NO20160762A1 - Bispesifikt antistoff som substituerer for funksjonelle proteiner - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse vedrører bi-spesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter for kofaktorene som forsterker enzymatisk reaksjon, og farmasøytiske preparater som omfatter antistoffet som en aktiv ingrediens.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Antistoffer har fått mye oppmerksomhet som en medisin på grunn av deres høye stabilitet i blod og lave antigenisitet. Blant disse er bispesifikke antistoffer som samtidig kan gjenkjenne to typer antigener. Bispesifikke antistoffer har blitt foreslått i noen tid, imidlertid bare antistoffer som enkelt sammenbinder to typer antigener, slik som de som endrer målrettingen av NK-celler, makrofager og T-celler (se ikke-patentdokument 7), har blitt rapportert. For eksempel er MDX-210 som for tiden er under klinisk studie er et bispesifikt antistoff som bare målsøker FcyRI-uttrykkende monocytter og slikt ytterligere til HER-2/neu-uttrykkende kreftceller. Dermed foreligger det så langt ikke noe eksempel som benytter et bispesifikt antistoff som en alternativ måte til funksjonelt å erstatte kofaktoren som forsterker en enzymatisk reaksjon.

Eksempler på kofaktorer er vevsfaktor (TF), blodkoagulasjonsfaktor-V (F.V.), aktivert blodkoagulasjonsfaktor-V (F.Va), blodkoagulasjonsfaktor-VIII (F.VIII), aktivert blodkoagulasjonsfaktor-VIII (F.Villa), trombomodulin (TM), protein-S (PS), protein-Z (PZ), heparin, komplement-C4b, komplementregulatorisk faktor-H, membrankofaktorprotein (MCP) og komplementreseptor-1 (CR1).

Av disse er F.VIII/F.Villa en kofaktor som er nødvendig for tilstrekkelig aktivitetsekspresjon av aktivert blodkoagulasjonsfaktor-IX (F.IXa). Scheiflinger F. et al., oppdaget at et visst anti-F.IX/F.IXa-antistoff virker for å fremme aktiveringen av blodkoagulasjonsfaktor-X (F.X) ved F.IXa i en kromogen analyse (patentdokument 1). I en analyse som undersøker evnen for koagulasjonsgjenvinning i F.VIII-manglende plasma, ble imidlertid koagulasjonsgjenvinningsevnen kun observert når F.IXa ble tilsatt eksogent, men ikke hvis dette antistoffet ble anvendt alene.

F.VIII har vært kjent for å interagere med ikke bare F.IXa, men også med F.X (se ikke-patentdokumentene 5 og 6). I så henseende kan ikke antistoffet til Scheiflinger F. et al. sies i tilstrekkelig grad å erstatte funksjonen av F. VIII/F.Villa, og dens aktivitet ser også ut til å være utilstrekkelig.

Gjennom målrettet forskning har foreliggende oppfinnere lyktes i å produsere bispesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter for kofaktorene som forsterker enzymatisk aktivitet, og som dermed fullførte denne oppfinnelsen.

[Patentdokument 2] U.S. patent nr. 4 474 893

[Patentdokument 3] EP 404 097

[Patentdokument 4] WO 93/11161

[Patentdokument 5] japansk patentsøknad nr. 2002-112369

[Patentdokument 6] japansk patentsøknad nr. 2003-012648

[Patentdokument 7] japansk patentsøknad Kokai publikasjon nr. (JP-A) H5-304992

(ikke gransket, publisert japansk patentsøknad)

[Patentdokument 8] JP-A H2-145187

[Patentdokument 9] JP-A H5-213775

[Patentdokument 10] JP-A H10-165184

[Patentdokument 11] JP-A Hll-71288

[Patentdokument 12] JP-A 2002-518041

[Patentdokument 13] JP-A Hll-506310

[Patentdokument 14] JP-A H5-199894

[Patentdokument 15] JP-A H10-511085

[Patentdokument 16] JP-A H5-184383

[Ikke-patentdokument 1] Nilsson IM et al., "J. Intern. Med." 1992, vol. 235, s. 25-32 [Ikke-patentdokument 2] Lofqvist T et al., "J. Intern. Med" 1997, vol. 241, s. 395-400

("o" i Lofqvist er skrevet med en omlyd)

[Ikke-patentdokument 3] 24. møte i The Japanese Society on Thrombosis and Hematosis, Special Committee on Examining Hemophilia Standardization, mini-symposium, 2001,htt<p:>// www. jsth. org

[Ikke-patentdokument 4] Medical Bulletin #193 1994

[Ikke-patentdokument 5] Mertens K et al., "Thromb. Haemost." 1999, vol. 82, s. 209-217 [Ikke-patentdokument 6] Lapan KA et al., "Thromb. Haemost." 1998, vol. 80, s. 418-422 [Ikke-patentdokument 7] Segal DM et al., "Journal of Immunological Methods" 2001, vol. 248, s. 1-6

[Ikke-patentdokument 8] Bos Rog Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma" 1992, vol. 11, nr. 1, s. 41-51

[Ikke-patentdokument 9] Brennan M et al., "Science" 1985, vol. 229, nr. 1708, s. 81-3 [Ikke-patentdokument 10] Karpovsky B et al., "J. Exp. Med." 1984, vol. 160, nr. 6, s. 1686-701

[Ikke-patentdokument 11] Suresh MR et al., "Methods Enzymol." 1986, vol. 121, s. 210-28

[Ikke-patentdokument 12] Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods" 1997, vol. 201, s. 57-66

[Ikke-patentdokument 13] Brennan M et al., "Science" 1985, vol. 229, s. 81 [Ikke-patentdokument 14] Shalaby MR et al., "J. Exp. Med." 1992, vol. 175, s. 217-25

[Ikke-patentdokument 15] Holliner P et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 1993, vol. 175, s. 217-25

[Ikke-patentdokument 16] Ridgway JB et al., "Protein Eng." 1996, vol. 9, s. 6444-8 [Ikke-patentdokument 17] Hammerling U et al., "J. Exp. Med." 1968, vol. 168, s. 1461-73

[Ikke-patentdokument 18] Kurokawa T et al., "Bio/Technology" 1989, vol. 7, s. 1163 [Ikke-patentdokument 19] Link BK et al., "Blood" 1993, vol. 81, s. 3343 [Ikke-patentdokument 20] Nitta Tet al., "Lancet" 1990, vol. 335, s. 368-71 [Ikke-patentdokument 21] deLeij et al., "Foundation Nationale de Transfusjon Sanguine, Les Ulis France" 1990, s. 249-53

[Ikke-patentdokument 22] Le Doussal JM et al., "J. Nucl. Med." 1993, vol. 34, s. 1662-71 [Ikke-patentdokument 23] Stickney DR et al., "Cancer Res." 1991, vol. 51, s. 6650-5 [Ikke-patentdokument 24] Weiner GJ et al., "Cancer Res." 1993, vol. 53, s. 94-100 [Ikke-patentdokument 25] Kroesen BJ et al., "Br. J. Cancer" 1994, vol. 70, s. 652-61 [Ikke-patentdokument 26] Weiner GJ et al., "J. Immunol." 1994, vol. 152, s. 2385 [Ikke-patentdokument 27] Suresh MR et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 1986, vol. 83, s. 7989-93

[Ikke-patentdokument 28] Milstein C og Cuello AC, "Nature" 1983, vol. 305, s. 537 [Ikke-patentdokument 29] Xiang J et al., "Mol. Immunol." 1990, vol. 27, s. 169 [Ikke-patentdokument 30] Bebbington CR et al., "Bio/Technology" 1992, vol. 10, s. 169 [Ikke-patentdokument 31] Huse WD et al., "Science" 1989, vol. 246, s. 1275 [Ikke-patentdokument 32] McCafferty J et al., "Nature" 1990, vol. 348, s. 552 [Ikke-patentdokument 33] Kang AS et al., "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 1991, vol. 88, s.

4363

Ruef et al. (Thromb Haemost 1990. 82, 109-114) beskriver en bispesifik antistoff-konstruksjon som består av to Fab-er som målretter urokinase til fibrin og blodplate epitoper.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Et mål for foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe bispesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter for kofaktorene som forsterker enzymatisk reaksjon.

Gjennom målrettet forskning har foreliggende oppfinnere lyktes i å oppdage bispesifikke antistoffer som spesifikt binder til både F.IX/F.IXa og F.X. og som erstatter for funksjonen til kofaktor F.Villa (dvs. en funksjon for å fremme F.X-aktivering av F.IXa). Det vil si at foreliggende oppfinnere lyktes i å fremstille bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både et enzym og dens substrat og som funksjonelt erstatter for kofaktorer til enzymet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører bispesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter kofaktorene som forsterker enzymatisk reaksjon, og mer spesifikt til:

[1] Antistoff som gjenkjenner både et enzym og et substrat derav, hvor nevnte antistoff er et bispesifikt antistoff som erstatter for funksjonen til en kofaktor som forsterker den enzymatiske reaksjonen og hvor enzymet er et proteolytisk enzym.

[2] Antistoff ifølge [1] hvor nevnte proteolytiske enzym, substrat og kofaktor er blodkoagulasjonsfaktorer/fibrinolyse-assosierte faktorer.

[3] Antistoffet ifølge [2] hvor enzymet er ZPI, substratet er blodkoaguleringsfaktor X og/eller aktivert blodkoaguleringsfaktor X, og kofaktoren er PZ.

[4] Antistoffet ifølge [2], hvor enzymet er trombin, substratet er TAFI og kofaktoren er TM.

[5] Antistoffet ifølge [2], hvor enzymet er trombin, substratet er PC og kofaktoren er TM og/eller PS.

[6] Antistoffet ifølge [2], hvor enzymet er aktivert blodkoaguleringsfaktor X, substratet er protrombin, og kofaktoren er blodkoaguleringsfaktor V og/eller aktivert blodkoaguleringsfaktor V.

[7] Antistoff ifølge [1], hvor enzymet er Cls, substratet er C2 og kofaktoren er C4b.

[8. Antistoff ifølge [1], hvor enzymet er komplement regulerende faktor I, substratet er C3b, og kofaktoren er komplement regulerende faktor II, membran kofaktor Protein (MCP), og komplement reseptor I (CR1).

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 avbilder insersjonsområdet i pcDNA4-g4H.

Fig. 2 avbilder insersjonsområdet i pcDNA4-g4L og pIND-g4L.

Fig. 3 avbilder insersjonsområdet til pIND-g4H.

Fig. 4 avbilder resultatene fra måling av den F.VIIIa-hermende aktiviteten til et anti-F.IXa/anti-F.X-spesifikt antistoff som er generert fra anti-F.IXa-antistoff XB12 og anti-F.X-antistoff SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 eller SB34. Konsentrasjonen av antistoffløsningene var 10 ug/ml (sluttkonsentrasjon 1 ug/ml. Resultatet er ni typer av bispesifikke antistoffer som viste en økning i den F.VIIIa-hermende aktiviteten: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 og XB12/SB34 i rekkefølgen med aktivitetsstyrke. Fig. 5 avbilder resultatene fra måling av den F.IXa-hermende aktiviteten til et bispesifikt antistoff generert fra anti-F.IXa-antistoff XT04 og anti-F.X-antistoff SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 eller SB34. Konsentrasjonen av antistoffløsningene var 10 ug/ml (sluttkonsentrasjon 1 ug/ml). Som et resultat viste XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB06 og XT04/SB34 en økning i den F.VIIIa-hermende aktivitet. Fig. 6 avbilder resultatene fra måling av den F.VIIIa-hermende aktiviteten ved ulike konsentrasjoner av XB12/SB04, som viste den høyeste aktiviteten i Fig. 4. Som et resultat viste XB12/SB04 en konsentrasjonsavhengig økning av F.VIIIa-hermende aktivitet. Fig. 7 avbilder resultatene fra måling av plasmakoagulasjonstiden (APTT) i nærvær av XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 eller XB12/SB34. Konsentrasjonen av antistoffløsningen blandet med F.VIII-manglende plasma var 1,7 ug/ml forXB12/SB06 og 10 ug/ml for resten. Som et resultat viste XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 og XB12/SB34 en koagulasjonstidsforkortelseseffekt sammenlignet med i fraværet av antistoffene. Fig. 8 avbilder resultater fra måling av plasmakoagulasjonstiden (APTT) i nærvær av XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB05, XT04/SB06 og XT04/SB34. Konsentrasjonen av antistoffløsningene blandet med F.VIII-manglende plasma var 5 ug/ml for XT04/SB06 og 10 ug/ml for resten. Som et resultat viste XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/42, XT04/SB38, XT04/SB07, XT04/SB05 og XT04/SB06 en koagulasjonstidsforkortende effekt sammenlignet med i fraværet av antistoffene. XT04/SB34 viste ingen koagulasjonstidsforkortende effekt. Fig. 9 avbilder resultatet fra måling av koagulasjonstiden med ulike konsentrasjoner av XT12/SB04, som viste den høyeste koagulasjonstids(APTT)-forkortende effekten i figurene 7 og 8. Som et resultat viste XB12/SB04 en konsentrasjonsavhengig effekt ved forkortende koagulasjonstid. Antistoffkonsentrasjonen i figuren viser verdier for antistoffløsningen blandet med F.VIII-manglende plasma. Fig. 10 avbilder resultater fra GST-AP-Western-blotting av SB04 eller SB06, der 1), 2) og 3) er resultater fra reaksjonen av transkribert GST-AP med SB04, SB06 og en prøve som ikke inneholder antistoff. Resultatene viser påvisning av kun bindings-reaksjonen med SB04 med GST-AP. Fig. 11 avbilder en pELBGIad-vektor. ColElori: replikasjonsorigoregion forColEl-plasmidserie, flori: replikasjonsorigoregion forfl-fag, lad: kodende region for laktoserepressorprotein, P!ac: laktosepromotor, pelBss: signalsekvens for E. co//'-PelB-protein, scFv: kodende region for enkelttråd antistoffmolekyl, gen III (gen 3): kodende region for fl-fag-gen-III-protein, Amp<r>: ampicillinresistensgen og Sfi I: restriksjonsenzym Sfi I-kløyvingssete. Fig. 12 avbilder resultatet fra måling av den F.VIIIa-hermende aktiviteten ved å benytte kultursupernatanter fra de uttrykte bispesifikke antistoffene, som er kombinasjoner av et anti-F.XIa-antistoff (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 eller XB12 og et anti-F.X-antistoff (B2, B5, B9, B10, Bil, B12, B13, B14, B15, B16, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 eller SB27). "+" representerer tilfeller der den F.VIIIa-hermende aktiviteten er 0,1 eller mer. Fig. 13 avbilder resultater fra en plasmakoagulasjonsanalyse utført ved å benytte rensede preparater av uttrykte bispesifikke antistoffer, som er kombinert fra et anti-FIXa-antistoff (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 eller XB12 og et anti-F.X-antistoff (B2, B5, B9, B10, Bil, B12, B13, B14, B15, B16, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 eller SB27). Koagulasjonstiden ble forkortet med 10 til 20 sekunder ("+"), 20 til 40 sekunder ("++"), 40 til 50 sekunder ("+++") eller 50 sekunder ("++++") eller mer med antistofftilsetningen sammenlignet med når antistoffene ikke ble tilsatt. Fig.14 avbilder resultater fra måling av koagulasjonstiden ved ulike konsentrasjoner av A44/B26, som hadde en høy koagulasjonstids(APTT)-forkortende effekt i Fig. 13. Koagulasjonstiden var 113 sekunder når antistoffet ikke ble tilsatt. Som et resultat viste A44/B26 en konsentrasjonsavhengig effekt ved forkorting av koagulasjonstiden. Antistoffkonsentrasjonen i figuren viser verdier for antistoffløsningen blandet med F.VIII-manglende plasma. Fig. 15 avbilder resultater fra måling av koagulasjonstiden ved ulike konsentrasjoner av A69/B26, som hadde en høy koagulasjonstids(APTT)-forkortende effekt i Fig. 13. Koagulasjonstiden var 109,6 sekunder når antistoffet ikke var tilsatt. Som et resultat viste A69/B26 en konsentrasjonsavhengig koagulasjonstidsforkortelseseffekt. Antistoffkonsentrasjonen i figuren viser verdier for antistoffløsningen blandet med F.VIII-manglende plasma. Fig. 16 avbilder resultater fra måling av koagulasjonstiden(APTT) i sameksistens med A44/B26 eller XB12/SB04 med F.VIII. Sammenlignet med F.VIII alene viste en blandet løsning av A44/B26 eller XB12/SB04 med F.VIII som et resultat en koagulasjonstidsforkortende effekt. Fig. 17 avbilder resultater fra måling av koagulasjonstiden(APTT) i inhibitorplasma ved nærvær av A44/B26 eller XB12/SB04. Som et resultat viste A44/B26 eller XB12/SB04 en koagulasjonstidsforkortende effekt sammenlignet med i fraværet av antistoffene. Fig. 18 avbilder resultater fra måling av koagulasjonstiden ved ulike konsentrasjoner av XB12/SB04 og humanisert XB12/humanisert SB04. Koagulasjonstiden var 111,3 sekunder når antistoff ikke var tilsatt. Som et resultat av målingene viste humanisert XB12/humanisert SB04 en koagulasjonstidsforkortende effekt tilsvarende til den for XB12/SB04. Antistoffkonsentrasjonen i figuren viser verdier av antistoffløsningene blandet med F.VIII-manglende plasma.

Beste måte for utførelse av oppfinnelsen

Et bispesifikt antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er et molekyl som omfatter to typer av antistoffer eller antistoffragmenter som har spesifisiteter for forskjellige antigener. Det bispesifikke antistoffet er ikke spesielt begrenset, men fortrinnsvis monoklonalt.

De bispesifikke antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis rekombinante antistoffer, som er generert ved å benytte genrekombinasjonsteknikker (se f.eks. Borrebaeck CAK and Larrick JW, Therapeutic Monoclonal Antibodies, publisert i Storbritania av MacMillan Publishers Ltd, 1990). Et rekombinant antistoff kan fremskaffes ved å klone et antistoffkodende DNA fra antistoffproduserende celler, slik som hybridomer eller sensibiliserte lymfocytter, ved å inkorporere DNA i en egnet vektor og introdusere vektoren inn i en vert for antistoffproduksjon.

Videre kan antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse være antistoff rag menter eller modifiserte antistoffer. Antistoffragmenter inkluderer dialegemet (Db), lineære antistoffer, enkelttrådet antistoff (heretter referert til som scFv)-molekyler osv. Her representerer "Fv"-fragmenter det minste antistoffragmentet, som omfatter et komplett antigengjenkjenningssete og bindingssete. Et "Fv"-fragment er en dimer (VH-VL-dimer) der en tung(H)-kjede variabel region (VH) og en lett (L)-kjede variabel region (VL) er sterkt bundet sammen ved en ikke-kovalent binding. Tre komplementaritetsbestemmende regioner (CDR-er) i hver variabel region interagerer for å danne et antigenbindingssete på overflaten av en VH-VH-dimer. Seks CDR-er overfører et antigenbindingssete på et antistoff. Likevel er til og med én variabel region (eller en halv Fv som inneholder kun tre antigenspesifikke CDR-er) i stand til å gjenkjenne et antigen og binding dertil, selv om dens affinitet er lavere enn den for hele bindingssetet.

I tillegg inneholder Fab-fragmenter (også referert til som (F(ab)) ytterligere en L-kjede konstant region og en H-kjede konstant region (CH1). Et Fab'-fragment er forskjellig fra et Fab-fragment ved at den første inneholder ytterligere flere residuer fra karboksylterminalen til en H-kjede-CHl-region, som omfatter ett eller flere cysteinerfra hengsleregionen fra et antistoff. Fab'-SH refererer til Fab' som har en fri tiolgruppe på ett eller flere cysteinresiduer i konstantregionen. F(ab')-fragmenter blir fremstilt ved å spalte disulfidbindingen i cysteinene i hengsledelen av et F(ab')2-pepsinfordøying. Andre kjemisk bundne antistoffragmenter er også kjent for folk på området.

Dialegeme refererer til et bivalent antistoffragment som er fremstilt ved gen-fusjon (Holliger P et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993), EP 404 097, WO 93/11161, etc). Dialegeme er en dimer som omfatter to peptidkjeder, der en L-kjede variabel region (VL) i hver peptidkjede er bundet sammen med en H-kjede variabel region (VH) på den samme kjeden via en linker som er for kort til å tillate parring mellom de to regionene (for eksempel omtrent 5 residuer). VLog VH som er kodet på for den samme polypeptidkjeden, danner en dimer fordi de ikke kan danne et enkelttrådet variabel regionfragment på grunn av den korte linkeren mellom dem. Dermed ender et dialegeme opp med to antigenbindende seter.

At enkelttråd antistoff eller scFv-fragment inneholder VH- og VL-regioner til et antistoff, og disse regionene eksisterer på en enkel polypeptidkjede. Generelt inneholder et Fv-polypeptid ytterligere en polypeptidlinker mellom VH- og VL-regionen, slik at scFv er i stand til å danne en struktur som er nødvendig for antigenbinding (se Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) s. 269-315, 1994 for generelle bemerkninger på scFv). Linkerne i foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge de ikke inhiberer ekspresjon av de antistoffvariable regionene som er bundet til begge endene på en linker.

Et IgG-type bispesifikt antistoff kan utskilles av et hybrid hybridom (kvadrom) som er dannet ved å fusjonere to typer hybridomer som produserer IgG-antistoffer (Milstein C et al., Nature 1983, 305:537-540). Det kan også bli utskilt ved å introdusere inn i cellene gener for L-kjedene og H-kjedene som utgjør de to IgG-ene av interesse (totalt fire typer gener) for ko-ekspresjon.

Teoretisk er det imidlertid så mange som ti kombinasjoner av H-kjeder og L-kjeder i IgG-ene som ble fremstilt ved disse fremgangsmåtene. Det er vanskelig å rense et IgG som omfatter den ønskede kombinasjonen av H- og L-kjeder fra de ulike typer av IgG-er. I teorien blir videre mengden av kombinasjonen av interesse dramatisk minsket, og dermed er storskala celledyrking nødvendig, noe som fører til en ytterligere økning i fremstillingskostnader.

I dette tilfellet er det, ved hensiktsmessig å substituere aminosyre/aminosyrer i CG3-regionen på en H-kjede, mulig å fortrinnsvis utskille IgG-er som haren heterolog kombinasjon av H-kjeder (Ridgway, JB et al., Protein Engineering 1996, ):617-621, Merchant, AM et al. Nature Biotechnology 1998, 16:677-681).

Slik som for L-kjeder er en L-kjede variabel region mindre mangfoldig sammenlignet med en H-kjederegion og derfor kan fremskaffelse av en vanlig L-kjede som tilveiebringer bindingsaktiviteter med to H-kjeder være forventet. Effektiv ekspresjon av en bispesifikk IgG blir mulig ved å introdusere gener for denne vanlige L-kjeden og begge H-kjedene inn i en celle for IgG-ekspresjon (Nature Biotechnology, 1998, 16, 677-681). Imidlertid er muligheten for at to tilfeldig valgte typer av antistoffer inneholder den samme L-kjeden liten, og dermed er det vanskelig å sette den tidligere nevnte ideen ut i praksis. I denne forbindelse har en fremgangsmåte blitt foreslått for seleksjon av en felles L-kjede som tilpasses tilfeldige forskjellige H-kjeder for å vise høy bindingsevne (WO 2004/065611). En H-kjede som har den ovenfor beskrevne CH3-varianten (Nature Biotechnology, 1998, 16, 677-681) blir sjelden utskilt i fravær av den andre H-kjeden. Ved å anvende denne egenskapen for først å indusere ekspresjon av høyrearm-L-kjeden og -H-kjeden og stoppe ekspresjonen, og deretter indusere ekspresjon av venstrearm-L-kjeden og -H-kjeden kan andelen av IgG-er uttrykt i kombinasjonen av interesse bli økt (PCT/JP2004/008585).

Et bispesifikt antistoff kan også bli fremstilt ved kjemisk å kryssbinde Fab'-er. En bispesifikk F(ab')2kan bli fremstilt for eksempel ved å maleimidere en Fab' fremstilt fra et antistoff med o-PDM (orto-fenylenedimaleimid) og reagere produktet med en Fab' fremstilt fra et annet antistoff, slik at man kan kryssbinde Fab'-er som er avledet fra ulike antistoffer (Keier T et al. Cancer Research 1997, 57:4008-4014). Videre er en fremgangsmåte for kjemisk å binde sammen antistoff-fragmentet slik som et Fab'-tionitrobenzosyre (TNB)-derivat og Fab'-tiol (SH) også kjent (Brennan M et al. Science 1985, 229:81-83).

I stedet for kryssbinding kan en leusinzipper avledet fra Fos og Jun eller lignende benyttes. Selv om Fos og Jun også danner en homodimer er deres fortrinnsvise heterodimerdannelse anvendt. En Fab' tilsatt sammen med en Fos-leusinzipper og en andre Fab' tilsatt sammen med en Jun-leusinzipper uttrykkes for fremstilling. Ved å blande og reagere monomere Fab'-Fos og Fab'-Jun, som har blitt redusert under milde betingelser, kan en bispesifikk F(ab')2dannes (Kostelny SA et al. J. of Immunology, 1992, 148: 1547-53). Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til Fab' og kan også benyttes på scFv, Fv, osv.

Et bispesifikt antistoff kan også fremstilles i form av et dialegeme. Et bispesifikt dialegeme er en heterodimer som omfatter to overkryssings-scFv-fragmenter. Det vil si et bispesifikt dialegeme kan fremstilles ved å konstruere en heterodimer ved å anvende VH(A)-VL(B) og VH(B)-VL(A), som har blitt dannet ved å binde sammen VH og VLavledet fra to typer antistoffer: A og B, med en relativt kort linker på omtrent 5 aminosyre-residuer (Holliger P et al. Proe. of the National Academy of Sciences of the USA 1993, 90: 6444-6448).

I dette tilfellet kan konstruksjonen av et bispesifikt dialegeme av interesse bli fremmet ved å utføre egnede aminosyre substitusjoner (Knobs-into-holes: Zhu Z et al. Protein Science. 1997, 6: 781-788) for å binde sammen to typer av scFv' med en fleksibel og relativt lang linker på omtrent 15 aminosyre residuer (et enkeltkjedet dialegeme: Kipriyanov SM et al. J. of Molecular Biology. 1999, 293:41-56).

sc(Fv)2som kan fremstilles ved å binde to typer av scFv' med en fleksibel og relativt lang linker av 15 aminosyre residuer kan også bli et bispesifikt antistoff (Mailender WD et al. J. of Biological Chemistry, 1994, 269: 199-206).

Et modifisert antistoff kan for eksempel være et antistoff som binder til ulike molekyler slik som polyetylenglykol (PEG). I de modifiserte antistoffene i foreliggende oppfinnelse er stoffer som skal bli bundet ikke begrenset. Slike modifiserte antistoffer kan fremskaffes ved kjemisk å modifisere antistoffene fremskaffet. Disse fremgangsmåtene har allerede blitt etablert på dette fagområdet.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer humane antistoffer, museantistoffer, rotteantistoffer og slike, uten noen begrensning på deres opprinnelse, og kan være genetisk modifiserte antistoffer, slik som kimære antistoffer og humaniserte antistoffer.

Fremgangsmåter for å fremskaffe humane antistoffer er kjent, og et humant antistoff av interesse kan fremskaffes for eksempel ved å immunisere et transgent dyr som har alle repertoarer av humane antistoffgener med et antigen av interesse (se WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).

Genetisk modifiserte antistoffer kan bli fremstilt ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Spesielt omfatter for eksempel et kimært antistoff variable regioner fra H- og L-kjedene fra et antistoff fra immuniserte dyr, og konstant regioner fra H- og L-kjedene for et humant antistoff. Et kimært antistoff kan fremskaffes ved å binde sammen et DNA som koder for den variable regionen til et antistoff som er avledet fra immuniserte dyr med et DNA som koder for den konstante regionen til et humant antistoff, sette inn det resulterende DNA i en ekspresjonsvektor og introdusere den rekombinante vektoren i en vert for produksjon.

Et humanisert antistoff er et modifisert antistoff som også blir referert til som et ombygget humant antistoff. Et humanisert antistoff blir fremstilt ved å transplantere den komplementaritetsbestemmende regionen (CDR) fra et antistoff som er avledet fra immuniserte dyr inn i CDR-en fra et humant antistoff. Generelle genteknologiske teknologier er også kjent.

Spesielt blir en DNA-sekvens som er designet for å binde CDR-en fra et museantistoff til rammeverksregionen (FR) på et humant antistoff syntetisert ved hjelp av PCR, ved å anvende flere oligonukleotider som har blitt fremstilt slik at de inneholder overlappende deler i deres terminale regioner. Etter å ha bundet det fremskaffede DNA til et DNA som koder for den konstante regionen til et humant antistoff, blir det resulterende DNA inkorporert i en ekspresjonsvektor og introdusert inn i en vert for å fremstille et humanisert antistoff (se EP 239400 og WO 96/02576). Som et humant antistoff-FR som skal bindes via CDR, er ett som er i stand til å danne et antigenbindende sete med en god komplementaritetsbestemmende region valgt. Aminosyrer i rammeverksregionen i en antistoff variabel region kan substitueres hvis det er nødvendig, slik at den komplementaritetsbestemmende regionen til et ombygget humant antistoff danner et egnet antigenbindingssete (Sato K et al., Cancer Research 1993, 53: 851-856). Rammeverksregionen kan substitueres med rammeverksregioner avledet fra ulike humane antistoffer (se WO 99/51743).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer bispesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter kofaktorer som gjenkjenner både et enzym og dets substrat.

Kofaktorer ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset så lenge de er i stand til å virke på et enzym for å forsterke den enzymatiske reaksjonen. En kofaktor ifølge foreliggende oppfinnelse er for eksempel kofaktor for et proteolytisk enzym. Spesifikke eksempler på en kofaktor for et proteolytisk enzym er kofaktor for blod- koagulasjonsfaktorer og fibrinolyseassosierte faktorer (F.VIII/F.Villa, F.V/F.Va, PZ, TM, TM/PS-system), kofaktorer for komplementreaksjoner (C4b, MCP, CR1, H-faktor), og slike.

De følgende kombinasjonene kan listes opp som spesifikke eksempler på enzym og enzymsubstrat, i tillegg til enzym kofaktorer.

(a) Kofaktor for blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor (eksempel 1)

Enzym: F.IXa

Substrat: F.X

Kofaktor: F.VIII/F.VIIIa

Kofaktor F.Villa binder til både F.IXa og F.X og forsterker F.X-aktivering ved F.IXa. Blant bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både det ovenfor beskrevne enzymet F.IXa og substratet F.X har noen en effekt på F.X-aktivering. Noen av disse antistoffene er antatt å ha en effekt ved å erstatte for funksjonen til kofaktor F.VIII/F.VIIIa.

(b) Kofaktor for blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor (eksempel 2)

Enzym: PZ

Substrat: F.X/F.Xa

Kofaktor: PZ

Kofaktor PZ binder til ZPI i serpinfamilien og til aktivert blodkoagulasjonsfaktor X (F.Xa) for å forsterke den F.Xa-inhiberende aktiviteten til ZPI. Spesifikt er noen bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både ZPI og F.X/F.Xa antatt å ha en effekt ved å substituere for PZ-funksjonen.

(c) Kofaktor for blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor (eksempel 3)

Enzym: trombin

Substrat: TAFI

Kofaktor: TM

Kofaktor TM forsterker TAFI-aktivering ved trombin. Spesifikt er noen bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både trombin og TAFI antatt å ha en effekt ved å substituere for TM-funksjonen.

(d) Kofaktor for blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor (eksempel 4)

Enzym: trombin

Substrat: PC

Kofaktorer: TM/PS

TM/PS-systemet forsterker PC-aktivering ved trombin. Spesifikt er noen bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både trombin og PC antatt funksjonelt å

erstatte for TM/PS-systemet.

(e) Kofaktor for blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor (eksempel 5)

Enzym: F.Xa

Substrat: Protrombin

Kofaktor: F.V/F.Va

Kofaktor F.Va binder til både F.Xa og protrombin for å forsterke protrombinaktivering ved F.Xa. Blant spesifikke antistoffer som gjenkjenner både det ovenfor beskrevne enzymet F.Xa og dets substrat protrombin, har noen forsterkende effekter på protrombinaktivering. Noen av disse antistoffene er antatt å ha en funksjon som erstatter for funksjonen til kofaktor F.V/F.Va.

(f) Kofaktor for komplementreaksjon (eksempel 1)

Enzym: Cls

Substrat: C2

Kofaktor: C4b

C4b har Cl's fremmende effekt på C2-nedbrytning. Spesifikt er noen bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både Cl og C2 og antatt funksjonelt å erstatte for C4b.

(g) Kofaktorer for komplementreaksjon (eksempel 2)

Enzym: Komplementregulatorisk faktor I

Substrat: C3b

Kofaktorer: Komplementregulatorisk faktor H,

Membrankofaktorprotein (MCP) og

Komplementreseptor 1 (CR1)

Komplementregulatoriske faktorer H, MCP og CR1 har den fremmende effekten av komplementregulatorisk faktor 1 på C3b-nedbrytning. Blant de bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både komplementregulatorisk faktor 1 og C3b, er noen spesifikk antatt funksjonelt å substituere for komplementregulatoriske faktorer H, MCP og CR1.

Blant de ovenfor beskrevne kofaktorene er F.VIII/F.VIIIa spesielt foretrukket. Selv om FVIII/F.Villa gjennomgår begrenset proteolyse av proteolytiske enzymer

slik som trombin, spiller dens form ingen rolle så lenge den har F.VIII/F.VHIa-aktivitet. Videre er F.VIII/F.VHIa-varianter og F.VIII/F.VIIIa som har blitt kunstig modifisert ved hjelp av genrekombinasjonsteknikker, også inkludert i F.VIII/F.VIIIa så lenge de opprettholder F.VIII/F.VIIIa-kofaktoraktivitet.

Fremgangsmåter for å fremskaffe bispesifikke antistoffer som funksjonelt erstatter kofaktorer ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset, og kan fremskaffes ved hvilken som helst fremgangsmåte. Når man, for eksempel, fremskaffer et bispesifikt antistoff som funksjonelt erstatter enzym-A og substrat-B, så blir enzym-A og substrat-B hver immunisert til et dyr for å fremskaffe anti-enzym-A-antistoff og anti-substrat-B-antistoff. Deretter blir et bispesifikt antistoff som omfatter anti-enzym-A- antistoff-H-og-L-kjedene og anti-substrat-B-antistoff-H-og-L-kjedene fremstilt. Her er det ønskelig å fremskaffe flere typer av hvert av anti-enzym-A-antistoffet og anti-substrat-B-antistoffet, slik at disse antistoffene fortrinnsvis kan anvendes til å fremstille så mange kombinasjoner av bispesifikke antistoffer som mulig. Etter at bispesifikke antistoffer er fremstilt, blir antistoffer med en aktivitet som erstatter kofaktorfunksjon valgt.

Antistoffer mot et enzym eller et substrat kan fremskaffes ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. For eksempel kan antistoffer fremstilles ved å immunisere dyr med antigener. Antigener til immunisering av dyr er for eksempel fullstendig antigener som har immunogenisitet og ufullstendige antigener (inkludert haptener) uten immunogenisitet. I foreliggende oppfinnelse blir et enzym hvis kofaktor kan bli funksjonelt studert av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som virker som kofaktor eller substrat for enzymet, benyttet som det ovenfor beskrevne antigenet (immunogenet). Som dyr som skal bli immunisert kan foreksempel mus, rotte, hamster, marsvin, gris, kanin, høns, rhesusape og slike benyttes. Immunisering av disse dyrene med antigener kan bli utført ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagfolk på området. I foreliggende oppfinnelse blir antistoff-L-kjede- og -H-kjede variable regioner fortrinnsvis samlet fra immuniserte dyr eller celler derav. Denne prosedyren kan bli utført av fagfolk på området ved å benytte generelt kjente fremgangsmåter. Antigen-immuniserte dyr uttrykker antistoffet mot antigenet, spesielt i miltcellene. Derfor kan for eksempel mRNA bli fremstilt fra miltceller fra et immunisert dyr, og variable regioner for L-kjeden og H-kjeden kan bli gjenvunnet ved hjelp av RT-PCR ved å benytte primere mot dyrets variable regioner.

Spesifikt blir dyr immunisert med et enzym eller et substrat. Enzymet og substratet som ble benyttet som immunogener, kan være hele proteiner eller partielle peptider derav. Videre, avhengig av omstendighetene, kan et kandidatantigen bundet til et annet molekyl for å danne et løselig antigen, eller fragmenter av disse, bli benyttet som et immunogen for å immunisere dyr.

Miltceller er isolert fra miltene til immuniserte mus og fusjonert med musemyelo-celler for å fremstille hybridomer. Etter å ha valgt hybridomer som binder til de respektive antigenene, blir variable regioner for L-kjeden og H-kjeden gjenvunnet ved hjelp av RT-PCR ved å benytte for eksempel primere som tilsvarer de variable regionene. Primere for CDR, primere for rammeverksregioner som er mindre mangfoldige enn CDR, eller primere for signalsekvenser og CH- eller L-kjede konstant regionen (CL) kan også bli benyttet.

Alternativt blir mRNA ekstrahert fra miltceller fra immuniserte dyr og cDNA for L-kjedens og H-kjedens variable regioner ble gjenvunnet ved hjelp av RT-PCR ved å benytte primere i nærheten av de variable regionene. Videre kan lymfocytter også bli immunisert in vitro og anvendt til å konstruere scFv- eller Fab-presenterende biblioteker. De variable regionene kan bli fremskaffet ved å konsentrere og klone en antigenbindende antistoff-klon ved panering. I dette tilfellet kan screening bli utført ved å benytte tilsvarende biblioteker som er konstruert fra mRNA som er avledet fra de perifere blodmonocyttene, milt, mandel og lignende fra humane og ikke-immuniserte dyr som materialer.

De variable regionene blir deretter anvendt for å fremstille antistoff ekspresjonsvektorer. Ved å introdusere en anti-enzym-antistoff ekspresjonsvektor og en anti-substrat-antistoff ekspresjonsvektor inn i den samme cellen og uttrykke antistoffene kan et bispesifikt antistoff bli fremskaffet.

Antistoffer som har en kofaktor-funksjonserstattende aktivitet kan bli selektert, for eksempel ved hjelp av fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor. (1) I et reaksjonssystem som omfatter enzymet og substratet blir seleksjonen utført ved å benytte elevering av enzymaktivitet (substrat degraderingsevne) som en indeks, der eleveringen av enzymaktiviteten er et resultat av antistofftilsetning. (2) I et system for å måle eller simulere de biologiske funksjonene som enzymet, substratet og kofaktoren er involvert i (for eksempel et system for å måle plasma-koagulasjonen), blir seleksjonen utført ved å benytte aktiviteten for funksjonell gjenvinning som en indeks, der aktiviteten for funksjonell gjenvinning er et resultat av antistofftilsetting i fravær av kofaktoren.

Antistoffet som blir fremskaffet på denne måten, kan renses til homogenitet. Separasjon og rensing av antistoffet kan utføres ved hjelp av separasjons- og rense-fremgangsmåter som blir benyttet for generelle proteiner. Foreksempel kan antistoffer blir separert og renset ved å velge og kombinere egnede kromatografikolonner slik som affinitetskromatografi, filtrering, ultrafiltrering, utsalting, dialyse, SDS-polyakrylamid-gelelektroforese, isoelektrisk elektroforese osv. (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow og David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), men fremgangsmåtene er ikke begrenset til disse. En kolonne som blir benyttet til affinitetskromatografi, er for eksempel protein-A-kolonne, protein-G-kolonne og lignende.

For eksempel, når F.VIII/F.VIIIa er den substituerende kofaktor, det vil si når enzymet og substratkombinasjonen er plasmakoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor F.IXa og F.X, så har det bispesifikke antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse fortrinnsvis en struktur som omfatter den variable regionen til et anti-F.IXa-antistoff og den variable regionen til et anti-F.X-antistoff.

Bispesifikke antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse som funksjonelt erstatter F.VIII/F.VIIIa ble fremstilt ved hjelp av den følgende fremgangsmåten. Mus ble subkutant immunisert med kommersielt F.IXa eller F.X. Miltceller ble isolert fra miltene fra de immuniserte musene med et forhøyet antistofftiter, og fusjonert med musemyelomceller for å danne hybridomer. Hybridomer som binder til antigen-F.IXa eller F.X ble selektert, og L-kjedens og H-kjedens variable regionene ble gjenvunnet ved hjelp av RT-PCR ved å benytte primere for de variable regionene. L-kjedens variable region ble inkorporert i en CL-inneholdende L-kjede ekspresjonsvektor og H-kjedens variable region ble satt inn i en H-kjede ekspresjonsvektor inneholdende en H-kjede konstant region. I tillegg ble mRNA ekstrahert fra miltene til de immuniserte musene og hver cDNA for L-kjedens og H-kjedens variable regioner ble gjenvunnet ved hjelp av RT-PCR ved å benytte primere for den respektive variable region. Ved å benytte disse variable regionene ble et scFv-presenterende fag-bibliotek konstruert. Antigenbindende antistoffkloner ble konsentrert og klonet ved panering og antistoff ekspresjonsvektorene ble dannet ved å benytte den variable regionen derav. Anti-F.IXa-antistoff(H-kjede, L-kjede)ekspresjonsvektorene og anti-F.X-antistoff(H-kjede, L-kjede)-ekspresjonsvektorene ble introdusert inn i den samme cellen for antistoffekspresjon og bispesifikke antistoffer ble fremskaffet.

Bispesifikke antistoffer som ble fremskaffet på denne måten, ble undersøkt for deres effekter i å funksjonelt erstatte F.VIII/F.VIIIa (kofaktorer for F.X-aktivering ved F.IXa) i et analysesystem som omfatter F.XIa (F.IX-aktiverende enzym), F.IX, F.X, et syntetisk substrat (S-2222) for F.Xa og for fosfolipid. Som et bispesifikt antistoff som har aktivitet til funksjonelt å erstatte F.VIII/F.VIIIa, ble i prinsippet bispesifikke antistoffer som viser F.VIIIa-hermende aktivitet på 0,1 eller mer i dette analysesystemet selektert basert på analyseresultatene. Den F.VIIIa-hermende aktiviteten referert til her, er en verdi som ble fremskaffet i løpet av 30 eller 60 minutter ved å trekke verdien for absorbansendringen for et løsningsmiddel eller en kultursupernatant som ikke uttrykker antistoffet fra verdien til absorbansendringen til en antistoffløsning eller en kultursupernatant som uttrykker antistoffet.

Bispesifikke antistoffer som er selektert ovenfor eller bispesifikke antistoffer som er nært beslektet med dem, ble målt for deres evne til å gjenopprette koagulering i et koagulasjonstidsanalysesystem som benytter humant F.VIII-manglende plasma. Som et resultat av dette ble bispesifikke antistoffer som er i stand til forkorte koagulasjonstiden sammenlignet med når de ikke er tilsatt, fremskaffet. Koagulasjonstiden som ble referert til her, er, som vist i eksempel 7, den aktiverte partielle tromboplastintiden som er målt ved å anvende humant F.VIII-manglende plasma. Blant disse bispesifikke antistoffene har de foretrukne bispesifikke antistoffene evnen til å forkorte koagulasjonstiden med 10 sekunder eller mer, mer foretrukket med 20 sekunder eller mer, enda mer foretrukket med 40 sekunder eller mer og, mest foretrukket 50 sekunder eller mer.

H-kjeden-CDR3 ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset, men har spesifikt en komplementaritetsbestemmende region som omfatter en aminosyresekvens som er beskrevet i en hvilken som helst av H-kjede-CDR-sekvensene (SEKV. ID. NR.: 16, 20, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 og 96) for XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 og A69 beskrevet i eksemplene beskrevet nedenfor eller de som er funksjonelt ekvivalente dertil, og den komplementaritetsbestemmende regionen som omfatter en aminosyresekvens som er beskrevet i en hvilken som helst av H-kjede-CDR3-sekvensene (SEKV. ID. NR.: 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200 og 204) i SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, Bil, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B331, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 og SB27 eller de som er funksjonelt ekvivalente dertil.

Videre blir et spesifikt eksempel på de ovenfor beskrevne antistoffene fortrinnsvis kombinert fra et antistoff som har en komplementaritetsbestemmende region som omfatter en hvilken som helst av H-kjede-CDR-aminosyresekvensene til XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 og A69 (SEKV. ID. NR.: 14-16, 18-20, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82-84, 86-88, 90-92 og 94-96) eller en komplementaritetsbestemmende region som er funksjonelt ekvivalent dertil, og et antistoff som haren komplementaritetsbestemmende region som omfatter en hvilken som helst av H-kjede-CDR-sekvensene (SEKV. ID. NR.: 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 98-100, 102-104, 106-108, 100-112, 114-116, 118-120, 122-124, 126-128, 130-132, 134-136, 138-140, 142-144, 146-148, 150-152, 154-156, 158-160, 162-164, 166-168, 170-172, 174-176, 178-180, 182-184, 186-188, 190-192, 194-196, 198-200 og 202-204) i SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, Bil, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 og SB27) eller en komplementaritetsbestemmende region som er funksjonelt ekvivalent dertil.

Aminosyresekvenser for H-kjedens variable regioner til XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, SB04, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, Bil, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 og SB27 som er tilkjennegjort i foreliggende oppfinnelse er vist som SEKV. ID. NR.: 13, 17, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197 og 201.

Aminosyresekvensene til L-kjedens variable regioner til A44, B26, XB12 og SB04 som er tilkjennegjort i foreliggende oppfinnelse, er vist som SEKV. ID. NR.: 205, 209, 213 og 217. L-kjede-CDR-sekvensene til A44, B26, XB12 og SB04 er vis som SEKV. ID. NR.: 206-208, 210-212, 214-216 og 218-220. H-kjede-CDR-nukleotidsekvensene til XB12, SB04, A44 og B26 er vist som SEKV. ID. NR.: 221 (222), 223 (224), 225 (226), 233

(234), 235 (236), 237 (238), 245 (246), 247 (248), 249 (250), 257 (258), 259 (260) og 261 (262) (sekvenser i parenteser er aminosyresekvenser som er kodet for av de respektive nukleinsyrene), og deres L-kjede-CDR-nukleotidsekvenser er vist som SEKV. ID. NR.: 227 (228), 229 (230), 231 (32), 239 (240), 241 (242), 243 (244), 251 (252), 253 (254), 255 (256), 263 (264), 265 (266) og 267 (268). SEKV. ID. NR.: 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258 og 264 representerer CDR1. SEKV. ID. NR.: 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, 143, 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260 og 266 representerer CDR2. SEKV. ID. NR.: 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262 og 268 representerer CDR3.

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er ikke spesielt begrenset, men

fortrinnsvis de bispesifikke stoffene som er kombinert fra et anti-faktor-IXa-antistoff og et anti-faktor-X-antistoff, som harde samme epitopene som de tidligere nevnte antistoffene eller epitopene nært beslektet dertil. Antistoffer som har en lik eller nært beslektet epitop her, refererer for eksempel til de som konkurrerer med hverandre om antigenbinding i kompetitiv ELISA, osv. Uten å være begrenset dertil, i denne kompetitive ELISA-fremgangsmåten, blir faktor-IX/IXa eller faktor-X immobilisert på en 96-brønners Micro Well-plate, et egnet merket antistoff og et antistoff som skal undersøkes, blir samtidig tilsatt og bundet antistoff påvises ved å benytte markøren. Denne markøren er ikke spesielt begrenset og inkluderer alkalisk fosfatasemarkør, peroksidasemarkør, biotinmerket streptavidinbindende enzym (alkalisk fosfatase, peroksidase osv.), FITC og lignende. Det foreligger en epitopoverlapp hvis minst 50 % konkurranse observeres når antistoffet er til stede i en konsentrasjon på opp til 100 000 ganger overskudd av et antistoff som skal undersøkes.

Når man fremstiller et fullengdeantistoff ved å anvende de variable regionene som er tilkjennegjort i foreliggende oppfinnelse, så er ikke konstantregionene til antistoffet spesielt begrenset, og de som er kjent for fagfolk på området, for eksempel de som er beskrevet i "Sequences of proteins of immunological interest, (1991), U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service National Institutes of Health" og "An efficient route to human bispesific IgG, (1998). Nature Biotechnology vol. 16, 677-681", og slike kan anvendes.

I én utførelsesform av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse har antistoffene en effekt å funksjonelt erstatte kofaktorer, og er dermed ventet å bli effektive legemidler for sykdommer som er forårsaket av minskning i aktiviteten (funksjonen) til disse kofaktorene. I tilfeller der kofaktoren som er funksjonelt erstattet av et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er en blodkoagulasjonsfaktor og fibrinolyseassosiert faktor, er de ovenfor beskrevne sykdommene, for eksempel, blødning, sykdommer som følges av blødning, sykdommer som er forårsaket av blødning og lignende. Spesielt har funksjonell reduksjon og mangel på F.VIII/F.VIIIa, F.IX/F.Xa og F.XI/F.XIa vært kjent for å føre til unormal blødning som er referert til som hemofili.

Av hemofilitypene blir unormal blødning som skyldes medfødt hypofunksjon av F.VIII/F.VIIIa eller mangel på F.VIII/F.VIIIa referert til som hemofili A. Når en hemofili-A-pasient blør, blir erstatningsterapi med en F.VIII-formulering utført. I tillegg kan preventiv administrering av en F.VIII-formulering utføres (se ikke-patentdokumentene 1 og 2) på dagen med kraftig mosjon eller på en turdag, når hyppig intra-artikulær blødning forekommer, eller når pasienten er klassifisert som å ha alvorlig hemofili. Siden denne preventive administreringen av F.VIII-formuleringen merkbart reduserer blødnings-episoderfor pasienten med hemofili-A, har den i det siste blitt svært populær. Reduksjonen av blødningsepisoder reduserer ikke bare dødelige og ikke-dødelige blødningsrisikoer og den medfølgende smerten, men forebygger også hemofil artropati forårsaket av hyppig intra-artikulær blødning. Som et resultat bidrar den til forbedringen av hemofili-A-pasientens QOL.

Halveringstiden til en F.VIII-formulering i blodstrømmen er så kort som omtrent 12 til 16 timer. For kontinuerlig forebygging er det derfor nødvendig å administrere en F.VIII-formulering omtrent tre ganger i uken. Dette er ekvivalent med å opprettholde omtrent 1 % F.VIII-aktivitet eller mer (se ikke-patentdokument 3 og 4). I erstatnings-terapier for blødningshendelser er det også nødvendig periodisk å administrere booster-F.VIII-formuleringer i en viss periode, bortsett fra når blødningen er mild, for å hindre ny blødning og etablere fullstendig hemostase.

F.VIII-formuleringer blir videre administrert intravenøst. Det er tekniske vanskeligheter ved å utføre intravenøs administrering, og det blir enda mer vanskelig, spesielt når administrering blir utført på unge pasienter hvis vener er tynne.

I den ovenfor beskrevne preventive administreringen av F.VIII-formuleringen og ved kriseadministrering derav i tilfelle med blødningshendelser, blir hjemmebehandling og selvinjeksjon benyttet i de fleste tilfeller. Behovet for hyppig administrering og de tekniske vanskelighetene som er involvert, påfører ikke bare smerte til pasientene, men blir også grunnen som hindrer hjemmebehandling og selvinjeksjon fra å bli populært.

Følgelig har det vært en sterk etterspørsel, sammenlignet med nåværende blodkoagulasjonsfaktor FVIII-formuleringer, etter legemidler som har lengre administreringsintervaller og legemidler som enkelt kan administreres.

Videre kan anti-F.VIII-antistoffer som er referert til som inhibitorer, genereres i hemofili-A-pasienter, spesielt hos pasienter med alvorlig hemofili-A. Hvis en inhibitor blir generert, blir effekter av en F.VIII-formuleringer hindret av inhibitoren. Som et resultat blir hemostasekontroll svært vanskelig for pasientene.

Når en slik hemofili-A-inhibitorpasient blør, blir nøytraliseringsterapi som anvender en massiv dose F.VIII-formulering eller bypass-terapi som anvender et komplekst konsentrat eller F.VIIa-formulering vanligvis utført. Ved nøytraliseringsterapi kan imidlertid administrering av en massiv dose med F.VIII-formulering negativt forhøye inhibitor (anti-F.VIII-antistoff)-titre. Ved bypass-terapi blir i tillegg de relativt korte halveringstidene (omtrent 2 til 8 timer) for komplekse konsentrater og F.VIIa-formulering problematiske. Siden deres virkningsmekanismer dessuten er uavhengig av F.VIII/F.VHIa-funksjonen, dvs. en funksjon for å katalysere aktiveringen av F.X ved F.IXa, kan det hende at hemostasemekanismen ikke virker godt og blir ikke-responsiv. I mange tilfeller av hemofili-A-inhibitorpasienter blir derfor tilstrekkelig hemostatiske effekter ikke oppnådd sammenlignet med hemofili-A-ikke-inhibitor-pasienter.

Det har derfor vært en sterk etterspørsel etter legemidler som er upåvirket av tilstedeværelsen av inhibitorer og som funksjonelt kan erstatte F.VIII/F.VIIIa.

I tillegg til hemofili og pådratt hemofili forårsaket av anti-F.VIII-autoantistoff, har von Willebrands sykdom som er forårsaket av funksjonell abnormitet eller mangel på vWF blitt kjent som en unormal blødningsforstyrrelse assosiert med F.VIII/F.VIIIa. vWF er nødvendig ikke bare for den normale adhesjonen av blodplater til subendotelvev på steder med karveggskade, men også til dannelsen av komplekser med F.VIII for å opprettholde et normalt plasma-F.VIII-nivå. Hos pasienter med von Willebrands sykdom kan disse funksjonene avta og funksjonell abnormitet av hemostase forekommer.

Med hensyn på det som er beskrevet ovenfor, kan fremgangsmåter som anvender antistoffer bli overveid til fremstilling av legemidler som (i) har lange administreringsintervaller, (ii) med letthet kan bli administrert og (iii) er upåvirket av tilstedeværelsen av inhibitorer, og (iv) som funksjonelt kan erstatte F.VIII/F.VIIIa på en F.VIII/F.VHIa-uavhengig måte. Vanligvis er halveringstidene for antistoffer i blodstrømmen relativt lange - fra flere dager til flere uker. Videre er antistoffer kjent for å migrere inn i blodstrømmen etter subkutan administrering. Det betyr at antistofflegemidler generelt imøtekommer de ovenfor beskrevne kravene i (i) og (ii).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som en aktiv ingrediens. For eksempel når et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er ett av antistoffene som gjenkjenner både F.IX/F.IXa og F.X, og som kan funksjonelt erstatte F.VIIIa, er antistoffet forventet å kunne bli et farmasøytisk middel eller legemiddel for å forebygge eller behandle blødning, forstyrrelser som innebærer blødning eller forstyrrelser forårsaket av blødning. Når et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse er ett av antistoffene som gjenkjenner F.X/F.Xa og protrombin og som funksjonelt kan erstatte F.Va, er antistoffet videre forventet å kunne bli et farmasøytisk middel eller legemiddel for å forebygge eller behandle blødning, forstyrrelser som følges av blødning eller forstyrrelser forårsaket av blødning.

Samtidig er det forventet at et antistoff som binder til ZPI og F.X og som funksjonelt erstatter PZ, kan bli et farmasøytisk middel eller legemiddel med anti-trombotisk virkning, et antistoff som binder til trombin og TAFI og som funksjonelt erstatter TM, kan bli et farmasøytisk middel eller legemiddel med en hemostase- fremmende effekt og et antistoff som binder til trombin og PC og som funksjonelt erstatter PS/TM-system, kan bli et farmasøytisk middel eller legemiddel med en koagulasjonsmodulerende effekt.

Siden komplement C4-mangel forårsaker systemisk lupus erythematosus (SLE), er i tillegg et antistoff som funksjonelt erstatter C4b, forventet å kunne bli et farmasøytisk middel eller legemiddel med en effekt som undertrykker SLE-fremkomst. Siden H-faktor-mangel forårsaker suppurativ infeksjon og autoimmun glomerulonefritt, er et antistoff som funksjonelt erstatter H-faktor, forventet å kunne bli et farmasøytisk middel eller legemiddel med en effekt som undertrykker fremkomsten av disse sykdommene.

For formulering av farmasøytiske midler kan farmasøytiske preparater som omfatter et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse som blir benyttet til behandling eller forebygging som en aktiv ingrediens, blandes med en hensiktsmessig farmasøytisk akseptabel bærer, medium og slike som er inerte dertil, hvis nødvendig. For eksempel kan sterilt vann eller fysiologisk saltvann, stabilisatorer, eksipienser, antioksidanter (askorbinsyre osv.), buffere, fosforsyre, sitronsyre, andre organiske syrer, osv.), antiseptiske midler, overflateaktive midler (PEG, Tween, osv.) chelaterende midler (EDTA, osv.), bindingsmidler og slike bli benyttet. Farmasøytiske preparater kan også inneholde andre polypeptider med lav molekylvekt, proteiner slik som serumalbumin, gelatin og immunglobuliner, aminosyrer slike som glysin, glutamin, asparagin, arginin og lysin, sukkere slike som polysakkarid og monosakkarid og karbohydrater, og sukkeralkoholer slike som mannitol og sorbitol. Når det fremstilles vandige løsninger for injeksjon, inkluderer for eksempel løseliggjørende midler inkludert fysiologisk saltvann, isotone løsninger som inneholder glukose og andre adjuvans-midler slike som D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol og natriumklorid, og kan benyttes i kombinasjon med egnede løseliggjørende midler som alkohol (etanol osv.), polyalkohol (propylenglykol, PEG osv.) og ikke-ioniske overflatestoffer (polysorbat 80, HCO-50 osv.).

Hvis nødvendig kan videre antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse innkapsles i mikrokapsler (mikrokapsler fremstilt av hydroksymetylcellulose, gelatin, poly(metyl-metakrylat), osv.), eller inkludert i et kolloidalt legemiddel leveringssystem (liposom, albuminmikrokule, mikroemulsjon, nanopartikkel og nanokapsel osv.) (se "Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Olso utg. (1980) osv.). Fremgangsmåter for å formulere vedvarende frigjørende legemidler er også kjent og kan benyttes på antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277 (1981), Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982), U.S. patentskrift nr. 3 773 919, europeisk patentsøknad nr. (EP): 58 481, Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556

(1983), EP 133 988).

Antistoffer eller farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i kombinasjon med blodkoagulasjonsfaktor-VIII. Antistoffer eller farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres med blodkoagulasjonsfaktor- VIII samtidig eller med et intervall mellom dem. Administrering kan utføres med et sett som kombinerer et antistoff eller farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse med blodkoagulasjonsfaktor-VIII. Når et antistoff eller farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse blir anvendt i kombinasjon med blodkoagulasjonsfaktor-VIII, hvis ønskelig, er det også mulig å benytte lavere doser enn når de benyttes alene.

Selv om doseringen av de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er hensiktsmessig bestemt ved å overveie formuleringstypen, fremgangs-måten for administrering, alderen og kroppsvekten til pasientene, pasientenes symptomer, type og progresjon av sykdom, osv., og i siste instans av leger, kan vanligvis doser på 0,1 til 2000 mg/dag oppdeles i én til flere administreringer for voksne. Dosen er fortrinnsvis 1 til 1000 mg/dag, mer foretrukket 5 til 500 mg/dag og mest foretrukket 100 til 300 mg/dag. Selv om dosen varierer i henhold til kroppsvekten og alderen til pasientene, administreringmåter og lignende, kan en fagperson på området hensiktsmessig velge en egnet dosering. Fortrinnsvis blir doseringsperioden også hensiktsmessig bestemt i henhold til foreksempel helingsprosessen til pasientene.

Videre er det også mulig å utføre genterapi ved å sette inn et gen som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse inn i genterapivektorer. Som en administreringsfremgangsmåte som er forskjellig fra direkte administrering av nakne plasmider, kan genene administreres ved å pakke dem inn i liposomet og lignende, eller innsetting i ulike virusvektorer, slike som retrovirusvektor, adenovirusvektorer, vaccinia virusvektorer, koppevirusvektorer, adeno-assosierte virusvektorer og HVJ-vektorer (se Adolph "Virus Genome Method" CRC Press, Florid (1996), eller ved belegning på bærerkuler, slike som kolloidale gullpartikler (WO 93/17706 osv.). Likevel kan genet administreres ved hjelp av enhver fremgangsmåte så lenge antistoffet kan uttrykkes in vivo for å utøve sin virkning. Fortrinnsvis blir en tilstrekkelig dose administrert via en hensiktsmessig parenteral rute, slik som ved intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intrakutan, intra-fettvev, intra-bryst og intramuskulær injeksjon og infusjon, inhalering, gassinduserbart partikkelbombarderingsfremgangsmåte (med en elektronkanon og lignende), eller via slimhinne ved å benytte nesedråper. Gener som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, kan administreres ved å introdusere genet inn i blodceller, celler som er avledet fra benmarg og lignende, ved å benytte ex vivo-liposomtransfeksjon, partikkelbombarderingsfremgangsmåte (U.S. patentskrift nr. 4 945 050) eller virusinfeksjon, og reintrodusere disse cellene inn i dyrene. Ved genterapi kan ethvert gen som koder for et antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel gener som omfatter nukleotidsekvenser for CDR-er for de ovenfor beskrevne XB12, SB04, A44 og B26 benyttes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for å forebygge og/eller behandle blødning, forstyrrelser som følges av blødning eller forstyrrelser forårsaket av blødning, som omfatter trinnene med å administrere antistoff eller preparat ifølge denne oppfinnelsen. Antistoffer eller preparater kan for eksempel administreres ved hjelp av de tidligere nevnte fremgangsmåtene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av antistoffene ifølge denne oppfinnelsen for fremstilling av (farmasøytiske) preparater ifølge denne oppfinnelsen.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse sett som omfatter minst et antistoff eller preparat ifølge denne oppfinnelsen som skal benyttes i de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene. Glassprøyter, injeksjonsnåler, farmasøytisk akseptabelt medium, alkoholbomull, bandasje, instruksjonsmanual som beskriver anvendelsen, eller lignende kan også eventuelt være forpakket i disse settene.

Nedenfor vil foreliggende oppfinnelse spesifikt bli beskrevet med referanse til eksempler.

Eksempel 1: Fremstilling av ikke-nøytraliserende antistoff mot faktor-IXa (F.IXa)

1-1. Immunisering og fremstilling av hybridomer

Åtte BALB/c-mus (hanner, 6 uker gamle da immunisering ble initiert (Charles River, Japan)) og fem MRL/lpr-mus (hanner, 6 uker gamle da immunisering ble initiert (Charles River, Japan)) ble immunisert med human faktor-IXap (Enzyme Research Laboratories, Inc.) som beskrevet nedenfor. Som en første immunisering ble faktor-IXap (40 ug/hode) emulgert med FCA (Freunds komplette adjuvans H37 Ra (Difco laboratories)) subkutant administrert. To uker senere ble faktor-IXap (40 ug/hode) emulgert med FIA (Freunds ukomplette adjuvans (Difco laboratories)) subkutant administrert. Etter dette ble tre til sju boosterimmuniseringer utført med én ukes intervaller. Etter at titre til et plasmaantistoff mot faktor-IXap var bekreftet å være forhøyet ved hjelp av ELISA (Enzymbundet immunosorbent analyse) beskrevet i 1-2, ble faktor-IXap (40 ug/hode) fortynnet i PBS(-) (fosfatbufret saltvann fritt for kalsiumioner og magnesiumioner) intravenøst administrert som en siste immunisering. Tre dager etter den siste immuniseringen ble milter skåret ut fra musene. Mens en del av dette ble benyttet i eksempel 10-2 ble resten av miltcellene fusjonert med musemyelomceller P3X63Ag8U.l (referert til som P3U1, ATCC CRL-1597) ved en standardfremgangsmåte ved å benytte PEG1500 (Roche Diagnostics). Fusjonerte celler suspendert i RPMI1640-medium (Invitrogen) inneholdende 10 % FBS (Invitrogen) (heretter referert til som 10 % FBS/RPMI1640) ble sådd ut ti en 96-brønners kulturplate, og 1, 2, 3 og 5 dager etter fusjonen ble mediet erstattet med et HAT-seleksjonsmedium (10 % FBS/RPMI1640/2 % HAT 50x-konsentrat (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd)/5 % BM-Condimed Hl (Roche Diagnostics) for selektivt å dyrke hybridomer. Ved å benytte supernatantene som var samlet på den 8. og 9. dagen etter fusjonen, ble faktor-IXa-bindingsaktivitet målt ved ELISA beskrevet i 1-2 for å selektere hybridomer som hadde faktor-IXa-bindingsaktivitet. Deretter ble aktiviteten til nøytraliserende faktor-IXa-enzymatisk aktivitet målt ved hjelp av fremgangsmåten som beskrevet i 1-3 for å selektere hybridomer som ikke har faktor-

IXa-nøytraliserende aktivitet. Hybridomer ble klonet to ganger ved å utføre begrensende fortynninger der en celle blir sådd ut i hver brønn på en 96-brønners kulturplate. Enkeltkoloniceller bekreftet ved hjelp av mikroskopisk observasjon ble utsatt for ELISA og nøytraliseringsaktivitetsanalyse som beskrevet i 1-2 og 1-3 ble utført for klonseleksjon. Ascites inneholdende det klondannede stoffet ble fremstilt ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i 1-4 og antistoffet ble renset fra ascitesen. Det rensede antistoffet var ikke i stand til å forlenge APTT (aktivert partiell tromboplastintid) og dette ble bekreftet ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i 1-5.

1-2. Faktor-IXa-ELISA

Faktor-IXap ble fortynnet til 1 ug/ml med en belegningsbuffer (100 mM natrium-bikarbonat, pH 9,6, 0,02 % natriumazid) og fordelt i Nunc-Immuno plate (Nunc-Immuno 96 Micro Well plates MaxiSorp (Nalge Nunc International)) ved 100 ul/brønn. Deretter ble platen inkubert ved 4 °C over natten. Etter å ha vasket platen med PBS(-) inneholdende Tween 20 to ganger, ble den blokkert med en fortynningsbuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,1, 1 % bovint serumalbumin, 1 mM MgCI2, 0,15 M NaCI, 0,05 % Tween 20, 0,02 % natriumazid) ved romtemperatur i 2 timer. Etter å ha fjernet bufferen ble et fortynningsbuffer-fortynnet museantiserum eller hybridom kultursupernatant tilsatt med 100 ul/brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter å ha vasket platen tre ganger ble alkalisk fosfatasemerket geite-anti-muse-IgG (H+L) (Zymed Laboratories) som hadde blitt fortynnet til 1/2000 med fortynningsbufferen tilsatt med 100 ul/brønn og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter å ha vasket platen seks ganger ble et kolorimetrisk substrat «Blue-Phos» fosfatsubstrat (Kirkegaard & Perry Laboratories) tilsatt med 100 ul/brønn og inkubert ved romtemperatur i 20 minutter. Etter å ha tilsatt «Blue-Phos»-Stoppløsningen (Kirkegaard & Perry Laboratories) (100 ul/brønn), ble absorbansen ved 595 nm målt med en Model 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories).

1-3. Måling av faktor-IXa-nøytraliserende aktivitet

Fosfolipid (Sigma-Aldrich) ble løst i destillert vann for injeksjon og ultrasonikert for å fremstille en fosfolipidløsning (4000 ug/ml). Trisbufret saltvann inneholdende 0,1 % bovint serumalbumin (heretter betegnet som TBSB) (40 ul), 30 ng/ml faktor-IXap (Enzyme Reasearch Laboratories) (10 ul), 400 ug/ml fosfolipidløsning (5 ul), TBSB inneholdende 100 mM CaCI2og 20 mM MgCI2(5 ul), og hybridom-kultursupernatant (10 ul) ble blandet i en 96-brønners plate og inkubert ved romtemperatur i 1 time. I denne blandede løsningen ble 50 ug/ml faktor-X (Enzyme Research Laboratories) (20 ul) og 3 U/ml faktor-VIIIa (American diagnostica) (10 ul) tilsatt og reagert ved romtemperatur i 30 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 0,5 M EDTA (10 ul). Etter tilsetting av en S-2222-løsning (50 ul, Chromogenix) og inkubering ved romtemperatur i 30 minutter ble absorbansen målt ved bølgelengde 405 nm og referansebølgelengde 655 nm på en modell 3550 Microplate Reader (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

1-4. Ascites-fremstilling og antistoffrensing

Ascites fra de etablerte hybridomene ble fremstilt i henhold til standardprosedyrer. Det vil si at hybridomen ble dyrket in vitro (2 x IO<6>) og transplantert inn i peritonealhulen til en BALB/c-mus (hann, 5 til 7 uker gammel på det tidspunkt eksperimentet ble startet, Japan Charles River) eller BALB/c-nakenmus (hunn, 5 til 6 uker gammel på tidspunktet eksperimentet ble startet, Japan Charles River og Japan CLEA), som ble intraperitonealt administrert to ganger med pristan (2,6,10,14-tetrametylpentadekan, WAKO Pure Chemical Industries) på forhånd. Én til fire uker etter transplantasjonen ble ascites samlet fra musen med en oppblåst mage.

Antistoffet ble renset fra ascites ved å benytte en Protein G Sepharose 4 Fast Flow-kolonne (Amersham Biosciences). Ascites ble fortynnet 2 ganger med en bindings-buffer (20 mM natriumacetat, pH 5,0) og påsatt kolonnen, som hadde blitt vasket med 10 kolonnevolumer av bindingsbufferen. Antistoffet ble eluert med 5 kolonnevolumer av en elueringsbuffer (0,1 M glysin-HCI, pH 2,5), og nøytralisert med en nøytraliseringsbuffer (1 M Tris-HCI, pH 9,0). Den resulterende løsningen ble konsentrert ved å benytte en Centriprep 10 (Millipore) og løsningsmidlet ble erstattet med TBS (50 mM Tris-bufret saltvann). Antistoffkonsentrasjonen ble beregnet fra absorbansen ved 280 nm med A

(1 %, 1 cm) = 13,5. Absorbansen ble målt med DU-650 (Beckman Coulter).

1- 5. Måling av APTT (aktivert partiell tromboplastintid)

APTT ble målt med en CR-A (Amelung)-tilkoblet KC10A (Amelung). En blanding av den TBSB-fortynnede antistoffløsningen (50 ul), standard humant plasma (Dade Behring)

(50 ul), og APTT-reagens (Dade Behring) (50 ul) ble varmet til 37 °C i 3 minutter. Til denne blandingen ble 20 mM CaCI2(Dade Behring) (50 ul) tilsatt for å sette i gang koaguleringsreaksjon og koaguleringstiden ble målt.

Eksempel 2: Fremstilling av ikke-faktor-X (F.X)-nøytraliserende antistoff

2- 1. Immunisering og hybridomfremstilling

Åtte BALB/c-mus (hanner, 6 uker gammel da immuniseringen ble initiert, Japan Charles River) og fem MRL/Ipr mus (hanner, 6 uker gamle da immuniseringen ble initiert, Japan Charles River) ble immunisert med human faktor-X (Enzyme Research Laboratories) som beskrevet nedenfor. Som en første immunisering ble faktor-X (40 ug/hode) emulgert med FCA subkutant administrert. To uker senere ble faktor-X (20 eller 40 ug/hode) emulgert med FIA subkutant administrert. Deretter ble tre til seks booster-immuniseringer gitt med én ukes intervaller. Etter at titre for et plasmaantistoff mot faktor-X var bekreftet å være forhøyet ved hjelp av ELISA som beskrevet i 2-2, ble

faktor-X (20 eller 40 ug/hode) fortynnet i PBS (-) administrert intravenøst som en siste immunisering. Tre dager etter den siste immuniseringen ble musemilter skåret ut. Mens en del derav ble benyttet i eksempel 10-2, ble de gjenværende miltcellene fusjonert med musemyelom-P3Ul-celler i overensstemmelse en standard fremgangsmåte ved å benytte PWG1500. Fusjonerte celler suspendert i 10 % FBS/RPMI1640 medium ble sådd ut på en 96-brønners kulturplate, og hybridomer ble selektivt dyrket ved å erstatte mediet med et HAT-seleksjonsmedium 1, 2, 3 og 5 dager etter fusjonen. Bindingsaktivitet mot faktor-X ble målt ved hjelp av ELISA beskrevet i 2-2, ved å benytte kultursupernatanten som var samlet inn på den 8. dagen etter fusjonen. Hybridomer som hadde faktor-X-bindingsaktivitet ble valgt, og deres aktiviteter i forhold til å nøytralisere faktor-X/Xa-enzymaktivitet, ble målt ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i 2-3. Hybridomer som ikke har en nøytraliserende aktivitet mot faktor-Xa, ble klonet ved å utføre begrensende fortynning to ganger. Ascites inneholdende det klonedannede stoffet ble fremsilt ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i 1-4, og antistoffet ble renset fra ascites. Det rensede antistoffet var ikke i stand til å forlenge APTT og dette ble bekreftet ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i 1-5.

2-2. Faktor-X-ELISA

Faktor-X ble fortynnet til 1 ug/ml med en belegningsbuffer, og dispergert i en Nunc-immuno-plate med 100 ul/brønn. Deretter ble platen inkubert ved 4 °C over natten. Etter å ha vasket platen med PBS (-)-inneholdende Tween 20 tre ganger ble den blokkert med en fortynningsbuffer ved romtemperatur i 2 timer. Etter at bufferen var fjernet, ble et fortynningsbuffer fortynnet museantiserum eller hybridomkultursupernatant tilsatt til platen, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter at vasking av platen tre ganger ble alkalisk fosfatasemerket geit-anti-muse-IgG (H+L) som hadde blitt fortynnet til 1/2000 med fortynningsbufferen tilsatt, og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Etter å ha vasket platen seks ganger, ble et kolorimetrisk substrat «Blue-Phos» fosfatsubstrat (Kirkegaard & Perry Laboratories) tilsatt ved 100 ul/brønn og inkubert ved romtemperatur i 20 minutter. Etter tilsetning av «Blue-Phos»-stoppløsning (Kirkegaard & Perry Laboratories) (100 ul/brønn), ble absorbansen ved 595 nm målt med en Model 3550 mikroplateavleser (Bio-Rad Laboratories).

2-3. Måling av faktor-Xa-nøytraliserende aktivitet

Hybridomkultursupernatanten fortynnet til 1/5 med TBSB (10 ul) ble blandet med 40 ul TBCP (TBSB inneholdende 2,78 mM CaCI2og 22,2 uM fosfolipider (fosfatidylcholin:fosfatidylserin = 75:25, Sigma-Aldrich) inneholdende 250 pg/ml faktor-Xa (Enzyme Research Laboratories), og inkubert ved romtemperatur i 1 time. Til denne blandede løsningen ble TBCP (50 ul) inneholdende protrombin (Enzyme Research Laboratories) (20 ug/ml) og 100 ng/ml aktivert koagulasjonsfaktor-V (faktor-Va

(Haematologic Technologies)) tilsatt og reagert ved romtemperatur i 10 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 0,5 M EDTA (10 ul). Til denne reaksjonsløsningen ble 1 mM S-2238-løsning (Chromogenix) (50 ul) tilsatt, og etter inkubering ved romtemperatur i 30 minutter ble absorbans målt ved 405 nm med en Model 3550 mikroplateavleser (Bio-Rad Laboratories).

Eksempel 3: Konstruksjon av kimært bispesifikt antistoffekspresjonsvektor.

3-1. Fremstilling av antistoffvariabelregionkodende DNA-fragmenter fra hybridomer.

Fra hybridomer som produserer anti-F.IXa-antistoff eller anti-F.X-antistoff, ble total-RNA ekstrahert ved å benytte Qiagen RNeasy Mini Kit (QIAGEN) i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet i instruksjonsmanualen. Total-RNA ble løst i sterilt vann (40 ul). Enkelttrådet cDNA ble syntetisert ved RT-PCR ved å benytte Superscript cDNA synthesis system (Invitrogen) med det rensede RNA (1 til 2 ug) som templat, i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet i instruksjonsmanualen.

3-2. PCR-amplifisering av antistoff-H-kjedevariabelregion og sekvensanalyse

Som primere for å amplifisere museantistoff-H-kjedens variable region (VH) cDNA, ble en HB-primerblanding og HF-primerblanding beskrevet i rapporten til Krebber et al. (J. Immunol. Methods 1997, 201: 35-55) fremstilt. Ved å benytte 0,5 ul av hver av 100 uM HB-primerblandingen og 100 uM HF-primerblandingen ble en reaksjonsløsning (25 ul) (cDNA-løsning fremstilt i 3-1 (2,5 ul), KOD pluss buffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1,5 mM MgCI2, 0,75 enheter DNA-polymerase KOD pluss (TOYOBO)) fremstilt. Ved å benytte termosykleren Gene Amp PCR system 9700 (Perkin Eimer), ble PCR utført i overensstemmelse med amplifiseringseffektiviteten til cDNA-fragmentene, enten ved betingelsene A (3 min oppvarming ved 98 °C, etterfulgt av 32 sykler med reaksjon (98 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus)) eller betingelser B (3 min varming ved 94 °C etterfulgt av 5 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 46 °C, 20 sek og 68 °C, 30 sek i én syklus) og 30 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus)). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter av den ønskede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset ved å benytte et QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) i overensstemmelse med fremgangsmåtene som beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen og eluert med sterilt vann (30 ul). Nukleotidsekvenser for DNA-fragmentene ble bestemt ved å benytte en BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) på en DNA-sekvensator ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Sekvensgrupper som ble bestemt ved hjelp av denne fremgangsmåten ble komparativt analysert ved å benytte en analytisk programvare, GENETYX-SV/RC versjon 6.1 (Genetyx) og DNA med ulike sekvenser ble valgt.

3-3. Fremstilling av antistoffvariabelregion-DNA-fragmenter til kloning

Den følgende prosedyren ble utført for å innføre restriksjonsenzym Sfi I kløyvingsseter for kloning på begge endene til amplifikasjonsfragmentene til antistoffvariabelregion. For å amplifisere VH-fragmentene innført med et Sfi I-kløyvingssete (Sfi I-VH) ble en primer (primer VH-5'-ende) der primeren HB (Gly4Ser)2-linkersekvensen er erstattet med en sekvens inneholdende Sfi I-kløyvingssete (SEKV. ID. NR.: 5) fremstilt. Ved å benytte 0,5 ul hver av den 10 uM sekvensspesifikke primer VH-5'-enden og 10 uM primer scfor (J. Immunol. Methods 1997, 201: 35-55) ble en reaksjonsløsning (20 ul), (renset løsning av et VH-cDNA-amplifikasjonsfragment fremstilt i 3-2 (1 ul), KOD pluss buffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1,5 mM MgCI2, 0,5 enheter DNA-polymerase KOD pluss (TOYOBO)) fremstilt. Ved å benytte en termosykler GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Eimer), ble PCR utført i henhold til amplifikasjonseffektivitet for cDNA-fragmentene, enten under betingelsene A (3 min oppvarming ved 98 °C etterfulgt av 32 sykler med reaksjon (98 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek, og 72 °C, 30 sek i en syklus)) eller ved betingelser B (3 min oppvarming ved 94 °C etterfulgt av 5 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 46 °C, 20 sek og 98 °C, 30 sek i én syklus) og 30 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek, og 72 °C, 30 sek i en syklus)). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter fra den ønskede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den medfølgende instruksjonsmanualen og eluert med sterilt vann (30 ul).

For å amplifisere museantistoff-L-kjedens variabelregion (VL)-cDNA-fragmentene ble 0,5 ul hver av 100 uM-LB-primerblanding og 100 uM LF-primerblanding som er beskrevet i rapporten til Krebberetal. (J. Immunol. Methods 1997, 201: 35-55 først benyttet, og en reaksjonsløsning (25 ul) (cDNA-løsning fremstilt i 3-1 (2,5 ul), KOD pluss buffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1,5 mM MgCI2, 0,75 enheter DNA-polymerase KOD pluss (TOYOBO)) fremstilt. Ved å benytte termalsykler GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Eimer), ble PCR utført i henhold til amplifiseringseffektiviteten til fragmentene, ved betingelser med 3 minutters oppvarming ved 94 °C etterfulgt av 5 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 46 °C, 20 sek og 68 °C, 30 sek i én syklus) og 30 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter med den ønskede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den medfølgende instruksjonsmanualen og eluert med sterilt vann (30 ul). Fragmentene foreligger i en tilstand der den primer-LF-avledede (Gly4Ser)3-linkersekvensen blir påsatt på deres C-terminaler. For å kunne innføre et Sfi I-kløyvingssete på C-terminalene til fragmentene ble en primer (primer-VL-3'-ende) der primeren LF (Gly4Ser)3-linker-sekvensen var erstattet med en sekvens som hadde et Sfi I-kløyvingssete (SEKV. ID. NR.: 6) fremstilt. For å amplifisere VL-fragmentene med innført Sfi I-kløyvingssetet (Sfi I-VL), ble 0,5 ul hver av 10 uM VL-3'-ende primerblanding og 10 uM scback-primer benyttet, og en reaksjonsblanding (20 ul) (renset løsning av VL-cDNA-amplifisierings-fragment (1 ul), KOD pluss buffer (TOYOBO, 0,2 mM dNTP-er, 1,5 mM MgCI2, 0,5 enheter DNA-polymerase KOD pluss (TOYOBO)) fremstilt. PCR ble utført ved å benytte en termosykler GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Eimer) ved betingelser med 3 minutter oppvarming ved 94 °C etterfulgt av 5 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 46 °C, 20 sek og 68 °C, 30 sek i én syklus) og 30 sykler med reaksjon (94 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter av den ønskede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen og eluert med sterilt vann (20 ul).

De rensede Sfi I-HH og Sfi I-VL-fragmentene ble fordøyd med Sfi I (Takara Bio) ved 50 °C over natt i en reaksjonsløsning fremstilt i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Deretter ble reaksjonsløsningen renset ved å benytte KIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med Buffer EB (30 ul) som er inkludert i settet.

3-4. Ekspresjonsplasmid for bispesifikke IgG-antistoff

Når det bispesifikke IgG-antistoffet av interesse ble produsert, ble det referert til "knobs-into-holes"-teknikken med IgGl (Ridgway et al., Protein Eng. 1996,): 617-621 når IgG4 ble fremstilt med en aminosyresubstituert CH3-del for å danne heteromolekyler for hver H-kjede. Type a (IgG4ya) substitueres med Y349C og T366W, og type b (IgG4yb) substitueres med E356C, T366S, L368A og Y407V. Videre ble en substitusjon (-ppcpScp- -> -ppcpPcp-) introdusert på hengsleregionene til begge typene. Nesten alle H-kjedene blir heteromolekyler ved hjelp av denne teknikken, likevel gjelder nødvendigvis ikke dette for L-kjedene, og dannelsen av unødvendige antistoffmolekyler kan påvirke påfølgende aktivititetsmålinger. For separat å uttrykke armene til hvert antistoffmolekyl (kalt HL-molekyl), som har ulike spesifisiteter og som effektivt danner typen av bispesifikt IgG-antistoff av interesse i celler, ble derfor de som er induserbare med ulike legemidler benyttet som ekspresjonsvektorer for hvert HL-molekyl.

Som ekspresjonsvektor for en arm av antistoffmolekylet (kalt høyre arm-HL-molekyl for hensiktsmessigheten) ble pcDNA4-g4H eller pcDNA4-g4L (fig. 1 eller fig. 2) fremstilt, der den respektive H-kjede- eller L-kjederegionen, dvs. en hensiktsmessig museantistoffvariabelregion (VH eller VL) og en human IgG4Ya-konstantregion (SEKV. ID. NR.: 7) eller K-konstantregion (SEKV. ID. NR.: 8) ble inkorporert inn i den tetrasyklin-induserbare vektoren pcDNA4 (Invitrogen) nedstrøms for signalsekvensen (IL3ss) for dyreceller (Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 1984, 81: 1075). Først ble Eco RV og Not I (Takara Bio) benyttet for å fordøye pcDNA4 på restriksjonsenzymkløyvingssetene som er til stede på dens multikloningssete. Høyrearm-H-kjede- eller -L-kjedeekspresjonsenheten (omtrent 1,6 kb eller omtrent 1,0 kb) for et kimært bispesifikt antistoff som har hensiktmessig antistoffvariabelregioner ble fordøyd med Xho I (Takara Bio). Deretter ble den renset med QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og reagert med DNA-polymerase-KOD (TOYOBO) ved 72 °C i 10 minutter i en reaksjonsløsningssammensetning som beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen for å gjøre enden butt. Fragmentene med butte ender ble renset med QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og fordøyd med Not I (Takara Bio). Not I/buttendefragmentene (henholdsvis 1,6 kb eller 1,0 kb) og den Eco RV/Not I-fordøyde pcDNA4 ble utsatt for en ligeringsreaksjon ved å benytte Ligation High (TOYOBO) i overensstemmelse med fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. En DH5a-E. Co//-stamme (Competent high DH5a (TOYOBO)) ble transformert med den ovenfor beskrevne reaksjonsløsningen. Fra de ampicillinresistente klonene som ble fremskaffet på denne måten ble respektive plasmid-DNA isolert med å benytte QIAprep Spin Miniprrep Kit (QIAGEN).

Som en ekspresjonsvektor for antistoffmolekylets andre arm, (kalt venstre arm-HL-molekyl for hensiktsmessigheten), ble pIND-g4H eller pIND-g4L (fig. 2 eller fig. 3) fremstilt i henhold til den ovenfor beskrevne fremgangsmåten, der H-kjede- eller L-kjederegionen, det vil si en passende museantistoffvariabelregion (VH eller VL) og en human IgG4Yb-konstantregionen (SEKV. ID. NR.: 9) eller K-konstantregionen (SEKV. ID. NR.: 8), ble inkorporert inn i den ecdysonanalog-induserbare typen pIND (Invitrogen) nedstrøms fra signalsekvensen (IL3ss) for dyreceller (EMBO. J. 1987, 6: 2939), og de respektive plasmid-DNA-er ble isolert.

3-5. Konstruering av ekspresjonsvektor for bispesifikt antistoff

Det tetrasyklin-induserbare type ekspresjonsplasmidet som ble fremstilt i 3-4 (pcDNA4-g4H eller pcDNA4-g4L) ble fordøyd med Sfi I, og ble utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Fragmenter (omtrent 5 kb) som mangler den iboende antistoffvariabel-regiondelen (VH eller VL (se fig. 1 eller fig. 2)) ble renset ved å benytte QIAqick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med sterilt vann (30 ul). Fragmentene, og det tilsvarende Sfi I-VH- eller Sfi-VL-fragmentet avledet fra det Sfi I-fordøyde anti-F.IXa-antistoffet som ble fremstilt i 3-3, ble utsatt for en ligeringsreaksjon ved å benytte Quick Ligation Kit (New England Biolabs) i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. En DH5a-stamme E. coli (Competent high DHa (TOYOBO) ble transformert med den ovenfor beskrevne reaksjonsløsningen. Videre ble fragmenter som var fremskaffet ved å fjerne antistoffvariabelregion delen ved hjelp av en tilsvarende teknikk som beskrevet ovenfor (VH eller VL (se fig. 2 eller fig. 33)) fra det Sfi I-fordøyde ecdysonanalog-induserbare ekspresjonsplasmidet (pIND-g4H eller pIND-4GL) som var fremstilt i 3-4 og det tilsvarende Sfi I-fordøyde anti-F.X-antistoff-avledede Sfi I-VH- eller Sfi I-VL-fragmentet inkorporert ved hjelp av en tilsvarende fremgangsmåte.

I hver av de ampicillinresistente transformantene som var fremskaffet på denne måten, ble insersjon av fragmenter av interesse bekreftet ved hjelp av koloni-PCR-fremgangsmåte ved å benytte primere som omfavner det innskutte fragmentet. For anti-F.IX-antistoff-kimære-H-kjede- eller L-kjede-ekspresjonsvektoren ble først en 21-mer CMVF primer (SEKV. ID. NR.: 10) som annealer til CMV-foroverprimingssetet oppstrøms for insersjonssetet, og en 18-mer BGHR-primer (SEKV. ID. NR.: 11) som annealer til BGH-reversprimingssetet nedstrøms for insersjonssetet syntetisert (Sigma Genosys). For anti-F.X-antistoff-kimær-H-kjede-eller-L-kjede-ekspresjonsvektoren ble en 24-mer EcdF-primer (SEKV. ID. NR.: 12) som annealer til oppstrøms for insersjonssete og en 18-mer-BGHR-primer (SEKV. ID. NR.: 11) som annealer til BGH-reversprimingssetet nedstrøms for insersjonssetet syntetisert (Sigma Genosys). For koloni-PCR ble en reaksjonsløsning (20 ul) (0,2 ul primer) (10 uM), KOD-dash buffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er og 0,75 enheter DNA-polymeraseprimer (10 uM), KOD-dash (TOYOBO), ble fremstilt. Til denne reaksjonsløsningen ble celler av transformantstammen tilsatt i hensiktsmessige mengder og PCR ble utført. PCR ble utført ved å benytte et termosykler-GeneAmp- PCR-system 9700 (Perkin Eimer) ved betingelser med 1 minutt varming ved 96 °C etterfulgt av 30 sykler med reaksjon (96 °C, 10 sek, 55 °C, 10 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese og kloner fra hvilke amplifiseringsfragmenter av den ønskede størrelsen ble fremskaffet, ble valgt. PCR-produktet ble behandlet med en ExoSAP-IT (Amersham Bioscences) for å inaktivere overskudd av primere og dNTP-er i henhold til den vedlagte instruksjonsmanualen. Nukleotidsekvenser for DNA-fragmentene ble bestemt ved å benytte et BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) på en DNA-sekvensator ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Sekvensgrupper som ble bestemt ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte, ble analysert ved en analytisk programvare, GENETYX-SV/RC versjon 6.1 (Genetyx). For VH ble kloner av interesse som ikke hadde noen insersjon, delesjon eller mutasjon valgt. For VL, i motsetning til fra P3Ul-avledede pseudo-VL-genet som ble benyttet i hybridomer, ble kloner av interesse som ikke hadde noen insersjon, delesjon eller mutasjon valgt.

Fra klonene av interesse ble de respektive plasmid-DNA isolert ved å benytte et QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, og deretter løst i sterilt vann (100 ul). Anti-F.IXa-antistoffkimær-H-kjedeekspresjonsvektor, anti-F.IXa-antistoff kimær-L-kjede-ekspresjonsvektor, anti-F.X-antistoffkimær-H-kjede-ekspresjonssvektor og anti-F.X-antistoff-kimær-L-kjede-ekspresjonsvektor ble betegnet henholdsvis pcDNA4-g4IXaHn, pIND-g4XHn og pIND-g4XLn. Hver plasmidløsning ble lagret ved 4 °C til de ble anvendt.

Eksempel 4: Uttrykking av kimære bispesifikke antistoffer i dyreceller

4-1. Fremstilling av DNA-løsninger

Ekspresjon av antistoffets høyrearm-HL-molekyl ekspresjonsvektorer (pcDNA4-g4IXaHn og pcDNA4-g4IXal_n) blir indusert ved hjelp av tetrasyklin. I fravær av tetrasyklin er Tet-repressorkodende plasmid pcDNA6/TR (Invitrogen) nødvendig for fullstendig å undertrykke deres ekspresjon. Videre ble ekspresjon av venstre arm antistoff-HL-molekyl ekspresjonsvektoren (pIND-g4XHn og pIND-g4XLn) indusert ved hjelp av et insekthormon ecdyson (ponasteron A). Dette krever plasmid-pVgRXR (Invitrogen) som koder for ecdyson reseptoren og retinoid-X-reseptor som reagerer med ponasteron A og indusere ekspresjon. Til transfeksjon av dyreceller ble derfor en blanding av totalt seks typer plasmid-DNA fremstilt. Til 1 ml cellekultur ble pcDNA4-g4IXaHn, pcDNA4-g4IXal_n, pIND-g4XHn og pIND-g4XLn (218,8 ng hver), i tillegg til pcDNA6/TR og pVgRXR (1312,5 ng hver) benyttet.

4-2. Transfeksjon av dyreceller

Human føtal nyrekarsinomcelle-avledet HEK293H-stamme (Invitrogen) ble suspendert i et DMEM-kulturmedium (Invitrogen) inneholdende 10 % FCS (MORTEGATE) og 1 ml av dette ble sådd ut med en celletetthet på 5 x IO<5>celler/ml i hver brønn på en 12-brønners plate for celler som fester seg (CORNONG) og dyrket i en C02-inkubator (37 °C, 5 % C02). Plasmid-DNA-blandingen som ble fremstilt i 4-1 ble tilsatt til en blanding av transfeksjonsreagenser, Lipofectaine 2000 (Invitrogen) (7 ul) og Opti-MEM I-medium (Invitrogen) (250 ul) og hensatt ved romtemperatur i 20 minutter. Den resulterende blandingen ble tilsatt til cellene i hver brønn og inkubert i 4 til 5 timer i en C02-inkubator (37 °C, 5 % C02).

4-3. Induksjon av bispesifikk IgG-antistoffuttrykking

Kulturmediet ble fjernet ved avsuging fra den transfekterte cellekulturen beskrevet ovenfor, og deretter ble 1 ml med et CHO-S-SFM-II-medium (Invitrogen) inneholdende 1 ug/ml tetrasyklin (Wako Pure Chemical Industries) tilsatt. Den resulterende blandingen ble inkubert i én dag i en C02-inkubator (37 °C, 5 % C02) for å indusere primæruttrykking av antistoffets høyrearm-HL-molekyl. Deretter, etter å ha fjernet mediet ved avsuging, vasking med 1 ml CHO-S-SFM-II-medium og tilsetting av 1 ml med et C02-S-SFM-II-medium inneholdende 5 uM ponasteron A (Invitrogen), ble blandingen inkubert i en C02-inkubator (37 °C, 5 % C02) i 2 til 3 dager, og sekundær ekspresjon av antistoffets høyrearm-HL-molekyl ble indusert slik at det bispesifikke IgG-antistoffet ble utskilt til mediet. Kultursupernatanten ble gjenvunnet og sentrifugert (omtrent 2000 g, 5 min, romtemperatur) for å fjerne cellene og konsentrert ved å benytte «Microcon»-YM-50 (Millipore), hvis nødvendig. Prøven ble lagret ved 4 °C inntil den ble benyttet.

Eksempel 5: Kvantifisering av konsentrasjonen av humant IgG

Affinitetsrenset geiteantistoff mot humant IgG-Fc (Cappel) ble justert til 1 ug/ml med en belegningsbuffer, og immobilisert på en Nunc-Immunoplate. Etter blokkering med en fortynningsbuffer (D.B.), ble en prøve av kultursupernatanten som hensiktsmessig var fortynnet med D.B., tilsatt. Som en standard for å beregne antistoffkonsentrasjonen ble videre humant IgG4 (humanisert antistoff-TF-antistoff, se WO 99/51743) fortynnet med D.B. i en to gangers fortynningsserie opp til 11 stadier som begynner på 1000 ng/ml tilsvarende tilsatt. Etter tre vaskinger ble geit-antihuman-IgG-alkaliefosfatase (Biosource International) reagert. Etter fem vaskinger ble platen fargeutviklet ved å anvende «Sigma 104» fosfatasesubstratet (Sigma-Aldrich) som et substrat, og absorbansen ved 405 nm ble målt på en absorbansavleser modell 3550 (Bio-Rad Laboratories) med en referanse-bølgelengde på 655 nm. Ved å benytte programvaren til Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories) ble human IgG-konsentrasjon i kultursupernatanten beregnet fra standardkurven.

Eksempel 6: F.Villa (aktivert koagulasjonsfaktor-VIII)-hermende aktivitetsanalyse

Den F.VIIIa-hermende aktiviteten til et bispesifikt antistoff ble undersøkt ved hjelp av den følgende enzymatiske analysen. De følgende reaksjonene ble alle utført ved romtemperatur. En blanding av 40 ul faktor-IX (3,75 ug/ml, Enzyme Research Laboaratories) og 10 ul av antistoffløsningen ble inkubert i en 96-brønners plate i 1 time. Deretter ble 10 ul faktor-XIa (10 ng/ml, Enzyme Research Laboratories), 20 ul faktor-X (50 ug/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 ul fosfolipid (400 ug/ml, se eksemplene 1-3), og 15 ul TBSB inneholdende 5 mM CaCI2og 1 mM MgCI2(heretter forkortet til TBSB-S) tilsatt for å initiere enzymatisk reaksjon. Etter 30 minutter ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 10 ul 0,5 M EDTA.

Etter å ha tilsatt en kolorimetrisk substratløsning (50 ul) til hver brønn, ble absorbans ved 405 nm (referanse bølgelengde 655 nm) ved 0 og 30 minutter målt med en modell 3550 Microplate Reader (Bio Rad Laboratories). Den F.VIIIa-hermende aktiviteten ble presentert som en verdi, fremskaffet ved å trekke verdien til absorbansendringen i løpet av 30 minutter uten antistofftilsetting fra verdien med antistofftilsetting (se fig. og fig. 5).

TBSB ble benyttet som et løsningsmiddel for fosfolipid, mens TBSB-S ble benyttet som løsningsmiddel for faktor-XIa, faktor-IX og faktor-X. Den kolorimetriske substrat-løsningen varen l:l-blanding av "Tesutochimu"-kolorimetrisk substrat S-2222 (Chromogenix) løst i henhold til den vedlagte instruksjonsmanual og en polybrenløsning (0,6 mg/l heksadimetrinbromid (Sigma)).

Videre ble konsentrasjonsavhengigheten av XB12/SB04 sin F.VIIIa-hermende aktivitet, som var den høyeste blant alle, målt (fig. 6).

Eksempel 7: Plasmakoagulasjonsanalyse

For å klarlegge om et bispesifikt antistoff korrigerer koagulasjonsevnen i hemofili-A-blod, ble effekter av det bispesifikke antistoffet på aktivert partiell tromboplastintid (APTT) undersøkt ved å anvende F.VIII-manglende plasma. En blandet løsning omfattende en antistoffløsning ved ulike konsentrasjoner (50 ul), F.VIII-manglende plasma (50 ul, Biomerieux) og APTT-reagens (50 ul, Dade Behring) ble varmet ved 37 °C i 3 minutter. Koagulasjonsreaksjonen ble initiert ved å tilsette 20 mM CaCI2(50 ul, Behring) til den ovenfor beskrevne blandingen. Tiden som var nødvendig for koagulasjon ble målt med CR-A (Amelung)-tilkoblet KC10A (Amelung) (fig. 7 og fig. 8).

Videre ble XB12/SB04, som viste den høyeste koagulasjonstidsforkortende aktiviteten, målt for sin konsentrasjonsavhengighet (fig. 9).

Eksempel 8: Antistoffrensing

Kultursupernatanten (10 ml) som er fremskaffet ved fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 4, ble konsentrert til 1 ml med «Centricon» YM-50 (Millipore). Til dette konsentratet ble 10 % BSA (10 ul), 1 % tween-20 (10 ul) og rProtein-A-«sepharose» Fast Flow (Amersham Bioscences) (100 ul) tilsatt, og løsningen ble blandet ved horisontal rotering ved 4 °C over natt. Løsningen ble overført til en «Ultrafree»-MC 0,22 um filterkopp (Millipore), og etter vasking med TBS inneholdende 0,01 % «Tween»-20 (500 ul) tre ganger, ble rProtein-A-«Sepharose»-resinet suspendert i 100 ul 10 mM HCI/0,01 % «Tween»-20 (pH 2,0) og hensatt i 3 minutter. Deretter ble antistoffet eluert og eluatet ble straks nøytralisert ved tilsetting av 5 ul 1 M tris-HCI, pH 8,0. Ved å benytte Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories) programvare ble konsentrasjonen av humant IgG beregnet fra standard kurven. Antistoffkonsentrasjonen ble kvantifisert i henhold til eksempel 5.

Eksempel 9: GST-AP - Western blotting av anti-F.X-antistoff

En rekombinant E. coli som uttrykker fusjonsprotein av F.X-aktivert peptid (AP) med glutation-S-transferase (GST) ble konstruert. cDNA som dekker fullengde-translasjonsregionen av humant F.X, ble PCR-amplifisert fra det humane lever Marathon-Ready cDNA (Clontech). Dette cDNA ble deretter anvendt som templat for å amplifisere regionen som koder for AP-region ved PCR (Leytus et al., Biochemistry 1986, 25: 5098), som ble subklonet inn i en pGEM-T-vektor (Promega) for å oppnå GST-AP-kodende pGEX-F10AP. E. coli transformert med dette plasmidet ble dyrket og ved OD = 0,8 ble 1 mM IPTG tilsatt for å indusere GST-AP-ekspresjon. Etter sentrifugering av kulturløsningen (3000 x g, 30 min, 4 °C) ble cellene samlet opp og lagret ved -20 °C inntil de ble anvendt.

Etter resuspendering av celle-peletten i 1/20 kulturvolum av PBS, ble 2,4 ml SDS-PAGE prøvebuffer (IWAKI) tilsatt for hver 0,1 ml av suspensjonen, og den resulterende blandingen ble kokt ved 95 °C i 5 minutter. Denne reaksjonsløsningen (10 ul) ble tilsatt til hver brønn på en 14 % SDS-PAGE-minigel (Asahi Technoglass), og utsatt for elektroforese. Etter elektroforesen ble gelen overført på en «Immobilon-P» Transfer Membrane (Millipore) ved å anvende en semi-tørr blotter (Bio-Rad) og blokkert med BT-PBS (PBS inneholdende 2 % BSA og 0,05 % «Tween»-20). Etter at blokkeringen var fullstendig, ble det reagert i 1 time med et anti-F.X-museantistoff SB04 eller SB06 renset i eksemplene 1-4 og fortynnet med BT-PBS til 2 ug/ml. Etter vasking med PBS inneholdende 0,05 % «Tween»-20, ble membranen reagert i 1 time med alkalisk fosfatasemerket geit-antimuse-IgG (H+L) (Zymed Laboratories) fortynnet 2000 ganger med BT-PBS. Etter vasking med PBS som inneholder 0,05 % «Tween»-20, ble membranen fargeutviklet med et kolorimetrisk substrat, BCIP/NBT fosfatasesubstrat (Kirkegaard & Perry Laboratories) (se fig. 10).

Eksempel 10: Fremskaffelse av bispesifikt antistoff fra immunisert musemilt-avledet scFv-bibliotek

10-1. Antigen og immunisering

Tre BALB/c-mus (hanner, 6 uker gamle når immuniseringen ble initiert (Japan Charles River)), 3 MRL/lpr-mus (hanner, 6 uker gamle når immuniseringen ble initiert (Japan Charles River), og 3 C57BL/6N-mus (hanner, 6 uker gamle når immuniseringen ble initiert (Japan Charles River) ble immunisert med antigen faktor-IXap (Enzyme Research Laboratories, Inc.) eller faktor-X (Enzyme Research Laboratories, Inc.) som beskrevet nedenunder. Som en innledende immunisering ble antigenet (40 ug/hode) emulgert med FCA (Freunds komplette adjuvans H37 Ra, Difco laboratories)) subkutant administrert. To uker senere ble antigenet (40 ug/hode) emulgert med FIA (Freunds ukomplette adjuvans, Difco laboratories) subkutant administrert. Etter dette ble tre booster-immuniseringer gitt med én ukes intervaller og 8 dager etter den siste immuniseringen ble milter skåret ut fra musene.

10-2. Konstruering av fagbibliotek

En del av miltene som var skåret ut fra de immuniserte musene, klargjort i eksempel 1-1 og 2-1, og miltene som var skåret ut fra de immuniserte musene, klargjort i eksempel 10-1, ble plassert i trizolreagens ((Invitrogen)) (50 mg milt/ml av reagenset) og homogenisert ved å anvende en glasshomogenisator. Deretter ble total-RNA ekstrahert i henhold til fremgangsmåten som var beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Fra ekstraktløsningen ble polyA(+)RNA ekstrahert ved å benytte PolyATract System 1000 kit (Promega) i henhold til fremgangsmåten som var beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. cDNA ble syntetisert ved hjelp av RT-PCR (SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR, (Invitrogen) og lagret ved -20 °C inntil bruk.

Som primere for amplifisering av cDNA for museantistoff-tungkjedevariabel-region (VH) og lettkjede-variabelregionen (VL) ble HB-primerblanding, HF-primerblanding, LB-primerblanding og LF-primerblanding anvendt i eksempel 3-2 og 3-3 fremstilt. Til VH-amplifisering ble en 50 ul reaksjonsløsning (2,5 ul cDNA-løsning, KOD plussbuffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1,5 mM MgCI2, 3,75 enheter DNA-polymerase KOD pluss (TOYOBO)) fremstilt ved å anvende 1 ul av 100 uM HB-primerblanding og 100 uM HF-primerblanding hver. Til VL-amplifisering ble ytterligere en 50 ul reaksjonsløsning av det samme preparat som beskrevet ovenfor, fremstilt ved å benytte 1 ul av 100 uM LB-primerblanding og 100 uM LF-primerblanding hver. PCR ble utført ved å anvende et termosykler-GeneAmp-PCR-system-9700 (Perkin Eimer) ved en 3-minutters oppvarming ved 98 °C etterfulgt av 32 sykler med reaksjon (98 °C, 20 sek, 58 °C, 20 sek og 72 °C, 30 sek i én syklus). Etter PCR ble reaksjonsløsningen utsatt for 2 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter av størrelsen av interesse (omtrent 400 bp) ble renset ved å anvende QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med sterilt vann (50 ul). Til scFv-fragment-amplifisering ble deretter ti rør med en 100 ul reaksjonsløsning (3 ul VH-fragmentløsning, 3 ul VL-fragmentløsning, KOD plussbuffer (TOYOBO), 0,2 mM dNTP-er, 1 mM MgCI2,

5 enheter DNA-polymerase KOD plussbuffer (TOYOBO) fremstilt. Etter den første PCR

(3 minutter varming ved 94 °C etterfulgt av de 7 sykler reaksjon (94 °C, 1 min og 63 °C,

4 min i én syklus)), ble 10 uM scfor-primer og 10 uM scback-primer (2,5 ul hver) tilsatt til hvert rør, holdt varmt ved 63 °C og deretter ble den andre PCR (en 35 sek varming ved 94 °C etterfulgt av 30 sykler med reaksjon (94 °C, 2 min og 63 °C, 2 min i én syklus)) utført. Etter PCR ble reaksjonsløsningen renset ved å benytte QIAquick PCR purification kit (QIAGEN) og de rensede produktene ble fordøyd med restriksjonsenzym Sfi I (Takara Bio) ved 50 °C over natt. Etter å ha utsatt fordøyningene for 2 % agarosegelelektroforese, ble amplifiserte fragmenter med størrelse av interesse (omtrent 800 bp) renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med en passende mengde sterilt vann. For å presentere scFv på fag-gen-III-protein, ble pELBGIacI (se fig. 11) benyttet som en fagemidvektor. Etter å ha fordøyd vektoren (10 ug) med restriksjons-senzym Sfi (Takara Bio) ved 50 °C over natt, ble kløyvingsfragmenter av størrelse av interesse (omtrent 5 kb) renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med en passende mengde sterilt vann. Det rensede PCR-produktet og det rensede vektorfragmentet ble utsatt for en ligeringsreaksjon ved 16 °C over natt, ved å benytte Ligation High (TOYOBO) ifølge fremgangsmåten som beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Elektrokompetente E. co//'-XLl-Blue- celler (Stratagene) eller elektromaks DH12s ((Invitrogen) ble transformert ved å anvende reaksjonsløsningen ved en elektroporeringsmåte ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Alle de ampicillinresistente transformantene som ble fremskaffet på det viset, ble samlet og lagret som det rekombinante biblioteket ved -20 °C inntil anvendelse.

E. co//'-biblioteket (2 x 10<9>cfu) ble inokulert i 50 ul 2 x YTAG (2x TY inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 2 % glukose) og dyrket ved 37 °C til OD 600 nådde 0,4 til 0,5. 4 x 10<11>hjelpefag VCSM13 (Strategene) ble tilsatt til kulturen, som ble hensatt ved 37 °C i 15 minutter for celleinfeksjon. De infiserte cellene ble dyrket ved 30 °C i 10 timer, etterfulgt av tilsetting av 450 ml 2x YTAK (2x TY inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 25 ug/ml kanamycin) og 25 ul av 1 mol/l IPTG. Kultursupernatanten ble samlet ved sentrifugering, blandet med 100 ml PEG-NaCI-løsning (10 % polyetylenglykol 8000, 2,5 mol/l NaCI), og hensatt ved 4 °C i 60 minutter. Fag ble presipitert ved sentrifugering ved 10 800 x g i 30 minutter, og presipitatet ble løst i 40 ml vann, blandet med 8 ml PEG-NaCI-løsning og hensatt ved 4 °C i 1 time. Fag ble presipitert ved hjelp av sentrifugering ved 10 800 x g i 30 minutter og løst i 5 ml PBS for å oppnå fagbiblioteket. Fagene ble lagret ved 4 °C inntil anvendelse.

10-3. Konsentrasjon av bundne fag ved hjelp av panering

Faktor-IXap eller faktor-X ble merket med biotin ved å benytte No-Weight Premeasured NHS-PE04-Biotin Microtubes (Pierce). Den biotinmerkede faktor-IXap eller faktor-X (100 pmol) ble tilsatt til fagbibliotekløsningen som var fremstilt i 10-2 (600 ul) og kontaktet med antigenet i 60 minutter. Dynabeads M-280 streptavidin (600 ul, DYNAL) vasket med 5 % M-PBS (PBS inneholdende 5 % vekt/volum skummet melk) ble tilsatt for binding i 15 minutter. De kulebundne fagene ble vasket flere ganger med PBST) PBS inneholdende 0,1 % Tween-20, 1 ml) og deretter med PBS. Kulene ble løst i 0,8 ml 0,1 mol/l glysin/HCI (pH 2,2) i 5 minutter for å eluere fagene.

Alternativt ble fagbiblioteket (80 ul/brønn x 5) som hadde blitt inkubert med

2,5 % vekt/volum skummet melk i 15 minutter tilsatt til faktor-IXap eller faktor-X

(10 ug/brønn x 5) immobilisert på en immunoplate (MaxiSorp, Nunc), og ble kontaktet med antigen i 60 minutter. De antigenbundne fagene ble vasket flere ganger med PBST (PBS inneholdende 0,1 % Tween-20, 1 ml) og deretter med PBS. De bundne fagene ble inkubert med 0,8 ml 0,1 ml/l glysin/HCI (pH 2,2) i 5 minutter for å eluere fagene.

Fagløsningen som var samlet på denne måten, ble nøytralisert ved å tilsette

2 mol/l tris (45 ul), tilsatt til 10 ml XLl-Blue-celler i logaritmisk vekstfase (OD 600 = 0,4 til 0,5), og hensatt i 30 minutter ved 37 °C for celleinfeksjon. Blandingen ble spredd ut på en 2x YTAG-plate og dyrket ved 30 °C. Kolonier ble samlet, inokulert i 2x YTAG og dyrket ved 37 °C inntil OD 600 = 0,4 til 0,5). IPTG (1 mol/l, 5 ul) og hjelpefag VCSM13 (10<11>pfu) ble tilsatt til kulturløsning (10 ml) og blandingen ble hensatt ved 37 °C i 30 minutter. Cellene ble samlet ved sentrifugering, resuspendert i 2x YTAK (100 ml), og dyrket ved 30 °C i 10 timer. Kultursupernatanten ble gjenvunnet ved sentrifugering, blandet med 10 % PEG-5 mol/l NaCI-løsning (20 ml) og hensatt ved 4 °C i 20 minutter. Fag ble presipitert ved hjelp av sentrifugering ved 10 800 x g i 30 minutter og løst i PBS (2 ml), og tilveiebrakt til den påfølgende paneringen.

10-4. Fag-ELISA

Den ovenfor beskrevne enkelte kolonien ble inokulert i 2 x YTAG (100 ul) og dyrket ved 30 °C over natt. Etter at 5 ul av denne kulturen var inokulert i 2 x YTAG (500 ul) og dyrket ved 37 °C i 5 timer, ble hjelperfag (2 x IO<8>pfu) tilsatt, og kulturen ble deretter hensatt ved 37 °C i 30 minutter. Etter 30 minutters dyrking med risting ved 37 °C, ble ytterligere 2 x YTAK inneholdende 0,5 mM IPTG (120 ul) tilsatt. Etter en over natt dyrking ved 30 °C, ble den sentrifugerte supernatanten utsatt for ELISA. For ELISA av kloner fremskaffet ved panering av biotinmerkede antigener, ble en Strepta Well 96 mikrotiterplate (Roche) belagt med 1,0 ug/ml biotinmerket antigen benyttet. For ELISA kloner fremskaffet ved panering av native antigener ble ytterligere en immunoplate (MaxiSorp, Nunc) immobilisert med 1,0 ug/ml nativt antigen benyttet. Etter vasking med PBST for å fjerne antigenet, ble reaksjonen blokkert med 200 ul 2 % M-PBS eller 2 % BSA-PBS (PBS inneholdende 2 % vekt/volum BSA) som en blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur. Etter å ha fjernet bufferen ble kultursupernatanten tilsatt til platen og hensatt i 60 minutter for fagbinding. Etter vasking ble de bundne fagene påvist med et HRP-bundet anti-M13-antistoff (Amersham Pharmacia Biotech) og TMB-substrat (Zymed). Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 1 mol/l H2S04og A450-verdi ble målt med en plateavleser.

10-5. Sekvensbestemmelse og klonseleksjon

Ved å benytte 2 x YTAG-kultumediet fra den ELISA-positive rekombinante E. coli-klonen, ble nukleotidsekvens for scFv-regionen bestemt ved hjelp av PCR-amplifisering med primerne PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC -3'/SEKV. ID. NR.: 1) og PBG3-Rl (5'-U I I ICATAATCAAAATCACCGG -3'/SEKV. ID. NR.: 2). En 15 ul PCR-løsning omfattende 1 ul kulturmedium, 1,5 ul 10 x KOD Dash-buffer, 0,2 ul hver av 10 ul/l-primere og 0,3 ul KOD Dash-polymerase (TOYOBO, 2,5 U/ul) ble utsatt for 30 sykler med amplifisering (96 °C, 10 sek, 55 °C, 10 sek og 72 °C, 30 sek) ved å benytte GeneAmp PCR-systemet 9700 termosykler (Perkin Eimer). Etter PCR ble 3 ul ExoSAP-IT

(Amersham) tilsatt til 5 ul av reaksjonsløsningen, og blandingen ble holdt varm ved 37 °C i 15 minutter og deretter ved 80 °C i 15 minutter. Reaksjonen av denne prøven ble utført ved å benytte BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) med PBG3-F2 (5'-ATTGCCTACGGCAGCCGCT-37SEKV. ID. NR.: 3) eller PBG3-R2 (5'-AAATCACCGGAACCAGAGCC-3'/SEKV. ID. NR.: 4) som primer og produktene ble utsatt for elektroforese på en Applied Biosystems PRISM 3700 DNA Sequencer. Som et resultat ble kloner som har ulike CDR3-aminosyresekvens beregnet fra nukleotidsekvensene valgt for 52 kloner som anti-faktor-IXa og 33 kloner som anti-faktor-X.

10-6. Konstruksjon av ekspresjonsvektor for de bispesifikke IgG-antistoff

For å uttrykke scFv-antistoff som en IgG-type, ble antistoffvariabelregioner (VH,

VL) klonet inn i induserbare ekspresjonsvektorer ved hjelp av fremgangsmåter tilsvarende de som er vist i eksempel 3-3, 3-4 og 3-5. Anti-F.IXa-antistoffvariabelregioner (VH og VL) ble individuelt inkorporert inn i en tetrasyklininduserbar vektor (pcDNA4-g4H og pcDNA4-g4L). Anti-F.X-antistoffvariabelregioner (VH og VL) ble individuelt inkorporert inn i en ecdysonanalog-induserbar vektor (pIND-g4H og pcDNAr-g4L). Fra klonene av interesse ble de respektive plasmid-DNA isolert ved å benytte QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) og løst i sterilt vann (100 ul).

10-7. Uttrykking av kimært bispesifikt antistoff i dyreceller

Ved å benytte DNA-løsningen som var fremstilt ved hjelp av fremgangsmåter som vist i eksempel 4-1, ble DNA uttrykt i dyreceller ved hjelp av fremgangsmåter tilsvarende de som er vist i eksemplene 4-2 og 4-3, og kultursupernatanten ble samlet opp. Prøven ble lagret ved 4 °C inntil anvendelse.

Eksempel 11: Antistoffrensing

Til 10 ml av kultursupernatanten som var fremskaffet ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 10-7, ble 100 ul rProtein-A-«Sepharose» Fast Flow (Amersham Biosciences) tilsatt og blandet med horisontal rotering ved 4 °C over natt. Løsningen ble overført til en «Ultrafree»-MC 0,22 filterkopp (Millipore) og etter tre vaskinger med 500 ul TBS inneholdende 0,01 % «Tween»-20, ble rProtein-A-«Sepharose» resin suspendert i 100 ul med 10 mM HCI/0,01 % «Tween»-20 (pH 2,0) og hensatt i 3 minutter. Antistoffet ble deretter eluert og eluatet ble straks nøytralisert ved å tilsette 5 ul 1 M tris-HCI, pH 8,0. Ved å benytte Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories) programvaren ble konsentrasjonen av det humane IgG i kultursupernatanten beregnet fra standardkurven med humant IgG4 (humanisert a nti-TF-a nti stoff, se WO 99/51743). Antistoffkonsentrasjonen ble kvantifisert i henhold til eksempel 5.

Eksempel 12: F.Villa (aktivert koagulasjonsfaktor-VIII)-hermende aktivitetsanalyse

Den F.VIIIa-hermende aktivitet til et bispesifikt antistoff ble vurdert ved den følgende enzymatiske analysen. De følgende reaksjonene ble alle utført ved romtemperatur. En blandet løsning av 10 ul faktor-IX (15 ug/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 ul TBSB inneholdende 100 mM CaCI2og 20 mM MgCI2og 50 ul av kultursupernatanten fremskaffet ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 10-7, ble inkubert i en 96-brønners plate i 1 time. Deretter ble 10 ul faktor-XIa (10 ng/ml, Enzyme Research Laboratories), 20 ul faktor-X (50 ug/ml, Enzyme Research Laboratories), og 5 ul fosfolipider (400 ug/ml) tilsatt for å initiere den enzymatiske reaksjonen. Etter 30 minutter ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 10 ul 0,5 M EDTA.

Etter å ha tilsatt 50 ul av en kolorimetrisk substratløsning til hver brønn, ble absorbansen ved 405 nm (referansebølgelengde 655 nm) målt ved 0 og 60 minutter med en modell 3550 Microplate Reader (Bio Rad Laboratories). F.VIIIa-hermende aktivitet ble uttrykt som en verdi som ble fremskaffet ved å trekke verdien for absorbansendringen i kultursupernatanten som ikke uttrykker noe antistoff fra verdien for kultursupernatanten som uttrykker antistoffet (se fig. 12).

TSTB ble benyttet som et løsningsmiddel for fosfolipid, faktor-XIa, faktor-IX og faktor-X. Den kolorimetriske substratløsningen varen 1:1 blanding av "Tesutochimu" kolorimetrisk substrat S-2222 (Chromogenix) løst i henhold til den vedlagte instruksjonsmanual og polybrenløsning (0,6 mg/l heksadimetrinbromid, Sigma).

Eksempel 13: Plasmakoagulasjonsanalyse

For å klarlegge om et bispesifikt antistoff fremstilt i henhold til fremgangs-måten i eksempel 11 gjenvinner koagulasjonsevnen til hemofili-A-blod, ble effekten av antistoffet på aktivert partiell tromboplastintid (APTT) ved å benytte F.VIII-manglende plasma undersøkt ved hjelp av fremgangsmåten som er tilsvarende den som er vist i eksempel 7 (se fig. 13). Videre ble A44/B26 og A69/B26, som er svært effektive i å forkorte koagulasjonstid, målt for deres konsentrasjonsavhengighet (se fig. 14 og 15).

Eksempel 14: Evaluering av den samtidige anvendelsen av bispesifikke antistoff og F.VIII

Samtidig anvendelse av et bispesifikt antistoff og F.VIII ble evaluert ved de følgende plasmakoagulasjonsanalysebetingelsene. En blanding av 40 ul antistoffløsning (25 ug/ml) og 50 ul F.VIII-manglende plasma (Biomerieux) ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Til denne blandingen ble 10 ul av den rekombinante blodkoagulasjonsfaktor-VIII-formuleringen Kogenate FS (BAYER) og 50 ul APTT-reagens (Dade Behring) tilsatt og varmet ved 37 °C i 3 minutter. Koagulasjonsreaksjonen ble initiert ved å tilsette 50 ul 20 nM CaCI2(Dade Behring). Tiden som var nødvendig for koagulasjon ble målt ved å anvende CR-A (Amelung)-tilkoblet KC10A (Amelung) (se fig. 16).

Eksempel 15: Effekter av bispesifikt IgG-antistoff i inhibitorplasma

Effekter av et bispesifikt IgG-antistoff i inhibitorplasma ble undersøkt ved de følgende plasmakoagulasjonsanalysebetingelsene. En blanding av 50 ul F.VIII-manglende plasma (Biomerieux) og 10 ul anti-humant F.VIII-nøytraliserende antistoff (100 ug/ml, katalognummer: MAB3440, CHEMICON) ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Dette plasma ble benyttet som inhibitorplasma. Til dette inhibitorplasmaet ble 40 ul av antistoffløsningen (25 ug/ml) og 50 ul APTT-reagens (Dade Behring) tilsatt og varmet ved 37 °C i 3 minutter. Koagulasjonsreaksjonen ble initiert ved å tilsette 50 ul 20 mM CaCI2(Dade Behring) til blandingen. Tiden som var nødvendig for koagulasjon, ble målt ved å benytte CR-A (Amelung)-tilkoblet på KC10A (Amelung) (se fig. 17).

Eksempel 16: Humanisering av bispesifikt antistoff

Blant de bispesifikke antistoffene som ble fremskaffet i eksemplene 1 til 7, ble XB12 (muse-anti-faktor-IXa-antistoff)/SB04 (muse-anti-faktor-X-antistoff), som var det mest effektive i å forkorte blodkoagulasjonstid, utsatt for humanisering som følger.

16-1. Homologisøk for humane antistoffer

Databasen ble konstruert basert på aminosyresekvensdata for humane antistoffer fremskaffet fra Kabat Database ([ ftp:// ftp. ebi. ac. uk/ pu b/ data bases/ ka bat/ b og IMGT Database d http:// imqt. cines. fr7b som er allment tilgjengelig og homologisøk ble utført separat for muse-XB12-H-kjedevariabelregion, muse-XB12-L-kjedevariabelregion, muse-SB04-H-kjedevariabelregion og muse-SB04-L-kjedevariabelregion. Resultatene bekreftet at de har høye homologier med de humane antistoffsekvensene vist nedenfor, og det ble videre bestemt at de ville bli benyttet som rammverksregionen (heretter forkortet til FR) for humaniserte antistoffer.

(1) XB12-H-kjedevariabelregion: KABATID-020619 (Kabat Database)

(Mariette et al., Arthritis Rheum. 1993, 36: 1315-1324)

(2) XB12-L-kjedevariabelregion: EMBL aksesjonsnr. X61642 (IMGT Database)

(Mark et al., J Mol Biol. 1991, 222: 581-597)

(3) SB04-H-kjedevariabelregion: KABATID-025255 (Kabat Database)

(Demaison et al., Immunogetetics 1995, 42: 342-352)

(4) SB04-L-kjedevariabelregion: EMBL aksesjonsnr. AB064111 (IMGT

Database)

(Upubliserte data)

For fremstilling av humaniserte antistoffer ble komplementaritetsbestemmende regioner (heretter forkortet som CDR) for hvert museantistoff transplantert på FR-ene på humane antistoffer (l)-(4).

Den allment tilgjengelige NCBI-internettsiden

([ http:// www. ncbi. nlm. nih. qov/ BLAST7l) ble også benyttet ved å søke etter sekretoriske signalsekvenser fra humant antistoff som er svært homologe med humane antistoffer (l)-(4). De følgende sekretoriske signalsekvensene fremskaffet ved hjelp av homologi-søket, ble benyttet.

(1) XB12-H-kjedevariabelregion: GenBank-aksesjonsnr. AF062120

(2) XB12-L-kjedevariabelregion: Gen-Bank-aksesjonsnr. M74019

(3) SB04-H-kjedevariabelregion: Gen-Bank-aksesjonsnr. BC019337

(4) SB04-L-kjedevariabelregion: GenBank-aksesjonsnr. AY204756

16-2. Konstruksjon av ekspresjonsvektor for genet humanisert antistoff

Tolv syntetiske oligonukleotider på omtrent 50 baser ble fremstilt fra en nukleotidsekvens som koder for aminosyresekvensen fra den sekretoriske signalsekvensen til antistoffvariabelregionen, slik at omtrent 20 baser på deres 3'-terminal hybridiserer med hverandre. Videre ble en primer som hybridiserer til 5'-terminalen til et antistoffvariabelregiongen og som hadde Xhol-kløyvingssekvens, og en primer som hybridiserer til 3'-terminalen til et antistoffvariabelregion-gen og som hadde Sfil-kløyvingssekvensen fremstilt.

De syntetiske oligonukleotidene fremstilt (2,5 uM, 1 ul hver) ble blandet, og 1 x TaKaRa Ex Taq-buffer, 0,4 mM dNTP-er og 0,5 enheter TaKaRa Ex Taq (alle fra Takara Shuzo) ble tilsatt for å lage en 48 ul reaksjonsløsning. Etter oppvarming av blandingen ved 94 °C i 5 minutter ble 2 sykler med reaksjon (94 °C, 2 min, 55 °C, 2 min og 72 °C, 2 min) utført for å sette sammen og forlenge hver av de syntetiske oligo-DNA. Deretter ble en primer som hybridiserer den 5'-terminalen og en primer som hybridiserer til den 3'-terminalen av antistoffgenet tilsatt (10 uM, 1 ul hver), og antistoffvariabelregion-gener ble amplifisert i 35 sykler med reaksjon (94 °C, 30 sek, 55 °C, 30 sek og 72 °C, 1 min) og en 5 minutters reaksjon ved 5 °C. Etter PCR ble hele reaksjonsløsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. Amplifiserte fragmenter av den forventede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset med QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved fremgangsmåten som beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med sterilt vann (30 ul). Fragmentene ble klonet ved hjelp av pGEM-T Easy Vector System (Promega) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Nukleotidsekvenser for DNA-fragmentene ble bestemt ved å benytte BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) på ABI PRISM 3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) i henhold til fremgangsmåten som beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen.

Etter å ha fordøyd et plasmid som var bekreftet å omfatte den korrekte humaniserte antistoffvariabelregion-gensekvensen med Xhol og Sfil, ble reaksjons-løsningen utsatt for 1 % agarosegelelektroforese. DNA-fragmenter av den forventede størrelsen (omtrent 400 bp) ble renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit

(QIAGEN) ved fremgangsmåten beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med sterilt vann (30 ul). Etter å ha fordøyd de tetrasyklin-induserbare ekspresjons-plasmidene (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) og de ecdysonanaloginduserbare ekspresjons-plasmidene (pIND-g4H, pIND-g4L) som ble renset i eksempel 3-4 med Xhol og Sfi I, ble fragmentene som omfatter antistoffkonstantregionen (omtrent 5 kb) videre renset ved å benytte QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen, og eluert med sterilt vann (30 ul). Det humaniserte XB12-antistoffgenfragment (H-kjedens variable region (heretter VH) eller L-kjedens variable region (heretter VL)) som var fordøyd med Xhol og Sfil, og det tetrasykl-ininduserbare ekspresjonsplasmidet (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) som var fordøyd med Xhol ig Sfil ble utsatt for en ligeringsreaksjon ved å benytte Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. I tillegg ble det humaniserte SB04-antistoffgenfragmentet som er fordøyd med Xhol og Sfil (H-kjedens variable region eller L-kjedens variable region), og det ecdysonanalog-induserbare ekspresjonsplasmidet som er fordøyd med Xhol og Sfil (pIND-g4H,

pIND-g4L) ble utsatt for en ligeringsreaksjon ved å benytte Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics) ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. En del av hver av reaksjonsblandingene ble benyttet til å transformere E. coli-stammen DH5a (TOYOBO).

16-3. Fremstilling av humanisert bispesifikt antistoff

Genene ble transfektert og uttrykt i HEK293H ved fremgangsmåtene som er beskrevet i eksemplene 4-2 og 4-3 ved å benytte fire typer av humaniserte antistoff-ekspresjonsvektorer i tillegg til pcDNA6/TR og pVgRXR. Videre ble antistoffrensing og kvantifisering av antistoff konsentrasjon utført ved fremgangsmåtene som er vist i eksemplene 8 og 5.

16-4. Aktivitetsundersøkelse av humanisert bispesifikt antistoff og modifisering av antistoffsekvens

For å undersøke plasmakoagulasjonsevnen til de således fremstilte humaniserte bispesifikke antistoffene og det kimære bispesifikke antistoff XB12/SB04, ble effekter av antistoffene på APTT undersøkt ved å anvende F.VIII-manglende plasma. Aminosyrer for det humane antistoff-FR ble modifisert for å øke aktiviteter av humanisert bispesifikke antistoffer, hvis blodkoagulasjonsevne har blitt redusert. I tillegg ble cysteinresidiene i CDR3 hos XB12-antistoff-VH modifisert til alanin i bekymring for det mulige fall i dens termostabilitet. Spesifikt ble mutasjoner introdusert inn i den humaniserte antistoff-ekspresjonsvektoren ved å benytte QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ved fremgangsmåten som er beskrevet i den vedlagte instruksjonsmanualen. Ved å gjenta aminosyremodifisering av FR-sekvensen og undersøkelsen av blodkoagulasjonsevne, ble et humanisert bispesifikt antistoff (humanisert XB12-antistoff (VH:hXB12f-A, VL:hXBVL)/humanisert SB04-antistoff (VH:hSB04e, VL:hSBVL-F3f)) fremskaffet (fig. 18).

Industriell anvendbarhet

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer bispesifikke antistoffer som gjenkjenner både et enzym og dets substrat og som funksjonelt erstatter en kofaktor som forsterker den enzymatisk aktiviteten.

De bispesifikke antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er antatt å ha høy stabilitet i blod og lav antigenisitet. Derfor er det betydelig forventning om at de vil bli farmasøytiske midler.

Claims (8)

1. Antistoff som gjenkjenner både et enzym og et substrat derav,karakterisert vedat hvor nevnte antistoff er et bispesifikt antistoff som erstatter for funksjonen til en kofaktor som forsterker den enzymatiske reaksjonen og hvor enzymet er et proteolytisk enzym.

2. Antistoff ifølge krav 1, hvor nevnte proteolytiske enzym, substrat og kofaktor er blodkoagulasjonsfaktorer/fibrinolyse-assosierte faktorer.

3. Antistoffet ifølge krav 2, hvor enzymet er ZPI, substratet er blodkoaguleringsfaktor X og/eller aktivert blodkoaguleringsfaktor X, og kofaktoren er PZ.

4. Antistoffet ifølge krav 2, hvor enzymet er trombin, substratet er TAFI og kofaktoren er TM.

5. Antistoffet ifølge krav 2, hvor enzymet er trombin, substratet er PC og kofaktoren er TM og/eller PS.

6. Antistoffet ifølge krav 2, hvor enzymet er aktivert blodkoaguleringsfaktor X, substratet er protrombin, og kofaktoren er blodkoaguleringsfaktor V og/eller aktivert blodkoaguleringsfaktor V.

7. Antistoff ifølge krav 1, hvor enzymet er Cls, substratet er C2 og kofaktoren er C4b.

8. Antistoff ifølge krav 1, hvor enzymet er komplement regulerende faktor I, substratet er C3b, og kofaktoren er komplement regulerende faktor II, membran kofaktor protein (MCP), og komplement reseptor I (CR1).