體、牛痘病毒載體、痘病毒載體、腺病毒關連載體、 HVJ載體等各種病毒載體（參見Ad()lph『病毒基因體法』 CRC Pfess，Flond (1996))，或者可被覆於膠體金粒子等顆 粒載體W093/17等）再進行投予。可藉由在活體内表現
抗體，並能發揮作用之任何方法投予。較佳為為透過適當 之非經口途靜脈内、腹腔内、皮下、丨内、脂肪組織 内、乳腺組織内、吸入或肌肉内之途徑，藉由注射' 注入、 或，體誘導性粒子衝擊法（電子搶等）、點鼻藥等透過點膜 途徑之方法等）投予足夠量。亦可在體外（ex viv〇)利用微脂 體轉染、粒子衝擊法（美國專利第4,945,050號）或病毒感 染對血液細胞及骨髓由來細胞等投予，再藉由將該細胞對 動物進行再導人，以投予編碼為本發明抗體之基因。基因 治療可使用編碼為本發明抗體之任意基因，例如含有前述 则2、SB04、A44、B26之CDR之驗基序列的基因。 又本發明提供用於預防及/或治療出血、伴隨出血 之疾病、或因出血引起疾病之方法，#包含投予本發明抗 體或組合物之過程。抗體或組合物之投予例如可藉由前述
又，本發明係關於本發明抗體、本發明（醫藥）組人 物之製造之使用。 Q 再者，本發明提供用於上述方法之套組，其至少包含 本發明抗體或組合物1套組除上述以外，亦可將注射= 靖、注射針、藥學上可容許之介質、酒精棉花、綷創膏、 2125-6598-PF 36 1354676 或記載有使用方法之說明書等包裝在内。 又’本說明書_所引用之所有先前技術文獻包含於本 說明書内以作為參考。 實施例 以下’以實施例對本發明具體說明，但本發明不限定 於該等實施例。 〔實施例1〕製作對抗第IXa因子（F.IXa )之非中和抗體 1 -1免疫及融合瘤製作 • 對BALB/c小鼠（雄、免疫開始時6週大、曰本Charles
River) 8隻及MRL/lpr小鼠（雄、免疫開始時6週大、曰本 Charles River ) 5 隻，以人類因子（human Factor) IXap (Enzyme Research Laboratories, Inc·)依以下方式免疫。 初次免疫係將以FCA (佛洛依德完全佐劑H37 Ra ( Difco laboratories))乳化之第lxap因子以4(^g/隻進行皮下投予。 2週後將以FI A (佛洛依德不完全佐劑（Difc〇 laboratories )) 乳化之第Ixap因子以4〇gg/隻進行皮下投予。之後以1週之間 籲隔追加免疫3〜7久。以1-2所示之ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)確認對抗第ixaJ3因子之血清抗體價 上升後’最終免疫使用以PBS(-)(不含妈離子、鎮離子之構 酸緩衝鹽液）稀釋之第Ixap因子以4〇μβ/隻進行靜脈内投 予。最終免疫3日後，摘取小鼠脾臟，其中一部分使用於實 施例10 _ 2，其餘之脾臟細胞及小鼠骨髓瘤細胞 P3X63Ag8U.l (稱為 P3U1 ’ ATCC CRL-1597 )依據使用 PEG 1 500 (羅氏藥廠）之通常方法進行細胞融合。將懸浮 2125-6598-PF 37 1354676 於含 10%FBS(Invitrogen)之 RPMI1640 培養基（invitr〇gen) (以下、稱為l〇%FBS/RPMI1640)的融合細胞接種於96孔培 養平盤，並藉由於融合1、 2、 3、 5日後更換HAT選擇培 養基（10%FBS/RPMI1640 / 2%HAT 50x concentrate (大日 本製藥）/ 5% BM-Condimed HI (羅氏藥廢），以進行融合 瘤之選擇培養。使用融合後第8日或第9日所收集之培養上 清’以1-2表示之ELISA測定對第IXa因子之結合活性，以選 擇具有第IXa因子結合活性之融合瘤。接著，以1 _3表示之 鲁 方法測定對第IXa因子酵素活性之中和活性，以選擇對第 IXa因子不具有中和活性之融合瘤。融合瘤係藉由將1個細 胞接種於96孔培養平盤之1個孔内進行極限稀釋2次以選 殖。對於以顯微鏡觀察確認為單一細胞群落之細胞，進行 1-2、1-3表示之ELISA及中和活性測定，以選擇選殖體。藉 由1 -4表示之方法’製作選殖化抗體之腹水，並由腹水純化 抗體。純化彳几體以1 - 5表不之方法轉認不會延長a P T T (活 化部分血栓形成素時間）。
• 1-2第IXa因子之ELISA 將以覆膜緩衝液（100mM重碳酸鈉，pH 9.6,0.02%叠 氮化鈉）稀釋為1 pg/mL之第Ixap因子以lOOpL/孔分注於
Nunc-免疫平盤（Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM piates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))後，於4。〇培養一 晚。以含Tween(R) 20之PBS(-)清洗3次後，以稀釋緩衝液 (50mM Tris-HCl，pH8.1，1% 牛血清白蛋白，ImM MgCl2, 0.15M NaCl，0.05% Tween® 20, 0.02%疊氮化鈉）將平盤於室 2125-6598-PF 38 1354676 溫進行2小時之棚截反應（bl〇cklng)。除去緩衝液後，在平 盤中以1〇〇叫/孔添加以稀釋緩衝液稀釋之小鼠抗血清或融 合瘤之培養上清’並於室溫進行丨小時溫育。將平盤清洗3 次後，以ΙΟΟμί/孔添加以稀釋緩衝液稀釋為1/2〇〇〇之鹼性 填酸酶標記山羊抗小鼠IgG (H + L) ( Zymed Laboratories )， 並於室溫溫育1小時。將平盤清洗6次後，以1〇〇μυ孔添加 呈色基質 Blue_PhosTM 磷酸基質（Kirkegaad & perry Laboratories )，於室溫溫育2〇分鐘。以1〇〇μ]：/孔添加 • Blue-phosTM 中止溶液（Kirkegaad & Perry Laboratories) 後，以微平盤讀取儀第3550型（Bi0_Rad Lab〇rat〇ries)測 定於595nm之吸光度。 1 - 3第IX a因子中和活性測定 將磷脂質（Sigma-Aldrich)以注射用蒸餾水溶解，並施 以超音波處理’以調配400pg/mL之填脂質溶液。將含有 0.1%牛血清白蛋白之Tris緩衝生理食鹽水（以下稱為TBSB) 40μί 與 30ng/mL 第 ΙΧ&β 因子（Enzyme Research ® Laboratories) 1〇μί 與 40(^g/mL 磷脂質溶液 5μΕ 與含有 100 mM CaCl2、20 mM MgCl2之TBSB 5μί與融合瘤培養上清 1 Ομί在96孔平盤進行混合，並於室溫溫育1小時。於該混合 浴液中’添加50pg/mL第X因子（Enzyme Research Laboratories ) 20pL 及 3U/mL 第 Villa 因子（Amrican diagnostica ) 10 gL，於室溫使其反應30分鐘。於其中藉由 添加10pL之0.5M EDTA使反應停止。於該反應溶液内，添 加50pL之S-2222溶液（Chromogenix )，並於室溫溫育30分 2125-6598-PF 39 1354676 里後以微平盤讀取儀第3550型（Bio-Rad Laboratories ) 測定於測定波長4〇5nm、參考波長655nm之吸光度。 1 _4腹水之製作及抗體之純化 依通常方法製作建立之融合瘤之腹水。即，將體外培 養之融合瘤2 X 1〇6個移殖到預先腹腔内投予2次降植烷 (2,6,1〇, 14-四甲基五癸烷；和光純藥工業）之BALB/c小 鼠（雄’實驗開始時5〜7週大，日本Charles River )和BALB/c 裸!鼠（雌’實驗開始時5〜6週大，曰本Charles River及 日本庫雷爾）之腹腔内。移殖後第1〜4週從腹部變肥大之 小鼠回收腹水。 從腹水純化抗體使用Protein G SepharoseTM 4 Fast Flow (Amersham Bi〇Sciences)管柱進行。將以結合緩衝液 (20 mM乙酸鈉，pH5.0 )稀釋2倍之腹水施用於管柱，並 以10倍管柱容量之結合緩衝液清洗。以5倍管柱容量之洗提 緩衝液（0.1 Μ甘胺酸-氣化氫，ph2.5 )將抗體溶出，並以 中和緩衝液（1 M Tris -氣化氫，ρΗ9·0 )進行中和。將該等 以CentriprepTM 10 ( Millipore )濃縮，並將溶劑更換為TBS (50mM Tris-緩衝鹽液）。抗體濃度係由28〇nm之吸光度以 A(l%，lcm) = 13.5算得。吸光度之測定係用du-650 (Beckman Coulter)進行。 1 -5 APTT (活化部分血栓形成素時間）之測定 APTT係藉由連接 CR-A( Amelung)之 KC10A( Amelung) 測定。將以TBSB稀釋之抗體溶液5〇pL、標準人類血聚 (Dade Behring) 50μί 及 APTT試藥（Dade Behring) 50μί 2125-6598-PF 40 1354676 之混合液於37°C加溫3分鐘。藉由將20 mM之CaCl2 ( Dade Behring) 50μ[添力口至該混合液以起始凝固反應，並測定凝 固時間。 〔實施例2〕製作對抗第X因子（F.X )之非中和抗體 2-1免疫及製作融合瘤 對BALB/c小鼠（雄，免疫開始時6週大，曰本Charles River) 8隻及MRL/lpr小鼠（雄，免疫開始時6週大，曰本 Charles River) 5隻’以人類第 X 因子（Enzyme Research _ Laboratories )依如下方法進行免疫。初次免疫將以fca乳 化之第X因子以40pg/隻進行皮下投予。2週後將以FIA乳化 之第X因子以20或40pg/隻進行皮下投予。之後以1週的間隔 合計追加免疫3〜6次。以2-2所示ELISA確認對抗第X因子 之血清抗體價上升後’最終免疫用以PBS (_)稀釋之第X因 子以20或40μ^隻進行靜脈内投予。最終免疫3日後，摘取 小鼠脾臟，其中一部分使用於實施例1〇— 2，其餘的脾臟細 胞及小鼠骨髓瘤細胞P3U1則依使用PEG 1500之通常方法進 • 行細胞融合。將懸浮於10%FBS/RPMI1640培養基之融合細 胞接種於96孔培養平盤，並藉由於融合1、 2、 3、 5日 後更換為HAT選擇培養基，以實施融合瘤的選擇培養。使 用融合後第8日所收集的培養上清，依2_2所示eusa，測定 對第X因子之結合活性。選擇具有第χ因子結合活性之融合 瘤’並依2-3所示方法測定對第Xa因子之酵素活性的中和活 性。將對第Xa因子不具中和活性之融合瘤藉由實施2次極限 稀釋選瘦化。依Η所示方法，製作選瘦化抗體之腹水，並
2125-6598-PF 41 1354676 由腹水純化抗體。純化抗體以2_5所示方法確認不會使 APTT延長。
2-2第X因子之ELISA 將以覆膜緩衝液稀釋為lpg/m之第χ因子以1〇〇μί/孔分 注於Nimc-免疫平盤後，於4。〇溫溫育一晚。以含2〇 之PBS(-)清洗3次後，以稀釋緩衝液將平盤於室溫棚截反應 (blocking”小時。除去緩衝液後，在平盤中添加以稀釋緩 衝液稀釋之小鼠抗jk清及融合瘤之培養上清，於室溫溫育1 • 小時。將平盤清洗3次後，添加以稀釋緩衝液稀釋為〗/2000 之鹼性磷酸酶標記山羊抗小鼠IgG (H + L)，並於室溫溫育1 小時。將平盤清洗6次後’添加呈色基質Blue_Ph〇sTM磷酸 基質（Kirkegaad& Perry Laboratories) ΙΟΟμί/孔，並於室 溫溫育20分鐘。以1〇〇μΐ7孔添加mue_phosTM中止溶液 (Kirkegaad& Perry Laboratories)後，以微平盤讀取儀第 3550 型（Bio-Rad Laboratories)測定於 595nm 之吸光度。 2 - 3第X a因子中和活性測定
鲁 將以TBSB稀釋為1/5之融合瘤培養上清ι〇μΐ^與含40pL 之 250 pg/mL第 Xa因子（Enzyme Research Laboratories)之 TBCP ( 2.7 8 mM CaCl2、22·2μΜ磷脂質（含磷脂醯膽鹼： 峨脂醯絲胺酸= 75: 25、Sigma-Aldrich)之TBSB)混合， 並於室溫溫育1小時。於該混合溶液内添加含有2C^g/mL原 凝血酶（Enzyme Research Laboratories)及 100 ng/mL 活化 凝固第 V因子（Factor Va ( Haematologic Technologies))之 TBCP50pL，並於室溫反應10分鐘。藉由添加0.5 Μ 2125-6598-PF 42 1354676 EDTAlOpL使反應停止。於該反應溶液内，添加1 mM S-2238 溶液（Chromogenix ) 50pL ’並於室溫溫育30分鐘後，微平 盤讀取儀第 3550 型（Bio-Rad Laboratories)測定於405nm 之吸光度。 〔實施例3〕構建嵌合雙專一性抗體表現載體 3-1_由融合瘤製備編碼為抗體可變區之DNA片段 由產生抗F.IXa抗體或抗F.X抗體之融合瘤，使用 QIAGEN(R) RNeasy(R) Mini 套組（QIAGEN )依說明書所 記載之方法萃取總RNA。將總RNA溶解於40pL無菌水。將 純化之RNA1〜2gg作為模板，用Superscript cDNA合成系統 (Invitrogen)依其說明書記載之方法以rt-PCR法合成單鏈 cDNA。 3-2.將抗體Η鏈可變區以PCR放大及序列解析 準備 Krebber 等之報告（J. Immunol. Methods 1997 ; 201:3 5-55 )所記載之HB引子混合物及HF引子混合物作為 小鼠抗體Η鏈可變區（VH ) cDNA放大用之引子。使用各 〇·5μί之ΙΟΟμΜ HB引子混合物及ι〇〇μΜ HF引子混合 物，以製備反應液25pL( 3-1中調製之cDNA溶液2.5μ卜KOD plus buffer (東洋紡績）、〇.2mM dNTPs，1·5ηιΜ MgCl2, 0.75 units DNA聚合酶KOD plus (東洋紡績））。PCR係使用熱 循環儀 GeneAmp PCR 系統 9700 ( Parkin Elmer )，依 cDNA 片段放大之效率性，以條件A (於98°C加熱3分鐘後，以98 °C 20秒、58°C 20秒、72它30秒之反應為1個循環進行32 個循環）至條件B (於94。(：加熱3分鐘加後，以94°C 20秒、 2125-6598-PF 43 1354676 46°C 20秒、68°C 30秒之反應作為i個循環’進行5個循 環’再以94Ϊ 20秒、58t 2〇秒' 72〇c 3〇秒之反應為Hg] 循環，進行30個循環）之任一條件實施。Pcr後，反應液 供1 °/◦瓊脂膠體電泳之用。將目標長度（約4〇〇bp )之放大 片段使用QIAquick膠體萃取套組（qIAGeN )，以所附說明 書記載之方法純化’並無菌水30μ1溶出之。各DNA片段之 鹼基序列係使用BigDye Terminator循環定序套組（Applied Biosystems)，以 DNA定序儀 ABI PRISM 3100 Genetic 馨 Analyzer ( Applied Biosystems )，依所附說明書記載之方法 決定。由本方法決定之序列群以解析軟體genetyx-sv/rc 第6.1版（Genetyx )比較解析，並選擇具有相異序列者。 3-3•選殖用抗體可變區DNA片段之製備 為將選殖用限制酶Sfi I切斷部位加成抗體可變區放大 片段之兩末端，進行以下操作。 為將Sfi I切斷部位加成VH片段（Sfi I-VH)放大，準 備將引子HB之（Gly4Ser)2_連結子序列變更為具有sfi I ® 切斷部位之所示序列（序列識別號：5 )(引子VH-5，末 端）。使用各0.5μ1之ΙΟμΜ序列專一性引子vH_5’末端及 ΙΟμΜ 引子 scfor ( J. Immunol. Methods 1997 ； 201: 3 5-55 ) ’以調配反應液2(VL (於3_2調製之純化VH cDNA放 大片段溶液Ιμΐ，KOD plus緩衝液（東洋紡績）、〇.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2, 0.5 units DNA 聚合酶 KOD plus(東 洋紡績））。PC R係使用熱循環儀Gene Amp PCR系統9700 (Parkin Elmer )，依片段放大之效率性，依條件a (於98 2125-6598-PF 44 1354676 C加熱3分鐘後、以98〇c 2〇秒、58。匚2〇秒' 72〇c 3〇秒之 反應為1循環，進行32個循環）或條件b (於941加熱3分鐘 後’以94°C 20秒、46eC 20秒、68。0 30秒之反應為1循 環’進行5個循環，再以94°C 20秒、58°C 20秒、72°C 30 秒之反應為1循環，進行30個循環）任一者之條件實施。PCR 後’反應液提供於丨％瓊脂膠體電泳之用。目標長度（約 400bP)之放大片段以QIAquick膠體萃取套組（QIAGEN) 依所附說明書記載之方法純化，並以無菌水3〇#溶出之。 為放大小鼠抗體L鏈可變區（VL) cDNA片段，首先使用 Krebber 等之報告（j_ immunol. Methods 1997 ; 201: 35-55 ) 記載之各0.5μ1100μΜ LB引子混合物及1〇〇μΜ LF引子混 合物’調配反應液25μί (於3-1調製之c-DNA溶液2.5μί， KOD plus 緩衝液（東洋紡績）、〇 2mM dNTPs，1.5mM MgCl2, 0.75 units DNA聚合酶KOD plus (東洋紡績））。PCR使用 熱循環儀 GeneAmpPCR 系統 9700 (Parkin Elmer)，依片 段放大之效率性，於94t加熱3分鐘後，以94°C 20秒、46 °C 20秒、68°C 30秒之反應為1循環，進行5個循環，再以94 C 20秒' 5 8°C 20秒、72°C 30秒之反應為1循環，進行30 循環的條件實施。PCR後’反應液提供於1 %環脂膠體電泳 之用。目標長度（約400bp )之放大片段以QlAqucick膠體 萃取套組（QIAGEN )依所附說明書記載之方法純化，並以 無菌水30μί溶出之。該片段為在其C末端上加成有引子LF 由來之（Gly4Ser)3-連結子序列之狀態。為於該片段c末 端加成Sfi I切斷部位，準備將引子LF之（Gly4Ser)3-連結子 2125-6598-PF 45 1354676 序列變更為具有Sfi I切斷部位之所示序列（序列識別號：6 ) 者（引子 VL-3 ’末端）。為放大Sfi I切斷部位加成VL片段 (Sfi I-VL)，使用各0.5μί之ΙΟμΜ VL-3’末端引子混合物及 ΙΟμΜ scback引子，以調製反應液20μί (純化VL cDNA放 大片段溶液1 μΙ>, KOD plus緩衝液（東洋紡績）、〇 2mM dNTPs, 1.5mM MgCl2, 0.5 units DNA 聚合酶 KOD plus(東 洋纺績））。PCR係使用熱循環儀GeneAmp PCR系統9700 (Parkin Elmer )，於 94°C 加熱 3 分鐘後，以 94°C 20秒、46 # °C 20秒、68°C 30秒之反應為1循環，進行5循環，再以94 °C 20秒、58°C 20秒、72°C 30秒之反應為1循環，進行30 循環之條件實施。PCR後，反應液供1 %瓊脂膠體電泳之 用。目標長度（約400bp )之放大片段使用QIAquick膠體萃 取套組（QIAGEN )，依所附說明書記載之方法純化，並以 無菌水30pL溶出。 將純化Sfi I-VH及Sfi I-VL片段依 Sfi I ( TakaraBio)所 附說明書記載之方法調製反應液，並於5(TC分解一晚。之 ® 後’將反應液使用QIAquick PCR純化套組（QIAGEN )依 所附說明書記載之方法純化，並以該套組所附之緩衝液 ΕΒ30μί溶出。 3-4.雙專一性IgG抗體表現用質體 於產生目標之雙專一性IgG抗體時，為形成各Η鏈之異 質分子’參考IgGl之瘤進入洞（knobs-into-holes)技術 (Ridgway et al., Protein Eng. 1996； 9: 617-621)製作 IgG4
對CH3部分之胺基酸取代體。A型（IgG4ya)為Y349C、T366W 2125-6598-PF 46 1354676 取代體，b型（igG4Yb)為 E356C、T366S、L368A、Y407V 之取代體。再者，兩取代體之鉸鏈區也導 -> -ppcpPcp-)。藉該技術，可得到大部分異質體，但因對 於L鏈，不僅生成了 l鏈還會生成不必要的，會影響之後的 活性測定。故，為於各別之表現具有各專一性抗體分子單 臂（稱為HL分子）之細胞内有效製作目標型雙專一性igG抗 體’對應於各HL分子使用以不同藥劑誘導之表現載體。 抗體分子單臂（為方便，稱右臂HL分子）之表現，製 • 作於四環黴素誘導型載體pcDNA4 ( Invitrogen )上嵌入Η 鏈與L鏈各該區（第1圖及第2圖），即動物細胞用訊息序列 (IL3ss) ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984 ； 8 1: 1075 ) 之下游處嵌入適當之小鼠抗體可變區（VH及VL )與人類 IgG4ya固定區（序列識別號：7 )及κ固定區（序列識別號： 8)者（pcDNA4-g4H 及 pcDNA4-g4L)。首先，將pcDNA4 以 存在於其多選殖位之限制酶切斷部位Ec〇 RV及Not I (TakaraBio )分解。將具有適當抗體可變區之嵌合雙專一 _ 性抗體右臂H鏈及L鏈表現單元（各約i.6kb至約l.Okb )以
Xho I ( TakaraBio)分解之後，用QIAquick pcr純化套組 (QIAGEN)依所附說明書記載之方法純化，並以〇να聚合 酶KOD (東洋纺績）依所附說明書記載之反應液組成於72 °C反應10分鐘’使末端平滑化。將該平滑化末端片段以 QIAquick PCR純化套組（qIAGEn)依所附說明書記載之 方法純化，並以Not I ( TakaraBi〇 )分解。將該N〇t 鈍端 片段（各約1.6kb至i.〇kb )及該以Ec〇 RV_N〇t I分解之 2125-6598-PF 47 1354676 pcDNA4使用高連結（Ligation High)(東洋紡績）依所附說 明書記载之方法實施連結反應。以該反應液對大腸菌DH5a 株（Competent high DH5a (東洋紡績））進行轉形。由所 得到安皮西林耐受性選殖體使用QIAprep Spin Miniprep 套組（QIAGEN)單離各質體DNA。 另一單臂（方便上稱為左臂HL分子）依前述方法，製 作對蜆皮激素（ecdysone)類似體誘導型載體pIND (Invitrogen )嵌入各自之Η鏈及L鏈（第2圖及第3圖），即 _ 動物細胞用訊息序列（IL3ss)(EMBO.J. 1987; 6:2939 ) 之下游嵌入適當之小鼠抗體可變區（VH及VL )與人類 IgG4Yb固定區（序列識別號：9 )及κ固定區（序列識別號： 8)者（pIND-g4H 與 pIND-g4L)，並單離各質體 DNA。 3-5.構建雙專一性抗體表現載體 將於3-4調製之四環黴素誘導型表現質體 (pcDNA4-g4H及pcDNA4-g4L)以Sfi I分解，並將反應液 供1 %瓊脂膠體電泳之用。將除去原本具有抗體可變區部 鲁 分（VH及VL (參見第1圖及第2圖））之片段（約5kb )使用 QIAquick膠體萃取套組（QIAGEN )，依所附說明書記載 之方法純化，並以無菌水3 0 μί溶出。將該片段及各自對應 之於3-3調製之Sfi I分解抗F.IXa抗體由來的Sn Ι-VH及Sfi Ι-VL片段以快速連結套組（New England Biolabs)依所附 說明書記載之方法實施連結反應。以該反應液對大腸菌 DH5a株（Competent high DH5a (東洋紡績））進行轉形。 又’將以與上述同樣的手法從於3-4調製之sfil分解蜆皮激 2125-6598-PF 48 1354676 素類似體誘導型表現質體（PIND-g4H及PIND-g4L )除去抗 體可變區部分（VH及VL(參見第2圖及第3圖））之片段及 各自對應之於3-3所調製之Sfi I分解抗f.x抗體由來Sfi I-VH及Sfi I-VL片段以同樣之手法嵌入。 所得到之各安皮西林耐受性轉形體使用可夾住插片段 之引子’依群落PCR法確認目標片段之插入。首先，為合 成抗F.IXa抗體嵌合Η鏈及L鏈表現載體，合成附著於存在插 入部位上游之CMV順向引子部位（Forvvard priming site)之 籲 21-mer之引子CMVF (序列識別號：1〇)及附著於存在插入 部位下游之BGH反向引子部位（Reverse priming site)的 18-mer之引子 BGHR (序列識別號：η ) ( sigma Genosys)。 為合成抗F.X抗體嵌合Η鏈及L鏈表現載體，合成附著於插 入部位上游之24-mer之引子EcdF (序列識別號：12)及附 著於存在插入部位下游之BGH反向引子部位（Reverse priming site)之18-mer的引子BGHR (序列識別號：11 ) (Sigma Genosys )。為群落PCR之使用，調配反應液2〇μί ® (各1〇μΜ引子〇.2μί、KOD dash緩衝液（東洋紡績）、 0.2mM dNTPs、0_75 units DNA 聚合酶 KOD dash (東洋 纺績））°於該反應液中適量投入轉形株細胞並進行PCR。 PCR係使用熱循環儀GeneAmp PCR系統9700 ( Parkin Elmer)，於96°C加熱1分鐘後，以96°C 10秒、55°C 10秒、 72°C 30秒之反應為1循環，進行3〇循環反應之條件實施。
PCR後，反應液供1 %瓊脂膠體電泳之用，並選擇可得到目 標長度之放大片段的選殖體。該PCR產物依ExoSAP-IT 2125-6598-PF 49 1354676 (Amersham Biosciences )所附說明書，實施過剩之引子及 dNTPs之不活化。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator 循環定序套組（Applied Biosystems)，以 DNA 定序儀 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer ( Applied Biosystems )依所附說明書記載之方法決定。依該方法所 決定之序列群以解析軟體GENETYX-SV/RC 第6.1版 (Genetyx )解析，並選擇在VH上無插入缺失變異等為目 標選殖體，及選殖在VL上與融合瘤所使用之P3U1由來偽 • VL基因不同之無插入缺失變異等之目標選殖體。 籲 由該目標選殖體，使用QIAprep Spin Miniprep套組 (QIAGEN)，單離各質體DNA，並溶解於ΙΟΟμί之無菌水。 將抗F.IXa抗體嵌合Η鏈表現載體、抗F.IXa抗體嵌合L鏈表 現載體、抗F.X抗體嵌合Η鏈表現載體及抗F.X抗體嵌合L鏈 表現載體，分別命名為 pcDNA4-g4IXaHn 、 pcDNA4-g4IXaLn、pIND-g4XHn及 pIND-g4XLn。各質體溶 液至使用前保存於4°C。 ® 〔實施例4〕嵌合雙專一性抗體於動物細胞之表現 ® 4-1.DNA溶液之調製 抗體右臂HL分子表現用載體（pcDNA4-g4IXaHn及 pcDNA4-g4IXaLn )可藉由四環黴素誘導表現。為使四環黴 素不存在下完全抑制表現，需要編碼為Tet抑制子之質體 pcDNA6/TR ( Invitrogen)。又，抗體左臂HL分子表現用載 體（pIND-g4XHn及PIND-g4XLn )係藉由昆蟲荷爾蒙蛻皮 激素類似體（ponasterone A )誘導表現。此時，須要編碼 2125-6598-PF 50 1354676 為與尖葉土極甾酮A(ponasteroneA)反應並誘導之蜆皮激 素受體及視黃醇受體的質體pVgRXR ( Invitrogen )。故，為 進行動物細胞之轉染，調製共6種之質體DNA混合液。使用 pcDNA4-g4IXaHn、pcDNA4-g4IXaLn、pIND-g4XHn 及 pIND-g4XLn 各 218.8 ng、pcDNA6/TR 及 pVgRXR以供細胞培 養液1 mL之用。 4 - 2 ·動物細胞之轉染 將人類胎兒腎癌細胞由來HEK293H株（Invitrogen )懸 鲁 浮於含10%FCS (MOREGATE)之DMEM培養基 (Invitrogen)，並以5χ1〇5個/mL之細胞密度於接著細胞用12-孔平盤（CORNING)之各孔内以各lmL於C02培養箱（37 °C、5% C02)内培養。將於4-1調製之DNA混合液加入轉染 各式藥、脂質體（Lipofectamine 2000) ( Invitrogen) 7μί 及 Opti-MEM I培養基（invitrogen) 250gL之混合液並於室溫 靜置20分鐘’再投入各孔之細胞，並於c〇2培養箱（37°C， 5% C02)内培養4〜5小時。 ® 4_3.雙專一性IgG抗體之表現誘導
如前項之方法’由轉染之細胞培養液吸走培養基，並 投入含lgg/mL四環黴素（和光純藥工業）之1 mL CHO-S-SFM-II ( Invitrogen )培養基，於 C02培養箱（37°C、 5% C〇2)内培養1日，進行抗體右臂hl分子之第1次表現誘 導。之後’吸走培養基，投入含5 Mm尖葉土極甾酮 A(ponasteroneA )( Invitrogen)之 1 mL CHO-S-SFM-II培養 基’於C02培養箱（37t ' 5% C02)内培養2〜3日，進行抗 2125-6598-PF 51 1354676 體左臂HL分子之第2次表現誘導，使分泌雙專一性igG抗 體。回收培養上清後，離心（約2000g、5分鐘、室溫）以 除去細胞’並依須要以Micr〇c〇n(R) γΜ·5〇 ( MilHp〇re)進 行濃縮°將該樣本於使用之前保存於4 β 〔實施例5〕人類IgG濃度之定量 將山羊對人類親和性純化抗體IgG Fc ( Cappel )以覆 膜緩衝液調製為lpg/mL，並固相化於Nunc-免疫平盤。以稀 釋緩衝液（D_B_ )進行攔截反應處理後，添加用D B適當 稀釋之培養上清樣本。又’同樣添加以D B從1〇〇〇 ng/mL φ 以2倍系列稀釋11次之人類IgG4 (人類型化抗TF抗體、參見 W0 99/51743)’以作為算出抗體濃度之標準。清洗3次後， 將山羊抗人類IgG與驗性峨酸酶（Biosource International ) 反應。清洗5次後’以Sigma l〇4(R)填酸酶基質 (Sigma-Aldrich )作為基質使呈色，並以吸光度讀取儀第 35 50型（Bio-Rad Laboratories)，以波長 655ηιη為參考波長， 測疋於405nm之吸光度。使用Microplate Manager III (Bio-Rad Laboretories)軟體，由標準校正曲線算出培養 β 上清中之人類IgG濃度。
〔實施例6〕類F. Villa (活化凝固第VIII因子）樣活性試驗 雙專一性抗體之類F. Villa活性係依以下之酵素試驗評 價。又’以下之反應全部於室溫進行。將3.75pg/mL之第IX 因子（Enzyme Research Laboratories)4〇pL與抗體溶液 ΐ〇μ[ 之混合液於96孔平盤中溫育1小時。再於該混合液中，添加
10 ng/mL之第 Xia 因子（Enzyme Research Laboratories )10pL, 2125-6598-PF 52 1354676 50pg/mL之第 X因子（Enzyme Research Laboratories) 20pL， 400pg/mL之磷脂質（參見實施例1-3) 5μί,含5mM CaCl2 及ImM MgCl2之TBSB (以下稱TBSB-S) 15μί，以起始酵 素反應。反應30分鐘後，藉由添加0.5Μ ED ΤΑ 10 pL中止反 應。 將呈色基質溶液50μί加入各孔後，以微平盤讀取儀第 3550型（Bio Rad Loboratories)測定於0分 ' 30分在 405nm (參考波長655nm )之吸光度。類F. Villa活性係將抗體添 # 加之30分鐘内的吸光度變化值減去未添加抗體之30分鐘内 之吸光度變化值之值表示（參見第4圖及第5圖）。 磷脂質之溶劑使用TBSB，第XIa因子、第IX因子及第χ 因子之溶劑使用TBSB-S。呈色基質溶液為依所附說明書溶 解之測試呈色基質S-2222 ( Chromogenix )與凝聚胺 (polybrene)液（0.6 mg/L hexadimethrine bromide ( Sigma)) 之1:1混合液》 再者’為活性最尚之XB 1 2/SB04，測定類f_ vina活性 ® 之濃度依存性（第6圖）。 〔實施例7〕血漿凝固試驗 為解明雙專一性抗體對血友病A血液之凝固能力，探討 該抗體對於使用欠缺F. VIII之血漿對活化部分灰检形成素 時間（APTT)之影響《將各濃度之抗體溶液5(^L、欠缺 F.VIII 之血漿（Biomerieux ) 50pL 及 APTT 試藥（Dade Behring) 50μί之混合液於37°C加溫3分鐘。凝固反應藉由 將20 mM之CaCl2 ( Dade Behring) 50μ]：加入該混合液以起 2125-6598-PF 53 1354676 始。藉由連接 CR-A( Amelung )之 KC10 A ( Amelung )測定 到凝固為止之時間（第7圖及第8圖）。 再者，測定凝固時間之縮短效果最高之XB12/SB04其 濃度依存性（第9圖）。 〔實施例8〕抗體純化 將依實施例4記載之方法得到之1 〇mL之培養上清以
CentriCon(R) ym-50 ( Millipore )濃縮至 1 mL。於其中添加 ΙΟμί 之 10% BSA、ΙΟμί 之 1 % Tween(R) 20 及 ΙΟΟμί 之 • rProtein A Sepharose™ Fast Flow ( Amersham Biosciences )，並於4°C倒轉混合一晚。將該溶液移至0.22μπι 過濾杯111卜3伢66(11)-]\4(：(]^14〇代），以含0.01%丁评6611(11)20 之 TBS 500μ[清洗 3次後，將 rProtein A SepharoseTM樹脂懸 浮於含 lOOpL 0.01% Tween(R) 20之 10 mM HC1，pH2.0内 3分 鐘並靜置後，將抗體溶出。緊接著，加入5pLlM Tris-HCl， ρΗ8·0 中和之。使用 Microplate Manager III ( Bio-Rad Laboretories )軟體，由標準校正曲線算出培養上清中之人 Φ 類IgG濃度。抗體濃度依實施例5進行定量》 〔實施例9〕抗F.X抗體之GST-ΑΡ西方墨點法 構建表現F.X之活化肽（AP)及谷胱甘肽S轉移酶（GST) 之融合蛋白質（GST-ΑΡ)之重組大腸菌。藉由PCR法將包含 人類F.X之全長轉錄區的cDNA以人類肝臟Marathon-Ready cDNA(Clontech)放大後，以該等為模板，以PCR法將編碼 為 AP 區（Leytus et al.，Biochemistry 1 986 ; 25: 5098)之區 域放大，並次轉殖於pGEM-T載體（Promega)，以得到編碼 2125-6598-PF 54 1354676 為GST-AP之pGEX-FlOAP。培養以該質體轉形之大腸菌， 並於OD = 0.8添加ImM IPTG以進行GST_ap之誘導表現。將 培養液離心（3,000 X g，30分間、4。匚）後，回收菌體，於使 用前保存於-20°C。 將菌體顆粒狀物再懸浮於培養量之1/2〇量的pbs，並 對於懸浮液0. lmL，以2.4mL之比例添加SDS_PAGE樣本 緩衝液（IWAKI )，於95°C沸騰5分鐘。於SDS-PAGE mini (14%)膠體（旭得克奴葛拉司）之各孔内加入反應溶液 鲁 1 0^L ’並進行電泳。將電泳後之膠體使用半乾式點墨機 (BIO-RAD)，轉印至 Immobilon-PTM 轉印膜 (MILLIPORE)，並以 BT-PBS (含 2% BSA 及 0.05% Tween(R) 2 0之P B S)點墨。點墨終了後’將實施例1 — 4中純化之抗 F.X小鼠抗體SB04及SB06與以BT-PBS稀釋為2pg/mL者 反應1小時。以含0.05% Tween(R) 20之PBS清洗後，與以 BT-PBS稀釋2000倍之驗性填酸酶標記山羊抗小鼠IgG (H + L) ( Zymed Laboratories)反應 1 小時間。以含 〇.〇5〇/0 籲 Tween(R) 20之PBS清洗後，以呈色基質BCIP/NBT構酸酶 基質（Kirkegaad& Perry Laboratories)使呈色（參見第 圖）。 〔實施例10〕由免疫小鼠脾臟由來scFv庫取得雙專一性抗 體 10— 1抗原及免疫 對BALB/c小鼠（雄，免疫開始時6週大，日本Charles River ) 3隻、MRL/lpr小鼠（雄，免疫開始時6週大，日本
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Charles River) 3隻及C57Bl/6N小氛（雄，免疫開始時6週 大，曰本Charles River) 3隻，以第 ixap因子（Enzyme
Research Laboratories, Inc.)或第 X因子（Enzyme Research
Laboratories，lnc.)為抗原，依以下方式進行免疫。初次免 疫以用FCA (佛洛依德完全佐劑H37 Ra ( Difc〇 laboratories))乳化之抗原以4〇μ§/隻進行皮下投予。2週後 用以FIA (佛洛依德不完全佐劑（Difco laboratories ))乳 化之抗原以40pg/隻進行皮下投予。之後以1週的間隔進行3 • 次追加免疫，於最終免疫8日後從小鼠摘取脾臟。 1〇—2構建噬菌體庫 將實施例1 — 1及2 — 1中製作出之免疫小鼠摘出脾臟的 一部分及由實施例1 0 — 1製作出之免疫小鼠所摘出之脾臟 投入Trizol試劑（Invitrogen) (50mg脾臟/ml試劑），並用 玻璃均質機進行均質化。之後，依試藥所附手冊所記載之 方法，萃取總RNA。從萃取溶液使用p〇iyATract系統1〇〇〇 套組（Promega)依所附手冊所記載之方法萃取 ® P〇lyA(+)RNA。以 RT-PCR(SUperSCriPt III First-Strand Synthesis System f0r RT-PCR，Invitrogen)合成 C_DNA，並 於-20°C保存至使用時為止。 準備實施例3 — 2及3 — 3所使用之HB引子混合物' HF引子混合物、LB引子混合物及LF引子混合物作為小鼠 抗體重鏈可變區（VH )及輕鏈可變區（vl)cDNa之放大用 引子。使用各Ιμί之ΙΟΟμΜΗΒ引子混合物及ι〇0μΜΗΡ 引子混合物作為VH放大用引子，並調製反應液50μί 2125-6598-PF 56 1354676
(cDNA溶液2.5μ卜KODplus緩衝液（東洋紡績）、0.2mM dNTPs，1.5mM MgCl2，3.75 units DNA 聚合酶 KOD plus (東洋纺績））。又’使用各lpL之ΙΟΟμΜ LB引子混合物 及1 ΟΟμΜ LF引子混合物作為vl放大用引子，並調配與 上述同樣組成之反應液（5〇μί)。PCR係使用熱循環儀
GeneAmp PCR 系統 9700 ( Parkin Elmer)，於 98°C 加熱 3 分鐘後’以981 20秒、58°C 20秒、72°C 30秒之反應為
1循環，實施32個循環。PCR後之反應液供2%瓊脂膠體 電泳之用。目標長度（約4〇〇bp )之放大片段使用QIAquick 膠體萃取套組（QIAGEN )，依所附說明書記載之方法純化， 並以無菌水50μ1溶出。其次’為放大scFv片段，調製反 應液ΙΟΟμίΧ VH片段溶液3μ1、ν£片段溶液3〆、K〇D plus 緩衝液（東洋紡績）、〇.2mM dNTPs，lmM MgCl2，5 DNA聚合酶KOD plus (東洋紡績））} 〇份，進行i stpCR (於94。。加熱3分鐘後，以94。。i分、63χ： 4分之反應 為1循％，進行7循環）後，於保溫於63 〇c之狀態下，對 各管添加10μΜ scf0r引子及1〇μΜ scback引子各2 5μ1， 再進仃2nd PCR(於94°C加熱35秒後，以94<t 2分、63 C 2分之反應為！循環，進行3〇循環）。pcR後，將反應 液以QIAqinck PCR純化套組（QIAGEN)純化，將純化產 物以限制酶Sfl I(TakaraBlo)於5〇t分解一晚。將分解物供 2%瓊脂膠體電泳之用後，將目標長度（約_bP)之放大 片段使用QIAquick膠體萃取套組（qiagen)，依所附說 明書記載之方法純化，並溶出於適量之無菌水。為於嗤菌 2125-6598-PF 57 1354676 體gene ΠΙ蛋白質上表現scFv ’使用pELBGlacI(參見第 11圖）嗟菌體卡間載體。將該載體1 以限制酶如 I(TakaraBio)於50°C分解一晚消化後，將目標長度（約5kb) 之切斷片段使用QIAquick膠體萃取套組（qIAGEN )，依 所附s兒明書記載之方法純化，並以適量之無菌水溶出。將 純化PCR產物與純化載體片段使用Ligati〇n High (東洋紡 績）依所附說明書記載之方法’於16°c進行一晚的連結反 應。以該反應液對大腸菌XL1藍色電勝任細胞（blue 籲 electrocompetent cell) (Stratagene)或依雷克特羅馬克司 DH12S(Invitr〇gen)依所附說明書記載之方法以電穿孔法進 行轉形。將所得到之安皮西林耐受性轉形體全部回收，並 保存於-20°C直到供作重組大腸菌庫使用為止。 將該大腸菌庫（2xl〇9cfu)接菌於50 mL 2xYTAG (含 lOOpg/mL安皮西林、2%葡萄糖之2ΧΤΥ)，並於3VC培養至 OD 600 0.4〜0_5為止。加入4 X 1011之幫助嗤菌體 VCSM13(Stratagene)，並於37°C靜置15分鐘使感染。於其
鲁 中添加 450 mL 2xYTAK (含 l〇〇pg/mL安皮西林、25pg/mL 卡那黴素之2xTY)、25pL lmol/L IPTG，並於30°C培養10 小時。以離心回收培養上清，並與l〇〇mL PEG-NaCl溶液 (10%聚乙二醇8000，2.5 111〇1/1^化(^1)混合後，於4。〇靜置 60分鐘。以10,800 X g、離心3〇分鐘將嗤菌體沉殿，並將沉 澱物懸浮於40 mL的水中，與8 mL PEG-NaCl溶液混合後， 於4°C靜置1小時。以10,800 X g、離心30分鐘將噬菌體沉 澱’並懸浮於5 mL PBS，以得到噬菌體庫。將該噬菌體保 2125-6598-PF 58 1354676 存於4°C至使用為止。 10-3以移位（panning)法濃縮結合噬菌體 將第IXaP因子或第X因子使用未事先測重之 nhs-pe〇4_生物素微試管（Pierce)進行生物素標記。於1〇 2製作之嗟卤體庫溶液6〇〇μ1内加入1 〇〇 pm〇i之生物素標 記第IXap因子或第X因子，並與抗原接觸6〇分鐘間抗原。加 入以5% Μ-PBS (含5%w/v脫脂奶之PBS)清洗之Dynabeads M-280鏈黴抗生物素蛋白（dynal)6〇(^l，進行15分鐘之 • 結合。將顆粒結合噬菌體以1 mL之PBST (含〇·ΐ〇/ο Tween_2〇 之PBS)清洗數次後，以PBS清洗。將顆粒懸浮於〇 8爪[之 0.1 mol/L甘胺酸/HC1(PH2.2)懸浮5分鐘，使噬菌體溶出。 或者’對免疫平盤（MaxiSorp，Nunc)上固相化之第ιχ3β 因子或第X因子（1 〇Hg/wellx 5)，添加以2.5%w/v脫脂奶溫育 15分鐘之噬菌體庫（soy/weu χ 5)，使與抗原接觸6〇分鐘。 將抗原結合噬菌體以1 mL之PBST (含〇 1% Tween_2〇i PBS)清洗數次後，以PBS清洗。於〇 8机之〇丨则丨化甘胺 鲁酸/HC1 ( pH2·2 )溫育5分鐘，使嗟菌體溶出。 於回收之噬菌體溶液内添加45μ[ 2 m〇1/L Tris使中 和，於對數增殖期（OD 600 = 0.4〜〇5)添加XL1Blue 1〇 mL，並於37 C靜置30分鐘使感染。將該等塗布於2χγτΑσ 平盤，於30C培養。回收菌落，接種於2χΥΤΑ(}，並於37 °C培養至OD 600 = 〇.4〜〇_5為止。於培養液1〇 mL内添加 5卟 lm〇l/L H>TG、10" pfu幫助噬菌體（VCSM13)，並於 37 C靜置30分鐘。離心收集菌體後，再懸浮於2χγΤΑκ 2125-6598-PF 59 1354676 lOOmL内，於30°C培養10小時。以離心回收培養上清，並 與20 mL 10%PEG-5mol/L NaCl溶液混合後，於4°C靜置20 分鐘。以10,800 X g離心30分鐘，使噬菌體沉澱，並懸浮於 2 mL PBS，以供之後的移位（panning)用。
10- 3 噬菌體ELISA 將上述單一菌落接重於lOOgL 2xYTAG，於30°C培養一 晚。將其5μί接種於500μί 2xYTAG，於37°C培養5小時後， 投入幫助噬菌體2x 108pfu，於37°C靜置30分鐘，再於37°C 鲁攪拌培養30分鐘後，添加含0.5 mM IPTG之2xYTAK120pL。 於30°C培養一晚培養，將離心上清供ELISA之用。為得到 生物素標記抗原之移位選殖體ELISA，使用以1 .Ogg/mL之 生物素標記抗原覆膜之StreptaWell 96微滴定平盤 (Roche )。又，為得到天然抗原之移位選殖體ELISA，使 用將l.Opg/mL之天然抗原固相化之免疫平盤（MaxiSorp， Nunc)。以PBST清洗並除去抗原後，以2% M-PBS 200pL或 2% BSA-PBS(含2%w/v BSA之PBS)作為攔截緩衝液，於室 ® 溫進行1小時間攔截反應。除去缓衝液，於其中加入培養上 清，靜置6 0分鐘，使嗟菌體結合。清洗後，結合嗟菌體於 攔截緩衝液内以稀釋之HRP結合抗Μ1 3抗體（Amersham Pharmacia Biotech)及 TMB基質（Zymed)檢測，並藉由添 加lmol/L H2S04使反應停止後，以平盤讀取儀測定A450之 值。 10—5序列決定與選殖體之選擇 將ELISA為陽性之選殖體的重組大腸菌2xYTAG培養 2125-6598-PF 60 1354676 液，使用引子PBG3-F1 ( 5'- CAGCTATGAAATACCTATTGCC -31 / 序列識別號 ：1 ) 及 PBG3-R1 ( 5'- CTTTTCATAATCAAAATCACCGG -3，/序列識別號：2)， 以PCR法放大scFv區，並決定其鹼基序列。將含有培養液 lpL、10 X KOD Dash緩衝液 1·5μί、ΙΟμπιοΙ/L引子各 0.2pL、 KOD Dash聚合酶（東洋紡績、2.5 υ/μΙ〇 0.3μί之PCR反應 液 15μϊ^，以熱循環儀 GeneAmp PCR 系統 9700(Perkin Elmer) 進行96°C 10秒、55°C 10秒、72°C 30秒之30循環放大。PCR 鲁後，於5pL之反應液内添加ExoSAP-IT (Amersham) 3pL， 於37°C保溫15分鐘，再於80°C保溫15分鐘。對該樣本，以 PBG3-F2(5’- ATTGCCTACGGCAGCCGCT -3，/序列識別 號：3)或 PBG3-R2 ( 5'- AAATCACCGGAACCAGAGCC -3' /序列識別號：4)為引子，以BigDye Terminator循環定 序套組（Applied Biosystems )進行反應，並以Applied Biosystems PRISM 3700 DNA定序儀電泳。從與驗基序列 推定胺基酸序列之CDR3不同的選殖體，選出抗第IXa因子 • 之52個選殖體，及抗第X因子之33個選殖體。 10— 6構建雙專一性IgG抗體表現載體 為使scFv抗體表現為IgG型，以實施例3 — 3、3 — 4及3 一 5所示同樣的方式，將抗體可變區（VH，VL)選殖於誘導型 表現載體上。將抗F.IXa抗體可變區（VH及 VL)嵌入四環 黴素誘導型載體（各為pcDNA4-g4H及pcDNA4-g4L)。將抗 F.X抗體可變區（VH及VL)嵌入蛻皮激素類似體誘導型載 體（各為pIND-g4H及pcDNA4-g4L )。從目標選殖體以 2125-6598-PF 61 1354676 QIAprep Spin Miniprep 套組（Qiagen)單離出各質體 DNA，並溶解loo#之無菌水。 1 〇 — 7叙合雙專一性抗體於動物細胞之表現 使用以與實施例4 — 1所示同樣方式調配之dnA溶液， 以與實施例4一 2及4 一 3所示同樣的方式於動物細胞表現， 並回收培養上清。將該樣本保存於4°c直到使用時為止。 〔實施例11〕抗體純化 於以實施例10 — 7所記載之方法得到之丨〇niL培養上清 •内添加 1〇〇μΕ 之 rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences )，並於4°C進行一晚倒轉混合。將 該溶液移 0.22μιη之過濾杯 Ultrafree(R)-MC ( Millipore )，並 以含 0.01%Tween(R)20 之 TBS50(^L清洗 3 次後，將 rProtein A SepharoseTM樹脂懸浮於 ΙΟΟμί之含 0.01 % Tween(R) 20的 1 0 mM HC1，pH2.0 ’並靜置3分鐘後，使抗體溶出。馬上加 入 5pL 之 1M Tris-HCl , pH8.0 中和之。使用 Microplate Manager III ( Bio-Rad Laboretories )軟體，由人類IgG4(參 ® 見人類型化抗TF抗體、WO 99/51743 )之校正曲線算出培 養上清中之人類IgG濃度。抗體濃度依實施例5定量。 〔實施例12〕類F. Villa (活化凝固第VIII因子）活性試驗 雙專一性抗體之類F. Villa活性係以如下之酵素試驗評 價。又，以下之反應全部於室溫進行。將15pg/mL之第IX 因子（Enzyme Research Laboratories ) 10μί 及含 l〇〇mM CaCl2與20mM MgCl2之TBSB 5pL及以實施例10— 7記載之 方法得到之培養上清50μί的混合液於96孔平盤中溫育1小
2125-6598-PF 62 1354676 時。再於該混合液中’添加10 ng/mL之第Xia因子（Enzyme
Research Laboratories) ΙΟμί、50pg/inL之第 X因子（Enzyme Research Laboratories) 20μί、400pg/mL之磷脂質 5μΙ> , 使酵素反應開始。反應30分鐘之後，添加〇.5M EDTA 10μί 使停止。 於各孔中添加呈色基質溶液50μΙ後，以微平盤讀取儀 第 3550 型（Bio Rad Loboratories )測定於 0分、60分在 405nm (參考波長655nm)之吸光度。類f.Villa活性係以抗體表 現培養上清於60分鐘内吸光度變化值減去抗體未表現之培 養上清於60分鐘内之吸光度變化值之值表示（參見第12 圖）。 磷脂質、第Xia因子、第IX因子及第X因子之溶劑使用 TBSB。呈色基質溶液為依所附說明書溶解之測試呈色基質 S-2222 ( Chromogenix )與凝聚胺液（〇·6 mg/L hexadimethrine bromide ( Sigma ))之 1:1 混合液。 〔實施例13〕血漿凝固試驗 為解明依實施例11之方法所調製之雙專一性抗體可回 復血友病A血液之凝固能力，依與實施例7所示同樣之方法 評價（參見第13圖）該抗體對於使用欠缺F.VIII之血漿對活 化部分血栓形成素時間（APTT )之影響。再者，對凝固時 間之縮短效果高之A44/B26、A69/B26，測定濃度依存性（參 見第14圖、第15圖）。 〔實施例14〕雙專一性IgG抗體與f.VIII之併用探討 雙專一性抗體與F.VIII之併用探討係以如下血漿凝固 2125-6598-PF 63 1354676 試驗條件進行評價。將25pg/mL抗體溶液40pL、欠缺 F.VIII之血漿（Bi〇rnerieux) 50μί的混合液於室溫温育30 分鐘。再於該混合液内添加〇 iU/mL之基因重組型第VIII 凝企因子製劑可吉蕊特（R)FS(BAYER) 10μί及APTT試藥 (Dade Behring) 50μί，並於37°C加溫3分鐘。凝固反應係 於該混合液中加入20 ηιΜ之CaCl2 ( Dade Behring) 50μί使 開始。測定 CR-A ( Amelung)從連接之KC10A ( Amelung) 凝固為止之時間（參見第16圖）。 〔實把例1 5〕抑制子血黎中雙專一性I g g抗體之效果 抑制子企漿中雙專一性IgG抗體之效果係依如下之血 裝凝固試驗條件進行評價。將欠缺F.VIII血漿（Bi〇merieux) 5〇pL與l〇(^g/mL抗人類F νιπ中和抗體（Catai〇g
Number:MAB3440、CHEMIC〇N) 1〇吣之混合液於室溫溫 月30刀鐘。將該企漿作為抑制子血漿。於該抑制子丘漿内 添加 25gg/mL抗體溶液 40μΙ^ΑρΤΤ試藥（Dade Behring) 5〇μΙ^，並於3rC加溫3分鐘。凝固反應係藉由在該混合液中 添加 20 mMaaCl2( Dade Behnng ) 5〇叫而開始。測定 cr a (Amelung)從連接之KC1〇A(Amelung)凝固為止之時間 (參見第17圖）。 〔實施例16〕雙專一性抗體之人類化 對實施例1〜7所取得之雙專一性抗體中，血液凝固 時間之縮短效果最高之XB12(小鼠抗第ixa因子抗 體脚〇4(小鼠抗第X因子抗體），依如下方式f施人類化。 1 6 - 1人類抗體之相同性檢索 2125-6598-PF 64 I3M676 從一般公開之 Kabat 資料庫 Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)及 ΙΜΘΤ 資料庫 (http://imgt.cines.fr/)取得人類抗體胺基酸序列資料，並使 用構建之資料庫分成小鼠XB12-H鏈可變區、小鼠xB12-L 鏈可變區、小鼠SB04-H鏈可變區、小鼠SB04-L鏈可變區 進行相同性檢索。其結果，因確認與如下所示人類抗體序 列具有高度相同性，故使用為人類化抗體之框架區（以下稱 為 FR)。 (1) XB12-H 鏈可變區：KABATID-020619 (Kabat 資料庫） (Mariette 等人、Arthritis Rheum. 1993 ; 36 : 1315-1324)
(2) XB12-L 鏈可變區：EMBL Accession No. X61642(IMGT 資料庫） (Mark 等人、J Mol Biol. 1991 ； 222 : 581-597.) (3) SB04-H 鏈可變區：KABATID-025255 (Kabat Database) (Demaison 等人、Immunogetetics 1995 ； 42 : 342-352)
(4) SB04-L 鍵可變區：EMBL Accession No. AB064111(IMGT 資料庫） （未公開資料） 於（1)-(4)之人類抗體的FR移殖各小鼠抗體之互補性抗原 決定區（以下稱CDR )，以製作人類化抗體。 又，使用NCBI所一般公開之相同性檢索網站 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/)，進行與（1)-(4)之 人類抗體具有高度相同性之人類抗體之分泌訊息序列之檢 索。依照檢索’使用所得到之如下所示的分泌訊息序列。 (1 )XB 1 2-H 鏈可變區：GenBank 取得編號 AF062 1 20 2125-6598-PF 65 1354676 (2) XB12-L鏈可變區：GenBank取得編號M74〇i9 (3) SB04-H 鏈可變區：GenBank 取得編號 Bc〇i9337 (4) SB04-L 鏈可變區：GenBank 取得編號 Αγ2〇4756 16—2構建人類化抗體基因表現載體 交互製作12條50個鹽基左右之合成寡DNA，使與編 碼為分泌訊息序列至抗體可變區之胺基酸序列的鹼基序列 其3’末端側約有20個鹽基左右會雜交。再者，與抗體可變 區基因之5,末端側雜交’並與具有Xh〇i切斷序列之引子及 抗體可變區基因之3,末端側雜交，並製作具有Sfn切斷序 列之引子。 將調配為2.5μΜ之合成寡DNA各1μ[混合，並加入 lx TaKaRa Ex Taq 緩衝液，〇.4ιηΜ dNTPs，0.5units TaKaRa
Ex Taq(全為寶酒製造）’將反應液調配為於94t保 溫5分鐘後，以94〇C2分、55t 2分、72^2分之反應為 1循環’進行2循環，並實施各合成寡DNA之組合及延長 反應。其次，添加會雜交於抗體基因之5，末端側及3，末端 側之引子（各10μΜ)1μ[ ’並以94°C 30秒、55°C 30秒、 7 2 C 1分鐘之反應為1循環，進行3 5個循環，於7 2 °C反 應5分鐘，以將抗體可變區基因放大^ pcR後，將全部反 應液供1 %瓊脂膠體電泳之用。將目標長度（約4〇〇bp ) 之放大片段使用QIAquick膠體萃取套組（QIAGEN )，依所 附說明書記載之方法純化’並以無菌水3〇μ1溶出。將該片 丰又用pGEM-T Easy載體系統（promega)，依所附說明書記 2125-6598-PF 66 1354676 載方法進行選殖。各DNA片段之鹼基序列使用BigDye Terminator 循環定序套組（Applied Biosystems )，以 DNA 足序儀 ABI PRISM 3700 DNA Sequencer ( Applied Biosystems)，依所附說明書記載之方法決定。 將已確認為正確人類化抗體可變區基因序列之質體以 Xhol及Sfil分解後，將反應液提供於瓊脂膠體電泳之 用。將目標長度（約400bp)之DNA片段以QIAquick膠 體萃取套組（QIAGEN )，依所附說明書記載之方法純化， 鲁 以無菌水30μ1溶出。又’將實施例3 — 4所製作之四環徽 素誘導型表現質體（pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L)及蜆皮 激素類似體誘導型表現質體（pIND-g4H、pIND-g4L )以 Xhol及Sfil分解後，將含有抗體固定區之片段（約5kb ) 以QIAquick膠體萃取套組（QIAGEN)依所附說明書記載 之方法純化’並以無菌水30μ1溶出。將以Xhol及Sfil分 解之人類化XB 12抗體基因片段（H鏈可變區（以下稱Vh) 及L·鏈可變區（以下稱VL))與以Xhol及Sfil分解之四環黴 籲 素誘導型表現質體（pcDNA4-g4H、pcDNA4-g4L )使用快 速 DNA 連結套組（Rapid DNA Ligation kit)(Roche
Diagnostics) ’依所附說明書記載之方法進行連結反應。 又’將以Xhol及Sfil分解之人類化SB04抗體基因片段（H 鏈可變區及L鏈可變區）與以Xhol及Sfil分解之蜆皮激素 類似體誘導型表現質體（pIND-g4H、pIND-g4L )使用快速 DNA連結套組（Roche Diagnostics)依所附說明書記載之方 法進行連結反應。使用各反應液之一部分對大腸菌DH5a 2125-6598-PF 67 1354676 ♦ 株（東洋紡績）轉形。 16—3人類化雙專一性抗體之調製 使用4種類之人類化抗體表現載體及pcDNA6/TR、 pVgRXR，以實施例4—2、4—2所示之方法對HEK293H 進行基因導入及表現誘導。再者，依實施例8、5所示方法 實施抗體純化及抗體濃度之定量。 16— 4 .人類化雙專一性抗體之活性評價及抗體序列之改變 為評價所調製之人類化雙專一性抗體及嵌合雙專一性 鲁抗體（XB12/SB04)的血漿凝固能力，依實施例7之方法，使 用欠缺F. VIII之血漿，探討抗體對Αρττ之影響。對血液 凝固迠力低落之人類化雙專—性抗體，以活性上升為目 標，改變人類抗體FR。又，對於有熱安定性低落等可能的 XB12抗體VH其CDR3之半胱胺酸殘基，亦改變為精胺酸 殘基。具體而言，使用QuikChange點突變套組 (Stratagene)，依所附說明書記載之方法對人類化抗體表現 載體導入變異。藉由反覆進行FR序列之胺基酸改變及血液 籲凝固能力之評價，以取得具有與XB 1 2/SB04為同等活性之 人類化雙專一性抗體（人類化ΧΒ12抗體（VH:hXB12f A， VL:hXBVL ) / 人類化 SB〇4 抗體（VH:hSB〇4e, VL:hSBVL-；F3f)(第 18 圖）。 產業上之可利用性 藉由本發明，可提供雙專一性抗體，其可辨識酵素及 該酵素基質兩者，並可代替增強酵素活性之輔因子之機能。 本發明之雙專一性抗體於血液中之安定性高，且抗原 2125-6598-PF 68 1354676 性亦低，故可高度期待成為醫藥品。 【圓式之簡單說明】 第1圖表示pcDNA4-g4H之插入區。 第2圖表示pcDNA4-g4L及pIND-g4L之插入區。 第3圖表示pIND-g4H之插入區。 第4圖表示藉由抗F.IXa抗體XB12與抗F.X抗體SB04、 SB21、SB42、SB38、SB30、SB07、SB05、SB06、SB34所 製作之抗F.IXa/抗F.X雙專一性抗體的類F.VIIIa活性測定 • 結果。抗體溶液之濃度為1 Opg/niL(最終濃度1 pg/mL)。結果 為，有9種雙專一性抗體顯示類F.VIIIa活性上升，且活性依 XB12/SB04、XB12/SB21、XB12/SB42、XB12/SB38、 XB12/SB30、XB12/SB07、XB12/SB05、XB12/SB06、 XB12/SB34的順序遞增。 第5圖為藉由抗F.IXa抗體XT04與抗F.X抗體SB04、 SB21、SB42、SB38、SB30、SB07、SB05、SB06、SB34所 製作之抗F.IXa/抗F.X雙專一性抗體及XT04抗體的類 • F.VIIIa活性測定結果。抗體溶液之濃度為lOpg/mL (最終濃 度 lpg/mL)。結果為，XT04/SB04、XT04/SB21、 XT04/SB42、XT04/SB38、XT04/SB30、XT04/SB07、 XT04/SB05、XT04/SB06、XT04/SB34顯示類 F.VIIIa活性上 升。 第6圖表示對第4圖中活性最高的XB12/SB04，於各濃 度下所測定之類F.VIIIa活性之測定結果。結果為， XB12/SB04顯示濃度依存性之類F.VIIIa活性上升。 2125-6598-PF 69 1354676 第 7圖表示於 XB12/SB04、XB12/SB21、XB12/SB42、 XB12/SB38、XB12/SB30、XB12/SB07、XB12/SB05、 XB12/SB06、XB12/SB34存在下之血漿凝固時間（APTT)測 定結果。抗體溶液與欠缺F. VIII之血漿混合後的濃度在 XB12/SB06 為 1.7pg/mL，其餘為 10pg/mL。結果為， XB12/SB04、XB12/SB21、XB12/SB42、XB12/SB38、 XB12/SB30、XB12/SB07、XB12/SB05、XB12/SB06、 XB 12/SB34與抗體不存在下相比較，顯示有凝固時間縮短 • 的效果。 第 8 圖表示於 XT04/SB04、XT04/SB21、XT04/SB42、 XT04/SB38、XT04/SB30、XT04/SB07、XT04/SB05、 XT04/SB06、XT04/SB34存在下，血漿凝固日夺間（APTT)之測 定結果。抗體溶液與欠缺F. VIII之血漿混合後的濃度於 XT04/SB06 為 5pg/mL，其餘為 10pg/mL。結果為， XT04/SB04、XT04/SB21 、XT04/SB42、XT04/SB38、 XT04/SB30、XT04/SB07、XT04/SB05、XT04/SB06與抗體 ® 不存在下相比較，顯示有凝固時間縮短之效果。XT04/SB34 被認為凝固時間沒有縮短。 第9圖表示對第7圖、第8圖中凝固時間（APTT)縮短 效果最高的XB12/SB04，於各濃度下測定凝固時間的結 果。結果為，XB 1 2/SB04顯示濃度依存性之凝固時間縮短 效果。圖中之抗體濃度表示抗體溶液與欠缺F. VIII血漿混 合後之數值。 第10圖表示SB04及SB06之GST-ΑΡ西方墨點法之 2125-6598-PF 70 1354676 結果。對轉印的GST-ΑΡ，1為轉印的GST_AP與SB〇4 ’ 2 為轉印的GST-ΑΡ與SB06, 3為轉印的GST_AP與不含抗 體之樣本反應之結果。結果僅有SB04與GST-ΑΡ檢測出有 結合反應。 第 11 圖表示 pELBGlacI 載體。colElori: ColEl 系質 體複製開始區、flori: fl噬菌體複製開始區、lacI:乳糖抑 制蛋白質編碼、Plac:乳糖促進子、pelBss:大腸菌peiB蛋 白質訊息序列、scFv: —條鏈抗體分子編碼區、gene III: fl _ 嗤函體Genelll蛋白質編碼區、Ampr:安皮西林对受性基 因。Sfi I:限制 Sfi I切斷部位。 第12圖表示使用組合抗 F.ixa抗體 (A19，A25，A31，A38，A39，A40，A41，A44，A50，A69，XB12)與抗 F · X 抗 體
(B2，B5，B9，B10，B1 1，B12，B13，B14，B15，B16，B18，B19，B20，B2 1，B2 3，B25，B26，B2 7，B3 1，B34-1，B3 4-2，B3 5，B3 6，B3 8，B42，SB 04，SB15，SB27)所表現之雙專一性抗體其培養上清之類 ® F.VIIIa活性測定結果。+表示類F.VIIIa活性為0.1以上的 情形。 第 13 圖表示使用組合抗 F.IXa 抗體 (A19，A25，A31，A38，A39，A40，A41，A44，A50，A69，XB12)與抗 F.X 抗 體 (B2，B5，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B18，B19，B20， B21,B23,B25,B26，B27，B3 1，B34-1，B3 4-2，B3 5，B3 6，B3 8，B42 ，SB04，SB15，SB27)所表現之雙專一性抗體其純化物所進行 2125-6598-PF 71 1354676 之血漿凝固試驗結果。與不添加抗體時相比’抗體添加時 之凝固時間縮短10秒〜20秒者以+、20秒〜40秒者以+ +、40秒〜50秒者以+ + +，且50秒以上者以+ + + + 表示。 第14圖表示對第13圖中凝固時間（APTT)之縮短效果 高的A44/B26，於各濃度下所之凝固時間測定結果。不添 加抗體時之凝固時間為11 3秒。結果為，A44/B26顯示濃 度依存性之凝固時間縮短效果。圖中之抗體濃度表示抗體 翁溶液與欠缺F. VIII之血漿混合後的數值。 第15圖表示對第13圖中凝固時間（APTT)縮短效果高 之A69/B26，於各濃度下之凝固時間測定結果。未添加抗 體時之凝固時間為109.6秒。結果為，A69/B26顯示濃度依 存性凝固時間縮短效果。圖中之抗體濃度表示抗體溶液與 欠缺F. VIII之血漿混合後的數值。 第16圖表示於A44/B26或XB12/SB04與F.VIII共存 時之血漿凝固時間（APTT)測定結果。結果為，A44/B26或 • XB12/SB04與F.VIII之混合溶液與F.VIII單獨者相比，顯 示具有凝固時間之縮短效果。 第17圖表示於A44/B26或B12/SB04存在時，抑制劑 血漿之凝固時間（APTT)測定結果。結果為’ A44/B26或 XB12/SB04與不存在抗體時相比較，顯示有凝固時間之縮 短效果。 第18圖表示對XB12/SB04及人類化XB12/人類化 SB04，於各濃度之凝固時間測定結果。未添加抗體時之凝
2125-6598-PF 72 1354676 固時間為111.3秒。測定之結果顯示，人類化XB 12/人類化 SB04與XB12/SB04有同程度之凝固時間縮短效果。圖中 之抗體濃度表示抗體溶液與欠缺F. VIII血漿混合後之數 值。 【主要元件符號說明】 無 • ·
2125-6598-PF 73 1354676 1/103
序列表 <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Bispecific antibody having the ability of substitution for functional protein <130> C1-A0313P3-TW <150> PCT/JP03/13062 <151〉 2003-10-10 <150> PCT/JP03/13123 〈151〉 2003-10-14 <160> 268
<170> Patentln version 3. 1 <210〉 1 <211〉 22 <212〉 DNA 〈213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 1 cagctatgaa atacctattg cc 22 <210〉 2 <211> 23 <212〉 DNA <213> Artificial
<220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence <400> 2 cttttcataa tcaaaatcac egg 23 <210〉 3 <211> 19 <212> DNA <213〉 Artificial <220> 1354676 2/103 <223〉 an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 3 attgcctacg gcagccgct 19 <210〉 4 <211〉 20 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉 <223〉 an artificially synthesized primer se叫ence
〈400〉 4 aaatcaccgg aaccagagcc 〈210〉 5 <211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 5 24
ttactcgcgg cccagccggc catg <210〉 6 <211〉 28 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence 〈400〉 6 ggaattcggc ccccgaggcc cactcacg <210> 7 <211〉 1215
〈212〉 DNA <213> Homo sapiens 28 1354676 3/103 <400〉 7 ggcctcgggg gccagctttc tggggcaggc caggcctgac cttggctttg gggcagggag 60 ggggctaagg tgaggcaggt ggcgccagcc aggtgcacac ccaatgccca tgagcccaga 120 cactggacgc tgaacctcgc ggacagttaa gaacccaggg gcctctgcgc cctgggccca 180 gctctgtccc acaccgcggt cacatggcac cacctctctt gcagcttcca ccaagggccc 240 atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg 300 ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag 420
cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg 540 cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa 600 acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt 660 gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa 720 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcace taccgtgtgg tcagcgtcct 780 caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840
aggcctccce tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc 900 acaggtetgc accctgcccc catcccagga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg 960 gtgcctggtc aaaggcttct accccagcga catceccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga ccacecctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1080 ctacagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg 1200 taaatgagcg gccgc 1215 <210> 8 <210 684 601354676 4/103 <212〉 DNA <213> Homo sapiens 〈400〉 8 ggcctcgggg gccgaattcc taaactctga gggggtcgga tgacgtggcc attctttgcc taaagcattg agtttactgc aaggtcagaa aagcatgcaa agccctcaga atggctgcaa agagctccaa caaaacaatt tagaacttta ttaaggaata gggggaagct aggaagaaac tcaaaacatc aagattttaa atacgcttct tggtctcctt gctataatta tctgggataa gcatgctett ttctgtctgt ccctaacatg ccctgtgatt atccgcaaac aacacaccca agggcagaac tttgttactt aaacaccatc ctgtttgctt ctttcctcag gaactgtggc 120 180 240 300 360
tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtetcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tagagggcgg ccgc 420 480 540 600 660 684
<210〉 9 〈211〉 1215 <212> DNA <213> Homo sapiens <400〉 9 ggcctcgggg gcctcccagg ctctgggcag gcacaggcta ggtgccccta acccaggccc tgcacacaaa ggggcaggtg ctgggctcag acctgccaag agccatatcc gggaggaccc tgcccctgac ctaagcccac cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc tcggacacct tctctcctcc cagattccag taactcccaa tcttctctct gcagcttcca ccaagggccc atccgtcttc cccctggcgc cctgctccag gagcacctcc gagagcacag ccgccctggg 60 120 180 240 300
ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct 360 1354676 5/103 gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag 420 cagcgtggtg accetgccct ccagcagctt gggcacgaag acctacacct gcaacgtaga 480 tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag tccaaatatg gtcccccatg 540 cccaccatgc ccagcacctg agttcctggg gggaccatca gtcttcctgt tccccccaaa 600 acccaaggac actctcatga tctcccggac ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt 660 gagccaggaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg gatggcgtgg aggtgcataa 720 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtt caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct 780 caccgtcctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 840
aggcctcccg tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagagcc 900 acaggtgtac accctecccc catcccagtg cgagatgacc aagaaccagg tcagcctgtc 960 ctgcgcggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 1020 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 1080 cgtgagcagg ctaaccgtgg acaagagcag gtggcaggag gggaatgtct tctcatgctc 1140 cgtgatgcat eaggctctgc acaaccacta cacacagaag agcctctccc tgtctctggg 1200 taaatgagcg gccgc 1215
<210〉 10 <211> 21 <212> DNA <213〉 Artificial 〈220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence <400〉 10 cgcaaatggg cggtaggcgt g 21 <210> 11 〈211〉 18 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉1354676 * 6/103 <223> an artificially synthesized primer sequence <400〉 11 tagaaggcac agtcgagg 18 <210〉 12 <211> 24 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉 <223> an artificially synthesized primer sequence
<400〉 12 24 ctctgaatac tttcaacaag ttac 〈210〉 13 <211> 116 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 13
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr 15 10 15
Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Thr Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Asn Leu Glu 35 40 45
Trp lie Gly Tyr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Glu Asn Gin Phe 65 70 75 80 1354676 7/103
Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Pro Pro Cys Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ala 115
〈210〉 14 <211> 6 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 14
Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr 1 5 <210〉 15 <211> 16
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 15
Tyr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
<210〉 16 〈211〉 6
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 16
Gly Pro Pro Cys Thr Tyr 1 5 <210> 17 <211〉 120 1354676 8/103
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 17
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Asp Tyr Val His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp
lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Asp Gly Lys Thr Lys Tyr Ala Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Asp Lys Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Trp Arg lie Tyr Tyr Gly Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gin
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211〉 5
<212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 18
Asp Asp Tyr Va! His 1 5 1354676 9/103 <210〉 19 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 19
Arg lie Asp Pro Ala Asp Gly Lys Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Asp
<210〉 20 〈211〉 10 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 20
Trp Arg Ile Tyr Tyr Gly Leu Met Asp Tyr 1 5 10
<210〉 21 〈211〉 123 <212〉 PRT 〈213〉 Mus musculus 〈400〉 21
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His 20 25 30
Phe Val Leu His Trp Val Lys Gin Asn Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Ile Gly Tyr lie lie Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 1354676 竭 10/103 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 22 <211〉 5 <212> PRT <213) Mus musculus <400〉 22
His Phe Val Leu His 1 5 <210〉 23 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 23
Tyr lie lie Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 24 〈211〉 13 13.54676 11/103
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 24
Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 25 〈211〉 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 25
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn lie Gin Asp 20 25 30
Asn Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp lie Ser Ser Asn Thr Thr 65 70 75 80
Cys Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Pro Leu Gly Cys Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Va! Thr Va! Ser Ala 115 i 1354676 12/103 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26
Asp Asn Tyr Met His 1 5 <210〉 27 〈211〉 17
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 27
Arg lie Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Gly
〈210〉 28 <211> 7 〈212〉 PRT <213) Mus musculus <400> 28
Pro Tyr Tyr Pro Leu Gly Cys 1 5 〈210〉 29 〈211〉 116 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 29
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15 1354676 13/103
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 20 25 30
Asn Thr lie Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Ser lie Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr 50 55 60
Leu Thr lie Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80
Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Gly 85 90 95
Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210〉 30 <211> 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 30
Glu Asn Thr lie Tyr 1 5 <210> 31 <211> 11
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 31 1354676 14/103
Ser lie Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Asp 1 5 10 <210> 32 <211> 12 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 32
Ser Gly Gly Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr Phe Asp Ser 1 5 10
<210〉 33 <211〉 117
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 33
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Asn Tyr Met His Trp lie Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Arg lie Asp Pro Gly Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Asp Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 1354676 15/103
Cys Ala Ser Pro Tyr Tyr Pro Leu Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115 〈210〉 34 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 34
Asp Asn Tyr Met His 1 5 〈210〉 35 <211〉 17
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 35
Arg lie Asp Pro Gly Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 36 <211> 7 <212> PRT <213〉 Mus musculus <400> 36
Pro Tyr Tyr Pro Leu Gly Tyr 1 5 <210〉 37 <211> 114 1354676 16/103 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Asp Tyr lie His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Arg lie Asp Pro Thr Asn Gly Asn Pro Ala Tyr Ala Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Asp Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser lie Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Thr Gly Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ala <210〉 38 <211> 5
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 38
Asp Asp Tyr Ile His 1 5 1354676 17/103 <210> 39 <210 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 39
Arg lie Asp Pro Thr Asn Gly Asn Pro Ala Tyr Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Asp
〈210〉 40 〈211〉 4 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 40
Ser Phe Ala Tyr 1 <210〉 41 〈211〉 114
<212〉 PRT
<213> Mus musculus <400〉 41
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Asp Tyr Val His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Arg lie His Pro Ala Asn Gly Asn Pro Gin Tyr Ala Pro Lys 1354676 18/103 50 55 60
Phe Gin Asp Lys Ala Thr lie lie lie Gly Thr Ala Ser Asn Thr Thr 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ala <210〉 42 <211> 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 42
Asp Asp Tyr Val His 1 5 <210〉 43 〈211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 43
Arg lie His Pro Ala Asn Gly Asn Pro Gin Tyr Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Asp <210〉 44 <211> 4 1354676 19/103 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 44
Pro Phe Ala Tyr 1 <210> 45 <211〉 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 45
Met Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser 20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu 35 40 45
Trp Met Gly Tyr lie Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80
Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Ala Phe Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ala 115 1354676 嶠 20/103 <210〉 46 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46
Ser Asn Tyr Tyr Trp Asn 1 5 <210〉 47 <211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus <400〉 47
Tyr lie Asn Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15 <210> 48 <211〉 6
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 48
Gly Gly Ala Phe Thr Tyr 1 5
<210> 49 〈211〉 114
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 49
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr lie Thr Asp 20 25 30 1354676 21/103
Asn Lys Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Tyr lie Ser Pro Asn Asn Gly Asp lie Gly Tyr Asn Arg Lys 50 55 60
Phe Arg Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
Cys Ala Arg His Arg Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110
Ser Ala <210〉 50 〈211〉 5
〈212〉 PRT <213> Mus musculus
<400> 50
Asp Asn Lys Met Asp 1 5 <210〉 51 <211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 51
Tyr !!e Ser Pro Asn Asn Gly Asp Me Gly Tyr Asn Arg Lys Phe Arg 15 10 15 1354676 22/103
Asn <210〉 52 <211) 4 <212〉 PRT <213) Mus musculus 〈400〉 52
His Arg Ala Tyr 1
<210> 53 〈211〉 121
〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 53
Met Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr 20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Tyr lie Ser Asn Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr 85 90 95 1354676
Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 54 〈211〉 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 54
Thr Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 55 <211〉 17
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 55
Tyr lie Ser Asn Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 56 <211> 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 56
Gly Gly Tyr Arg Tyr Pro Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 57 <211> 121 1354676 24/103
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 57
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Gin Gin Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Arg lie His Pro Ser Asp Ser Glu Ala Arg Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr lie Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Glu Tyr Pro Ser Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 58 〈211〉 5
〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 58
Ser Tyr Trp Met His 1354676 25/103 <210〉 59 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 59
Arg lie His Pro Ser Asp Ser Glu Ala Arg Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Ser
<210〉 60 <211〉 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 60
Arg Gly Glu Tyr Pro Ser Tyr Thr Met Asp Tyr 1 5 10. <Z10> 61 <211> 119
<212〉 PRT
<213> Mus musculus <400〉 61
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly 1 5 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Thr Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Asn Tyr Asn Gin Lys 1354676 26/103 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Thr Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Phe Gly Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 62 <211> 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 62
Ser Tyr Trp Met His 1 5
<210〉 63 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 63
Thr Phe Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Ser Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 64 <211〉 9 1354676 27/103 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 64
Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Phe Gly Tyr 1 5 <210〉 65 <211> 117 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 65
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Ser Leu lie His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Trp lie Asp Pro Glu Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Ala Pro Arg 50 55 60
Phe Gin Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala lie Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Trp Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser 115 1354676 28/103 <210〉 66 〈211> 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 66
Asp Ser Leu lie His 1 5
<210> 67 〈211〉 17 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 67
Trp Ile Asp Pro Glu Asp Gly Arg Thr Lys Tyr Ala Pro Arg Phe Gin 15 10 15
Asp
<210〉 68 <211> 7 <212〉 PRT 〈213〉 Mus musculus 〈400〉 68
Trp Val Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210〉 69 <211> 123
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 69
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 15 10 15 1354676 29/103
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Asp lie Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Asn Thr Ala
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser His Asp Ala Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
〈210〉 70 <210 5
<212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 70
Asp Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 71 <211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 71 1354676 30/103
Glu lie Asp lie Ser Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 〈210〉 72 〈211〉 13 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 72
Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser His Asd Ala Met Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 73 <211〉 123 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 73
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Met Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Asp lie Ser Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80 1354676 31/103
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asn Val Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 74 <211〉 5
<212> PRT
<213> Mus musculus <400〉 74
Asp Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 75 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 75
Glu lie Asp lie Ser Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 76 〈211〉 13 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 76
Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Asn Val Met Asp Tyr 1 5 10 1354676 32/103 <210> 77 <211〉 123 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 77
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Gly Glu Leu Val Met Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Asp lie Ser Asp Gly His Thr Thr Tyr Asn Gin Glu 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr
Cys Ala Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Val Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 78 <211〉 5 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 78 1354676 33/103
Asp Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 79 〈211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79
Glu lie Asp lie Ser Asp Gly His Thr Thr Tyr Asn Gin Glu Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 80 <211〉 13 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 80
Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser Asn Asp Val Met Asp Tyr 1 5 10
<210〉 81 〈211〉 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 81
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp I3M676 34/103 35 40 45 lie Gly Glu lie Asp lie Ser Asp Ser His Thr Thr Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser His Asp Val Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 82 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 82
Asp Tyr Trp Met His 1 5
<210〉 83 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 83
Glu lie Asp lie Ser Asp Ser His Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 1354676 35/103 <210> 84 <211> 13
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 84
Gly Glu Asp Tyr Asp Gly Ser His Asp Val Met Asp Tyr 1 5 10
<210〉 85 <211> 119 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 85
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30
Ser Trp Met His Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Leu Gly Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys 50 55 60
Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys A!a Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110 1354676 36/103
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210〉 86 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 86
Ser Ser Trp Met His 1 5
<210〉 87 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 87
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe Arg 15 10 15
Asp
<210〉 88 <211〉 9 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 88
Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210〉 89 <211〉 119 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 37/103 <400〉 89
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 20 25 30
Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Asn Gly Asn Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
<210〉 90 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 90
Thr Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 91 <211〉 17 1354676 38/103 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 91
Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Val <210〉 92
〈211〉 9
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 92
Gly Asn Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 <210> 93 <210 119 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 93
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
Leu Gly Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys 50 55 50 1354676 39/103
Phe Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 ^ 95
Cys Ala Arg Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Π5
<210〉 94 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 94
Asp Tyr Tyr Met His 1 5
<210〉 95 <211〉 17 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 95
Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe Arg 15 10 15
Asp 〈210〉 96 <211> 9
<212> PRT <213> Mus musculus 1354676 40/103 <400> 96
Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Leu Asp Tyr 1 5 <210> 97 <211> 118
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 97
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Leu Ser Asn 20 25 30
Asn Trp lie Gin Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Ser Asp Thr lie Asn Tyr Asn Glu Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Ala Ser Ser Asn Thr Ala
Tyr Met Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115 〈210〉 98 <211〉 5 1354676 41/103
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 98
Asn Asn Trp Me Gin 1 5 <210〉 99 <211〉 17 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 99
Glu lie Leu Pro Gly Ser Asp Thr lie Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 100 <211> 8
〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 100
Glu Gly Ala Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210〉 101 <211> 118 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 101
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Ser lie Ser Asn 1354676 42/103 20 25 30
His Trp lie Gin Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Glu lie Leu Thr Gly Ser Asp Thr lie Asn Tyr Asn Glu Lys 50 55 60
Leu Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Glu Gly Ser Ser Trp Phe Ala His Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115 〈210〉 102 〈211〉 5
<212> PRT
<213> Mus musculus 〈400〉 102
Asn His Trp lie Gin 1 5 〈210〉 103 <211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 103
Glu lie Leu Thr Gly Ser Asp Thr lie Asn Tyr Asn Glu Lys Leu Lys 15 10 15 1354676 43/103
Gly <210> 104 <211〉 8
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 104
Glu Gly Ser Ser Trp Phe Ala His 1 5
<210〉 105 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 105
Met Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Trp Ser Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr lie Tyr Asp Pro Lys 50 55 60
Phe Gin Gly Lys Ala Ser lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn lie Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 1354676 44/103
Cys Ala Arg Gly Gly Arg Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 106 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 106
Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210〉 107 〈211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 107
Trp Ser Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr lie Tyr Asp Pro Lys Phe Gin 15 10 15
<210> 108 〈211〉 8
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 108
Gly Gly Arg Arg Ala Met Asp Tyr 1 5 〈210〉 109 1354676 45/103 <211> 119 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 109
Met Glu Val Met Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu
Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80
Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Ser Gly His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 110 <211〉 6 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 110
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn 1 5 1354676
mu s u M 46/103 <210> 111 <211〉 16 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 111
Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15 <210> 112 <211〉 9
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 112
Gly Gly Ser Gly His Ala Met Asp Tyr 1 5 <210〉 <211> <212> <213> <400> 113
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30
Tyr Leu Met His Trp Val Lys Gin Lys Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Phe lie He Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 50 55 60
1354676 47/103
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Val Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210〉 114 <211〉 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 114
Asn Tyr Leu Met His 1 5 <210〉 115 〈211〉 17
<212> PRT
<213> Mus musculus 〈400〉 115
Phe lie lie Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 116 〈211〉 13 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 48/103 <400> 116
Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 117 <211> 128 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> Π7
Met Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Lys Pro Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser 20 25 30
Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Arg Ser Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Thr lie Ser Ser Ala Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe lie lie Ser Arg Asp Asn Leu Lys Asn lie Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg His Glu Ala Ser lie Met lie Thr Thr Gly Arg lie Trp 100 105 110
Ala Trp Phe Gly Asn Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 125 <210〉 118 <211> 5 1354676 49/103
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 118
Ser Asn Ala Met Ser 1 5 <210> 119 〈211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 119
Thr lie Ser Ser Ala Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210> 120 <211〉 18
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 120
His Glu Ala Ser lie Met lie.Thr Thr Gly Arg lie Trp Ala Trp Phe 15 10 15
Gly Asn <210> 121 〈211〉 124 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 121
Met Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 1354676 50/103 15 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg 20 25 30
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Asn Tyr His Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Asp Arg Leu Thr lie Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg His Val Leu Leu Thr Thr lie Gly Tyr Tyr Ala lie Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210〉 122 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 122
Arg Tyr Ala Met Ser 1 5 〈210〉 123 <211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus 1354676 51/103 <400> 123
Thr lie Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Asn Tyr His Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Asp 〈210〉 124 〈211〉 14 〈212〉 PRT <213> Mus musculus
<400〉 124
His Val Leu Leu Thr Thr lie Gly Tyr Tyr Ala lie Asp Tyr 1 5 10 <210> 125 <211〉 124 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 125
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Gly Val Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 20 25 30
Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Thr lie Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Me Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 1354676 52/103
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg His Val Leu Gin Thr Met lie Gly Tyr Tyr Ala Val Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 126 <210 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 126
Arg Tyr Thr Met Ser 1 5 <210〉 127 <211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 127
Thr lie Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 128 〈211〉 14 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 128
His Val Leu Gin Thr Met lie Gly Tyr Tyr Ala Val Asp Tyr 1354676 53/103 1 5 10 <210> 129 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 129
Met Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Arg Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 20 25 30
Tyr Thr Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Thr lie Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Val Arg His Val Leu Gin Thr Thr lie Gly Tyr Tyr Ala Val Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 130 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 54/103 <400〉 130
Arg Tyr Thr Met Ser 1 5 〈210〉 131 <211> 17 <212> PRT 〈213〉 Mus musculus <400> 131
Thr lie Ser Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 15 10 15
Gly <210〉 132 <211> 14 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 132
His Val Leu Gin Thr Thr lie Gly Tyr Tyr Ala Val Asp Tyr 1 5 10
<210> 133 <211〉 124 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 133
Met Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Ala Gly 15 10 15
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg 20 25 30 1354676 55/103
Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp 35 40 45
Val Ala Thr lie Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser 50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ala Gin Asn Thr Leu 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg His Leu Leu Gin Thr Met lie Gly Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 134 <211> 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 134
Arg Tyr Ala Met Ser 1 5
<210> 135 <211> 17
<212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 135
Thr lie Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly 1354676 56/103 <210> 136 <211〉 14
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 136
His Leu Leu Gin Thr Met lie Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10
<210〉 137 <211〉 120 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 137
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Me Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
His Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Phe Asp Thr Thr lie Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Arg Phe Asp Leu Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 1354676 57/103
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 138 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 138
Asp His Asn Met Asp 1 5
〈210〉 139 〈211〉 17
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 139
Asp lie Asn Pro Asn Phe Asp Thr Thr lie Tyr Asn Gin Lys Phe Arg 15 10 15
Gly
<210> 140 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400> 140
Arg Gly Tyr Tyr Arg Phe Asp Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 141 <211> 120 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 58/103 <400> 141
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Phe Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ala Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Lys Arg Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120
<210〉 142 <211〉 5 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 142
Asp Asn Asn Met Asp 1 5 〈210〉 143 1354676 59/103 <211> 17
<212> PRT <213> Mus inusculus <400> 143
Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 〈210〉 144
<211> 11
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 144
Arg Arg Lys Arg Arg Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 145 〈211〉 120 <212> PRT <213> Mus inusculus
<400〉 145
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45
Me Gly Asp Val Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Met Tyr Asn Gin Lys 50 55 60 1354676 60/103
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg lie Arg Arg Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 146 <211〉 5 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 146
Asp Asn Asn Met Asp 1 5
<210〉 147 <211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 147
Asp Val Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Met Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 148 <211> 10 〈212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 61/103 <400> 148
Arg lie Arg Arg Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210〉 149 <211〉 120 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 149
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr lie Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg lie Tyr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 150 1354676 62/103 <211〉 5
<212> PRT <213〉 Mus musculus 〈400〉 150
Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210> 151 〈211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus
<400> 151
Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr lie Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 〈210〉 152 <211> 10
<212> PRT <213> Mus musculus
<400> 152
Arg lie Tyr Tyr Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210〉 153 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 153
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15 1354676 63/103
Ala Ser Vai Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
His Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Val lie Ser Asp Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Leu Arg Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 154 <211> 5
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 154
Asp His Asn Met Asp 1 5 <210> 155 <211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 155
Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Val lie Ser Asp Gin Lys Phe Lys 1354676 64/103 15 10 15
Gly <210〉 156 <211> 10
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 156
Arg Leu Arg Gly Gly Phe Ala Met Asp Tyr
<210> 157 <211> 120 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 157
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr lie Tyr Lys Gin Asn 50 55 60
Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 1354676 65/103
Cys Ala Arg Arg Met Arg Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 158 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Uus musculus
<400〉 158
Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210〉 159 <211〉 17 <212> PRT <213) Mus musculus 〈400〉 159
Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr lie Tyr Lys Gin Asn Phe Lys 15 10 15
Gly <210> 160 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400> 160
Arg Met Arg Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 1354676 66/103 <210> 161 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 161
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Asp lie Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr lie Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 162 <211> 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 162
Asp Asn Asn Met Asp 1354676 67/103 <210〉 163 <211> 17
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 163
Asp lie Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly
<210> 164 <211〉 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 164
Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
<210〉 165 〈211〉 120 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 165
Met Gin Val Gin Leu Lys Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Thr Pro Gly 15 10 15
Thr Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu 丫rp 35 40 45 1354676 68/103 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ala Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Val Arg Arg Gly Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 〈210〉 166 〈211〉 5 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 166
Asp Asn Asn Met Asp 1 5
<210> 167 〈211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 167
Asp lie Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 1354676 69/103 <210〉 168 <211> 10 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 168
Arg Val Arg Arg Gly Tyr His Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 169 <211> 122 <212〉 PRT <213> Mus musculus
<400〉 169
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Arg Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 20 25 30
Asn Ala Leu Tyr Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly lie lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Gly Arg Gly Gin Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1354676 70/103 115 120 <210> 170 <211> 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 170
Glu Asn Ala Leu Tyr 1 5
<210〉 171 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 171 lie lie Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Asp
〈210〉 172 <211> 12 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 172
Ser Gly Gly Arg Gly Gin Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 173 〈211〉 118 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 173 1354676 71/103
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser 20 25 30
Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 174 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 174
Ser Tyr Trp Met Gin 1 5 <210〉 175 〈211〉 17
<212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 72/103 <400〉 175
Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 176 〈211〉 8
〈212〉 PRT <213> Mus musculus
<400〉 176
Asp Gly Tyr Asp Leu Phe Ala Tyr 1 5 <210〉 177 〈211〉 118 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 177
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Are Pro Gly
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30
Tyr Trp Met Gin Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp lie Arg lie Thr Gin Lys 50 55 60
Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 1354676 73/103
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Asp Gly Tyr Asp Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210〉 178
〈211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 178
Asn Tyr Trp Met Gin 1 5 <210> 179 〈211〉 17 <212〉 PRT <213> Mus musculus
〈400〉 179
Ala lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp lie Arg lie Thr Gin Lys Phe Arg 15 10 15
Gly 〈210〉 180 〈211〉 8 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 180 1354676 74/103
Asp Gly Tyr Asp Leu Phe Ala Tyr 1 5 〈210〉 181 <211〉 117 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 181
Met Asp Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 15 10 15
Gin Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser 20 25 30
Gly Tyr Tyr Leu Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly His Lys Leu Glu 35 40 45
Trp Met Gly Tyr lie Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Lys Asn Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe 65 70 75 80
Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Ser Phe Phe Tyr Gly Lys His Asp Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 182 <211> 6 <212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 75/103 <400> 182
Ser Gly Tyr Tyr Leu Asn 1 5 <210〉 183 <211〉 16
<212> PRT <213> Mus rousculus <400〉 183
Tvr lie Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn
<210〉 184 〈211〉 7
<212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 184
Phe Phe Tyr Gly Lys His Asp 1 5 <210〉 <211> 〈212> <213〉
5 5 -— 8 1 R
Mu us <400〉 185
Met Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg 20 25 30
Ser Trp Met Asn T卬 Val Lys G!n Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 1354676 76/103 lie Gly Trp ILe-Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115 <210〉 186 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 186
Arg Ser Trp Met Asn 1 5
〈210〉 187 <211> 17
<212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 187
Trp Ile Tyr Pro Gly Asp. Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15
Gly 1354676 77/103 <210〉 188 <211〉 5
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 188
Gly Gly Leu Asp Tyr 1 5 <210〉 189 〈211〉 119 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 189
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ser Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Arg 20 25 30
Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45
lie Gly Gin lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Arg Gly Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 1151354676 78/103 <210> 190 <211〉 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 190
Arg Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 191
<211〉 17
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 191
Gin lie Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 192
<211〉 9
〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 192
Gly Arg Gly Tyr Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 193 <211〉 120 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 193 1354676 79/103
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys lie Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp He Asp Pro Asn Asn Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Pro Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
〈210〉 194 <211> 5 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 194
Asp Tyr Asn Met Asp 1 5 <210〉 195 <211> 17
<212> PRT <213> Mus musculus 1354676 80/103 <400〉 195
Asp lie Asp Pro Asn Asn Gly Gly Ala Leu Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 196 <211> 10
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 196
Arg Pro Val Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 > > > > 0 12 3 1— 4— 1» II 2 2 2 2 NZ < < < 7 ο T s 9 2 R u us <400> 197
Met His Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly
Ala Ser Val Lys lie Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 20 25 30
Asn Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Asp lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr lie Tyr Asn Gin Lys 50 55 60
Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75 80 1354676 81/103
Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Gly Arg Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 198 <211〉 5 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 198
Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210〉 199 <211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus
<400〉 199
Asp lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr lie Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 200 <211> 10 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 200 1354676 82/103
Arg Gly Tyr Tyr Gly Arg Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 201 <211〉 117 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 201
Met Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp 20 25 30
Asp Tyr Met His Trp Val Asn Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 lie Gly Trp He Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys 50 55 60
Phe Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala 65 70 75 80
Tyr Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95
Cys Thr Tyr Gly lie Tyr Val Arg Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 202 <211> 5
<212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 83/103 <400〉 202
Asp Asp Tyr Met His 1 5 <210> 203 〈211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 203
Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe Gin
Gly <210〉 204 〈211〉 7
〈212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 204
Gly Ile Tyr Val Arg Gly Tyr 1 5
<210〉 205 〈211〉 107 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 205
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala 20 25 30 1354676 84/103
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Leu Cys Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr lie Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 206 <211> 11
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 206
Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10
<210〉 207 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 207
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 〈210〉 208 <211> 8
<212> PRT <213> Mus musculus 1354676 85/103 <400> 208
Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr lie Thr 1 5 <210〉 209 <211> 108 <212〉 PRT <213〉 Mus musculus <400〉 209
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ala Leu lie 35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Asn Val Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 210 <211〉 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus 1354676 86/103 <400> 210
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 211 〈211〉 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 211
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5
<210〉 212 〈211〉 9 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 212
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210〉 213 <211〉 107 〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 213
Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr lie 20 25 30
Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp lie Phe 35 40 45 1354676 87/103
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Phe Ser Ser Ser Pro Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105
<210> 214 <211〉 10 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 214
Arg Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr lie Tyr 1 5 10
<210〉 215 <211〉 6 <212〉 PRT <213) Mus musculus <400〉 215
Thr Ser Asn Leu Ala Pro 1 5 <210〉 216 <211〉 9
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 216
Gin Gin Phe Ser Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 1354676 88/103 <210〉 217 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 217
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30
Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
lie Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Leu Cys Gin Gin 85 90 95
Tyr Tyr Arg Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys Arg <210> 218 <211〉 17
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 218 1354676 89/103
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210〉 219 <211〉 7
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 219
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
〈210〉 220 〈211〉 9
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 220
Gin Gin Tyr Tyr Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5
<210〉 221 <211〉 18 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉
<221> CDS <222> (1).. (18) <223〉 <400> 221 agt ggt tat tac tgg acc 18
Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr 1 5 1354676 90/103 <210〉 222 <211> 6 <212> PRT <213〉 Mus musculus <400〉 222
Ser Gly Tyr Tyr Trp Thr 1 5 <210〉 223 <211〉 48 <212> DNA <213> Mus musculus
<220〉 <221〉 CDS <222〉⑴..（48) <223〉 〈400〉 223 tac ata tcc ttc gac ggt acc aat gac tac aac cca tct etc aaa aat Tyr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15 〈210〉 224 <211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus <400> 224
Tyr lie Ser Phe Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn 15 10 15 <210〉 225 <211> 18 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220>
<221〉 CDS <222〉⑴..⑽ <223〉 1354676 91/103 Η <400〉 225 ggc ccc ccc tgt act tac 18
Gly Pro Pro Cys Thr Tyr 1 5 〈210〉 226 <211〉 6 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 226
Gly Pro Pro Cys Thr Tyr
<210〉 227 <211> 30
<212〉 DMA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 CDS <222〉（1)..(30) <223〉 <400> 227 30
agg gcc acc tea agt gta aat tac att tac Arg Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr lie Tyr 1 5 10 <210〉 228 <211> 10
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 228
Arg Ala Thr Ser Ser Val Asn Tyr lie Tyr 1 5 10 <210> 229 <211〉 18 1354676 92/103
V
<212> DNA <213> Mus musculus <220〉
<221> CDS <222〉⑴.·（18) <223〉 <400〉 229 aca tcc aac ctg get cct 18
Thr Ser Asn Leu Ala Pro 1 5 <210〉 230
<211> 6
〈212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 230
Thr Ser Asn Leu Ala Pro 1 5 <210> 231 <211〉 27
<212> DNA <213> Mus musculus
〈220〉 <221〉 CDS 〈222〉（1).· (27) <223〉 〈400〉 231 cag cag ttt tet agt tcc cca tgg aeg Gin Gin Phe Ser Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 232 <211〉 9
<212> PRT <213> Mus musculus <400> 232 27 1354676 93/103
Gin Gin Phe Ser Ser Ser Pro Trp Thr 1 5 <210〉 233 <211) 15
<212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 CDS <222〉⑴..（15) <223〉
15
<400〉 233 cac ttt gtt ttg cac His Phe Val Leu His 1 5 〈210〉 234 <211〉 5 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 234
His Phe Val Leu His 1 5
<210〉 235 <211> 48 〈212〉 DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222〉⑴..（48) <223> <400〉 235 tat att att cct tac aat gat ggt act aag tac aat gag aag ttc aaa 48
Tyr Me Me Pro Tyr Asn Asp G!y Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15 1354676 94/103 <210〉 236 <211〉 16 <212〉 PRT <213> Mus musculus 〈400〉 236
Tyr lie lie Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 15 10 15 <210〉 237 <211> 39 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 (39) <221> CDS 〈222〉(1). <223> <400> 237 ggg aat agg tac gac gta ggt tcc tat get atg gac tac Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 > > > > o -— 2 3 An 1— 1 11 2 2 2 2 < < < < 238 13
PRT
Mus musculus <400> 238
Gly Asn Arg Tyr Asp Val Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 239 <211〉 51
〈212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221> CDS <222〉 (1).. (51) <223>1354676 95/103 <400> 239 aag tcc agt cag age ett tta tat agt age aat caa aag aac tac ttg Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15 gcc
Ala
<210〉 240 〈211〉 17 <212> PRT <213) Mus musculus 〈400〉 240
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala
<210> 241 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus 〈220〉 <221〉 CDS <222〉⑴..（21) <223〉 <400> 241 tgg gca tcc act agg gaa tet Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 242 <211〉 7 <212) PRT <213> Mus musculus 1354676 96/103 <400> 242
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 243 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <220 CDS <222> (1).. (27)
<223〉 〈400〉 243 27 cag caa tat tat agg ttt ccg tac acg Gin Gin Tyr Tyr Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5 〈210〉 244 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 244
Gin Gin Tyr Tyr Arg Phe Pro Tyr Thr 1 5
<210〉 245 <211> 15 〈212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221〉 CDS 〈222〉〇)·_ (15) <223〉 〈400〉 245 age tcc tgg atg cac 15
Ser Ser Trp Met His 1354676 97/103 1 5 <210> 246 <211> 5 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 246
Ser Ser Trp Met His 1 5 <210〉 247
<211> 51
<212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221> CDS <222〉⑴·.（51) <223〉 <400〉 247 tac att aat cct age agt ggt tat act aag tac aat egg aag ttc agg 48
Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe Arg
<210〉 248 <211> 17 <212) PRT
1 5 10 15 gac 51 Asp <213〉 Mus musculus <400> 248
Tyr lie Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Arg Lys Phe Arg 15 10 15
Asp 1354676 98/103 <210> 249 <211> 27
<212〉 DNA <213> Mus muscuius <220〉 <221〉 CDS 〈222> ⑴..（27) <223> <400> 249 ggg ggt aac ggt tac tac ttt gac tac Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
27 <210> 250 <211〉 9
<212> PRT <213> Mus muscuius <400〉 250
Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210〉 251 <211> 33 <212〉 DNA <213> Mus muscuius <220〉 <220 CDS <222〉（1)..(33) <223〉 <400> 251 aag gcc agt cag gat gtg ggg act get gta gcc 33
Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210〉 252 <211〉 11 1354676 99/103
<212> PRT <213> Uus musculus 〈400〉 252
Lys Ala Ser Gin Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210〉 253 <211〉 21 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉
<221> CDS <222〉(1).. (21) <223> <400> 253 tgg gca tcc acc egg cac act Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 〈210〉 254 <211> 7
<212> PRT <213> Mus musculus
<400〉 254
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 〈210〉 255 〈211〉 24
<212> DNA <213> Mus musculus <220〉 〈221〉 CDS <222〉⑴..（24) <223〉 〈400〉 255 135-4676 100/103 cag caa tat age aac tat ate aeg 24
Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr lie Thr 1 5 〈210〉 256 <211〉 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400〉 256
Gin Gin Tyr Ser Asn Tyr lie Thr 1 5
<210> 257 〈211〉 15
<212> DNA <213> Mus musculus 〈220〉 〈221〉 CDS <222〉⑴..（15) 〈223〉 <400〉 257 gac aac aac atg gac 15
Asp Asn Asn Met Asp 1 5
<210> 258 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 258
Asp Asn Asn Met Asp 1 5 <210〉 259 <211〉 51 <212〉 DNA <213〉 Mus musculus 1354676 r 101/103 <220〉 <221> CDS <222〉⑴._ (51) <223> <400> 259 gat att aat act aaa agt ggt ggt tct ate tac aac cag aag ttc aag 48
Asp lie Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15 ggc 51
Gly
〈210〉 260 〈211〉 17 <212> PRT <213> Mus musculus 〈400〉 260
Asp lie Asn Thr Lys Ser Gly Gly Ser lie Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly
<210〉 261 <211〉 30 <212〉 DNA <213> Mus musculus <220〉 <221> CDS <222〉⑴_· (30) <223〉 〈400〉 261 agg agg age tac ggc tac tac ttt gac tac 30
Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10
1354676 4 I 102/103 <210> 262 <211〉 10 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 262
Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210〉 263 <211〉 33
<212〉 DNA <213> Mus musculus
〈220〉 <221> CDS <222〉⑴ _.(33) <223〉 〈400〉 263 aag gcc agt cag aat gtg ggt act get gta gcc Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10
〈210〉 264 〈211〉 11 <212〉 PRT <213> Mus musculus <400〉 264
Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210> 265 <210 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220〉 <221> CDS <222> (1).. (21) <223〉 1354676 103/103 <400> 265 teg gca tee tac egg tac agt 21
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 266 <211> 7
<212〉 PRT <213> Mus musculus <400> 266
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 〈210〉 267 <211〉 27 <212) DNA <213> Mus musculus <220〉 〈221〉 CDS <222〉⑴ _.(27) 〈223〉 <400〉 267 cag caa tat aac age tat cct etc aeg Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 268 <211> 9
<212> PRT <213> Mus musculus <400〉 268
Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 27

Claims (1)

1354676謂娜8號 i 一一· —>公告另 100年10月18日修正替換頁 十、申請專利範圍： 1.一種雙專一性抗體’其可辨識第IX凝血因子及/或活 化第IX凝血因子與第X凝血因子， 其中，該抗體包括含有下述（A)及（B)的互補性決定區 (CDR)： (A) 下述（al)〜(a3)任一項之抗第ix/ixa凝血因子抗體的Η鏈 CDR及下述（bl)或（b2)的L鏈CDR之胺基酸序列； (B) 下述（cl)〜(cl 0)任一項之抗第X凝血因子抗體的η鏈CDR ^ 及下述（dl)或（d2)的L鏈CDR之胺基酸序列： (al ) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：μ、15、16之胺 基酸序列， (a2) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：18、19、2〇之胺 基酸序列， (a3 ) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：86、87、88之胺 基酸序列，
(bl ) L鏈 CDR1，2, 之胺基酸序列， (b2) L 鏈 CDR1，2, 之胺基酸序列， 3分別為序列識別號：206、207、208 3分別為序列識別號：214、215、216 (cl) Η鍵CDR1,2，3分別為序 基酸序列， 列識別號：22、23、24之胺 為序列識別號：2 6、2 7、2 8之胺 (c2) Η 鏈 CDR1，2, 3 分別 基酸序列， (c3) Η鏈CDR1，2, 3分别 為序列識別號：3 0、3 1、3 2之胺 2125-6598-PF2 1354676綱麵號 Γ% *'7' —j本丨 100年10月18日修正替換頁 基酸序列， (c4) Η鏈CDR1，2, 3分別為序 基酸序列， (c5) Η鏈CDR1，2,3分別為序 基酸序列， 列識別號：34、35、36之胺 列識別號：38、39、40之胺 (c6) Η鍵CDR1，2，3分別兔严 〜為序列識別號：42、43、44之胺 基酸序列， (c7) Η鏈CDR1, 2’ 3分別為序列識別號：46、47、48之胺 # 基酸序列， (c8 ) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：％、51、52之胺 基酸序列， (c9) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：54、55、％之胺 基酸序列， (clO) Η鍵CDR1，2, 3分別為序列識別號：162、163、ι64 之胺基酸序列， (dl ) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號：21〇、211、212 Φ之胺基酸序列’ (d2) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號：218、219、22〇 之胺基酸序列’ 其中’該抗體機能性代替第νιπ凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子。 2. —種雙專一性抗體’其可辨識第lx凝血因子及/ 或活化第IX凝血因子與第X凝血因子，其中該抗體包括： (Α)包含序列識別號：13、17、85、205或213之胺基酸 2 2125-6598-PF2 1354676 第。™ I公告本丨 100年10月18日修正替換頁 序列的抗弟IX/IXa凝血因子的抗體可變區及 (B)包含序列識別號：21、25、29 ' 33、37、41、45、 49、53、161、209或217之胺基酸序列的抗第χ凝血因子 的抗體可變區， 其中，該抗體機能性代替第νπι凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子。 3. —種組合物’包含申請專利範圍第1或2項之抗體及 藥學上可容許之載體。 4. 如申請專利範圍第3項之組合物，其係用於預防及/ 或治療出血、伴隨出血之疾病或因出血引起之疾病的醫藥 組合物，其中出血 '伴隨出血之疾病或因出血引起之疾病 為因第νπι凝血因子及/或活化第νιπ凝血因子之活性低落 乃至於缺損而發病或惡化的疾病。 5·如申請專利範圍第4項之組合物，其中因第νιπ凝 血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性低落乃至於缺損而 發病或惡化的疾病為血友病。 6.如申請專利範圍第4項之組合物，其中因第νιπ凝 血因子及/或活化血液凝固第νπι因子之活性低落乃至於缺 損而發病或惡化的疾病為對於第VIII凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子出現抑制子的疾病。 7·如申請專利範圍第4項之組合物，其中因第VIII凝 血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性低落乃至於缺損而 發病或惡化的疾病為後天性血友病。 8_如申凊專利範圍第4項之組合物，其中因第VIII凝 3 2125-6598-PF2 1354676 第 093130368 號 公告本 100年10月18日修正替換頁 血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性低落乃至於缺損而 發病或惡化的疾病為類血友病。 9. 一種使用法，係將申請專利範圍第丨或2項之抗體使 用於製造申請專利範圍第3項〜第8項任一項之組合物。 1 〇· —種用於預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病或 因出血引起之疾病的套組’其至少包含申請專利範圍第1 或2項之抗體或申請專利範圍第3項之組合物。 11. 一種用於預防及/或治療出血、伴隨出血之疾病或 ^ 因出血引起之疾病的套組，其至少包含申請專利範圍第1 或2項之抗體或申請專利範圍第3項之組合物，且含有第 VIII凝血因子。 12. —種雙專一性抗體，其可辨識第lx凝血因子及/或 活化第IX凝也因子與第X凝血因子，其中該抗體為： (A)連接第IX/ixa凝血因子的相同抗原結合部位之具有 下述（al)〜（a3)任一項的Η鏈CDR及下述（bl)或（b2)的L键 CDR之抗體，及 • (B)連接第X凝血因子的相同抗原結合部位之具有下述 〇1)〜（。10)任一項的11鏈〇〇11及下述（£11)或（(12)的1^鏈（：1^ 之抗體： (a 1 ) Η鏈CDR 1，2，3分別為序列識別號：丨4、丨5、丨6之胺 基酸序列， (a2 ) Η鏈CDR1，2, 3分別為序列識別號：18、19、2〇之胺 基酸序列， (a3) Η鏈CDR1，2,3分別為序列識別號：86、87、88之胺 2125-6598-PF2 4 1354676 第 093130368 號
100年10月18日修正替換頁
基酸序列， (bl) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號 之胺基酸序列， (b2) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號 之胺基酸序列， (cl ) Η鍵CDR1，2, 3分別為序列識別號： 基酸序列， (c2) Η鍵CDR1，2, 3分別為序列識別號： 基酸序列， (c3) Η鍵CDR1，2,3分別為序列識別號： 基酸序列， (C4) Η鍵CDR1，2,3分別為序列識別號： 基酸序列， (C5) Η鏈CDR1，2,3分別為序列識別號: 基酸序列， (c6 ) Η鏈CDR1，2，3分別岌卢 . 引為序列識別號： 基酸序列， (c7 ) Η 鍵 CDR1，2，3 分別泛— 刀別為序列識別號： 基酸序列， (c8) Η 鏈 CDR1，2, 3 分別 Α ^ 引為序列識別號： 基酸序列， (c9) Η鏈CDR1，2, 3分別发十 t 引為序列識別號： 基酸序列， cl〇) Η鏈CDR1，2,3分別為序 2125-6598-PF2 列識別號 ：206 ' 207 ' 208 ：214 ' 215 > 216 22、23、24之胺 26 ' 27、28之胺 30、31、32之胺 34、35、36之胺 38、39、40之胺 42 ' 43、44之胺 46、47、48之胺 50、51、52之胺 54、55、56之胺 ：162 ' 163 ' 164 5 I---------------, 座丨 1354676 100年10月18日修正替換頁 第 093130368 號 之胺基酸序列 (d 1 ) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號：2 i 〇、2】i、2丄2 之胺基酸序列， (d2) L鏈CDR1，2，3分別為序列識別號：218、219、22〇 之胺基酸序列， 其中，該抗體機能性代替第νπι凝血因子及/或活化第 VIII凝血因子。 13. —種雙專一性抗體，其可辨識第ιχ凝血因子及/ • 或活化第ΙΧ凝血因子與第χ凝血因子，其中該抗體為： (Α)連接第IX/IXa凝血因子的相同抗原結合部位之具有 包含序列識別號.13、17、85、205或213之胺基酸序列 的可變區之抗體，及 (B)連接第X凝血因子的相同抗原結合部位之具有包含 序列識別號：21、25、29、33、37、4卜 G、49、Η、161、 209或217之胺基酸序列的可變區之抗體， 其中，該抗體機能性代替第VIII凝血因子及/或活化第 零 VIII凝血因子。 14. 一種組合物，包含申請專利範圍第12或13項之 抗體及藥學上可容許之載體。 15. 如申請專利範圍帛14,之組合物，其係用於預防 及/或治療出血、伴隨出血之疾病或因出血引起之疾病的醫 藥組合物，其中出血、伴隨出血之疾病或因出血引起之疾 病為因第VIII凝血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性 低落乃至於缺損而發病或惡化的疾病。 2125-6598-PF2 6 1354676 第 〇™ 本丨100年10月18日修正替換頁 16.如申請專利範圍第15項之組合物，其中因第VIII 凝血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性低落乃至於缺 損而發病或惡化的疾病為血友病。 17.如申請專利範圍第15項之組合物，其中因第VIII 凝血因子及/或活化血液凝固第νπΙ因子之活性低落乃至於 缺損而發病或惡化的疾病為對於第VIII凝血因子及/或活化 第VIII凝血因子出現抑制子的疾病。 18.如申請專利範圍第15項之組合
凝血因子及/或活化第VIII凝血因子之活性低落乃至於缺損 而發病或惡化的疾病為後天性血友病。 19. 如申明專利範圍第15項之組合物，其中因第mu 凝血因子及/或活化第彻凝血因子之活性滅乃至於缺損 而發病或惡化的疾病為類血友病。 、 20. —種使用法，係蔣主 ’、申吻專利範圍第12或13項之枋 :使用於製造^專利範圍第14項〜第19項任—項之^
……預防及/或治療出血、伴隨出血 因出血引起之疾病的套組，龙 、’ -¾ 1，= '、主v包含申請專利範11坌 或13項之抗體或申請專 ”乾圍第 札固第項之組合物。 22. —種用於預防及/或 因出血引起之疾病的套組，龙至、伴隨出血之疾病 或13項之抗體或巾請專利範圍第；;包含W專利範圍第 VIII凝血因子。 項之組合物，且含有 2125-6598-PF2
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Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080050367A1 (en) 1998-04-07 2008-02-28 Guriq Basi Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide
TWI239847B (en) 1997-12-02 2005-09-21 Elan Pharm Inc N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease
GB0300571D0 (en) * 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
WO2004111233A1 (ja) * 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
WO2005035754A1 (ja) * 2003-10-14 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
US8187595B2 (en) 2004-05-07 2012-05-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I
EP1797182A2 (en) * 2004-10-05 2007-06-20 Wyeth a Corporation of the State of Delaware Methods and compositions for improving recombinant protein production
PE20061329A1 (es) 2004-12-15 2006-12-08 Neuralab Ltd Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
WO2006109592A1 (ja) * 2005-04-08 2006-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血液凝固第viii因子の機能代替抗体
US11046784B2 (en) 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
JP2009274958A (ja) * 2006-08-31 2009-11-26 Nara Prefecture 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の活性化を促進する抗体
US9624309B2 (en) 2007-08-15 2017-04-18 Bayer Intellectual Property Gmbh Monospecific and multispecific antibodies and method of use
US9096651B2 (en) 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
EP3415529B1 (en) 2007-09-26 2020-11-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant region
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
EP2236604B1 (en) 2007-12-05 2016-07-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-nr10 antibody and use thereof
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
UA103032C2 (uk) * 2008-08-06 2013-09-10 Елі Ліллі Енд Компані Селективні антитіла проти гепсидину-25 та їх застосування
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
US9067981B1 (en) 2008-10-30 2015-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Hybrid amyloid-beta antibodies
KR101940059B1 (ko) * 2008-12-19 2019-01-18 마크로제닉스, 인크. 공유결합형 디아바디 및 이의 용도
TWI544077B (zh) 2009-03-19 2016-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody constant region change body
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
WO2010131733A1 (ja) 2009-05-15 2010-11-18 中外製薬株式会社 抗axl抗体
RU2595409C2 (ru) * 2009-09-03 2016-08-27 Мерк Шарп И Доум Корп., Анти-gitr-антитела
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
AR080428A1 (es) 2010-01-20 2012-04-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos
EP2543730B1 (en) 2010-03-04 2018-10-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
JO3330B1 (ar) 2010-06-10 2019-03-13 Lilly Co Eli الأجسام المضادة cgrp
HUE038305T2 (hu) 2010-11-17 2018-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A VIII vérkoagulációs faktor mûködésére alternatív funkciójú multispecifikus antigén-kötõ molekula
TWI812066B (zh) 2010-11-30 2023-08-11 日商中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
CA2817448C (en) 2010-12-23 2019-01-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Binding agent
CN103384831B (zh) * 2010-12-23 2016-02-10 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过二价结合剂来检测多肽二聚体
WO2012085064A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 Roche Diagnostics Gmbh Detection of a posttranslationally modified polypeptide by a bi-valent binding agent
JP5766296B2 (ja) 2010-12-23 2015-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用
EP3539991A1 (en) 2011-01-07 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for improving physical properties of antibody
AU2012222252B2 (en) 2011-02-25 2016-08-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIb-specific Fc antibody
EP2762493B1 (en) 2011-09-30 2021-06-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
WO2013065708A1 (ja) 2011-10-31 2013-05-10 中外製薬株式会社 重鎖と軽鎖の会合が制御された抗原結合分子
PL2821415T3 (pl) * 2012-02-29 2021-07-05 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Przeciwciało przeciwko lipoarabinomannanowi i test immunologiczny do oznaczania zakażenia kwasoopornymi prątkami przy użyciu tego przeciwciała
KR102494534B1 (ko) 2012-03-14 2023-02-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 다중특이성 항원-결합 분자 및 그것의 용도
CA2881966C (en) 2012-08-24 2020-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
CN104768975A (zh) * 2012-08-31 2015-07-08 北卡罗来纳大学教堂山分校 用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(igf-1)的单克隆抗体
RU2683933C2 (ru) * 2012-09-28 2019-04-03 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ для оценки реакции коагуляции крови
PT3050896T (pt) 2013-09-27 2021-08-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Processo para a produção de heteromultímeros de polipéptidos
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
TW201625299A (zh) 2014-06-20 2016-07-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 用於因第ｖｉｉｉ凝血因子及／或活化的第ｖｉｉｉ凝血因子的活性降低或欠缺而發病及／或進展的疾病之預防及／或治療之醫藥組成物
GB201412658D0 (en) 2014-07-16 2014-08-27 Ucb Biopharma Sprl Molecules
TWI701435B (zh) * 2014-09-26 2020-08-11 日商中外製藥股份有限公司 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
TWI700300B (zh) * 2014-09-26 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
KR102650420B1 (ko) 2014-12-19 2024-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
SG10201907215QA (en) 2015-02-05 2019-09-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies Comprising An Ion Concentration Dependent Antigen-Binding Domain, Fc Region Variants, Il-8-Binding Antibodies, And Uses Therof
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
CA2978038A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies
JP2018123055A (ja) * 2015-04-24 2018-08-09 公立大学法人奈良県立医科大学 血液凝固第ｖｉｉｉ因子（ｆｖｉｉｉ）の機能を代替する多重特異性抗原結合分子を含有する、血液凝固第ｘｉ因子（ｆｘｉ）異常症の予防および／または治療に用いられる医薬組成物
US11191844B2 (en) 2015-07-06 2021-12-07 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
GB201601073D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
GB201601077D0 (en) 2016-01-20 2016-03-02 Ucb Biopharma Sprl Antibody molecule
IL258088B2 (en) 2015-09-18 2024-02-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibodies that bind to IL-8 and their uses
GB201521382D0 (en) 2015-12-03 2016-01-20 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
EP3395835B1 (en) 2015-12-25 2021-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody having enhanced activity, and method for modifying same
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
EP3398965A4 (en) 2015-12-28 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION
WO2017136820A2 (en) 2016-02-06 2017-08-10 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
TW201735947A (zh) 2016-03-14 2017-10-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
EP3448891A1 (en) 2016-04-28 2019-03-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
MX2018012648A (es) 2016-04-28 2019-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparaciones que contienen anticuerpos.
CA3029003A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
AU2017303205A1 (en) 2016-07-29 2019-01-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Bispecific antibody exhibiting increased alternative FVIII-cofactor-function activity
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
JP7125932B2 (ja) 2016-09-06 2022-08-25 中外製薬株式会社 凝固第ｉｘ因子および／または活性化凝固第ｉｘ因子ならびに凝固第ｘ因子および／または活性化凝固第ｘ因子を認識する二重特異性抗体の使用法
AU2017363309A1 (en) 2016-11-23 2019-07-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Mono- and bispecific antibodies binding to coagulation factor IX and coagulation factor X
KR20190133230A (ko) 2017-03-31 2019-12-02 고리츠다이가쿠호징 나라켕리츠 이카다이가쿠 혈액 응고 제viii 인자의 기능을 대체하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 함유하는, 혈액 응고 제ix 인자 이상증의 예방 및/또는 치료에 이용되는 의약 조성물
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
BR112020005834A2 (pt) 2017-09-29 2020-09-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha molécula multiespecífica de ligação ao antígeno tendo atividade de substituição de função de cofator do fator viii de coagulação sanguínea (fviii), e formulação farmacêutica contendo a referida molécula como ingrediente ativo
MA50534A (fr) 2017-11-01 2020-09-09 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Variant d'anticorps et isoforme à activité biologique réduite
JP2021502984A (ja) * 2017-11-15 2021-02-04 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｆｘ活性化を促進する第ｘ因子結合剤
US20210231654A1 (en) 2018-06-04 2021-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for detecting complex
FR3082427B1 (fr) 2018-06-14 2020-09-25 Lab Francais Du Fractionnement Combinaison de facteur vii et d'un anticorps bispecifique anti-facteurs ix et x
US11220554B2 (en) 2018-09-07 2022-01-11 Novo Nordisk A/S Procoagulant antibodies
US11009507B2 (en) 2018-09-14 2021-05-18 University Of New England Methods and diagnostics for cancer detection and treatment monitoring
HRP20220088T1 (hr) 2018-12-21 2022-04-15 Kymab Limited Dvojno-specifično fixaxfx antitijelo sa zajedničkim lakim lancem
EP3956359A1 (en) * 2019-04-17 2022-02-23 Novo Nordisk A/S Bispecific antibodies
WO2021070885A1 (ja) 2019-10-11 2021-04-15 中外製薬株式会社 後天性血友病ａの予防および／または治療に用いられる医薬組成物、および当該医薬組成物を含む製品
EP4043033A4 (en) 2019-10-11 2023-11-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PHARMACEUTICAL COMPOSITION THAT MAY BE USED FOR THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF ACQUIRED HEMOPHILIA A AND PRODUCT CONTAINING THE PHARMACEUTICAL COMPOSITION
JP2023106635A (ja) 2020-04-17 2023-08-02 中外製薬株式会社 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法
EP4155405A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody for neutralizing substance having coagulation factor viii (f.viii) function-substituting activity
CN112794903B (zh) * 2021-04-14 2021-06-25 广州市雷德生物科技有限公司 一种特异性结合IFN-γ的抗体及其应用
WO2023118150A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Royal College Of Surgeons In Ireland A conjugate for use in localising a molecule to the vascular endothelium.

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US6010902A (en) * 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
IL89491A0 (en) 1988-11-17 1989-09-10 Hybritech Inc Bifunctional chimeric antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991008770A1 (en) 1989-12-11 1991-06-27 Immunomedics, Inc. Method for antibody targeting of diagnostic or therapeutic agents
TW212184B (zh) * 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
JPH05184383A (ja) 1990-06-19 1993-07-27 Dainabotsuto Kk 二重特異性抗体
JPH05199894A (ja) 1990-08-20 1993-08-10 Takeda Chem Ind Ltd 二重特異性抗体および抗体含有薬剤
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
JPH05304992A (ja) 1991-06-20 1993-11-19 Takeda Chem Ind Ltd ハイブリッド・モノクローナル抗体および抗体含有薬剤
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JPH05203652A (ja) 1992-01-28 1993-08-10 Fuji Photo Film Co Ltd 抗体酵素免疫分析法
JPH05213775A (ja) 1992-02-05 1993-08-24 Otsuka Pharmaceut Co Ltd Ｂｆａ抗体
DE69333814T2 (de) 1992-03-11 2006-02-02 Powderject Vaccines, Inc., Madison Genetischer impfstoff gegen den immunschwäche virus
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
US5744446A (en) * 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
SG48760A1 (en) 1992-07-24 2003-03-18 Abgenix Inc Generation of xenogenetic antibodies
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE122009000068I2 (de) 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5945311A (en) * 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
NZ288883A (en) 1994-07-11 1998-12-23 Univ Texas Conjugates comprising coagulation factors
AU701342B2 (en) 1994-07-13 1999-01-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Reconstituted human antibody against human interleukin-8
EP1241264A1 (en) 1994-12-02 2002-09-18 Chiron Corporation Monoclonal antibodies to colon cancer antigen
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
MA24512A1 (fr) * 1996-01-17 1998-12-31 Univ Vermont And State Agrienl Procede pour la preparation d'agents anticoagulants utiles dans le traitement de la thrombose
ZA976326B (en) 1996-07-19 1998-02-03 Amgen Inc Analogs of cationic proteins.
JPH10165184A (ja) 1996-12-16 1998-06-23 Tosoh Corp 抗体、遺伝子及びキメラ抗体の製法
US20030207346A1 (en) * 1997-05-02 2003-11-06 William R. Arathoon Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
AU751659B2 (en) 1997-05-02 2002-08-22 Genentech Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US20020062010A1 (en) * 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DE19725586C2 (de) * 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
US6207805B1 (en) 1997-07-18 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Prostate cell surface antigen-specific antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
DK1069185T3 (da) 1998-04-03 2011-06-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humaniseret antistof mod human vævsfaktor (TF) og fremgangsmåde til at konstruere humaniseret antistof
US20020142374A1 (en) 1998-08-17 2002-10-03 Michael Gallo Generation of modified molecules with increased serum half-lives
AT411997B (de) 1999-09-14 2004-08-26 Baxter Ag Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate
JP2002112369A (ja) 2000-10-03 2002-04-12 Sharp Corp 端末網制御装置
US20030008880A1 (en) 2001-05-02 2003-01-09 Pfizer Inc. 4-(2-Pyridyl) piperizines having 5HT7 receptor agonist activity
US20030157108A1 (en) 2001-10-25 2003-08-21 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
DE10156482A1 (de) * 2001-11-12 2003-05-28 Gundram Jung Bispezifisches Antikörper-Molekül
EP1500665B1 (en) 2002-04-15 2011-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHODS FOR CONSTRUCTING scDb LIBRARIES
AU2003235833A1 (en) * 2002-04-26 2003-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of screening agonistic antibody
US20050130224A1 (en) 2002-05-31 2005-06-16 Celestar Lexico- Sciences, Inc. Interaction predicting device
DE602004021095D1 (de) * 2003-01-21 2009-06-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening der leichten kette eines antikörpers
WO2005035753A1 (ja) 2003-10-10 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
WO2005035754A1 (ja) 2003-10-14 2005-04-21 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 機能蛋白質を代替する二重特異性抗体
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP5057967B2 (ja) 2005-03-31 2012-10-24 中外製薬株式会社 ｓｃ（Ｆｖ）２構造異性体
WO2006109592A1 (ja) 2005-04-08 2006-10-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 血液凝固第viii因子の機能代替抗体
KR101367544B1 (ko) * 2005-06-10 2014-02-26 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 메글루민을 함유하는 단백질 제제의 안정화제, 및 그의이용
EP3345616A1 (en) 2006-03-31 2018-07-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody modification method for purifying bispecific antibody
US11046784B2 (en) * 2006-03-31 2021-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
AR061317A1 (es) 2006-06-08 2008-08-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agentes para prevenir o tratar enfermedades inflamatorias
PE20140132A1 (es) 2007-09-26 2014-02-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-receptor de il-6
US9096651B2 (en) * 2007-09-26 2015-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in CDR
LT2708559T (lt) 2008-04-11 2018-06-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigeną surišanti molekulė, galinti pakartotinai prisijungti prie dviejų ar daugiau antigeno molekulių
EP2294087B1 (en) 2008-05-01 2014-05-14 Amgen, Inc. Anti-hepcidin antibodies and methods of use
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA06003831A (es) 2006-07-03
ATE518952T1 (de) 2011-08-15
CN1890369A (zh) 2007-01-03
CN1890369B (zh) 2017-07-28
KR20060111497A (ko) 2006-10-27
BRPI0415230B1 (pt) 2023-01-10
EP1688488A4 (en) 2008-03-05
WO2005035756A1 (ja) 2005-04-21
EP3085783A1 (en) 2016-10-26
EP2289944A3 (en) 2011-03-09
US8062635B2 (en) 2011-11-22
ES2370250T3 (es) 2011-12-13
NZ546509A (en) 2010-03-26
AU2004280421B2 (en) 2011-06-02
NO20160762A1 (no) 2006-07-07
WO2005035753A1 (ja) 2005-04-21
US20070041978A1 (en) 2007-02-22
EP2289944A2 (en) 2011-03-02
EP1688488B9 (en) 2012-03-21
CA2541671C (en) 2015-01-06
NO345624B1 (no) 2021-05-18
KR101361437B1 (ko) 2014-02-11
CA2541671A1 (en) 2005-04-21
DK1688488T3 (da) 2011-09-26
PL3085783T3 (pl) 2021-07-19
RU2339696C2 (ru) 2008-11-27
AU2003271174A1 (en) 2005-04-27
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