TWI302942B - Bacillus sp.d747 strain, agent for controlling plant diseases and agent for controlling pests using the same, and controlling method using the same - Google Patents

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1302942 玖、發明說明 (發明說明應敘明：發明所屬之技術領域、先前技術、內容、實施方式及圖式簡單說明) (一） 發明所屬之技術領域 本發明係關於桿囷D747菌株（Ac/Z/i/ssp. D747)及其 應用，更詳細地說，係關於含有具植物病害的發病抑制效果 及害蟲防除效果的桿菌D747菌株爲有效菌之植物病害防除 劑及/或害蟲防除劑，及使用這些防除劑之防除方法。 (二） 先前技術 植物病害及蟲害的防除法，例如利用輪作和太陽熱之耕種 或物理防治、使用化學農藥之化學防治、使用病害抵抗性品 種之防治、使對弱毒病毒和病原菌用拮抗微生物之生物防治 等。其中，化學農藥特別是有機合成殺菌劑的開發硏究近年 來相當發達，逐漸開發出多種效力高且具有各種作用的藥劑 ，亦開發出各種施用法。使用這些藥劑的化學防除法對植物 的病害防除及防除作業的省力化有很大的貢獻，相當普及。 惟，近年出現所謂的藥劑耐性菌，部分作物、病害出現化學 防除法的防除效果低落之現象，造成問題。又，隨著作物的 指定產地化持續連作的結果，化學農藥亦難防除的土壤傳染 性病害的發生在各地形成嚴重的問題。又，大量且不斷地重 複使用化學農藥的方法，因在環境中釋出不存在於自然界的 化學物質，對動植物有直接毒性的藥劑和無直接毒性的藥劑 對環境將造成不良的影響。 如上述般，使用化學農藥的病害防除可能因耐性菌的出現 -6 - 1302942 使防除效果低落，彼時則必須開發新型殺菌劑。又，對於化 學農藥亦難防除的病害防除，必須採取代替的方法或其他倂 用的方法。又，期望開發對環境安全性更高的防除技術。 近年，基於這樣的背景，改正偏於使用化學藥劑的防除方 法，提議使用對環境的安全性高的微生物之生物防除（亦即 生物農藥）方法，其中一部份已實用化。 作爲植物病害的生物防除相關的硏究，已嘗試例如弱毒病 毒的利用、病原菌的弱病原性或非病原性系統微生物的利用 、拮抗微生物的利用等。其中，大多爲利用拮抗微生物相關 的硏究案例，又，有多數的報告係相關於使用拮抗微生物中 的桿菌屬菌的病害防除硏究，惟尙未發現具有較廣的病害防 除範圍之桿菌屬菌。 (三）發明內容 本發明的課題係分離出一種具有抑制多種植物病害的發 病及/又防除害蟲的效果之新型菌株。 本發明的另一課題係提供一種含有上述菌株爲有效菌，可 有效地使用爲生物農藥之植物病害防除劑及/或害蟲防除劑 〇 又，本發明的另一課題係提供一種使用上述植物病害防除 劑及/或害蟲防除劑之植物病害及/或害蟲的防除方法。 本發明者們從自然界分離出一種屬於桿菌屬的新菌株，對 植物體的成長無不良影響，並發現具有抑制數種植物病害發 病的效果及防除害蟲的效果，而完成本發明。 本發明係相關於下列的菌株及植物病害防除劑及/或害蟲 一 7- 1302942 防除劑，並植物病害防除及/或害蟲防除方法。 (1 ) 桿菌D7 47菌株。 (2 ) —種植物病害防除劑，其特徵係含有桿菌D747菌株爲 有效菌。 (3) —種害蟲防除劑，其特徵係含有桿菌D747菌株爲有 效菌。 (4 )——種植物病害及/或害蟲之防除方法，其特徵係使用 上述（2 )的植物病害防除劑及/或上述（3 )的害蟲 防除劑。 [桿菌D747菌株的單離和寄存] 本發明的桿菌D747菌株係從靜岡縣小笠郡菊川町的空氣 中分離出的菌株。這些菌株依據後述的細菌學性質，參考柏 格氏細菌分類手冊（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology),第1冊（1984)進行鑑定，係一種屬於桿 菌屬的新菌株，最初認爲係屬於蠟狀芽孢桿菌，於2000年 (平成 12 年）11 月 28 日，以「Bacillus cereus D747」 之名寄存在工業技術院生命工學工業技術硏究所（Agency of Industrial Science and Technology , National Institute of Bioscience and Human-Technology ) 0 惟，日後懷疑是否屬於蠟狀芽孢桿菌，經過詳細硏究，因 只能確認至屬於桿菌屬，於2002年（平成14年）4月1日 提出變更爲sp. D747」之申請。 因此，本發明的桿菌D7 47菌株（簡稱爲「D7 47菌株」） 在獨立行政法人產業技術綜合硏究所，以「sp 一 8 - 1302942 D747」（FERM P-18128)之名寄存，2002年（平成14年） 1 1月8日轉移至國際寄存，亦在特許生物寄存中心以「 sp· D747」（FERM BP- 8234 )之名寄存。 [D747菌株的細菌學性質] 本發明的D747株的細菌學性質如下所示。又，細菌學性 質的試驗係依據前述柏格氏細菌分類手冊（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)爲基礎而進行。 (A )形態學的性質 形態：桿菌 大小：寬1.0〜1.2/zm，長度3〜5//m 運動性：+ 鞭毛的附生狀態：周鞭毛 內生孢子：+ 孢子的位置：中央 孢子的膨脹：一 (B )培養的性質 菌落顏色：白色〜淡褐色 肉汁瓊膠平板培養：形成白色〜乳白色的菌落，表面呈皺 紋狀 (C )生理學的性質 革蘭氏染色性：+ 硝酸鹽的還原：+ MR試驗：一 VP試驗：+ -9- 1302942 吲哚的生成：一 澱粉的水解·_ + 檸檬酸的資源化性：+ 無機氮源：+ 氧化酶：一 羧化酶：+ 生長pH 6,8、肉萃取物培養基 生長pH 5.7、肉萃取物培養基 生長溫度 3 0 °C : + 生長溫度 5 0 °C :— 生長氯化鈉濃度 2 % : + 生長氯化鈉濃度 5% : + 生長氯化鈉濃度 7% ： + 好氣性生長：+ 厭氣性生長：一 0 - F試驗：〇 卵黃反應：一 由葡萄糖生成酸：+ 由甘露糖醇生成酸：-由L -阿拉伯糖生成酸：一 由D -木糖生成酸：一 由葡萄糖生成氣體：--半乳糖苷酶：一 氯化鈉及氯化鉀的需求性：- -10- 1302942 [D747菌株的培養] 本發明的D747菌株的培養方法中，培養基的種類及培養 條件等可選擇任一適用者。例如肉萃取物培養基等一般的培 養基之外，尙有含葡萄糖、腴、酵母萃取物等的培養基。又 ’除了液體培養基之外，亦可使用添加瓊膠的斜面培養基及 平板培養基等固體培養基。經由培養使D747菌株增殖，可 達期望的菌體量。 可使用上述菌株可同化者作爲培養基的碳來源。具體而言 ，例如除了葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽萃 取物、澱粉水解物等的糖之外，尙有D7 47菌株可利用的各 種合成或天然碳來源等。 培養基的氮來源，同樣地除了腺、肉萃取物、酵母萃取物 等含有有機氮者之外，亦可使用此菌株可利用的各種合成或 天然物。 依據微生物培養的常法，可依需求添加食鹽、磷酸鹽等無 機鹽類、鈣、鎂、鐵等金屬鹽類、維生素、胺基酸等微量營 養源。 可在振盪培養、通氣培養等好氣的條件下進行培養。培養 溫度爲20〜30 °C，較理想者爲25〜30C ’ pH爲5〜8，以6〜7 較佳，培養時間爲1〜4日，以2〜3日較適當。 使本發明的桿菌D7 47菌株之培養物（包含菌體）或其處 理物（培養物和其他成分的混合物等），又培養分離菌體（ 已離心分離處理培養物的菌體或其清洗菌體等）或其處理物 (培養分離菌體和其他成分的混合物等），以及這些的處理 -11- 1302942 物（這些的固體或液體稀釋物等）存在於根、莖、葉、種子 等植物體上，或其栽培土壤中，桿菌D7 47菌株具有抑止各 種植物病害並防除害蟲的性質。 本發明的D7 47菌株依施用形態，可防除由屬於卵菌綱（ )、子囊菌綱（)、擔子菌綱（ α )、及不完全菌綱（i ero/z/yce ί μ )之菌 類及細菌類引起的植物病害。 D747菌株可防除的病原菌具體而言，霜霉病 屬菌，例如黃瓜霜霉病菌 (尸S e Wo;? e r 〇/? 〇 *9ρ 〇 r a c i/6 em· s )、黑星病（Ke/7 i i/r / 5 )屬菌 ，例如蘋果黑星病菌（、白粉病（ h；7A e )屬菌，例如小麥白粉病菌（五r j/y /pA e gr a/ /7 i· s )、瘡病（屬菌，例如稻瘡病菌（ o/yzM)、灰霉病（方oiryi/s)屬菌，例如黃瓜灰霉病菌（ c//7erea)、立枯病屬菌，例如 稻苗立枯病菌（Ai? y Ζ 0 C ί C>77 / 5 S 0 / 5 77 i·)、葉銹病（Pi/ C C / ；? / 5 )屬菌，例如小麥葉銹病菌（Pi/C c i n i a recondita^) 、 M 病（SMiO/ia)屬菌，例如小麥穎枯病菌（心;㈣心/謂 )、核盤病（屬菌，例如核盤病菌（ κ/eroi/orz/zz;)、猝倒病（Pyih㈣）屬菌，例如黃瓜苗猝 倒病菌（八Κ ί A /㈣心Z?a rρ/7⑽s w )，又，細菌有立枯細 菌病（)，例如稻苗立枯細菌病（ W μ Uh/)等，惟本發明不受限於這些例子。 又’本發明的D747菌株可防除半翅目害蟲、鱗翅目害蟲 1302942 '鞘翅目害蟲、雙翅目害蟲、直翅目害蟲、白蟻目害蟲、薊 馬目害蟲、紅蜘蛛害蟲等害蟲。 D7 47菌株可防除的害蟲具體而言有半翅目害蟲，例如豆 椿象（等椿象類（異翅類；HETER0PTERA )、黑尾葉蟬等葉蟬類、稻褐 飛風等飛虱類、木風屬等木風類、 棉粉風（5e/z;/ s / 5 ί 5 Z?5 cy )等粉風類、桃虫牙（ζμ pem’cae )等极蟲類、康式粉阶等粉阶 類、鱗翅目害蟲例如綠刺蛾（万⑽0/2 a /7 / /^ )等葉蛾類 、葡萄細葉蛾（五///沒57Z7Wf i/e/h )等細葉蛾類、蓑 蛾屬等蓑蛾類、穀蛾（別/2 等蛾類、柑 橘潛葉蛾（cy we/h)等潛葉蛾類、菜蛾（ Plutella xylostella)等嫩辕、二 i匕歡 i Chilo suppressalis )等螟類、菸夜蛾（心//〇Mh 等夜蛾類、鞘 翅目害蟲例如大綠金龜子（c叩/^)等金龜蟲類、 馬鈴薯瓢蟲（办/ / Fij//7 “ 0 C〖〇pi/；7 C ί a U )等瓢蟲類 、美洲象蟲（等象蟲類、雙翅 目害蟲例如尖音庫蚊（)、中華瘧蚊（ Anopheles sinensis )、五帶淡色庫蚊（CWez i / / i ^ e/7 / 〇 ri?y/7 cA i/ ^ )、直翅目害蟲例如德國蜚鐮（a纟e / / 5 、白蟻目害蟲例如蕃節白蟻（7?以7(^///^///7^ 、萷馬目害蟲例如茶黃萷馬 心ru/ys)、紅蝴蛛類例如棉紅购I蛛（uri/cae )，又，其他有害動物、不良動物、衛生害蟲、寄生蟲，例 - 13- 1302942 如福壽螺（户⑽ 、蝓虫舌（π. )等腹足綱類（6^W/o；7(9心）、鼠婦 )等腳目類等，惟本發明不受限於這些例子。 [植物病害防除劑及害蟲防除劑] 本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑，係含有可防治上 述植物病害和害蟲的D747菌株爲有效菌。本發明的植物病 害防除劑及害蟲防除劑中，可以只使用D 7 4 7菌株，亦可同 時使用D747菌株和D7 47菌株的變異體。變異體具有上述 D747菌株的細菌學特性，且具有植物病害防除作用及害蟲 防除作用，自然突變株係使用紫外線和化學變異劑的突變株 ，亦可使用細胞融合株及基因組合株。本發明的植物病害防 除劑及害蟲防除劑中的D747菌株包含D747菌株的變異體。 本詳細說明書中「防除」不僅指病害和蟲害的預防、避免 ’亦含有去除、殺滅之意思。因此，即使是已經感染病原菌 的植物’亦可藉著使用本發明的植物病害防除劑從植物體去 除病原菌，可防止因病原菌引起的病害並抑制病害惡化。 本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑中，使用活菌的 D747菌株時，以1〇5〜1〇 1{)個/ ml的濃度添加在植物體較理想 〇 又’使用D747菌株的培養物時，其適用時期及適用量以 上述使用活菌時爲基準，適當地選擇即可。 本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑中的D747菌株， 除了單獨使用菌體或培養物，亦可利用惰性的液體或固體的 載體稀釋，依需求添加界面活性劑、其他的補助劑等藥劑而 一 1 4 一 1302942 使用。具體的製劑例，例如粒劑、粉劑、可濕性粉劑、懸浮 製劑、乳劑等劑型。較理想的載體例如滑石、皂土、陶土、 咼嶺土、砂藻土、白碳黑、輕石、熟石灰、砂砂、硫酸錢、 尿素、多孔質的固體載體、水、異丙醇、二甲苯、環己烷、 甲萘、烷二醇等液體載體等。界面活性劑及分散劑，例如聯 萘甲磺酸鹽、醇硫酸酯鹽、烷芳基磺酸鹽、木質素磺酸鹽、 聚環氧乙二醇醚、聚環氧乙烷烷芳基醚、聚環氧乙烷山梨糖 醇單烷基化物等。補助劑例如羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙 二醇、阿拉伯膠、咕噸膠等，保護劑例如脫脂奶粉、pH緩 衝劑等。此時，D747菌株的活菌體的量及/或其培養物的量 ，又，適用時期及適用量，可依據上述使用活菌時爲基準適 當地選擇。 又，本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑中的有效成分 可依需求含有殺蟲劑、鋤草劑、植物生長調節劑、肥料等其 他成分。又，本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑，除了 D747菌株外亦可同時含有其他種類的菌株。 本發明的植物病害防除劑及害蟲防除劑可直接使用或以 水稀釋後使用。植物病害防除劑及害蟲防除劑的使用方法無 特別的限制，例如直接散佈在植物和害蟲的方法、散佈在土 壤的方法、添加在植物和土壤灌溉用的水和肥料的方法等。 其他，製劑的用量依對象病害、對象害蟲、對象作物、使用 方法、發生傾向、被害程度、環境條件、使用劑型等而變化 ，作適當的調整較理想。 如上所述，本發明的桿菌sp.) D747菌株具 1302942 有較廣的病害及害蟲防除範圍，可防除多種的植物病害和害 蟲。 含有本發明D747菌株的本發明植物病害防除劑及害蟲防 除劑，因可防除植物病害和害蟲，故可作爲生物農藥使用。 因此，本發明的植物病害及害蟲防除劑對環境的安全性高， 又對多種病害和害蟲具有防除效果，即使不倂用其他方法亦 可防止廣泛的病害和害蟲。 (四）實施方式 【進行發明的最佳形態】 以下列的實例具體地說明本發明，惟本發明不受限於這些 實例。 實例1 : D747菌株的培養 從靜岡縣小笠郡菊川町的空氣中分離出D747菌株。亦即 ，爲要分離靜岡縣小笠郡菊川町加茂的空氣中漂浮的微生物 ’取下含有馬鈴馨-右旋糖壤膠培養基的平板培養基的蓋子 ，放置在空氣中10分鐘與空氣接觸。此培養基在以它下培 養3日，分離其中形成的菌落。將分離的菌落置於馬鈴薯— 右旋糖液體培養基中進行震盪培養，找出對植物病害菌有效 果的菌株，分離出D747菌株。 將分離出的D 7 4 7菌株置於含1 %葡萄糖、2 %可溶性丨殿粉 、0.5%聚腴、1%乾燥酵母、1%脫脂大豆、ο·〗％磷酸鉀、 0.2%氯化鈉、0.3%碳酸鈣，pH6.〇的培養基，在m、 1 2 0 ]： p m的條件下震盪培養3日後’進行離心集菌（，〇 〇 〇 χ g，1 5分鐘），懸浮在滅菌水中，清洗培養基成分。進行 一 1 6 - 1302942 此操作2次，再度懸浮在滅菌水中使濃度約爲1 〇9 / m 1。 實例2 :稻瘟病的防除效果試驗 在各個直徑7 . 5 cm的素燒盆中，分別播種1 〇粒稻種子（ 品種：愛知旭），在溫室內栽培。將實例1製得的D7 47菌 株懸浮液散佈在長出第4葉的稻苗，每盆約1 〇m 1。風乾後 ，噴霧接種稻瘟病菌（Λκ/ / c / a / / a a /yza e )的孢子懸浮液 ，在溫室內管理。接種5日後調查第4葉的病斑數，以此爲 發病度依據上述表1的基準進行評估。試驗結果示於表2。 表1 評估 A 不發病 B 無處理的發病度小於20% C 無處理的發病度大於20%小於50% D 無處理的發病度大於50% 實例3 :稻苗立枯病的防除效果試驗 在各個直徑6 · Ocm的素燒盆中，分別播種1〇粒稻種子（ 品種：金南風），在溫室內栽培。將實例1製得的D747菌 株懸浮液散佈在2〜3葉期的稻苗，每盆約l〇ml。風乾後， 接種稻苗立枯病菌（射r/s)，在溫室 內管理。接種5日後調查病斑數，以此爲發病度依據上述表 1的基準進行評估。試驗結果如表2所示。 實例4 : 小麥穎枯病的防除效果試驗 在各個直徑6 · Ocm的塑膠盆中，分別播種10粒小麥種子 (品種：農林6 1號），在溫室內栽培。將實例1製得的D7 4 7 -17- 1302942 菌株懸浮液散佈在長出第2葉的小麥苗，每盆約1 〇m 1 乾後，接種小麥穎枯病菌（S e ρ ί 〇 h λ 〇 ^ 〇 r㈣）的柄孢 在溫室內管理。接種1 0日後調查每一盆的第1葉的發 積，以此爲發病度依據上述表1的基準進行評估。試驗 如表2所示。 實例5 : 小麥白粉病的防除效果試驗 在各個直徑6.0 cm的塑膠盆中，分別播種10粒小麥 (品種：農林6 1號），在溫室內栽培。將實例1製得的 菌株懸浮液散佈在1.5〜2葉期的小麥苗，每盆約10ml 乾後，接種小麥白粉病菌（五g的分 子，直到調查前置於溫室內的架子上，在溫室內管理。 1 0日後調查每一盆的第1葉的發病面積，以此爲發病 據上述表1的基準進行評估。試驗結果如表2所示。 實例6 :黃瓜灰霉病的防除效果試驗 在各個直徑6.0cm的塑膠盆中，分別播種4粒黃瓜種 品種：相模半白），在溫室內栽培。將實例1製得的 菌株懸浮液散佈在長出子葉的黃瓜幼苗，每盆約1 〇m 1 乾後，將已浸漬黃瓜灰霉病菌（& ί/Μ h 的 懸浮液的多層圓紙置床接種在黃瓜子葉表面，在20 °C 室內管理。接種3日後調查子葉的發病面積，以此爲發 依據上述表1的基準進行評估。試驗結果如表2所示£ 實例7 :黃瓜霜霉病的防除效果試驗 在各個直徑6 . 0cm的塑膠盆中，分別播種4粒黃瓜g 品種：相模半白），在溫室內栽培。將實例1製得的 。風 子， 病面 結果 種子 D747 。風 生孢 接種 度依 :子（ D747 。風 孢子 的濕 病度 ) I子（ D747 -18- 1302942 菌株懸浮液散佈在長出子葉的黃瓜幼苗，每盆約1 0m 1。風 乾後，噴霧接種黃瓜霜霉病菌dope/* 0/2 05^0/5 的遊走子囊懸浮液，放置在22°C的濕室內24小 時後，在溫室內管理。接種8日後調查子葉的發病面積，以 此爲發病度依據上述表1的基準進行評估。試驗結果如表2 所示。 表2

實例號碼 試驗病害 使用D747菌株的防除效果 2 稻瘟病 A 3 稻苗立枯病 A 4 小麥穎枯病 A 5 小麥白粉病 A 6 黃瓜灰霉病 A 7 黃瓜霜霉病 A 實例8 : 美洲象蟲的殺蟲試驗 將實例1中製得的D747菌株懸浮液30ml放入容量60ml 的塑膠杯，使3片長3 cm的稻葉片浮於其上。放入1 〇隻美 洲象蟲（Z i· s μ rA叩i r ^ ο /yzopA 成蟲後’盖上蓋子 放置在25 °C的恆溫室。3日後計算生存蟲數。進行3次試驗 ，依據下述式（1)求出死蟲率，最終的死蟲率係由3次的 平均値算出。試驗結果如表3所示。 死蟲率（％ ) = {[10_ (生存蟲數）]/10}xl00 表 3___ _ 最終的死蟲率^ ) - 19- 1302942 以D747菌株處理 100 無處理 0 從上述表2及表3的結果可知，將含有本發明D7 47菌株 的植物病害防除劑及害蟲防除劑散佈在植物體上，可使此植 物對各種植物病及害蟲具有高的防除效果。 【應用在產業上的可能性】 本發明發現具有特色的新菌株一桿菌D747( FERM BP- 8234 )，使桿菌D747的培養物（包含活菌體）或其培養分離活 菌體存在於根、莖、葉、種子等植物體上或其栽培土壤中， 藉此，可抑制非常廣範圍的各種植物病害的發生，可防除害 蟲，而且噴灑含有本發明D747菌株的植物病害防除劑及害 蟲防除劑之植物，對各種植物病及害蟲具有高的防除效果。

Claims (1)

1302942 第9 1 1 340 1 6號「桿囷D747菌株，使用它之植物病害防除劑 . 及害蟲防除劑，及使用它之防除方法」專利案 ， (2008年6月11日修正） ‘ 拾、申請專利範爵> · 1· 一種桿菌D747菌株（sp.D747)，其微生物寄存 編號爲BCRC910213號。 2 . —種植物病害防除劑，其包含桿菌D747菌株爲有效菌， 其微生物寄存編號爲BCRC910213號。 ^ 3. —種害蟲防除劑，其包含桿菌D7 47菌株爲有效菌，其微 生物寄存編號爲BCRC910213號。 4 . 一種植物病害及/或害蟲之防除方法，其包含使用如申請 專利第2項之植物病害防除劑及/或如申請專利第3項之 害蟲防除劑。