TW202124431A - 抗登革熱病毒抗體、含有變異Fc區的多肽及使用方法 - Google Patents

抗登革熱病毒抗體、含有變異Fc區的多肽及使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種抗登革熱病毒抗體及其製備和使用方法。亦提供編碼抗登革熱病毒抗體的核酸以及包含該核酸之宿主細胞。抗登革熱病毒抗體具有包含治療登革熱病毒感染的用途。本發明亦提供含有變異Fc區之多肽及其製備與使用方法。亦提供編碼多肽的核酸以及包含該核酸之宿主細胞。多肽具有包含治療病毒感染的用途。

Description

抗登革熱病毒抗體、含有變異Fc區的多肽及使用方法
本發明係關於抗登革熱病毒抗體及其使用方法。本發明亦關於包含變異Fc區之多肽及其使用方法。
登革熱為世界上最常見的節足動物攜帶性病毒症。導致登革熱的病毒(或在此稱為DENV)可以分成四種不同的感染血清型(infective serotypes)，如DENV-1、DENV-2、DENV-3與DENV-4。登革熱感染的症狀包含發燒、肌肉疼痛、頭痛、低血小板數及低白血球數、凝血障礙、出血及可導致登革熱休克症的血管滲漏。當人類在先前感染後再次暴露於登革熱病毒時，抗病毒抗體可增強病毒進入宿主細胞的攝取，使患者處於發展成重症登革熱的高風險下。然而重症登革熱亦可能在第一次感染期間發生。
雖然是最常見的節足動物攜帶性病毒症，如今還沒有可用於治療登革熱的藥物。關於作為疾病的登革熱的處理方法主要係朝向預防感染及/或減輕症狀的治療。
因此需要提供能夠與至少一種登革熱血清型中和及/或結合的試劑。近來許多團隊已報導抗登革熱病毒中和抗體(參見如：WO2012/082073、WO2013/089647、WO2013/151764、WO2013/173348、WO2014/025546、 WO2015/123362、WO2015/122995及WO2016/012800)。然而仍需要具有更優異治療特性的抗體。
近來開發疫苗與抗體治療來預防與治療病毒感染。然而以抗體為基礎的治療並非沒有風險。此種風險中的其一為抗體依賴性增強(ADE)，其發生於當非中和抗病毒抗體促進病毒進入宿主細胞時，將導致細胞中感染性增加(Expert Rev Anti Infect Ther (2013) 11, 1147-1157)。ADE最常見的機制為經由抗體的Fc部分與細胞表面上的Fc受體(FcRs)的病毒-抗體複合物的交互作用。正常輕微的病毒感染可藉由ADE增強而變成危及生命的疾病。已有報導指出具有防止與FcγR結合的在Fc區中之突變的抗登革熱病毒抗體，無法增強登革熱病毒的感染(WO2010/043977)。然而，仍需要不增加感染抗體依賴性增強的風險的抗體治療。
本發明提供一種抗登革熱病毒抗體、包含變異Fc區的多肽及其使用方法。
於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體結合至登革熱病毒E蛋白。於一些實施例中，本發明的抗登革熱病毒抗體包含： (a)(i)包含胺基酸序列GGX1 ALFYDSYTTPX2 DX3 GSWWFDP的HVR-H3，其中X1 為R或E，X2 為R或F，X3 為G、D或L(SEQ ID：42)，(ii)包含胺基酸序列QQFX1 X2 LPIT的HVR-L3，其中X1 為D、S或E，X2 為D或A(SEQ ID：45)，及(iii)包含胺基酸序列VINPRGGSX1 X2 SAQKFQG的HVR-H2，其中X1 為T或R，X2 為A或R(SEQ ID：41)； (b)(i)包含胺基酸序列SX1 YX2 H的HVR-H1，其中X1 為N或Y，X2 為I或M(SEQ ID：40)，(ii)包含胺基酸序列VINPRGGSX1 X2 SAQKFQG的HVR-H2，其中X1 為T或R，X2 為A或R(SEQ ID：41)，及(iii)包含胺基酸序列GGX1 ALFYDSYTTPX2 DX3 GSWWFDP的HVR-H3，其中X1 為R或E，X2 為R或F，X3 為G、D或L(SEQ ID：42)； (c)(i)包含胺基酸序列SX1 YX2 H的HVR-H1，其中X1 為N或Y，X2 為I或M(SEQ ID：40)，(ii)包含胺基酸序列VINPRGGSX1 X2 SAQKFQG的HVR-H2，其中X1 為T或R，X2 為A或R(SEQ ID：41)，及(iii)包含胺基酸序列GGX1 ALFYDSYTTPX2 DX3 GSWWFDP的HVR-H3，其中X1 為R或E，X2為R或F，X3為G、D或L(SEQ ID：42)，(iv)包含胺基酸序列QASQX1 IRX2 YLN 的HVR-L1，其中X1 為D或E，X2 為K或Q(SEQ ID：43)，(v)包含胺基酸序列DASX1 LKX2 的HVR-L2，其中X1 為N或E，X2 為T或F(SEQ ID：44)，(vi)包含胺基酸序列QQFX1 X2 LPIT的HVR-L3，其中X1 為D、S或E，X2 為D或A(SEQ ID：45)；或 (d)(i)包含胺基酸序列QASQX1 IRX2 YLN的HVR-L1，中X1 為D或E，X2 為K或Q (SEQ ID：43)；(ii)包含胺基酸序列DASX1 LKX2 的HVR-L2，其中X1 為N或E，X2 為T或F(SEQ ID：44)；及(iii)包含胺基酸序列QQFX1 X2 LPIT的HVR-L3，其中X1 為D、S或E，X2 為D或A(SEQ ID：45)。
於一些實施例中，本發明之抗體不包含：包含(i)包含SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2、(iii)包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3、(iv)包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1、(v)包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的HVR-L2、及(vi)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3的抗體。
於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體包含： (a)(i)來自SEQ ID NOs：2至6中任一VH序列的HVR-H3， (ii) 來自SEQ ID NOs：8至10中任一的VL序列的HVR-L3，及 (iii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H2； (b) (i)來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H1， (ii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H2，及 (iii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H3； (c) (i)來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H1，(ii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H2，(iii) 來自SEQ ID NOs：2-至6中任一的VH序列的HVR-H3， (iv) 來自SEQ ID NOs： 8至10中任一的VL序列的HVR-L1； (v) 來自SEQ ID NOs：8至10中任一的VL序列的HVR-L2 ；及 (vi) 來自SEQ ID NOs： 8至10中任一的VL序列的HVR-L3； (d) (i) 來自SEQ ID NOs：8至10中任一的VL序列的HVR-L1；(ii)來自SEQ ID NOs：8至10中任一的VL序列的 HVR-L2；及 (iii) 來自SEQ ID NOs：8至10中任一的VL序列的HVR-L3 ；或 (e) (i) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H1 ，(ii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H2， (iii) 來自SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列的HVR-H3， (iv)來自SEQ ID NOs：7 中任一的VL序列的HVR-L1；(v) 來自SEQ ID NOs：7中任一的VL序列的HVR-L2；及 (vi) 來自SEQ ID NOs：7中任一的VL序列的HVR-L3。
於一些實施例中，本發明抗體不包含：包含(i) 來自SEQ ID NO：1之VH序列的HVR-H1， (ii) 來自SEQ ID NO：1之VH序列的HVR-H2，(iii) 來自SEQ ID NO：1之VH序列的HVR-H3 ， (iv)來自SEQ ID NO：7 之VL序列的HVR-L1 ，(v) 來自SEQ ID NO：7之VL序列的HVR-L2，及 (vi) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3的抗體。
於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體進一步包含FR1包含SEQ ID NO：31的胺基酸序列、FR2包含SEQ ID NO：32的胺基酸序列、FR3包含SEQ ID NO：33或34的胺基酸序列、FR4包含SEQ ID NO：35的胺基酸序列之重鏈可變域之架構。於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱抗體進一步包含FR1包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列、FR2包含SEQ ID NO：37的胺基酸序列、FR3包含SEQ ID NO：38的胺基酸序列、FR4包含SEQ ID NO：39的胺基酸序列之輕鏈可變域之架構。
於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體包含(a)與SEQ ID NO：2至6中任一胺基酸序列具有至少95%序列相同的VH序列；(b) 與SEQ ID NO：8至10中任一胺基酸序列具有至少95%序列相同的VL序列；或(c) SEQ ID NOs：2至6中任一的VH序列及SEQ ID NOs： 8至10中任一的VL序列；或(d) SEQ ID NOs： 2至6中任一的VH序列及SEQ ID NOs：7 中任一的VL序列。
於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體為單株抗體。於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體為人類、人源化或嵌合抗體。於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體為與登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白結合的抗體片段。於一些實施例中，本發明之分離的抗登革熱病毒抗體為全長IgG抗體。
於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體的Fc區包含根據EU編號在位置234的Ala及在位置235的Ala。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體的Fc區可選自本文所述的變異Fc區。
本發明亦提供編碼本發明之抗登革熱病毒抗體的分離的核酸。本發明亦提供包含本發明核酸的宿主細胞。本發明亦提供一種生產抗體的方法，其包含培養本發明的宿主細胞以產生抗體。
本發明亦提供包含本發明之抗登革熱病毒抗體及醫藥上可接受的載體之醫藥配方。
本發明之抗登革熱病毒抗體可作為藥物使用。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體可用於治療登革熱病毒感染的用途。
本發明之抗登革熱病毒抗體可用於製造藥物之用途。於一些實施例中，該藥物用於治療登革熱病毒感染的用途。
本發明亦提供治療具有登革熱病毒感染的個體之方法。於一些實施例中，該方法包含給予個體有效劑量的本發明之抗登革熱病毒抗體。於一些實施例中，該方法進一步包含給予該個體其他治療劑，例如，如下所述。
於一些實施例中，本發明之變異Fc區包含至少一胺基酸改變於親代Fc區中。進一步的實施例中，與該親代Fc區域相比時，變異Fc區與親代的Fc區相比，具有實質上降低的FcγR結合活性。進一步的實施例中，與該親代Fc區域相比時，變異Fc區不具有實質上地降低的C1q結合活性。
於一些實施例中，本發明之變異Fc區包含根據EU編號在位置234的Ala、在位置235的Ala。進一步實施例中，變異Fc區包含根據以下(a)至(c) 中任一的胺基酸改變：根據EU編號 (a)位置267、268及324；(b) 位置236、267、268、324及332；及(c) 位置326及333。
於一些實施例中，本發明之變異Fc區包含選自由以下所組成之群組之胺基酸：根據EU編號(a)於位置267的Glu；(b)於位置268的Phe；(c)於位置 324 的Thr；(d)於位置 236的Ala；(e)於位置 332的Glu；(f)於位置326的 Ala、Asp、Glu、Met或Trp；及(g)於位置的333 Ser。
於一些實施例中，本發明之變異Fc區進一步包含選自由以下所組成之群組之胺基酸：根據EU編號(a)於位置434的Ala；(b)於位置 434的Ala、於位置 436的Thr、於位置 438的Arg及於位置 440的Glu；(c) 於位置 428的Leu、 於位置 434的Ala、於位置 436的Thr、於位置 438的Arg及於位置 440的Glu；及(d)於位置 428的Leu、於位置 434的Ala、於位置 438的Arg及 於位置 440的Glu。
於一些實施例中，本發明之變異Fc區單獨或組合地包含如表4所述之任何胺基酸修改。於一些實施例中，本發明所描述的親代Fc區係分離自人類IgG1。本發明提供一種多肽，其包含SEQ ID Nos：51至59中任一的胺基酸序列。
於一些實施例中，本發明包含變異Fc區的多肽為一抗體。進一步實施例中，該抗體為抗病毒抗體。進一步實施例中，該抗體包含本文所述之衍生自抗登革熱病毒抗體的可變區。
於進一步實施例中，該抗體包含： (a)(i) 包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3， (ii)包含 SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3，且 (iii) 包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2； (b)(i) 包含 SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HVR-H1，(ii) 包含 SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2，且(iii)包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3； (c)(i)包含 SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HVR-H1，(ii)包含 SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2， (iii)包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3， (iv)包含 SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1； (v) 包含 SEQ ID NO： 24的胺基酸序列的HVR-L2；且 (vi)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3；或 (d)(i)包含 SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1； (ii)包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的HVR-L2；且 (iii)包含 SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3。
於進一步實施例中，該抗體包含： a) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3 ， (ii) 來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L3，及 (iii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2 ； (b) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1，(ii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2 ，及 (iii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3； (c) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1，(ii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H2， (iii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3， (iv) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1； (v) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2；及 (vi)來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L3； (d) (i)來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L1；(ii)來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L2；及 (iii)來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L3；或 (e) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1，(ii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2，(iii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3，(iv) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1； (v) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2；及 (vi) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3。
本發明亦提供編碼本發明包含變異Fc區的多肽之分離的核酸。本發明亦提供包含本發明核酸的宿主細胞。本發明亦提供製造含有變異Fc區之多肽的方法，包含培養本發明的宿主以製造該多肽。
本發明亦提供一種包含具有本發明變異Fc區之多肽及醫藥上可接受的載體的醫藥配方。
本發明包含變異Fc區的多肽可用作為藥物。於一些實施例中，本發明包含變異Fc區的多肽可用於治療病毒感染的用途。
本發明包含變異Fc區的多肽可用於製造藥物之用途。於一些實施例中，該藥物用來於治療病毒感染的用途。
本發明亦提供治療具有病毒感染之個體的方法。於一些實施例中，該方法包含施予個體有效量的本發明包含變異Fc區的多肽。
本發明亦提供如本文所述的抗登革熱病毒抗體，進一步包含本發明包含變異Fc區的多肽。
於一實施例中，本發明關於製備抗體的方法，其中抗體：(a)包含SEQ ID NO：12的胺基酸序列的HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列 的HVR-H2，(c)包含 SEQ ID NO：20的胺基酸序列的HVR-H3，(d) 包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1，(e) 包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的HVR-L2，及 (f)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3，該方法包含以下步驟： (a) 組合選自由3CH1047 (SEQ ID NO：6)及 3CH1049 (SEQ ID NO：95) 所組成群組中的VH變異序列與選自由SG182 (SEQ ID NO：46)、SG1095 (SEQ ID NO：54) 及SG1106 (SEQ ID NO： 59)所組成群組中的人類IgG1 CH序列； (b) 組合選自由3CL (SEQ ID NO：7)及3CL633 (SEQ ID NO：98)所組成群組中的VL變異序列與人類CL序列SK1 (SEQ ID NO：60)； (c) 選殖每一種組合於表現載體中； (d) 表達所得到的表現載體於共轉染細胞(宿主細胞)中；及 (e)自步驟(d)純化所得到的抗體。
本文所描述或提及之技術及方法透過利用常規的方法可被所屬技術領域具有通常知識者很好的理解且經常使用，像是，例如描述於Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.； Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., (2003)) ； the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)： PCR 2： A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))； Oligonucleotides Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press； Cell Biology： A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press； Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)； Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press； Cell and Tissue Culture： Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons； Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)； PCR： The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)； Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)； Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)； Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)； Antibodies (P. Finch, 1997)； Antibodies： A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)； Monoclonal Antibodies： A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)； Using Antibodies： A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)； The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)； and Cancer： Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993) 中廣泛使用的方法。
I. 定義
除非有另外定義，否則本文使用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域具有通常知識者的通常理解相同的含義。 Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.，J.Wiley＆Sons(New York，NY1994)和March，Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure 4th ed.,John Wiley＆Sons(New York ，NY 1992)，為本領域具有通常知識者提供了本申請中使用的許多術語的常見指導。本文引用的所有參考文獻，包括專利申請和出版物皆藉由引用的方式將其全文併入本文中。
為了解釋本說明書之目的，將採用以下定義，並且在適當的情況下，以單數使用的術語也將包括複數，反之亦然。應該理解為本文使用的術語僅用於描述具體實施例之目的，且不意圖為限制。若下文提出的任何定義與藉由引用併入本文的任何文件相衝突，則以下文的定義為準。
本文所述「受體人類架構(acceptor human framework)」是如下定義衍生自人類免疫球蛋白架構或人類共同架構(human consensus framework)之包含之輕鏈可變域(VL)架構或重鏈可變域(VH)序列架構之胺基酸序列的架構。「衍生自」人類免疫球蛋白架構或人類共同架構的受體人類架構可包含其相同胺基酸序列，或可包含胺基酸序列變化(amino acid sequence changes)。於一些實施例中，胺基酸變化的數量為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或者2或更少。於一些實施例中，VL受體人類架構的序列與VL人類免疫球蛋白架構序列或人類共同架構序列相同。
「親和力(Affinity)」是指分子(如抗體)的單個結合位與其結合配偶體(binding partner)(如抗原)之間所有的非共價交互作用之總合的強度。除非另有說明，否則本文使用的「結合親和力(binding affinity)」是指在結合對(如抗體與抗原)的成員之間反應1：1交互作用時的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力一般可以解離常數(Kd)表示。親和力可藉由包含本文所述的方法之本技術領域習知的方法測得。測量親和力的具體說明和例示性實施例將於下文中描述。
「親和力成熟(affinity matured)」抗體指的是抗體於一或多個高度變異區(HVRs)具有一或多個修改(alterations)，相較於不具有這些修改的親代抗體，這些修改造成抗體對抗原的親和力改善。
術語「抗登革熱病毒抗體(anti-DENV antibody)」及「結合至登革熱病毒的抗體(an antibody that binds to DENV)」指的是一抗體具有足夠的親和力以能夠結合登革熱病毒的抗體，該抗體被有效地作為針對登革熱病毒的診斷及/或治療試劑。該抗體可結合至登革熱病毒的E蛋白。術語「抗登革熱病毒E蛋白抗體(anti-DENV E protein antibody)」及「結合至登革熱病毒E蛋白的抗體(an antibody that binds to DENV E protein」指的是一抗體具有足夠的親和力以能夠結合登革熱病毒E蛋白的抗體，該抗體被有效地作為針對登革熱病毒的診斷及/或治療試劑。於一個實施例中，抗登革熱病毒E蛋白抗體對於不是登革熱病毒E蛋白的不相關的蛋白的結合程度少於例如藉由放射免疫分析法(RIA)測得之抗體對於登革熱病毒E蛋白的結合的大約10%。於某些實施例中，結合至登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白的抗體具有的解離常數(Kd)為1μM或更少、100 nM 或更少、10 nM 或更少、 1 nM 或更少、 0.1 nM 或更少、0.01 nM 或更少或 0.001 nM 或更少 (如 10-8 M 或更少、如從 10-8 M 至10‑13 M、如從 10-9 M 至10-13 M)。於某些實施例中，抗登革熱病毒抗體結合至登革熱病毒的抗原決定位，其在來自不同血清型的登革熱病毒之間為恆定的。於某些實施例中，抗登革熱病毒E蛋白抗體結合至在來自不同血清型的登革熱病毒E蛋白之間為保守的(conserved) 登革熱病毒E蛋白的抗原決定位。
術語「抗體(antibody)」在本文中以最廣的意義解釋且包含各式各樣的抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)及抗體片段，只要能夠表現期望的抗原結合活性即可。
「抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)」或「ADCC」是指一種細胞毒性的形式，其中分泌的Ig結合到存在於一些細胞毒性細胞(如NK細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上，使這些細胞毒性效應細胞特異性地結合到帶有抗原的目標細胞並利用細胞毒性殺死該目標細胞。用於介導ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII及FcγRIII。造血細胞上FcR的表達綜述於Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol 9：457-92 (1991)第464頁上的表3中。為評估感興趣分子的ADCC活性，可進行如美國專利案5,500,362或5,821,337或美國專利案6,737,056(Presta)中所述的體外ADCC檢測。在這種檢測中有效的效應細胞包含PBMC和NK細胞。此外或附加地，感興趣分子的ADCC活性可在像是Clynes等人於PNAS (USA) 95：652-656 (1998)中所揭示的例如動物模式中進行體內評估。
「抗體片段(antibody fragment)」是指完整抗體以外的分子，其包含結合抗原至其與完整抗體結合處的完整抗體的一部分。抗體片段的實例包含但不限於Fv、 Fab、 Fab'、 Fab'-SH、F(ab')2 ；雙體抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
作為參考抗體(reference antibody)之「結合至相同抗原決定位的抗體(antibody that binds to the same epitope)」是指在競爭分析中阻斷參考抗體對其抗原的結合的抗體，且相反地，參考抗體在競爭分析中阻斷該抗體對其抗原的結合。本文提供例示性的競爭分析。
「C1q」為包含免疫球蛋白Fc區的結合區的多肽。C1q與兩種絲胺酸蛋白酶C1r 及 C1s一起形成複合物C1，其為補體依賴性細胞毒性(CDC)路徑的第一成分。人類C1q可由商業途徑獲得，如來自於Quidel, San Diego, CA。
術語「嵌合(chimeric)」抗體是指其中一部分的重鏈及/或輕鏈係衍生自特定的來源或物種，而其餘部分的重鏈及/或輕鏈係衍生自不同的來源或物種的抗體。
抗體的「類別(class)」是指重鏈擁有之恆定域(constant domain)或恆定區(constant region)的種類。抗體的五種主要類別為：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而這些類型中的多個可進一步分成子類(同型(isotypes))如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 。相應於不同類別的免疫球蛋白的這些重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。
「補體依賴性細胞毒性(Complement dependent cytotoxicity)」或「CDC」指的是在補體存在下目標細胞的溶解(lysis)。典型補體途徑的活化是藉由補體系統的第一組成(C1q)與結合至其同源抗原的(適當的亞型的)抗體而引發。為評估補體的活化，可進行如Gazzano-Santoroet al .,J. Immunol. Methods 202：163 (1996)中所描述的CDC測定。具有修改的Fc區胺基酸序列的多肽變異(具有變異Fc區的多肽)及增加或減少的C1q結合能力敘述於例如：美國專利案No. 6,194,551 B1 及 WO 1999/51642，亦見於如 Idusogieet al. J. Immunol. 164： 4178-4184 (2000)。
本文所使用的術語「細胞毒劑(cytotoxic agent)」指的是抑制或防止細胞功能及/或造成細胞死亡或破壞的物質。細胞毒劑包括但不限於放射性同位素(如211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb 及 Lu的放射性同位素)；化學治劑或藥物(如胺甲蝶呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamycin)、長春花屬生物鹼(vinca alkaloids )(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、伊妥普賽(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、黴法蘭(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他嵌入劑) ；生長抑制劑；酵素及其片段，如核分解酵素；抗生素；毒素，如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活化性毒素，包含其片段及/或變異；以及下列所揭露的各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應物功能(Effector functions)」是指可歸因於隨著抗體同型而變化的抗體的Fc區的那些生物活性。抗體效應物功能的例子包含： C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)； Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC) ；吞噬作用；細胞表面受體(如B細胞受體)的負調節；及B細胞活化。
試劑的「有效劑量(effective amount)」，如醫藥配方，是指在劑量及所需的時間內，可有效達成希望的治療或預防結果的有效量。
術語「抗原決定位(epitope)」包括能夠被抗體結合的任何決定位(determinant)。抗原決定位是與以該抗原為目標的抗體結合的抗原區域，並包含直接接觸該抗體的特定胺基酸。抗原決定位可包含分子的化學活性表面群組，如胺基酸、醣側鏈、磷醯基(phosphoryl)或磺醯基(sulfonyl)，且可具有特定的三維結構特徵及/或特定的電荷特徵。通常對特定目標抗原具有特異性的抗體在蛋白質及/或大分子的複雜混合物中會優先辨識目標抗原上的抗原決定位。
「Fc受體(Fc receptor)」或「FcR」描述結合到抗體Fc區的受體。於一些實施例中FcR為自然人類FcR。於一些實施例中，FcR結合至IgG抗體(γ受體)且包含FcγRI、FcγRII、 及FcγRIII子類的受體，包含來自這些受體的對偶變異(allelic variants)及可變剪接形式(alternatively spliced forms)。FcγRII受體包含FcγRIIA (一種 「活化受體」) 及 FcγRIIB (一種「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域有所不同之相似的胺基酸序列。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中具有免疫受體酪胺酸活化模體(immunoreceptor tyrosine-based activation motif , ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中具有免疫受體酪胺酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITIM)。(參見Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15：203-234 (1997))。FcRs綜述於，如Ravetch及 Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9：457-92 (1991)； Capelet al., Immunomethods 4：25-34 (1994)； 以及 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med . 126：330-41 (1995)。包含未來所認定的其他FcRs皆被本文術語「FcR」所涵蓋。
術語「Fc受體(Fc receptor)」或「FcR」亦包含新生受體FcRn，其負責將母體的IgG傳輸至胎兒(Guyeret al., J. Immunol . 117：587 (1976) 及 Kim et al., J. Immunol . 24：249 (1994))及免疫球蛋白恆定的調節。測定與FcRn結合的方法係為已知(參見 Ghetie and Ward. ,Immunol. Today 18(12)：592-598 (1997)；Ghetieet al. ,Nature Biotechnology 15(7)：637-640 (1997)；Hintonet al. ,J. Biol. Chem. 279(8)：6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hintonet al .)。可於例如：轉基因小鼠或轉染表達人類FcRn的人類細胞株、或賦予具有變異Fc區的多肽之靈長類中分析於體內與人類FcRn的結合及人類FcRn高度親和結合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072 (Presta)中描述抗體變異改善或減弱與FcRs的結合。亦見於Shields et al.,J. Biol. Chem. 9(2)：6591-6604 (2001)。
本文中術語「Fc區(Fc region)」用於定義包含至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈的C末端區。術語包含自然序列Fc區及變異Fc區。於一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸到重鏈的羧基末端。然而Fc區的C末端離胺酸(Lys447) 或甘胺酸-離胺酸(殘基 446-447)可能存在或不存在。除非本文另外指明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基係根據EU編號系統(也稱為EU索引)編號，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所描述。
術語「包含有Fc區的抗體(Fc region-comprising antibody)」是指包含Fc區的抗體。如在抗體的純化期間或經由編碼該抗體的核酸的重組工程，可移除Fc區C末端離胺酸(殘基447) 或甘胺酸-離胺酸 (殘基 446-447)。因此，包含根據本發明的具有Fc區的抗體的組合物可包含具有G446-K447、具有 G446 且不具有 K447、去除所有G446-K447的抗體，或上述三種類型抗體的混合物。
「架構(Framework)」或「FR」是指除了高變異區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域的FR一般由四種FR域組成：FR1、 FR2、 FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般以下列序列出現在VH (或 VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體(full length antibody)」、「完整抗體（intact antibody）」及「全抗體(whole antibody)」在此可互換使用，指具有實質上相似於自然抗體的結構之結構或具有包含本文定義之Fc區的重鏈的抗體。
「功能性Fc區(functional Fc region)」擁有自然序列Fc區的「效應物功能」。例示性的「效應物功能」包含C1q結合、CDC、Fc受體結合、ADCC 、吞噬作用、細胞表面受體(如B細胞受體；BCR)的負調節等。這些效應物功能通常要求Fc區與結合域(如抗體可變域)結合，且可使用如本文的定義中公開的各種測定來分析。
術語「宿主細胞(host cell)」、「宿主細胞株(host cell line)」、「共轉染細胞(co-transfected cell)」及「宿主細胞培養(host cell culture)」可互換使用，指已經導入外源核酸的細胞，包含這些細胞的子代。宿主細胞包含「轉形體(transformants)」、「轉形細胞(transformed cells)」其包含原代的轉形細胞(primary transformed cell)及其衍生的子代，且不考慮傳代數。子代在核酸含量上可與母代細胞不完全相同，而可能包含突變。本文中包含具有與在最初轉形的細胞中篩選或選擇的相同功能或生物活性的突變子代。於一些實施例中，宿主細胞或共轉染細胞為CHO-DXB11、 CHO-K1 或 CHO-DG44。這些宿主細胞或共轉染細胞為可藉由導入編碼牛磺酸轉運蛋白的DNA而得到之表現牛磺酸轉運蛋白的細胞(WO2007/119774)。
「人類抗體(human antibody)」為具有對應藉由人類或人類細胞所產生，或利用人類抗體資料庫或其他人類抗體編碼序列的非人類來源衍生的抗體的胺基酸序列者。人類抗體的定義特別排除包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。
「人類共同架構(human consensus framework)」為代表人類免疫球蛋白VL或VH架構序列的選擇中最常見的胺基酸殘基架構。一般來說，人類免疫球蛋白VH或VL序列的選擇係來自於可變域序列的亞群。一般來說，序列之亞群為如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest , Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中的亞群。於一個實施例中，對於VL，亞群係如同Kabat et al., supra 中的κ I亞群。於一實施例中，對於VH，亞群為如同Kabat et al., supra 中的III亞群。
「人源化(humanized)」抗體指的是包含來自非人類HVRs的胺基酸殘基及來自人類FRs的胺基酸殘基的嵌合抗體。於一些實施例中，人源化抗體將包含實質上全部的至少一個，通常為兩個可變域，其中所有或實質上所有HVRs(如CDRs)對應於非人類抗體，且所有或實質上所有FRs對應於人類抗體。人源化抗體選擇性地可包含至少一部分衍生自人類抗體的抗體恆定區。例如非人類抗體之抗體的「人源化形式」是指已經過人源化的抗體。
於本文中所使用的術語「高度變異區(hypervariable region)」或「HVR」是指抗體可變域在序列上為高度變異(「互補決定區」或「CDRs」)及/或形成結構上定義的環(「高度變異環」)及/或包含抗原接觸殘基(「抗原接觸」) 的各個區域。一般而言，抗體包含六個HVRs：三個在 VH (H1、H2、 H3)且三個在VL (L1、 L2、 L3)。本文中例示性的HVRs包括： (a)  存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、 50-52 (L2)、91-96 (L3)、 26-32 (H1)、53-55 (H2)及 96-101 (H3)的高度變異環 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196：901-917 (1987))； (b) 存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、 31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)的CDRs (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c)  存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、 30-35b (H1)、47-58 (H2)及 93-101 (H3)的抗原接觸(MacCallum et al.J. Mol. Biol. 262： 732-745 (1996))；且 (d) 包含HVR 胺基酸殘基 46-56 (L2)、 47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、 26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、及94-102 (H3)的(a)、(b)及/或(c)的結合。
除非特別指出，否則在本文中，HVR殘基及在可變域的其他殘基(如FR殘基)根據Kabat et al., supra .編號。
「免疫接合物(immunoconjugate)」為與包含但不限於細胞毒劑之一或多個異源的分子接合的抗體。
「個體(individual)」或「主體(subject)」 為哺乳類。哺乳類包含但不限於馴養動物(如牛、羊、貓、狗或馬)、靈長類(如人類或非人類靈長類，如猴子)、兔子及齧齒類(如小鼠及大鼠)。於某些實施例中個體或主體為人類。
「分離的(isolated)」抗體為已自其自然環境的組成分離的抗體。於一些實施例中，抗體被純化至藉由如電泳(如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細電泳)或層析(如離子交換或逆向HPLC)測定為大於95%或99%的純度。有關抗體純度測定的綜述見如Flatman et al.,J. Chromatogr. B 848：79-87 (2007)。
「分離的(isolated)」核酸為已自其自然環境的組成分離的的核酸分子。分離的核酸包含被包含在通常包含核酸分子的細胞中的核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或於與其自然染色體位置不同的染色體位置。
「編碼抗體之分離的核酸 (Isolated nucleic acid encoding an antibody)」是指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)的一個或多個核酸分子，包含在單一載體或分離載體的此類核酸分子，且存在於宿主細胞的一個或多個位置的此類核酸分子。
本文所使用術語「單株抗體(monoclonal antibody)」指取得自實質上同源的(homogeneous)抗體群的抗體，即除了可能的變異型抗體外包含相同的群體及/或結合相同的抗原決定位的個別抗體，可能的變異抗體為，例如含有自然發生的突變或在單株抗體製備過程期間產生者，變異一般以少量存在。相對於通常包含直接針對不同決定區(抗原決定位)的不同抗體的多株抗體的製備，單株抗體製備的各個單株抗體直接針對抗原上的單個決定區。因此，修飾詞「單株」指從實質上同源的抗體群獲得之抗體的特徵，且不被解釋為要求以任何特定方法來產生抗體。例如根據本發明所使用的單株抗體可藉由各種技術製得，包含但不侷限於融合瘤技術、重組DNA法、噬菌體顯示法(phage-display methods)及使用含有全部或部分人類免疫球蛋白基因座的轉基因動物的方法，製作單株抗體的這些方法及其他例示性方法在本文中描述。
「裸抗體(naked antibody)」是指未接合至異源部分(如細胞毒性部分)或同位素標識的抗體。裸抗體可存在於醫藥配方中。
「自然抗體(Native antibodies)」是指具有多種結構的自然存在之免疫球蛋白分子。例如自然IgG抗體為由以雙硫結合之兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成的大約150,000道爾吞之異源四聚醣蛋白(heterotetrameric glycoproteins)。從N末端到C末端，具有可變區(VH)的各重鏈，又稱為可變重域或重鏈可變域，後接三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。相似地，從N末端到C末端，具有可變區(VL) 各輕鏈，又稱為可變輕域或輕鏈可變域，後接一個恆定輕域(CL)。根據其恆定域的胺基酸序列，抗體的輕鏈可被分為稱為kappa (κ) 及 lambda (λ)兩個種類中之其一。
「自然序列Fc區(native sequence Fc region)」包含與自然界中發現的Fc區的胺基酸序列相同的胺基酸序列。自然序列人類Fc區包含自然序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)、自然序列人類IgG2 Fc區、自然序列人類IgG3 Fc區及自然序列人類IgG4 Fc區及其自然發生的變異。
術語「藥品仿單(package insert)」用於指習慣上包含於醫療產品的商業包裝中之說明書，其包含關於使用這種醫療產品的適應症、用法、劑量、給藥、聯合治療、禁忌症及/或警告的資訊。
相對於參考多肽序列的「胺基酸序列相同性百分比(%)(Percent (%) amino acid sequence identity)」被定義為在比對序列和在必要時引入間隙(gap) 以來達到最大的序列相同性百分比後，且不將任何保守取代(conservative substitution)視為序列相同性的部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分比。以判定胺基酸序列相同性百分比為目的的比對可以本領域技術範圍內的各種方式達成，例如，使用公眾可獲得的電腦軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co., Ltd.)。本技術領域具通常知識者可判定出用於比對序列的適當參數，包含在待比較的序列的全長內達成最大比對所需的任何演算法。
ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，且這些原始程序碼已隨用戶文件提交於美國著作權局(Washington D.C.，20559)，其註冊在美國著作權註冊編號TXU510087下。ALIGN-2程式可從Genentech, Inc., South San Francisco, California公開取得，或可自原始程序代碼編譯。ALIGN-2程式應被編譯以用於UNIX作業系統，包含數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定，且不變動。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比對的情況下，給定的胺基酸序列A比、及、相對於給定胺基酸序列B(其可替換地表達為具有或包含比、及、相對於給定的胺基酸序列B一特定胺基酸序列相同性%之給定的胺基酸序列A)的胺基酸序列相同性%如下計算： 100 乘以分式 X/Y 其中X為在A與B的程式比對中，藉由序列比對程式ALIGN-2評分(scored)為相同匹配(identical matches)的胺基酸殘基數目，而Y為B中胺基酸殘基的總數。可理解的是，當胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度時，A對B的胺基酸序列相同性%不會等於B對A的胺基酸序列相同性%。除非另有說明，否則本文使用的胺基酸序列相同性%的值皆係如前一段所述地利用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥配方(pharmaceutical formulation)」是指一種製備物，其處於允許包含於其中的活性成分的生物活性有效的此種形式，且其不包含對將要施用該配方的主體來說不可接受之毒性的附加組成。
「醫藥上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carrier)」是指除了活性成分之外，對主體沒有毒性之醫藥配方中的成分其。醫藥上可接受的載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文中所使用的術語「登革熱病毒E蛋白(DENV E protein)」除非另有指出，否則其是指來自包含DENV-1、 DENV-2、 DENV-3及 DENV-4之登革熱病毒血清型中之任一的任意自然登革熱病毒E蛋白。登革熱病毒基因體編碼三個結構蛋白(鞘蛋白(C )、前膜蛋白/膜蛋白(prM/M)和套膜蛋白(E))和七種非結構蛋白((NS1、 NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4B及 NS5)。為大約55kDa的醣蛋白之E蛋白在病毒顆粒成熟前與PrM蛋白作為異二聚體存在。E蛋白胞外域的X光晶體學研究已揭示藉由螺旋桿錨(helical stem anchor)連接至病毒膜的三個不同的β桶狀域(beta-barrel domains)及兩個反平行跨膜域(antiparallel transmembrane domains)。域III(EDIII) 採用免疫球蛋白樣折疊，並已被提出在受體相互作用中扮演關鍵性角色。域II(EDII)為由兩個長指樣結構(long finger-like structure)組成的伸長域(elongated domain)且在尖端包含高度保守的13個胺基酸融合環(EDII-FL)，且參與E蛋白的膜融合及二聚化。中央域(域I；EDI)為分別由一個和四個可彎曲的連接體連接至EDIII和EDII的九股β桶。E蛋白對於病毒組裝、受器附著、進入、病毒融合及在病毒的生命週期期間可能的免疫逃避相當重要，因此為動態蛋白質在病毒顆粒上採取幾種不同構象(conformation)和排列(arrangement)之所需。術語包含「全長(full-length)」未加工的登革熱病毒E蛋白以及由細胞中處理產生的任何形式的登革熱病毒E蛋白。該術語亦包含自然存在的登革熱病毒E蛋白變異，如血清型變異或類種(quasispecies)。
如本文所使用之術語「實質上減少(substantially decreased)」、「實質上增加(substantially increased)」或「實質上不同(substantially different)」是指兩個數值之間足夠高的差異 (通常相關於一個分子與另一個參考/比較分子相關)，使所屬技術領域中具有通常知識者將認為兩個值之間的差異為在藉由所述值(如Kd值)量測的生物學特性的背景中具有統計學上意義的差異。
本文所使用「治療(treatment)」(及文法上的變化如「treat」或「treating」)是指試圖改變被治療個體的自然進程之臨床上的干涉，且亦可執行以用於預防或在臨床病理過程中執行。治療的理想效果包含但不限於，防止疾病的發生或復發、症狀的減輕、減少疾病的任何直接或間接病理學結果、預防轉移、降低疾病進展速度、改善或緩解疾病狀態及緩解或改善預後。於一些實施例中，本發明的抗體被用於延遲疾病的發展或延緩疾病的進程。
術語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」是指牽涉到抗體結合至抗原的抗體重鏈或輕鏈的域。自然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，各域包含四個保守的(conserved)架構區(FRs)及三個高度變異區(HVRs)。(參見如： Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007))。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合的特異性。進一步地，結合到特定抗原的抗體可藉由使用來自結合該抗原的抗體的VH或VL域來分離，以分別篩選互補VL或VH的資料庫。參見如Portolano et al., J. Immunol. 150：880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352：624-628 (1991)。
「變異Fc區(variant Fc region)」包含藉由至少一個胺基酸修飾(改變)，較佳地為一個或多個胺基酸取代而不同於自然序列Fc區的胺基酸序列。較佳地，相較於自然序列Fc區或親代多肽(parent polypeptide)的Fc區，變異Fc區具有至少一個胺基酸的取代，例如大約一至大約十個胺基酸的取代及較佳為大約一至大約五個胺基酸的取代於自然序列Fc區或親代多肽的Fc區。本文之變異Fc區與自然序列Fc區及/或親代多肽的Fc區較佳地至少有約80%的同源性，且最佳為與其具有至少約90%的同源性，再更佳為至少約95%之同源性。
本文所使用術語「載體(vector)」是指能夠繁殖與其連接的另一個核酸的核酸分子。該術語包含做為自我複製核酸結構的載體以及併入到其以引入之宿主細胞的基因組的載體。某些載體能夠引導與其有效連結之核酸的表現。這些載體在本文中稱為「表現載體(expression vectors)」。
II. 組成與方法
於一個態樣中，本發明的一部分以抗登革熱病毒抗體及其用法為基礎。於一些實施例中，提供結合至登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白的抗體。本發明之抗體在登革熱病毒感染的診斷或治療上有用。
於一個態樣中，本發明的一部分以包含變異Fc區的多肽及其用法為基礎。於一些實施例中，提供具有實質上降低的FcγR結合活性之包含變異Fc區的多肽。於一些實施例中，提供無實質上降低的C1q結合活性之包含變異Fc區的多肽。於特定實施例中，本發明之多肽為抗體。本發明包含變異Fc區的多肽在病毒感染的診斷或治療上有用。
A. 例示性抗登革熱病毒抗體及包含變異Fc區的多肽
於一個態樣中，本發明提供結合至登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白之分離的抗體。於一些實施例中，抗登革熱病毒抗體阻斷登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合。於一些實施例中，抗登革熱病毒抗體抑制登革熱病毒進入宿主細胞。於一些實施例中，抗登革熱病毒抗體與整個登革熱病毒顆粒結合。於進一步的實施例中，抗體結合到整個登革熱病毒顆粒優於結合到單分子構造的登革熱病毒E蛋白。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體結合到及/或中和選自由登革熱病毒血清型1 (DENV-1)、 登革熱病毒血清型 2 (DENV-2)、登革熱病毒血清型 3 (DENV-3) 及登革熱病毒血清型 4 (DENV-4)所組成之群組中的至少一個、至少兩個、至少三個或四個所有登革熱病毒血清型。在一些實施例中，抗登革熱病毒抗體結合及/或中和衍生自選自由DENV-1、 DENV-2、 DENV-3 及DENV-4所組成之群組中至少一個、至少兩個、至少三個或四個所有登革熱病毒血清型的登革熱病毒E蛋白。「血清型(serotype)」指的是病毒種類中相異的變異。
於一個態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NOs： 11-12 中任一的胺基酸序列的HVR-H1；(b) 包含SEQ ID NOs： 13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包含SEQ ID NOs： 16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3；(d) 包含SEQ ID NOs： 21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1 ；(e) 包含SEQ ID NOs： 24-26中任一的胺基酸序列的HVR-L2；及 (f) 包含SEQ ID NOs： 27-30中任一的胺基酸序列的HVR-L3中的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NO：40 之胺基酸序列的HVR-H1；(b) 包含SEQ ID NO： 41之胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-H3；(d) 包含SEQ ID NO： 43之胺基酸序列的HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-L2；及 (f) 包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NO：12 之胺基酸序列的HVR-H1；(b) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3 ；(d) 包含SEQ ID NO： 23之胺基酸序列的HVR-L1；(e) 包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列的HVR-L2；及 (f) 包含SEQ ID NO： 30之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NO：12 之胺基酸序列的HVR-H1；(b) 包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2； (c) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3；(d) 包含SEQ ID NO： 21之胺基酸序列的HVR-L1；(e) 包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列的HVR-L2；及 (f) 包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NOs： 11-12中任一的胺基酸序列的HVR-H1； (b) 包含SEQ ID NOs：13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2；及 (c)包含 SEQ ID NOs：16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的抗體。於一個實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NOs： 16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3。於另一實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NOs：16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3及具有SEQ ID NOs：27-30中任一的胺基酸序列的HVR-L3。於進一步的實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NOs：16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3、具有SEQ ID NOs：27-30中任一的胺基酸序列的 HVR-L3及具有SEQ ID NOs：13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2 。於進一步的實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NOs：11-12 中任一的胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NOs：13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2；及 (c)包含SEQ ID NOs：16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H1；(b)SEQ ID NO： 41之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO： 42之胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的抗體。於一個實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-H3。於另一實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-H3及具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-L3。於進一步的實施例中，抗體包含具有SEQ ID NO：42之胺基酸序列的HVR-H3、具有SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-L3及具有 SEQ ID NO：41之胺基酸序列的HVR-H2。在進一步的實施例中，該抗體包含 (a)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：41中胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO： 42之胺基酸序列的HVR-H3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1；(b)SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的抗體。於一個實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H3。於另一實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3及具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L3。於另一實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3及具有SEQ ID NO： 27之胺基酸序列的HVR-L3。於進一步的實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3、具有SEQ ID NO：30之胺基酸序列的HVR-L3及具有SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2。於進一步的實施例中，該抗體包含具有SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3、具有SEQ ID NO：27之胺基酸序列的HVR-L3及具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2。於進一步的實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的HVR-H1(b)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列的HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列的HVR-H3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NOs：21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NOs：24-26中任一的胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NOs： 27-30中任一的胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的抗體。於一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NOs：21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NOs： 24-26中任一的胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NOs： 27-30中任一胺酸序列的 HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列的HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的抗體。於一個實施例中，該抗體包含(a) 包含SEQ ID NO： 43之胺基酸序列的HVR-L1； (b) 包含SEQ ID NO： 44之胺基酸序列的HVR-L2 ；及 (c) 包含SEQ ID NO： 45之胺基酸序列的HVR-L3 。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 包含SEQ ID NO： 23之胺基酸序列的HVR-L1 ； (b) 包含SEQ ID NO： 26之胺基酸序列的HVR-L2；及 (c) 包含SEQ ID NO： 30之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的抗體。於一個實施例中，該抗體包含 (a) 包含SEQ ID NO： 23之胺基酸序列的HVR-L1； (b)  包含SEQ ID NO： 26之胺基酸序列的HVR-L2 ；及 (c)包含SEQ ID NO： 30 之胺基酸序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明之抗體包含：(a)選自 (i) 包含SEQ ID NOs： 11-12中任一的胺基酸序列的HVR-H1、 (ii) 包含SEQ ID NOs： 13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2 、及 (iii) 包含SEQ ID NOs： 16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自 (i) 包含SEQ ID NOs： 21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1、(ii)包含 SEQ ID NOs： 24-26中任一的胺基酸序列的HVR-L2、及 (iii)包含SEQ ID NOs： 27-30中任一的胺基酸序列的 HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自 (i) 包含SEQ ID NO： 40之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO： 41之胺基酸序列的 HVR-H2、及(iii) 包含SEQ ID NO： 42之胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i)包含SEQ ID NO： 43之胺基酸序列的HVR-L1、(ii) 包含SEQ ID NO： 44之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii) 包含SEQ ID NO： 45之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i)包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列的HVR-H1、 (ii) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii)包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i) 包含SEQ ID NO： 23之胺基酸序列的HVR-L1、(ii) 包含SEQ ID NO： 26之胺基酸序列的HVR-L2、及(iii) 包含SEQ ID NO： 30之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i)包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列的HVR-H1、(ii) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2、及(iii) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i) 包含SEQ ID NO： 21之胺基酸序列的HVR-L1 、 (ii) 包含SEQ ID NO： 24之胺基酸序列的HVR-L2 、及(iii) 包含SEQ ID NO： 27之胺基酸序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 包含SEQ ID NOs： 11-12中任一的胺基酸序列的HVR-H1； (b)包含 NOs： 13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2； (c)包含SEQ ID NOs： 16-20中任一的胺基酸序列的 HVR-H3；(d) 包含SEQ ID NOs： 21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1 ； (e)包含SEQ ID NOs： 24-26 中任一的胺基酸序列的HVR-L2 ；及 (f) 包含SEQ ID NOs： 27-30中任一的胺基酸序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 包含SEQ ID NO： 40之胺基酸序列的HVR-H1； (b) 包含SEQ ID NO： 41之胺基酸序列的HVR-H2 ； (c) 包含SEQ ID NO： 42之胺基酸序列的HVR-H3； (d) 包含SEQ ID NO： 43之胺基酸序列的HVR-L1 ；(e) 包含SEQ ID NO： 44之胺基酸序列的 HVR-L2 ；及(f) 包含SEQ ID NO： 45之胺基酸序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列的HVR-H1 ； (b) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2 ； (c) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3； (d) 包含SEQ ID NO： 23之胺基酸序列的HVR-L1； (e)包含SEQ ID NO： 26 之胺基酸序列的HVR-L2 ；及(f) 包含SEQ ID NO： 30之胺基酸序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列的HVR-H1；(b) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2 ； (c) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3 ；(d) 包含SEQ ID NO： 21之胺基酸序列的HVR-L1； (e) 包含SEQ ID NO： 24之胺基酸序列的HVR-L2 ；及 (f) 包含SEQ ID NO： 27之胺基酸序列的HVR-L3。
於某些實施例中，如以上提供的抗登革熱病毒抗體的任一或多個胺基酸在以下HVR位置被取代： (a) 在 HVR-H1 (SEQ ID NO： 11)中，於位置2及4； (b) 在HVR-H2 (SEQ ID NO： 13) 中，於位置9及10；；(c)在HVR-H3 (SEQ ID NO： 16) 中，於位置3、14及 16；(d) 在HVR-L1 (SEQ ID NO： 21) 中，於位置5及8； (e) 在HVR-L2 (SEQ ID NO：24) 中，於位置4及 7；及 (f) 在 HVR-L3 (SEQ ID NO：27) 中，於位置4及 5。
於某些實施例中，如本文所提供的，抗登革熱病毒抗體的一個或多個胺基酸取代為保守取代(conservative substitutions)。於某些實施例中，下列取代的任一或多個可以任意組合進行： (a) 在 HVR-H1 (SEQ ID NO： 11)， N2Y； I4M； (b)在 HVR-H2 (SEQ ID NO： 13)，T9R；A10R； (c)  在HVR-H3 (SEQ ID NO： 16)，R3E； R14F； G16D或 L； (d)在 HVR-L1 (SEQ ID NO： 21)， D5E； K8Q； (e)在HVR-L2 (SEQ ID NO： 24)， N4E；T7F；及(f)在HVR-L3 (SEQ ID NO： 27)， D4S或 E； D5A。
上述取代之所有可能之組合分別由HVR-H1、HVR-H2、 HVR-H3、 HVR-L1、HVR-L2及 HVR-L3之SEQ ID NOs： 40、 41、 42、 43、44及45的共同序列涵蓋。
於進一步的實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體並不是包含(i) 包含SEQ ID NO： 11之胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含SEQ ID NO： 13之胺基酸序列的HVR-H2、(iii) 包含SEQ ID NO： 16之胺基酸序列的HVR-H3、(iv) 包含SEQ ID NO： 21之胺基酸序列的HVR-L1、(v)包含SEQ ID NO： 24之胺基酸序列的HVR-L2以及(vi)包含SEQ ID NO： 27之胺基酸序列的HVR-L3 的抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a)來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1；(b) 來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H2；(c) 來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3；(d) 來自 SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的 HVR-L1；(e) 來自 SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L2；及(f)來自 SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L3中的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1；(b) 來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2 ；(c)來自 SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H3；(d)來自SEQ ID NOs：7中任一的VL序列的 HVR-L1；(e) 來自SEQ ID NOs：7中任一的VL序列的HVR-L2；及(f) 來自SEQ ID NOs：7中任一的VL序列的HVR-L3中的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a)來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1；(b) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H2 ；(c) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3；(d) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1；(e) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2；及(f) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L3中的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1； (b) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2 ； (c) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3；(d) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1；(e) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2；及 (f) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3中的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個HVR的抗登革熱病毒抗體。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1； (b) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2 ；及(c) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的抗體。於一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的VR-H3 。於另一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3及來自SEQ ID NOs： 8-10 中任一的VL序列的 HVR-L3。於另一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H3及來自SEQ ID NOs： 7 中任一的VL序列的HVR-L3。於進一步的實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3、來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的 HVR-L3及來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2 。於進一步的實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3、來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L3 及來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H2。於進一步的實施例中，該抗體包含 (a) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1；(b)來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H2 ；及(c) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3。
於一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1； (b)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H2；及 (c)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的抗體。於一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3。 於另一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3及來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L3。於另一實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H3及來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3。於進一步的實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3、來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L3 及來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H2。於進一步的實施例中，該抗體包含來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3、來自SEQ ID NO： 7 之VL序列的HVR-L3 及來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H2 。於進一步的實施例中，該抗體包含(a) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1 ；(b)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H2；及 (c)來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L1；(b) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L2；及(c) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的 HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的抗體。於一實施例中，該抗體包含(a)來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L1；(b)來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L2；及(c)來自SEQ ID NOs： 8-10 中任一的VL序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供包含選自(a) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1；(b) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2；及(c)來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的抗體。於一實施例中，該抗體包含(a) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1 ； (b) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2 ；及 (c) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i)來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H1、(ii)來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H2 、及(iii) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i)來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L1、(ii) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L2、及(iii) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1、 (ii) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2、及(iii) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及(b)包含選自(i)來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L1、(ii) 來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L2、及(iii)來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i)來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H1、 (ii)來自SEQ ID NO： 6之VH序列的 HVR-H2、及 (iii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1、(ii) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2 、及 (iii) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含選自(i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1、 (ii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2，且 (iii) 來自SEQ ID NO： 6中VH序列的HVR-H3中之至少一個、至少二個或所有三個VH HVR序列的VH域；及 (b)包含選自(i) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1、 (ii) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2、及 (iii) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3中之至少一個、至少二個或所有三個VL HVR序列的VL域。
於另一態樣中，本發明之抗體包含(a)來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的 HVR-H1； (b) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2；(c) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3； (d) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L1；(e) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L2；及(f) 來自SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H1； (b) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H2； (c) 來自SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列的HVR-H3；(d) 來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L1； (e) 來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L2；及(f) 來自SEQ ID NOs： 7中任一的VL序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1； (b) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2；(c) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3；(d) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1；(e) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2；及 (f) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L3。
於另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1；(b)來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2；(c) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3； (d) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1； (e) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2；及 (f)來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3。
於進一步的實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體並不是包含(i)來自SEQ ID NO： 1 之VH序列的HVR-H1 、(ii) 來自SEQ ID NO： 1之VH序列的HVR-H2 、 (iii)來自SEQ ID NO： 1 之VH序列的HVR-H3、(iv) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1、(v) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2、及 (vi) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3的抗體。
於任何上述實施例中，抗登革熱病毒抗體可被人源化。於一實施例中，抗登革熱病毒抗體包含如上述任何實施例的HVRs，且進一步包含受體人類架構，如人類免疫球蛋白架構或人類共同架構。於另一實施例中，抗登革熱病毒抗體包含如上述任何實施例的HVRs，且進一步包含具有FR序列的VH或VL。於進一步的實施例中，該抗登革熱病毒抗體包含下列重鏈及/或輕鏈可變域FR序列。對於重鏈可變域，FR1包含SEQ ID NO： 31的胺基酸序列、FR2包含SEQ ID NO： 32的胺基酸序列、FR3包含SEQ ID NO： 33或34的胺基酸序列、FR4包含SEQ ID NO： 35的胺基酸序列。對於輕鏈可變域，FR1包含SEQ ID NO： 36的胺基酸序列、FR2包含SEQ ID NO： 37的胺基酸序列、FR3包含SEQ ID NO： 38的胺基酸序列、FR4包含SEQ ID NO： 39的胺基酸序列。
於另一態樣中，抗登革熱病毒抗體包含重鏈可變域(VH)序列，其具有與SEQ ID NOs： 2-6中任一的胺基酸序列至少90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或 100%相同的序列。於一些實施例中，相對於參考序列，具有至少90%、 91%、 92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%或 99%相同的VH序列具有取代(如保守取代)、插入或刪除，但抗登革熱病毒抗體包含保有結合至登革熱病毒能力的序列。於某些實施例中，於SEQ ID NOs： 2-6中的任一個中，全部的1至10個胺基酸已被取代、插入及/或刪除。於某些實施例中，取代、插入或刪除發生在HVRs外的區域中(即在FR中)。選擇性地，抗登革熱病毒抗體包含在SEQ ID NOs： 2-6中任一的VH序列，包含該序列的轉譯後修飾。在特定的實施例中，該VH包含選自： (a) 包含SEQ ID NOs： 11-12中任一的胺基酸序列的HVR-H1 、 (b) 包含SEQ ID NOs： 13-15中任一的胺基酸序列的HVR-H2 、及 (c) 包含SEQ ID NOs： 16-20中任一的胺基酸序列的HVR-H3的一個、兩個或三個HVR。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N末端中的麩醯胺酸(glutamine)或麩胺酸鹽(glutamate)藉由焦麩胺化作用(pyroglutamylation)修飾成焦麩胺酸(pyroglutamic acid)。
於另一態樣中，抗登革熱病毒抗體包含重鏈可變域(VH)序列，其具有與SEQ ID NO： 6的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%相同的序列。於某些實施例中，相對於參考序列，具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的VH序列具有取代(如保守取代)、插入或刪除，但抗登革熱病毒抗體包含保有結合至登革熱病毒能力的序列。於某些實施例中，於SEQ ID NOs： 6中全部的1至10個胺基酸已被取代、插入及/或刪除。於某些實施例中，取代、插入或刪除發生在HVRs外的區域中(即在FR中)。選擇性地，抗登革熱病毒抗體包含SEQ ID NOs： 6中的VH序列，包含該序列的轉譯後修飾。在特定的實施例中，該VH包含選自： (a) 包含SEQ ID NO： 12之胺基酸序列的HVR-H1 、 (b) 包含SEQ ID NO： 15之胺基酸序列的HVR-H2 、及 (c) 包含SEQ ID NO： 20之胺基酸序列的HVR-H3的一個、兩個或三個HVR。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N端中的麩醯胺酸或麩胺酸鹽藉由焦麩胺化作用修飾成焦麩胺酸。
於另一態樣中，提供一種抗登革熱病毒抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域(VL)序列，該輕鏈可變域序列具有與SEQ ID NO： 8-10的任一的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%相同的序列。於某些實施例中，相對於參考序列，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的VL序列具有取代(如保守取代)、插入或刪除，但抗登革熱病毒抗體包含保有結合至登革熱病毒能力的序列。於某些實施例中，於SEQ ID NOs： 8-10的任一個中，全部的1至10個胺基酸已被取代、插入及/或刪除。於某些實施例中，取代、插入或刪除發生在HVRs外的區域中(即在FR中)。選擇性地，抗登革熱病毒抗體包含在SEQ ID NOs： 8-10中任一的VL序列，包含該序列的轉譯後修飾。在特定的實施例中，該VL包含選自： (a) 包含SEQ ID NOs： 21-23中任一的胺基酸序列的HVR-L1、 (b) 包含SEQ ID NOs： 24-26中任一的胺基酸序列的HVR-L2 、及 (c) 包含SEQ ID NOs：27-30中任一的胺基酸序列的HVR-L3的一個、兩個或三個HVR。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N端中的麩醯胺酸或麩胺酸鹽藉由焦麩胺化作用修飾成焦麩胺酸。
於另一態樣中，提供一種抗登革熱病毒抗體，其中該抗體包含輕鏈可變域(VL)序列，該輕鏈可變域序列具有與SEQ ID NO： 10之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%相同的序列。於某些實施例中，相對於參考序列，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的VL序列具有取代(如保守取代)、插入或刪除，但抗登革熱病毒抗體包含保有結合至登革熱病毒能力的序列。於某些實施例中，於SEQ ID NOs： 10中全部的1至10個胺基酸已被取代、插入及/或刪除。於某些實施例中，取代、插入或刪除發生在HVRs外的區域中(即在FR中)。選擇性地，抗登革熱病毒抗體包含在SEQ ID NOs： 10中的VL序列，包含該序列的轉譯後修飾。在特定的實施例中，該VL包含選自：(a) 包含SEQ ID NOs： 23之胺基酸序列的HVR-L1、(b) 包含SEQ ID NOs： 26之胺基酸序列的HVR-L2 、及 (c) 包含SEQ ID NOs： 30之胺基酸序列的HVR-L3。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N端中的麩醯胺酸或麩胺酸鹽藉由焦麩胺化作用修飾成焦麩胺酸。
於另一態樣中，提供一種抗登革熱病毒抗體，其中該抗體包含如在上述任何實施例中所提供的VH及如在上述任何實施例中所提供的VL。在一實施例中，該抗體分別包含在SEQ ID NOs： 2-6中任一及在SEQ ID NOs： 8-10中任一的VH及VL序列，包含這些序列的轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含在SEQ ID NOs： 2-6中任一及在SEQ ID NOs： 7中任一的VH及VL序列，包含這些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N端中的麩醯胺酸或麩胺酸鹽藉由焦麩胺化作用修飾成焦麩胺酸。
於另一態樣中，提供一種抗登革熱病毒抗體，其中該抗體包含如在上述任何實施例中所提供的VH及如在上述任何實施例中所提供的VL。在一實施例中，該抗體分別包含在SEQ ID NOs： 6及在SEQ ID NOs： 10中的VH及VL序列，包含這些序列的轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體分別包含在SEQ ID NOs： 6及在SEQ ID NOs： 7中的VH及VL序列，包含這些序列的轉譯後修飾。轉譯後修飾包含但不侷限於重鏈或輕鏈的N端中的麩醯胺酸或麩胺酸鹽藉由焦麩胺化作用修飾成焦麩胺酸。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其結合到與本文提供的抗登革熱病毒抗體相同的抗原決定位。於某些實施中，提供一種抗體，該抗體結合到包含選自由DENV-2 E蛋白上的G100、W101、K122、 I162、 S274、K310、W391及 F392所組成之群組中的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或所有胺基酸的抗原決定位。於某些實施中，提供一種抗體，該抗體結合到包含選自由DENV-2 E蛋白上的K122、 I162及S274所組成之群組中的至少一個、至少兩個或所有胺基酸的抗原決定位。於某些實施中，提供與抗原決定位結合的抗體，其中當抗原決定位包含選自由K122、 I162及S274所組成之群組的至少一個、至少兩個或所有胺基酸時，該抗原決定位進一步包含選自由G100、W101、K310、 W391、及F392所組成的群組的至少一個胺基酸。
於本發明進一步的態樣中，根據上述任一實施例之抗登革熱病毒抗體為單株抗體，包含嵌合性、人源化或人類抗體。在一個實施例中，抗登革熱病毒抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、 雙功能抗體(diabody)或 F(ab')2 片段。於另一實施例中，抗體為全長抗體，例如完整的IgG1抗體或如本文所描述之其他抗體類別或異構型。
於進一步的態樣中，本發明之抗登革熱病毒抗體可具有消除抗體與Fc-γ-受體(FcγR)結合的修飾。不希望受到理論的束縛，消除抗體與Fc-γ-受體(FcγR)結合的修飾可為有利的，因為減少抗體結合至FcR可避免感染的ADE(抗體依賴性增強)現象，ADE現象被認為主要係由與FcR的交互作用所介導。在一實施例中，本發明的抗登革熱病毒抗體之Fc區包含根據EU編號於位置234的Ala和於位置235的Ala。
在進一步的態樣中，根據任一上述實施例的抗登革熱病毒抗體可單獨或組合的整合如以下1-7部分中所述的任意特徵：
1.抗體親和力
於某些實施例中，本文所提供的抗體具有的解離常數(Kd)為1μM 或更少、100 nM或更少、10 nM或更少、1 nM或更少、 0.1 nM 或更少、 0.01 nM 或更少或 0.001 nM或更少(例如10-8 M或更少，例如從10-8 M 至10-13 M，例如從 10-9 M至10-13 M)。
於一個實施例中，Kd係藉由放射性標定的抗原結合檢測 (RIA)所測量。於一個實施例中，RIA係利用感興趣抗體之Fab型式及其抗原進行。例如Fabs對抗原的溶液結合親和力係藉在未標定抗原滴定系列的存在下，以最小濃度的(125 I)-標定抗原平衡Fab，之後以抗-Fab抗體-塗布盤擷取結合的抗原(參見如Chen et al., J. Mol. Biol. 293：865-881(1999))。為建立檢測條件，將MICROTITER (註冊商標)的多孔盤 (Thermo Scientific)以50 mM 碳酸鈉(pH 9.6)中5 μg/ml 的擷取抗Fab抗體(capturing anti-Fab antibody, Cappel Labs)塗布隔夜，之後以PBS中2% (w/v)的胎牛血清在室溫下(大約23度C)進行2至5小時的阻斷(blocked)。於非吸附盤(Nunc #269620)中，將100 pM 或 26 pM [125 I]-抗原與序列稀釋(serial dilutions)的感興趣之 Fab (例如與在Presta et al., Cancer Res. 57：4593-4599 (1997)中的抗-VEGF抗體，Fab-12，的評估一致) 混合。接著將感興趣之Fab培養隔夜，然而培養可持續一段長的時間(例如大約65小時)來確保達到平衡。此後，混合物轉移到擷取盤以在室溫下培養(例如1小時)。之後將溶液移除，且將盤以PBS中的0.1%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20 (註冊商標))清洗八次。當盤乾燥後，加入150μl/孔的閃爍體(scintillant) (MICROSCINT-20 TM； Packard)並將盤以TOPCOUNTTM伽瑪計數器 (Packard)計數10分鐘。選擇給出少於或等於20%的最大結合的各Fab濃度用於競爭結合檢測。
根據另一實施例， 使用BIACORE (註冊商標) 表面電漿子共振儀分析來檢測Kd。例如藉由以~10反應單位(response units, RU)固定抗原的CM5晶片，在25度C下執行使用BIACORE (註冊商標)-2000或 BIACORE(註冊商標)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)的分析。在一實施例中，根據供應商的指示，以N -乙基-N’ - (3- 二甲胺丙基)- 碳二亞胺鹽酸鹽(N -ethyl-N’ - (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride, EDC) 及N -羥基琥珀醯亞胺(N -hydroxysuccinimide, NHS)激活羧甲基葡聚糖生物感測晶片(carboxymethylated dextran biosensor chips, CM5, BIACORE, Inc.)。抗原在以5 µl/分鐘的流速注入前以pH 4.8的10mM的醋酸鈉稀釋成5 µg/ml (~0.2 µM)，以達到大約10反應單位(RU) 的耦合蛋白。注射抗原後，注入1M乙醇胺以阻斷未反應組(group)。對於動力學的測定，將兩倍序列稀釋的Fab(0.78 nM 至 500 nM)在25度C下，以大約25 µl/分鐘的流速注入於含有0.05%聚山梨醇酯20 (TWEEN-20TM )介面活性劑 (PBST)的PBS。使用簡易一對一朗繆爾(Langmuir)結合模式 (BIACORE (註冊商標)評估軟體版本3.2)，藉由同時擬合(fitting)結合與分解傳感圖來計算結合率(kon )及解離率(koff )。將平衡解離常數(Kd)計算為比值koff /kon 。參照如Chen et al., J. Mol. Biol. 293：865-881 (1999)。若藉由上述表面電漿子共振檢測得到結合率超過106 M-1 s-1 ，則結合率可藉由使用螢光淬滅技術來判定，其在25度C的pH 7.2的PBS中之20nM抗-抗原抗體(Fab型態)中測量螢光發射強度的增加或減少(激發 = 295 nm； 發光 = 340 nm，16 nm 帶通(band-pass))的，當在以例如配備了斷流(stop-flow)裝置的分光計(Aviv Instruments)或具攪拌比色管(stirred cuvette)之8000系列SLM-AMINCOTM分光計(ThermoSpectronic)之分光計中測量時出現增加濃度的抗原情況下。
2. 抗體片段
在一些實施例中，本文所提供的抗體為抗體片段。抗體片段包含但不侷限於Fab、Fab'、 Fab'-SH、 F(ab')2 、 Fv及 scFv 片段，以及下述的其他片段。一些抗體片段的綜述可參照Hudson et al.Nat. Med. 9：129-134 (2003)。ScFv片段的綜述，參照如Pluckthün, inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)； 亦見於WO 93/16185；及美國專利案Nos. 5,571,894 及 5,587,458。對於包含挽救(salvage)受體結合抗原決定位殘基且具有增加之體內半衰期的Fab和 F(ab')2 的討論，參見美國專利案No. 5,869,046。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位的抗體片段，其可為雙價或雙特異性。參見例如EP 404,097； WO 1993/01161； Hudson et al., Nat. Med. 9：129-134 (2003)；及 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 6444-6448 (1993)。三功能抗體(triabodies)及四功能抗體(tetrabodies)亦描述於Hudson et al., Nat. Med. 9：129-134 (2003)。
單域抗體(Single-domain antibodies)為包含抗體的所有或一部分的重鏈可變域或所有或一部分的輕鏈可變域的抗體片段。於一些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利案No. 6,248,516 B1)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包含但不侷限於如本文所述之完整抗體的蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(如大腸桿菌或嗜菌體)的製造。
3. 嵌合及人源化抗體
於一些實施例中，本文所提供的抗體為嵌合抗體。一些嵌合抗體被描述於，如美國專利案No. 4,816,567；及 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81：6851-6855 (1984))。於一個例子中，嵌合抗體包含非人類可變區(如衍生自小鼠、大鼠、倉鼠、兔子或非人類靈長類如猴子的可變區)及人類恆定區。在進一步的例子中，嵌合抗體是一種「類別轉換(class switched)」抗體，其類別或子類已自親代抗體改變。嵌合抗體包含其抗原-結合片段。
在一些實施例中，嵌合抗體為人源化抗體。通常非人類抗體藉由人源化來降低對人類的免疫反應，同時保留親代非人類抗體的特異性和親和力。通常人源化抗體包含一個或多個可變域，其中HVRs，例如CDRs(或其部分)衍生自非人類抗體，且FRs(或其部分)衍生自人類抗體序列。選擇性地，人源化抗體將亦包含至少一部分人類恆定區。於一些實施例，在人源化抗體的一些FR殘基被來自非人類抗體(例如HVR殘基自其衍生的抗體)的相應殘基取代，以例如，回復或改善抗體的特異性或親和力。
人源化抗體及其製造方法綜述於，例如 Almagro and Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)，且進一步論述於，例如Riechmann et al.,Nature 332：323-329 (1988)；Queen et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86：10029-10033 (1989)；美國專利案Nos. 5, 821,337、7,527,791、 6,982,321及 7,087,409；Kashmiri et al., Methods 36：25-34 (2005) (描述特異性決定區域(SDR)移接(grafting))；Padlan,Mol. Immunol . 28：489-498 (1991) (描述「表面重塑(resurfacing)」)；Dall’Acqua et al.,Methods 36：43-60 (2005) (描述 「FR改組(FR shuffling)」)；及 Osbourn et al.,Methods 36：61-68 (2005) 及 Klimka et al., Br.J. Cancer, 83：252-260 (2000) (描述FR改組的「導向選擇(guided selection)」方法)。
可用於人源化的人類架構區包含但不侷限於：使用「最適合(best-fit)」方法選擇的架構區(參見如 Sims et al.J. Immunol. 151：2296 (1993))； 衍生自特定子群的輕或重鏈可變區的人類抗體的共同序列的架構區(參見如Carter et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285 (1992)；及 Presta et al.  J. Immunol., 151：2623 (1993))；人類成熟 (體細胞突變) 架構區或人類生殖架構區( germline framework)(參見如 Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13：1619-1633 (2008))；及衍生自篩選FR資料庫的架構區(參見如 Baca et al.,J. Biol. Chem . 272：10678-10684 (1997) 及 Rosok et al.,J. Biol. Chem. 271：22611-22618 (1996))。
4. 人類抗體
於一些實施例中，本發明所提供的抗體為人類抗體。人類抗體可使用本領域習知的各種技術生產。人類抗體大致描述於van Dijk and van de Winkel,Curr. Opin. Pharmacol. 5： 368-74 (2001)及 Lonberg,Curr. Opin. Immunol. 20：450-459 (2008)。
人類抗體可準備藉由將免疫原施予已被修飾以應抗原刺激生產完整的人類抗體或以具有人類可變區的完整抗體的轉基因動物。這些動物通常包含所有或部分人類免疫球蛋白基因座，其取代內生性免疫球蛋白基因座或其在染色體外存在或隨機整合到動物染色體中。在這些轉基因小鼠中，內生性免疫球蛋白基因座通常已經失活。從轉基因動物得到人類抗體的方法的綜述，參見Lonberg,Nat. Biotech. 23：1117-1125 (2005)。亦可見於，例如描述 XENOMOUSETM 技術之美國專利案Nos. 6,075,181 及 6,150,584；描述 HUMAB (註冊商標)技術之美國專利案No. 5,770,429；描述 K-M MOUSE (註冊商標)之技術美國專利案No. 7,041,870及描述VELOCIMOUSE (註冊商標) 技術)之美國專利申請案No. US 2007/0061900。來自由這些動物產生的完整抗體之人類可變區可進一步修飾，例如藉由與不同的人類恆定區結合。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤的方法製得。已有人類骨隨瘤與小鼠-人類異源骨隨瘤細胞株(mouse-human heteromyeloma cell lines)用於生產人類單株抗體的描述。(參見如 KozborJ. Immunol. , 133：3001 (1984)； Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及 Boerner et al.,J. Immunol ., 147： 86 (1991)) 。藉由人類B細胞雜交瘤(hybridoma)技術產生的人類抗體亦描述於Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 103：3557-3562 (2006)。其他方法包含描述於以下文獻的方法，例如， 美國專利案No. 7,189,826 (描述從融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體) 及 Ni,Xiandai Mianyixue , 26(4)：265-268 (2006) (描述人類-人類融合瘤)。人類融合瘤技術 (三瘤技術(Trioma technology)) 亦描述於 Vollmers and Brandlein,Histology and Histopathology , 20(3)：927-937 (2005) 及 Vollmers and Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology , 27(3)：185-91 (2005)。
人類抗體亦可藉由分離選自自人類-嗜菌體顯示資料庫衍生的Fv株可變域序列(Fv clone variable domain sequences)生成。這些可變域序列之後可與期望的人類恆定區結合。從抗體資料庫選擇人類抗體的技術描述如下。
5. 自資料庫衍生的抗體
可藉由於組合資料庫篩選所期望的一或多種活性的抗體而分離本發明之抗體。例如，用於產生嗜菌體顯示資料庫並於此資料庫中篩選具有所期望的結合特性的抗體之各種方法已為本領域所習知。這些方法綜述於例如Hoogenboom et al. inMethods in Molecular Biology 178：1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 且進一步描述於，例如 McCafferty et al.,Nature 348：552-554；Clackson et al.,Nature 352： 624-628 (1991)； Marks et al.,J. Mol. Biol. 222： 581-597 (1992)；Marks and Bradbury, inMethods in Molecular Biology 248：161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)；Sidhu et al.,J. Mol. Biol. 338(2)： 299-310 (2004)； Lee et al.,J. Mol. Biol. 340(5)： 1073-1093 (2004)；Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34)： 12467-12472 (2004)；及 Lee et al.,J. Immunol. Methods 284(1-2)： 119-132(2004)。
在一些嗜菌體顯示方法中，VH和VL基因的庫(repertoires)係藉由聚合酶連鎖反應(PCR)分別選殖，並隨機重組於嗜菌體資料庫中，其後可如Winter et al.,Ann. Rev. Immunol. , 12： 433-455 (1994)所述地篩選抗原結合嗜菌體。嗜菌體通常顯示為單鏈Fv(scFv)片段或為Fab片段的抗體片段。來自免疫原的資料庫不需要建構融合瘤即可提供對免疫原高親和力的抗體。或者，可選殖(cloned)(例如自人類)自然庫(naive repertoire)以在沒有任何免疫作用的情況下提供單一來源的抗體給大範圍的非自身和自身抗原，如Griffiths et al.,EMBO J, 12： 725-734 (1993)所述的。最後也可藉由自幹細胞選殖未重排的V基因片段，並利用具有隨機序列的PCR引子來編碼高度變異性CDR3區，以達到體外重排來合成製得自然資料庫，如Hoogenboom and Winter,J. Mol. Biol. , 227： 381-388 (1992)中所述的。描述人類抗體嗜菌體資料庫的專利公開包含例如：美國專利案No. 5,750,373及美國專利公開案Nos. 2005/0079574、 2005/0119455、 2005/0266000、 2007/0117126、2007/0160598、 2007/0237764、 2007/0292936及 2009/0002360。
自人類抗體資料庫分離的抗體或抗體片段在本文中被認為是人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在一些實施例中，本發明所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係為對於至少兩個不同的位置具有結合特異性的單株抗體。在一些實施例中，其中一個結合特異性是對於登革熱病毒E蛋白，另一個是對於任何其他抗原。在一些實施例中，雙特異性抗體可結合到登革熱病毒E蛋白的兩個不同的抗原決定位。雙特異性抗體亦可被用於將細胞毒劑定位在表達登革熱病毒E蛋白的細胞。雙特異性抗體可被製備為全長抗體或抗體片段。
製造多特異性抗體的技術包含但不侷限於，具有不同特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的重組共表達(co-expression)(參見Milstein and Cuello,Nature 305： 537 (1983)), WO 93/08829及Traunecker et al.,EMBO J. 10： 3655 (1991))，及杵臼結構基因工程(knob-in-hole engineering)(參見美國專利案No. 5,731,168)。多特異性抗體亦可藉由以下方法製造：工程改造(engineering)用於製備抗體Fc-異二聚分子(WO 2009/089004A1)的靜電導向效應(electrostatic steering effects)；交聯兩個或多個抗體或片段 (參見如美國專利案No. 4,676,980及 Brennan et al., Science , 229： 81 (1985))；使用白胺酸拉鏈(leucine zippers)來製造雙特異性抗體 (參見如Kostelny et al.,J. Immunol. , 148(5)：1547-1553 (1992))； 使用「雙功能抗體」 技術來製作雙特異性抗體片段 (參見如 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 90：6444-6448 (1993))；及使用單鏈Fv (scFv)雙體 (參見如 Gruber et al., J. Immunol. , 152：5368 (1994))；及如Tutt et al.J. Immunol. 147： 60 (1991)所述地製備三特異性抗體。
本文亦包含具有三個或多個功能性抗原結合位的工程改造抗體，包含「章魚抗體(Octopus antibodies)」(參見如US 2006/0025576A1)。
本文所述的抗體或片段亦包含「雙重作用Fab(Dual Acting Fab)」或「DAF」，其具有結合到登革熱病毒E蛋白以及其他不同抗原的抗原結合位(參見如US 2008/0069820)。
7. 抗體變異
於一些實施例中，可預期本文所提供的抗體之胺基酸序列變異。例如改善抗體的結合親和力及/或其他生物特性可為理想的。抗體的胺基酸序列變異可藉由將適當的修飾導入至編碼該抗體的核苷酸序列來或藉由胜肽合成來製得。這些修飾包含，例如抗體的胺基酸序列中殘基的刪除及/或插入及/或取代。可進行任何刪除、插入及取代的組合以得到最終建構，提供具有期望的特性例如抗原結合的最終建構。
a)取代、插入及刪除變異
在一些實施例中，提供具有一個或多個胺基酸取代的抗體變異。取代誘變感興趣的位置包含HVRs及FRs。保守取代示於下表1標題為「較佳地取代」下。更實質的變化提供於表1標題「例示性取代」下，且參照胺基酸側鏈類別進一步描述於下。胺基酸取代可被引入感興趣的抗體中，並篩選具有期望的活性，如保留/改善抗原結合、降低免疫反應或改善ADCC或CDC的產物。
表1
原始殘基 例示性取代 較佳地取代
Ala (A) Val； Leu； Ile Val
Arg (R) Lys； Gln； Asn Lys
Asn (N) Gln； His； Asp, Lys； Arg Gln
Asp (D) Glu； Asn Glu
Cys (C) Ser； Ala Ser
Gln (Q) Asn； Glu Asn
Glu (E) Asp； Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn； Gln； Lys； Arg Arg
Ile (I) Leu； Val； Met； Ala； Phe； Norleucine Leu
Leu (L) Norleucine； Ile； Val； Met； Ala； Phe Ile
Lys (K) Arg； Gln； Asn Arg
Met (M) Leu； Phe； Ile Leu
Phe (F) Trp； Leu； Val； Ile； Ala； Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val； Ser Ser
Trp (W) Tyr； Phe Tyr
Tyr (Y) Trp； Phe； Thr； Ser Phe
Val (V) Ile； Leu； Met； Phe； Ala； Norleucine Leu
胺基酸可根據共同的(commmon)側鏈的特性分組： (1)  疏水性： 正白胺酸(Norleucine)、Met、 Ala、 Val、 Leu、Ile； (2)  中性親水性： Cys、 Ser、 Thr、 Asn、 Gln； (3)  酸性： Asp、 Glu； (4)  鹼性： His、 Lys、 Arg； (5)  影響鏈定向的殘基： Gly、 Pro； (6)  芳香族： Trp、 Tyr、 Phe。
非保守取代意味著將使其中一個類別的成員與另一個類別交換。
一個型態的取代變異涉及取代親代抗體(例如人源化或人類抗體)的一個或多個高度變異區殘基。通常，選擇用於進一步研究的所得變異將相對於親代抗體具有某些生物特性(例如增加親和力、降低免疫反應)的修飾(例如改善)及/或將具有實質上保留的一些親代抗體的生物特性。例示性取代變異是親和力成熟的抗體，其可例如使用本文所述那些基於噬菌體顯示的親和力成熟技術而方便地生成。簡而言之，將一個或多個HVR殘基突變，並將變異抗體顯示在噬菌體上並針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVRs中進行改變(如取代)，以例如改善抗體親和力。這些改變可在HVRs的「熱點(hotspots)」中進行，即由在體細胞成熟過程中以高頻率進行突變的密碼子編碼的殘基(參見如Chowdhury,Methods Mol. Biol. 207：179-196 (2008))及/或接觸抗原的殘基，具有被測試結合親和力之所得的變異VH或VL。
藉由構築及重選自第二資料庫之親和力成熟已被描述於如Hoogenboom et al. inMethods in Molecular Biology 178：1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) 。於親和力成熟的一些實施例中，將多樣性導入藉由多種方法的任一種選擇用於成熟的可變異基因中(例如易誤PCR (error-prone PCR)、鏈混排(chain shuffling)或寡核苷酸定向誘變(oligonucleotide-directed mutagenesis)。接著建立第二資料庫。而後篩選該資料庫以辨識具有期望親和力的任何抗體變異。另一種導入多樣性的方法涉及HVR導向的方法，其中隨機化幾個HVR殘基(例如同時有4至6個殘基)。參與抗原結合的HVR殘基可被特異性地辨識，例如使用丙胺酸掃描誘變或模擬。特別是CDR-H3和CDR-L3經常被標靶。
於一些實施例中，取代、插入或刪除可發生在一個或多個HVR中，只要這些改變不實質上降低抗體結合到抗原的能力。例如，可在HVR進行不會實質上降低結合親和力保守性改變(例如本文所提供的保守取代)。這些改變可例如在HVRs與抗原接觸的殘基外。在上述提供的變異VH及VL序列的一些實施例中，各HVR為未改變的或是包含不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於識別可為了誘變而標靶的抗體之殘基或區域有效的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，其如於Cunningham and Wells (1989)Science , 244：1081-1085所描述的。在此方法中，殘基或標靶殘基的群組(例如帶電殘基如arg、 asp、 his、 lys及glu)被識別並以中性或負電性胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代來判定抗體與抗原的交互作用是否受影響。可在顯示對初始取代具有功能敏感性的胺基酸位置導入進一步的取代。
抗原-抗體複合物的晶體結構可選擇性地或附加地被分析以識別抗原與抗體之間的接觸點。這些接觸殘基及相鄰殘基可作為取代的候選點而被標靶或消除。變異可被掃描來測定其是否具有所期望的特性。
胺基酸序列的插入物包含從一個殘基至包含百個或更多殘基的多肽的長度範圍的胺基-及/或羧末端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入物。末端插入物的範例包含具有N末端甲硫胺醯基殘基的抗體。其他抗體分子的插入變異包含與增加抗體血漿半衰期的酵素(例如用於ADEPT)或多肽與抗體的N端或C端融合。
b)醣基化(Glycosylation)變異
在一些實施例中，改變本文所提供的抗體以增加或降低抗體醣基化的程度。對於抗體添加或刪除醣基化的位置可藉由改變胺基酸序列而方便的完成，使一個或多個醣基化位置被創造或移除。
當抗體包含Fc區時，可改變與其附接的醣(carbohydrate)。由哺乳動物細胞產生的自然抗體通常包含分支、雙分支(biantennary)寡糖，其一般藉由N連接(N-linkage)附接至Fc區的CH2域的Asn297。參見Wright et al.TIBTECH 15：26-32 (1997)。寡醣可包含各種醣類，例如：甘露糖(mannose)、N-乙醯葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine,  GlcNAc)、半乳糖(galactose)和唾液酸(sialic acid)、以及與雙分支寡醣結構的「莖(stem)」中的GlcNAc附接的海藻糖(fucose)。在一些實施例中，可對本發明的抗體中的寡醣進行修飾以創造具有某些改善特性的抗體變異。
在一實施例中，提供的抗體變異具有缺乏(直接地或間接地)附接至Fc區的海藻糖的醣類結構。例如，在這些抗體中的海藻糖含量可為從1%至80%、從1%至65%、從5%至65%或從20%至40%。例如，海藻糖的含量藉由計算在Asn297的糖鏈內的海藻糖平均含量，相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析測量之附接到Asn297的所有醣類結構之總和 (例如複合物、雜合及高甘露糖結構)而測定，如於WO 2008/077546中所述的。Asn297是指大約位於Fc區的位置297(Fc區殘基的EU編號)的天冬醯胺酸(asparagine)殘基；然而由於抗體中少量的序列變異，Asn297亦可位於位置297的上游或下游大約+/-3個胺基酸處，即在位置294與300之間。這些海藻糖化變異可具有改善ADCC的功能。參見美國專利公開案Nos. US 2003/0157108 (Presta, L.)； US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。與「去海藻糖化(defucosylated)」或「海藻糖-缺乏(fucose-deficient)」抗體變異相關的公開物的例子包含： US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.J. Mol. Biol. 336：1239-1249 (2004)；Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87： 614 (2004)。 能夠產生去海藻糖化抗體的細胞株的例子包含蛋白質海藻糖化的Lec13 CHO細胞缺陷： (Ripka et al.Arch. Biochem. Biophys. 249：533-545 (1986)；美國專利申請案No US 2003/0157108 A1, Presta, L；及 WO 2004/056312 A1, Adamset al ., 特別是範例 11)，及剔除細胞株(knockout cell lines)，如ɑ-1,6-海藻糖轉移酶基因(alpha-1,6-fucosyltransferase gene)、FUT8 、 剔除CHO細胞(參見如 Yamane-Ohnuki et al.Biotech. Bioeng. 87： 614 (2004)； Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng ., 94(4)：680-688 (2006)；及 WO2003/085107)。
進一步提供具有對分寡糖(bisected)的抗體變異，例如其中附接到抗體Fc區的雙分支寡糖被GlcNAc對分。這種抗體變異可具有降低的海藻糖化及/或改善的ADCC功能。這些抗體變異的例子描述於例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.)；美國專利案No. 6,602,684 (Umana et al.)；及 US 2005/0123546 (Umanaet al .)。亦提供在附接到Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖(galactose)殘基的抗體變異。這些抗體變異可改善的CDC功能。這些抗體變異描述於，例如WO 1997/30087 (Patel et al.)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及 WO 1999/22764 (Raju, S.)。
c) Fc區變異
在一些實施例中，一個或多個胺基酸修飾可被導入本文提供的抗體的Fc區，從而產生Fc區變異。Fc區變異可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、 IgG2、 IgG3或 IgG4 Fc區)，其包含在一個或多個胺基酸位置的胺基酸修飾(例如取代)。
在一些實施例中，本發明預設具有一些但不是所有的效應物功能的抗體變異，這使得其對於抗體的半衰期在體內是重要的，但某些效應物功能(如ADCC) 是不必要或有害的應用為理想的候選物。可進行體外及/或體內細胞毒性分析來測定CDC及/或ADCC活性。例如可進行Fc受體(FcR)結合分析來確認抗體是否具有FcγR結合(因此可能具有ADCC活性)及/或FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達Fcγ RIII，而單核細胞表達FcγRI、 FcγRII 及 Fcγ RIII。FcR在造血細胞上的表達綜述於Ravetch and Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9：457-492 (1991)第464頁上的表3中。評估感興趣分子的ADCC活性之體外分析的非限制的例子描述於美國專利案No. 5,500,362 (參見如Hellstrom, I. et al.Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83：7059-7063 (1986)) 及 Hellstrom, I et al.,Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82：1499-1502 (1985)； 5,821,337 (參見 Bruggemann, M. et al.,J. Exp. Med. 166：1351-1361 (1987))。或者，可採用非放射性分析法 (參見例如流動式細胞測量術的ACT1TM 非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及 CytoTox 96 (註冊商標)非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI)。用於這些分析有效的效應物細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可以在體內，例如在如Clynes et al.Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95： 652-656 (1998)所述的動物模式中，評估感興趣的分子之ADCC活性。亦可執行C1q結合分析來確認抗體是否能夠結合C1q因而具有CDC活性。參見，例如WO 2006/029879 及 WO 2005/100402中C1q 與 C3c結合 ELISA。為了評估補體(complement)活化作用，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoroet al .,J. Immunol. Methods 202：163 (1996)； Cragg, M.S. et al.,Blood 101：1045-1052 (2003)；及 Cragg, M.S. and M.J. Glennie,Blood 103：2738-2743 (2004))。亦可藉由本領域習知的方法進行FcRn結合與體內清除/半衰期測定(參見如Petkova, S.B. et al.,Int’l. Immunol. 18(12)：1759-1769 (2006))。
具有修飾的效應物功能的抗體包含那些具有一個或多個Fc區殘基238、265、 269、 270、 297、 327 及329取代 (美國專利案No. 6,737,056)的抗體。這些Fc突變包含在胺基酸位置265、269、270、297及327中的兩個或多個具有取代的Fc突變，包含具有殘基265及297取代成丙胺酸之被稱為「DANA」的Fc突變(美國專利案No. 7,332,581)。
已描述對FcRs具有改變的結合之一些抗體變異。(參見如美國專利案No. 6,737,056； WO 2004/056312及 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2)： 6591-6604 (2001))。
於一些實施例中，抗體變異包含改變ADCC之具有一個或多個胺基酸取代的Fc區，例如在Fc區的位置298、333及/或334之取代(殘基的EU編號)。
在一些實施例中，Fc區中進行改變，其導致C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(即增加或減少)，如美國專利案No. 6,194,551、WO 99/51642、WO2011/091078及 Idusogie et al.J. Immunol. 164： 4178-4184 (2000)中所述。
具有增加的半衰期與對新生Fc受體(FcRn)增加的結合的抗體，其中新生Fc受體負責轉移母體的IgGs給胎兒(Guyer et al.,J. Immunol. 117：587 (1976)以及 Kim et al.,J. Immunol. 24：249 (1994))被描述於美國專利案 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)。這些抗體包含具有一個或多個取代的Fc區，其增加Fc區對FcRn的結合。這些Fc變異包含在Fc區殘基： 238、256、265、272、286、303、305、307、311、 312、317、 340、 356、360、 362、 376、 378、 380、 382、 413、 424 或 434中的一個或多個具有取代者，例如Fc區殘基434的取代(美國專利案No. 7,371,826)。
亦參見Duncan & Winter,Nature 322：738-40 (1988)；美國專利案No. 5,648,260；美國專利案No. 5,624,821；及 WO 94/29351關於其他Fc區變異的例子。
在另一個實施例中，抗體可包含本發明在下文中詳細描述的變異Fc區。
d)半胱胺酸工程改造抗體變異
在一些實施例中，創造半胱胺酸工程改造抗體，例如其中抗體的一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代之「thioMAbs」為理想的。於特定實施例中，被取代的殘基發生在抗體的可接觸位置(accessible sites)。藉由以半胱胺酸取代這些殘基，反應性的硫醇基因而被定位在抗體的可接觸位置且可用於將抗體與例如藥物部分或連結-藥物部分之其他部分偶合，以創造如本文進一步所述的免疫接合物。在一些實施例中，以下殘基中的任何一個或多個可被半胱胺酸取代：輕鏈的V205 (Kabat 編號) ；重鏈的A118 (EU 編號)；及重鏈Fc區的 S400 (EU 編號)。半胱胺酸工程改造抗體可如美國專利案No. 7,521,541中所描述般地生成。
e) 抗體衍生物
在一些實施例中，本文所提供的抗體可進一步修飾成包含在本領域為習知且可輕易地取得的其他非蛋白質部分。適合抗體的衍生化的部分包含但不侷限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包含但不侷限於，聚乙二醇(polyethylene glycol ，PEG)、乙二醇/丙二醇(glycol/propylene glycol)共聚物、羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose)、聚葡糖(dextran)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯氫吡咯酮(polyvinyl pyrrolidone)、 聚-1, 3-二氧戊環(poly-1, 3-dioxolane)、聚-1,3,6-三聚[口咢][口山](poly-1,3,6-trioxane)、乙烯/馬來酸酐(ethylene/maleic anhydride)共聚物、 聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物)及聚葡糖或聚(n-乙烯氫吡咯酮) 聚乙二醇(poly(n-vinyl pyrrolidone)polyethylene glycol)、聚丙烯乙二醇(polypropylene glycol)均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷(polypropylene oxide/ethylene oxide)共聚物、聚氧乙基化多元醇(polyoxyethylated polyols)(例如：甘油(glycerol))、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)及其混合物。聚乙二醇丙醛(Polyethylene glycol propionaldehyde)因其在水中的穩定性而可在製造中具有優勢。聚合物可為任何分子量，且可為分支或未分支的。連接到抗體的聚合物數量可有所變化，且如果附接多於一個聚合物，其可以是相同或不同的分子。通常用於衍生化的聚合物數量及/或類型可基於以下考量而判定，包含但不侷限於考量待改善抗體的特定性質或功能、抗體衍生物是否將用於定義條件下的治療等。
於另一實施例中，提供抗體及可藉由暴露於輻射而選擇性地加熱的非蛋白質部分的接合物。在一實施例中，非蛋白質部分是奈米碳管(Kam et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102： 11600-11605 (2005))。輻射可為任意波長，且包含但不限於不傷害普通細胞的波長，但其將非蛋白質部分加熱至抗體-非蛋白質部分附近的細胞被殺死的溫度。
於一態樣中，本發明提供包含具有實質上降低FcγR結合活性的變異Fc區之分離的多肽。於一態樣中，本發明提供包含未實質上降低C1q結合活性的變異Fc區之分離的多肽。於一態樣中，本發明提供包含具有實質上降低FcγR結合活性且未實質上降低C1q結合活性的變異Fc區之分離的多肽。在一些態樣中，該多肽為抗體。在一些態樣中，該多肽為Fc融合蛋白。在一些實施例中，相較於在自然或參考變異序列(有時在本文中統稱為「親代」Fc序列)的Fc區中相應的序列，變異Fc區包含至少一個胺基酸殘基改變(例如取代)。於一些實施例中，本發明之變異Fc區相較於親代Fc區具有實質上降低的FcγR結合活性。於一些實施例中，本發明之變異Fc區相較於親代Fc區不具有實質上降低的C1q結合活性。於一些實施例中，FcγR為人類FcγR、猴子FcγR(例如馬來猴(cynomolgus)、恆河獼猴(rhesus macaque)、狨猿(marmoset)、黑猩猩(chimpanzee)或狒狒(baboon) FcγR)或小鼠FcγR。
於一態樣中，相較於親代Fc區，本發明之變異Fc區具有實質上降低對於包含但不侷限於FcγRIa、 FcγRIIa (包含對偶變異 167H 及167R)、 FcγRIIb、 FcγRIIIa (包含對偶變異 158F及 158V)及 FcγRIIIb (包含對偶變異 NA1 及 NA2) 中之一個或多個人類FcγRs的結合活性。於進一步的態樣中，相較於親代Fc區，本發明之變異Fc區具有實質上降低對於人類FcγRIa、FcγRIIa (包含對偶變異 167H 及 167R)、FcγRIIb、FcγRIIIa (包含對偶變異 158F 及 158V)及 FcγRIIIb (包含對偶變異 NA1及 NA2)的結合活性。
於一態樣中，相較於親代Fc區，本發明之變異Fc區具有實質上降低對於包含但不侷限於FcγRI、 FcγRIIb、 FcγRIII及 FcγRIV中之一個或多個小鼠FcγRs的結合活性。於進一步的態樣中，相較於親代Fc區，本發明之變異Fc區具有實質上降低對小鼠FcγRI、 FcγRIIb、FcγRIII及FcγRIV的結合活性。
「Fcγ受體」(本文指的是Fcγ受體，FcγR 或 FcgR)是指可結合到IgG1、IgG2、IgG3及IgG4單株抗體的Fc區的受體，且特別指由Fcγ受體基因編碼的蛋白質家族的任何成員。在人類中，此家族包含含有異構物(isoforms)FcγRIa、 FcγRIb及FcγRIc的FcγRI (CD64)；含有異構物 FcγRIIa (包含異型(allotypes) H131 (H型)及 R131 (R型))、 FcγRIIb (包含 FcγRIIb-1及FcγRIIb-2)及 FcγRIIc的FcγRII (CD32)；及含有異構物FcγRIIIa (包含異型V158及F158)及 FcγRIIIb (包含異型FcγRIIIb-NA1及 FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII (CD16)及任何尚未被發現的人類 FcγRs、FcγR 異構物或異型，但不侷限於此。FcγRIIb1及 FcγRIIb2已經被報導為人類FcγRIIb的剪接變異。此外，稱為FcγRIIb3的剪接變異也被報導(J Exp Med, 1989, 170： 1369-1385)。除了這些剪接變異之外，人類FcγRIIb包含所有在NCBI註冊的剪接變異，其為NP_001002273.1、 NP_001002274.1、 NP_001002275.1、 NP_001177757.1及NP_003992.3。進一步地，人類FcγRIIb包含每個先前已報導的基因多型性(genetic polymorphism)，及FcγRIIb(Arthritis Rheum . 48：3242-3252 (2003)； Kono et al.,Hum. Mol. Genet . 14：2881-2892 (2005)；及 Kyogoju et al.,Arthritis Rheum . 46：1242-1254 (2002))，以及將於未來報導的每個基因多型性。
在FcγRIIa中有兩個異型，其一在FcγRIIa的位置167的胺基酸為組胺酸(H型)，而另一在位置167的胺基酸被取代為精胺酸(R型) (Warrmerdam,J. Exp. Med. 172：19-25 (1990))。
FcγR包含人類、小鼠、大鼠、兔子和猴子衍生的FcγRs，但不侷限於此，而可衍生自任何生物體。小鼠FcγRs 包含 FcγRI (CD64)、 FcγRII (CD32)、 FcγRIII (CD16)及 FcγRIV (CD16-2)，以及任何小鼠FcγRs或FcγR 異構物，但並不侷限於此。
人類FcγRIa的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO： 69；人類FcγRIIa(167H) 的胺基酸序列被述明在EQ ID NO：70；人類 FcγRIIa(167R) 的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：71；人類 FcγRIIb的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：72；人類 FcγRIIIa(158F)的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO： 73；人類 FcγRIIIa(158V)的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：74；人類 FcγRIIIb(NA1)的胺基酸序列被述明在EQ ID NO：75；人類 FcγRIIIb(NA2)的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：76。
小鼠FcγRI的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：77；小鼠FcγRIIb的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：78；小鼠FcγRIII的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：79；小鼠FcγRIV的胺基酸序列被述明在SEQ ID NO：80。
於一態樣中，本發明之變異Fc區具有實質上降低的FcγR-結合活性，其低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%、低於5%、低於2%、低於1%、低於0.5%、低於0.2%或低於0.1%的親代Fc區的結合活性。於一態樣中，本發明之變異Fc區具有實質上降低的FcγR結合活性，這意味著[FcγR與變異Fc區交互作用前後改變之傳感圖的RU值差]/[將FcγR抓捕到感測晶片前後改變之傳感圖的RU值差]的比例是低於1、低於0.8、低於0.5、低於0.3、低於0.2、低於0.1、低於0.08、低於0.05、低於0.03、低於0.02、低於0.01、低於0.008、低於0.005、低於0.003、低於0.002或低於0.001。
於一態樣中，本發明之變異Fc區不具有實質上降低C1q結合的活性，這意味著本發明的變異Fc區與其親代Fc區之間C1q結合活性的差低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%或低於5%的親代Fc區的C1q結合活性。
於一態樣中，本發明提供包含具有實質上降低之ADCC活性的變異Fc區之分離的多肽。於一態樣中，本發明提供包含未實質上降低之CDC活性的變異Fc區之分離的多肽。於一態樣中，本發明提供包含具有實質上降低之ADCC活性且未實質上降低之CDC活性的變異Fc區之分離的多肽。
於一態樣中，本發明之變異Fc區具有實質上降低之ADCC活性，其低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%、低於5%、低於2%、低於1%、低於0.5%,、低於0.2%或低於0.1%的親代Fc區的ADCC活性。
於一態樣中，本發明之變異Fc區不具有實質上降低之CDC活性，這意味著在本發明中變異Fc區和親代Fc區之間CDC活性的差低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%或低於5%的親代Fc區的CDC活性。
於一態樣中，本發明提供相較於包含親代Fc區的多肽，包含具有實質上降低之FcγR結合活性及未實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區之分離的多肽。於進一步的態樣中，本發明之多肽包含選自由根據EU編號為234、235、 236、 267、 268、 324、 326、 332及 333所組成之群組中之至少一個位置的至少一個胺基酸改變。
於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性及未實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含位於位置234的Ala、位於位置235的Ala及選自由根據EU編號236、 267、 268、 324、326、 332及 333所組成之群組中之至少一個位置的至少一個胺基酸改變。
於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含位於位置234的Ala、位於位置235的Ala及於以下(a)-(c)中之任一的進一步的胺基酸改變： 根據EU編號(a)位置 267、 268及 324； (b)位置236、 267、268、 324及332；及 (c)位置326及 333。
於進一步的態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號，選自由(a)位於位置267的 Glu；(b) 位於位置268的Phe； (c) 位於位置324的Thr ； (d) 位於位置236的Ala； (e) 位於位置332的Glu； (f) 位於位置326的Ala、 Asp、Glu、Met或 Trp；及 (g) 位於位置333的Ser所組成之群組之胺基酸。
於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號之以下胺基酸：位於位置234的Ala 、位於位置235的Ala 、位於位置326的 Ala及位於位置333的 Ser。於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號之以下胺基酸：位於位置234的Ala、位於位置235的Ala、位於位置326的Asp及位於位置333的 Ser。 於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號的以下胺基酸：位於位置234的Ala 、位於位置235的 Ala、位於位置326的Glu 及位於位置333的 Ser。於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號之以下胺基酸：位於位置234的 Ala、位於位置235的 Ala 、位於位置326的Met 及位於位置333的Ser。 於一態樣中，具有實質上降低之FcγR結合活性及無實質上降低之C1q結合活性的變異Fc區包含根據EU編號之胺基酸：位於位置234的Ala 、位於位置235的 Ala 、位於位置326的Trp 及位於位置333的 Ser。
另一態樣中，本發明之變異Fc區可進一步包含選自由根據EU編號：428、434、 436、 438及 440位置所組成之群組中之至少一個位置的至少一個胺基酸改變。
於進一步的態樣中，變異Fc區可進一步包含選自由以下所組成之群組的胺基酸序列：根據EU編號(a) 於位置434的Ala； (b) 於位置434的Ala、於位置436的 Thr、於位置438的 Arg 及於位置440的 Glu ；(c) 於位置428的Leu 、於位置434的 Ala 、於位置436的 Thr、於位置438的Arg 及於位置440的 Glu；及 (d) 於位置428的Leu、於位置434的Ala、於位置438的Arg 及於位置440的 Glu(亦參見描述胺基酸改變與變異Fc區的Fc-Rn結合活性之間的關係之WO2016/125495)。
於另一態樣中，本發明之變異Fc區包含根據EU編號的以下胺基酸：於位置234的Ala 、於位置235的Ala 、於位置326的Ala 、於位置333的 Ser 、於位置428的Leu 、於位置434的 Ala 、於位置436的 Thr 、於位置438的Arg及於位置440的Glu 。於另一態樣中，本發明之變異Fc區包含根據EU編號的以下胺基酸：於位置234的Ala 、於位置235的Ala 、於位置326的Ala 、於位置333的 Ser 、於位置428的Leu 、於位置434的 Ala 、於位置438的Arg及於位置440的Glu 。
於一態樣中，相較於親代Fc區，本發明之Fc區較佳地不具有實質上增加的FcRn活性，特別是在pH7.4時。
「FcRn」結構上相似於第I型的主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex, MHC)的多肽，並展現與第I型的主要組織相容性複合體分子22%至29%的序列相同性。FcRn表現為由包含與跨膜 α或重鏈複合的可溶性β或輕鏈(β2微球蛋白)組成之異二聚體。如同MHC，FcRn的α鏈包含三個細胞外域(α1、 α2、及 α3)，且其短細胞質域將他們繫在細胞表面。α1及 α2域與抗體Fc區的FcRn結合域交互作用。人類FcRn多核苷酸與胺基酸序列可自，例如分別顯示在NM_004107.4及NP_004098.1(包含訊息序列)的前驅物所衍生。
人類FcRn(α鏈)的胺基酸序列闡述於SEQ ID NO： 81；而人類β2微球蛋白的胺基酸序列闡述於SEQ ID NO： 82。
於一態樣中，本發明之變異Fc區較佳地為不具有實質上增加的FcRn結合活性，特別是在pH7.4下，相較於親代Fc區的FcRn結合活性，其少於1000倍、少於 500倍、少於 200倍、 少於 100倍、少於 90倍、 少於 80倍、 少於 70倍、少於 60倍、 少於 50倍、 少於 40倍、少於 30倍、少於 20倍、少於10倍、少於 5倍、 少於 3倍或少於 2倍。於一態樣中，本發明之變異Fc區不具有實質上增加的FcRn結合活性，特別是在pH7.4下這意味著[FcRn與變異Fc區交互作用前後改變之傳感圖的RU值差]/ [將FcRn抓捕到感測晶片前後改變之傳感圖的RU值差異]的比例低於0.5、低於0.3、低於0.2、低於0.1、低於0.08、低於0.05、低於0.03、低於0.02、低於0.01、低於0.008、低於0.005、低於0.003、低於0.002或低於0.001。
於另一態樣中，本發明之變異Fc區包含單一或合併的描述於表4之任意胺基酸改變。於另一態樣中，本發明之變異Fc區包含描述於表4之至少任何一個胺基酸改變。於另一態樣中，本發明提供包含SEQ ID NOs： 51-59中之任一胺基酸序列的多肽。
於一些實施例中，包含本發明的變異Fc區的多肽為抗體重鏈恆定區。於一些實施例中，包含本發明的變異Fc區的多肽進一步包含抗原結合域。於進一步的實施例中，多肽是抗體重鏈。於進一步的實施例中，多肽是抗體。於一些實施例中，抗體是嵌合抗體或人源化抗體。抗體的來源並無特別限制，但其例子包含人類抗體、小鼠抗體、大鼠抗體及兔子抗體。於進一步實施例中，多肽是Fc融合蛋白。
本文所描述之包含變異Fc區的兩個或多個多肽可包含在一個分子中，其中包含變異Fc區的兩個多肽為相聯的(associated)，非常相似於抗體。抗體的種類並不受限制，且可為IgA (IgA1、IgA2)、IgD、 IgE、 IgG (IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4)及 IgM或可使用之類似物。
於一些實施例中，包含本發明的變異Fc區之多肽為抗體。在進一步的實施例中，包含本發明的變異Fc區之多肽為抗病毒抗體。
於進一步的實施例中，包含本發明的變異Fc區之多肽包含抗體可變區，該抗體可變區包含： a)(i)包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3、(ii) 包含 SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3、以及 (iii)包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2； (b)(i) 包含 SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含 SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2、以及(iii)包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3； (c)(i)包含 SEQ ID NO：11的胺基酸序列的HVR-H1、(ii)包含 SEQ ID NO：13的胺基酸序列的HVR-H2、 (iii)包含 SEQ ID NO：16的胺基酸序列的HVR-H3、 (iv)包含 SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1、 (v)包含 SEQ ID NO： 24的胺基酸序列的HVR-L2、以及 (vi)包含SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3；或 (d)(i)包含 SEQ ID NO：21的胺基酸序列的HVR-L1、 (ii)包含SEQ ID NO：24的胺基酸序列的HVR-L2、以及 (iii)包含 SEQ ID NO：27的胺基酸序列的HVR-L3。
於進一步的實施例中，包含本發明的變異Fc區之多肽包含抗體可變區，該抗體可變區包含： a) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3 、(ii) 來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L3 、及 (iii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2 ； (b) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1 、(ii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2  、及 (iii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3； (c) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1 、(ii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H2 、(iii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H3 、(iv) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L1、(v) 來自SEQ ID NO： 10之VL序列的HVR-L2、及 (vi)來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L3； (d) (i)來自SEQ ID NO： 10 之VL序列的HVR-L1、(ii)來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L2、及 (iii)來自SEQ ID NO： 10之VL序列的 HVR-L3；或 (e) (i) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H1 、(ii) 來自SEQ ID NO： 6之VH序列的HVR-H2 、(iii)來自SEQ ID NO： 6 之VH序列的HVR-H3 、(iv) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L1 、 (v) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L2、及 (vi) 來自SEQ ID NO： 7之VL序列的HVR-L3。
於進一步的實施例中，包含本發明的變異Fc區的多肽包含含有SEQ ID NO： 1的胺基酸序列的VH區及含有SEQ ID NO： 7的胺基酸序列的VL區。在進一步的實施例中，本發明提供包含在重鏈包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 54的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 7的胺基酸序列的VL區的抗體。於進一步的實施例中，本發明提供包含在重鏈包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 58的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 7的胺基酸序列的VL區之抗體。於進一步的實施例中，本發明提供包含在重鏈包含SEQ ID NO： 1的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 59的胺基酸序列變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 7的胺基酸序列的VL區之抗體。
本發明亦提供在本文描述的抗登革熱病毒抗體，進一步包含具有本發明的變異Fc區的多肽。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體包含在重鏈包含SEQ ID NO： 6的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 54的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 10的胺基酸序列的VL區。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體包含在重鏈包含SEQ ID NO： 6的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 58的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 10的胺基酸序列的VL區。於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體包含在重鏈包含SEQ ID NO： 6的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 59的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 10的胺基酸序列的VL區。
於一些實施例中，本發明之抗登革熱病毒抗體包含在重鏈包含SEQ ID NO： 6的胺基酸序列的VH區及包含SEQ ID NO： 59的胺基酸序列的變異Fc區，及在輕鏈包含SEQ ID NO： 7的胺基酸序列的VL區。
本文所使用「親代Fc區」是指引入在本文所述的胺基酸改變之前的Fc區。親代Fc區較佳的例子包含衍生自自然抗體的Fc區 。舉例而言，抗體包含IgA (IgA1、 IgA2)、 IgD、 IgE、 IgG (IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4)及 IgM等。抗體可衍生自人類或猴子(例如馬來猴、恆河獼猴、狨猿、黑猩猩或狒狒)。自然抗體亦可包含自然發生的突變。基因多型性所致的複數個IgGs異型序列描述於「免疫學感興趣的蛋白質序列(Sequences of proteins of immunological interest)」 NIH出版編號91-3242，且其中的任何一個都可用於本發明。具體而言，就人類IgG1而言，位於位置356至358(EU編號)的胺基酸序列可為DEL或EEM。親代Fc區較佳的例子包含衍生自人類IgG1(SEQ ID NO： 83)、人類 IgG2 (SEQ ID NO： 84)、人類 IgG3 (SEQ ID NO： 85)及人類IgG4 (SEQ ID NO： 86)的重鏈恆定區的Fc區。親代Fc區另一較佳的例子為衍生自重鏈恆定區SG1 (SEQ ID NO： 87)的Fc區。親代Fc區另一較佳的例子為衍生自重鏈恆定區SG182 (SEQ ID NO： 46)的Fc區。進一步地，親代Fc區可為藉由將本文所述的胺基酸改變之外的胺基酸改變添加到自自然抗體衍生的Fc區而產生的Fc區。
此外，為了其他目的進行的胺基酸改變可與本文所述的變異Fc區組合。例如可添加改善FcRn結合活性的胺基酸取代(Hinton et al.,J. Immunol. 176(1)：346-356 (2006)； Dall'Acqua et al.,J. Biol. Chem. 281(33)：23514-23524 (2006)； Petkova et al.,Intl. Immunol . 18(12)：1759-1769 (2006)； Zalevsky et  al.,Nat. Biotechnol. 28(2)：157-159 (2010)； WO 2006/019447； WO 2006/053301；及 WO 2009/086320)及改善抗體異質性(heterogeneity)或穩定性的胺基酸取代(WO 2009/041613)。此外，描述於WO 2011/122011、WO 2012/132067、 WO 2013/046704 或 WO 2013/180201之具有改善之抗原清除(antigen clearance)特性的多肽、描述於WO 2013/180200之具有特異性結合至標靶組織特性的多肽、描述於WO 2009/125825、 WO 2012/073992 或WO 2013/047752之具有重複結合到複數個抗原分子特性的多肽，可與本文所描述之變異Fc區組合。此外，以賦予其他抗原結合能力為目的，可將揭示於EP1752471及EP1772465的胺基酸改變與本文描述的變異Fc區的CH3結合。此外，以增加血漿滯留性(plasma retention)為目的，可將降低恆定區的pI(WO 2012/016227)的胺基酸改變與本文描述的變異Fc區結合。此外，以促進細胞攝取為目的，可將增加恆定區的pI(WO 2014/145159)的胺基酸改變與本文描述的變異Fc區結合。此外，以促進自血漿消除目標分子為目的，可將增加恆定區的pI(WO2016/125495 及WO2016/098357)的胺基酸改變與本文描述的變異Fc區結合。
在酸性pH值下增強人類FcRn結合活性的胺基酸改變亦可與本文所描述的變異Fc區結合。具體而言，這些改變可包含例如根據EU編號，以Leu取代位置428的Met及以Ser取代位置434的 Asn (Nat Biotechnol, 2010, 28： 157-159)；以Ala取代位置434的Asn(Drug Metab Dispos, 2010 Apr； 38(4)： 600-605)；以Tyr取代位置252的Met、以Thr取代位置254的Ser及以Glu取代位置256的Thr(J Biol Chem, 2006, 281： 23514-23524)；以Gln取代位置250的Thr及以Leu取代位置438的Met(J Immunol, 2006, 176(1)： 346-356)；以His取代位置434的Asn (Clin Pharmacol Ther, 2011, 89(2)： 283-290)及描述於WO2010/106180、WO2010/045193、 WO2009/058492、 WO2008/022152、 WO2006/050166、 WO2006/053301、 WO2006/031370、 WO2005/123780、 WO2005/047327、 WO2005/037867、 WO2004/035752、 WO2002/060919等的改變。於另一實施例，這些改變可包含，例如選自由以Leu取代位置428的Met、以Ala取代位置434的Asn及以Thr取代位置436的Tyr所組成之群組中之至少一個改變。這些改變可進一步包含以Arg 取代位置438的 Gln及/或以Glu取代位置440的Ser (WO2016/125495)。
在本發明中，胺基酸的改變表示取代、刪除、增加、插入及修飾中之任一或其組合。在本發明中胺基酸改變可改述為胺基酸突變。
胺基酸改變藉由本領域習知之各種方法產生。這些方法包含定點突變法(Hashimoto-Gotoh et al.,Gene 152：271-275 (1995)； Zoller,Meth. Enzymol. 100：468-500 (1983)； Kramer et al.,Nucleic Acids Res. 12： 9441-9456 (1984))； Kramer and Fritz,Methods Enzymol. 154： 350-367 (1987)；及 Kunkel,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82：488-492 (1985))、PCR突變法及盒式突變法(cassette mutation method)，但不侷限於此。
導入Fc區的胺基酸改變的目沒有限制。在一些實施例中，其可為1、2或更少、3或更少、4或更少、5或更少、6或更少、8或更少、10或更少、12或更少、14或更少、16或更少、18或更少或20或更少。
再者，包含本發明變異Fc區之多肽可以如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)及細胞毒性物質的各種分子化學性修飾。這些化學性修飾多肽的方法已建立在本領域中。
於一些實施例中，包含本發明變異Fc區的多肽為抗體或Fc融合蛋白，其包含可結合至任意抗原的域。可被這些抗體和Fc融合蛋白結合之抗原的例子包含但不侷限於配位基(ligands)( 細胞激素、趨化因子(chemokines)等)、受體、癌症抗原、病毒抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白及部分含有免疫球蛋白的免疫複合物。
B. 重組方法及組成
於一例子中，述及製備如本文所述之抗體的過程，其中該過程包含步驟：
(a)將本文所描述的VH變異序列與本文所描述的人類IgG1 CH序列組合；
(b)將本文所描述的VL變異序列與人類CL序列SK1組合；
(c)在表現載體中選殖各個組合物；
(d) 在共轉染細胞中表達所得到的表現載體；及
(e)純化經由步驟(d)所得到的抗體。於一些例子中，宿主細胞為CHO-DXB11、CHO-K1或CHO-DG44。這些宿主細胞可為藉由導入DNA編碼牛磺酸運輸蛋白取得之表現牛磺酸運輸蛋白的細胞 (WO2007/119774)。可用於製造這些抗體的載體係為本領域已知的。一般來說，抗體可使用重組方法及組成來產生，例如於美國專利案No. 4,816,567中所描述的。於一實施例中，提供編碼本文描述之抗登革熱抗體病毒之分離的核酸。於另一實施例中，提供編碼包含本文描述之變異Fc區或親代Fc區的多肽之分離的核酸。這些核酸可編碼包含抗體的VL的胺基酸序列及/或包含抗體的VH的胺基酸序列(如抗體的輕及/或重鏈)。於進一步實施例中，提供包含此種核酸的一個或多個載體(例如表現載體)。於進一步的實施例中，提供包含此種核酸的宿主細胞。於這些實施例中的一個中，宿主細胞包含(如已被轉化具有)：(1)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及包含抗體之VH的胺基酸序列的核酸之載體，或(2)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列的核酸之第一載體及包含編碼包含抗體之VH的胺基酸序列的核酸之第二載體。於一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或淋巴樣細胞(lymphoid cell)(如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。於一實施例中，提供製造抗登革熱病毒抗體之方法，其中該方法包含在適合表現抗體的條件下培養如上述所提供之包含編碼抗體的核酸之宿主細胞，並選擇性地將抗體從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收。於另一實施例中，提供製備包含變異Fc區或親代Fc區的多肽之方法，其中該方法包含：在適合表現多肽的條件下培養包含如上所述之編碼如抗體、Fc區或變異Fc區之多肽之核酸的宿主細胞，並選擇性地將多肽從宿主細胞(或宿主細胞培養基)恢復回收。
為了抗登革熱病毒抗體的重組製造，將如上所述編碼抗體的核酸分離並插入一個或多個載體以進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。為了Fc區的重組製造，將編碼Fc區的核酸分離並插入至一個或多個載體以進一步在宿主細胞中選殖及/或表現。這些核酸可使用常規方法輕易分離並定序(如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體重鏈及輕鏈的基因之寡核苷酸探針)。
適合編碼抗體載體的選殖或表現的宿主細胞包含本文所描述的原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，特別是當不需要糖基化和Fc效應功能時。在細菌中表現抗體片段及多肽可參見如美國專利案Nos. 5,648,237、5,789,199及 5,840,523。(亦參見描述在E. coli .中抗體片段的表現之Charlton,Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254)。表達後，抗體可從可溶性部分中的細菌細胞糊(bacterial cell paste)中分離出來，並可進一步純化。
除了原核生物之外，如絲狀真菌或酵母之真核微生物是適於編碼抗體的載體的選殖或表達宿主，包含其糖基化途徑已被「人源化」，導致具有部分或全部人類糖基化模式的抗體產生的真菌和酵母菌株。參見Gerngross,Nat. Biotech. 22：1409-1414 (2004)及 Li et al.,Nat. Biotech. 24：210-215 (2006)。
適於糖基化抗體的表達之宿主細胞亦衍生自多細胞生物(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞的例子包含植物及昆蟲細胞。已鑒別多種桿狀病毒株，其可與昆蟲細胞共同使用，特別係用於草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞的轉染(transfection)。
植物細胞培養物亦可被用作為宿主。參見如美國專利案Nos. 5,959,177、 6,040,498、 6,420,548、 7,125,978及 6,417,429 (描述用於從轉基因植物中產生抗體的 PLANTIBODIESTM 技術)。
脊椎動物亦可被用作為宿主細胞。例如適於在懸浮液中生長的哺乳類細胞株可為有用的。其他有用的哺乳類宿主細胞株的例子為：藉由SV40轉化的猴子腎臟CV1株(COS-7)；人類胚胎腎臟株(如在Graham et al., J. Gen Virol. 36：59 (1977) 描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞 (BHK)；小鼠塞氏細胞(如在Mather,Biol. Reprod. 23：243-251 (1980)描述之TM4細胞)；猴子腎臟細胞 (CV1)；非洲綠猴腎臟細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎臟細胞(MDCK)； 水牛鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)； 小鼠乳房腫瘤 (MMT 060562)；例如在Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci . 383：44-68 (1982)所述之TRI 細胞； MRC 5 細胞；及FS4細胞。其他有用的哺乳類宿主細胞株包含中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，其包含DHFR- CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，如Y0、 NS0及 Sp2/0。適用於抗體產生的一些哺乳類宿主細胞株的綜述參見如 Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。
多株抗體較佳為藉由在動物中多次皮下(sc)或腹腔(ip)注射相關抗原及佐劑而產生。其對於使用雙官能或衍生劑，例如馬來醯亞胺苯甲醯磺基琥珀醯亞胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester )(藉由半胱胺酸殘基結合)、 N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide)(藉由離胺酸殘基)、戊二醛(glutaraldehyde)、丁二酸酐(succinic anhydride)、SOCl2 或R1 N═C═NR，其R及 R1 為不同的烷基，來將相關抗原接合到待免疫物種中免疫性(immunogenic)的蛋白質可為有用的，例如鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、血清白蛋白(serum albumin)、牛甲狀腺球蛋白(bovine thyroglobulin)或大豆胰蛋白酶抑製劑(soybean trypsin inhibitor)。
藉由將例如100μg或5μg的蛋白質或接合物(分別對於兔或小鼠)和3體積(3 volumes)的佛朗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)組合並在多個位點皮下注射溶液，使動物(通常為非人類哺乳類) 對抗原、免疫性結合物或衍生物免疫。一個月後，藉由在多個位點皮下注射1/5至1/10的原始量的佛朗氏完全佐劑中的肽或接合物對動物進行加強。7至14天後對動物取血並測定血清的抗體效價。動物被加強直到滴定濃度平臺(titer plateaus)。較佳地，使用相同抗原，但接合到不同蛋白及/或經由不同交聯劑的接合物對動物進行加強。接合物亦可在重組細胞培養物中製備為蛋白質融合物。且凝集劑，如明礬，適於增強免疫反應。
單株抗體從實質上同源的抗體群體中獲得，即除了可以少量存在的自然發生之突變及/或轉譯後修飾(例如異構化、醯胺化)以外，包含該群體的個別抗體是相同的。因此，修飾詞「單株」是指的抗體的特性而非分散抗體的混合物。
舉例而言，單株抗體可使用初次描述於Kohler et al.,Nature 256(5517)：495-497 (1975)的融合瘤技術形成。在融合瘤技術中，小鼠或其他適合的宿主動物如倉鼠藉由上述免疫化來引發淋巴細胞產生或能夠產生特異性結合到用於免疫反應之蛋白質上的抗體。或者淋巴細胞可在體外被免疫。
免疫試劑通常將包含抗原蛋白或其融合變異。一般如果需要人類來源的細胞，則會使用外周血液淋巴細胞(PBL)，如果需要非人類哺乳動物來源的，則使用脾細胞或淋巴結細胞。之後使用合適的融合劑，如聚乙二醇，將淋巴細胞與永生細胞株(immortalized cell line)融合，以形成融合瘤細胞(Goding, Monoclonal Antibodies： Principles and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103)。
永生細胞株通常是經轉化的哺乳動物細胞，特別是囓齒類動物、牛和人來源的骨隨瘤細胞。通常使用大鼠或小鼠的骨隨瘤細胞株。將由此製備的融合瘤細胞接種並生長在適合的培養基中，所述培養基較佳地含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞的生長或存活的物質。舉例而言，若親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HPRT)，則融合瘤的培養基通常包含次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸苷(HAT培養基)，這些是阻止HGPRT- 缺陷細胞生長的物質。
較佳的永生骨隨瘤細胞是有效地融合、透過所選之抗體生產細胞支持抗體穩定地高水準的產生、並對如HAT培養基之培養基敏感的細胞。其中，較佳的是鼠類骨髓瘤細胞株，如從得自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤，以及從得自美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collectio)之SP-2細胞(及其衍生物， X63-Ag8-653)衍生的。人骨髓瘤和小鼠 -人異源骨髓瘤細胞株已被描述用於人單株抗體的生產(Kozbor et al.J. Immunol. 133(6)：3001-3005 (1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987))。
測定融合瘤細胞生長的培養基中針對抗原的單株抗體的產生。較佳地，經由免疫沉澱法或藉由體外結合測定法，如放射免疫測定法(RIA)或酵素免疫吸附法(ELISA)，來測定由融合瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性。這些技術和測定是本領域已知的。舉例而言，結合親和力可藉由Munson,Anal. Biochem. 107(1)：220-239 (1980)的Scatchard分析來確定。
在識別出產生具有所需特異性、親和力及/或活性的抗體之融合瘤細胞後，殖株可經由限制稀釋程序次選殖並藉由標準方法生長(Goding，同上)。適用於此目的培養基包含例如D-MEM或RPMI-1640培養基。另外，融合瘤細胞可作為哺乳動物之腫瘤而於體內生長。
由次選殖分泌的單株抗體藉由一般的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A-瓊脂糖(protein A-Sepharose)、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析從培養基、腹水或血清中適當的分離。
使用如胃蛋白酶之蛋白酶，部分地分解IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4單株抗體等後，可藉由再沖提吸附在蛋白質A管柱上的部分(fraction)來獲得Fc區。蛋白酶無特別限制，只要能夠分解全長抗體，使得Fab 及 F(ab')2將藉由適當地設定pH等酶反應條件而以限制性的方式生成即可，其實例包含胃蛋白酶及木瓜酵素。
進一步地，本發明提供生產相較於包含親代Fc區的多肽，包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的方法，其包含引入至少一個胺基酸改變至親代Fc區中。在一些態樣中，產生的多肽為抗體。在某些實施例中，抗體是嵌合抗體或人源化抗體。在一些態樣中，產生的多肽是Fc融合蛋白。
在一態樣中，在選自由根據EU編號為234、 235、 236、 267、 268、 324、 326、 332及 333所組成之群組中之至少一個位置，至少一個胺基酸在以上提及的方法中被改變，以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽。
於另一態樣中，在位置234及235，兩個胺基酸在由上提及的方法中被改變，以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽。
於另一態樣中，胺基酸在由上提及的方法中被改變，以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽，該改變包含：(a)在位置234及235的兩個胺基酸改變、及(b)在選自由根據EU編號為236、 267、 268、 324、 326、 332及 333所組成之群組中之至少一個位置的至少一個胺基酸改變。
在另一態樣中，胺基酸在由上提及的方法中被改變，以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽，該改變包含：(a) 在位置234及235的兩個胺基酸改變、及(b)下述(i)-(iii)中任一個之至少一個胺基酸改變：根據EU編號(i)位置 267、 268及 324； (ii) 位置236、 267、 268、 324及 332；及 (iii) 位置 326 及 333。
於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係位於選自由以下群組所組成的各個位置：根據EU編號(a) 在位置234的Ala； (b)在位置235的 Ala； (c)在位置267的 Glu；(d)在位置268的 Phe； (e) 在位置324的Thr；(f) 在位置236的Ala； (g) 在位置332的Glu； (h) 在位置326的Ala、 Asp、 Glu、 Met、 Trp ；及 (i) 在位置333的Ser。
於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係：根據EU編號，在位置234的Ala、在位置235的 Ala、在位置236的Ala、及在位置333的Ser。於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係： 根據EU編號，在位置234的Ala、在位置235的 Ala、在位置326的Asp 及在位置333的Ser。於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係：根據EU編號，在位置234的Ala、在位置235的Ala、在位置326的Glu 及在位置333的 Ser 。於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係：根據EU編號，在位置234的Ala 、在位置235的Ala 、在位置326的Met 及在位置333的 Ser。於進一步的態樣中，在由上提及的方法中用以生產包含具有實質上降低之FcγR結合活性且無實質上降低之C1q結合活性之變異Fc區之多肽的胺基酸改變係：根據EU編號，在位置234的Ala、在位置235的Ala 、在位置326的Trp及在位置333的 Ser。
於另一態樣中，在選自由以下群組組成：根據EU編號，428、 434、 436、 438及 440之至少一個位置，至少一個胺基酸在以上提及的方法中被進一步地改變。
於進一步的態樣中，在以上提及的方法中的胺基酸改變係進一步選自以下(a)-(d)： 根據EU編號(a) 在位置434的Ala；(b) 在位置434的Ala 、在位置436的Thr 、在位置438的Arg及在位置440的Glu；(c) 在位置428的Leu 、在位置434的Ala、在位置436的Thr 、在位置438的Arg 及在位置440的Glu ；及 (d) 在位置428的Leu 、在位置434的Ala、在位置438的Arg及在位置440的(亦參見描述胺基酸改變與變異Fc區的FcRn結合活性之間的關係的 WO2016/125495)。
於進一步的態樣中，在以上提及的方法中的胺基酸改變為：根據EU編號，在位置234的Ala、 在位置235的Ala、在位置326的Ala、在位置333的Ser、在位置428的Leu 、在位置434的Ala 、在位置436的Thr 、在位置438的 Arg 及在位置440的 Glu 。於進一步的態樣中，在以上提及的方法中的胺基酸改變為：根據EU編號，在位置234的Ala、在位置235的Ala、在位置326的Ala、在位置333的Ser、在位置428的 Leu 、在位置434的Ala、在位置438的Arg 及在位置440的Glu。
在一態樣中，較佳的為，相較於親代Fc區，本發明的變異Fc區不具有實質上增加的FcRn結合活性，特別是在pH7.4。
於進一步的態樣中，在以上提及的製備方法中的胺基酸改變為選自表4中描述的任意單一改變、單一改變的組合或組合改變。
藉由上述方法或其他本領域以之方法製備之包含變異Fc區的多肽被包含在本發明中。
C.分析
本文所提供之抗登革熱病毒抗體可藉由本領域已知的各種分析法來識別、篩選或表示其物理/化學性質及/或生物學活性。
本文所提供之變異Fc區可藉由本領域已知的各種分析法來識別、篩選或表示其物理/化學性質及/或生物學活性。
1. 結合分析及其他分析
在一態樣中，例如藉由已知之方法如ELISA、西方墨點法(Western blot)等，測試本發明之抗體之抗原結合活性。在一態樣中，例如藉由已知之方法如ELISA、西方墨點法(Western blot)等，測試本發明包含變異Fc區的多肽之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析辨別本文所提及的任何抗登革熱病毒抗體競爭與登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白之結合的抗體。在某些實施例中，當這種競爭抗體過量存在時，其會阻斷(如：減少)參考抗體與登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白的結合至少10%、 15%、 20%、 25%、 30%、35%、 40%、 45%、 50%、55%、 60%、65%、 70%、 75%或更多。在一些情況下，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或更多。在某些實施例中，這些競爭抗體結合到與本文所述的抗登革熱病毒抗體結合的抗原決定位相同的抗原決定位(例如：線性或構象抗原決定位)。用於定位(mapping)與抗體結合的抗原決定位之詳細的例示性方法提供在Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," inMethods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)。
在例示性的競爭分析中，固定的登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白被培養在一溶液中，該溶液包含與登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白結合之第一標記抗體及待測試其與第一抗體競爭與登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白結合的能力之第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為控制組，將固定的登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白培養在包含第一標記抗體但不包含第二未標記抗體之溶液中。在允許第一抗體與登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白結合的條件下培養後，除去多餘的未結合抗體，並測量與固定的登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白結合的標記量。若測試樣品中與固定的登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白結合的標記量相較於控制樣品實質上降低，則代表第二抗體與第一抗體競爭與登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白的結合。參見Harlow and Lane (1988)Antibodies ： A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
用於測定包含變異Fc區的多肽對一個或多個FcR家族成員的結合活性的分析已在本文中描述或在本領於中是已知的。這些結合分析包含但不限制於使用表面電漿共振(SPR)現象的BIACORE® 分析、放大化學發光親和均相分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay, ALPHA)篩選、ELISA及流式細胞分選(FACS) (Lazar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11)： 4005-4010)。
在一實施例中，BIACORE® 分析可被用於評估包含變異Fc區之多肽的結合活性對於特定的FcR家族成員是否增強或維持或降低。例如藉由觀察自傳感圖分析獲得的解離常數(Kd)值是否減少或增加，其中各種FcR作為分析物與固定或抓捕在傳感器芯片上的包含變異Fc區的多肽相互作用，其使用已知的方法和試劑，如蛋白A、蛋白L、蛋白A/G、蛋白G、抗λ鏈抗體、抗κ鏈抗體、抗原肽、抗原蛋白。結合活性的改變還可以藉由比較一種或多種FcR作為分析物與被抓捕的包含變異Fc區的多肽相互作用之前和之後的傳感圖上的共振單位(RU)值的變化來確定。或者，可以將FcR固定或抓捕到感測芯片上，並將包含變異Fc區的多肽作為分析物。
在BIACORE®分析中，觀察相互作用的物質(配位體)之其一被固定在感測芯片上的金薄膜上，並藉由從感測芯片的背面照射光使得在金薄膜與玻璃之間的界面處發生全反射，反射光的一部分形成了反射強度降低的部分(SPR訊號)。當使觀察相互作用的物質(分析物)中的另一個在感測芯片表面上流動並且配位體與分析物結合時，固定的配位體分子的質量增加，並且感測芯片表面上溶劑的折射係數改變。SPR信號的位置由於此折射率的改變而位移(另一方面。當結合解離時，信號位置返回)。BIACORE®系統指出上述的移位量，或者更具體而言，藉由在縱坐標上將感測芯片表面上質量變化繪製為測量數據(傳感圖) ，指出質量的時間變化。從傳感圖判定與被抓捕在感測芯片表面上的配位體結合的分析物的量。自傳感圖的曲線判定動力學參數，如結合速率常數(ka)和解離常數(kd)，解離常數(Kd)由這些常數的比值判定。在BIACORE®方法中，較佳地使用測量抑制的方法。測量抑制的方法的例子被描述於Lazar et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103(11)：4005-4010 (2006)。
ALPHA篩選是基於以下原則，藉由使用兩個珠子(一個供體和一個受體)的ALPHA技術進行。只有當與供體珠子結合的分子與結合到受體珠子上的分子物理性地相互作用時，才能檢測到發光信號，且這兩個珠子彼此非常接近。在供體珠子中的雷射激發光敏劑將環境的氧氣轉化成激發態的單重態氧。單重態氧分散在供體珠子的周圍，當它接觸到相鄰的受體珠子時，在珠子中誘導化學發光反應而最終發出光。當結合到供體珠子的分子不與結合到受體珠子的分子相互作用時，因為供體珠子產生的單重態氧不接觸受體珠子而不發生化學發光反應。
例如生物素化多肽複合物結合到供體珠子，且以穀胱甘肽S轉移酶(GST)標記的Fc受體連接至受體珠子。在不存在包含變異Fc區的競爭性多肽複合物的情況下，包含親代Fc區的多肽複合物與Fc受體相互作用並產生520-620nm的信號。包含未標記的變異Fc區之多肽複合物與包含親代Fc區的多肽複合物競爭與Fc受體的相互作用。相關的結合活性可藉由量化觀察到的螢光下降作為競爭結果的測定。多肽複合物的生物素化，例如使用磺基-NHS-生物素的抗體，是已知的。在攜帶融合基因的細胞中表達Fc受體和GST的方法，被適當地用作為以GST標記Fc受體的方法，所述融合基因藉由將編碼Fc受體的多核苷酸與編碼GST的多核苷酸在可表達載體中在框架內融合，並使用穀胱甘肽管柱進行純化採用而產生。較佳地，將所獲得的信號進行分析，例如藉由將他們與單點競爭模型(one-site competition model)擬合，其使用如GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego)之軟體做非線性回歸分析。
具有降低的FcR結合活性的變異Fc區是指，當使用實質上相同量的相應親代Fc區和變異Fc區進行分析時，與FcR結合的Fc區之結合活性實質上低於親代Fc區。此外，具有增加的FcR結合活性的變異Fc區是指，當使用實質上相同量的相應親代Fc區和變異Fc區進行分析時，與FcR結合的Fc區具有的結合活性實質上強於相應的親代Fc區。具有維持FcR結合活性的變異Fc區是指，當使用實質上相同量的相應親代Fc區和包含變異Fc區的多肽進行分析時，與FcR結合的Fc區具有的結合活性等於或實質上沒有不同於與親代Fc區的結合活性。
Fc區對於各FcR的結合活性是否增加或減少可根據透過上述的測定方法來判斷Fc區與各種FcR的結合量的增加或減少來判定。在此，各種FcR與Fc區的結合量可被評估為藉由將作為分析物的各種FcR與Fc區相互作用前後傳感圖改變的RU值差除以將Fc區抓捕到感測芯片前後傳感圖改變的RU值差的值。Fc區對於FcγR或FcRn的結合活性可藉由本文實例5中描述的方法判定。
在本發明中，實質上降低的FcγR結合活性較佳地是指，例如變異Fc區對於FcγR的結合活性低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%、低於5%、低於2%、低於1%、低於0.5%、低於0.2%或低於0.1%的親代Fc區對於FcγR的結合活性。亦較佳地為意指，例如[FcγR與變異Fc區交互作用前後之傳感圖改變的RU值差]/[將FcγR抓捕到感測晶片前後傳感圖改變的RU值差]的比例是低於1、低於0.8、低於0.5、低於0.3、低於0.2、低於0.1、低於0.08、低於0.05、低於0.03、低於0.02、低於0.01、低於0.008、低於0.005、低於0.003、低於0.002或低於0.001。
在本發明中，未實質上增加的FcRn結合活性，特別是在pH7.4，較佳地是指，例如與親代Fc區的FcRn結合活性相比，變異Fc區對於FcRn的結合活性少於1000倍、少於 500倍、少於 200倍、 少於 100倍、少於 90倍、 少於 80倍、 少於 70倍、少於 60倍、 少於 50倍、 少於 40倍、少於 30倍、少於 20倍、少於10倍、少於 5倍、 少於 3倍或少於 2倍。亦較佳地為意指，例如[FcRn與變異Fc區交互作用前後改變之傳感圖的RU值差]/ [將FcRn抓捕到感測晶片前後改變之傳感圖的RU值差]的比例是低於0.5、低於0.3、低於0.2、低於0.1、低於0.08、低於0.05、低於0.03、低於0.02、低於0.01、低於0.008、低於0.005、低於0.003、低於0.002或低於0.001。
為了判定包含變異Fc區的多肽對於C1q的結合活性，實施C1q結合ELISA。簡言之，可將分析盤以在塗佈緩衝液中包含變異Fc區的多態或包含親代Fc區(控制組)的多肽在4°C下塗佈隔夜。之後盤可被沖洗和阻隔。沖洗後，可將等分的人類C1q加入至每個孔洞中並在室溫下培養2小時。進一步沖洗之後，可將100μl綿羊抗補體C1q過氧化物酶接合抗體(peroxidase conjugated antibody)加入到每個孔中，並在室溫下培養1小時。可再次用沖洗緩衝液沖洗盤，且可將100μl之含有OPD(鄰苯二胺二鹽酸鹽(o-phenylenediamine dihydrochloride (Sigma)))的基質(substrate)緩衝液添加到每個孔中。使藉由觀察黃色外觀的氧化反應進行30分鐘，並藉由加入100μl的4.5N 硫酸(H2 SO4 ) 來終止。然後可讀取492-405 nm的吸光值。Fc區對C1q的結合活性可以藉由本文實例4中描述的方法判定。
於一態樣中，本發明之變異Fc區及親代Fc區之間的C1q結合活性的差係低於50%、低於45%、低於40%、低於35%、低於30%、低於25%、低於20%、低於15%、低於10%、低於5%的親代Fc區的C1q結合活性。
2. 活性分析
於一態樣中，提供識別具有生物活性的抗登革熱病毒抗體之分析法。生物活性可包含，例如阻隔登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合、抑制登革熱病毒進入宿主細胞、抑制及/或避免宿主細胞的登革病毒感染等。亦提供在體內及/或體外具有這些生物活性的抗體。
在某些實施例中，測試本發明之抗體的這些生物活性。在某些實施例中，可利用溶斑減少試驗法(plaque reduction neutralization test, PRNT)測量測試抗體的活性或中和效力。於一些實施例中，可用動物宿主來測量體內的抗登革熱病毒活性。
在某些實施例中，細胞可被用來直接分析登革熱病毒和測試抗體之間的結合。免疫組織化學法(Immunohistochemical techniques)、共焦技術(confocal techniques)及/或用於分析結合的其他技術對於本技術領域中具有通常知識者為習知。此種篩選分析可使用各種細胞株，包含專門為本目而特地工程改造的細胞。用於篩選分析的細胞之實例包含哺乳類細胞、真菌細胞、細菌細胞或病毒細胞。細胞可為受刺激的細胞，如受生長因子刺激的細胞。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，本文揭示的發明設想了用於測量測試抗體與登革熱病毒結合的能力的各種分析。
根據分析，可能需要細胞及/或組織培養。可利用許多不同的生理學分析中之任一來測試細胞。可選地或另外地，可進行分子分析，包含但不限制於以西方墨點法監測蛋白質表達及/或檢測蛋白質-蛋白質交互作用；以質譜法監測其他化學修飾等。
在一些實施例中，這些方法利用動物宿主。例如適於本發明的動物宿主可為任何哺乳類宿主包含靈長類、白鼬(ferrets)、貓、狗、牛、馬及齧齒類，如小鼠、倉鼠、兔子及大鼠。在一些實施例中，動物宿主在施予測試抗體之前或在施予測試抗體同時，接種、感染或以其他方式曝露於病毒。自然的及/或接種的動物可用於各種研究中的任一種。舉例而言，如本領域所習知的，此種動物模型可用於病毒傳播研究。測試抗體可在病毒傳播研究之前、期間或之後施用於合適的動物宿主，以判定抗體阻斷動物宿主中的病毒結合及/或感染性的功效。
於一態樣中，提供用於識別具有生物活性之包含變異Fc區的多肽的分析。生物活性可包含，例如ADCC活性及CDC活性。亦提供在體內及/或體外具有這些生物活性之包含變異Fc區的多肽。
在某些實施例中，測試包含本發明變異Fc區的多肽的此種生物活性。在某些態樣中，包含本發明變異Fc區的多肽與包含親代Fc區的多肽相比，調節了效應物功能。在某些態樣中，這種調節是ADCC及/或CDC的調節。
可進行體內及/或體外細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析來確保抗體具有FcγR結合(因此可能具有ADCC活性)，並維持FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、 FcγRII 及 FcγRIII。FcR在造血細胞上的表達綜述於Ravetch and Kinet, Annu Rev Immunol (1991) 9, 457-492的第464頁之表3中。評估感興趣分子的ADCC活性之體外分析的非限制實例描述於美國專利案No. 5,500,362 (參見，例如Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83, 7059-7063) 及 Hellstrom et al, Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82, 1499-1502； US 5,821,337 (參見 Bruggemann et al, J Exp Med (1987) 166, 1351-1361)。另外，可使用非放射性分析法 (參見，例如流動式細胞測量術的ACTI™非放射性細胞毒性分析 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析 (Promega, Madison, WI))。用於這些分析有用效的效應物細胞包含周邊血液單核細胞(PBMC)和自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可以在體內，例如在如Clynes et al.Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95： 652-656 (1998)所述的動物模式中，評估感興趣的分子之ADCC活性。亦可執行C1q結合分析來確認抗體是否能夠結合C1q因而具有CDC活性。參見在WO 2006/029879 及 WO 2005/100402中Clq和C3c結合ELISA。為評估補體活化作用，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro et al, J Immunol Methods (1997) 202, 163-171； Cragg et al, Blood (2003) 101, 1045-1052；及 Cragg and Glennie, Blood (2004) 103, 2738-2743)。亦可藉由本領域習知的方法進行FcRn結合與體內清除/半衰期測定(參見例如Petkova et al, Int Immunol (2006) 18, 1759-1769)。
D. 免疫接合物(Immunoconjugates)
在一些實施例中，本發明亦提供免疫接合物，其包含與一個或多個細胞毒劑接合之本文的抗登革熱病毒抗體，其中細胞毒劑為，例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(蛋白毒素；細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素(enzymatically active toxins)或其片段)或放射性同位素，。在一些實施例中，本發明亦提供包含與一個或多個細胞毒劑接合之本文之包含變異Fc區的多肽的免疫接合物，其中細胞毒劑為，例如化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(蛋白毒素；細菌、真菌、植物或動物來源的酵素活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一實施例中，免疫接合物是其中抗體與一個或多個藥物接合之抗體-藥物接合物(ADC)，包含但不侷限於美登素(maytansinoid)(參見美國專利案Nos. 5,208,020、5,416,064及歐洲專利案 EP 0 425 235 B1)；澳瑞他汀(auristatin)如單甲基澳瑞他汀藥物部分DE及DF(MMAE 及MMAF) (參見美國專利案 Nos. 5,635,483 及 5,780,588, 及 7,498,298)；尾海兔素(dolastatin)；卡奇黴素(calicheamicin)或其衍生物 (參見美國專利案 Nos. 5,712,374、5,714,586、 5,739,116、 5,767,285、5,770,701、 5,770,710、 5,773,001及 5,877,296；Hinman et al.,Cancer Res. 53：3336-3342 (1993)；及 Lode et al.,Cancer Res. 58：2925-2928 (1998))；蒽環類(anthracycline)如道諾黴素(daunomycin) 或多比柔星 (參見 Kratz et al.,Current Med. Chem. 13：477-523 (2006)； Jeffrey et al.,Bioorganic & Med. Chem. Letters 16：358-362 (2006)； Torgov et al.,Bioconj. Chem. 16：717-721 (2005)；Nagy et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97：829-834 (2000)； Dubowchik et al.,Bioorg. & Med. Chem. Letters 12：1529-1532 (2002)；King et al.,J. Med. Chem. 45：4336-4343 (2002)；以及美國專利案No. 6,630,579)；胺甲蝶呤；長春新鹼；紫杉烷(taxane)，如多烯紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、 拉洛他賽(larotaxel)、替司他賽(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；單端孢黴素(trichothecene)；及 CC1065。
在另一實施例中，免疫接合物包含與酵素活性毒素或其片段接合之本文所描述之抗體，酵素活性毒素或其片段包含但不侷限於白喉A鏈(diphtheria A chain)、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈(ricin A chain)、相思豆毒蛋白A鏈(abrin A chain)、蒴蓮根毒蛋白A鏈(modeccin A chain)、α-帚曲毒蛋白(alpha-sarcin)、油桐 (Aleurites fordii)蛋白質、香石竹(dianthin)毒蛋白、 美洲商陸(Phytolacca Americana)蛋白(PAPI、 PAPII及 PAP-S)、 苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒蛋白(gelonin)、米托黴素(mitogellin)、侷限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊諾霉素(enomycin)及單端孢黴素。
在另一實施例中，免疫接合物包含與放射性原子接合之本文所描述之抗體，以形成放射性接合物。各種放射性同位素可用於產生放射性接合物。實例包含211 At、131 I、125 I、90 Y、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi、32 P、212 Pb及Lu的放射性同位素。當使用放射性接合物來偵測時，其可包含放射性原子用於閃爍研究的放射性原子，例如Tc-99m 或123 I或用於核磁共振(NMR)成像(也被稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記物，像是再次的碘-123(iodine-123 again)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒劑的接合物可藉由多種雙功能蛋白偶聯劑來製備，如N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, SMCC)、亞胺基硫烷(iminothiolane, IT)、亞胺酸酯(imidoesters)的雙功能衍生物(如己二亞胺酸二甲酯鹽酸鹽(dimethyl adipimidate HCl))、活性酯(如二琥珀醯亞胺基辛二酸酯(disuccinimidyl suberate))、醛類(如戊二醛(glutaraldehyde)) 、雙-疊氮化合物(如雙(對- 疊氮苯甲醯基)己二胺(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine))、雙-重氮衍生物(如雙- (對重氮苯甲醯基) -乙二胺(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine))、二異氰酸酯(如甲苯2,6-二異氰酸酯(toluene 2,6-diisocyanate))及雙活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))。例如可如於Vitetta et al.,Science 238：1098 (1987)所述般地製備蓖麻毒蛋白免疫毒素描述。碳-14標記的1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid ，MX-DTPA)是用於將放射性核種(radionuclide)與抗體接合的例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接劑(linker)可為促進細胞內細胞毒性藥物釋放的「可切割連接劑(cleavable linker)」，例如可使用酸不穩定連接劑、肽酶敏感(peptidase-sensitive)連接劑、光不穩定連接劑、二甲基連接劑或含二硫化物的連接劑(Chari et al.,Cancer Res. 52：127-131 (1992)；美國專利案No. 5,208,020)。
本文中免疫接合物或ADCs明確地設想但不侷限於使用交聯劑製備這樣的接合物，所述交聯劑包含但不侷限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、 SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC和磺基-SMPB、和SVSB(琥珀醯亞胺基- (4-乙烯基碸)苯甲酸酯(succinimidyl-(4-vinylsulfone)benzoate))，其為商業上可取得的(例如來自Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A)。
E. 用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供的任何登革熱病毒抗體在檢測生物樣品中是否存在登革熱病毒及/或登革熱病毒E蛋白係有用的。本文所使用的用語「檢測(detecting)」包含定量或定性的檢測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，如血清、全血、血漿、切片樣品、組織樣品、細胞懸浮液、唾液、痰、口腔液、腦脊髓液、羊水、腹水、乳汁、初乳、乳腺分泌物、淋巴液、尿液、汗液、淚液、胃液、關節液、腹膜液、眼晶狀體液(ocular lens fluid)或黏液。
在一實施例中，提供用於診斷或檢測方法的抗登革熱病毒抗體。於進一步的態樣中，提供檢測生物樣品中登革熱病毒存在的方法。在某些實施例中，方法包含在允許抗登革熱病毒抗體與登革熱病毒結合的條件下，將生物樣品與本文所述的抗登革熱病毒抗體接觸，並檢測抗登革熱病毒抗體與登革熱病毒之間是否形成複合物。此種方法可為體內或體外的方法。於另一態樣中，提供檢測生物樣品中登革熱病毒E蛋白存在的方法。在某些實施例中，方法包含在允許抗登革熱病毒抗體與登革熱病毒E蛋白結合的條件下，將生物樣品與本文所述的抗登革熱病毒抗體接觸，並檢測抗登革熱病毒抗體與登革熱病毒E蛋白之間是否形成複合物。此種方法可為體內或體外的方法。在一實施例中，使用抗登革熱病毒抗體來選擇適合用抗登革熱病毒抗體治療的受試者，例如其中登革熱病毒或登革熱病毒E蛋白是用來選擇主體的生物標記。
可使用本發明之抗體診斷的例示性病症包含登革熱病毒感染及由登革熱病毒感染引起或與之相關的疾病及/或症狀，如登革熱、登革熱出血熱(DHF)及登革休克症候群(DSS)。
在一些實施例中，提供標記的抗登革熱病毒抗體。標記包含但不侷限於直接被偵測的標記或部分(如螢光、發色、電子密度(electron-dense)、化學發光和放射性標記)，亦如經由酵素反應或分子相互作用的而間接被偵測的部分，像是酵素或配位基。標記的實施例包含但不侷限於放射性同位素32 P、14 C、125 I、3 H 及131 I；如稀土螯合物之螢光團或螢光素及其衍生物；若丹明(rhodamine)及其衍生物；丹醯(dansyl)；傘形酮(umbellifeixme)；螢光素酶(luceriferases)，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利案No. 4,737,456)；螢光素(luciferin)；2,3-二氫酞嗪二酮(2,3-dihydrophthalazinediones)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) ；鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)；β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)；葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)；溶菌酶(lysozyme)；糖氧化酶(saccharide oxidases)，如葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、半乳糖氧化酶(galactose oxidase)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)；雜環氧化酶(heterocyclic oxidases)，如尿酸酶(uricase)和黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase)；使用過氧化氫結合以氧化染料前體的酶結合的酶，如HRP、乳過氧化酶(lactoperoxidase)或微過氧化物酶(microperoxidase)；生物素/卵白素(biotin/avidin)、自旋標記物(spin labels)、噬菌體標記物(bacteriophage labels)、穩定的自由基(stable free radicals)及其類似物。
在一實施例中，包含本發明變異Fc區的抗體可用作為親和純化劑(affinity purification agent)。在此過程中，抗體變異以本領域習知之技術固定在如Sephadex樹脂或濾紙的固相上。被固定的抗體變異與含有待純化的抗原樣品接觸，之後使用適合的溶劑沖洗載體(support)，適合的溶劑將實質上去除在樣品中除了結合到固定的抗體變異的待純化抗原外的所有物質。最後，用另一適合的溶劑，如pH 5.0的甘胺酸緩衝液沖洗載體，其將從抗體變異釋出抗原。
抗體變異在例如用於偵測特定細胞、組織或血清中感興趣的抗原表現的診斷分析中亦可為有效的。
抗體變體可用於任何已知的分析方法，例如競爭結合分析法、直接和間接三明治分析法(direct and indirect sandwich assays)以及免疫沉澱分析法。Zola, Monoclonal Antibodies： A Manual of Techniques, (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc。
F. 醫藥配方
如本文所述的抗登革熱病毒抗體之醫藥配方係藉由以凍乾製劑或水溶液的形式混合具有所需純度的此種抗體與一個或多個可選的醫藥上可接受的載體而製得(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。
如本文中所述的包含變異Fc區的多肽之醫藥配方係藉由以凍乾製劑或水溶液的形式混合具有所需純度的此種多肽與一個或多個可選的醫藥上可接受的載體而製得。
醫藥上可接受的載體一般在使用劑量和濃度下對接受者是無毒的，且包含但不侷限於： 緩衝液，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包含抗壞血酸和甲硫胺酸(如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；苯基氯卡銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚(phenol)、丁基(butyl)或苯甲醇(benzyl alcohol)；對羥基苯甲酸烷基酯(alkyl parabens)，例如對羥基苯甲酸甲酯(methyl paraben)或對羥基苯甲酸丙酯(propyl paraben)；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇(cyclohexanol)； 3-戊醇(3-pentanol)及間甲酚(m-cresol))；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸(histidine)、精胺酸(arginine)或離胺酸；單醣、雙醣和其他醣類，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子(salt-forming counter-ions)，如鈉；金屬複合物(如鋅-蛋白質複合物)；及/或非離子表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)。例示性的醫藥上可接受的載體於本文中進一步包含間質藥物分散劑，如可溶性中性-活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，如rHuPH20 (HYLENEX (註冊商標)，Baxter International, Inc.)。例示性的一些sHASEGPs使用方法，包含rHuPH20描述於美國專利案Nos. 2005/0260186 及 2006/0104968。在一態樣中，sHASEGP與一或多種其他的糖胺聚醣酶(glycosaminoglycanases)，例如軟骨素酶(chondroitinases)組合。
例示性的凍乾抗體配方描述於美國專利案No. 6,267,958。水溶液抗體配方包含於美國專利案No. 6,171,586和WO2006/044908中所描述者，後者的配方包含組胺酸-醋酸鹽緩沖液。
若為被治療的特定適應症所需，本文中的配方亦可包含多於一種的活性成分，其較佳地為具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。例如可能期望進一步提供抗病毒劑，例如但不侷限於，干擾素(interferons)(如干擾素α-2b、干擾素-γ等)、抗登革熱病毒單株抗體、抗登革熱病毒多株抗體、RNA聚合酶抑製劑、蛋白酶抑製劑、解旋酶抑製劑(helicase inhibitors)、免疫調節劑(immunomodulators)、反義化合物(antisense compounds)、短干擾RNA、短髮夾RNA、微RNA、RNA適配體、核糖酵素及其組合。此種活性成分適合以對於預期目有效的量存在於組合中。
活性成分可被包埋在例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用(interfacial polymerization)製備之微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或粗滴乳液(macroemulsions)中之羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)或明膠微膠囊(gelatin-microcapsules)及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊(poly-(methylmethacrylate) microcapsules)。這些技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的適合實例包含含有抗體的固體疏水性聚合物的半滲透性基質，該基質為成形製品的形式，例如，薄膜或微膠囊。
待用於體內給藥的配方一般為無菌的。無菌可例如藉由無菌濾膜過濾而輕易地完成。
G. 治療方法及組合物
任何本文中所提供的抗登革熱病毒抗體可被用於治療方法。
在一態樣中，提供用作為藥物的抗登革熱病毒抗體。於進一步的態樣中，提供用於治療方法的用途的抗登革熱病毒抗體。在某些實施例中，提供用於治療抗登革熱病毒感染的用途的抗登革熱病毒抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療具有登革熱病毒感染的個體之方法的用途之抗登革熱病毒抗體，方法包含向個體施予有效量的抗登革熱病毒抗體。在一個這樣的實施例中，方法進一步包含給予個體有效量的至少一種其他治療劑，其他治療劑為，像是如下所述者。在進一步實施例中，本發明提供用於阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞的用途之抗登革熱病毒抗體。在某些實施例中，本發明提供用於阻斷個體中登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞之方法的用途之抗登革熱病毒抗體，方法包含向個體施予有效量的抗登革熱病毒抗體以阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞。根據上述任何實施例所提到的「個體」較佳地是指人。
於進一步的態樣中，本發明提供抗登革熱病毒抗體在製造或製備藥物的用途。在一實施例中，該藥物係用於治療登革熱病毒感染。在進一步的實施例中，藥物係用於治療登革熱病毒感染的方法之用途，包含給予具有登革熱病毒感染的個體有效量的藥物。在一個這樣的實施例中，方法進一步包含施予個體有效量的至少一種其他治療劑，其他治療劑為，像是如下所述者。在進一步的實施例中，藥物係用於阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞。在進一步的實施例中，藥物係用於阻斷個體中登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞的方法的用途，該方法包含施予個體有效量的藥物以阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞。根據上述任何實施例所提到的「個體」可為人。
於進一步的態樣中，本發明提供治療登革熱病毒感染的方法。在一個實施例中，該方法包含對具有此種登革熱病毒感染的個體施予有效量的抗登革熱病毒抗體。在一個這樣的實施例中，該方法進一步包含施予個體有效量的至少一種其他治療劑，其他治療劑為，像是如下所述者。根據上述任何實施例所提到的「個體」可為人。
於進一步的態樣中，本發明提供阻斷個體中登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞的方法。在一實施例中，該方法包含給予個體有效量的抗登革熱病毒抗體以阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞。在一實施例中，「個體」是指人。
於進一步的態樣中，本發明提供包含本文提供的任何抗登革熱病毒抗體的醫藥配方，其係例如用於任何上述的治療方法中。在一實施例中，醫藥配方包含本文提供的任何抗登革熱病毒抗體和醫藥上可接受的載體。在另一實施例中，醫藥配方包含本文提供的任何抗登革熱病毒抗體和至少一種其他治療劑，其他治療劑為，像是如下所述者。
於進一步的態樣中，該醫藥配方係用於治療登革熱病毒感染。在進一步的實施例中，醫藥配方用於阻斷登革熱病毒E蛋白與宿主細胞的結合及/或登革熱病毒進入宿主細胞。在一實施例中，醫藥配方被施予具有登革熱病毒感染的個體。根據上述任何實施例所提到的「個體」較佳地是指人。
在某些實施例中，登革熱病毒感染可包含由登革熱病毒感染引起或與之相關的疾病及/或症狀，如登革熱、登革熱出血熱(DHF)及登革休克症候群(DSS)。
任何本文提供之具有變異Fc區的多肽可被用於治療方法的用途。
在一態樣中，提供用於作為藥物的用途之包含變體Fc區的多肽。在某些實施例中，提供用於治療方法的用途之包含變體Fc區的多肽。在某些實施例中，本發明提供用於治療具有病症的個體的方法之用途的包含變體Fc區的多肽，方法包含施予個體有效量的包含變體Fc區的多肽。在一個這樣的實施例中，方法進一步包含施予個體有效量的至少一種其他治療劑。在一個實施例中，病症是病毒感染。在一實施例中，「個體」是人。
於進一步的態樣中，本發明提供包含變體Fc區的多肽用於製造或製備藥物的用途。在一實施例中，藥物是用於治療病症的。在一些態樣中，多肽是抗體。在一些態樣中，多肽是Fc融合蛋白。在進一步的實施例中，藥物係用於治療病症的方法之用途，方法包含給予具有待治療病症的個體有效量的藥物。在一個這樣的實施例中，方法進一步包含施予個體有效量的至少一種其他治療劑。在一個實施例中，病症是病毒感染。在一個實施例中，「個體」是人。
於進一步的態樣中，本發明提供治療病症的方法。在一個實施例中，該方法包含給予具有這些病症的個體有效量的包含變異Fc區的多肽。在一這樣的實施例中，該方法進一步包含給予個體有效量的至少一種其他治療劑。在一個實施例中，病症是病毒感染。在一個實施例中，「個體」是人。
於進一步的態樣中，本發明提供用於例如本文所述的任何治療方法的治療方法之目的的，包含本文提供的包含變異Fc區的多肽的醫藥配方。在一個實施例中，醫藥配方包含本文提供的包含變異Fc區的多肽和醫藥上可接受的載體。在另一實施例中，醫藥配方包含本文提供的包含變異Fc區的多肽和至少一種其他治療劑。
於進一步的態樣中，醫藥配方係用於治療病症。在一個實施例中，將醫藥配方施予具有病症的個體。在一個實施例中，病症是病毒感染。在一個實施例中，「個體」是人。
包含本發明的變異Fc區的抗病毒抗體可抑制裡用傳統抗病毒抗體時所觀察到的抗體依賴性增強(ADE)。ADE是其中與抗體結合的病毒藉由活化FcγR而被吞噬，從而增強病毒對細胞的感染的現象。減少與活化FcγR相互作用的Fc修飾可減輕ADE的風險。已指出在位置234與235從白胺酸(leucine)變成丙胺酸(alanine)以形成LALA突變的突變能夠降低體內登革熱感染的ADE風險(Cell Host Microbe (2010) 8, 271-283)。然而，這些修飾降低了抗體介導的其他效應物免疫功能，如ADCC和CDC。特別是，可預期CDC在抑制ADE中扮演重要的角色，因此Fc區的補體成分C1q結合不因治療功效而降低。抗體半衰期可藉由工程改造Fc區來延長，其改變對其挽救受體FcRn的結合親和力，這可能導致用於保護病毒感染的抗體的預防性用途。
病毒較佳地選自於腺病毒(adenovirus)、星狀病毒(astrovirus)、肝炎病毒(hepadnavirus)、皰疹病毒(herpesvirus)、乳多泡病毒(papovavirus)、痘病毒(poxvirus)、沙狀病毒(arenavirus)、崩芽病毒(bunyavirus)、杯狀病毒(calcivirus)、冠狀病毒(coronavirus)、絲狀病毒(filovirus)、黃病毒(flavivirus)、正黏液病毒(orthomyxovirus)、副黏液病毒(paramyxovirus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、里奧病毒(reovirus)、反轉錄病毒(retrovirus)、棒狀病毒(rhabdovirus)或披衣病毒(togavirus)。
在較佳的實施例中，腺病毒包括但不侷限於人腺病毒。在較佳的實施例中，星狀病毒包括但不侷限於哺乳動物星狀病毒(mamastrovirus)。在較佳的實施例中，肝炎病毒包括但不侷限於B型肝炎病毒(hepatitis B virus)。在較佳的實施例中，皰疹病毒包括但不侷限於第一型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type I)、第二型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 2)、人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、水痘帶狀皰疹病毒(varicella zoster virus)、玫瑰皰疹病毒(roseolovirus)和卡波西肉瘤相關性皰疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus)。在較佳的實施例中，乳多泡病毒包括但不侷限於人類乳突瘤病毒(human papilloma virus)和人多瘤病毒(human polyoma virus)。在較佳的實施例中，痘病毒包括但不侷限於天花病毒(variola virus)、痘瘡病毒(vaccinia virus)、牛痘病毒(cowpox virus)、猴痘病毒(monkeypox virus)、天花病毒(smallpox virus)、假牛痘病毒(pseudocowpox virus)、丘疹性口炎病毒(papular stomatitis virus)、塔那痘病毒(tanapox virus)、亞巴猴腫瘤病毒(yaba monkey tumor virus)和傳染性軟疣病毒(molluscum contagiosum virus)。在較佳的實施例中，沙狀病毒包括但不侷限於淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus)、拉薩病毒(lassa virus)、馬丘波病毒(machupo virus)及胡寧病毒(junin virus)。在較佳的實施例中，崩芽病毒包括但不侷限於漢他病毒(hanta virus)、內羅病毒(nairovirus)、正本雅病毒(orthobunyavirus)和沙蠅病毒(phlebovirus)。在較佳的實施例中，杯狀病毒包括但不侷限於囊泡狀病毒(vesivirus)、諾羅病毒(norovirus)，如諾瓦克病毒(Norwalk virus)和沙波病毒(sapovirus)。在較佳的實施例中，冠狀病毒包括但不侷限於人類冠狀病毒(human coronavirus)(嚴重急性呼吸系統綜合症(severe acute respiratory syndrome, SARS)的病原體)。在較佳的實施例中，絲狀病毒包括但不侷限於伊波拉病毒(Ebola virus)和馬堡病毒(Marburg virus)。在較佳的實施例中，黃病毒包括但不侷限於黃熱病毒(yellow fever virus)、西尼羅病毒(West Nile virus)、登革熱病毒(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4)、C型肝炎病毒(hepatitis C viru)、蜱傳腦炎病毒(tick borne encephalitis virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、墨累谷腦炎病毒(Murray Valley encephalitis virus)、聖路易斯腦炎病毒(St. Louis encephalitis virus)、俄羅斯春夏腦炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus)、鄂木斯克出血熱病毒(Omsk hemorrhagic fever virus)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus)、科薩努森林病病毒(Kyasanus Forest disease virus)、以及波瓦森腦炎病毒(Powassan encephalitis virus)。在較佳的實施例中，正黏液病毒包括但不侷限於A型流感病毒(influenza virus type A)、B型流感病毒(influenza virus type B)和C型流感病毒(influenza virus type C)。在較佳的實施例中，副黏液病毒包括但不侷限於副流感病毒(parainfluenza viru)、腮腺炎病毒(rubula virus) (流行性腮腺炎(mumps))、麻疹病毒(morbillivirus)(麻疹(measles))、肺炎病毒(pneumovirus)，如人類呼吸道融合病毒(human respiratory syncytial virus)和亞急性硬化性全腦炎病毒(subacute sclerosing panencephalitis virus)。在較佳的實施例中，小核糖核酸病毒包括但不侷限於脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、鼻病毒(rhinovirus)、克沙奇病毒A型(coxsackievirus A)、克沙奇病毒B型(coxsackievirus B)、A型肝炎病毒(hepatitis A viru)、伊科病毒(echovirus)和腸病毒(eneterovirus)。在較佳的實施例中，里奧病毒包括但不侷限於科羅拉多壁蝨熱病毒(Colorado tick fever virus)和輪狀病毒(rotavirus)。在較佳的實施例中，反轉錄病毒包括但不侷限於慢病毒(lentivirus)，如人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)和人類嗜T淋巴球病毒(human T-lymphotrophic virus, HTLV)。在較佳的實施例中，棒狀病毒包括但不侷限於麗莎病毒(lyssavirus) ，如狂犬病病毒(rabies virus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus)和傳染性造血組織壞死症病毒(infectious hematopoietic necrosis virus)。在較佳的實施例中，披衣病毒包括但不侷限於α病毒(alphavirus)，如羅斯河病毒(Ross river virus)、歐尼昂-尼昂病毒(O'nyong'nyong virus)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、東部馬腦炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、西部馬腦炎病毒(Western equine encephalitis virus)和德國麻疹病毒(rubella virus)。
於進一步的態樣中，本發明提供用於製備藥物或醫藥配方的方法，包含將本文提供的任何抗登革熱病毒抗體與醫藥上可接受的載體混合，以例如用於任何上述治療方法中。在一個實施例中，用於製備藥物或醫藥配方的方法進一步包含將至少一種其他治療劑添加到藥物或醫藥配方中。
於治療中，本發明的抗體可單獨使用或與其它藥劑組合使用。例如，本發明的抗體可與至少一種其他治療劑共同施予。在某些實施例中，另外的治療劑是抗病毒劑，例如但不侷限於干擾素(例如干擾素α-2b、干擾素-γ等)、抗登革熱病毒單株抗體、抗登革熱病毒多株抗體、RNA聚合酶抑製劑、蛋白酶抑製劑、解旋酶抑製劑、免疫調節劑、反義化合物、短干擾RNA、短髮夾RNA、微RNA、RNA適配體、核糖酵素及其組合。
於進一步的態樣中，本發明提供用於製備藥物或醫藥配方的方法，包括將任何本文提供的包含變異Fc區的多肽與醫藥上可接受的載體混合，以，例如用於任何上述治療方法中。在一個實施例中，用於製備藥物或醫藥配方的方法進一步包含將至少一種其他治療劑添加到藥物或醫藥配方中。
於治療中，本發明的包含變異Fc區的多肽可以單獨使用或與其它藥劑組合使用。例如，本發明包含變異Fc區的多肽可以與至少一種其他治療劑共同施予。在某些實施例中，其他治療劑是抗病毒劑，例如但不限於干擾素(例如干擾素α-2b、干擾素-γ等)、抗病毒單株抗體、抗病毒多株抗體、RNA聚合酶抑製劑、蛋白酶抑製劑、解旋酶抑製劑、免疫調節劑、反義化合物、短干擾RNA、短髮夾RNA、微RNA、RNA適配體、核糖酵素及其組合。
上述的這些組合治療包含組合給藥(其中兩種或多種治療劑被包含在相同或分開的配方中)和分別給藥，在這種情況下，本發明包含變異Fc區的多肽或抗體的施予可在一種或多種其他治療劑的施予之前、同時及/或之後發生。在一實施例中，抗登革熱病毒抗體的施用和其他治療劑的施用相互在約一個月內或一、二、三周內或在一、二、三、四、五或六天內發生。在另一實施例中，包含變異Fc區的多肽的施用和其他治療劑的施用相互在約一個月內或一、二、三周內或在一、二、三、四、五或六天內發生。
本發明包含變異Fc區的多肽或抗體(以及任何其他治療劑)可以藉由任何適合的手段施用，包括腸胃外、肺內和鼻內，且如果需要局部治療，則在病灶內施用。腸胃外輸液包含肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下給藥。可以藉由任何適合的途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，其在一定程度上係根據給藥是短期或長期性而定。各種給藥的排程包含但不侷限於單次或在不同時間點多次給藥，推注給藥和脈衝輸注亦在本文考量範圍中。
本發明包含變異Fc區的多肽或抗體將以與良好醫療實踐相符的方式進行配方、配量及施用。在這種情況下考慮的因素包含待治療的具體病症、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病症的原因、藥物遞送部位、給藥方法、給藥時間排程以及醫生已知的其他因素。藥劑不必要但是可選擇地與目前用於預防或治療問題病症的一種或多種藥劑一起配製。這種其他藥劑的有效量取決於製劑中存在的藥劑的量、病症或治療的類型以及上面討論的其它因素。這些通常以與本文相同的劑量及相同的給藥途徑使用，或本文所述劑量的大約1%至99%使用，或以藉由經驗/臨床判定為適合的任何劑量和任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，本發明包含變異Fc區的多肽或抗體的合適劑量(當單獨使用或與一種或多種另外的其他治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、抗體的類型、包含變異Fc區的多肽的類型、疾病的嚴重性及進程、抗體或包含變異Fc區的多肽是否以預防或治療的目的施予、先前的治療、患者的臨床病史及對抗體或包含變異Fc區的多肽的反應、及主治醫生的判斷。抗體或包含變異Fc區的多肽經由一次性地或在一系列的治療中適當地施予患者。根據疾病的類型和嚴重性，約1 μg/kg 至 15 mg/kg (如 0.1mg/kg至10mg/kg)的抗體或包含變異Fc區的多肽可為對患者施用的最初候選劑量，無論係例如，藉由一次或多次分開給藥，或藉由連續輸注。根據上述因素，典型的每日劑量可以在1 μg/kg至100 mg/kg或更多的範圍內。根據病症，幾天或更長時間的重複給藥，一般將持續治療直到出現期望的疾病症狀抑制。抗體或包含變異Fc區的多肽的一個例示性劑量係在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg的範圍內。因此，可向患者施予約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg(或其任何組合)的一個或多個劑量。這些劑量可以間隔地給藥，例如每周或每三周地給藥(例如使患者接受約2至約20次，或例如約6次的抗體或包含變異Fc區的多肽)。可以一開始施予高負荷劑量，之後施用一次或多次的較低劑量。這種治療方法很容易藉由一般的技術和分析進行監測。
可以理解的是，上述任何配方或治療方法可使用本發明的免疫接合物代替抗登革熱病毒抗體或除抗登革熱病毒抗體之外另外添加本發明的免疫接合物來進行。同樣可以理解的是，上述任何配方或治療方法可使用本發明的免疫接合物代替本文提供的包含變異Fc區的多肽或除本文提供的包含變異Fc區的多肽之外另外添加本發明的免疫接合物來進行。
H. 製品
在本發明的另一態樣中，提供了包含有用於治療、預防及/或診斷上述病症材料的製品。該製品包含容器和與該容器結合的標籤或藥品仿單(package insert)。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料製成，例如玻璃或塑料。容器裝有組合物，該組合物本身或與另一種組合物組合而對於治療，預防及/或診斷病症係有效的，並且可具有無菌存取口(例如該容器可以是靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性試劑是本發明的抗體或包含變異Fc區的多肽。標籤或藥品仿單標明組合物是用於治療特定的病症。此外，製品可包含(a)有組合物包含於其中的第一容器，其中組合物包括本發明的抗體或包含變異Fc區的多肽；及(b)有組合物包含於其中的第二容器，其中組合物包括另外的細胞毒性劑或其他治療劑。在本發明的此實施例中的製品可進一步包括標明組合物可用於治療特定症狀的藥品仿單。替代地或額外地，製品可進一步包括第二(或第三)容器，其包括醫藥上可接受的緩衝劑，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及葡萄糖溶液。從商業及用戶立場，其可進一步包含所需的其他材料，包含其他緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針頭及注射器。
可以理解的是，上述任何製品可包含本發明的免疫接合物來代替抗登革熱病毒抗體或除抗登革熱病毒抗體之外另外包含本發明的免疫接合物。可以理解的是，上述任何製品中可包含本發明的免疫接合物來代替包含變異Fc區的多肽或除包含變異Fc區的多肽之外另外包含本發明的免疫接合物。
III. 實例
以下是本發明的方法和組合物的實例。可以理解的是，鑑於上述提供的一般性描述，可以實施各種其他實施例。
實例1：抗原及抗體的製備
來自DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的重組可溶性E蛋白的表達和純化。
來自DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4之具有羧基端8x組胺酸標籤(分別為SEQ ID NOs：65-68)的重組可溶性E蛋白(0.8 E-His)係使用FreeStyle293- F細胞株或Expi293細胞株(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬時表達(expressed transiently)。藉由表達來自DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的prM0.8E-His(分別為SEQ ID NOs：61-64)，prM0.8E-His在細胞中被表達為單個多肽，其接著在細胞內處理以在prM和0.8E-His之間切割。結果，0.8E-His被分泌到細胞培養基中。將含有0.8E-His的條件培養基用於以裝有鎳或鈷的固定化金屬親和層析(IMAC)樹脂填充的管柱，接著以咪唑(imidazole)洗脫。收集含有0.8E-His的部分並用於Superdex 200凝膠過濾管柱(GE healthcare，Uppsala，Sweden)。收集含有0.8E-His的部分並儲存在-80°C。
重組人類FcγRs的表達與純化
人類FcγRs的細胞外域由以下方法製備。首先，藉由本領域具有通常知識者所習知的方法合成FcγRs的胞外域基因。此時，根據在NCBI註冊的訊息生成每個FcγR的序列。具體而言，根據NCBI登錄號NM_000566(版本號NM_000566.3)的序列產生FcγRIa、根據NCBI登錄號NM_001136219(版本號NM_001136219.1)的序列產生FcγRIIa、根據NCBI登錄號NM_004001(版本號NM_004001.3)的序列產生FcγRIIb、根據NCBI登錄號NM_001127593(版本號NM_001127593.1)的序列產生FcγRIIIa以及根據 NCBI登錄號NM_000570(版本號NM_000570.3)的序列產生FcRγIIIb，並且His標籤連接至每個FcγR建構體的C末端。此外，FcγRIIa、FcγRIIIa和FcRγIIIb的多形性(polymorphism)的存在是已知的，並且FcγRIIa藉由參考Warmerdam et al. (J Exp Med (1990) 172, 19-25)；FcγRIIIa 藉由參考Wu et al. (J Clin Invest (1997) 100, 1059-1070) ；及FcγRIIIb藉由 參考Ory et al. (J Clin Invest (1989) 84, 1688-1691)生成多形性的位點。
藉由將獲得的基因片段插入動物細胞表達載體而建構表達載體。將建構的表達載體瞬時導入人類胚胎腎癌細胞衍生的FreeStyle293細胞(Invitrogen)中以表達感興趣的蛋白質。自經過瞬時導入的上述細胞的培養基得到的培養上清液通過0.22 μm過濾器過濾而製備的液體，原則上藉由以下四個步驟純化：(i)陽離子交換管柱層析(SP Sepharose FF)；(ii)His標籤親和管柱層析(affinity column chromatography for His-tag, HisTrap HP)；(iii)凝膠過濾管柱層析(Superdex200)；及(iv)無菌過濾。為了純化FcγRI，在步驟(i)中使用具有Q瓊脂糖FF(Q sepharose FF)的陰離子交換管柱層析。使用分光光度計在280nm測量純化的蛋白質的吸光值。根據測量值，使用藉由像是PACE(Protein Science(1995)4,2411-2423)之方法測定的消光係數，計算純化蛋白質的濃度。
重組小鼠FcγRs的表達與純化
藉由以下方法製備小鼠FcγRs(mFcγRs)的胞外域：首先，藉由本領域具有通常知識者習知的方法合成FcγR胞外域的基因。為了該合成，根據NCBI中登記的訊息製備每個FcγR的序列。具體而言，根據NCBI參考序列：NP_034316.1的序列製備mFcγRI；根據NCBI參考序列：NP_034317.1的序列製備mFcγRIIb；根據NCBI參考序列：NP_034318.2的序列製備mFcγRIII；並且根據NCBI參考序列NP_653142.2的序列製備mFcγRIV。這些序列中的每一個都用His標籤標記C-末端。
將獲得的各基因片段插入在動物細胞中表達的載體中以製備表達載體。將製備的表達載體瞬時轉移到人類胚胎腎癌細胞的FreeStyle 293細胞(Invitrogen)以表達感興趣的蛋白質。回收所得的培養上清液，並接著使其通過0.22μm的過濾器，以得到培養上清液。得到培養上清液通常藉由以下四個步驟純化：(i)離子交換管柱層析，(ii)His標籤親和管柱層析(HisTrap HP)，(iii)凝膠過濾管柱層析(Superdex 200 )，和(iv)無菌過濾。步驟(i)中， mFcγRI的離子交換管柱層析係使用Q瓊脂糖 HP，mFcγRIIb及mFcγRIV的離子交換管柱層析係使用SP瓊脂糖 FF，且mFcγRIII的離子交換管柱層析係使用SP瓊脂糖 HP進行。D-PBS(-)在步驟(iii)中或之後用作為溶劑，其中mFcγRIII使用含有0.1M精胺酸的D-PBS(-)作為溶劑。使用分光光度計在280nm測量各純化蛋白質的吸光值，並使用自像是PACE(Protein Science(1995)4,2411-2423)之方法獲得的值所計算出之消光係數，計算純化蛋白質的濃度。
重組人類FcRn的表達與純化
FcRn是FcRnα鏈及β2-微球蛋白的異二聚體。根據公開的人類FcRn基因序列(J Exp Med(1994)180,2377-2381)製備寡聚DNA引子(Oligo-DNA primers)。使用人類cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)作為模板和製備的引子，藉由PCR製備編碼整個基因的DNA片段。編碼含有訊號區域(Met1-Leu290)胞外域的DNA片段係以獲得的DNA片段為模板，藉由PCR擴增，並插入到哺乳動物細胞表達載體中。同樣地，根據公開的人類β2-微球蛋白基因序列(Proc Natl Acad Sci USA(2002)99,16899-16903)製備寡聚DNA引子。使用人類cDNA (Human Placenta Marathon-Ready cDNA，Clontech)作為模板和所製備的引子，藉由PCR製備編碼整個基因的DNA片段。使用得到的DNA片段作為模板，編碼包含訊號區域(Met1-Met119)的整個蛋白質的DNA片段藉由PCR擴增，並插入到哺乳動物細胞表達載體中。
藉由以下步驟表達可溶性人類FcRn。藉由脂轉染法(lipofection method)，使用PEI(Polyscience)，將建構用於表達人FcRnα鏈(SEQ ID NO：81)和β2-微球蛋白(SEQ ID NO：82)的質體引入人類胚胎腎癌衍生細胞株HEK293H(Invitrogen)的細胞。收集所得培養上清液，使用IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)純化FcRn，然後使用HiTrap Q HP(GE Healthcare)(J Immunol(2002)169,5171-5180)進一步純化。
重組抗體的表達與純化
使用FreeStyle293-F細胞株或Expi293細胞株(Thermo Fisher，Carlsbad，CA，USA)瞬時表達重組抗體。使用蛋白質A用一般方法進行表達抗體的條件培養基的純化。若有需要，進一步進行凝膠過濾。
重組可溶性人類CD154的表達與純化
根據公開的蛋白質序列(NP_000065.1)合成人類CD154基因。使用合成的DNA作為模板，藉由PCR製備編碼具有FLAG標籤的可溶形式的人CD154(shCD154)的DNA片段，將所得的DNA片段插入到哺乳動物細胞表達載體中，由此產生FLAG-shCD154( SEQ ID NO：106)表達載體。使用本領域技術人員習知的一般方法確定獲得的表達載體的核苷酸序列。如製造商提供的方案所述，使用FreeStyle 293細胞株(Invitrogen)表達FLAG-shCD154。轉染後，在收穫條件培養基之前，使細胞生長適當的時間。使用25 mM MES(pH6.0)對條件培養基進行陽離子交換層析，並用連續梯度25 mM MES，1M NaCl(pH6.0)洗脫FLAG-shCD154。收集峰部分，使用Amicon Ultra Ultracel進行濃縮，並使用磷酸鹽緩衝鹽水(Wako)進行凝膠過濾層析。再次收集峰部分並使用Amicon Ultra Ultracel濃縮，然後藉由用0.22微米PVDF膜過濾器過濾滅菌。使用分光光度計在280 nm測量吸光值以確定純化的FLAG-shCD154的濃度。使用藉由在Protein Science (1995) 4: 2411-2423中描述之方法計算出的吸收係數，自該確定值計算純化蛋白質的濃度。
實例2： 產生對登革熱病毒 E蛋白具有改善的親和力之抗體變異。
編碼抗登革熱病毒 E蛋白抗體的VH(3CH，SEQ ID NO：1)和VL(3CL，SEQ ID NO：7)的基因被合成，並分別與人類IgG1CH(SG182，SEQ ID NO：46 )和人類CL(SK1，SEQ ID NO：60)組合，並將兩種建構體皆選殖到單個表達載體中。抗體在本文中被稱為DG_3CH-SG182 /3CL-SK1或3C。
檢驗了許多突變及其組合，以識別改善3C的結合特性的突變和組合。然後將多個突變引入可變區以增強對E蛋白的結合親和力。從而產生優化的VH變異3CH912 (SEQ ID NIO： 2)、3CH953 (SEQ ID NO： 3)、 3CH954 (SEQ ID NO： 4)、 3CH955 (SEQ ID NO： 5)、 3CH1047 (SEQ ID NO： 6)、 3CH987 (SEQ ID NO： 90)、3CH989 (SEQ ID NO： 91)、3CH992 (SEQ ID NO： 92)、 3CH1000 (SEQ ID NO： 93)、 3CH1046 (SEQ ID NO： 94)、3CH1049 (SEQ ID NO： 95)， 及優化的 VL 變異 3CL499 (SEQ ID NO： 8)、 3CL563 (SEQ ID NO： 9)、 3CL658 (SEQ ID NO： 10)、 3CL012 (SEQ ID NO： 96)、3CL119 (SEQ ID NO： 97)、 3CL633 (SEQ ID NO： 98)、3CL666 (SEQ ID NO： 99)、 3CL668 (SEQ ID NO： 100)。將編碼VH的基因與人IgG1CH(SG182，SEQ ID NO：46；SG1095，SEQ ID NO：54；或SG1106，SEQ ID NO：59中的任一個)組合，並將編碼VL的基因與人類CL(SK1，SEQ ID NO：60) 組合。將它們中的每一個選殖到表達載體中。抗體變異的胺基酸序列總結於表2。其中一變異，DG_3CH1047-SG182 / 3CL658-SK1在本文中也被稱為3Cam，且另一變異，DG_3CH1047-SG182 / 3CL-SK1在本文中被稱為3Cam2。
抗體在用重鏈和輕鏈表達載體的混合物共轉染的HEK293細胞中表達，並藉由蛋白質A純化。
表2
3C及3C變異的胺基酸序列
Figure 02_image001
使用Biacore T200儀器(GE Healthcare)在25°C測定結合DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的E蛋白的抗登革熱病毒 E蛋白抗體的親和力。使用胺偶聯試劑盒(amine coupling kit (GE Healthcare))將抗組胺酸抗體(GE Healthcare)固定在CM4感測芯片的所有流通槽(flow cells)上。在含有20mM磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％Tween 20和0.005%NaN3 的pH 7.4的PBS中製備所有抗體和分析物。將具有C末端His標籤的DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4的E蛋白捕獲到流通槽2或3上，流通槽1作為參考流通槽。 E蛋白的捕獲量的目標為200共振單位(RU)。在整個感測表面上以250nM注射抗登革熱病毒 E蛋白抗體180秒，接著進行300秒解離。每次循環後使用10mM Gly-HCl pH1.5再生感測表面。使用Biacore T200評估軟件2.0版(GE Healthcare)，藉由處理和擬合數據至1：1結合模型來測定結合親和力。
表3a和3b顯示了與DENV-1(在表中描述為DV1)、DENV-2(在表中描述為DV2)中的DENV-3(在表中被描述為DV3)和DENV-4(在表中被描述為DV4)的E蛋白結合之抗登革熱病毒 E蛋白抗體的親和力(Kd )。與親代3C相比，每種3C變異對所有四種DENV血清型皆顯示了增加的結合親和力。作為實例，第1圖中顯示了親代抗體3C(DG_3CH-SG182/3CL-SK1)及其中一變異抗體3Cam(DG_3CH1047-SG182/3CL658-SK1)的傳感圖。而且，第12圖顯示親代抗體3C (DG_3CH-SG182/3CL-SK1)及其中一變異變異抗體3Cam2(DG_3CH1047-SG182/3CL-SK1) 的傳感圖。
表3a
3C和3C變異對四種DENV血清型的Kd值
Figure 02_image003
註：*強結合物(binders)，解離速率慢(slow off rate)＜1E-05，無法單獨判定KD
表3b
3C和3C變異對DENV1和DENV3血清型的Kd值
Figure 02_image005
註：*強結合物(binders)，解離速率慢(slow off rate)＜1E-05，無法單獨判定KD
實例3：改善性能的抗體CH變異之生成
將多個突變導入人類IgG1重鏈恆定區CH (SG182, SEQ ID NO： 46)，從而導致生成人類IgG1 CH 變異SG192 (SEQ ID NO： 47)、SG1085 (SEQ ID NO： 48)、SG1086 (SEQ ID NO： 49)、 SG1087 (SEQ ID NO： 50)、 SG1088 (SEQ ID NO： 51)、 SG1089 (SEQ ID NO： 52)、SG1090 (SEQ ID NO： 53)、 SG1095 (SEQ ID NO： 54)、 SG1096 (SEQ ID NO： 55)、 SG1097 (SEQ ID NO： 56)、 SG1098 (SEQ ID NO： 57)、 SG1105 (SEQ ID NO： 58)、SG1106 (SEQ ID NO： 59)、 SG1109 (SEQ ID NO： 107)、SG1044 (SEQ ID NO： 108)及 SG1045 (SEQ ID NO： 109)。編碼CH 變異的基因與3C (3CH, SEQ ID NO： 1)、一個3C 變異 (3CH1047，SEQ ID NO： 6)或抗-CD154 抗體 (SLAPH0336a，SEQ ID NO： 88)的VH組合。 抗-CD154抗體(SLAPL0336a，SEQ ID NO： 89)的VL 基因與人類CL(SK1，SEQ ID NO： 60)組合。將其中的每一個選殖到表達載體中。CH變異的細節總結在表4中。可使用在三聚抗原CD154存在下可形成大免疫複合物的抗CD154抗體SLAPH0336a / SLAPL0366a的可變區，以評估結合CH變異與每個Fc受體結合的親和力。
抗體在用重鏈和輕鏈表達載體的混合物共轉染的HEK293細胞中表達，並藉由蛋白質A純化。
表4
變異Fc區的胺基酸序列
Figure 02_image007
實例4：具有Fc變異的抗體對於補體C1q的結合親和力
人類C1q結合分析
將具有Fc變異的抗CD154抗體(使用實例3中描述的方法產生的內部抗體(in-house antibodies))分配到Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge Nunc International)上並在4°C放置過夜。用PBST洗滌後，在室溫下用含有0.5%BSA和1×Block Ace：Blocking Reagent(DS Pharma)的TBST阻斷盤2小時。洗滌盤後，將人類C1q(Calbiochem)分配到盤中，並在室溫下放置1小時。將盤洗滌後，加入HRP標記的抗人類C1q抗體(Bio Rad)，以在室溫反應1小時，並進行洗滌。隨後加入TMB受質(Invitrogen)。由盤分析儀(plate reader)在450 nm(測試波長)和570 nm(參考波長)的波長處測量訊號。具有野生型Fc區(WT)的抗體與人類C1q的結合親和力會藉由將LALA突變引入Fc區而減少，且對人類C1q的結合親和力之減少係藉由進一步引入LALA突變以外的KWES、EFT或EFT + AE來恢復(第2圖)。LALA + KMES突變略微地增加了結合親和力，而LALA + KWES、LALA + KAES和LALA + KEES突變以與WT相當的親和力結合C1q(第3圖)。上述的LALA或LALA + KAES突變的結合特性不受進一步引入ACT3或ACT5突變影響(第4圖)。
小鼠C1q結合分析
將具有Fc變異的抗CD154抗體(使用實例3中描述的方法產生的內部抗體)分配到Nunc-ImmunoPlate MaxiSorp(Nalge Nunc International)上並在4°C放置過夜。用PBST洗滌後，在4°C用含有0.5%BSA和1×Block Ace：Blocking Reagent(DS Pharma)的TBST阻斷盤7小時。洗滌盤後，將10%小鼠血漿(Innovative Research)分配到盤中，並在4°C放置過夜。洗滌盤並加入生物素化的抗小鼠C1q抗體(Hycult Biotech)，以在室溫反應1小時，並進行洗滌。加入鏈黴親和素-HRP(Streptavidin-HRP (Pierce))，以在室溫反應1小時，並進行洗滌。隨後加入ABTS ELISA HRP受質(KPL)。藉由盤分析儀在405nm的波長處測量訊號。具有野生型Fc區(WT)的抗體與小鼠C1q的結合親和力會藉由將LALA突變引入Fc區而減弱，且對小鼠C1q的結合親和力之降低係藉由進一步引入LALA突變之外的KAES來恢復。上述LALA或LALA + KAES突變的結合特性不受進一步引入ACT3或ACT5突變影響(第5圖)。
實例5：結合到FcγRs 及 FcRn的Fc變異的Biacore 分析
使用Biacore T200儀(GE Healthcare)在25°C測定Fc變異在pH7.4對人類或小鼠FcγRs和人類FcRn的結合。在含有50mM磷酸鈉、150mM NaCl、0.05％Tween 20、0.005%NaN3 的pH 7.4的PBS-P中製備所有抗體和FcγR或FcRn。使用胺偶聯試劑盒(GE Healthcare)將抗組胺酸抗體(GE Healthcare)固定在CM4感測芯片的所有流通槽上以用於FcγR結合分析。藉由抗組胺酸抗體將每個FcγR在捕獲流通槽2、3或4上，以流通槽1作為參考流通槽。 FcγR捕獲量的目標是400共振單位(RU)。所有抗體都以100nM注射到所有的流通槽上。免疫複合物藉由以1：1莫耳比例混合抗體和三聚體CD154，並在室溫下培養1小時來製備。每次循環後使用pH 1.5的10mM甘胺酸-HCl再生感測表面。
使用Biotin CAPture試劑盒(GE Healthcare)將Biotin CAPture Reagent(GE Healthcare)固定在CAP感測芯片的流通槽1和流通槽2上以用於FcRn結合分析。將生物素化FcRn捕獲到流通槽2上，流通槽1作為參考流通槽。 FcRn捕獲量的目標為400RU。將所有抗體以100 nM注射到流通槽1和2上。藉由以1：1的莫耳比例混合抗體和三聚體CD154，並在室溫下培養1小時而製備免疫複合物。每次循環後使用8M鹽酸胍、1M NaOH(3：1 v/v)再生感測表面。
結合量對相應的FcγR或FcRn的捕獲量標準化。基於結合反應來監測單獨的抗體或免疫複合物(抗體及三聚體CD154抗原)對人類或小鼠FcγR和人FcRn的結合。免疫複合物被用於評估藉由親和力作用增強之對FcγR或FcRn的結合。第6圖(a)至 (h)部分中顯示人類FcγR1a、FcγR2a 167H和167R、FcγR2b、FcγR3a 158F和158V、FcγR3b NA1和NA2的結果。第7圖(a)至(d)部分表示小鼠FcγR1、FcγR2b、FcγR3、FcγR4的結果。對於測試的每種FcγR，野生型Fc區(描述為WT IgG)的結合會藉由將LALA、LALA + KAES或LALA + KWES突變引入的Fc區而顯著降低。在單獨使用抗體(記載為Ab alone)和免疫複合物(記載為CD154IC)的分析之間的趨勢大致相同。對於大多數測試的FcγR，KAES或KWES突變的結合與WT IgG的結合相比沒有大幅降低。第8圖顯示人類FcRn的結果。即使在將LALA或LALA + KAES突變引入Fc區之後，野生型Fc區(描述為hIgG1)與人類FcRn的結合也沒有表現出其受到了影響。結合藉由進一步引入ACT3或ACT5突變而稍微增強了，但仍然保持相對較低(第8圖)。
實例6： 抗登革熱病毒抗體對登革熱病毒感染的體內效果
6-8週齡AG129小鼠用106 斑點形成單位(pfu)DENV-2毒株D2Y98P腹膜內感染。 48小時後，用25 μg PBS中抗體治療小鼠。抗體經由眼窩路徑(retro-orbital route)靜脈注射。再24小時後，即初次感染72小時後，收集血液。在之前的研究中(Zust et al, J Virol (2014) 88, 7276-7285; Tan et al, PLOS Negl Trop Dis (2010) 4, e672)，已建立在D2Y98P感染之後，峰值病毒血症(peak viremia)會在感染後3-4天之間達到。從來自每隻小鼠的血漿中提取病毒RNA，並進行定量PCR，並與斑點試驗中具有已知感染性的DENV-2標準進行比較。在這個小鼠模型中，與PBS控制組相比，3C和3Cam抗體都大幅降低了病毒血症，並且兩種抗體的效果相當。與僅具有LALA突變的抗體相比，在Fc區中具有LALA + KAES突變的抗體顯示出更強的效果。 3C和3Cam抗體都是如此(第9圖)。該結果表明藉由向LALA突變添加KAES突變來恢復C1q結合活性與抗體的抗病毒效力相關。
6-8週齡的AG129小鼠用106 斑點形成單位(pfu)的登革熱病毒(DENV-1毒株 08K3126、DENV-2毒株 D2Y98P、DENV-3毒株VN32/96、DENV-4毒株 TVP360)腹膜內感染。 48小時後，用25 μg PBS中抗體治療小鼠。抗體經由眼窩路徑靜脈注射。再24小時後，即初次感染72小時後，收集血液。在之前的研究中(Zust et al, J Virol (2014) 88, 7276-7285; Tan et al, PLOS Negl Trop Dis (2010) 4, e672)，已建立在D2Y98P感染之後，峰值病毒血症(peak viremia)會在感染後3-4天之間達到。從來自每隻小鼠的血漿中提取病毒RNA，並進行定量PCR，並與斑點試驗中具有已知感染性的DENV-2標準進行比較。在這個小鼠模型中，與PBS控制組相比，具有相同Fc變異的3C和3Cam2抗體(LALA + KAES)皆大幅降低了病毒血症，且與3C抗體相比，3Cam2抗體降低了病毒血症(第10圖)。
隨著施予的抗體劑量的增加，與只有LALA突變的抗體相比，在Fc區具有LALA + KAES突變的3Cam2顯示出更強的效果(第11圖)。該結果表明藉由向LALA突變添加KAES突變來恢復C1q結合活性與抗體的抗病毒效力相關。
雖然為了清楚理解的目的已經藉由舉例說明和實例的方式較詳細地描述了前述發明，但是描述和實例不應被解釋為本發明範圍的限制。藉由引用明確地將本文引用的所有專利和科學文獻的公開內容整體併入。
無。
第1圖(A)至(D)部分說明如實例2所述的對於(A)DENV-1  E蛋白(B) DENV-2  E 蛋白 (C) DENV-3  E蛋白及(D) DENV-4  E 蛋白的抗登革熱病毒抗體3C及3Cam的BIACORE® 傳感圖。
第2圖說明如實例4所述的具有不同Fc變異的抗體對於人類C1q的結合親和力。結合活性藉由ELISA測定。測試之Fc變異為：WT、 LALA + KWES、 LALA + EFT + AE、 LALA + EFT及 LALA。
第3圖說明如實例4所述的具有不同Fc變異的抗體對於人類C1q的結合親和力。結合親和力藉由ELISA測定。測試之Fc變異為：WT、LALA、 LALA + KWES、LALA + KAES、LALA + KDES、LALA + KEES及LALA + KMES。
第4圖說明如實例4所述的具有不同Fc變異的抗體對於人類C1q的結合親和力。結合親和力藉由ELISA測定。測試之Fc變異為：WT、LALA、LALA + ACT3、LALA + ACT5、LALA + KAES、LALA + ACT3 + KAES及 LALA + ACT5 + KAES。
第5圖說明如實例4所述的具有不同Fc變異的抗體對於小鼠C1q的結合親和力。結合親和力藉由ELISA測定。測試之Fc變異為：WT、 LALA、LALA + ACT3、 LALA + ACT5、LALA + KAES、LALA + ACT3 + KAES及LALA + ACT5 + KAES。
第6圖(a)至(h)部分說明如實例5所述的結合至人類FcγRs的Fc變異之Biacore分析。測試之Fc變異為：WT (圖中敘述為 WT IgG)、KWES、 EFT + AE、 EFT、 KAES、LALA + KWES、LALA + EFT + AE、LALA + EFT、LALA、LALA + ACT3、LALA + ACT5、LALA + KAES、LALA + KAES + ACT3及LALA + KAES + ACT5。測試這些Fc變異對於包含：(a) 人類 FcγR1a、 (b) 人類 FcγR2a 對偶變異(allelic variant)167H、(c)人類 FcγR2a對偶變異167R、(d)人類 FcγR2b、(e) 人類 FcγR3a對偶變異158F、(f) 人類 FcγR3a對偶變異158V、(g) 人類 FcγR3b a對偶變異NA1及 (h)人類 FcγR3b對偶變異NA2 的FcγRs的結合。 各Fc變異以單獨具有Fc變異抗體的形式(描述為Ab alone)及以抗體和三聚CD154抗原形成免疫複合物的形式(描述為CD154 IC)評估。
第7圖(a)至(d)部分說明如實例5所述的結合至小鼠FcγRs的Fc變異之Biacore分析。測試之Fc變異為：WT (圖中敘述為 WT IgG)、KWES、EFT + AE、 EFT、KAES、LALA + KWES、LALA + EFT + AE、LALA + EFT、LALA、LALA + ACT3、LALA + ACT5、LALA + KAES、LALA + KAES + ACT3及 LALA + KAES + ACT5。測試些這些Fc變異對於包含：(a) 小鼠 FcγR1、(b) 小鼠 FcγR2b、(c) 小鼠 FcγR3及 (d) 小鼠 FcγR4的FcγRs的結合。各Fc變異以單獨具有Fc變異抗體的形式(描述為Ab alone)及以抗體和三聚CD154抗原形成免疫複合物的形式(描述為CD154IC)評估。
第8圖說明如實例5所述的結合至人類FcRn的Fc變異之Biacore分析。測試之Fc變異為：WT (圖中敘述為hIgG1)、LALA、 LALA + ACT3、 LALA + ACT5、LALA + KAES、LALA + KAES + ACT3及 LALA + KAES + ACT5。各Fc變異以單獨具有Fc變異抗體的形式(描述為Ab alone)及以抗體和三聚CD154抗原形成免疫複合物的形式(描述為CD154IC)評估。
第9圖說明如實例6所述的在AG129小鼠中的DENV-2病毒感染後第3天之病毒血症。在病毒感染後第2天給予結合WT(描述為hIgG1)、LALA及 LALA + KAES的Fc變異之抗登革熱病毒抗體3C及3Cam或作為負控制組的PBS。
第10圖說明如實例6所述的在AG129小鼠中的DENV-1至4病毒感染後第3天之病毒血症。在病毒感染後第二天給予具有相同Fc變異(LALA+KAES)的抗登革熱病毒抗體3C及3Cam2或作為負控制組的P1緩衝液。
第11圖說明如實例6所述的在AG129小鼠中的DENV-2病毒感染後第3天之病毒血症。在病毒感染後第二天給予抗登革熱病毒抗體3Cam2-LALA及3Cam2-LALA+KAES或作為負控制組的P1緩衝液。
第12圖(A)至(D)部分說明如實例2所述的對於(A)DENV-1 E蛋白(B) DENV-2 E 蛋白 (C) DENV-3 E蛋白及(D) DENV-4 E 蛋白的抗登革熱病毒抗體3C及3Cam2的BIACORE® 傳感圖。
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無。

Claims (7)

  1. 一種多肽，包含變異Fc區，其包含至少一胺基酸改變於一親代Fc區域中，其中與該親代Fc區域相比時，該變異Fc區具有實質上降低的FcγR結合活性且不具有實質上降低的C1q結合活性。
  2. 如請求項1所述之多肽，其中該變異Fc區包含在位置234的Ala、在位置235的Ala及以下(a)至(c)中任一者的進一步的胺基酸改變：根據EU編號 (a) 位置267、268及324； (b) 位置236、267、268、324及332；及 (c) 位置326及333。
  3. 如請求項2所述之多肽，其中該變異Fc區包含選自由以下所組成之群組之胺基酸：根據EU編號 (a) 於位置267的Glu； (b) 於位置268的Phe； (c) 於位置324的Thr； (d) 於位置236的Ala； (e) 於位置332的Glu； (f) 於位置326的Ala、Asp、Glu、Met或Trp；及 (g) 於位置333的Ser。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之多肽，其中該變異Fc區進一步包含選自由以下所組成之群組之胺基酸：根據EU編號 (a) 於位置434的Ala； (b) 於位置434的Ala、於位置 436的Thr、於位置438的Arg及於位置440的Glu； (c) 於位置428的Leu、於位置434的Ala、於位置436的Thr、於位置438的Arg及於位置440的Glu；及 (d) 於位置428的Leu、於位置434的Ala、於位置438的Arg及於位置440的Glu。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之多肽，其中該多肽為一抗體。
  6. 一種醫藥配方，包含請求項1至5中任一項所述之多肽及一醫藥上可接受的載體。
  7. 一種製備抗體的方法，其中該方法包含以下步驟： (a) 組合一VH序列與SEQ ID NOs：51~59中任一者的一人類IgG的Fc變異序列； (b) 組合VL序列； (c) 選殖每一種組合於一表現載體中； (d) 表達所得到的該表現載體於共轉染細胞中；及 (e) 從步驟(d)純化所得到的該抗體。
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