TW201717891A - 用於皮膚美白且含有人參衍生類外泌體囊泡的組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明內容揭露了一用於皮膚美白且含有人參衍生(ginseng-derived)類外泌體囊泡(exosome-like vesicles)的組合物及用於製備此人參衍生類外泌體囊泡的方法。 由人參衍生而來的類外泌體囊泡可具有20-500奈米的直徑,且可從人參根中分離而來。此含有人參衍生類外泌體囊泡作為活性成分的組合物,透過有效抑制黑色素生成,具有預防、改善或治療皮膚色素沉著病如肝斑(melasma)、斑點(freckle)、雀斑(lentigo)、痣(nevus)、黑色素細胞瘤(melanoma)等的效果。
Description
本發明內容揭露了一用於皮膚美白且含有人參衍生類外泌體囊泡的組合物及用於製備此人參衍生類外泌體囊泡的方法。
大多數動物細胞具有分泌各種大小和組成之細胞衍生胞外囊泡的能力。 這些胞外囊泡存在於所有生物流體(biological fluids)中,包括血液、尿液、唾液和細胞培養的培養基(cultured medium)(Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases.Circ Res
2014; 114: 345-53; Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis.Adv Drug Deliv Rev
2013; 65: 398-401)。
胞外囊泡是直徑大約20奈米至5微米的膜結構囊泡。它們在大小和組成上不同,且含有各種物種,例如外泌體(exosomes)(約30-100奈米),核外粒體(ectosomes),微胞(microvesicles)(約100-1000奈米),微粒(microparticles)等。
不同類型的細胞外囊泡是根據其來源、直徑、蔗糖密度(density in sucrose)、形狀、沉澱速率,脂質組成,蛋白質標記,分泌形式(secretion type)(即,它們是由信號誘導還是自然生成的)等來區分。例如,微胞是具有大小約100至1,000奈米的膜囊泡不規則形狀。它們源自質膜(plasma membrane)並且已知包含整聯蛋白(integrins)、選滯蛋白(selectins)、含有CD40配體的標記物,以及含有磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserines)的脂質。而且,外泌體是具有杯形、大小約30至100奈米(<200奈米)的最小膜囊泡(membrane vesicles)。它們源自胞內體(endosomes),並且已知含有如CD63和CD9的四次跨膜蛋白(tetraspanins)、含有TSG101和ESCRT的標記,以及含有膽固醇(cholesterols),神經鞘磷脂(sphingomyelins),神經醯胺(ceramides)和磷脂醯絲胺酸的脂質。
胞外囊泡反映其分泌來源的細胞(供體細胞)狀態,根據其分泌來源細胞不同而表現出各種生物活性,同時當它們在細胞之間轉移遺傳物質和蛋白質時在細胞對細胞的交互作用中扮演了重要角色。
在植物中,由於質膜和多胞體(multivesicular bodies)之間的融合,小囊泡被釋放到細胞外空間,並且在各種植物細胞的胞外空間中觀察到多泡體中的囊泡(Marchant R, Peat A, Banbury GH. The ultrastructural basis of hyphal growth.New Phytol.
1967; 66: 623-629; Halperin W, Jensen WA. Ultrastructural changes during growth and embryogenesis in carrot cell cultures.J Ultrastruct Res
. 1967; 18: 428-443; Marchant R, Robards AW. Membrane systems associated with the plasmalemma of plant cells.Ann Bot
. 1968; 32: 457-471)。近來也報導了源自植物細胞的類外泌體奈米粒子(nanoparticles)與源於哺乳動物細胞的外泌體,在奈米尺寸囊泡結構和奈米粒子的組成上相類似(An, Q, Hückelhoven, R, Kogel, KH and van Bel, AJ (2006). Multivesicular bodies participate in a cell wall-associated defence response in barley leaves attacked by the pathogenic powdery mildew fungus.Cell Microbiol
8: 1009-1019; Regente, M, Pinedo, M, Elizalde, M and de la Canal, L (2012). Apoplastic exosome-like vesicles: a new way of protein secretion in plants?Plant Signal Behav
7: 544-546)。
外泌體主要用作生物標記(biomarkers)。然而,依據外泌體的內在功效(intrinsic efficacy)將外泌體用於特定目的之技術還未被開發出來。尤其是植物細胞衍生而來的類外泌體膜結構囊泡的具體用途了解甚少。對於人參,儘管已經發表了取自人參的萃取物或其成分的皮膚美白效果,但並沒有關於人參衍生外泌體膜結構囊泡的皮膚美白效果的報導。關於人參萃取物的先前技術已在韓國專利公報No.10-2009-0130801中揭露。
[技術問題]
一方面,本發明內容關於提供一用於皮膚美白的組合物,其含有人參衍生類外泌體囊泡,而不是人參萃取物作為活性成分。
另一方面,本發明內容關於提供一種用於製備人參衍生類外泌體囊泡的方法。
[技術解答]
本發明內容提供一種皮膚美白用組合物,其含有人參衍生類外泌體囊泡作為活性成分。
一方面,類外泌體囊泡可從人參根中分離而來。
另一方面,類外泌體囊泡可具有直徑20-500奈米。
另一方面,類外泌體囊泡可由人參細胞外液在100,000或更高的重力加速度倍數(xg)下超速離心沉澱而來。
另一方面,類外泌體囊泡在碘克沙醇(iodixanol)中可具有1.00-1.20公克/毫升的浮力密度(buoyant density)。
另一方面,活性成分可抑制黑色素生成。
另一方面,活性成分可預防、改善或治療選自於由以下一種或多種皮膚色素沉著症(skin pigmentation disease)所組成的群組:肝斑、斑點、雀斑、痣、黑色素細胞瘤、藥物引起的色素沉澱(drug-induced pigmentation)、發炎後色素沈澱 (post-inflammatory pigmentation)和皮膚炎引起的色素沉澱(dermatitis-induced pigmentation)。
本發明還提供了一種用於製備人參衍生類外泌體囊泡的方法,其包括:(1)擠壓人參提取汁液的步驟;(2)離心分離汁液並除去殘餘物(remnant)得到上清液(supernatant)的步驟;和(3)將上清液超速離心(ultracentrifuging)獲得類外泌體囊泡的步驟。
一方面,步驟(2)中的離心可在500-3,000重力加速度倍數下進行10-30分鐘。
另一方面,步驟(3)中的超速離心可用蔗糖緩衝液密度梯度和碘克沙醇密度梯度來進行。
另一方面,步驟(3)中的超速離心可在100,000-200,000重力加速度倍數下進行1-6小時。
另一方面,在步驟(3)中,類外泌體囊泡可以藉由將上清液超速離心並分離碘克沙醇中浮力密度為1.00-1.20公克/毫升的部份而得到。
[有益效果]
在一方面,本發明內容提供了一種供應皮膚美白組合物的效果,其含有人參衍生的類外泌體囊泡作為活性成分。
另一方面,本發明內容提供了一種供應製備人參衍生類外泌體囊泡方法的效果。
本發明內容詳細描述於下文中。
本發明內容提供一種用於皮膚美白的組合物,其含有人參衍生類外泌體囊泡作為活性成分。本發明內容提供一種用於皮膚美白的組合物,其含有人參衍生類外泌體囊泡,特別是來自於人參的細胞外液之類外泌體囊泡,而不是人參衍生的萃取物作為活性成分。
在一個示例性實施例中,人參可以是一種或多種選自一植物屬為Panax
的種子、根、莖、葉和果實所組成的群組。具體地,人參屬(genusPanax
)中的植物可以是高麗參(Korean ginseng)(人參(Panax ginseng)),美國人參(American ginseng)(西洋參(Panax quinquefolium)),三七(Panax notoginseng),日本人參(Japanese ginseng)(東洋參 (Panax japonicum)),矮人參(dwarf ginseng)(三葉參 (Panax trifolium)),喜馬拉雅人參(Himalayan ginseng) (假人參 (Panax pseudoginseng)),越南人參(Vietnamese ginseng)(Panax vietnamensis)等。其物種、類型、加工處理、生長環境等沒有限制,可以包括紅參(red ginseng),新鮮參(fresh ginseng),白參(white ginseng),培養人參(cultured ginseng)或包括木本人參(woods-grown ginseng),山生長人參(mountain-grown ginseng)和野山參培養根(cultured-root of wild ginseng)等野生人參( wild ginseng)。
在本發明內容中,「類外泌體囊泡」是指由細胞分泌到細胞外空間(extracellular space)之奈米尺寸的胞外囊泡(extracellular vesicle)。囊泡包括外泌體並以最廣泛的概念使用,包括在奈米尺寸泡狀結構(vesicular structure)和組合物中與外泌體相似的小胞(vesicle)。
由於細胞膜和多胞體(multivesicular body)間融合(fusion)的結果,類外泌體囊泡藉由胞吐作用(exocytosis)被分泌到細胞外空間。類外泌體囊泡被脂質雙層(lipid bilayer)分為內部和外部,由於其含有膜脂質(membrane lipids)、膜蛋白(membrane proteins)、遺傳物質和細胞質(cytosplasmic)等成分,間接地反映出細胞的性質和狀態。同時,類外泌體囊泡作為媒介(mediating)細胞與細胞之間信息傳遞(communication)的胞外運輸蛋白(extracellular transporter),藉由與其他細胞和組織的結合,將膜組成物(membrane components)、傳訊RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、蛋白質(生長激素(growth hormones),細胞激素等(cytokines))等轉移至受體細胞。
在本發明內容中,「人參衍生類外泌體囊泡」是指由人參細胞所分泌之奈米尺寸類外泌體囊泡。類外泌體囊泡可以從人參細胞外液(extracellular fluid)中分離,也可以是從現有組織或細胞中完全地或部分地以物理性分離(physically isolated)得到。
在一示例性實施例中,類外泌體囊泡可以從人參根中分離出來。
在一方面,類外泌體囊泡可以是直徑為20-500奈米的胞外囊泡。另一方面,類外泌體囊泡可以是直徑為20奈米或更大,30奈米或更大,40奈米或更大,50奈米或更大,60奈米或更大,70奈米或更大,80奈米或更大,90奈米或更大,或100奈米或更大的胞外囊泡,以及500奈米或更小,450奈米或更小,400奈米或更小,350奈米或更小,300奈米或更小,250奈米或更小,200奈米或更小,150奈米或更小,或100奈米或更小的胞外囊泡。
另一方面,類外泌體囊泡可以藉由將人參細胞外液在100,000或更高的重力加速度倍數下超速離心沉澱出來,特別是在100,000-200,000重力加速度倍數或100,000重力加速度倍數下。
另一方面,類外泌體囊泡在碘克沙醇中可具有1.00-1.20公克/毫升、1.03-1.20公克/毫升或1.06-1.20公克/毫升的浮力密度。浮力密度是指由密度梯度離心(density gradient centrifugation)測得的密度。
在另一方面,類外泌體囊泡的膜組成可以被化學性或物理性修飾,以便有效地在標靶細胞中執行所需的功能。例如,類外泌體囊泡的膜組成可以使用硫醇基(a thiol group)(-SH)或胺基(an amino group)(-NH2
)做化學性修飾,或透過化學性鍵結將誘導物質(inducing substance),融合質(fusogen),聚乙二醇( polyethylene glycol)結合至外泌體囊泡上。
在一示例性實施例中,類外泌體囊泡可透藉由選自於以下一種或多種方法所組成的群組來分離,包括超速離心(ultracentrifugation),差速離心(differential centrifugation),平衡密度離心(equilibrium density centrifugation),密度梯度(density gradient),過濾(filtration),透析(dialysis)和自由流動電泳(free-flow electrophoresis),但不限於此 。
密度梯度是當分離具有不同密度的物質時最常使用的方法。根據本發明內容,類外泌體囊泡由於密度不同可用密度梯度來分離。作為具體實例,可以使用密度梯度物質如聚蔗糖(Ficoll),甘油(glycerol),蔗糖,氯化銫(cesium chloride),碘克沙醇等,但不限於此。一方面,密度梯度可以與超速離心等一起使用。另一方面,凝膠過濾(gel filtration)或超微過濾(ultrafiltration)可用於分離類外泌體囊泡。另一方面,可以使用透析代替過濾以除去小尺寸分子。另一方面,可使用自由流動電泳。
在一個示例性實施例中,人參衍生類外泌體囊泡可以透過以下的方法得到,包括:(1)從人參中獲取含有人參細胞外液之汁液的步驟;(2)離心分離汁液並除去殘餘物得到上清液的步驟;和(3)將上清液超速離心得到類外泌體囊泡的步驟。
在一示例性實施例中,步驟(1)中的汁液是從人參中擠出的液體並且可以由機械降解、用化學品處理等獲得。一方面,汁液可以藉由擠壓人參得到,而擠壓可以是根據本領域已知的方法由一般技術人員適當地執行。
在示例性實施例中,步驟(2)中的離心可以在500-3,000重力加速度倍數下進行10-30分鐘。離心的速度或時間可逐級(by stages)改變。
另一方面,步驟(3)中的超速離心可在蔗糖緩衝溶液密度梯度和碘克沙醇密度梯度下進行。
另一方面,步驟(3)中的超速離心可在100,000-200,000重力加速度倍數下進行1-6小時。離心的速度或時間可逐級改變。
另一方面,步驟(3)中的超速離心可在蔗糖緩衝溶液密度梯度和碘克沙醇密度梯度下以100,000-200,000重力加速度倍數進行1-6小時。
在另一方面,在步驟(3)中,外泌體囊泡可經由超速離心上清液,然後分離碘克沙醇中浮力密度為1.00-1.20公克/毫升的部分所得到。分離出來的部分可以用緩衝液(buffer)稀釋,然後超速離心。具體地,直徑20-500奈米的顆粒狀(pelletized)類外泌體囊泡可以在100,000重力加速度倍數下超速離心2小時來分離。
在一示例性實施例中,活性成分提供了預防、治療或改善因直接或間接與黑色素增加有關的皮膚損傷或皮膚疾病的效果。也就是說,活性成分透過有效抑制黑色素生成而提供了預防、治療或改善由過量黑色素生成所引起之疾病的效果。
另一方面,本發明內容提供了一增強皮膚美白的方法,其包括對有需要的受試者施予能夠有效增強皮膚美白之人參衍生類外泌體囊泡的劑量。
另一方面,本發明內容提供了一抑制黑色素生成的方法,其包括給予有需要的受試者有效抑制黑色素生成之人參衍生類外泌體囊泡的劑量。
另一方面,本發明內容提供了一用於預防,治療和/或改善直接或間接與黑色素增加有關的皮膚損傷或皮膚疾病,和/或由過量黑色素生成所引起的疾病的方法,其包括對有需要的受試者給予有效之人參衍生類外泌體囊泡的劑量,此劑量能夠有效預防、治療和/或改善直接或間接與黑色素增加有關的皮膚損傷或皮膚疾病,和/或由過量黑色素生成所引起的疾病。
另一方面,本發明內容提供了用於增強受試者皮膚美白之人參衍生類外泌體囊泡。
另一方面,本發明內容提供了用於抑制受試者黑色素生成之人參衍生類外泌體囊泡。
另一方面,本發明內容提供了人參衍生類外泌體囊泡,用於預防、治療和/或改善直接或間接與黑色素增加有關的皮膚損傷或皮膚疾病,和/或由過量黑色素生成所引起的疾病。
另一方面,本發明內容提供了一製備用於增強受試者皮膚美白且含有人參衍生類外泌體囊泡組合物的用途。
另一方面,本發明內容提供了一製備用於抑制受試者黑色素生成且含有人參衍生類外泌體囊泡組合物的用途。
另一方面,本發明內容提供了一製備含有人參衍生類外泌體囊泡組合物的用途,此組合物可用於預防、治療和/或改善直接或間接與黑色素增加有關的皮膚損傷或皮膚疾病,和/或由過量黑色素生成所引起的疾病。
在一示例性實施例中,人參衍生類外泌體囊泡可以藥物組合物、化妝品組合物或食品組合物的形式使用於受試者或給予受試者。
在一示例性實施例中,人參衍生類外泌體囊泡可以用在受試者皮膚或給予受試者用在皮膚上。
在一個示例性實施例中,由過量黑素生成所引起的疾病可以是一種或多種選自以下組成:肝斑、斑點、老年斑(age spot)、果皮斑(blemish)、表皮黑色素細胞病變(epidermal melanocytic lesion)、牛奶咖啡斑點(咖啡牛奶斑(cafe's au lait macule))、貝克氏母斑(Becker's nevus)、扁平母斑(nevus spilus)、雀斑、真皮黑色素細胞病變(dermal melanocytic lesion)、蒙古斑(Mongolian spot)、太田母斑(nevus of Ota)、獲得性兩側太田痣樣斑(acquired bilateral nevus of Ota-like macule)、Ito氏母斑(nevus of Ito))、藍痣(blue nevus)、黑色素細胞痣(melanocytic nevus)、結痣(junctional nevus)、複合痣(compound nevus)、皮內痣(intradermal nevus)、暈痣(halo nevus)、先天性黑色素細胞痣(congenital melanocytic nevus)、史必茲痣(Spitz nevus)、發育異常性母斑(dysplastic nevus)、黑色素細胞瘤、小痣性惡性黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)、淺表擴散性黑色素瘤(superficial spreading melanoma)、肢端小痣性黑色素瘤(acral lentiginous melanoma)、結節性黑色素瘤(nodular melanoma)、色素性基底細胞癌(pigmented basal cell carcinoma)、色素性皮膚纖維瘤(pigmented dermatofibromas)、色素性皮樣囊腫(pigmented dermoid cyst)、色素性蟹足腫(pigmented keloid)和色素性角質棘皮瘤(pigmented keratoacanthomas)。
在一示例性實施例中,組合物可以預防、改善或治療選自於以下一種或多種由於黑色素生成增加而局部地出現在皮膚上的皮膚色素沉著症所組成的群組:肝斑、斑點、雀斑、痣、黑色素細胞瘤、藥物引起的色素沉澱、發炎後色素沉澱和皮膚炎引起的色素沉澱。
在另一方面,本發明內容提供了一方法用於預防、改善和/或治療選自於以下一種或多種由於黑色素生成增加而局部地出現在皮膚上的皮膚色素沉著症所組成的群組:肝斑、斑點、雀斑、痣、黑色素細胞瘤、藥物引起的色素沉澱、發炎後色素沉澱和皮膚炎引起的色素沉澱,其方法包括對有需要的受試者給予有效的人參衍生類外泌體囊泡劑量。
在另一方面,本發明內容提供了一人參衍生類外泌體囊泡,用於預防、改善和/或治療選自以下一種或多種由於黑色素生成增加而局部地出現在皮膚上的皮膚色素沉著症所組成的群組:肝斑、斑點、雀斑、痣、黑色素細胞瘤、藥物引起的色素沉澱、發炎後色素沉澱和皮膚炎引起的色素沉澱。
另一方面,本發明內容提供了一用於製備含有人參衍生類外泌體囊泡組合物的用途,可用於預防、改善和/或治療選自以下一種或多種由於黑色素生成增加而局部地出現在皮膚上的皮膚色素沉著症所組成的群組:肝斑,斑點,雀斑,痣,黑色素細胞瘤,藥物引起的色素沉澱,發炎後色素沉澱和皮膚炎引起的色素沉澱。
在一示例性實施例中,組合物可以是冷凍乾燥(freeze-dried)的製劑。 組合物可以是包含於密封包裝材料或容器中的冷凍乾燥製劑,使其易於使用(即用型)。
本發明內容還提供了一用於皮膚美白、抑制黑色素生成或用於預防、改善或治療皮膚色素沉著病的套裝組,其包含:含有人參衍生類外泌體囊泡作為活性成分的冷凍乾燥組合物;以及無菌水或純水。套裝組可以包含在密封包裝材料或容器中,使其易於使用(即用型)。
在一示例性實施例中,組合物可以是藥物組合物。
除了人參衍生類外泌體囊泡之外,藥物組合物還可以含有藥劑(pharmaceutical adjuvant)如防腐劑(antiseptic)、安定劑(stabilizer)、潤濕劑(etting agent)、乳化促進劑(emulsification promoter),用於控制滲透壓的鹽和/或緩衝液等,以及其它治療有用性的物質,並且可以根據常用方法製備成用於口服或非口服外用型的各種製劑。
用於口服給藥的製劑可以是如片劑(tablet)、丸劑(pill)、硬或軟膠囊(capsule)、液體(liquid)、懸浮液(suspension)、乳液(emulsion)、糖漿(syrup)、粉末(powder)、粉劑(dust)、細顆粒(fine granule)、顆粒(granule)、丸狀(pellet)等,而這些製劑除活性成分外可以含有表面活性劑(surfactant)、稀釋劑(例如乳糖(lactose)、葡萄糖(dextrose)、蔗糖、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)、纖維素和甘胺酸(glycine))、潤滑劑(例如二氧化矽、滑石、硬脂酸(stearic acid)和其鎂鹽或鈣鹽以及聚乙二醇)。片劑還可含有粘合劑(binder)如矽酸鎂鋁(magnesium aluminum silicate),澱粉糊(starch paste),明膠(gelatin),黃蓍膠(tragacanth),甲基纖維素(methyl cellulose),羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose)和聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrolidone),並且可含有藥物添加劑如崩散劑(disintegrant),如澱粉,洋菜(agar)或海藻酸(alginic acid) 或其鈉鹽,吸收劑,著色劑,香味劑,甜味劑等。片劑可用常用的混合、造粒或包衣方法製備。
用於非口服的給藥製劑可以是用於經皮給藥(transdermal administration)的製劑,如注射劑、滴劑、軟膏、化妝水(lotion)、凝膠、乳霜、噴霧劑、懸浮液、乳液、塞劑(suppository)、貼布(patch)等,但不限於此。
活性成分的給藥劑量取決於本領域一般技術人員的水平範圍內。每日給藥劑量可根據各種因素而變化,例如待治療疾病的階段、年齡、健康狀況,併發症的存在等。一方面,組合物可給予每日劑量1微克/公斤至200毫克/公斤,更具體地50微克/公斤至50毫克/公斤,一天1-3次。然而,施用劑量並不以任何方式限制本發明內容的範圍。
藥物組合物可以是皮膚外用的製劑。用於皮膚外用的製劑包括任何可外部施用於皮膚上的製劑,以及各種類型的醫藥製劑亦包含於其中。
在一示例性實施例中,組合物可以是化妝品組合物。
除了人參衍生類外泌體囊泡之外,化妝品組合物可包含功能性添加物和化妝品組合物中常包含的成分。功能添加物可包括選自水溶性維生素、油溶性維生素、多胜肽(polypeptide)、多醣體(polysaccharide)、神經鞘脂質(sphingolipid)和海藻萃取物的成分。除此之外,還可含有油、脂肪、潤濕劑、潤滑劑(emollient)、表面活性劑、有機或無機顏料、有機粉末、紫外線吸收劑、防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、植物萃取物、酸鹼值控制劑(pH control agent)、酒精、著色劑、香料、血液循環促進劑、清涼劑、止汗劑、純水等。
化妝品組合物的製劑沒有特別限制,可根據目的適當選擇。例如,可以製備成選自由以下一種或多種製劑組成的群組:洗面乳(skin lotion),皮膚軟化劑(softener),皮膚調色劑(toner),收斂劑(astringent),化妝水,乳液(milk lotion),保濕乳液(moisturizing lotion),滋養乳液(nourishing lotion),按摩霜(massage cream),滋養霜(nourishing cream),保濕霜(moisturizing cream),護手霜(hand cream),粉底(foundation),精華液(essence),滋養精華(nourishing essence),包裝(pack),肥皂,清潔泡沫(cleansing foam),清潔乳液(cleansing lotion),清潔霜(cleansing cream),身體乳液(body lotion)和沐浴乳(body cleanser),但不限於此。
當本發明內容的製劑是糊劑(paste)、霜劑或凝膠、動物纖維、植物纖維、蠟、石蠟(paraffin)、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、矽氧烷聚合物(silicone)、膨潤土(bentonite)、二氧化矽(silica)、滑石(talc)、氧化鋅(zinc oxide)等,可以用作載體成分。
當本發明內容的製劑是粉末或噴霧劑時,可以使用乳糖、滑石、二氧化矽、氫氧化鋁(aluminum hydroxide)、矽酸鈣(calcium silicate)、聚醯胺(polyamide)粉末等作為載體成分。尤其是當製劑是噴霧劑時,還可包含推進劑(propellant)如氯氟碳氫化合物(chlorofluorohydrocarbon)、丙烷(propane)/丁烷(butane)或二甲醚(dimethyl ether)。
當本發明的製劑是溶液或乳液時,溶劑、增溶劑(solubilizer)或乳化劑(emulsifier)可用作載體成分。例如,可以使用水、乙醇、異丙醇(isopropanol)、碳酸乙酯(ethyl carbonate)、乙酸乙酯(ethyl acetate)、苯甲醇(benzyl alcohol)、苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)、丙二醇(propylene glycol)、1,3-丁二醇油(1,3-butyl glycol oil)、甘油脂肪族酯(glycerol aliphatic ester)、聚乙二醇或脫水山梨醇脂肪酸酯(fatty acid ester of sorbitan)。
當本發明的製劑是懸浮液、液體稀釋劑如水、乙醇或丙二醇、懸浮劑如乙氧基異硬脂醇(ethoxylated isostearyl alcohol)、聚氧乙烯山梨醇酯(polyoxyethylene sorbitol ester)和聚氧乙烯脫水山梨醇酯(polyoxyethylene sorbitan ester),微晶纖維素(microcrystalline cellulose)、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤土、洋菜、黃蓍膠等可用作載體成分。
當本發明內容的製劑是含表面活性劑的清潔劑時,脂肪族醇硫酸鹽(aliphatic alcohol sulfate)、脂肪醇醚硫酸鹽(aliphatic alcohol ether sulfate)、磺基琥珀酸單酯(sulfosuccinic monoester)、羥乙基磺酸鹽(isethionate)、咪唑啉衍生物(imidazolinium derivative)、甲基牛磺酸鹽(methyl taurate)、肌氨酸鹽(sarcosinate)、脂肪酸醯胺醚硫酸鹽(fatty acid amide ether sulfate)、烷基醯胺基甜菜鹼(alkyl amidobetaine)、脂肪醇(aliphatic alcohol)、脂肪酸甘油酯(fatty acid glyceride)、脂肪酸二乙醇醯胺(fatty acid diethanolamide)、植物油、羊毛脂衍生物(lanolin derivative)、乙氧基化甘油脂肪酸酯(ethoxylated glycerol fatty acid ester)等可用作載體成分。
在一個示例性實施例中,組合物可以是食品組合物。
食品組合物可以是液體或固體製劑。例如,它可以是各種食品、飲料、膠(gums)、茶、維生素混合物、補充性保健食品(supplementary health foods)等形式,並且可以配製成粉末、顆粒、片劑、膠囊或飲料。食品組合物的各種製劑可以由本領域技術人員毫無困難地根據目的將活性成分與本領域常使用的成分混合來製備。當活性成分與其它成分一起使用時可以達到協同效應(synergic effect)。
除了活性成分之外,包含在食品組合物中的液體成分沒有特別限制。各種香精(flavors)、天然碳水化合物(carbohydrates)等可進一步包含於普通飲料中。天然碳水化合物可以是單醣(monosaccharide)、雙糖(disaccharide)如葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)等,多醣如麥芽糖(maltose)、蔗糖等,普通糖如糊精(dextrin)、環糊精(cyclodextrin)等,或糖醇(sugar alcohol)如木糖醇(xylitol)、山梨醇、赤藻糖醇(erythritol)等。作為香精,可以使用天然香精(索馬甜(thaumatin)、甜菊萃取物(stevia extract)(例如瑞鮑迪苷A(rebaudioside A)、甘草甜素(glycyrrhizin)等),或合成香精(例如糖精(saccharin)、阿斯巴甜(aspartame)等)。通常每100毫升本發明內容組合物中含有的量約為1-20公克,具體是約5-12公克。
一方面,食品組合物可以含有各種營養素、維生素、礦物質(電解質)、香精如合成香精和天然香精、著色劑、增量劑(乾酪,巧克力等)、果膠酸(pectic acid)及其鹽,海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體(colloidal)增稠劑、酸鹼值控制劑、安定劑、防腐劑、甘油、醇、碳酸飲料中使用的碳酸化試劑(carbonating agents)等。另一方面,用於製備天然果汁和蔬菜飲品的果肉(pulps)可包含其中。這些成分可以單獨使用或組合使用。根據本發明內容,每100份組合物重量使用約0.001-20份的添加劑,但不限於此。
在下文中,本發明內容將透過實施例詳細描述。然而,以下實施例僅用於說明目的,本發明內容的範圍並不受實施例的限制。
實施例
1.
人參衍生外泌體囊泡的分離
(步驟1) 首先,透過擠壓4年的人參根來製備含有人參根細胞外液的汁液。
(步驟2) 將汁液在4℃和500重力加速度倍數下離心10分鐘得到上清液。然後,再將此上清液於4℃和3,000重力加速度倍數下離心20分鐘並取上清液。
(步驟3) 在35毫升超速離心管中依序加入0.5毫升之2.5M蔗糖,1毫升之0.8M蔗糖和32毫升除去雜質的上清液,將離心管於4℃和100,000重力加速度倍數下超速離心2小時。在超速離心後,人參根類外泌體囊泡因其密度而位於2.5M蔗糖層和0.8M蔗糖層之間。因此,從離心管的上側除去溶液可分離出含有人參根類外泌體囊泡的液體層。
(步驟4) 將所分離出來含有人參根類外泌體囊泡的液體層進行密度梯度超速離心。具體地,將0.42毫升含有人參根類外泌體囊泡的分離層與2.08毫升的60%碘克沙醇混合。所得之2.5毫升50%碘克沙醇加到12-毫升的超速離心管中。然後,在向管中依序加入2.5毫升35%碘克沙醇、2.5毫升20%碘克沙醇和2.5毫升150mM氯化鈉/20mM羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)之後,於4℃和200,000重力加速度倍數下進行超速離心4小時。之後,從管的頂部取得1毫升分餾物(fraction),藉由密度量測獲取對應於類外泌體囊泡密度之分餾物3(1.08公克/毫升)(參見圖1)。
(步驟5) 將所得到的分餾物3用HBS(HEPES-緩衝生理鹽水)60毫升稀釋,並加入到70-毫升的超速離心管中。然後,在4℃和100,000重力加速度倍數下超速離心2小時獲得顆粒狀的人參衍生的類外泌體囊泡。
試驗實施例
1.
人參衍生類外泌體囊泡之穿透式電子顯微鏡分析
透過穿透式電子顯微鏡(TEM)分析實施例1中獲得的人參衍生的類外泌體囊泡的尺寸和形狀。
圖2顯示人參衍生類外泌體囊泡之穿透式電子顯微鏡圖像。證實了人參衍生類外泌體囊泡具有50-100奈米的直徑且大致為球形。
試驗實施例
2.
用人參衍生類外泌體囊泡(
1
微克
/
毫升)處理
1
週
後的
MNT-1
細胞黑色素生成之比較
將人類黑色素瘤細胞株MNT-1細胞置於20%胎牛血清(fetal bovine serum)補充的最低必需培養基(MEM)中,於37℃、5%二氧化碳(CO2)的條件下培養。將細胞平鋪在60-毫米培養皿上,每個培養皿上有 1×105 個細胞並靜置過夜,用實施例1中獲得之1微克/毫升人參衍生類外泌體囊泡相同培養基替換該培養基。為了比較,陰性控制組沒有經過任何處理。將含有類外泌體囊泡的新鮮培養基每4天更換一次,細胞培養共8天直到它們裝滿培養皿。當細胞完全生長時,用300微升胞溶緩衝液(lysis buffer)(1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40), 50mM三羥甲基氨基甲烷-氯化鈉(Tris-HCl); pH 7.5, 150mM 氯化鈉)處理細胞,並使用細胞刮刀收集在微型管(microtube)中。然後,在每分鐘15,000轉(rpm)離心10分鐘後,沉澱出的顆粒溶解在1N氫氧化鈉(NaOH)中,在波長450奈米下測量吸光度(absorbance)來比較黑色素含量。
結果,證實了用人參衍生類外泌體囊泡處理的MNT-1細胞其黑色素含量與未用人參衍生類外泌體囊泡處理的MNT-1細胞相比顯著降低,如圖3所示。 (n = 6,*:p <0.05)。
試驗實施例
3.
用各種濃度的人參衍生類外泌體囊泡處理2週後,用
20
毫焦耳
/
平方公分(
mJ/cm2
)紫外線
B
光(
UVB
)照射
2
次的人類黑色素細胞其黑色素生成之比較
將人類原代黑色素細胞(Human primary melanocytes)(Life Technologies,CA,USA)置於37℃和5%二氧化碳條件下,在有人類黑色素細胞生長添加劑(growth supplement)(HMGS; Gibco BRL,NY,USA)補充的M-254培養基(Gibco BRL,NY,USA)中培養。將細胞平鋪在100-毫米培養皿上,每皿2×105
個細胞並靜置過夜,以20毫焦耳/平方公分的紫外線B光照射2次,每次間隔24小時。然後,將細胞用含有實施例1中所獲得之人參衍生類外泌體囊泡培養基培養2週,每4天分別以濃度0.1微克/毫升、1微克/毫升、5微克/毫升或10微克/毫升的培養基置換一次。為了比較,陽性對照組以相同的方式分別用30μM麝香草酚三甲氧基肉桂酸酯,1μM化合物K或濃度百萬分之2(2ppm)發酵皂苷處理2週,並測量其黑色素生成量。陰性對照組則以相同的方式培養,分別為未用紫外線B光處理的黑素細胞和用紫外線B光處理但未用測試物質處理的黑色素細胞。2週後,將細胞從培養皿上分離併計數。相同數量的細胞收集在一微量管中,用蛋白提取細胞裂解緩衝液(RIPA)(Millipore,20-188)裂解,然後以每分鐘13,500轉離心30分鐘。將沉澱出的顆粒溶解在1N氫氧化鈉中並拍照以比較顏色。在波長450奈米下測量吸光度來比較黑色素含量。
結果證實,當用1微克/毫升或更高濃度的人參衍生類外泌體囊泡處理細胞時,經由紫外線B光照射的黑色素生成量顯著降低,如圖4所示。(*:p < 0.05)。根據本發明內容所得之人參衍生類外泌體囊泡顯示出與AmorePacific之Melasolv,化合物K以及發酵皂苷具有相當的皮膚美白效果。當用所述物質處理細胞時黑色素含量之降低量列於表1中。
表1. 用測試物質處理後,以20焦耳/平方公分紫外線B光照射2次的人類黑色素細胞中黑色素含量的減少(%)
試驗實施例
4.
用人參衍生類外泌體囊泡或人參汁
液
處理
48
小時後人類黑
色
素細胞存活率
之
比較
將人類原代黑色素細胞(Life Technologies,CA,USA)置於37℃和5%二氧化碳條件下,在有人類黑色素細胞生長添加劑(HMGS; Gibco BRL,NY,USA)補充的M-254培養基(Gibco BRL,NY,USA)中培養。在24井盤(24-well plate)上鋪 0.7×105
個細胞並靜置過夜後,分別用濃度為1微克/毫升或10微克/毫升,含有實施例1中所得之人參衍生類外泌體囊泡(GEV)的培養基、或人參汁液培養基替換,或不含前兩者的培養基替換(對照組)。培養48小時後,使用細胞增殖分析套組(WST-1溶液)(Roche Applied Science,德國)測量細胞存活率。
結果當培養基分別含有濃度1微克/毫升之人參衍生類外泌體囊泡(GEV)和人參汁液時,細胞存活率分別為92%和86%,而當培養基濃度為10微克/毫升之人參衍生類外泌體囊泡(GEV)和人參汁液時,細胞存活率分別為84%和65%,相較於不含任何物質的培養基(控制組),如圖5所示(*:p <0.05)。因此,證實了以相同濃度處理時,人參衍生類外泌體囊泡表現出比人參汁液更低的毒性。
試驗實施例
5.
用人參衍生外泌體囊泡或人參汁
液
處理
2
週
後,
以
20
毫焦耳
/
平方公分
紫外線
B
光照射
2
次
之
人
類
黑色素細胞
其
黑色素
生成
量的比較
將人類原代黑色素細胞(Life Technologies,CA,USA)置於37℃和5%二氧化碳條件下,在有人類黑色素細胞生長添加劑(HMGS; Gibco BRL,NY,USA)補充的M-254培養基(Gibco BRL,NY,USA)中培養。將2×105
個細胞平鋪在100-毫米培養皿上並靜置過夜,以20毫焦耳/平方公分的紫外線B光照射2次,每次間隔24小時。然後,將細胞用含有實施例1中所獲得之人參衍生類外泌體囊泡培養基或人參汁液培養基培養2週,分別用濃度1微克/毫升或10微克/毫升的培養基每4天替換一次。對照組則為以相同方式培養但未用紫外線B光處理的黑素細胞,以及用紫外線B光處理但未用測試物質處理的黑色素細胞。2週後,將細胞從培養皿上分離併計數。相同數量的細胞收集在一微量管中,用蛋白提取細胞裂解緩衝液(Millipore,20-188)裂解,然後以每分鐘13,500轉離心30分鐘。將沉澱出的顆粒溶解在1N氫氧化鈉中並拍照以比較顏色。在波長450奈米下測量吸光度來比較黑色素含量。
結果,當用人參衍生類外泌體囊泡(GEV)或人參汁液處理細胞時,紫外線B光處理後所增加的黑色素生成量顯著降低,如表2和圖6所示。(*:p < 0.05,**:p < 0.01)。然而,考慮到10微克/毫升人參汁液顯示出高細胞毒性,可以看出本發明內容之人參衍生類外泌體囊泡則可以更有效地降低紫外線誘導的黑色素含量的增加,同時具有低細胞毒性。
表2. 用測試物質處理後以20毫焦耳/平方公分紫外線B光照射2次的人類黑色素細胞中黑色素含量的減少(%)
下文中,將透過製劑實施例詳細描述本發明內容。然而,以下製劑實施例僅用於說明之目的且本發明內容的範圍不受限於製劑實施例。
[
製劑
實例
1]
軟膠囊
將50毫克人參衍生類外泌體囊泡,80-140毫克L-肉毒鹼(L-carnitine)、180毫克大豆油(soybean oil)、2毫克棕櫚油(palm oil)、8毫克氫化植物油(hydrogenated vegetable oil)、4毫克黃色蜂蠟(yellow beeswax)和6毫克卵磷脂(lecithin)混合,並根據常用的方法將每個膠囊填充至400毫克。
[
製劑
實例
2]
片劑
將50毫克人參衍生類外泌體囊泡、200毫克半乳寡糖(galactooligosaccharide)、60毫克乳糖和140毫克麥芽糖(maltose)混合,用流體化床乾燥器(fluidized-bed drier)造粒,加入6毫克糖酯,然後使用壓錠機壓片以製備錠劑。
[
製劑
實例
3]
顆粒
將50毫克人參衍生類外泌體囊泡、250毫克無水結晶葡萄糖和550毫克澱粉混合,使用流體化床製粒機(fluidized-bed granulator)將混合物製粒,然後填充在小囊中來製備顆粒。
[
製劑
實例
4]
飲品
將50毫克人參衍生類外泌體囊泡、10公克葡萄糖、0.6公克檸檬酸和25公克寡糖糖漿(oligosaccharide syrup)混合,加入300毫升純水,且將每瓶填充200毫升來製備飲品。在裝入瓶中後,將飲品在130℃下消毒(sterilize)4-5秒。
[
製劑
實例
5]
化妝水
根據常用的方法用表3中所述之成分製備化妝水。
表3.
[
製劑
實例
6]
乳霜
根據常用的方法用表4中所述之成分製備乳霜。
表4.
[
製劑實例
7]
袋裝
根據常用的方法用表5中所述之成分製備袋裝。
表 5.
儘管已舉例說明並描述了示例性實施例,但在不脫離本發明內容的專利申請範圍所定義的精神和範疇的情況下,任何形式和細節上的各種改變都將能夠被本領域的技術人員所理解。
無
圖1顯示根據本發明內容之示例性實施例從所得之人參根汁液中分離出類外泌體囊泡的過程。
圖2顯示根據本發明內容之示例性實施例所得之人參衍生類外泌體囊泡的穿透式電子顯微鏡圖像。
圖3顯示用本發明內容之示例性實施例所得之人參衍生類外泌體囊泡處理過的MNT-1細胞的黑色素生成量。
圖4比較了用本發明內容之示例性實施例所得之人參衍生類外泌體囊泡處理或用正調控物質(positive control substances)(麝香草酚三甲氧基肉桂酸酯(Melasolv)(愛茉莉太平洋(AmorePacific)的代表性皮膚美白物質)、化合物K和發酵皂苷(fermented saponin))處理之人類黑色素細胞(human melanocytes)的黑色素生成量。
圖5比較了用本發明內容示例性實施例所得之人參衍生類外泌體囊泡處理或用人參汁液處理之人類黑色素細胞的存活力。
圖6比較了用本發明內容示例性實施例所得之人參衍生類外泌體囊泡處理或用人參汁液處理之人類黑色素細胞的黑色素生成量。
Claims (12)
- 一種用於皮膚美白的組合物,其含有人參衍生的類外泌體囊泡作為活性成分。
- 如請求項1所述之皮膚美白組合物,其中所述之類外泌體囊泡是從人參根中分離而來。
- 如請求項1所述之皮膚美白組合物,其中所述之類外泌體囊泡的直徑為20-500奈米。
- 如請求項1所述之皮膚美白組合物,其中所述之類外泌體囊泡是由人參細胞外液在100,000或更高的重力加速度倍數下超速離心沉澱而來。
- 如請求項1所述之皮膚美白用組合物,其中所述外泌體囊泡在碘克沙醇中的浮力密度為1.00-1.20公克/毫升。
- 如請求項1所述之皮膚美白用組合物,其中所述活性成分抑制黑色素生成。
- 如請求項1所述之皮膚美白用組合物,其中所述活性成分預防,改善或治療選自於由以下一種或多種皮膚色素沉著症所組成的群組:肝斑、斑點、雀斑、痣、黑色素細胞瘤、藥物引起的色素沉澱、 發炎後色素沉澱和皮膚炎引起的色素沉澱。
- 一種用於製備如請求項1至7中任一項所述之人參衍生類外泌體囊泡的方法,其包括: (1)擠壓人參提取汁液的步驟; (2)離心分離所述汁液並除去殘餘物得到上清液的步驟;和 (3)將所述上清液超速離心得到類外泌體囊泡的步驟。
- 如請求項8所述之人參衍生類外泌體囊泡的製備方法,其中所述步驟(2)中所述的離心分離在500-3,000重力加速度倍數下進行10-30分鐘。
- 如請求項8所述之人參衍生類外泌體囊泡的製備方法,其中步驟(3)中所述的超速離心是在蔗糖緩衝溶液(sucrose cushion)密度梯度和碘克沙醇密度梯度下進行。
- 如請求項8所述之人參衍生類外泌體囊泡的製備方法,其中步驟(3)中所述的超速離心在100,000-200,000重力加速度倍數下進行1-6小時。
- 如請求項8所述之人參衍生類外泌體囊泡的製備方法,其中,於步驟(3)中,所述類外泌體囊泡是經由超速離心所述上清液,然後分離碘克沙醇中浮力密度為1.00-1.20公克/毫升的部分所得到。
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