TWI282279B - A61p 37/04 200601 a i vhtw a61p 17/16 200601 a i vhtw - Google Patents
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Description
1282279 玖、發明說明 [發明所屬之技術領域] 本發明係關於一種含有/3 -葡聚糖之組成物,該組成物 係以含有冷-1,3-1,6-葡聚糖之屬於擔子菌屬 (Aureobasidium)^:菌培養物及乳酸菌菌體作為有效成分, 及利用該組成物之便秘改善劑、免疫賦活劑及皮膚用保濕 劑。 本件有關之微生物寄存如下: 國外寄存:2004/02/10, FERM BP-08615 國内寄存:2004/05/21, BCRC 930069 [先前技術] 屬於擔子菌屬(Aureobasidium sp·)之菌(通稱黑酵母) 所產生之/3-1,3-1,6-葡聚糖,已知具有免疫增強作用、抗 腫瘤活性、癌細胞增殖抑制作用、抗過敏作用、抗炎症作 用、膽固醇降低作用、抗血栓作用、食物纖維作用、血壓 降低作用、血糖降低作用、肝功能亢進等各種生理活性。 因此,已有多種嘗試利用/5-1,3-1,6_葡聚糖作為機能性材 料或醫藥品。 例如,日本專利特開昭57-1493〇1號公報中揭示一種 屬於不兀王菌黑菌科擔子菌屬(Aureobasidium^之菌(微工 研可存、’扁號4257號)所產生之多醣為主成分之整腸劑及复 他醫藥。 〃 曰本專利特公平5_4〇63號公報中揭示一種果寡醣及 万葡聚糖為主成分之飲食品之製造方法,該飲食 6 315590修正本 1282279 叩可利用於健康維持飲料(腸内雙歧桿菌(bmdus、的增 殖、防止便秘、增強免疫)、整腸劑等。 曰本專利特開2002-335926號公報中揭示一種含有万 •HU-葡聚糖及蘋果萃取物之組成物,該組成物有用於 作為飲料或皮膚塗布劑,而純料期待具有各種過敏症狀 一、、低放果(疫異常疾患之改善效果、癌抑制效果、血 :障礙疾患之改善效果、病毒性疾患之改善效果、泌尿器 "、統疾患之改善效果、便秘、下痢消化器官系統疾患之 本專利特開平6-34〇7〇1號公報中揭示由出芽短梗 =(^mMli^U^llulans) IF〇4466菌株之培養上清液所 得之,以β-1,3鍵結之葡萄糖殘基作為主鏈,且於其中以 /5 -1’6鍵結之㈣糖殘基之分歧鏈作為多數側鏈,具 =均分子量為i萬至500萬之高分歧度之^葡聚糖,且 有、、、至口之面抗腫瘤活性及免疫賦活活性, 藥、食品添加物、飼料添加物等。 、〜、醫 揭示以 β ,可應用作 日本專利特開2002-204687號公報中 ―1,3-1,6葡聚糖作為主成分之擔子菌屬培養液 為對各種疾病之醫藥品。 +寻利特開 能θ 3 t < ·〜,柙不含有鍵結 心A -H1,心葡聚糖之化妝品等之添加劑。 Ο Λ ^ Λ …囚此,揭示 ’ ,6 —葡聚糖之水溶液而直接塗布於古_ 相較於羽土 叩Κ皮膚或毛髮時 相較於自知之化妝料、整髮料、軟膏添加材且 的皮膚或毛髮面的皮膜形成性及保濕性。 八良 315590修正本 7 1282279 日本專利特開平1()_31()515號公報中揭示含有由微生 物所生產之至少一種細胞外同多醣 (homopolysaccharide),及該細胞外同多醣與至少一種胺芙 酸之沐浴劑。因此,前述細胞外同多醣之構成糖為万 葡萄糖,前述/3 _D-葡萄糖為屬於擔子菌屬之微生物所生 產之-1,3 _ 1,6 -葡聚糖。 另一方面,利用乳酸菌作為免疫賦活劑,例如日本專 利特開2001-48796號公報中揭示以糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)AD 1 0 1菌株之死菌體作為主成分之 免疫調整劑。 再者,日本專利特開2〇〇3_113114號公報中揭示,由 屬於腸球菌屬(Enterococcus)^乳酸菌及麴菌之液體培養 之培養菌體’作為有效成分之免疫賦活材料。 此外,將点_葡聚糖及乳酸菌併用者,例如,日本專利 特開2003-40785號公報中揭示,將含有万_葡聚糖之材 料,與乳酸菌生產之加熱處理菌體,作為有效成分之感染 抑制組成物。 又’曰本專利特開2〇〇1-323001號公報中揭示一種低 分子量之水溶性yS _葡聚糖,該冷_葡聚糖能促進體内如 TNF之細胞激素(cyt〇kine)之產生、增強該等之作用、增強 抗體產生能力或全體免疫作用從而有助於各種感染症或腫 瘤發生的預防,並揭示該石_葡聚糖與乳酸菌併用。 然而,屬於擔子菌屬^Aureobasidium sp.)之菌(通稱為 黑黴菌)所產生之/5-1,3-1,6-葡聚糖單獨而言,尚無法具有 8 315590修正本 1282279 足夠之上述各種的生理活性效果,因此仍需要更高效果的 材料。 [發明内容] 本發明之目的係提供一種含有点_葡聚糖之組成物,其 係將屬於擔子菌屬(Aureobasidium)之菌的培養物所含冷 -1,3-1,6·葡聚糖之生理活性效果進一步提高者,及利用該 組成物之便秘改善劑、免疫賦活劑及皮膚用保濕劑。 為達成上述目的,本發明之一含有培養屬於擔子菌 (Aureobacicium邛·)之菌所得之含有万_ i,3_ i,6_葡聚糖之 培養物與乳酸菌菌體作為有效成分為特徵之含有石_葡聚 糖之組成物。 本卷月之έ有万-葡聚糖之組成物,因含有培養屬於擔 子菌(AiLreobacicium sp.)之菌所得之含有万_丨,3_丨,6_葡聚 糖之培養物作為有效成分,因此不僅是石葡聚 糖,其他含於培養物中之各種有用成分也能無損害地加以 利用又,3有礼酸菌菌體作為有效成分時,由於含於前 述培養物之有用成分與乳酸㈣體之增效作用(啊响以 effect) ’可期待各種生理活性效果。此外,將前述各種成 分利用於飲食品等時,由於是來自天然物之成&,故安全 性高。 #上述發明中,前述屬於擔子菌屬(Aure〇basjdh]m sp ) 之园較佳為出芽短梗黴(版reQbasj[dium pulh】lang )(FERM BP-G8 615)。依照該等方式能簡單地製備生理 活性高的万-1,3-1,6-葡聚糖。 315590修正本 9 1282279 再者固形物車父佳含有前述培養物(以沒_i,3-1,6-葡聚 糖计异)1至80質量%,且較佳含有前述乳酸菌菌體4至 95質量%。 此外 前述乳酸菌較佳為糞腸球菌(Enterococcus 依照該等方式,能期待mi,6-葡聚糖與乳酸菌菌 體具有增效作用(synergistic effect)的生理活性效果。 此外,前述乳酸菌較佳為經加熱殺菌者。經加熱殺菌 =能廣泛地添加於必須經加熱處理之商品。再者,其保存 安定性高,使用作為飲食以醫藥品等之原料時,安全性 也非常高。 本發明之另一者為含有前述之含有^葡聚糖之組成 物作為有效成分之便秘改善劑。 本發明之便秘改善劑因含有上述含有葡聚糖之組 成物作為有效成分,由料屬於料 P丄之菌所付之3有万_葡聚糖之培養物中含有之各種有 用成分與乳酸菌菌體之增效作用, 改善效果。 m 寺具有優異之便秘 :發明之另-者為含有前述之含有r葡聚糖之組成 物為有效成分之免疫賦活劑。 :發明之免疫賦活劑,因含有上述含有"聚糖之組 成物作為有㈣分’由培養屬於擔子 :.Γ:所得之葡聚糖之組成物為有效成分培養 中3有之各種有用成分與乳酸菌菌體之増效作用,可期 315590修正本 10 1282279 待具有優異之免疫賦活效果。 葡聚糖之組成 本發明之另一者為含有前述之含有 物作為有效成分之皮膚用保濕劑。 、葡聚糖之 擔子菌屬 <培養物中 ’可提供優 本發明之皮膚用保濕劑因含有上述含有曰 組成物作為有效成分,由培養屬於 (Aur^obasidium sp〇^菌所得之含有/3 -葡聚糠 含有之各種有用成分與乳酸菌菌體之增效作用 異之保濕效果持續性及使用感之皮膚用保濕劑 [實施方式] ^本發明中,培養屬於擔子菌屬邛)之 菌所得之培養物(以下,單以培養物稱之)可使用培養屬於 擔么子菌屬(AlMasidium $Ρ·)且具有m i‘葡聚糖生 產能力之菌之培養液本身,該培養液之濃縮液,或由該培 養液去除水分之固形物等,但較佳係使用培養液本身或該 培養液之濃縮液,於該等情況下,固形物濃度較佳為 至5質量%,更佳為1至3質量%。 上述屬於擔子菌屬(Aureobasidium sp·)之菌,可使用 例如日本專利特開昭57-149301號公報、特公平5-4063號 公報、特開2002-335926號公報中所揭示之菌株,本發明 較佳係使用出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans Μ-1,寄 存於獨立行政法人產業技術總合研究所專利生物寄存中 心,寄存編號PERM ΒΡ-08615)。又,本發明之 葡聚糖係指具有葡萄糖yS -1,3-鍵結主鏈及-1,6鍵結之 葡萄糖為分歧之構造。 11 315590修正本 A282279 依昭==二菌屬之菌的培養可 進行。亦… 本專利特開昭57,贿號公報等) % P ’ :囷接種於添加有碳源(砂糖)0.5至5.0質量 見源0 · 1裊量〇/〇、及直他料旦 機類^ &矣甘 及/、他议里物質(例如維生素類、無 瑪-員)之培養基(ΡΗ5·2至6.〇),於加声μ ^ 養2至7日,鈥社丸 、酿度20至3(rc下通氣培 生成會使培養液黏度上升mV , 由此所得之谇幕、、广A古7成黏性-的膠狀。一般而言, 物中含有之:0·6至1,8質量%之固形物,該固形 了二t:,6-葡聚糖為5至80質量%。再者,除 ,3 -1,6 -葡聚糖以外,由於 之碟、鉀、鎂、維生素C等1他:S有助於該葡聚糖吸收 聚糖所1有之Jtr 成分,^1,3-1,6·葡 本广生理活性效果能更有效率地發揮。 本务明中使用之培養物, 糖之含量宜為…。/ -固形物中/5 -1’3-M·葡聚 為10二 …以上’較佳為5質量%以上,更佳 局 0貝Ϊ %以上,料祛盍? η供 .1 3^1 6 特佺為20質量%以上。培養物中Θ 理活性::聚糖濃度過低時,不能充分期待該葡聚糖之生 石-1,3-1,6_葡聚糖之中^ 行。亦g , 里可採用例如下述方法進 白酶等進;r ^ t Μ㈣歲粉酶、殿粉葡萄糖脊酶、蛋 葡聚糖,再進行乙醇沉殿。再以玻路闌(pullu1· 樣品。此_ ^, 再以玻璃膜過濾而製得高分子 淨。經二之^去除含單糖之低分子,以8。%乙醇充分洗 加水分解再以丙明洗淨,添加硫酸,進行 尺刀解後,中和,取濾液以葡萄糖氧化酶法 315590修正本 12 1282279 疋量葡萄糖,以下列數學式計算葡萄糖含量。 數學式U -葡聚糖(g/100g)=葡萄糖(g/i〇〇g)x 〇 9 再者万-1’3-1,6_β)聚糖之定量可依曰本專利特公平 W咖號公報所揭示之方法進行。亦即,於培養終了後干 將培養液殺菌,離心分離去除菌體後,將氯仿/丁醇混 以10%(v/v)添加至所得溶液後震盈(Sevage法),再以= 處理去除氯仿及不溶物。重複該操作2次後,以乙醇沉/ 回收沉澱物且溶解於蒸餾水中,以酵素處理分解普路蘭又, 再於蒸麻中進行透析,透析液以乙m回收沉搬物 (厶"*1,6-葡聚糖)而求回收量。 本發明中,上述所製得之培養液可使用直接加熱或加 壓加熱進行殺菌,亦可使用離心分離等去除菌體後殺菌。 再者,必要時可使用對應之濃縮物,或乾燥物。又,屬於 擔子菌屬(Aureobasidim邛.)之菌之培養物,使用作為增 黏安定劑等之食品添加物之安全性高。 另一方面,本發明所適用之乳酸菌,只要食品中能使 用之乳酸菌皆可,並無特別限制,具體而言,可例舉如腸 糞球菌(Enterococcus , faecalis)、腸球菌(Enterococcus ~ec^um)、嗜酸乳桿囷(Lactobacillus acidophilus)、酿酸乳 桿菌(Lactobacillus casei)、乳酪鏈球菌(Streptococcic crenroris.)、乳酸鏈球菌(Streptococcus lactic、嗜熱鏈球菌 (Streptococcus thermophilus、、 長雙叉 乳桿菌 (Bjfidobacteriumjongum),短雙叉乳桿菌(Bifidobacterium breve_)、雙叉乳桿菌(Bifidobacterium bifidum)。上述乳酸 13 315590修正本 1282279 菌可單獨使用,亦可2種以上併用。 再者,糞腸5東菌(Enterococcus faecalis)、腸球菌 (Enterococcus faecium.)^;乳酸菌製劑等中使用之乳酸菌, 赂酸乳桿菌(Lactobacillus casei)、乳絡鏈球菌 (Slreptococcus cremoris)、嗜酸乳桿菌 axidophilus)^起司、發酵乳、酸乳酪、乳酸菌飲料等中所 使用之乳酸菌’乳酸鏈球菌(Streptococcus lactic)、嗜熱鍵 球鹵(StrePtQ.coccus thermophilus^為起司、酸乳絡等石員用之 乳酸菌、長雙叉乳桿菌(Bifidobacterium longum^,短雙叉 乳才干 _ (B i fidobacterium breve、、 雙叉乳才曰菌 (Bifidobacterium bifidum)為發酵乳等中所使用之乳酸 菌。因此,該等乳酸菌為熟習此項技藝者能容易取得者。 本發明中,特別較佳者係使用上述乳酸菌中之糞腸球 菌(Enterococcus faecali^ .例如 ATCC 19433、ATCC: 145 08、ATCC 123 65 5、IFO 16803 箄、。μ n i 心 寻)。上述培養物與糞腸 球菌(Enterococcus faei^)併用時,可期待由該等成八而 增效之生理活性效果(例如便秘改善效果、免疫賦活效刀 保濕效果等)。 本發明較佳係使用上述乳酸菌之經加熱殺菌者。由 此,能廣泛地添加於必須經加埶處 …、心陶口口。再者,J:伴 存安定性高,使用作為飲食或醫筚〇 八’、 、/一 西^叩專之原料時之安全性 非常局,特別適合使用於皮膚用保濕劑。 上述乳酸菌之培養可採用一般方 … 力又万去進行,例如 述乳酸囷以一般方法培養所得之培養 、 、 〇 乂勿,以過濾、離心等 315590修正本 14 1282279 方法回收菌體,水洗後,冑其懸浮於水等,再於⑽至⑴ 。’加熱處理30分鐘至3〇秒間。經加熱殺菌之乳酸菌, 必要時予以濃縮、乾燥使用亦可。 本發明之含有万_葡聚糖之組成物可由,例如,將上述 屬於擔子囷屬(Aureo^Ldium sp·)之菌培養物經殺菌後, $上述經加熱殺菌之乳酸菌混合分散而製得。再者,必要 4 ’可做成錠劑、膠囊劑、粉末、顆粒、液狀 狀等各種型態。 ^ 八本發明之含有万_葡聚糖之組成物較好是在其固形物 。中含有上述培養物以mu,葡聚糖換算$丄至肋質量 /〇及含有上述乳酸菌菌體4至95質量〇/〇。再者,除上述 ίί成分外’可適宜地含有香料、甜味料、維生素類、礦 w質類、寡糖、黏多膽、糊精、植物萃取物、其他植物成 分等。 本發明之含有石_葡聚糖之組成物可直接作為便秘改 善劑、免疫賦活劑、皮膚用保濕劑等。 例如’本發明之含有石-葡聚糖之組成物作為便秘改善 劑時,固形物中較佳合右μ、+ 至 ^ 施管炎 S有上述培養物以[葡聚糖 〇、π :、、、1至40貝里/〇且含有上述乳酸菌菌體4至%質量 /〇車乂好疋含有上述培養物以Π3」,卜葡聚糖換算為2 ,40質量%且含有上述乳酸菌菌體⑺至%質量%,更好 〇疋含有上述培養物以石葡聚糖換算為3至利質量 %且含有上述乳酸菌菌體3〇至%質量%。 貝里 本發明之便秘改善劑之有效攝取量宜為成人每日攝 315590修正本 15 1282279 換算為0 · 0 1至1 0 較佳為上述培養物 及上述乳酸菌菌體 克及 以/3 0.05 取上述培養物以/3 -1,3-1,6-葡聚糖 上述乳酸菌菌體〇·〇1至1〇克; _1,3-1,6-葡聚糖換算為〇.5至5克 至1克。 本發明之便秘改善劑亦可與例如清涼飲料、滚膠飲料 (Jellydrink)、果汁飲料、蔬菜汁、湯、味嗜湯、冷凍食品 及其他加卫食品#各種飲食品配合。上述各飲食品中本發 明之便秘改善劑之添加量為,以上述之相#於成人每日: 有效攝取量為基準設定時,一般而言,較佳為i至50質量 %,更佳為10至20質量%。再者,添加方法並無別限制, 可與各飲食品中所使用之其他原料—起於最起始時添加。 又,本發明之含有点_葡聚糖之組成物作為免疫賦活劑 時’固形物中較佳含有上述培養物以石— 葡聚糖換 异為8至80質量%且含有上述乳酸菌菌體1〇至8〇質量 %,更好是含有上述培養物以召4,3 4,6_葡聚糖換算為25 至70質量%且含有上述乳酸菌菌體2〇至7〇質量%,最好 疋含有上述培養物以/3-153_1,6_葡聚糖換算為3〇至6〇質 量%且含有上述乳酸菌菌體30至60質量%。 本發明之免疫賦活劑之有效攝取量相當於成人每曰 攝取上述培養物以;34,31,心葡聚糖換算為〇〇2至〇·5〇 克及上述乳酸菌菌體〇· 10至0.90克,較佳為上述培養物 以沒-1,3-1,6-葡聚糖換算為〇〇6至〇.4〇克及上述乳酸菌菌 體〇·15至〇·45克。 本發明之免疫賦活劑可與例如清涼飲料、凍膠飲料 16 315590修正本 1282279 (jelly drink)、果汁飲料 直他加工舍《耸i ‘采汁、苟、味噌湯、冷凍食品、 兵他加工&扣寻各種飲 之免疫賦活劑之添加量…、口。34各飲食品中本發明 4 | I曰& 1 以上述之相當於成人每日之有 效攝取1為基準設定時,一 (有 質量%,更佳為00, H較佳為0.02至0.50 ”、、·至〇·40質量%。再者,乳酸菌菌俨耔 佳為0.10至0.90質旦。/ 有礼酉夂涵囷體較 、里。更佳為0.15至〇·45質量%。又 添加方法並無特別限制 貝里/〇又 ,可吳各飲食品中所使用之Jl#7;S 料-起於最起始時添加。 Η 更用之其他原 再者,本發明之含古 _ 濕劑時,固形物中,,佳二:擔之組成物作為皮膚用保 聚糖換算為u40質1含有上述培養物以mu-葡 體…5質量心=有上述乳酸菌之加熱殺菌菌 、 更4土為含有上述培養物以占】3— 聚糖換算為2至40皙曰。/八口香物以/5 -^,6•匍 質量。/。,最… 含有上述乳酸菌菌體10至% 為3至4❹二3有上述培養物以々-1,3·1,6-葡聚糖換算 二 …且含有上述乳酸菌菌體30至95質量%。 含有石-葡聚糖之材料之配人曰、λ丨± 貝里/〇。 濕效果,㈣則二:::過少時’無法得到充分的保 咸鐵类/衣口口之流動性(延伸容易性)降低,使用 無::’乳酸菌之加熱殺菌菌圮之配合量過少時, $ 14 pi Γ 的保濕效果之持續性,過多時則製品中之分 放性降低’無法製得均一的製品。 之刀 時,伴、、蟲2迷培養物與上述乳酸菌之加熱殺菌菌體併用 矛 保濕效果之持靖/14担曰a 貝丨生k幵的理由雖然尚未明確地了解, 一 J可愿為,例如,令丨缺#、, t # 礼I囷之加熱殺菌菌體作為載體而保 得召-匍聚糖及泱八 好… 刀。特別是糞腸球菌(Enter〇c〇ccus 315590修正本 17 1282279 toiii),相較於乳桿菌或雙叉乳桿菌而言,菌體的尺寸 較小,添加等質量時之菌體數較多,可提高保濕效果。 本發明之皮膚用保濕劑可直接用作化粧水或化粧 液亦可配合各種皮膚用化粧品使用。該皮膚用保濕劑對 皮膚用化粧品之配合量較佳為〇·5至5〇質量%,更佳為$ 至20質量%。 (實施例) 以下,以實施例具體說明本發明,惟本發明並不為其 所限定。再者,以下說明中,除非特別說明,「%」均表示 「質量%」。 實施例1 (1) 擔子菌(Aureobasidium^ 培養 將出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans Μ-1 )(FERM BP-0 86 15)之前培養液適量接種於含蔗糖、抗壞血酸 0.2%、米糠0.2%之液體培養基中,於25°c,進行通氣培 養2天。培養終了後,於i21t將該培養液殺菌is分鐘。 該培養液之固形物為1 〇/〇,而該固形物中含3 5 %之点 -1,3-1,6-葡聚糖。 (2) 糞腸球菌(Enterococcus faecalis)之培養 將糞腸球菌(Enterococcus faecalis)於羅格沙培養基 (Rogosa medium)中,將37。(:下經24小時培養之前培養液 適量接種於含酵母抽出物4%、聚蛋白腺(polypept〇ne)3%、 乳糖10%之液體培養基中,使用pH__stat以苛性鈉水溶液 調控pH為6.8至7.0之間,於37°C下進行中和培養22至 18 315590修正本 Ϊ282279 24 小時 立口養終了後’以連續式、 水稀糴P s 、式離〜機分離菌體,回收後添加 稀釋至原液體積,再以連蜻 此P 連、’式離心分離菌體回收。重複 項知作4次洗淨菌體。1次 量分+ 將經洗淨之菌體懸浮於適 里水中,於10〇t殺菌30分锆銘此 乾择而制他a 刀、,里後,使用喷霧乾燥機將菌體 衣備成加熱殺菌之菌體粉末(5X 1(^efu/g)。 (3)便秘改善效果之確認 使用上述⑴所得之擔子g培養物與上述⑺所得之乳 y熱殺菌菌冑,依照以下方法進行便秘改善效果的 確認試驗。 試驗期間為4週,具便秘體質之自願受試者ι〇位, 於起始之第i週期間不投予任何試驗物,其次之i週期間 (第2週)投予乳酸菌菌體(2〇〇mg/天),再其次之i週期間(第 3週)投予擔子菌培養物(i5ml/天),最後丨週期間(第4週) 投予擔子菌培養物(15ml/天)與乳酸菌菌體(2〇〇mg/天)。調 查各試驗樣品於投予期間之1週中的排便次數。其結果示 於表1。 表1 Μ更次數 第1週 第2週 第3週 第 受試者 投與前 投與乳酸菌 菌體 投與擔子菌 培養物 ϋ 擔 物及乳酸菌菌體 1 3 3 3 5 2 2 4 2 5~^ 3 4 4 3 6~~ ~~ 4 3 4 3 5 ^~~ 5 2 2 2 3 ~~ 〜一------ 19 315590修正本 1282279
^ •表1可知,僅投予乳酸菌菌體時,有些許便秘改善 效果僅投予擔子g培養物日寺,無便秘改善效果。另外, 擔子菌坧養物與礼酸菌菌體併用日寺,確認排便次數增加, 顯示便秘確實獲得改善。 實施你 於貝施例(1)所製知之擔子菌培養物丨L中添加乳酸菌 之加熱殺菌菌體l〇g,而得均一混合之含有万_葡聚糖之組 成物。使用s亥含有万-葡聚糖之組成物,依照以下方法檢測 初期感染之預防效果。 (1)存活率之測定 將28隻(由日本SLC公司購得)經i週期間預備飼養 之BALB/c小鼠(7週大,雌性)分為4組(每組7隻),各組 分別以下列之試驗物質以每隻動物2⑽μ1,1天1次,於試 驗期間連續經口投予。 試驗組:上述之含有万-葡聚糖之組成物 比較組1 :擔子菌培養液(實施例1 (1)所製得者) 比較組2 ·乳酸菌之加熱殺菌菌體(實施例丨(2)所製得 者)懸浮於PBS中者(lg菌體/loomi)
對照組:PBS 20 315590修正本 1282279 將經過1週期間連續經口投予上述各試驗物質之各組 小鼠由尾靜脈内接種5·4χ 104 cfuQOOpi/小鼠(2χ LD5〇)之 細胞内寄生性細菌之李斯德菌(Listeria m〇n〇cvtoapn.c, GD菌株)’於其後2週期間進行觀察,求出各組之存活 率及平均存活期間。 其結果示於表2及第1至3圖。於試驗期間,水及飼 料(商口口名米刀末飼料CRF-1」,Oriental Yeast公司製)採自 由攝取。
—由表2及第1至3圖可知,試驗組中僅有丨例死亡(接 菌後6天)’試驗終了時之存活率為85 7%,而對照組為全 部死亡(接菌後4天),試驗終了時之存活率為〇%。再者, 峰組1中有2例死亡(接菌第6天上例,第7天i例), 試驗終了時之存活系泉7 j 1^ , 仔古羊為71 ·4%。而比較組2中有5例死亡 (接菌第4天3例,第5天2例),試驗終了時之存活率為 28.6%。使用Mann_Whitney υ試驗來檢測試驗組與其他組 間的顯著性差異’顯示試驗組相對於對照組及比較组2, 危險率不到1%,具顯著性差異。 再者’關於平均存活期間,相對於試驗組之12.7曰, 315590修正本 21 1282279 對照組為3.0日,比# έ 你田λ, 較組1為U·5曰,比較組2為“曰。 使用 Mann-Whitnev ττ μ + + 著性差里,… 來檢測試驗組與其他組間的顯 者後差”心⑽組相對於對照組及比較 低於1¾,具顯著性差異。 危險羊 由其結果可知,經口攝 ,^社 月之3有冷_匍聚糖之組 成物,於細痛感染時顯示宿主之感染抵抗性报強。 (2)臟器内菌數測定 對李二,中’已顯示本發明之含有厂葡聚糖之組成物 ” 之感純抗性有作用,而進行分析作為菌排除 “之臟器内菌數之經時變化。 —使用經過丨週預備飼養之BALB/c小鼠(7週大,雖幻 每組30隻’每組以上述相同之試驗物質進行投予。而後, 將經過1週連續經口投予上述各試驗物質之各組小鼠由尾 ^脈内接菌2.7x 1G3efu⑽μ1/小鼠(1/1GxLD5q)之細胞内 寄生性細菌之李斯德菌菌 株)’於細菌接種後第i、3、5、7及1〇天,每組各犧牲$ 隻’回收脾臟。 將口收之脾臟以均質機打碎後再懸浮於p B s 5 m 1中作 為原液。將該原液以10倍階段性稀釋法稀釋,原液及各序 列稀釋液各吸取100μ1塗抹於TSA培養基上,於37χ:之怔 溫箱中培養16小時。測定TSA培養基上生長之細菌菌落 數而計算臟器内菌數。計算各組臟器内菌數之平均值及標 準差。其結果示於表3及第4圖 表3 315590修正本 22 1282279 組 李斯德菌接種後之經過日數 ----— 1曰 3曰 5曰 7曰 iJJoV δ式驗組 6·88± 8·18χ 104 9.79± 7.76χ 104 2.86± 1.45x 104 7·24± 8·78χ 102 2.76± 2.54χ 比較組1 5.66± 1.77χ 104 1.20+ U3x 106 3.83± 2.76x 104 1.36+ 1.87χ 103 _ 檢出限界未 滿 比較組2 7.06± 0.30χ 104 7.12± 4.06x 105 2·00± 1·56χ 104 9.75± 14·9χ 102 檢 滿 對照組 4·37± 7.47χ— 103 1.00± 1.62x 107 1·14± 0.85χ 105 1.17± 2.36χ 104 3.75+ 7.50χ _IQ4 由表3可知,對照組中,接菌3天時脾臟内之細菌數 達高峰,之後便慢慢減少至接菌第10天時接近檢測界限 (3·75± 7·5χ 104CFU/脾臟)。另外,試驗組中,接菌後第丄 天認定有菌的增加,而菌接第3天顯示與第1天幾乎相等 之菌數’其後減少至接菌第1〇天為27± 25CFU/脾臟。比 較組1及比較組2中,接菌後第丨天認定有菌的增加,接 菌第3天说定為脾臟内細菌數之高峰,其後慢慢減少,接 菌第10天則不達檢測界限(<333CFU/脾臟)。 由結果可知,本發明之含有卢_葡聚糖之組成物於感染 早期之免疫機構有作用,此感染抵抗性之增強推測可能來 自由成熟T細胞而來之攻擊性強的免疫機構或由未成熟形 τ細胞或巨嗜細胞而來之非特異的免疫機構。 (3)細胞表面分子之分析 述⑴及(2)中,已確認存活率、存活期間及臟器内菌 數之差異,而以流速細胞儀⑺〇wcyt〇mete 胞關於對李斯德菌之感染抵抗性之分析。 生體内" 於上述⑺之臟器内菌數測定時,同時回收腸間膜淋巴 315590修正本 23 1282279 結(mesenteric lymph node ; MLN)。將回收之 MLN 以滑動 玻璃(slide glass)弄破,以不鏽鋼網眼(stainless mesh)去除 夕餘組織片後’將淋巴球以1 x 1 〇6/ml再懸浮於FacS用之 Hank’s液中。以下列(^至(d)所示之4種染色型式將淋巴 球染色後,使用流速細胞儀(Epics_XL : Beckman c〇ulter) 進行細胞(T細胞中心)表面分子的分析。其結果示於表4 及第5圖。 (a) Cy-chrome(Cy)標識之抗CD3單株抗體(τ細胞原有 之辨識標圮)/FITC標識之抗TCR α冷單株抗體(τ細胞類 型辨識標記)/ΡΕ標識之抗CD4單株抗體/biotin標識之抗 TCR γ δ(Τ細胞類別辨識標記)單株抗體。 (b) Cy-chrome(Cy)標識之抗CD3單株抗體/FItc標識 之抗TCRa /3單株抗體/PE標識之抗cD4單株抗體/bi〇tin 標識之抗CD69單株抗體(早期活化標記)。 (C)Cy-chr〇me(Cy)標識之抗CD3單株抗體/FITC標識 之抗TCRa:万單株抗體/pe標識之抗CD4單株抗體/biotin 標識之抗CD25單株抗體(lL-2Ra ;活性化標記)。 (d)Cy-chrome(Cy)標識之抗CD3單株抗體/FITC標識 之抗TCR α石單株抗體/PE標識之抗CD122單株抗體 (IL-2R点;活性化標記)/biotin標識之抗CD4單株抗體。 表4 組 CD25/ 李斯; CD122/CD69 表現率(%) 隐菌接種後之經過曰數 0曰 1曰 3曰 5曰 7曰 10曰 試驗組 20/20/20 21/20/20 24/23/35 20/22/20 24/20/20 19/20/20 24 315590修正本 1282279 比較組1 20/20/20 20/22/20 21/22/33 21/20/20 20/22/20 20/20/21 比較組2 20/20/20 20/20/20 24/20/38 20/23/20 23/19/20 20/18/20 對照組 20/20/21 20/20/19 22/23/28 21/20/20 20/20/21 20/22/20 如表4及第5圖所示,相較於對照組,試驗組及比較 組1及2之CD4陽性α点形T細胞增加。特別是試驗組, 較比較組1及2之增加比例更多。又,菌感染3天後,任 一組均顯示幾乎相同比例。另一方面,CD4陽性細胞中活 性標記,CD25分子(IL-2Ra ;活性化標記)、CD122分子 (IL-2R/3 ;活性化標記)及CD69分子(早期活化樣記)在任 一組中均為幾乎相等之表現程度。 由該結果,於試驗組中,由於感染前與感染後CD4陽 性α /3型T細胞的顯著變化,由本發明之含有々-葡聚糖之 組成物而來之感染抵抗性之增強可推測為來自低分化之細 胞集團的機能亢進。 又,以市售之TFN- 7測定套組(Genzyme公司製)之方 法測定血液中細胞激素時,如表5所示,試驗組於感染3 天時顯示IFN- r量之高值。由於CD4陽性α /3型T細胞 的變化,而認為產生IFN- 7之細胞為巨嗜細胞之可能性。 表5 組 IFN- τ產生i 李斯德菌接種; t (units/ml) il:之經過日數 0曰 1曰 3曰 5曰 7曰 10日 試驗組 20 100 450 300 140 80 比較組1 20 120 240 300 260 100 比較組2 ^20 140 360 320 140 100 對照組 ^20 60 80 140 240 160 25 315590修正本 1282279 宜施例3 使用實施例1(υ所製得之擔子菌培養液與實施例ι(2) 所製得之乳酸菌之加熱殺菌菌體製備下列所示之受試樣 品’以5位女性自願受試者(2〇至3〇歲2位、%至二歲: 4〇至50歲、50至60歲各!位)進行保濕效果之確認試驗。 試驗樣品 1 :擔子菌培養液 2 :乳酸菌加熱殺菌菌體1 %懸浮液 3 :含有乳酸菌加熱殺菌菌體1 %之擔子菌培養液 4 :水(對照) 將各受試者之測定部位(前腕内侧彎曲部分以下化㈤ 之寬3cmx長l〇cm的範圍)以肥皂洗淨後,請受試者在調 整溫度為18至20°C、溼度為50至55%之恆溫忮濕條件下 之至内保持安靜2 0分鐘。而後,將上述測定部位分為4 個區域,將上述試驗樣品各丨〇μ1分別塗布後,應用高頻率 阻抗(impedance)法使用表皮角質層水分含量測定裝置 「SKINCON_200」(商品名,IBS公司製)測定各區域之表 皮角質層水分含量(表皮導電度之經時變化。表皮角質 層水份含量之測定係於試驗樣品塗布前5分鐘分鐘)、 塗布後(0分鐘)、塗布後10、20、30、60分鐘進行。其於 果示於第6至10圖。再者,第6至10圖中,1至4分別 為相對應之試驗樣品1至4。 由第6至10圖,塗布試驗樣品3時,相較於試驗樣 26 315590修正本 1282279 ^及2者,在塗布後經時過程中,表皮角質層水分量仍 維持高含量,表示保濕效果持續。再者,詢查受試者之使 用感日守,不會感覺黏滯或油潰,使用感亦佳。 (產業上可利用性) 由以上之說明可知,本發明之含有/5 _葡聚糖之組成 物,因含有由培養屬於擔子菌屬(AureobasMiili21 sp )之菌 所製得之含yS-m,6-葡聚糖之培養物與乳酸菌菌體,由 該等成分之增效作用能期待優異之生理活性效果,可利用 作為便秘改善劑、免疫賦活劑、皮膚用保濕劑等。 [圖式簡單說明] 第1圖為李斯德_接種後之存活率與經過天數之關係 圖示。 第2圖為李斯德菌接種後之存活率受試驗物影響之圖 示。 第3圖為李斯德菌接種後之平均生存天數與試驗物關 係之圖示。 第4圖為李斯德菌接種後之脾臟内菌數之經時變化受 試驗物影響之圖示。 第5圖為李斯德菌接種後,使用流速細胞分析儀進行 細胞表面分子解析結果之圖示。 丁 第6圖為測定受試者1(20至30歲女性)之表皮角質層 水刀I (表皮導電度之經時變化結果之圖示。 第7圖為测定受試者2(20至30歲女性)之表皮角質層 水分$ (表皮導電度pS)之經時變化結果之圖示。 27 315590修正本 1282279 第8圖為測定受試者3(30至40歲女性)之表皮角質層 水分量(表皮導電度pS)之經時變化結果之圖示。 弟9圖為測疋受试者4(40至50歲女性)之表皮角質層 水分量(表皮導電度l^s)之經時變化結果之圖示。 第10圖為測定受試者5(50至60歲女性)之表皮角質 層水分量(表皮導電度KS)之經時變化結果之圖示。 28 315590修正本
Claims (1)
1282279
私年V月2^日修(:更).正替換頁 第93105857號專利申請案 (96年3月29日] 拾、申請專利範圍: 1 · 一種含有/5 -葡聚糖之組成物,其係含有培養屬於擔子 菌屬(Aureobasidium sp.)之菌所得之含有/3 -1,3-1,6-葡 聚糖之培養物與經加熱殺菌之乳酸球菌之糞腸球菌 (Enterococcus faecalis)作為有效成分。 2 ·如申请專利範圍第1項之含有石-葡聚糖之組成物,其 中’屬於擔子菌屬(Aureobasidium sp·)之菌係出芽短梗 M (Aureobasidium pullulans Μ-ΠΓ BCRC930069)。 3 ·如申請專利範圍第1項之含有点_葡聚糖之組成物,其 中,固形物含有前述培養物(以々-134,6_葡聚糖計算)i 至80質量。/〇,且含有前述乳酸菌菌體4至95質量0/〇。 4· 一種便秘改善用組成物,其係含有申請專利範圍第}至 3項中任一項之含有石·葡聚糖之組成物作為有效成分。 5· —種免疫賦活用組成物,其係含有申請專利範圍第丨至 3項中任一項之含有万_葡聚糖之組成物作為有效成分。 6. -種皮膚則呆濕用組成物,其係含有申請專利範圍第i 至3項中任一項之含有葡聚糖之組成物作為有效成 分0 (修正本)315590 29
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