ES2865152T3 - Anticuerpo biespecífico que sustituye a proteínas funcionales - Google Patents

Abstract

Método para obtener anticuerpos de tipo IgG biespecíficos que sustituyen funcionalmente al factor VIII/VIIIa, que comprende las etapas de: - inmunizar un animal no humano con F.IXa para obtener un anticuerpo anti-F.IXa; - inmunizar un animal no humano con F.X para obtener un anticuerpo anti-F.X; - producir un anticuerpo biespecífico que comprende las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.IXa y las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.X, en el que la región CH3 de una cadena H del anticuerpo biespecífico comprende por lo menos una sustitución de aminoácido para obtener un anticuerpo IgG que presenta una combinación heteróloga de cadenas H; y - seleccionar los anticuerpos con una actividad que sustituye a la función de F.VIII/F.VIIIa.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo biespecífico que sustituye a proteínas funcionales

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para obtener los anticuerpos de tipo IgG biespecíficos que sustituyen funcionalmente al factor VIN/VINa.

Antecedentes de la técnica

Los anticuerpos han recibido mucha atención como medicina debido a su estabilidad en sangre elevada y su antigenicidad baja. Los anticuerpos biespecíficos pueden reconocer simultáneamente dos tipos de antígeno. Los anticuerpos biespecíficos han sido propuestos durante cierto tiempo; sin embargo, sólo se ha informado de anticuerpos que conectan simplemente dos tipos de antígeno, tales como aquellos para el redireccionamiento de las células NK, macrófagos y células T (ver el documento no de patente n° 7). Por ejemplo, MDX-210, que actualmente se encuentra bajo estudio clínico, es un anticuerpo biespecífico que únicamente redirige los monocitos que expresan FcyRI y similares a células de cáncer que expresan HER-2/neu. De esta manera, no existe ningún ejemplo hasta el momento que utilice un anticuerpo biespecífico como medios alternativos para sustituir funcionalmente el cofactor que potencia las reacciones enzimáticas.

Son ejemplos de factores el factor tisular (TF), el factor V de coagulación sanguínea (F.V), el factor V activado de coagulación sanguínea (F.Va), el factor VIII de coagulación sanguínea (F.VIII), el factor VIII activado de coagulación sanguínea (F.VIIIa), la trombomodulina (TM), la proteína S (PS), la proteína Z (PZ), la heparina, el complemento C4b, el factor H regulador del complemento, la proteína cofactor de membrana (MCP) y el receptor 1 del complemento (CR1).

De ellos, el F VIII/F VIIIa es un cofactor necesario para una expresión suficiente de actividad del factor IX activado de coagulación sanguínea (F.IXa). Scheiflinger F. et al. descubrieron que un determinado anticuerpo anti-F.IX/F.IXa actúa estimulando la activación del factor X de coagulación sanguínea (F.X) por parte de F.IXa en un ensayo cromogénico (documento de patente n° 1). Sin embargo, en un ensayo que examina la capacidad de recuperación de la coagulación en plasma deficiente en F.VIII, se observó capacidad de recuperación de la coagulación únicamente al añadir exógenamente F.IXa, pero no en el caso de que se utilizase este anticuerpo por sí solo.

Es conocido que F.VIIIa interactúe no sólo con F.IXa sino también con F.X (ver los documentos no de patente n° 5 y 6). A este respecto, el anticuerpo de Scheiflinger F. et al. no puede considerarse un sustituto suficiente para la función de F.VIII/F.VIIIa, y su actividad aparentemente también resulta insuficiente.

A partir de la investigación específica, se ha conseguido la producción de anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los factores que potencian la actividad enzimática.

[Documento de patente 1] WO 01/19992

[Documento de patente 2] Patente US n° 4. 474.893

[Documento de patente 3] EP 404097

[Documento de patente 4] WO 93/11161

[Documento de patente 5] Solicitud de patente japonesa: 2002-112369

[Documento de patente 6] Solicitud de patente japonesa: 2003-012648

[Documento de patente 7] Solicitud de patente japonesa Kokai Publicación n° (JP-A) H5-304992 (sin examinar, solicitud de patente japonesa publicada)

[Documento de patente 8] JP-A H2-145187

[Documento de patente 9] JP-A H5-213775

[Documento de patente 10] JP-A H10-165184

[Documento de patente 11] JP-A H11-71288

[Documento de patente 12] JP-A 2002-518041

[Documento de patente 13] JP-A H11-506310

[Documento de patente 14] JP-A H5-199894

[Documento de patente 15] JP-A H10-511085

[Documento de patente 16] JP-A H5-184383

[Documento no de patente 1] Nilsson IM et al., "J. Intern. Med." 1992, Vol.235, p.25-32

[Documento no de patente 2] Lofqvist T et al,. "J. Intern. Med" 1997, Vol.241, p.395-400 (the "o" of Lofqvist is written with an umlaut)

[Documento no de patente 3] 24th Meeting of The Japanese Society on Thrombosis and Hematosis, Special Committee on Examining Hemophilia Standardization, Mini-symposium, 2001, http://www jsth.org [Documento no de patente 4] Medical Bulletin #193 1994

[Documento no de patente 5] Mertens K et al., "Thromb. Haemost." 1999, Vol.82, p.209-217

[Documento no de patente 6] Lapan KA et al., "Thromb. Haemost." 1998, Vol.80, p.418-422

[Documento no de patente 7] Segal DM et al., "Journal of Immunological Methods" 2001, Vol.248, p.1-6 [Documento no de patente 8] Bos R y Nieuwenhuitzen W, "Hybridoma" 1992, Vol.11, n° 1, p.41-51 [Documento no de patente 9] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, n° 1708, p.81-3

[Documento no de patente 10] Karpovsky B et al., "J. Exp. Med." 1984, Vol.160, n° 6, p.1686-701 1 [Documento no de patente 11] Suresh MR et al., "Methods Enzymol." 1986, Vol.121, p. 210-28 [Documento no de patente 12] Massimo YS et al., "J. Immunol. Methods" 1997, Vol.201, p.57-66 [Documento no de patente 13] Brennan M et al., "Science" 1985, Vol.229, p. 81

[Documento no de patente 14] Shalaby MR et al., "J. Exp. Med." 1992, Vol.175, p.217-25 '

[Documento no de patente 15] Holliner P et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1993, Vol.90, p. 6444-8 [Documento no de patente 16] Ridgway JB et al., "Protein Eng." 1996, Vol.9, p. 617-21

[Documento no de patente 17] Hammerling U et al., "J. Exp. Med." 1968, Vol.128, p.1461-73 [Documento no de patente 18] Kurokawa T et al., "Bio/Technology" 1989, Vol.7, p.1163

[Documento no de patente 19] Link BK et al., "Blood" 1993, Vol.81, p.3343

[Documento no de patente 20] Nitta T et al., "Lancet" 1990, Vol.335, p.368-71

[Documento no de patente 21] deLeij L et al., "Foundation Nationale de Transfusion Sanguine, Les Ulis France" 1990, p.249-53

[Documento no de patente 22] Le Doussal JM et al., "J. Nucl. Med." 1993, Vol.34, p. 1662-71 1 [Documento no de patente 23] Stickney DR et al., "Cancer Res." 1991, Vol.51, p.6650-5

[Documento no de patente 24] Weiner LM et al., "Cancer Res." 1993, Vol.53, p.94-100

[Documento no de patente 25] Kroesen BJ et al., "Br. J. Cancer" 1994, Vol.70, p.652-61

[Documento no de patente 26] Weiner GJ et al., "J. Immunol." 1994, Vol.152, p.2385

[Documento no de patente 27] Suresh MR et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1986, Vol.83, p.7989-93 [Documento no de patente 28] Milstein C y Cuello AC, "Nature" 1983, Vol.305, p.537

[Documento no de patente 29] Xiang J et al., "Mol. Immunol." 1990, Vol.27, p.809

[Documento no de patente 30] Bebbington CR et al., "Bio/Technology" 1992, Vol.10, p. 169

[Documento no de patente 31] Huse WD et al., "Science" 1989, Vol. 246, p.1275

[Documento no de patente 32] McCafferty J et al., "Nature" 1990, Vol.348, p.552

[Documento no de patente 33] Kang AS et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 1991, Vol.88, p. 4363

Ruef et al. (Thromb. Haemost. 82:109-114, 1990) dan a conocer un constructo de anticuerpo biespecífico que consiste de dos Fab que dirigen la uroquinasa a epítopos de fibrina y de plaquetas.

Exposición de la invención

La presente divulgación proporciona unos anticuerpos biespecíficos que sustituyan funcionalmente a los cofactores que potencian las reacciones enzimáticas.

A partir de la investigación específica, se han podido descubrir anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente tanto a F.IX/F.IXa como a F.Xy sustituyen la función del cofactor F.VIIIa (es decir, una función de estimulación de la activación de F.X por parte de F.IXa). Es decir, se han podido producir anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto un enzima como su sustrato y que sustituyen funcionalmente los cofactores del enzima.

La presente divulgación se refiere a anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los cofactores que potencian las reacciones enzimáticas, y más concretamente a:

[1] Un método para obtener anticuerpos de tipo IgG biespecíficos que sustituyen funcionalmente al factor VIM/VNIa, que comprende las etapas de:

- inmunizar un animal no humano con F.IXa para obtener un anticuerpo anti-F.IXa;

- inmunizar un animal no humano con F.X para obtener un anticuerpo anti-F.X;

- producir un anticuerpo biespecífico que comprende las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.IXa y las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.X, en el que la región CH3 de una cadena H del anticuerpo biespecífico comprende por lo menos una sustitución de aminoácido para obtener un anticuerpo IgG que presenta una combinación heteróloga de cadenas H; y

- seleccionar los anticuerpos con una actividad que sustituye a la función de F.VNI/F.VINa.

[2] El método según [1], en el que los anticuerpos que presentan una actividad que sustituye a la función de F.VNI/F.VINa se seleccionan en un sistema de reacción que comprende F.IXa y F.X y se realiza la selección utilizando la elevación de la actividad de F.IXa como un índice, en el que la elevación de la actividad de F.IXa es un resultado de la actividad de anticuerpo.

[3] El método según [2], en el que el sistema de reacción comprende F.XIa, F.IX, F.X, un sustrato sintético S-2222 para F.Xa, y fosfolípido.

[4] El método según [1], en el que los anticuerpos que presentan una actividad que sustituye a la función de F.VIII/F.VIIIa se seleccionan en un sistema para medir o simular las funciones biológicas en las que F.IXa, F.X y F.VIII/F.VIIIa están implicados, y la selección se realiza utilizando la actividad de la recuperación funcional como un índice, en el que la actividad de la recuperación funcional es un resultado de la adición de anticuerpo en ausencia de F.VIII/F.VIIIa.

[5] El método según [4], en el que el sistema para medir o simular las funciones biológicas es un sistema para medir la coagulación de plasma.

[6] El método según [5], en el que se mide la capacidad de restaurar la coagulación en un sistema de ensayo de tiempo de coagulación utilizando plasma deficiente en F.VIII humano.

[7] El método según [6], en el que los anticuerpos biespecíficos seleccionados presentan la capacidad de reducir el tiempo de coagulación en 10 segundos o más.

[8] El método según cualquiera de [1] a [7], en el que el anticuerpo biespecífico comprende la región variable de un anticuerpo anti-F.IXa y la región variable de un anticuerpo anti-F.X.

[9] El método según cualquiera de [1] a [7], en el que el anticuerpo biespecífico comprende

(a) una secuencia de CDR3 de cadena H de anticuerpo anti-F.IXa seleccionada de entre las (a1) o (a2) siguientes, y

(b) una secuencia de CDR3 de cadena H de anticuerpo anti-F.X seleccionada de entre las (b1) o (b9) siguientes:

(a1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 16

(a2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 20

(b1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 24

(b2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 28

(b3) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 32

(b4) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 36

(b5) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 40

(b6) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 44

(b7) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 48

(b8) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 52

(b9) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 56

[10] El método según cualquiera de [1] a [7], en el que dicho anticuerpo biespecífico comprende (a) las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena H de anticuerpo anti-F.IXa seleccionadas de entre las (a1) o (a2) siguientes, y

(b) las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena H de anticuerpo anti-F.X seleccionadas de entre las (b1) a (b9):

(a1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 14, 15 y 16, respectivamente;

(a2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 18, 19 y 20, respectivamente;

(b1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 22, 23 y 24, respectivamente;

(b2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 26, 27 y 28, respectivamente;

(b3) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente;

(b4) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 34, 35 y 36, respectivamente;

(b5) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 38, 39 y 40, respectivamente;

(b6) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 42, 43 y 44, respectivamente;

(b7) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 46, 47 y 48, respectivamente;

(b8) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 50, 51 y 52, respectivamente;

(b9) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 54, 55 y 56, respectivamente.

[11] El método según [1], en el que dicho anticuerpo biespecífico compite por la unión de F.IX/IXa y/o F.X con un anticuerpo según las reivindicaciones 9 o 10 en un ensayo ELISA competitivo.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la región de inserción de pcDNA4-g4H.

La figura 2 ilustra las regiones de inserción de pcDNA4-g4L y pIND-g4L.

La figura 3 ilustra la región de inserción de pIND-g4H.

La figura 4 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico anti-F.IXa/anti-F.X, generado a partir del anticuerpo XB12 anti-F.IXa y los anticuerpos anti-F.X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 o SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpos era 10 |jg/ml (concentración final: 1 jg/ml). El resultado fueron nueve tipos de anticuerpos biespecíficos que mostraban un incremento de la actividad mimética de F.VIIIa: XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 y XB12/SB34, en orden de intensidad de la actividad.

La figura 5 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico anti-F.IXa/anti-F.X generado a partir del anticuerpo XT04 anti-F.IXa y anticuerpos anti-F.X SB04, SB21, SB42, SB38, SB30, SB07, SB05, SB06 o SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo era 10 jg/m l (concentración final: 1 jg/ml). En consecuencia, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 y XT04/SB34 mostraron un incremento de la actividad mimética de F.VIIIa.

La figura 6 ilustra los resultados de la medición de la actividad mimética de F.VIIIa de diversas concentraciones de XB12/SB04, que mostraban la actividad más alta en la figura 4. En consecuencia, XB12/SB04 mostró un incremento dependiente de la concentración de la actividad mimética de F.VIIIa.

La figura 7 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación plasmática (APTT) en presencia de XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 o XB12/SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo mezclas con plasma deficiente en F.VIII era de 1,7 jg/m l para XB12/SB06 y de 10 jg/m l para el resto. En consecuencia, XB12/SB04, XB12/SB21, XB12/SB42, XB12/SB38, XB12/SB30, XB12/SB07, XB12/SB05, XB12/SB06 y XB12/SB34 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de los anticuerpos.

La figura 8 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación plasmática (APTT) en presencia de XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05, XT04/SB06 y XT04/SB34. La concentración de las soluciones de anticuerpo mezcladas con plasma deficiente en F.VIII era de 5 jg/m l para XT04/SB34 y de 10 jg/m l para el resto. En consecuencia, XT04/SB04, XT04/SB21, XT04/SB42, XT04/SB38, XT04/SB30, XT04/SB07, XT04/SB05 y XT04/SB06 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de los anticuerpos. XT04/SB34 no mostró ningún efecto de acortamiento del tiempo de coagulación.

La figura 9 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación con diversas concentraciones de XB12/SB04, que mostró el efecto de acortamiento del tiempo de coagulación (APTT) más alto en las figuras 7 y 8. En consecuencia, XB12/SB04 mostró un efecto dependiente del tiempo de coagulación dependiente de la concentración. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclados con plasma deficiente en F.VIII.

La figura 10 ilustra los resultados de la transferencia western de GST-AP de SB04 o SB06, en donde 1), 2) y 3) son los resultados de hacer reaccionar GST-AP transcrito con SB04, SB06 y una muestra que no contenía anticuerpo, respectivamente. Los resultados muestran la detección de únicamente la reacción de unión de SB04 y GST-AP.

La figura 11 ilustra un vector pELBGlacI. ColE1ori: la región del origen de replicación de la serie de plásmidos ColE1; f1 ori: región del origen de replicación del fago f1; lacI: región codificante de la proteína represora de la lactosa; Plac: promotor lactosa; pelBss: secuencia de señal de la proteína PelB de E. coli; scFv: región codificante de la molécula monocatenaria de anticuerpo; gen III (gen3): región codificante de la proteína del gen III del fago fl; Ampr: gen de resistencia a la ampicilina, y SfiI: sitio de corte del enzima de restricción SfiI.

La figura 12 ilustra los resultados del a medición de la actividad mimética de F.VIIIa utilizando sobrenadantes de cultivo de los anticuerpos biespecíficos expresados, que son combinaciones de un anticuerpo anti-F.IXa (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 o XB12) y un anticuerpo anti-F.X (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 o SB27). "+" representa casos en los que la actividad mimética de F.VIIIa es 0,1 o superior.

La figura 13 ilustra los resultados de un ensayo de coagulación plasmática realizado utilizando preparaciones purificadas de anticuerpos biespecíficos expresados, que se combinan a partir de un anticuerpo anti-F.IXa (A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69 o XB12) y un anticuerpo anti-F.X (B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB04, SB15 o SB27). El tiempo de coagulación se acortó en 10 a 20 segundos ("+"), en 20 a 40 segundos ("++"), en 40 a 50 segundos ("+++") o en 50 segundos ("++++") o más con la adición del anticuerpo en comparación con la no adición de los anticuerpos.

La figura 14 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación en diversas concentraciones de A44/B26, que presentaba un efecto de acortamiento elevado del tiempo de coagulación (APTT) en la figura 13. El tiempo de coagulación era de 113 segundos en el caso de no adición de anticuerpo. En consecuencia, A44/B26 mostró un efecto dependiente de la concentración de acortamiento del tiempo de coagulación. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclada con plasma deficiente en F.VIII.

La figura 15 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación a diversas concentraciones de A69/B26, que presentaba un efecto de acortamiento elevado del tiempo de coagulación (APTT) en la figura 13. El tiempo de coagulación era de 109,6 segundos en el caso de no adición del anticuerpo. En consecuencia, A69/B26 mostró un efecto dependiente de la concentración de acortamiento del tiempo de coagulación. La concentración de anticuerpo en la figura muestra valores de la solución de anticuerpo mezclada con plasma deficiente en F.VIII.

La figura 16 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación (APTT) en la coexistencia de A44/B26 o XB12/SB04 con F.VIII. En consecuencia, en comparación con F.VIII solo, una solución mixta de A44/B26 o XB12/SB04 con F.VIII mostró un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación.

La figura 17 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación (APTT) en plasma inhibidor bajo la presencia de A44/B26 o XB12/SB04. En consecuencia, A44/B26 o XB12/SB04 mostraron un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación en comparación con la ausencia de anticuerpos.

La figura 18 ilustra los resultados de la medición del tiempo de coagulación a diversas concentraciones de XB12/SB04 humanizado y de XB12/SB04 humanizado. El tiempo de coagulación era de 111,3 segundos en el caso de no adición de anticuerpo. Como consecuencia de la medición, XB12 humanizado/SB04 humanizado mostró un efecto de acortamiento del tiempo de coagulación similar al de XB12/SB04. La concentración de anticuerpo en la figura muestra los valores de la soluciones de anticuerpo mezclas con plasma deficiente en F.VIII.

Descripción detallada

Un anticuerpo biespecíficos según la presente divulgación es una molécula que comprende dos tipos de anticuerpo o de fragmentos de anticuerpo que presentan especificidades para diferentes antígenos. El anticuerpo biespecífico es, sin limitación particular aunque preferentemente, monoclonal.

Los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación son preferentemente anticuerpos recombinantes, generados utilizando técnicas de recombinación génica (ver, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K. y Larrick J.W., Therapeutic monoclonal antibodies, publicado en el Reino Unido por MacMillan Publishers Ltd., 1990). Puede obtenerse un anticuerpo recombinante mediante clonación de un ADN codificante de anticuerpo a partir de células productoras de anticuerpos, tales como hibridomas o linfocitos sensibilizados, que incorporan el ADN en un vector apropiado, e introducir el vector en un huésped para la producción de anticuerpos.

Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden ser fragmentos de anticuerpo o anticuerpos modificados. Los fragmentos de anticuerpo comprenden los diacuerpos (Db), los anticuerpos lineales, las moléculas de anticuerpo monocatenario (en adelante también denominados scFv), etc. En la presente memoria, un fragmento "Fv" representa el fragmento de anticuerpo más pequeño que comprende sitios completos de reconocimiento de antígeno y de unión. Un fragmento "Fv" es un dímero (dímero Vh-Vl) en el que una región variable de cadena pesada (H) (V^h) y una región variable de cadena ligera (L) (V^l) se encuentran fuertemente conectados mediante un enlace no covalente. Tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cada región variable interactúan formando un sitio de unión a antígeno sobre la superficie de un dímero V^h-V^l. Seis CDR proporcionan un sitio de unión a antígeno sobre un anticuerpo. Sin embargo, incluso una región variable (o la mitad de un Fv que contiene únicamente tres CDR específicos de antígeno) es capaz de reconocer un antígeno y la unión al mismo, aunque su afinidad es inferior a la del sitio de unión completo.

Además, el fragmento Fab (también denominado F(ab)) contiene además una región constante de cadena L y una región constante de cadena H (CH1). Un fragmento Fab' difiere de un fragmento Fab en que el primero contiene varios residuos adicionales derivados del extremo carboxilo-terminal una región CH1 de cadena H, que comprende una o más cisteínas de la región bisagra de un anticuerpo. Fab'-SH se refiere a Fab' que presenta un grupo tiol libre en uno o más residuos cisteína de la región constante. Los fragmentos F(ab') se generan mediante corte del enlace disulfuro en las cisteínas de la parte bisagra de un digerido con pepsina de F(ab')². El experto en la materia también conocerá otros fragmentos de anticuerpo unidos químicamente.

Diacuerpo se refiere a un fragmento bivalente de anticuerpo construido mediante fusión génica (Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993; documento EP 404 097, documento WO 93/11161, etc.). Un diacuerpo es un dímero que comprende dos cadenas peptídicas; en cada cadena polipeptídica, una región variable de cadena L (V^l) se encuentra conectada a una región variable de cadena H (V^h) en la misma cadena mediante una molécula conectora que es excesivamente corta para permitir el apareamiento entre las dos regiones (por ejemplo aproximadamente 5 residuos). V^l y V^h codificados en la misma cadena polipeptídica forman un dímero debido a que no pueden formar un fragmento monocatenario de región variable debido a que la molécula conectora entre ellas es corta. De esta manera, un diacuerpo acaba presentando dos sitios de unión a antígeno.

Un anticuerpo monocatenario o fragmento scFv contiene las regiones V^h y V^l de un anticuerpo, y estas regiones existen en una única cadena polipeptídica. En general, un polipéptido Fv contiene además un polipéptido conector entre las regiones V^h y V^l, de manera que scFv puede formar una estructura que resulta necesaria para la unión de antígeno (ver Pluckthun, "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113 (Rosenburg y Moore, editores (Springer Verlag, New York), páginas 269 a 315, 1994, para comentarios generales sobre scFv). Las moléculas conectoras de la presente divulgación no se encuentran particularmente limitadas, con la condición de que no inhiban la expresión de las regiones variables de anticuerpo conectadas a ambos extremos de una molécula conectora.

Un anticuerpo biespecífico de tipo IgG puede ser secretado por un hibridoma híbrido (un cuadroma) formado mediante la fusión de dos tipos de hibridoma que producen anticuerpos IgG (Milstein C. et al., Nature 305:537-540, 1983). También puede ser secretado mediante la introducción en las células de genes de las cadenas L y H que constituyen las dos IgG de interés (un total de cuatro tipos de genes) para la coexpresión.

Sin embargo, en teoría, existen hasta diez combinaciones de cadenas H y L en las IgG producidas mediante estos métodos. Resulta difícil purificar una IgG que comprenda la combinación deseada de cadenas H y L de diez tipos diferentes de IgG. Además, en teoría, se reduce drásticamente la cantidad de la combinación de interés, y de esta manera, resulta necesario el cultivo celular a gran escala, lo que conduce a un incremento adicional del coste de fabricación.

En este caso, mediante la sustitución apropiada del aminoácido o aminoácidos en la región CH3 de una cadena H, resulta posible secretar preferentemente las IgG que presentan una combinación heteróloga de cadenas H (Ridgway J.B. et al., Protein Engineering 9:617-621, 1996; Merchant A.M. et al., Nature Biotechnology 16:677-681, 1998).

Respecto a las cadenas L, una región variable de cadena L es menos diversa en comparación con una región variable de cadena H; por lo tanto, podría esperarse la adquisición de una cadena L común que proporcione actividades de unión con dos cadenas H. La expresión eficiente de una IgG biespecífica resulta posible al introducir genes de esta cadena L común y ambas cadenas H en una célula para la expresión de IgG (Nature Biotechnology 16:677-681, 1998). Sin embargo, la posibilidad de tipos seleccionados aleatoriamente de anticuerpos que contengan la misma cadena L es baja; de esta manera, resulta difícil poner en práctica la idea mencionada anteriormente. A este respecto, se ha propuesto un método para la selección de una cadena L común adaptadora de cadenas H arbitrariamente diferentes con el fin de mostrar una capacidad de unión elevada (documento WO 2004/065611). Una cadena H que presente la variante de CH3 indicada anteriormente (Nature Biotechnology 16:677-681, 1998) resulta raramente secretada en ausencia de la otra cadena H. Mediante la utilización de esta característica para inducir en primer lugar la expresión de las cadenas L y H del brazo derecho y detener la expresión, y después inducir la expresión de las cadenas L y H del brazo izquierdo, puede incrementarse la proporción de IgG expresadas en la combinación de interés (documento PCT JP2004/008585).

También puede prepararse un anticuerpo biespecífico mediante el entrecruzamiento químico de Fabs. Puede producirse un F(ab')² biespecífico, por ejemplo, mediante maleimidación de un Fab' preparado a partir de un anticuerpo con o-PDM (orto-fenilendimaleimida) y haciendo reaccionar el producto con un Fab' preparado a partir de otro anticuerpo, de manera que se entrecrucen los Fabs derivados de diferentes anticuerpos (Keler T. et al., Cancer Research 57:4008-4014, 1997). Además, también se conocer un método para conectar químicamente fragmentos de anticuerpo tales como un ácido Fab'-tionitrobenzoico (TNB) y Fab'-tiol (SH) (Brennan M. et al., Science 229:81-83, 1985).

En lugar del entrecruzamiento, puede utilizarse una cremallera de leucinas derivada de Fos y Jun o similar. Aunque Fos y Jun también forman un homodímero, se utiliza su preferencia de formación del heterodímero. Para la preparación se expresan un Fab' con adición de una cremallera de leucinas Fos y un segundo Fab' con adición de una cremallera de leucinas Jun. Mediante la mezcla y reacción de Fab'-Fos monomérico y Fab' Jun, que han sido reducidos bajo condiciones suaves, puede formarse un F(ab')² biespecífico (Kostelny S.A. et al., J. of Immunology 148:1547-53, 1992). Este método no se encuentra limitado a Fab' y también puede aplicarse a scFv, Fv, etc.

También puede prepararse un anticuerpo biespecífico en una forma de diacuerpo. Un diacuerpo biespecífico es un heterodímero que comprende dos fragmentos scFv entrecruzados. Es decir, puede prepararse un anticuerpo biespecífico mediante la construcción de un heterodímero utilizando V^h(A)-V^l(B) y V^h(B)-V^l(A), que se han formado mediante la conexión de V^h y V^l derivados de dos tipos de anticuerpo: A y B, con una molécula conectora relativamente corta, de aproximadamente 5 residuos aminoácidos (Holliger P. et al., Proc. of the National Academy of Sciences of the USA 90:6444-6448, 1993).

En este caso, puede estimularse la construcción de un diacuerpo biespecífico de interés llevando a cabo sustituciones apropiadas de aminoácidos (botón-en-ojal: Zhu Z. et al., Protein Science 6:781-788, 1997), de manera que se unan dos tipos de scFv con una molécula conectora flexible y relativamente larga, de aproximadamente 15 residuos aminoácidos (un diacuerpo monocatenario: Kipriyanov S.M. et al., J. of Molecular Biology 293:41-56, 1999).

El fragmento sc(Fv)², que puede prepararse mediante la unión de dos tipos de scFv con una molécula conectora flexible y relativamente larga, de aproximadamente 15 residuos aminoácidos, también puede convertirse en un anticuerpo biespecífico (Mallender W.D. et al., J. of Biological Chemistry 269:199-206, 1994).

Un anticuerpo modificado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo que se una a diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). En los anticuerpos modificados de la presente divulgación, no existe limitación respecto a las sustancias que pueden unirse. Dichos anticuerpos modificados pueden obtenerse modificando químicamente los anticuerpos obtenidos. Estos métodos ya se encuentran establecidos en el presente campo.

Entre los anticuerpos de la presente divulgación se incluyen anticuerpos humanos, de ratón, de rata y similares, sin ninguna limitación respecto a su origen, y pueden ser anticuerpos genéticamente modificados, tales como un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado.

Los métodos para obtener anticuerpos humanos son conocidos, y puede obtenerse un anticuerpo humano de interés, por ejemplo, mediante la inmunización de un animal transgénico que presente todos los repertorios de genes de anticuerpo humano con un antígeno de interés (ver los documentos WO 93/12227, 92/03918, 94/02602, 94/25585, 96/34096 y 96/33735).

Pueden producirse anticuerpos genéticamente modificados mediante métodos conocidos. Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende regiones variables de las cadenas H y L de un anticuerpo procedentes de animales inmunizados, y regiones constantes de las cadenas H y L de un anticuerpo humano. Puede obtenerse un anticuerpo quimérico mediante unión de un ADN codificante de la región variable de un anticuerpo derivado de animales inmunizados con un ADN codificante de la región constante de un anticuerpo humano, insertando el ADN resultante en un vector de expresión, e introduciendo el vector recombinante en un huésped para la producción.

Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo modificado también denominado anticuerpo humano reformado. Un anticuerpo humanizado se construye mediante injerto de la región determinante de complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de animales inmunizados en la CDR de un anticuerpo humano. También son conocidas las tecnologías generales de ingeniería genética.

Concretamente, se sintetiza mediante PCR una secuencia de ADN diseñada para unir la CDR de un anticuerpo de ratón a la región marco (FR) de un anticuerpo humano, utilizando varios oligonucleótidos que han sido preparados para que contengan partes solapantes en sus regiones terminales. Tras unir el ADN obtenido a un ADN codificante de la región constante de un anticuerpo humano, el ADN resultante se incorpora en un vector de expresión y se introduce en un huésped para producir un anticuerpo humanizado (ver los documentos EP 239 400 y w O 96/02576). A modo de FR de anticuerpo humano para la unión mediante CDR, se selecciona uno que pueda formar un sitio de unión a antígeno con una buena región determinante de complementariedad.

Pueden sustituirse aminoácidos de la región marco en una región variable de anticuerpo según resulte necesario, de manera que la región determinante de complementariedad de un anticuerpo humano reformado forme un sitio de unión a antígeno apropiado (Sato K. et al., Cancer Research 53:851-856, 1993). La región marco puede sustituirse con regiones marco derivadas de diversos anticuerpos humanos (ver el documento WO 99/51743).

La presente divulgación proporciona anticuerpos biespecíficos que sustituyen funcionalmente los cofactores que reconocen tanto un enzima como su sustrato.

Los cofactores de la presente divulgación no se encuentran particularmente limitados, con la condición de que puedan actuar sobre un enzima potenciando la reacción enzimática. Un cofactor de la presente divulgación es, por ejemplo, un cofactor de un enzima proteolítico. Son ejemplos específicos de un cofactor de un enzima proteolítico, los cofactores para la coagulación sanguínea y los factores asociados a la fibrinolisis (F.VIN/F.VNIa, F.V/F.Va, PZ, TM, sistema TM/PS), los cofactores de reacciones del complemento (C4b, MCP, Cr 1, factor H) y similares.

Las combinaciones siguientes pueden proporcionarse como ejemplos específicos de enzima y sustrato del enzima, así como cofactores enzimáticos.

(a) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 1).

Enzima: F.IXa

Sustrato: F.X

Cofactor: F.VIN/F.VNIa

El cofactor F.VIIIa se une tanto a F.IXa como a F.X y potencia la activación del F.X por parte de F.IXa. Entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen los mencionados anteriormente enzima F.IXa y sustrato F.X, algunos presentan un efecto potenciador de la activación de F.X. Algunos de estos anticuerpos se cree que presentan un efecto de sustitución de la función del cofactor F.VI-M/F.VIMa.

(b) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 2).

Enzima : ZPI

Sustrato: F.X/F.Xa

Cofactor: PZ

El cofactor PZ se une a ZPI de la familia de la serpina y al factor X activado de coagulación sanguínea (F.Xa) potenciando la actividad inhibidora de F.Xa del ZPI. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto ZPI como F.X/F.Xa se cree que presentan un efecto de sustitución de la función de PC. (c) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 3).

Enzima: trombina

Sustrato: TAFI

Cofactor: TM

El cofactor TM potencia la activación de TAFI por parte de la trombina. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto la trombina como TAFI se cree que presentan un efecto de sustitución de la función de TM.

(d) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 4).

Enzima: trombina

Sustrato: PC

Cofactores: TM/PS

El sistema TM/PS potencia la activación de PC por parte de la trombina. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto la trombina como PC se cree que sustituyen funcionalmente al sistema TM/PS.

(e) Cofactor de la coagulación sanguínea y factor asociado a la fibrinolisis (ejemplo 5)

Enzima: F.Xa

Sustrato: protrombina

Cofactor: F.V/F.Va

El cofactor F.Va se une tanto a F.Xa como a la protrombina, potenciando la activación de la protrombina por parte de F.Xa. Entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto el enzima mencionado anteriormente F.Xa como su sustrato protrombina, algunos presentan efectos potenciadores de la activación de la protrombina. Algunos de estos anticuerpos se cree que presentan una función que sustituye a la función del cofactor F.V/F.Va.

(f) Cofactor de la reacción del complemento (ejemplo 1).

Enzima: C1s

Sustrato: C2

Cofactor: C4b

C4b presenta el efecto estimulador de C1s sobre la descomposición de C2. Concretamente, algunos anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto los C1s como C2 se cree que sustituyen funcionalmente a C4b.

(g) Cofactores de la reacción del complemento (ejemplo 2).

Enzima: factor I regulador del complemento

Sustrato: C3b

Cofactores:

Factor H regulador del complemento

Proteína cofactor membranal (MCP), y

Receptor 1 del complemento (CR1)

Los factores reguladores del complemento H, MCP y CR1 presentan el efecto estimulador del factor regulador del complemento 1 sobre la degradación de C3b. Concretamente, entre los anticuerpos biespecíficos que reconocen tanto el factor 1 regulador del complemento y C3b, se cree que algunos sustituyen funcionalmente a los factores reguladores del complemento H, MCP y CR1.

Entre los cofactores mencionados anteriormente, resulta particularmente preferido el F.VNI/F.VNIa. Aunque F.VNI/F.VINa experimenta una proteolisis limitada por parte de enzimas proteolíticos tales como la trombina, con la condición de que presente actividad de F.VI-M/F.VIMa, no es importante la forma que presente. Además, las variantes de F.VNI/F.VNIa y F.VNI/F.VINa que han sido modificadas artificialmente mediante técnicas de combinación génica también se incluyen en F.VNI/F.VNIa, con la condición de que conserven actividad de cofactor F.VNI/F.VNIa.

Los métodos para obtener anticuerpos biespecíficos que sustituyan funcionalmente a cofactores de la presente divulgación no se encuentran particularmente limitados y pueden obtenerse mediante cualquier método. Por ejemplo, al obtener un anticuerpo biespecífico que sustituya funcionalmente al enzima A y al sustrato B, son inmunizados en un animal tanto el enzima A como el sustrato B con el fin de obtener anticuerpo antienzima A y anticuerpo antisustrato B. A continuación, se produce un anticuerpo biespecífico que comprende las cadenas H y L del anticuerpo antienzima A y las cadenas H y L del anticuerpo antisustrato B. En la presente memoria resulta deseable obtener varios tipos de cada uno de los anticuerpos antienzima A y antisustrato B, de manera que estos anticuerpos puedan utilizarse preferentemente para producir el máximo número posible de combinaciones de anticuerpos biespecíficos. Tras producir los anticuerpos biespecíficos, se seleccionan los anticuerpos que presentan una actividad que sustituya a la función del cofactor.

Los anticuerpos contra un enzima o un sustrato pueden obtenerse mediante métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos mediante la inmunización de animales con antígenos. Los antígenos para inmunizar animales son, por ejemplo, antígenos completos que presenten inmunogenicidad y antígenos incompletos (que incluyan los haptenos) sin inmunogenicidad. En la presente divulgación se utiliza un enzima cuyo cofactor pueda sustituirse funcionalmente por un anticuerpo de la presente divulgación que actúa como cofactor, o un sustrato del enzima, a modo del antígeno (inmunógeno) mencionado anteriormente. Como animales que deben inmunizarse pueden utilizarse, por ejemplo, el ratón, la rata, el hámster, el cobaya, el conejo, el pollo, el mono rhesus y similares. La inmunización de estos animales con antígenos puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos por el experto en la materia. En la presente divulgación, las regiones variables de las cadenas L y H de anticuerpo se recogen preferentemente de animales inmunizados o de células de los mismos. Este procedimiento puede ser llevado a cabo por un experto en la materia utilizando métodos generalmente conocidos. Los animales inmunizados con antígenos expresan anticuerpos contra el antígeno, especialmente en las células del bazo. Por lo tanto, puede prepararse, por ejemplo, ARNm a partir de las células del bazo de un animal inmunizado, y recuperarse regiones variables de las cadenas L y H mediante RT-PCR utilizando cebadores de las regiones variables del animal.

Concretamente, se inmunizan animales con un enzima o un sustrato. El enzima y el sustrato utilizados como inmunógeno pueden ser proteínas completas o péptidos parciales de las mismas. Además, dependiendo de las circunstancias, puede utilizarse un antígeno candidato unido a otra molécula para formar un antígeno soluble, o fragmentos del mismo, como inmunógeno para la inmunización de animales

Se aíslan células del bazo de ratones inmunizados, y se fusionan con células de mieloma de ratón con el fin de producir hibridomas. Tras seleccionar los hibridomas que se unen a los antígenos respectivos, se recuperan las regiones variables de las cadenas H y L mediante RT-PCR, utilizando, por ejemplo, cebadores correspondientes a las regiones variables. También pueden utilizarse cebadores de la CDR, cebadores de regiones marco que se encuentran menos diversificadas que la CDR, o cebadores de secuencias de señal y CH1 o región constante de cadena L (C^l).

Alternativamente, se extrae el ARNm de las células de bazo de animales inmunizados y los ADNc de las regiones variables de las cadenas L y H se recuperan mediante RT-PCR utilizando cebadores de la región próxima a las regiones variables. Además, también pueden inmunizase linfocitos in vitro y utilizarse para construir bibliotecas que presentan scFv o Fab. Las regiones variables pueden obtenerse concentrando y clonando un clon de anticuerpos ligantes de antígeno mediante adsorción (panning). En este caso, también puede llevarse a cabo el cribado utilizando bibliotecas similares construidas a partir de ARNm derivados de monocitos de sangre periférica, bazo, amígdala y similares, procedentes de seres humanos y animales no humanizados.

A continuación, se utilizan las regiones variables para preparar vectores de expresión de anticuerpos. Mediante la introducción de un vector de expresión de anticuerpo antienzima y un vector de expresión de anticuerpo antisustrato en una misma célula y la expresión de los anticuerpos puede obtenerse un anticuerpo biespecífico.

Pueden seleccionarse los anticuerpos que presentan una actividad de sustitución de la función del cofactor, por ejemplo mediante los métodos descritos a continuación.

(1) En un sistema de reacción que comprende el enzima y el sustrato, se lleva a cabo la selección utilizando la elevación de la actividad enzimática (capacidad de degradación del sustrato) como índice, en el que la elevación de la actividad enzimática es un resultado de la adición de anticuerpos.

(2) En un sistema para la medición o simulación de las funciones biológicas en las que se encuentran implicados el enzima, el sustrato y cofactor (por ejemplo un sistema para medir la coagulación plasmática), la selección se lleva a cabo utilizando la actividad de recuperación funcional como índice, en la que la actividad de recuperación funcional es un resultado de la adición del anticuerpo en ausencia del cofactor.

El anticuerpo así obtenido puede purificarse hasta la homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo pueden llevarse a cabo mediante métodos de separación y purificación utilizados para las proteínas generales. Por ejemplo, pueden separarse y purificarse anticuerpos mediante la selección y combinación apropiadas de columnas de cromatografía tal como la cromatografía de afinidad, la filtración, la ultrafiltración, la precipitación salina, la diálisis, la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, la electroforesis isoeléctrica y similares (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), aunque los métodos no se encuentran limitados a los mismos. Una columna utilizada en la cromatografía de afinidad es, por ejemplo, la columna de proteína A, la columna de proteína G y similares.

Por ejemplo, en el caso de que F.VNI/F.VNIa sea el cofactor sustituto, es decir, en el caso de que la combinación de enzima y sustrato sean los factores de coagulación plasmática y asociado a fibrinolisis F.IXa y F.X, el anticuerpo biespecífico de la presente divulgación preferentemente presenta una estructura que comprende la región variable de un anticuerpo anti-F.IXa y la región variable de un anticuerpo anti-F.X.

Los anticuerpos biespecíficos de la presente divulgación que sustituyen funcionalmente a F.VNI/F.VNIa se generaron mediante el método siguiente. Se inmunizaron subcutáneamente ratones con F.IXa o F.X comercial. Se aislaron células de bazo a partir de bazos de los ratones inmunizados con un título elevado de anticuerpos, y se fusionaron con células de mieloma de ratón para formar hibridomas. Se seleccionaron los hibridomas que se unían al antígeno F.IXa o F.X, y se recuperaron las regiones variables de las cadenas L y H mediante RT-PCR utilizando cebadores de las regiones variables. Se incorporó la región variable de la cadena L en un vector de expresión de cadena L que contenía C^l y se insertó la región variable de cadena H en un vector de expresión de cadena H que contenía una región constante de cadena H. Además, se extrajo el ARNm a partir de los bazos de estos ratones inmunizados y cada ADNc de las regiones variables de las cadenas L y H se recuperó mediante RT-PCR utilizando cebadores de la región variable respectiva. Utilizando estas regiones variables, se construyó una biblioteca fágica que presenta scFv. Se concentraron los clones de anticuerpo ligantes de antígeno y se clonaron mediante adsorción (panning) y se formaron los vectores de expresión de anticuerpos utilizando la región variable de los mismos. Se introdujeron el anticuerpo anti-F.IXa (cadena H, cadena L) y los vectores de expresión del anticuerpo anti-F.X (cadena H, cadena L) en las mismas células para la expresión de anticuerpos y se obtuvieron anticuerpos biespecíficos.

Los anticuerpos biespecíficos así obtenidos se evaluaron para sus efectos de sustitución funcional de F.VNI/F.VINa (cofactores para la activación de F.X por parte de F.IXa) en un sistema de ensayo que comprendía F.XIa (enzima activador de F.IX), F.IX, F.X, un sustrato sintético (S-2222) de F.Xa y fosfolípido. En principio, como anticuerpo biespecífico con actividad de sustitución funcional de F.VNI/F.VINa, se seleccionaron los anticuerpos biespecíficos que mostraban una actividad mimética de F.VIIIa de 0,1 o superior en este sistema de ensayo basándose en los resultados de ensayo. La actividad mimética de F.VIIIa a la que se hace referencia en la presente memoria es un valor obtenido durante 30 ó 60 minutos restando el valor de cambio de absorbancia de un solvente o sobrenadante de cultivo que no expresa el anticuerpo respecto al valor de cambio de absorbancia de una solución de anticuerpos o de un sobrenadante de cultivo que expresa el anticuerpo.

Los anticuerpos biespecíficos seleccionados anteriormente o los anticuerpos biespecíficos estrechamente relacionados con los mismos se midieron para su capacidad de restituir la coagulación en un sistema de ensayo de tiempo de coagulación que utiliza plasma deficiente en F.VIII. En consecuencia, se obtuvieron los anticuerpos biespecíficos capaces de acortar el tiempo de coagulación en comparación con el caso de no adición. El tiempo de coagulación al que se hace referencia en la presente memoria es, tal como se muestra en el ejemplo 7, el tiempo activado parcial de tromboplastina medido utilizando plasma humano deficiente en F.VIII. Entre estos anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos biespecíficos preferidos presentan la capacidad de acortar el tiempo de coagulación 10 segundos o más, más preferentemente 20 segundos o más, todavía más preferentemente 40 segundos o más, y con todavía más preferentemente, 50 segundos o más.

La CDR3 de cadena H de los anticuerpos de la presente divulgación no se encuentra particularmente limitada, pero específicamente presenta una región determinante de complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos, indicada en cualquiera de entre las secuencias de CDR3 de cadena H (SEC ID n° 16, 20, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 y 96) de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 y A69, indicadas en los ejemplos descritos posteriormente o las equivalentes funcionalmente a las mismas, y la región determinante de complementariedad que comprende una secuencia de aminoácidos indicada en cualquiera de entre las secuencias de CDR3 de cadena H (SEC ID n° 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200 y 204) en SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27, respectivamente, o las equivalentes funcionalmente a las mismas.

Además, un ejemplo específico de los anticuerpos mencionados anteriormente se combina preferentemente a partir de un anticuerpo que presenta una región determinante de complementariedad que comprende cualquiera de entre las secuencias de aminoácidos de la CDR de cadena H de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50 y A69 (SEC ID n° 14-16, 18-20, 58-60, 62-64, 66-68, 70-72, 74-76, 78-80, 82­ 84, 86-88, 90-92 y 94-96) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a la misma, y un anticuerpo que presenta una región determinante de complementariedad que comprende cualquiera de entre las secuencias de aminoácidos de la CDR de cadena H (SEC ID n° 22-24, 26-28, 30-32, 34-36, 38-40, 42-44, 46-48, 50-52, 54-56, 98-100, 102-104, 106-108, 110-112, 114-116, 118-120, 122-124, 126-128, 130-132, 134-136, 138-140, 142-144, 146-148, 150-152, 154-156, 158-160, 162-164, 166-168, 170­ 172, 174-176, 178-180, 182-184, 186-188, 190-192, 194-196, 198-200 y 202-204) en SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27) o una región determinante de complementariedad equivalente funcionalmente a las mismas.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H de XB12, XT04, A19, A25, A31, A38, A39, A40, A41, A44, A50, A69, SB04, SB05, SB06, SB07, SB21, SB30, SB34, SB38, SB42, B2, B5, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15, B16, B18, B19, B20, B21, B23, B25, B26, B27, B31, B34-1, B34-2, B35, B36, B38, B42, SB15 y SB27 dados a conocer en la presente divulgación se muestran como las SEC ID n° 13, 17, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 21,25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197 y 201.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena L de A44, B26, XB12 y SB04 dadas a conocer en la presente divulgación se muestran como SEC ID n° 205, 209, 213 y 217. Las secuencias de CDR de cadena L de A44, B26, XB12 y SB04 se muestran como las SEC ID n° 206-208, 210-212, 214-216 y 218­ 220. Las secuencias de nucleótidos de la CDR de cadena H de XB12, SB04, A44 y B26 se muestran como las SEC ID n° 221 (222), 223 (224), 225 (226), 233 (234), 235 (236), 237 (238), 245 (246), 247 (248), 249 (250), 257 (258), 259 (260) y 261 (262) (las secuencias entre paréntesis son secuencias de aminoácidos codificadas por los ácidos nucleicos respectivos) y sus secuencias de nucleótidos de la CDR de cadena L se muestran como SEC ID n° 227 (228), 229 (230), 231 (232), 239 (240), 241 (242), 243 (244), 251 (252), 253 (254), 255 (256), 263 (264), 265 (266) y 267 (268).

Las SEC ID n° 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258 y 264 representan CDR1.

Las SEC ID n° 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, 143, 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 224, 230, 236, 242, 248, 254, 260 y 266 representan CDR2.

Las SEC ID n° 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, 262 y 268 representan CDR3.

Los anticuerpos de la presente divulgación son preferentemente, aunque sin limitación particular, los anticuerpos biespecíficos combinados a partir de un anticuerpo anti-factor IXa y un anticuerpo anti-factor X, que presentan los mismos epítopos que los anticuerpos mencionados anteriormente o epítopos estrechamente relacionados con los mismos. Los anticuerpos que presentan un epítopo igual o estrechamente relacionado se refieren en la presente invención, por ejemplo, a los que compiten entre sí para la unión a antígenos en una ELISA competitiva, etc. Sin limitación a la misma, en este método de ELISA competitiva, se inmoviliza factor IX/IXa o factor X en una placa MicroWell de 96 pocillos, y se añaden simultáneamente un anticuerpo apropiadamente marcado y un anticuerpo que debe evaluarse, y se detecta el anticuerpo unido mediante la utilización del marcaje. Este marcaje no se encuentra particularmente limitado e incluye marcaje de fosfatasa alcalina, marcaje peroxidasa, enzima de unión a estreptavidina marcada con biotina (fosfatasa alcalina, peroxidasa y similares), FITC y similares. Existe un solapamiento de epítopos en el caso de que se observe una competición de por lo menos 50% al encontrarse presente el anticuerpo a una concentración en exceso de hasta 100.000 veces respecto al anticuerpo que debe evaluarse.

Al preparar un anticuerpo de longitud completa utilizando las regiones variables dadas a conocer en la presente divulgación, las regiones constantes del anticuerpo no se encuentran particularmente limitadas, y pueden utilizarse las conocidas por el experto en la materia, por ejemplo las indicadas en "Sequences of proteins of immunological interest", U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991 y en "An efficient route to human bispecific IgG", Nature Biotechnology 16:677-681, 1998, y similares.

En una forma de realización de los anticuerpos de la presente divulgación, los anticuerpos presentan el efecto de sustituir funcionalmente los cofactores, y de esta manera se espera que resulten fármacos efectivos para enfermedades causadas por la reducción de la actividad (función) de dichos cofactores. En los casos en los que el cofactor funcionalmente sustituido por un anticuerpo de la presente divulgación sea un factor de coagulación sanguínea y asociado a la fibrinolisis, las enfermedades mencionadas anteriormente son, por ejemplo, el sangrado, las enfermedades acompañadas de sangrado, las enfermedades causadas por el sangrado, y similares. En particular, es conocido que la reducción y deficiencia funcionales de F.VNI/F.VINa, F.IX/F.IXa y F.XI/F.XIa provocan hemorragias anormales conocidas como hemofilia.

De entre las hemofilias, la hemorragia anormal debida a una hipofunción congénita de F.VNI/F.VINa o una deficiencia de F.VNI/F.VINa se denomina hemofilia A. En el caso de que un paciente de hemofilia A sangre, se lleva a cabo una terapia de sustitución con una formulación de F.VIII. Además, puede llevarse a cabo la administración preventiva de una formulación de F.VIII (ver los documentos no de patente n° 1 y n° 2) los días en que se realicen ejercicios vigorosos o excursiones, cuando con frecuencia se produce sangrado intraarticular o en el caso de que el paciente se encuentre clasificado como de hemofilia severa. Debido a que esta administración preventiva de formulación de F.VIII reduce notablemente los episodios de hemorragia de los pacientes con hemofilia A, recientemente ha gozado de amplia popularidad. La reducción de los episodios de sangrado no sólo reduce los riesgos de sangrado letal y no letal y los dolores que la acompañan, sino que también previene la artropatía hemofílica causada por las frecuentes hemorragias intraarticulares. En consecuencia, contribuye en gran medida a la mejora de la calidad de vida de los pacientes de hemofilia A.

La vida media de una formulación de F.VIII en el flujo sanguínea es de tan sólo aproximadamente 12 a 16 horas. Por lo tanto, para una prevención continua, resulta necesario administrar una formulación de F.VIII aproximadamente tres veces a la semana. Esto equivale a mantener una actividad de F.VIII de aproximadamente 1% o superior (ver documentos no de patente n° 3 y n° 4). Además, en las terapias de sustitución de los episodios de sangrado resulta necesario administrar periódicamente formulaciones de F.VIII de refuerzo durante un determinado periodo de tiempo, excepto en el caso de que el sangrado sea leve, con el fin de prevenir el nuevo sangrado y establecer una hemostasis completa.

Además, las formulaciones de F.VIII se administran por vía intravenosa. Existen dificultades técnicas durante la realización de la administración intravenosa y resulta todavía más difícil, en particular al realizar la administración en pacientes jóvenes de venas delgadas.

En la administración preventiva mencionada anteriormente de la formulación de F.VIII y en la administración de urgencia de la misma en el caso de un episodio de sangrado, en la mayoría de casos se utiliza el tratamiento en casa y la autoinyección. La necesidad de una administración frecuente y las dificultades técnicas que supone no sólo provocan dolor, sino que también se convierten en un motivo que dificulta la popularización del tratamiento en casa y de la autoinyección.

Por lo tanto, ha existido una demanda fuerte, en comparación con las formulaciones actuales de factor VIII de coagulación sanguínea, de fármacos que presenten intervalos de administración más prolongados y de fármacos que puedan administrarse fácilmente.

Además, en los pacientes de hemofilia A pueden generarse anticuerpos anti-FVIII denominados inhibidores, particularmente en los pacientes de hemofilia A severa. En el caso de que se genere un inhibidor, los efectos de la formulación de F.VIII resultan dificultados por el inhibidor. En consecuencia, resulta muy complicado el control de la hemostasis en estos pacientes.

En el caso de que sangre uno de estos pacientes de hemofilia A con inhibidor, habitualmente se lleva a cabo la terapia de neutralización utilizando una dosis masiva de formulación de F.VIII o la terapia de derivación utilizando un complejo concentrado o formulación de F.VIIa. Sin embargo, en la terapia de neutralización, la administración de una dosis masiva de formulación de F.VIII puede incrementar adversamente el título de inhibidor (el anticuerpo anti-F.VIII). Además, en la terapia de derivación, las vidas medias relativamente cortas (aproximadamente 2 a 8 horas) de los concentrados de complejo y de la formulación de F.VIIa resultan problemáticas. Adicionalmente, debido a que sus mecanismos de acción son independientes de la función de F.VIII/F.VIIIa, es decir, una función que cataliza la activación de F.X por parte de F.IXa, el mecanismo hemostático puede no funcionar bien y perder sensibilidad. Por lo tanto, en muchos casos de pacientes de hemofilia A con inhibidor, no se obtienen efectos hemostáticos suficientes en comparación con los pacientes de hemofilia A sin inhibidor.

Por lo tanto, ha existido una fuerte demanda de fármacos que no resulten afectados por la presencia de inhibidores y que puedan sustituir funcionalmente a F.VIII/F.VIIIa.

Además de la hemofilia y hemofilia adquirida causada por un autoanticuerpo anti-F.VIII, la enfermedad de von Willebrand, causada por la anormalidad o deficiencia funcional del vWF se conoce como trastorno de sangrado anormal asociado a F.VIII/F.VIIIa. El vWF resulta necesario no sólo para la adhesión normal de las plaquetas a los tejidos subendoteliales en los sitios de daño a la pared vascular, sino también para la formación de complejos con F.VIII para mantener un nivel plasmático normal de F.VIII. En los pacientes con enfermedad de von Willebrand, estas funciones caen y se produce la anormalidad funcional de la hemostasis.

En los aspectos mencionados anteriormente, pueden considerarse los métodos que utilizan anticuerpos para la creación de fármacos que: (i) presenten intervalos de administración prolongados, (ii) se administren con facilidad, e (iii) no resulten afectados por la presencia de inhibidores, y (iv) puedan sustituir funcionalmente a F.VIII/F.VIIIa de modo independiente de F.VIII/F.VIIIa. Generalmente, las vidas medidas de los anticuerpos en el flujo sanguíneo son relativamente largos, de varios días a varias semanas. Además, es conocida la migración de los anticuerpos al flujo sanguíneo tras la administración subcutánea. Es decir, los fármacos anticuerpos en general cumplen los requisitos mencionados anteriormente de (i) e (ii).

La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente divulgación como principio activo. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo de la presente divulgación sea uno de los anticuerpos que reconocen tanto F.IX/F.IXa como F.X, y puedan sustituir funcionalmente a F.VIIIa, se espera que el anticuerpo se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco para prevenir o tratar el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado, o los trastornos causados por el sangrado. Además, en el caso de que un anticuerpo de la presente divulgación sea uno de los anticuerpos que reconocen tanto F.X/F.Xa como la protrombina y pueda sustituir funcionalmente a F.Va, se espera que el anticuerpo se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco que prevenga o trate el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado o los trastornos causados por el sangrado.

Simultáneamente, se espera que un anticuerpo que se una a ZPI y F.X y sustituya funcionalmente a PZ se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con acción antitrombótica, que un anticuerpo que se una a la trombina y a TAFI y sustituya funcionalmente a TM se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto estimulante de la hemostasis, y que un anticuerpo que se una a la trombina y a PC y sustituya funcionalmente al sistema PS/TM se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto modulador de la coagulación.

Además, debido a que la deficiencia del complemento C4 provoca el lupus eritematoso sistémico (SLE), se espera que un anticuerpo que sustituya funcionalmente a C4b se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto que suprima la incidencia de SLE. Debido a que la deficiencia del factor H causa infección supurativa y glomerulonefritis autoinmunológica, un anticuerpo que sustituya funcionalmente al factor H se espera que se convierta en un producto farmacéutico (composición farmacéutica) o fármaco con un efecto de supresión de la aparición de estas enfermedades.

Para la formulación de los farmacéuticos, las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de la presente divulgación utilizado para el tratamiento o prevención a modo de principio activo pueden mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable apropiado, un medio y similares que sean inertes frente al mismo, en caos necesario. Por ejemplo, pueden mencionarse el agua estéril o la solución salina fisiológica, estabilizador, excipiente, antioxidante (ácido ascórbico, etc.), tampón (ácido fosfórico, ácido cítrico, otros ácidos orgánicos, etc.), antiséptico, surfactante (PEG, Tween, etc.), agente quelante (EDTA, etc.), agente ligante y similares. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina sérica, gelatina e inmunoglobulinas, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina y lisina, azúcares tales como polisacáridos y monosacáridos y carbohidratos, y alcoholes de azúcares, tales como manitol y sorbitol. Durante la preparación de soluciones acuosas para inyección, por ejemplo, entre los agentes solubilizadores se incluyen solución salina fisiológica, soluciones isotónicas que contiene glucosa y otros agentes adyuvantes tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro sódico, y pueden utilizarse en combinación con agentes solubilizadores apropiados tales como alcohol (etanol, etc.), polialcohol (propilenglicol, PEG, etc.) y surfactante no iónico (polisorbato 80, HCO-50, etc.).

Además, en caso necesario, pueden encapsularse anticuerpos de la presente divulgación en microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulosa, gelatina, poli(metacrilato de metilo), etc.) o incluirse en un sistema de administración coloidal de fármaco (liposomas, microesferas de albúmina, microemulsión, nanopartículas y nanocápsulas, etc.) (ver "Remington's Pharmaceutical Science", 16a edición, Oslo, editor, 1980, etc.). También son conocidos métodos para formular fármacos de liberación sostenida, y pueden aplicarse a anticuerpos de la presente divulgación (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277, 1981; Langer, Chemtech. 12:98-105, 1982; patente US n° 3.773.919; solicitud de patente europea (EP) 58481; Sidman et al., Biopolymers 22:547-556, 1983; documento EP 133988).

Los anticuerpos o composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden utilizarse en combinación con el factor VIII de coagulación sanguínea. Los anticuerpos o las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse con factor VIII de coagulación sanguínea o simultáneamente o cierto intervalo entre ellos. La administración puede llevarse a cabo en un kit que combine un anticuerpo o composición farmacéutica de la presente divulgación con factor VIII de coagulación sanguínea. En el caso de que se utilice un anticuerpo o composición farmacéutica de la presente divulgación en combinación con factor VIII de coagulación sanguínea, si se desea también resulta posible utilizar dosis más bajas que en el caso de que se utilicen separadamente.

Aunque la dosis de las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se determina apropiadamente considerando el tipo de formulación, método de administración, edad y peso corporal de los pacientes, síntomas de los pacientes, tipo y avance de la enfermedad, etc., y finalmente según el criterio del médico, generalmente las dosis de entre 0,1 y 2.000 mg/día pueden dividirse en una a varias administraciones en el caso de un adulto. La dosis preferentemente es de entre 1 y 1.000 mg/día, más preferentemente de entre 5 y 500 mg/día, y todavía más preferentemente de entre 100 y 300 mg/día. Aunque la dosis varía según el peso corporal y edad de los pacientes, métodos de administración y similares, el experto en la materia podrá seleccionar convenientemente una dosis apropiada. Preferentemente, el periodo de dosificación también se determina apropiadamente según, por ejemplo, el proceso de cicatrización del paciente.

Además, también resulta posible llevar a cabo terapia génica mediante inserción de un gen codificante de un anticuerpo de la presente divulgación en vectores de terapia génica. Como método de administración aparte de la administración directa de plásmidos desnudos, los genes pueden administrarse mediante empaquetamiento en liposomas y similares, o mediante la inserción en diversos vectores víricos, tales como vectores retrovíricos, vectores adenovíricos, vectores de virus Vaccinia, vectores de poxvirus, vectores de virus adenoasociados y vectores HVJ (ver Adolph, "Virus Genome Method", CRC Press, Florida, 1996), o mediante recubrimiento sobre perlas portadoras tales como partículas coloidales de oro (documento WO 93/17706, etc.). Sin embargo, el gen puede administrarse mediante cualquier método, con la condición de que el anticuerpo pueda expresarse in vivo para ejercer su acción. Preferentemente, se administra una dosis suficiente mediante una vía parenteral apropiada, tal como intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracutánea, tejido intraadiposo, intramamaria y la inyección intramuscular e infusión, inhalación, método de bombardeo con partículas inducible con gas (con una pistola de electrones y similares) o vía mucosal utilizando gotas nasales. Los genes codificantes de un anticuerpo de la presente divulgación pueden administrarse mediante la introducción del gen en las células sanguíneas, en células derivadas de la médula ósea y similares, utilizando la transfección ex vivo de liposomas, el método de bombardeo de partículas (patente Us n° 4.945.050) o la infección vírica, y la reintroducción de estas células en animales. En la terapia génica, puede utilizarse cualquier gen codificante de un anticuerpo de la presente divulgación, por ejemplo genes que comprenden secuencias de nucleótidos de las CDR de los mencionados anteriormente XB12, SB04, A44 y B26.

La presente divulgación también proporciona métodos para prevenir y/o tratar el sangrado, los trastornos acompañados de sangrado o los trastornos causados por el sangrado, que comprende las etapas que consisten en administrar un anticuerpo o composición de la presente divulgación. Los anticuerpos o composiciones pueden administrarse, por ejemplo, mediante los métodos mencionados anteriormente.

La presente divulgación también se refiere a la utilización de los anticuerpos de la presente invención para preparar composiciones (farmacéuticas) de la presente divulgación.

Además, la presente divulgación proporciona kits que comprenden por lo menos un anticuerpo o composición de la presente divulgación que debe utilizarse en los métodos mencionados anteriormente. Las jeringas de vidrio, agujas de inyección, medio farmacéuticamente aceptable, alcohol, algodón, vendajes, manual de instrucciones que describe la utilización, o similares, también pueden empaquetarse opcionalmente en los kits.

A continuación en la presente memoria se describe en mayor detalle la presente invención haciendo referencia a los ejemplos.

[Ejemplo 1]. Preparación de anticuerpo no neutralizador contra el factor IXa (F.IXa)

1.1 Inmunización y preparación de hibridomas

Se inmunizaron ocho ratones BALB/c (macho, de 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Charles River, Japón)) y cinco ratones MRL/lpr (macho, de 6 semanas edad al iniciar la inmunización (Charles River, Japón)) con factor IXap humano (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como se describe a continuación. A modo de inmunización inicial se administró por vía subcutánea factor IXap (40 pg/cabeza) emulsionado con FCA (adyuvante completo de Freund H37 Ra (Difco Laboratories)). Dos semanas después, se administró por vía subcutánea factor IXap (40 pg/cabeza) emulsionado con FIA (adyuvante incompleto de Freund (Difco Laboratories)). A continuación, se llevaron a cabo tres a siete inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana. Tras confirmar que el título de un anticuerpo plasmático contra el factor IXap se encontraba elevado mediante ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), descrita en 1-2, se administró por vía intravenosa como inmunización final factor IXap (40 pg/cabeza) diluido en PBS(-) (solución salina tamponada con fosfato libre de iones calcio y magnesio). Tres días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de los ratones. Aunque una parte de los mismos se utilizó en el ejemplo 10.2, las células de bazo restantes se fusionaron con células de mieloma de ratón P3X63Ag8U.1 (denominadas P3U1, ATCC n° CRL-1597) mediante un método estándar utilizando PEG1500 (Roche Diagnostics). Se sembraron células fusionadas suspendidas en medio RPMI1640 (Invitrogen) que contenían FBS al 10% (Invitrogen) (en adelante denominado FBS al 10%/RPMI1640) en una placa de cultivo de 96 pocillos y 1, 2, 3 y 5 días después de la fusión se sustituyó el medio por un medio de selección HAT (FBS al 10%/RPMI1640/concentrado 50x de HAT al 2% (Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd)/BM-Condimed H1 al 5% (Roche Diagnostics) para cultivar selectivamente los hibridomas. Utilizando los sobrenadantes recogidos los días 8 ó 9 después de la fusión, se midió la actividad de unión a factor IXa mediante la ELISA descrita en 1-2 para seleccionar los hibridomas que presentaban actividad de unión a factor IXa. A continuación, se midió la actividad enzimática de factor IXa neutralizador mediante el método descrito en 1-3, con el fin de seleccionar los hibridomas que no presentaban actividad neutralizadora del factor IXa. Se clonaron dos veces los hibridomas llevando a cabo diluciones limitantes en las que se sembraba una célula en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos. Se sometieron las células de colonias individuales confirmadas mediante observación microscópica a ELISA y se llevó a cabo un ensayo de actividad de neutralización tal como se describe en 1-2 y 1-3 para la selección de clones. El ascites que contenía el anticuerpo clonado se preparó mediante el método descrito en 1-4, y se purificó el anticuerpo a partir del ascites. El anticuerpo purificado no pudo ampliar el APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado) y esto se confirmó mediante el método descrito en 1-5.

1.2 ELISA del factor IXa

Se diluyó factor IXap hasta 1 pg/ml con un tampón de recubrimiento (bicarbonato sódico 100 mM, pH 9,6, azida sódica al 0,02%) y se distribuyó en una placa Nunc-Immuno (placas Nunc-ImmunoTM 96 MicroWell™ MaxiSorp™ (Nalge Nunc International)) a razón de 100 pl/pocillo. A continuación, se incubó la placa a 4°C durante la noche. Tras lavar la placa con PBS(-) que contenía Tween® 20 tres veces, se bloqueó con un tampón diluyente (Tris-HCl 50 mM, pH 8,1, albúmina de suero bovino al 1%, MgCh 1 mM, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, azida sódica al 0,02%) a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras eliminar el tampón, se añadió un antisuero de ratón diluido con tampón diluyente o sobrenadante de cultivo de hibridoma hasta 100 pl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa tres veces, se añadió IgG de cabra anti­ ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina (Zymed Laboratories) hasta 1/2.000 con el tampón diluyente hasta 100 pl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa seis veces, se añadió un sustrato colorimétrico de fosfato Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) hasta 100 pl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras añadir la solución de parada Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 pl/pocillo), se leyó la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).

1.3 Medición de la actividad neutralizadora del factor IXa

Se disolvió fosfolípido (Sigma-Aldrich) en agua destilada para inyección, y se ultrasonicó para preparar una solución de fosfolípido (400 pg/ml). Se mezclaron solución salina tamponada con Tris que contenía albúmina de suero bovino al 0,1% (en adelante abreviada como TBSB) (40 |jl), 30 ng/ml de factor IXap (Enzyme Research Laboratories) (10 jl), 400 jg/m l de solución de fosfolípido (5 jl), t Bs B que contenía CaCh 100 mM y MgCl²20 mM (5 j l ) y sobrenadante de cultivo de hibridoma (10 j l ) en una placa de 96 pocillos, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución mezclada se le añadieron 50 jg/m l de factor X (Enzyme Research Laboratories) (20 j l ) y 3 U/ml de factor Villa (American Diagnostica) (10 j l ) y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 0,5 M (10 jl). Tras la adición de una solución de S-2222 (50 jl, Chromogenix) y la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se midió la absorbancia a una longitud de onda de medición de 405 nm y a una longitud de onda de referencia de 655 nm en un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

1.4 Preparación de ascites y purificación de anticuerpos

Se produjo ascites de los hibridomas establecidos, según procedimientos estándares. Es decir, se cultivó el hibridoma in vitro (2x106) y se trasplantó a la cavidad peritoneal de un ratón BALB/c (macho, de 5 a 7 semanas de edad al iniciar el experimento, Japan Charles River) o de un ratón BALB/c desnudo (hembra, de 5 a 6 semanas de edad al iniciar el experimento, Japan Charles River y Japan CLEA), que había sido administrado intraperitonealmente dos veces con pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano, WAKO Pure Chemical Industries) previamente. Una a cuatro semanas después del trasplante se recogió el ascites del ratón con un abdomen hinchado.

Se purificó el anticuerpo a partir del ascites utilizando una columna de proteína G Sepharose™ 4 Fast Flow (Amersham Biosciences). Se diluyó el ascites 2 veces con un tampón de unión (acetato sódico 20 mM, pH 5,0) y se aplicó a la columna, que se había lavado con 10 volúmenes de columna del tampón de unión. Se eluyó el anticuerpo con 5 volúmenes de columna de un tampón de elución (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5) y se neutralizó con un tampón neutralizador (Tris-HCl 1 M, pH 9,0). La solución resultante se concentró utilizando Centriprep™ 10 (Millipore) y se sustituyó el solvente con TBS (solución salina tamponada con Tris 50 mM). Se calculó la concentración de anticuerpo a partir de la absorbancia a 280 nm con A (al 1%, 1 cm)=13,5. Se midió la absorbancia con un DU-650 (Beckman Coulter).

1.5 Medición del APTT (tiempo de tromboplastina parcial activado)

Se midió el APTT con un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung). Se calentó una mezcla de la solución de anticuerpo diluida con TBSB (50 jl), plasma humano estándar (Dade Behring) (50 j l ) y reactivo de APTT (Dade Behring) (50 j l ) a 37°C durante 3 minutos. A esta mezcla se añadió CaCh 20 mM (Dade Behring) (50 j l ) para iniciar una reacción de coagulación y se midió el tiempo de coagulación.

[Ejemplo 2]. Preparación de anticuerpo no neutralizador de factor X (F.X)

2.1 Inmunización y preparación de hibridomas

Se inmunizaron ocho ratones BALB/c (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización, Japan Charles River) y cinco ratones MRL/lpr (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización, Japan Charles River) con factor X humano (Enzyme Research Laboratories) tal como se describe posteriormente. A modo de inmunización inicial, se administró por vía subcutánea factor X (40 jg/cabeza) emulsionado con FCA. Dos semanas después, se administró por vía subcutánea factor X (20 ó 40 jg/cabeza) emulsionado con FIA. Posteriormente, se administraron tres a seis inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana. Tras confirmar mediante ELISA tal como se describe en 2.2 que el título de un anticuerpo plasmático contra el factor X se encontraba elevado, se administró por vía intravenosa factor X (20 ó 40 jg/cabeza) diluido en PBS(-) a modo de inmunización final. Tres días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de ratón. Aunque se utilizó una parte de los mismos en el ejemplo 10-2, las células de bazo restantes se fusionaron con células P3U1 de mieloma de ratón siguiendo un método estándar utilizando PEG1500. Las células fusionadas suspendidas en FBS al 10%/RPMI1640 se sembraron en una placa de cultivo de 96 pocillos y se cultivaron selectivamente los hibridomas mediante sustitución del medio por un medio de selección HAT transcurridos 1, 2, 3 y 5 días de la fusión. Se midió la actividad de unión al factor X mediante la ELISA descrita en 2-2, utilizando el sobrenadante de cultivo recogido el octavo día después de la fusión. Se seleccionaron los hibridomas que presentaban actividad de unión al factor X y se midieron sus actividades de neutralización de la actividad enzimática de factor Xa mediante el método descrito en 2.3. Los hibridomas que no presentaban una actividad de neutralización del factor Xa se clonaron llevando a cabo una dilución limitante dos veces. El ascites que contenía el anticuerpo clonado se preparó mediante el método descrito en 1.4, y se purificó el anticuerpo a partir del ascites. El anticuerpo purificado no podía ampliar el APTT y esto se confirmó mediante el método descrito en 1.5.

2.2 ELISA del factor X

Se diluyó factor X hasta 1 jg/m l con un tampón de recubrimiento y se dispersó en una placa inmunológica Nunc a razón de 100 jl/pocillo. A continuación, la placa se incubó a 4°C durante la noche. Tras lavar la placa con PBS (-) que contenía Tween® 20 tres veces, se bloqueó con un tampón diluyente a temperatura ambiente durante 2 horas. Tras eliminar el tampón, se añadió a la placa un antisuero de ratón diluido con tampón diluyente o sobrenadante de cultivo de hibridoma, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa tres veces, se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina que había sido diluido 1/2.000 con tampón diluyente, y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras lavar la placa seis veces, se añadió un sustrato colorimétrico de fosfato Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) a razón de 100 pl/pocillo y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Tras añadir la solución de parada Blue-PhosTM (Kirkegaad & Perry Laboratories) (100 pl/pocillo), se midió la absorbancia a 595 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).

2.3 Medición de la actividad neutralizadora de factor Xa

Se mezcló el sobrenadante de cultivo de hibridoma diluido a 1/5 con TBSB (10 pl) con 40 pl de TBCP (TBSB que contenía CaCh 2,78 mM y fosfolípidos 22,2 pM (fosfatidilcolina:fosfatidilserina=75:25, Sigma-Aldrich) que contenía 250 pg/ml de factor Xa (Enzyme Research Laboratories) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución mezclada se le añadieron TBCP (50 pl) que contenía protrombina (Enzyme Research Laboratories) (20 pg/ml) y 100 ng/ml de factor V activado de coagulación (factor Va (Haematologic Technologies)), y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se detuvo la reacción mediante adición de EDTA 0,5 M (10 pl). A esta solución de reacción se añadió solución S-2238 1 mM (Chromogenix) (50 pl) y tras la incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos, se midió la absorbancia a 405 nm con un lector de microplacas modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories).

[Ejemplo 3]. Construcción de vector de expresión de anticuerpo biespecífico quimérico.

3.1 Preparación de fragmentos de ADN codificantes de región variable de anticuerpo a partir de hibridomas.

A partir de los hibridomas que producían anticuerpo anti-F.IXa o anticuerpo anti-F.X, se extrajo el ARN total utilizando el minikit QIAGEN® RNeasy® (QIAGEN) según el método descrito en el manual de instrucciones. Se disolvió el ARN total en agua estéril (40 pl). Se sintetizó el ADNc monocatenario mediante RT-PCR utilizando el sistema de síntesis de ADNc SuperScript (Invitrogen) con el ARN purificado (1 a 2 pg) como molde, según el método descrito en el manual de instrucciones.

3.2 Amplificación por PCR de la región variable de cadena H de anticuerpo y análisis de secuencias.

Como cebadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena H (VH) de anticuerpo de ratón, se preparó una mezcla de cebador HB y una mezcla de cebador HF tal como se describe en Krebber et al. (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997). Utilizando 0,5 pl de cada una de las mezclas: mezcla de cebador HB 100 pM y mezcla de cebador HF 100 pM, se preparó una solución de reacción (25 pl) (solución de ADNc preparada en 3.1 (2,5 pl)), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCh 1,5 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos de ADNc, bajo las condiciones A (3 minutos de calentamiento a 98°C seguido de 32 ciclos de reacción (98°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo) o bajo las condiciones B (3 minutos de calentamiento a 94°C seguido de 5 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 46°C, 20 s, y 68°C, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, se sometió la solución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) siguiendo los métodos descritos en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 pl). Las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN se determinaron utilizando un kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Los grupos de secuencia determinados mediante este método se analizaron comparativamente utilizando el programa de análisis GENETYX-SV/RC versión 6.1 (Genetyx) y se seleccionaron los ADN que presentaban secuencias diferentes.

3.3 Preparación de fragmentos de ADN de región variable de anticuerpo para la clonación

Se llevó a cabo el procedimiento siguiente para añadir los sitios de corte del enzima de restricción Sfil para la clonación a ambos extremos de los fragmentos de amplificación de región variable de anticuerpo.

Para amplificar los fragmentos de VH añadidos con un sitio de corte de Sfil (Sfil-VH), se preparó un cebador (cebador VH-extremo 5') en el que la secuencia conectora de cebador HB (Gly⁴Ser⁾² se sustituyó por una secuencia que contenía el sitio de corte de Sfil (SEC ID n° 5). Utilizando 0,5 pl de cebador específico de secuencia VH-extremo 5' 10 pM y de cebador scfor 10 pM (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997), se preparó una solución de reacción (20 pl) (solución purificada de fragmento de amplificación de ADNc de VH preparada en 3.2 (1 pl), tampón Ko D plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCh 1,5 mM, 0,5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos de ADNc, bajo las condiciones A (3 minutos de calentamiento a 98°C seguido de 32 ciclos de reacción (98°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72C, 30 s cada ciclo) o bajo las condiciones B (3 minutos de calentamiento a 94°C seguido de 5 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 46°C, 20 s, y 68°C, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo)). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 jl).

Para amplificar los fragmentos de ADNc de la región variable de cadena L (V^l) de anticuerpo de ratón, en primer lugar se utilizaron 0,5 j l de cada uno de la mezcla de cebador LB 100 jM y la mezcla de cebador LF 100 jM indicados en Krebber et al. (J. Immunol. Methods 201:35-55, 1997), y se preparó una solución de reacción (25 j l ) (solución de ADNc preparada en 3.1 (2,5 jl), tampón KOD plus (t Oy Ob O), dNTP 0,2 mM, MgCl² 1,5 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer), se llevó a cabo una PCR según la eficiencia de amplificación de los fragmentos, bajo las condiciones de 3 minutos de calentamiento a 94°C seguido de 5 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 46°C, 20 s, y 68°C, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 jl). Los fragmentos se encontraban en un estado en el que la secuencia conectora (Gly⁴Ser)³ derivada del cebador LF se ha añadido a sus extremos C-terminales. Con el fin de añadir un sitio de corte de Sfil a los extremos C-terminales de los fragmentos, se preparó un cebador (cebador VL-extremo 3') en el que se había sustituido la secuencia conectora (Gly⁴Ser)³ del cebador LF por una secuencia que presentaba el sitio de corte de Sfil (SEC ID n° 6). Para amplificar los fragmentos de V^l con adición de un sitio de corte de Sfil (Sfil-VL), se utilizaron 0,5 j l de la mezcla de cebador VL-extremo 3' 10 jM y cebador scback 10 jM , y se preparó una mezcla de reacción (20 j l ) (solución purificada de fragmento de amplificación de ADNc de V^l (1 jl), tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCh 1,5 mM y 0,5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Se llevó a cabo la PCR utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) bajo las condiciones de 3 minutos de calentamiento a 94°C seguido de 5 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 46°C, 20 s, y 68°C, 30 s cada ciclo) y 30 ciclos de reacción (94°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño deseado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel de QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 jl).

Los fragmentos SfiI-VH y SfiI-VL purificados se digirieron con SfiI (Takara Bio) a 50°C durante la noche en una solución de reacción preparada siguiendo el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. A continuación, se purificó la solución de reacción utilizando un kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con tampón e B (30 j l ) incluido en el kit.

3.4 Plásmido de expresión de anticuerpo IgG biespecífico

Al producir el anticuerpo IgG biespecífico de interés, se hizo referencia a la técnica de botón en ojal de IgG1 (Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621, 1996) durante la preparación de IgG4 utilizando una porción CH3 con sustitución de aminoácidos para formar heteromoléculas para cada cadena H. Se sustituyó el tipo a (IgG4Ya) con Y349C y T366W, y el tipo b (IgG4Yb) se sustituyó con E356C, T366S, L368A e Y407V. Además, también se introdujo una sustitución (-ppcpScp-->-ppcpPcp-) en las regiones bisagra de ambos tipos. Prácticamente la totalidad de las cadenas H se convirtieron en heteromoléculas mediante está técnica; sin embargo, esto no es necesariamente aplicable a las cadenas L, y la formación de moléculas de anticuerpo innecesarias podría afectar a mediciones posteriores de la actividad. Por lo tanto, para expresar separadamente los brazos de cada molécula de anticuerpo (denominada molécula HL), que presentan diferentes especificidades, y formar eficientemente el tipo de anticuerpo IgG biespecífico de interés dentro de las células, se utilizaron como vectores de expresión para cada molécula HL las inducibles por diferentes fármacos.

Como vector de expresión para un brazo de la molécula de anticuerpo (denominada molécula brazo derecho de HL por conveniencia), se preparó pcDNA4-g4H o pcDNA4-g4L (figura 1 ó figura 2), en el que la región de la cadena H o L respectiva, es decir, una región variable de anticuerpo de ratón apropiada (V^h o V^l) y una región constante de IgG4Ya humana (SEC ID n° 7) o región constante k (SEC ID n° 8) se incorporó en el vector pcDNA4 de tipo inducible por tetraciclina (Invitrogen) cadena abajo de la secuencia de señal (IL3ss) para células animales (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1075, 1984). En primer lugar se utilizaron EcoRV y NotI (Takara Bio) para digerir pcDNA4 en los sitios de corte de enzima de restricción presentes en su sitio de clonación múltiple. La unidad de expresión de brazo derecho de cadena H o L (de aproximadamente 1,6 kb o de aproximadamente 1,0 kb, respectivamente) de un anticuerpo biespecífico quimérico que presentaba las regiones variables de anticuerpo apropiadas se digirió con XhoI (Takara Bio). A continuación, se purificó con el kit de purificación por PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se hizo reaccionar con ADN polimerasa KOD (TOYOBO) a 72°C durante 10 minutos en una composición de solución de reacción descrita en el manual de instrucciones adjunto para crear extremos romos. Los fragmentos de extremo romo se purificaron con el kit de purificación por PCR QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se digirieron con NotI (Takara Bio). Los fragmentos de extremo romo/NotI (de aproximadamente 1,6 ó 1,0 kb, respectivamente) y el pcDNA4 digerido con EcoRV/NotI se sometieron a una reacción de ligación utilizando Ligation High (TOYOBO), según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformó una cepa E. coli DH5a (DH5a altamente competente (TOYOBO)) con la solución de reacción mencionada anteriormente. A partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos de esta manera, se aislaron los plásmidos de ADN respectivos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN).

Como vector de expresión para el otro brazo de la molécula de anticuerpo (denominada molécula de brazo izquierdo de HL por conveniencia) se preparó pIND-g4H o pIND-g4L (figura 2 ó 3) según el método mencionado anteriormente, en el que la región respectiva de la cadena H o L, es decir, una región variable de anticuerpo (VH o VL) de ratón apropiada y una región constante de IgG4Yb humana (SEC ID n° 9) o una región constante k (SEC ID n° 8) se incorporaron en el vector pIND de tipo inducible por análogo de ecdisona (Invitrogen) cadena abajo de la secuencia de señal (IL3ss) para células animales (EMBO. J. 6:2939, 1987) y se aislaron los plásmidos de ADN respectivos.

3.5 Construcción de vector de expresión de anticuerpo biespecífico

El plásmido de expresión de tipo inducible por tetraciclina preparado en 3.4 (pcDNA4-g4H o pcDNA4-g4L) se digirió con SfiI y se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos (de aproximadamente 5 kb) que no presentaban la parte de región variable intrínseca del anticuerpo (Vh o Vl (ver la figura 1 ó 2)) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 pl). Los fragmentos, y el fragmento Sfi-I-VH o Sfi-Vl correspondiente derivado del anticuerpo anti-F.IXa digerido con SfiI preparado en 3.3, se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit Quick Ligation (New England Biolabs) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformó una cepa E. coli DH5a (DH5a altamente competente (TOYOBO)) con la solución de reacción mencionada anteriormente. Además, los fragmentos obtenidos mediante eliminación de la parte de región variable del anticuerpo mediante una técnica similar a la indicada anteriormente (Vh o Vl (ver la figura 2 ó 3) del plásmido de expresión de tipo inducible por análogo de ecdisona digerido con SfiI (pIND-g4H o pIND-4GL) preparado en 3.4 y el fragmento SfiI-VH o SfiI-VL derivado del anticuerpo anti-F.X digerido con SfiI se incorporaron mediante un método similar.

En cada uno de los transformantes resistentes a ampicilina así obtenidos, se confirmó la inserción del fragmento de interés mediante el método de PCR de colonias utilizando cebadores que circundaban al fragmento insertado. En primer lugar, para el vector de expresión de cadena H o L quimérica del anticuerpo anti-F.IXa, se sintetizaron un cebador CMVF 21-mero (SEC ID n° 10) que se hibridaba con el sitio de cebador directo de CMV situado cadena arriba del sitio de inserción, y un cebador de BGHR 18-mero (SEC ID n° 11) que se hibridaba con el sitio de cebador inverso de BGH situado cadena abajo del sitio de inserción (Sigma Genosys). Para el vector de expresión de cadena H o L quimérica del anticuerpo anti-F.X se sintetizaron un cebador EcdF 24-mero (SEC ID n° 12) que se hibridaba cadena arriba del sitio de inserción y un cebador de BGHR 18-mero (SEC ID n° 11) que se hibridaba con el sitio de cebador inverso de BGH situado cadena abajo del sitio de inserción (Sigma Genosys). Para la PCR de colonias, se preparó una solución de reacción (20 pl) (0,2 pl de cebador (10 pM)), tampón KOD dash (TOYOBO), dNTP 0,2 mM y 0,75 unidades de ADN polimerasa KOD dash) (TOYOBO)). A esta solución de reacción se le añadieron células de la cepa transformante en cantidades apropiadas y se llevó a cabo la PCR. La PCR se llevó a cabo utilizando un ciclador térmico GeneAmp PCR system 9700 (Perkin Elmer) bajo las condiciones de calentamiento de 1 minuto a 96°C seguido de 30 ciclos de reacción (96°C, 10 s; 55°C, 10 s, y 72°C, 30 s en cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se seleccionaron los clones a partir de los que se obtendrían los fragmentos de amplificación del tamaño deseado. El producto de PCR se trató con ExoSAP-IT (Amersham Biosciences) para inactivar el exceso de cebadores y los dNTP, según el manual de instrucciones adjunto. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN utilizando un kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Los grupos de secuencias determinados mediante el presente método se analizaron utilizando el programa de análisis GENETYX-SV/RC versión 6.1 (Genetyx). Para VH, se seleccionaron los clones de interés que no presentaban ninguna inserción, deleción o mutación. Para VL, a partir del pseudogén VL derivado de P3U1 utilizado en hibridomas se seleccionaron los clones de interés que no presentaban ninguna inserción, deleción o mutación.

A partir de los clones de interés, los plásmidos de ADN respectivos se aislaron mediante la utilización de un kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y después se disolvieron en agua estéril (100 pl). El vector de expresión de cadena H quimérica del anticuerpo anti-F.IXa, el vector de expresión de cadena L quimérica del anticuerpo F.IXa, el vector de expresión de cadena H del anticuerpo anti-F.X y el vector de expresión de cadena L quimérica del anticuerpo anti-F.X se denominaron pcDNA4-g4lXaHn, pcDNA4-g4lXaLn, pIND-g4XHn y pIND-g4XLn, respectivamente. Se almacenó cada solución de plásmidos a 4°C hasta la utilización.

[Ejemplo 4]. Expresión de anticuerpos biespecíficos quiméricos en células animales

4.1 Preparación de soluciones de ADN

La expresión de los vectores de expresión del brazo derecho de la molécula HL del anticuerpo (pcDNA4-g4lXaHn y pcDNA4-g4lXaLn) se indujo con tetraciclina. En ausencia de tetraciclina, el plásmido codificante de represor Tet denominado pcDNA6/TR (Invitrogen) resultaba necesario para suprimir por completo sus expresiones. Además, la expresión de los vectores de expresión del brazo izquierdo de la molécula HL de anticuerpo (pIND-g4XHn y pIND-g4XLn) se indujo con un análogo de la hormona de insecto ecdisona (ponasterona A). Esto requiere el plásmido pVgRXR (Invitrogen) que codifica el receptor de ecdisona y el receptor del retinoide X que reaccionan con la ponasterona A e inducen la expresión. Por lo tanto, para la transfección de células animales, se preparó una mezcla de seis tipos de plásmido de ADN en total. Para 1 ml de cultivo celular, se utilizaron pcDNA4-g4lXaHn, pcDNA4-g4IXaLn, pIND-g4XHn y pIND-g4XLn (218,8 ng cada uno), así como pcDNA6/TR y pVgRXR (1.312,5 ng cada uno).

4.2 Transfección de células animales

Se suspendió la cepa HEK293H derivada de células de carcinoma renal fetal humano (Invitrogen) en un medio de cultivo DMEM (Invitrogen) que contenía FCS al 10% (MOREGATE), 1 ml del cual se sembró a una densidad celular de 5x105 células/ml en cada pocillo de una placa de 12 pocillos para células adhesivas (CORNING) y se cultivó en un incubador de CO² (37°C, 5% de CO²). La mezcla de plásmido de ADN preparada en 4.1 se añadió a una mezcla de reactivos de transfección, lipofectamina 2000 (Invitrogen) (7 j l ) y medio Opti-MEM I (Invitrogen) (250 j l) y se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla resultante se añadió a las células en cada pocillo y se incubó durante 4 a 5 horas en un incubador de CO² (37°C, 5% de CO²).

4.3 Inducción de la expresión de anticuerpo IgG biespecífico

Se eliminó el medio de cultivo mediante succión del cultivo celular transfectado indicado anteriormente, y después se añadió 1 ml del medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen) que contenía 1 jg/m l de tetraciclina (Wako Pure Chemical Industries). La mezcla resultante se incubó durante un día en un incubador de CO² (37°C, 5% de CO²) para inducir la expresión primaria del brazo derecho de la molécula HL de anticuerpo. Posteriormente, tras eliminar el medio mediante succión, lavar con 1 ml de medio CHO-S-SFM-II y añadir 1 ml de un medio CHO-S-SFM-II que contenía ponasterona A 5 jM (Invitrogen), la mezcla se incubó en un incubador de CO² (37°C, 5% de CO²) durante 2 a 3 días y se indujo la expresión secundaria del brazo izquierdo de la molécula HL de anticuerpo de manera que el anticuerpo IgG biespecífico se secretase al medio. Se recuperó el sobrenadante de cultivo y se centrifugó (aproximadamente 2.000 g, 5 minutos, temperatura ambiente) para separar las células y se concentró utilizando un Microcon® YM-50 (Millipore), en caso necesario. Se almacenó la muestra a 4°C hasta la utilización.

[Ejemplo 5]. Cuantificación de la concentración de la IgG humana.

Se ajustó la concentración de anticuerpo de cabra purificado por afinidad contra Fc de la IgG humana (Cappel) a 1 jg/m l con un tampón de recubrimiento y se inmovilizó en una placa inmunológica Nunc. Tras bloquear con un tampón diluyente (D.B.), se añadió una muestra del sobrenadante de cultivo convenientemente diluida con D.B. Además, como estándar para el cálculo de la concentración del anticuerpo, se añadió de manera similar IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, ver el documento WO 99/51743) diluida con D.B. en una serie de dilución de dos veces hasta 11 estadios partiendo de 1.000 ng/ml. Tras tres lavados, se hizo reaccionar anti-IgG humana de cabra-fosfatasa alcalina (Biosource International). Tras cinco lavados, se reveló el color de la placa utilizando el sustrato de fosfatasa Sigma 104® (Sigma-Aldrich) como sustrato y se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de absorbancia modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories) con una longitud de onda de referencia de 655 nm. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva estándar.

[Ejemplo 6]. Ensayo de actividad de mimético de F.VIIIa (factor VIII activado de coagulación)

Se evaluó la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico mediante el ensayo enzimático siguiente. Todas las reacciones siguientes se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se incubó una mezcla de 40 j l de factor IX (3,75 jg/ml, Enzyme Research Laboratories) y 10 j l de la solución de anticuerpos en una placa de 96 pocillos durante 1 hora. A continuación, se añadieron 10 j l de factor XIa (10 ng/ml, Enzyme Research Laboratories), 20 j l de factor X (50 jg/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 j l de fosfolípido (400 jg/ml, ver los ejemplos 1 a 3) y 15 j l de TBSB que contenía CaCh 5 mM y MgCh 1 mM (en adelante abreviado como TBSB-S) para iniciar la reacción enzimática. Tras 30 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 |jl de EDTA 0,5 M.

Tras añadir una solución de sustrato colorimétrico (50 j l ) a cada pocilio, se midió la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia: 655 nm) a los 0 y 30 minutos utilizando un lector de microplacas de modelo 3550 (Bio-Rad Laboratories). Se presentó la actividad mimética de F.VIIIa como valor obtenido tras restar el valor del cambio de absorbancia en 30 minutos sin adición de anticuerpo de la adición de anticuerpo (ver las figuras 4 y 5).

Se utilizó TBSB como solvente para los fosfolípidos, mientras que se utilizó TBSB-S como solvente para los factores Xla, IX y X. La solución de sustrato colorimétrico era una mezcla 1:1 de sustrato colorimétrico S-2222 "Tesutochimu" (Chromogenix) disuelto según el manual de instrucciones adjunto y una solución de polibreno (0,6 mg/l de bromuro de hexadimetrina (Sigma)).

Además, se midió la dependencia de la concentración de la actividad mimética de F.VIIIa presentada por XB12/SB04, que era la más alta de todas (figura 6).

[Ejemplo 7]. Ensayo de coagulación plasmática

Con el fin de elucidar si un anticuerpo biespecífico corregía la capacidad de coagulación de la sangre de hemofilia A, se examinaron los efectos del anticuerpo biespecífico sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) utilizando plasma deficiente en F.VIII. Se calentó a 37°C durante 3 minutos una solución mixta que comprendía una solución de anticuerpo a diversas concentraciones (50 jl), plasma deficiente en F.VIII (50 jl, Biomerieux) y reactivo de APTT (50 jl, Dade Behring). Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de CaCh 20 mM (50 jl, Dade Behring) a la mezcla mencionada anteriormente. Se midió el tiempo requerido para la coagulación con un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (figuras 7 y 8).

Además, se midió la dependencia de la concentración de XB12/SB04, que mostraba la actividad de acortamiento del tiempo de coagulación más elevada (figura 9).

[Ejemplo 8]. Purificación de los anticuerpos

El sobrenadante de cultivo (10 ml) obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 4 se concentró a 1 ml utilizando un Centricon® YM-50 (Millipore). A este concentrado se le añadieron BSA al 10% (10 jl), Tween 20 al 1% (10 j l ) y rProteína A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) (100 jl), y la solución se mezcló mediante agitación vertical a 4°C durante la noche. La solución se transfirió a una cubeta de filtro de 0,22 jm Ultrafree®-MC (Millipore) y tras el lavado con TBS que contenía Tween® 20 al 0,01% (500 j l) tres veces, se suspendió la resina rProtein A Sepharose™ en 100 j l de HCl 10 mM/Tween® 20 al 0,01% (pH 2,0) y se dejó reposar durante 3 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo y se neutralizó inmediatamente el eluido con la adición de 5 j l de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana a partir de la curva estándar. Se cuantificó la concentración de anticuerpo según el ejemplo 5.

[Ejemplo 9]. Transferencia western de GST-AP del anticuerpo anti-F.X

Se construyó un E. coli recombinante que expresaba proteína de fusión de péptido F.X. activado (AP) con glutatión-S-transferasa (GST). El ADNc que cubría la región de traducción de longitud completa del F.X humano se amplificó mediante PCR a partir del ADNc hepático humano Marathon-Ready (Clontech). A continuación, se utilizó este ADNc como molde para amplificar la región codificante de la región de AP mediante PCR (Leytus et al., Biochemistry 25:5098, 1986), que se subclonó en un vector pGEM-T (Promega) para obtener pGEX-F10AP codificante de GST-AP. Se cultivó E. coli transformado con este plásmido y a DO=0,8, se añadió IPTG 1 mM para inducir la expresión de GST-AP. Tras centrifugar la solución de cultivo (3.000xg, 30 minutos, 4°C), se recolectaron las células y se almacenaron a -20°C hasta la utilización.

Tras resuspender el sedimento celular en 1/20 de volumen de cultivo de PBS, se añadieron 2,4 ml de tampón para muestras SDS-PAGE (IWAKI) por cada 0,1 ml de suspensión, y la mezcla resultante se sometió a ebullición a 95°C durante 5 minutos. Se añadió esta solución de reacción (10 j l ) a cada pocillo de un mini gel de SDS-PAGE al 14% (Asahi Technoglass) y se sometió a electroforesis. El gel después de la electroforesis se transfirió a una membrana de transferencia Immobilon-PTM (MILLIPORE) utilizando un blotter semiseco (BIO-RAD) y se bloqueó con BT-PBS (PBS que contenía BSA al 2% y Tween® 20 al 0,05%). Tras completar el bloqueo, se hizo reaccionar durante 1 hora con anticuerpo SB04 o SB06 anti-F.X de ratón purificado en el ejemplo 1.4 y se diluyó con BT-PBS hasta 2 jg/m l. Tras lavar con PBS que contenía Tween® 20 al 0,05%, la membrana se hizo reaccionar durante 1 hora con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H+L) marcado con fosfatasa alcalina (Zymed Laboratories) diluido 2.000 veces con BT-PBS. Tras lavar con PBS que contenía Tween® 20 al 0,05%, se reveló el color de la membrana con un sustrato colorimétrico, sustrato de fosfatasa BCIP/NBT (Kirkegaad & Perry Laboratories) (ver la figura 10).

[Ejemplo 10]. Obtención de anticuerpo biespecífico a partir de biblioteca de scFv derivada de bazo de ratón inmunizado.

10.1 Antígeno e inmunización

Se inmunizaron tres ratones BALB/c (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)), 3 ratones MRL/lpr (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)) y 3 ratones C57BL/6N (macho, 6 semanas de edad al iniciar la inmunización (Japan Charles River)) con factor antígeno IXap (Enzyme Research Laboratories, Inc.) o factor X (Enzyme Research Laboratories, Inc.) tal como se describe posteriormente. A modo de inmunización inicial, se administró por vía subcutánea el antígeno (40 pg/cabeza) emulsionado con FCA (adyuvante completo de Freund H37 Ra, Difco Laboratories). Dos semanas después, se administró por vía subcutánea el antígeno (40 pg/cabeza) emulsionado con FIA (adyuvante incompleto de Freund, Difco Laboratories). Posteriormente, se administraron tres inmunizaciones de refuerzo a intervalos de una semana, y 8 días después de la inmunización final, se extirparon los bazos de los ratones.

10.2 Construcción de una biblioteca fágica

Se añadió al reactivo Trizol (Invitrogen) (50 mg de bazo/ml de reactivo) una parte de los bazos extirpados de los ratones inmunizados preparados en los ejemplos 1.1 y 2.1, y se homogenizaron utilizando un homogenizador de vidrio. A continuación, se extrajo el ARN total según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. A partir de la solución de extracto, se extrajo ARN poliA(+) utilizando un kit PolyATract System 1000 (Promega) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se sintetizó ADNc mediante RT-PCR (sistema de síntesis de primera cadena Superscript III para RT-PCR, Invitrogen) y se almacenó a -20°C hasta la utilización.

Como cebadores para la amplificación de los ADNc de las regiones variables de cadena pesada (VH) y de cadena ligera (VL) de anticuerpo de ratón, se prepararon mezcla de cebador HB, mezcla de cebador HF, mezcla de cebador LB y mezcla de cebador LF utilizadas en los ejemplos 3.2 y 3.3. Para la amplificación de VH, se preparó una solución de reacción de 50 pl (2,5 pl de solución de ADNc, tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCh 1,5 mM y 3,75 unidades de A d N polimerasa KOD plus (TOYOBO)) utilizando 1 pl de mezcla de cebador HB 100 pM y de mezcla de cebador HF 100 pM. Además, para la amplificación de VL, se prepararon 50 pl de solución de reacción de la misma composición indicada anteriormente utilizando 1 pl de mezcla de cebador LB 100 pM y 1 pl de mezcla de cebador LF 100 pM. Se llevó a cabo una PCR utilizando un ciclador térmico GeneAmp p Cr system 9700 (Perkin Elmer) mediante un calentamiento de tres minutos a 98°C seguido de 32 ciclos de reacción (98°C, 20 s; 58°C, 20 s, y 72°C, 30 s cada ciclo). Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2%. Los fragmentos amplificados del tamaño de interés (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (50 pl). A continuación, para la amplificación de fragmentos scFv, se prepararon diez tubos con 100 pl de solución de reacción (3 pl de solución de fragmento VH, 3 pl de solución de fragmento de VL, tampón KOD plus (TOYOBO), dNTP 0,2 mM, MgCl² 1 mM y 5 unidades de ADN polimerasa KOD plus (TOYOBO)). Tras la 1a PCR (calentamiento de 3 minutos a 94°C seguido de 7 ciclos de reacción (94°C, 1 minuto y 63°C, 4 minutos en cada ciclo), se añadieron cebador scfor 10 pM y cebador scback 10 pM (2,5 pl de cada uno) a cada tubo, manteniéndolos a 63°C, y después se llevó a cabo la 2a PCR (un calentamiento de 35 segundos a 94°C seguido de 30 ciclos de reacción (94°C, 2 minutos y 63°C, 2 minutos en cada ciclo). Tras la pCR, se purificó la solución de reacción utilizando el kit de purificación mediante PCR QIAquick (QIAGEN) y los productos purificados se digirieron con enzima de restricción SfiI (Takara Bio) a 50°C durante la noche. Tras someter los digeridos a electroforesis en gel de agarosa al 2%, se purificaron los fragmentos amplificados del tamaño de interés (aproximadamente 800 pb) utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con una cantidad apropiada de agua estéril. Para la presentación de scFv sobre la proteína fágica del gen III, se utilizó pELBGlacI (ver la figura 11) como vector fagémido. Tras digerir el vector (10 pg) con el enzima de restricción SfiI (Takara Bio) a 50°C durante la noche, los fragmentos cortados del tamaño de interés (aproximadamente 5 kb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con una cantidad apropiada de agua estéril. El producto de PCR purificado y el fragmento de vector purificado se sometieron a una reacción de ligación a 16°C durante la noche utilizando Ligation High (TOYOBO) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se transformaron células E. coli XL1 Blue electrocompetentes (Stratagene) o DH12 electromax (Invitrogen) utilizando la solución de reacción mediante un método de electroporación según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se recogieron todos los transformantes resistentes a ampicilina así obtenidos y se almacenaron como la biblioteca recombinante a -20°C hasta la utilización.

Se inoculó la biblioteca de E. coli (2x109 cfu) en 50 ml de 2x YTAG (2x TY que contenía 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 2%) y se cultivó a 37°C hasta que la DO 600 alcanzó entre 0,4 y 0,5. Se añadieron 4x1011 fagos ayudantes VCSM13 (Stratagene) al cultivo, que se dejó reposar a 37°C durante 15 minutos para la infección celular. Las células infectadas se cultivaron a 30°C durante 10 minutos, tras la adición de 450 ml de 2x YTAK (2x TY que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de canamicina) y 25 pl de IPTG 1 mol/l. Se recogió el sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, se mezcló con 100 ml de solución de PEG-NaCl (polietilenglicol 8000 al 10%, NaCl 2,5 moles/l) y se dejó reposar a 4°C durante 60 minutos. Se precipitaron los fagos mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendió el precipitado en 40 ml de agua, se mezcló con 8 ml de solución de PEG-NaCl y se dejó reposar a 4°C durante 1 hora. Los fagos se precipitaron mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendieron en 5 ml de PBS para obtener la biblioteca fágica. Se almacenaron los fagos a 4°C hasta la utilización.

10.3 Concentración de fagos unidos mediante adsorción (panning)

Se marcó factor IXap o factor X con biotina utilizando microtubos de NHS-PeO⁴-biotina premedido sin pesaje (Pierce). Se añadió factor IXap o factor X (100 pmoles) marcados con biotina a la solución de biblioteca fágica preparada en 10.2 (600 pl) y se puso en contacto con el antígeno durante 60 minutos. Se añadieron perlas Dynabeads M-280 recubiertas de estreptavidina (600 pl, DYNAL) con M-PBS al 5% (PBS que contenía leche desnatada al 5% p/v) para la unión durante 15 minutos. Los fagos unidos a las perlas se lavaron varias veces con PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,1%, 1 ml) y después con PBS. Las perlas se suspendieron en 0,8 ml de glicina/HCl 0,1 moles/l (pH 2,2) durante 5 minutos para eluir los fagos.

Alternativamente, la biblioteca fágica (80 pl/pocillo x 5), que había sido incubada con leche desnatada al 2,5% p/v durante 15 minutos, se añadió a factor IXap o a factor X (10 pg/pocillo x 5) inmovilizado sobre una placa inmunológica (MaxiSorp, Nunc) y se puso en contacto con el antígeno durante 60 minutos. Los fagos unidos a antígenos se lavaron varias veces con PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,1%, 1 ml) y después con PBS. Los fagos unidos se incubaron con 0,8 ml de glicina/HCl 0,1 ml/l (pH 2,2) durante 5 minutos para eluir los fagos.

La solución de fagos recolectada de esta manera se neutralizó mediante la adición de Tris 2 moles/l (45 pl), se añadió a 10 ml de células XL1-Blue en etapa de crecimiento logarítmico (DO600=0,4 a 0,5) y se dejó reposar durante 30 minutos a 37°C para la infección celular. Se extendió la mezcla sobre una placa 2x YTAG y se cultivó a 30°C. Se recolectaron las colonias, se inocularon en 2x YTAG y se cultivaron a 37°C hasta una DO600=0,4 a 0,5. Se añadieron IPTG (1 mol/l, 5 pl) y fago ayudante VCSM13 (1011 pfu) a la solución de cultivo (10 ml) y se dejó reposar la mezcla a 37°C durante 30 minutos. Se recogieron las células mediante centrifugación, se resuspendieron en 2x YTAK (100 ml) y se cultivaron a 30°C durante 10 horas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo mediante centrifugación, se mezcló con PEG-5 al 10%-solución de NaCl 5 moles/l (20 ml) y se dejó reposar a 4°C durante 20 minutos. Se precipitaron los fagos mediante centrifugación a 10.800xg durante 30 minutos y se suspendieron en PBS (2 ml) y se proporcionaron para el adsorción (panning) posterior.

10.4 ELISA de fagos

La colonia individual mencionada anteriormente se inoculó en 2x YTA (100 pl) y se cultivó a 30°C durante la noche. Tras inocular 5 pl de este cultivo en 2x YTAG (500 pl) y el cultivo a 37°C durante 5 horas, se añadió fago ayudante (2x10⁸ pfu) y después se dejó reposar el cultivo a 37°C durante 30 minutos. Además, tras el cultivo durante 30 minutos bajo agitación a 37°C, se añadió 2x YTAK que contenía IPTG 0,5 mM (120 pl). Tras un cultivo durante la noche a 30°C, el sobrenadante centrifugado se sometió a ELISA. Para la ELISA de los clones obtenidos mediante adsorción (panning) de los antígenos marcados con biotina, se utilizó una placa de microtitulación de 96 pocillos Strepta (Roche) recubierta con 1,0 pg/ml de antígeno marcado con biotina. Además, para el ELISA de los clones obtenidos mediante adsorción (panning) de los antígenos nativos, se utilizó una placa inmunológica (MaxiSorp, Nunc) inmovilizada con 1,0 pg/ml de antígeno nativo. Tras lavar con PBST para eliminar el antígeno, la reacción se bloqueó con 200 pl de M-PBS al 2% o BSA-PBS al 2% (PBS que contenía BSA al 2% p/v) como tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras eliminar el tampón, se añadió el sobrenadante de cultivo a la placa, y se dejó reposar durante 60 minutos para la unión de fagos. Tras el lavado, se detectó el fago unido con un anticuerpo anti-M13 unido a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) y sustrato TMB (Zymed). Se detuvo la reacción mediante la adición de H²SO⁴1 mol/l y se midió el valor de A450 con un lector de placas.

10.5 Determinación de secuencias y selección de clones

Utilizando el medio de cultivo 2x YTAG del clon de E. coli recombinante positivo en el ELISA, se determinó la secuencia de nucleótidos de la región de scFv mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores PBG3-F1 (5'-CAGCTATGAAATACCTATTGCC-3'/SEC ID n° 1) y PBG3-R1 (5-CTTTTCATAATCAAAATCACCGG-3'/SEC ID n° 2). Se sometió una solución para PCR de 15 pl que comprendía 1 pl de medio de cultivo, 1,5 pl de 10x tampón KOD Dash, 0,2 pl de cada uno de los cebadores 10 pmoles/l y 0,3 pl de polimerasa KOD Dash (TOYOBO, 2,5 U/pl) a 30 ciclos de amplificación (96°C, 10 s; 55°C, 10 s, y 72°C, 30 s) utilizando el ciclador térmico GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer). Tras la PCR, se añadieron 3 pl de ExoSAP-IT (Amersham) a 5 pl de la solución de reacción, y la mezcla se mantuvo caliente a 37°C durante 15 minutos y posteriormente a 80°C durante 15 minutos. De esta manera, la reacción se llevó a cabo utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) con PBG3-F2 (5-ATTGCCTACGGCAGCCGCT-3'/SEC ID n° 3) o PBG3-R2 (5'-AAATCACCGGAACCAGAGCC-3'/SEC ID n° 4) como cebador, y los productos se sometieron a electroforesis con un secuenciador de ADN Applied Biosystems PRISM 3700. Se seleccionaron así los clones que presentaban diferentes secuencias de aminoácidos de CDR3 predichas a partir de las secuencias de nucleótidos, 52 clones como anti-factor IXa y 33 clones como anti-factor X.

10.6 Construcción de vectores de expresión de anticuerpos IgG biespecíficos

Para expresar el anticuerpo scFv en forma de anticuerpo de tipo IgG, se clonaron regiones variables de anticuerpo (V^h, V^l) en vectores de expresión de tipo inducible, por medios similares a los mostrados en los ejemplos 3.3, 3.4 y 3.5. Se incorporaron individualmente regiones variables de anticuerpo anti-F.IXa (VH y VL) en un vector de tipo inducible por tetraciclina (pcDNA4-g4H y pcDNA4-g4L, respectivamente). Se incorporaron individualmente regiones variables de anticuerpo anti-F.X (V^h y V^l) en un vector de tipo inducible por análogo de ecdisona (pIND-g4H y pcDNA4-g4L, respectivamente). De los clones de interés, se aislaron los plásmidos de ADN respectivos utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y se disolvieron en agua estéril (100 jl).

10.7 Expresión de anticuerpos biespecíficos quiméricos en células animales

Utilizando la solución de ADN preparada por medios similares a los mostrados en el ejemplo 4.1, se expresó ADN en células animales por medios similares a los mostrados en los ejemplos 4.2 y 4.3, y se recogió el sobrenadante de cultivo. Se almacenaron las muestras a 4°C hasta la utilización.

[Ejemplo 11]. Purificación de anticuerpos

A 10 ml del sobrenadante de cultivo obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 10.7, se añadieron 100 j l de rProteína A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences) y se le mezclaron mediante agitación vertical a 4°C durante la noche. Se transfirió la solución a una cubeta de filtro de 0,22 jm Ultrafree®-MC (Millipore) y tras tres lavados con 500 j l de TBS que contenía Tween® 20 al 0,01%, se suspendió resina rProteína A Sepharose™ en 100 j l de Hcl 10 mM/Tween® 20 al 0,01% (pH 2,0) y se dejó reposar durante 3 minutos. A continuación, se eluyó el anticuerpo y el eluido se neutralizó inmediatamente mediante la adición de 5 j l de Tris-HCl 1 M, pH 8,0. Utilizando el programa Microplate Manager III (Bio-Rad Laboratories), se calculó la concentración de IgG humana en el sobrenadante de cultivo a partir de la curva estándar de IgG4 humana (anticuerpo anti-TF humanizado, ver el documento WO 99/51743). Se cuantificó la concentración de anticuerpos según el ejemplo 5.

[Ejemplo 12]. Ensayo de actividad de mimético de F.VIIIa (factor VIII activado de coagulación)

Se evaluó la actividad mimética de F.VIIIa de un anticuerpo biespecífico mediante el ensayo enzimático siguiente. Se llevaron a cabo todas las reacciones indicadas a continuación a temperatura ambiente. Una solución mixta de 10 j l de factor IX (15 jg/ml, Enzyme Research Laboratories), 5 j l de TBSB que contenía CaCl²100 mM y MgCh 20 mM, y 50 j l del sobrenadante de cultivo obtenido mediante el método descrito en el ejemplo 10.7 se incubó en una placa de 96 pocillos durante 1 hora. A continuación, se añadieron 10 j l de factor XIa (10 ng/ml, Enzyme Research Laboratories), 20 j l de factor X (50 jg/ml, Enzyme Research Laboratories) y 5 j l de fosfolípidos (400 jg/m l) para iniciar la reacción enzimática. Tras 30 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 10 j l de EDTA 0,5 M.

Tras añadir 50 j l de una solución de sustrato colorimétrico a cada pocillo, se midió la absorbancia a 405 nm (longitud de onda de referencia: 655 nm) a los 0 y 60 minutos con un lector de microplacas modelo 3550 (BioRad Laboratories). Se expresó la actividad mimética de F.VIIIa como un valor obtenido mediante la resta del valor de cambio de la absorbancia en el sobrenadante de cultivo que no expresaba ningún anticuerpo del valor obtenido del sobrenadante de cultivo que expresaba el anticuerpo (ver la figura 12).

Se utilizó TBSB como solvente para el fosfolípido, el factor XIa, el factor IX y el factor X. La solución de sustrato colorimétrico era una mezcla 1:1 de sustrato colorimétrico S-2222 "Tesutochimu" (Chromogenix) disuelto según el manual de instrucciones adjunto y solución de polibreno (bromuro de hexadimetrina 0,6 mg/l, Sigma).

[Ejemplo 13]. Ensayo de coagulación plasmática

Para elucidar si un anticuerpo biespecífico preparado según el método del ejemplo 11 recuperaba la capacidad de coagulación de la sangre de hemofilia A, se evaluaron los efectos del anticuerpo sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) utilizando plasma deficiente en F.VIIIa mediante un método similar al mostrado en el ejemplo 7 (ver la figura 13). Además, A44/B26 y A69/B26, que resultan muy efectivos en el acortamiento del tiempo de coagulación, se midieron para su dependencia de la concentración (ver las figuras 14 y 15).

[Ejemplo 14]. Evaluación de la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico y F.VIII

Se evaluó la utilización concomitante de un anticuerpo biespecífico y F.VIII bajo las condiciones de ensayo de coagulación plasmática siguientes. Se incubó una mezcla de 40 j l de solución de anticuerpo (25 |jg/ml) y 50 j l de plasma deficiente de F.VIII (Biomerieux) a temperatura ambiente durante 30 minutos. A esta mezcla, se le añadieron 10 j l de la formulación Kogenate® FS (BAYER) de factor VIII recombinante de coagulación sanguínea y 50 j l de reactivo de APTT (Dade Behring), y se calentó a 37°C durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de 50 j l de CaCh 20 mM (Dade Behring). Se midió el tiempo requerido para la coagulación utilizando un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (ver la figura 16).

[Ejemplo 15]. Efectos del anticuerpo IgG biespecífico en plasma inhibidor

Se evaluaron los efectos de un anticuerpo IgG biespecífico en el plasma inhibidor bajo las condiciones de ensayo de coagulación plasmática siguientes. Se incubó una mezcla de 50 j l de plasma deficiente en F.VIII (Biomerieux) y 10 j l de anticuerpo neutralizador anti-F.VIII humano (100 jg/ml, número de catálogo MAB3440, CHEMICON) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se utilizó este plasma como plasma inhibidor. A este plasma inhibidor se le añadieron 40 j l de la solución de anticuerpo (25 jg/m l) y 50 j l de reactivo de APTT (Dade Behring) y se calentó a 37°C durante 3 minutos. Se inició la reacción de coagulación mediante la adición de 50 j l de CaCh 20 mM (Dade Behring) a la mezcla. Se midió el tiempo requerido para la coagulación utilizando un analizador KC10A (Amelung) conectado a CR-A (Amelung) (ver la figura 17).

[Ejemplo 16]. Humanización de anticuerpos biespecíficos

De entre los anticuerpos biespecíficos obtenidos en los ejemplos 1 a 7, XB12 (anticuerpo de ratón anti-factor IXa)/SB04 (anticuerpo de ratón anti-factor X), que fue el más efectivo en el acortamiento del tiempo de coagulación sanguínea, se sometió a humanización del modo siguiente.

16.1 Búsqueda de homología de los anticuerpos humanos

Se construyó la base de datos basándose en datos de secuencias de aminoácidos de anticuerpos humanos obtenidos de la base de datos Kabat (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/ y de la base de datos IMGT (http://imgt.cines.fr/) disponibles públicamente, y la búsqueda de homologías se llevó a cabo separadamente para la región variable de cadena H de XB12 de ratón, de la región variable de cadena L de XB12 de ratón, de la región variable de cadena H de SB04 de ratón y de la región variable de cadena L de SB04 de ratón. Los resultados confirmaron que presentaban homologías elevadas respecto a las secuencias de anticuerpo humano mostradas posteriormente, y de esta manera se decidió que se utilizarían como la región marco (en adelante abreviada Fr ) de los anticuerpos humanizados.

(1) región variable de cadena H de XB12: KABATID-020619 (base de datos Kabat)

(Mariette et al., Arthrities Rheum. 36:1315-1324, 1993)

(2) Región variable de cadena L de XB12: n° de acceso de EMBL X61642 (base de datos IMGT) (Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991)

(3) región variable de cadena H de SB04: KABATID-025255 (base de datos Kabat)

(Demaison et al., Immunogenetics 42:342-352, 1995)

(4) región variable de cadena L de SB04: n° de acceso de EMBL AB064111 (base de datos IMGT) (datos no publicados)

Para la preparación de anticuerpos humanizados, se injertaron regiones determinantes de complementariedad (en adelante abreviadas como CDR) de cada anticuerpo de ratón en las FR de anticuerpos humanos (1) a (4). Además, se utilizó el sitio de internet en NCBI disponible públicamente (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) para la búsqueda de secuencias de señal secretoria del anticuerpo humano que eran altamente homólogas a los anticuerpos humanos (1) a (4). Se utilizaron las secuencias de señal secretoria siguientes obtenidas mediante la búsqueda de homologías.

(1) región variable de cadena H de XB12: n° de acceso GenBank AF062120

(2) región variable de cadena L de XB12: n° de acceso GenBank M74019

(3) región variable de cadena H de SB04: n° de acceso GenBank BC019337

(4) región variable de cadena L de SB04: n° de acceso GenBank AY204756

16.2 Construcción de vector de expresión de gen de anticuerpo humanizado

Se prepararon doce oligonucleótidos sintéticos de aproximadamente 50 bases a partir de una secuencia de nucleótidos codificante de la secuencia de aminoácidos entre la secuencia de señal secretoria y la región variable de anticuerpo, de manera que aproximadamente 20 bases de su extremo 3-terminal se hibridaban entre sí. Además, se prepararon un cebador que hibridaba con el extremo 5'-terminal de un gen de región variable de anticuerpo y que presentaba una secuencia de corte con XhoI, y un cebador que se hibridaba con el extremo 3'-terminal de un gen de región variable de anticuerpo y que presentaba la secuencia de corte con Sfil.

Se mezclaron los oligonucleótidos sintéticos preparados (2,5 j M, 1 j l de cada uno) y se añadieron 1x tampón TaKaRa Ex Taq, dNTP 0,4 mM y 0,5 unidades de TaKaRa Ex Taq (todos de Takara Shuzo), hasta 48 j l de solución de reacción. Tras calentar la mezcla a 94°C durante 5 minutos, se llevaron a cabo 2 ciclos de reacción (94°C, 2 minutos; 55°C, 2 minutos, y 72°C, 2 minutos) para ensamblar y alargar cada uno de los oligonucleótidos sintéticos de ADN. A continuación, se añadieron un cebador que se hibridaba con el extremo 5'-terminal y un cebador que se hibridaba con el extremo 3'-terminal del gen de anticuerpo (10 j M, 1 j l cada uno) y se amplificaron los genes de región variable de anticuerpo mediante 35 ciclos de reacción (94°C, 30 s; 55°C, 30 s, y 72°C, 1 minuto) y una reacción de 5 minutos a 75°C. Tras la PCR, la solución de reacción globalmente se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos amplificados del tamaño esperado (aproximadamente 400 pb) se purificaron con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 jl). Los fragmentos se clonaron utilizando el sistema de vector pGEM-T Easy (Promega) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN utilizando el kit de secuenciación cíclica BigDye Terminator (Applied Biosystems) en un secuenciador de ADN ABI PRISM 3700 DNA (Applied Biosystems) según el método descrito en el manual de instrucciones adjunto.

Tras digerir con XhoI y Sfil un plásmido que se había confirmado que comprendía la secuencia génica correcta de la región variable de anticuerpo humanizado, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado (aproximadamente 400 pb) se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto y se eluyeron con agua estéril (30 jl). Además, tras digerir con XhoI y SfiI los plásmidos de expresión de tipo inducible con tetraciclina (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) y los plásmidos de expresión de tipo inducible con análogos de ecdisona (pIND-g4H, pIND-g4L) preparados en el ejemplo 3.4, se purificaron fragmentos que comprendían la región constante de anticuerpo (aproximadamente 5 kb) utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto, y se eluyeron con agua estéril (30 jl). El fragmento génico del anticuerpo XB12 humanizado (región variable de cadena H (en adelante V^h) o la región variable de cadena L (en adelante V^l)) digerido con XhoI y SfiI, y el plásmido de expresión de tipo inducible por tetraciclina (pcDNA4-g4H, pcDNA4-g4L) digerido con XhoI y SfiI, se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit de ligación rápida de ADN (Roche Diagnostics) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Además, el fragmento génico del anticuerpo SB04 humanizado digerido con XhoI y SfiI (región variable de cadena H o región variable de cadena L) y el plásmido de expresión de tipo inducible por análogos de ecdisona digerido con XhoI y SfiI (pIND-g4H, pIND-g4L) se sometieron a una reacción de ligación utilizando el kit de ligación rápida de a Dn (Roche Diagnostics) mediante el método descrito en el manual de instrucciones adjunto. Se utilizó una parte de cada mezcla de reacción para transformar la cepa E. coli DH5a (TOYOBO).

16.3 Preparación de anticuerpo biespecífico humanizado

Los genes se transfectaron y expresaron en HEK293H mediante los métodos descritos en los ejemplos 4.2 y 4.3, utilizando cuatro tipos de vectores de expresión de anticuerpo humanizado, así como pcDNA6/TR y pVgRXR. Además, se llevaron a cabo la purificación y cuantificación de la concentración de anticuerpos mediante los métodos presentados en los ejemplos 8 y 5.

16.4 Evaluación de la actividad del anticuerpo biespecífico humanizado y modificación de la secuencia del anticuerpo

Para evaluar la capacidad de coagulación plasmática de los anticuerpos biespecíficos humanizados preparados de esta manera y del anticuerpo biespecífico quimérico XB12/SB04, se examinaron los efectos de los anticuerpos sobre el APTT utilizando plasma deficiente en F.VIII. Los aminoácidos de la FR del anticuerpo humano se modificaron para incrementar las actividades de los anticuerpos biespecíficos humanizados cuya capacidad de coagulación sanguínea se había reducido. Además, se sustituyeron los residuos cisteína en la c DR3 de la V^h del anticuerpo XB12 por alaninas respecto a la posible caída de su termoestabilidad. Concretamente, se introdujeron mutaciones en el vector de expresión de anticuerpo humanizado utilizando el kit de mutagénesis sitio-dirigida QuikChange (Stratagene) mediante el método descrito en el manual de

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Método para obtener anticuerpos de tipo IgG biespecíficos que sustituyen funcionalmente al factor VIN/VNIa, que comprende las etapas de:

- inmunizar un animal no humano con F.IXa para obtener un anticuerpo anti-F.IXa;

- inmunizar un animal no humano con F.X para obtener un anticuerpo anti-F.X;

- producir un anticuerpo biespecífico que comprende las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.IXa y las regiones variables de cadena H y L de anticuerpo anti-F.X, en el que la región CH3 de una cadena H del anticuerpo biespecífico comprende por lo menos una sustitución de aminoácido para obtener un anticuerpo IgG que presenta una combinación heteróloga de cadenas H; y

- seleccionar los anticuerpos con una actividad que sustituye a la función de F.VNI/F.VNIa.

2. Método según la reivindicación 1, en el que los anticuerpos que presentan una actividad que sustituye a la función de F.VNI/F.VNIa se seleccionan en un sistema de reacción que comprende F.IXa y F.X y la selección se realiza utilizando la elevación de la actividad de F.IXa como un índice, en el que la elevación de la actividad de F.IXa es un resultado de la actividad de anticuerpo.

3. Método según la reivindicación 2, en el que el sistema de reacción comprende F.XIa, F.IX, F.X, un sustrato sintético S-2222 para F.Xa, y fosfolípido.

4. Método según la reivindicación 1, en el que los anticuerpos que presentan una actividad que sustituye a la función de F.VNI/F.VNIa se seleccionan en un sistema para medir o simular las funciones biológicas en las que F.IXa, F.X y F.VIII/F.VIIIa están implicados, y la selección se realiza utilizando la actividad de la recuperación funcional como un índice, en el que la actividad de la recuperación funcional es un resultado de la adición de anticuerpo en ausencia de F.VIII/F.VIIIa.

5. Método según la reivindicación 4, en el que el sistema para medir o simular las funciones biológicas es un sistema para medir la coagulación de plasma.

6. Método según la reivindicación 5, en el que se mide la capacidad de restaurar la coagulación en un sistema de ensayo de tiempo de coagulación que utiliza plasma deficiente en F.VIII humano.

7. Método según la reivindicación 6, en el que los anticuerpos biespecíficos seleccionados presentan la capacidad de reducir el tiempo de coagulación en 10 segundos o más.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo biespecífico comprende (a) una secuencia de la CDR3 de la cadena H de anticuerpo anti-F.IXa seleccionada de entre las (a1) o (a2) siguientes, y

(b) una secuencia de la CDR3 de la cadena H de anticuerpo anti-F.X seleccionada de entre las (b1) a (b9) siguientes:

(a1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 16

(a2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 20

(b1) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 24

(b2) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 28

(b3) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 32

(b4) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 36

(b5) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 40

(b6) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 44

(b7) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 48

(b8) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 52

(b9) secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena H descrita en SEC ID n° 56.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho anticuerpo biespecífico comprende (a) las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena H de anticuerpo anti-F.IXa seleccionadas de entre las (a1) o (a2) siguientes, y

(b) las secuencias de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena H de anticuerpo anti-F.X seleccionadas de entre las (b1) a (b9) siguientes:

(a1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 14, 15 y 16, respectivamente;

(a2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 18, 19 y 20, respectivamente;

(b1) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 22, 23 y 24, respectivamente;

(b2) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 26, 27 y 28, respectivamente;

(b3) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 30, 31 y 32, respectivamente;

(b4) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 34, 35 y 36, respectivamente;

(b5) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 38, 39 y 40, respectivamente;

(b6) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 42, 43 y 44, respectivamente;

(b7) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 46, 47 y 48, respectivamente;

(b8) secuencias de aminoácidos de las CDR 1, 2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 50, 51 y 52, respectivamente;

(b9) secuencias de aminoácidos de las CDR 1,2 y 3 de la cadena H descritas en SEC ID n° 54, 55 y 56, respectivamente.