ES2888802T3 - Composición de aclaramiento que comprende vesículas de tipo exosoma derivadas del ginseng - Google Patents
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Abstract
Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de la pigmentación de la piel asociada con el aumento de melanina.
Description
DESCRIPCIÓN
Composición de aclaramiento que comprende vesículas de tipo exosoma derivadas del ginseng
Campo técnico
En la presente exposición se describen una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de la pigmentación de la piel asociada con el aumento de melanina, y un uso no terapéutico, cosmético o alimentario de una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para blanquear la piel.
Antecedentes de la técnica
La mayoría de las células animales tienen la capacidad de segregar vesículas extracelulares derivadas de células de diversos tamaños y composiciones. Estas vesículas extracelulares se encuentran en todos los fluidos biológicos, incluyendo la sangre, la orina, la saliva, y el medio cultivado de cultivos celulares (Loyer X, Vion AC, Tedgui A, Boulanger CM. Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovascular diseases. Circ Res 2014; 114: 345-53; Ohno S, Ishikawa A, Kuroda M. Roles of exosomes and microvesicles in disease pathogenesis. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65: 398-401).
Las vesículas extracelulares son vesículas con estructura de membrana con diámetros comprendidos entre alrededor de 20 nm y alrededor de 5 pm. Se diferencian en tamaños y composiciones, e incluyen diversas especies tales como exosomas (alrededor de 30-100 nm), ectosomas, microvesículas (alrededor de 100-1,000 nm), micropartículas, etc.
Los diferentes tipos de las vesículas extracelulares se distinguen en función de su origen, diámetro, densidad en sacarosa, forma, tasa de precipitación, composición lipídica, marcador proteico, tipo de secreción (es decir, si son inducidas por señales o producidas naturalmente), etc. Por ejemplo, las microvesículas son vesículas de membrana que oscilan entre alrededor de 100 y 1,000 nm con formas irregulares. Se originan en la membrana plasmática, y se sabe que contienen integrinas, selectinas, marcadores que incluyen el ligando CD40, y lípidos que incluyen fosfatidilserinas. Y los exosomas son las vesículas de membrana más pequeñas que oscilan entre alrededor de 30 y 100 nm (< 200 nm) con forma de copa. Se originan a partir de endosomas, y se sabe que contienen tetraspaninas tales como CD63 y CD9, marcadores que incluyen TSG101 y ESCRT, y lípidos que incluyen colesteroles, esfingomielinas, ceramidas, y fosfatidilserinas.
Las vesículas extracelulares reflejan el estado de las células (células del donante) de las que se segregan, exhiben diversas actividades biológicas según las células de las que se segregan, y desempeñan un papel importante en las interacciones de célula a célula a medida que transfieren material genético y proteínas entre células.
También en las plantas se liberan pequeñas vesículas al espacio extracelular como resultado de la fusión entre la membrana plasmática y los cuerpos multivesiculares, y se observan vesículas en los cuerpos multivesiculares en el espacio extracelular de las células vegetales de diversas especies (Marchant R, Peat A, Banbury GH. The ultrastructural basis of hyphal growth. New Phytol. 1967; 66: 623-629; Halperin W, Jensen WA. Ultrastructural changes during growth and embryogenesis in carrot cell cultures. J Ultrastruct Res. 1967; 18: 428-443; Marchant R, Robards AW. Membrane systems associated with the plasmalemma of plant cells. Ann Bot. 1968; 32: 457-471). Además, recientemente se dio a conocer que las nanopartículas similares a exosomas derivadas de células vegetales son similares a los exosomas derivados de células de mamíferos en estructura vesicular de tamaño nanométrico y en composición de nanopartículas (An, Q, Hückelhoven, R, Kogel, KH y van Bel, AJ (2006). Multivesicular bodies participate in a cell wall-associated defence response in barley leaves attacked by the pathogenic powdery mildew fungus. Cell Microbiol 8: 1009-1019; Regente, M, Pinedo, M, Elizalde, M y de la Canal, L (2012). Apoplastic exosome-like vesicles: a new way of protein secretion in plants? Plant Signal Behav 7: 544 546).
Los exosomas se han usado principalmente como biomarcadores. Sin embargo, no se han desarrollado tecnologías para usar exosomas para fines específicos en base a la eficacia intrínseca de los exosomas. En particular, se sabe poco sobre el uso específico de vesículas con estructura de membrana similares a exosoma derivadas de células vegetales. En cuanto al ginseng, aunque se ha dado a conocer el efecto blanqueador de la piel de los extractos derivados del ginseng o de sus ingredientes, no se ha dado a conocer el efecto blanqueador de la piel de las vesículas con estructura de membrana similares a exosomas derivadas del ginseng. La técnica anterior sobre extractos de ginseng se divulga en la publicación de patente coreana n° 10-2009-0130801. El documento CN 104825365 A enseña extractos de raíz de ginseng Radix como agente activo en composiciones blanqueadoras de la piel.
Exposición
Problema técnico
En un aspecto, la presente exposición se refiere a la provisión de una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de la pigmentación de la piel asociada con el aumento de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición se refiere a la provisión de un uso no terapéutico, cosmético o alimentario de una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para blanquear la piel.
Solución técnica
La presente exposición proporciona una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de la pigmentación de la piel asociada con el aumento de melanina.
La vesícula similar a un exosoma se aísla de la raíz de ginseng.
En un aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede tener un diámetro de 20-500 nm.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede precipitarse mediante ultracentrifugación del líquido extracelular de ginseng a 100,000 x g o más.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede tener una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml en iodixanol.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede inhibir la producción de melanina.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede prevenir, mejorar o tratar una o más enfermedades de la pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigo, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis.
En un aspecto no reivindicado, el procedimiento para preparar la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng incluye: (1) una etapa de obtención de un zumo exprimiendo ginseng; (2) una etapa de centrifugar el zumo y obtener un sobrenadante eliminando el remanente; y (3) una etapa de obtener una vesícula similar a un exosoma ultracentrifugando el sobrenadante.
En un aspecto, la centrifugación en la etapa (2) se puede realizar a 500-3,000 x g durante 10-30 minutos.
En otro aspecto, la ultracentrifugación en la etapa (3) se puede realizar usando un gradiente de densidad de almohadilla de sacarosa y un gradiente de densidad de iodixanol.
En otro aspecto, la ultracentrifugación en la etapa (3) se puede realizar a 100,000-200,000 x g durante 1-6 horas. En otro aspecto, en la etapa (3), la vesícula similar a un exosoma se puede obtener ultracentrifugando el sobrenadante y separando después una fracción que tiene una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml en iodixanol.
Efectos ventajosos
En un aspecto, la presente exposición proporciona el efecto de proporcionar una composición para blanquear la piel, que contiene una vesícula similar a un exosoma derivada del ginseng como se reivindica como ingrediente activo.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra un procedimiento para aislar vesículas similares a exosomas de un zumo de raíz de ginseng según un ejemplo de forma de realización de la presente exposición.
La figura 2 muestra imágenes de microscopía electrónica de transmisión de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según un ejemplo de forma de realización de la presente exposición.
La figura 3 muestra la producción de melanina por células MNT-1 tratadas con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según un ejemplo de forma de realización de la presente exposición.
La figura 4 compara la producción de melanina por melanocitos humanos tratados con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según un ejemplo de forma de realización de la presente exposición o con sustancias de control positivo (Melasolv (sustancia blanqueadora de la piel representativa de AmorePacific), compuesto K y saponina fermentada).
La figura 5 compara la viabilidad de melanocitos humanos tratados con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según una forma de realización a modo de ejemplo de la presente exposición o con zumo de ginseng.
La figura 6 compara la producción de melanina por melanocitos humanos tratados con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según un ejemplo de forma de realización de la presente exposición o con zumo de ginseng.
Mejor modo
A continuación, se describe en detalle la presente exposición.
La presente exposición proporciona una composición para blanquear la piel, que contiene una vesícula similar a un exosoma derivada del ginseng de la raíz de ginseng como ingrediente activo. La presente exposición proporciona una composición para blanquear la piel, que contiene una vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng, específicamente una vesícula similar a un exosoma derivada del líquido extracelular de ginseng, no un extracto derivado de ginseng, como ingrediente activo.
El ginseng se selecciona de la raíz de una planta del género Panax. Específicamente, la planta del género Panax puede ser ginseng coreano (Panax ginseng), ginseng americano (Panax quinquefolium), notoginseng (Panax notoginseng), ginseng japonés (Panax japonicum), ginseng enano (Panax trifolium), ginseng de1Himalaya (Panax pseudoginseng), ginseng vietnamita (Panax vietnamensis), etc. No está limitado en especie, tipo, procesamiento, ambiente de crecimiento, etc., y puede incluir ginseng rojo, ginseng fresco, ginseng blanco, ginseng cultivado, o ginseng silvestre, incluyendo ginseng cultivado en bosques, ginseng cultivado en la montaña, y raíces cultivadas de ginseng silvestre.
En la presente exposición, la “vesícula similar a un exosoma” se refiere a una vesícula extracelular de tamaño nanométrico segregada por una célula al espacio extracelular. La vesícula incluye un exosoma, y se usa en el concepto más amplio, incluyendo una vesícula similar en una estructura vesicular de tamaño nanométrico y una composición con el exosoma.
La vesícula similar a un exosoma se segrega al espacio extracelular como resultado de la fusión entre la membrana plasmática y el cuerpo multivesicular por exocitosis. La vesícula similar a un exosoma está dividida en interior y exterior por una bicapa lipídica, y refleja indirectamente las propiedades y el estado de la célula debido a que contiene lípidos de membrana, proteínas de membrana, materiales genéticos, y componentes citoplásmicos. Además, la vesícula similar a un exosoma sirve como un transportador extracelular que media la comunicación célula-célula uniéndose a otras células y tejidos y transfiriendo componentes de la membrana, ARNm, miARN, proteínas (hormonas de crecimiento, citocinas, etc.), etc., a células aceptoras.
En la presente exposición, la “vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng” se refiere a una vesícula similar a un exosoma de tamaño nanométrico segregada por células de ginseng. La vesícula similar a un exosoma puede aislarse del líquido extracelular de ginseng, y la vesícula similar a un exosoma puede aislarse físicamente total o parcialmente de tejidos o células existentes.
La vesícula similar a un exosoma se aísla de la raíz de ginseng.
En un aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede ser una vesícula extracelular que tiene un diámetro de 20 500 nm. En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede ser una vesícula extracelular que tiene un diámetro de 20 nm o más, 30 nm o más, 40 nm o más, 50 nm o más, 60 nm o más, 70 nm o más, 80 nm o más, 90 nm o más, o 100 nm o más, y 500 nm o menos, 450 nm o menos, 400 nm o menos, 350 nm o menos, 300 nm o menos, 250 nm o menos, 200 nm o menos, 150 nm o menos, o 100 nm o menos.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede precipitarse ultracentrifugando el líquido extracelular de ginseng a 100,000 x g o más, específicamente a 100,000-200,000 x g, o 100,000 x g.
En otro aspecto, la vesícula similar a un exosoma puede tener una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml, 1.03 1.20 g/ml, o 1.06-1.20 g/ml en iodixanol. La densidad de flotación se refiere a una densidad medida por centrifugación en gradiente de densidad.
En otro aspecto, el componente de la membrana de la vesícula similar a un exosoma puede modificarse química o físicamente de manera que se realice eficazmente la función deseada en una célula diana. Por ejemplo, el componente de la membrana de la vesícula similar a un exosoma puede modificarse químicamente usando un grupo tiol (-SH) o un grupo amina (-NH2), o uniendo químicamente una sustancia inductora, un fusógeno, polietilenglicol a la vesícula similar a un exosoma.
En un ejemplo de forma de realización, la vesícula similar a un exosoma puede aislarse mediante uno o más procedimientos seleccionados de entre un grupo que consiste en ultracentrifugación, centrifugación diferencial, centrifugación de densidad en equilibrio, gradiente de densidad, filtración, diálisis, y electroforesis de flujo libre, aunque sin limitarse a ellos.
El gradiente de densidad es un procedimiento que se utiliza con más frecuencia cuando se separan materiales con diferentes densidades. Las vesículas similares a exosomas según la presente exposición pueden aislarse mediante gradiente de densidad debido a las diferentes densidades. Como ejemplo específico, se pueden usar materiales de separación en gradiente de densidad tales como Ficoll, glicerol, sacarosa, cloruro de cesio, iodixanol, etc., aunque sin limitarse a ellos. En un aspecto, el gradiente de densidad se puede usar junto con ultracentrifugación, etc. En otro aspecto, se puede usar filtración o ultrafiltración en gel para separar las vesículas similares a exosomas. En otro aspecto, se puede usar diálisis en lugar de filtración, para eliminar moléculas de pequeño tamaño. En otro aspecto, puede usarse electroforesis de flujo libre.
En un ejemplo de forma de realización ejemplar, la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng puede obtenerse mediante un procedimiento que incluye: (1) una etapa de obtener un zumo que contiene el líquido extracelular de ginseng a partir de ginseng; (2) una etapa de centrifugar el zumo y obtener un sobrenadante eliminando el remanente; y (3) una etapa de obtener una vesícula similar a un exosoma ultracentrifugando el sobrenadante.
En un ejemplo de forma de realización, el zumo en la etapa (1) es un líquido exprimido de ginseng, y puede obtenerse por degradación mecánica, tratamiento con sustancias químicas, etc. En un aspecto, el zumo puede obtenerse exprimiendo ginseng, y el exprimido puede ser realizado adecuadamente por los expertos según un procedimiento conocido en la materia.
En un ejemplo de forma de realización, la centrifugación en la etapa (2) se puede realizar a 500-3,000 x g durante 10-30 minutos. La velocidad o el tiempo de centrifugación pueden variar por etapas.
En otro aspecto, la ultracentrifugación en la etapa (3) se puede realizar usando un gradiente de densidad de almohadilla de sacarosa y un gradiente de densidad de iodixanol.
En otro aspecto, la ultracentrifugación en la etapa (3) se puede realizar a 100,000-200,000 x g durante 1-6 horas. La velocidad o el tiempo de centrifugación pueden variar por etapas.
En otro aspecto, la ultracentrifugación en la etapa (3) se puede realizar a 100,000-200,000 x g durante 1-6 horas usando un gradiente de densidad de almohadilla de sacarosa y un gradiente de densidad de iodixanol.
En otro aspecto, en la etapa (3), la vesícula similar a un exosoma se puede obtener ultracentrifugando el sobrenadante y separando después una fracción que tiene una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml. La fracción separada se puede diluir con un amortiguador, y después se puede ultracentrifugar. Específicamente, se puede aislar una vesícula peletizada similar a un exosoma que tiene un diámetro de 20-500 nm mediante ultracentrifugación a 100,000 x g durante 2 horas.
En un ejemplo de forma de realización, el ingrediente activo proporciona el efecto de prevenir, tratar o mejorar el daño de la piel o una enfermedad de la piel asociada directa o indirectamente con el aumento de melanina. Es decir, el ingrediente activo proporciona el efecto de prevenir, tratar o mejorar una enfermedad causada por una producción excesiva de melanina al inhibir eficazmente la producción de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona un procedimiento para mejorar el blanqueamiento de la piel, que incluye administrar la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng en una cantidad eficaz para mejorar el blanqueamiento de la piel a un sujeto que lo necesite.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona un procedimiento para suprimir la producción de melanina, que incluye administrar a un sujeto que lo necesite la vesícula similar a un exosoma derivada del ginseng en una cantidad eficaz para suprimir la producción de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona un procedimiento para prevenir, tratar y/o mejorar el daño de la piel o una enfermedad de la piel asociada directa o indirectamente con el aumento de melanina y/o una enfermedad causada por la producción excesiva de melanina, que incluye administrar a un sujeto que lo necesite la vesícula similar a un exosoma derivada del ginseng en una cantidad eficaz para prevenir, tratar y/o mejorar el
daño de la piel o la enfermedad de la piel asociada directa o indirectamente con el aumento de melanina y/o la enfermedad causada por la producción excesiva de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng para mejorar el blanqueamiento de la piel de un sujeto.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng para suprimir la producción de melanina de un sujeto.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng para prevenir, tratar y/o mejorar el daño de la piel o una enfermedad de la piel asociada directa o indirectamente con el aumento de melanina y/o una enfermedad causada por una producción excesiva de melanina.
En un ejemplo de forma de realización, la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng se puede aplicar o administrar a un sujeto en forma de una composición farmacéutica, una composición cosmética, o una composición alimentaria.
En un ejemplo de forma de realización, la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng se puede aplicar o administrar a la piel de un sujeto.
En un ejemplo de forma de realización, la enfermedad causada por la producción excesiva de melanina puede ser una o más seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, manchas de la edad, imperfecciones, lesión melanocítica epidérmica, mancha de café con leche (mácula de café con leche), nevo de Becker, nevo spilus, lentigo, lesión melanocítica dérmica, mancha mongol, nevo de Ota, nevo bilateral adquirido de mácula similar a Ota, nevo de Ito, nevo azul, nevo melanocítico, nevo de unión, nevo compuesto, nevo intradérmico, halo nevo, nevo melanocítico congénito, nevo de Spitz, nevo displásico, melanoma, melanoma lentigo maligno, melanoma de extensión superficial, melanoma lentiginoso acral, melanoma nodular, carcinoma de células basales pigmentado, dermatofibromas pigmentados, quiste dermoide pigmentado, queloide pigmentado, y queratoacantomas pigmentados.
En un ejemplo de forma de realización, la composición puede prevenir, mejorar o tratar una o más enfermedades de pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigo, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis, que se produce por vía tópica en la piel debido al aumento de la producción de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona un procedimiento para prevenir, mejorar y/o tratar una o más enfermedades de pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigos, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis, que se produce tópicamente en la piel debido a una mayor producción de melanina, que incluye administrar una cantidad eficaz de la vesícula similar a un exosoma derivada del ginseng a un sujeto que lo necesite.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng para prevenir, mejorar y/o tratar una o más enfermedades de la pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigo, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis, que se produce por vía tópica en la piel debido al aumento de la producción de melanina.
En otro aspecto, la presente exposición proporciona un uso para preparar una composición que contiene la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng para prevenir, mejorar y/o tratar una o más enfermedades de la pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigo, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis, que se producen por vía tópica en la piel debido al aumento de la producción de melanina.
En un ejemplo de forma de realización, la composición puede ser una formulación liofilizada. La composición puede ser una formulación liofilizada contenida en un material de envase o recipiente sellado de manera que pueda usarse fácilmente (lista para uso).
La presente exposición también proporciona un kit para blanquear la piel, para suprimir la producción de melanina, o para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad de la pigmentación de la piel, que contiene: una composición liofilizada que contiene la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng como ingrediente activo; y agua estéril o agua purificada. El kit puede estar contenido en un material de envase o recipiente sellado de modo que pueda usarse fácilmente (listo para uso).
En un ejemplo de forma de realización, la composición puede ser una composición farmacéutica.
La composición farmacéutica puede contener, además de la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng, un adyuvante farmacéutico tal como un antiséptico, un estabilizante, un agente humectante, un promotor de emulsificación, una sal y/o amortiguador para el control de la presión osmótica, etc., y otras sustancias terapéuticamente útiles, y se puede preparar en diversas formulaciones para administración oral o parenteral según procedimientos habituales.
La formulación para administración oral puede ser, por ejemplo, un comprimido, una pastilla, una cápsula dura o blanda, un líquido, una suspensión, una emulsión, un jarabe, un polvo, un polvo fino, un gránulo fino, un gránulo, un pelet, etc., y estas formulaciones pueden contener, además del ingrediente activo, un tensioactivo, un diluyente (por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa, y glicina), un lubricante (por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico y una sal de magnesio o calcio del mismo, y polietilenglicol). El comprimido puede contener además un aglutinante tal como silicato de aluminio y magnesio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y polivinilpirrolidona, y puede contener un aditivo farmacéutico tal como un disgregante, por ejemplo almidón, agar, o ácido algínico o una sal sódica del mismo, un absorbente, un colorante, un sabor, un edulcorante, etc., según lo requiera la ocasión. El comprimido se puede preparar mediante un procedimiento habitual de mezclado, granulación o recubrimiento.
La formulación para administración parenteral puede ser una formulación para administración transdérmica, por ejemplo una inyección, un goteo, un ungüento, una loción, un gel, una crema, un aerosol, una suspensión, una emulsión, un supositorio, un parche, etc., aunque no se limita a ellos.
La determinación de la dosis de administración del ingrediente activo está dentro del nivel de los expertos normales. Una dosis de administración diaria puede variar dependiendo de diversos factores tales como la etapa de la enfermedad que debe tratarse, la edad, el estado de salud, la presencia de complicaciones, etc. En un aspecto, la composición puede administrarse a una dosis diaria de entre 1 jg/kg y 200 mg/kg, más específicamente entre 50 |jg/kg y 50 mg/kg, 1-3 veces al día. Sin embargo, la dosis de administración no limita el alcance de la presente exposición de ninguna manera.
La composición farmacéutica puede ser una formulación para aplicación externa a la piel. La formulación para aplicación externa a la piel incluye cualquier formulación que pueda aplicarse externamente sobre la piel, y se pueden incluir en ella diversos tipos de formulaciones médicas.
En un ejemplo de forma de realización, la composición puede ser una composición cosmética.
La composición cosmética puede contener, además de la vesícula similar a un exosoma derivada de ginseng, un aditivo funcional y un ingrediente incluido habitualmente en una composición cosmética. El aditivo funcional puede incluir un ingrediente seleccionado de entre un grupo que consiste en una vitamina soluble en agua, una vitamina soluble en aceite, un polipéptido, un polisacárido, un esfingolípido, y un extracto de algas. Además, pueden estar contenidos adicionalmente un aceite, una grasa, un humectante, un emoliente, un tensioactivo, un pigmento orgánico o inorgánico, un polvo orgánico, un absorbente de rayos UV, un antiséptico, un esterilizador, un antioxidante, un extracto vegetal, un agente de control del pH, un alcohol, un colorante, un sabor, un promotor de la circulación sanguínea, un agente refrescante, un antitranspirante, agua purificada, etc.
La formulación de la composición cosmética no está especialmente limitada, y puede seleccionarse adecuadamente dependiendo de los fines. Por ejemplo, se puede preparar en una o más formulaciones seleccionadas de entre un grupo que consiste en una loción para la piel, un suavizante para la piel, un tónico para la piel, un astringente, una loción, una loción de leche, una loción humectante, una loción nutritiva, un crema de masaje, una crema nutritiva, una crema hidratante, una crema de manos, una base, una esencia, una esencia nutritiva, un paquete, un jabón, una espuma limpiadora, una loción limpiadora, una crema limpiadora, una loción corporal, y un limpiador corporal, aunque no se limita a ellos.
Cuando la formulación de la presente exposición es una pasta, una crema o un gel, se puede usar como ingrediente portador una fibra animal, una fibra vegetal, una cera, parafina, almidón, tragacanto, un derivado de celulosa, polietilenglicol, silicona, bentonita, sílice, talco, óxido de zinc, etc.
Cuando la formulación de la presente exposición es un polvo o una pulverización, se puede usar como ingrediente portador lactosa, talco, sílice, hidróxido de aluminio, silicato de calcio, polvo de poliamida, etc. En particular, cuando la formulación es un aerosol, puede contener además un propulsor tal como clorofluorohidrocarbono, propano/butano, o éter dimetílico.
Cuando la formulación de la presente exposición es una disolución o una emulsión, se puede usar como ingrediente portador un disolvente, un solubilizante, o un emulsionante. Por ejemplo, se puede usar agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, aceite de 1,3-butilglicol, un éster alifático de glicerol, polietilenglicol o un éster de ácido graso de sorbitán.
Cuando la formulación de la presente exposición es una suspensión, se puede usar como ingrediente portador un diluyente líquido tal como agua, etanol o propilenglicol, un agente de suspensión tal como alcohol isoestearílico etoxilado, éster de polioxietilensorbitol y éster de polioxietilensorbitán, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar, tragacanto, etc.
Cuando la formulación de la presente exposición es un limpiador que contiene tensioactivo, se puede usar como ingrediente portador un sulfato de alcohol alifático, un éter sulfato de alcohol alifático, monoéster sulfosuccínico, isetionato, un derivado de imidazolinio, metil taurato, sarcosinato, un éter sulfato de amida de ácido graso, una alquilamidobetaína, un alcohol alifático, un glicérido de ácido graso, una dietanolamida de ácido graso, un aceite vegetal, un derivado de lanolina, un éster de ácido graso de glicerol etoxilado, etc.
En un ejemplo de forma de realización, la composición puede ser una composición alimentaria.
La composición alimentaria puede ser una formulación líquida o sólida. Por ejemplo, puede estar en forma de diversos alimentos, bebidas, gomas de mascar, tés, mezclas de vitaminas, alimentos saludables suplementarios, etc., y puede formularse como un polvo, un gránulo, un comprimido, una cápsula o una bebida. Cada formulación de la composición alimentaria puede ser preparada por los expertos en la técnica sin dificultad mezclando el ingrediente activo con ingredientes usados habitualmente en la técnica dependiendo de los fines. Se puede lograr un efecto sinérgico cuando el ingrediente activo se usa junto con otros ingredientes.
Los ingredientes líquidos que pueden estar contenidos en la composición alimentaria, además del ingrediente activo, no están particularmente limitados. En las bebidas habituales, pueden estar contenidos además diversos sabores, hidratos de carbono naturales, etc. El hidrato de carbono natural puede ser un monosacárido, un disacárido tal como glucosa, fructosa, etc., un polisacárido tal como maltosa, sacarosa, etc., un azúcar habitual tal como dextrina, ciclodextrina, etc., o un alcohol de azúcar tal como xilitol, sorbitol, eritritol, etc. Como sabor, se puede usar un sabor natural (taumatina, extracto de estevia (por ejemplo, rebaudiósido A, glicirricina, etc.), o un sabor sintético (por ejemplo, sacarina, aspartamo, etc.). El hidrato de carbono natural puede estar contenido en una cantidad de generalmente alrededor de 1-20 g, específicamente alrededor de 5-12 g, por 100 ml de la composición según la presente exposición.
En un aspecto, la composición alimentaria puede contener diversos nutrientes, vitaminas, minerales (electrolitos), sabores tales como sabores sintéticos y sabores naturales, colorantes, extendedores (queso, chocolate, etc.), ácido péctico y sales del mismo, ácido algínico y sales del mismo, ácidos orgánicos, espesantes coloidales protectores, agentes de control de pH, estabilizantes, antisépticos, glicerina, alcoholes, agentes carbonatantes usados en bebidas carbonatadas, etc. En otro aspecto, pueden contener pulpas para preparar zumos de frutas naturales y bebidas vegetales. Estos ingredientes pueden usarse independientemente o en combinación. Estos aditivos se pueden usar en una cantidad de alrededor de 0,001-20 partes en peso por 100 partes en peso de la composición según la presente exposición, aunque sin limitarse a ello.
Modo de invención
A continuación, la presente exposición se describirá en detalle mediante ejemplos. Sin embargo, los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos, y el alcance de la presente exposición no está limitado por los ejemplos.
Ejemplo 1. Aislamiento de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng
(Etapa 1) Primero, se preparó un zumo que contenía el líquido extracelular de la raíz de ginseng exprimiendo una raíz de ginseng de 4 años.
(Etapa 2) Se obtuvo un sobrenadante centrifugando el zumo a 4°C y 500 x g durante 10 minutos. Después, se obtuvo un sobrenadante centrifugándolo nuevamente a 4°C y 3000 x g durante 20 minutos.
(Etapa 3) Después de añadir secuencialmente 0.5 ml de sacarosa 2.5 M, 1 ml de sacarosa 0.8 M y 32 ml del sobrenadante con impurezas eliminadas a un tubo de ultracentrifugación de 35 ml, el tubo se ultracentrifugó a 4°C y 100,000 x g durante 2 horas. Después de la ultracentrifugación, se localizaron vesículas de raíz de ginseng similares a exosomas entre la capa de sacarosa 2.5 M y la capa de sacarosa 0.8 M debido a sus densidades. Por lo tanto, la capa en la que estaban contenidas las vesículas similares a exosomas de raíz de ginseng se separó retirando la disolución del lado superior del tubo.
(Etapa 4) La capa separada que contenía las vesículas similares a exosomas de raíz de ginseng se sometió a ultracentrifugación en gradiente de densidad. Específicamente, se mezclaron 0.42 ml de la capa separada que contenía las vesículas similares a exosomas de raíz de ginseng con 2.08 ml de iodixanol al 60%. Los 2.5 ml resultantes de iodixanol al 50% se añadieron a un tubo de ultracentrifugación de 12 ml. Después, se llevó a cabo la ultracentrifugación a 4°C y 200,000 x g durante 4 horas después de añadir secuencialmente 2.5 ml de iodixanol al 35%, 2.5 ml de iodixanol al 20%, y 2.5 ml de NaCl 150 mM/HEPES 20 mM al tubo. Posteriormente,
se obtuvieron fracciones de 1 ml del lado superior del tubo, y se tomó la fracción 3 (1.08 g/ml) correspondiente a la densidad de vesículas similares a exosomas midiendo las densidades (véase la figura 1).
(Etapa 5) La fracción 3 obtenida se diluyó en 60 ml de HBS (disolución salina amortiguada con HEPES) y se añadió a un tubo de ultracentrifugación de 70 ml. Después, las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng peletizadas se obtuvieron mediante ultracentrifugación a 4°C y 100,000 x g durante 2 horas.
Ejemplo 1 de ensayo. Análisis microscópico electrónico de transmisión de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng
El tamaño y la forma de las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng obtenidas en el Ejemplo 1 se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM).
La figura 2 muestra las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng. Se confirmó que las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng tenían un diámetro de 50-100 nm, y eran aproximadamente esféricas.
Ejemplo 2 de ensayo. Comparación de la producción de melanina por las células MNT-1 después del tratamiento con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng (1 pg/ml) durante 1 semana
Las células de la línea celular MNT-1 de melanoma humano se cultivaron en un medio esencial mínimo (MEM) suplementado con suero fetal bovino al 20% en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de sembrar las células en una placa de cultivo de 60 mm con 1x105 células por placa y esperar durante la noche, el medio se reemplazó por el mismo medio al que se añadió 1 pg/ml de las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng obtenidas en el Ejemplo 1. A modo de comparación, un grupo de control negativo se trató sin nada. El medio nuevo que contenía las vesículas similares a exosomas se reemplazó una vez cada 4 días, y las células se cultivaron durante un total de 8 días hasta que llenaron la placa. Cuando las células crecieron por completo, se trataron con 300 pl de un amortiguador de lisis (NP-40 al 1%, Tris-HCl 50 mM; pH 7,5, NaCl 150 mM) y se recogieron en un microtubo usando un raspador de células. Después, tras centrifugar a 15,000 rpm durante 10 minutos, los pelets que precipitan se disolvieron en NaOH 1 N, y se comparó el contenido de melanina midiendo la absorbancia a 450 nm.
Como resultado, se confirmó que el contenido de melanina disminuyó significativamente en las células MNT-1 tratadas con las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng en comparación con las células MNT-1 no tratadas con las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, como se observa en la figura 3 (n = 6, *: p < 0.05).
Ejemplo 3 de ensayo. Comparación de la producción de melanina por melanocitos humanos irradiados con 20 mJ/cm2 UVB 2 veces después del tratamiento con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng de diversas concentraciones durante 2 semanas
Se cultivaron melanocitos primarios humanos (Life Technologies, CA, USA) en medio M-254 (Gibco BRL, NY, USA) suplementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS; Gibco BRL, NY, USA) en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de sembrar las células en una placa de cultivo de 100 mm con 2x105 células por placa y esperar durante la noche, se irradiaron 20 mJ/cm2 de UVB 2 veces con un intervalo de 24 horas. Después, las células se cultivaron durante 2 semanas mientras se reemplazaba el medio por uno que contenía las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng obtenidas en el Ejemplo 1 a concentraciones de 0.1 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml o 10 pg/ml, una vez cada 4 días. A modo de comparación, los grupos de control positivo se trataron durante 2 semanas de la misma manera con Melasolv 30 pM, compuesto K 1 pM o 2 ppm de saponina fermentada, y se midió la producción de melanina. Como grupos de control negativo, los melanocitos no tratados con UVB y los melanocitos tratados con UVB pero no tratados con las sustancias de ensayo se cultivaron de la misma manera. Después de 2 semanas, las células se separaron de la placa de cultivo y se contaron. Las células del mismo número se recogieron en un microtubo, se lisaron con un amortiguador de lisis RIPA (Millipore, 20-188), y después se centrifugaron a 13,500 rpm durante 30 minutos. Los pelets que precipitan se disolvieron en NaOH 1 N y se fotografiaron para comparar el color. El contenido de melanina se compararon midiendo la absorbancia a 450 nm.
Como resultado, se confirmó que la producción de melanina aumentada por el tratamiento con UVB disminuyó notablemente cuando las células se trataron con 1 pg/ml o más de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, como se observa en la figura 4 (*: p < 0.05). Las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng según la presente exposición mostraron un efecto blanqueador de la piel comparable al de Melasolv de AmorePacific, compuesto K, y saponina fermentada. La disminución del contenido de melanina cuando las células se trataron con las sustancias se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Disminución (%) del contenido de melanina en melanocitos humanos irradiados con 20 mJ/cm2 UVB 2 veces después del tratamiento con sustancias de ensayo
Ejemplo 4 de ensayo. Comparación de la viabilidad de los melanocitos humanos 48 horas después del tratamiento con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng o con zumo de ginseng
Se cultivaron melanocitos primarios humanos (Life Technologies, CA, USA) en medio M-254 (Gibco BRL, NY, USA) suplementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS; Gibco BRL, NY, USA) en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de sembrar 0.7x105 células en una placa de 24 pocillos y esperar durante la noche, el medio se reemplazó por un medio que contenía las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng obtenidas en el Ejemplo 1 (GEV) o zumo de ginseng en concentraciones de 1 pg/ml o 10 pg/ml, o un medio que no los contiene (control). Después de cultivar durante 48 horas, se midió la supervivencia celular usando la disolución WST-1 (Roche Applied Science, Alemania).
Como resultado, la viabilidad celular fue 92% y 86%, respectivamente, cuando las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng (GEV) y el zumo de ginseng estaban contenidos en una concentración de 1 pg/ml, y la viabilidad celular fue 84% y 65% respectivamente, cuando las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng (GEV) y el zumo de ginseng estaban contenidos en una concentración de 10 pg/ml, en comparación con el medio que no contenía nada (control), como se observa en la figura 5 (*: p < 0.05). Por consiguiente, se confirmó que las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng exhiben una toxicidad menor que el zumo de ginseng cuando se tratan a la misma concentración.
Ejemplo 5 de ensayo. Comparación de la producción de melanina por melanocitos humanos irradiados con 20 mJ/cm2 UVB 2 veces después del tratamiento con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng o zumo de ginseng durante 2 semanas
Se cultivaron melanocitos primarios humanos (Life Technologies, CA, USA) en medio M-254 (Gibco BRL, NY, USA) suplementado con suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS; Gibco BRL, NY, USA) en condiciones de 37°C y CO2 al 5%. Después de sembrar 2x105 células en una placa de cultivo de 100 mm y esperar durante la noche, se irradiaron 20 mJ/cm2 UVB 2 veces con un intervalo de 24 horas. Después, las células se cultivaron durante 2 semanas mientras se reemplazaba el medio por uno que contenía las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng obtenidas en el Ejemplo 1 o zumo de ginseng a concentraciones de 1 pg/ml o 10 pg/ml una vez cada 4 días. Como grupos de control, los melanocitos no tratados con UVB y los melanocitos tratados con UVB pero no tratados con las sustancias de ensayo se cultivaron de la misma manera. Después de 2 semanas, las células se separaron de la placa de cultivo y se contaron. Las células del mismo número se recogieron en un microtubo, se lisaron con un amortiguador de lisis RIPA (Millipore, 20-188), y después se centrifugaron a 13,500 rpm durante 30 minutos. Los pelets que precipitan se disolvieron en NaOH 1 N y se fotografiaron para comparar el color. Los contenidos de melanina se compararon midiendo la absorbancia a 450 nm.
Como resultado, la producción de melanina aumentada por el tratamiento con UVB disminuyó notablemente cuando las células se trataron con vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng (GEV) o el zumo de ginseng, como se observa en la Tabla 2 y la figura 6 (*: p < 0.05, **: p < 0.01). Sin embargo, cuando se considera que 10 pg/ml de zumo de ginseng exhibe una alta citotoxicidad, se puede ver que las vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng de la presente exposición pueden disminuir más eficazmente el aumento inducido por UV del contenido de melanina con baja citotoxicidad.
Tabla 2. Disminución (%) del contenido de melanina en melanocitos humanos irradiados con 20 mJ/cm2 UVB 2 veces después del tratamiento con sustancias de ensayo
A continuación, la presente exposición se describirá en detalle mediante ejemplos de formulación. Sin embargo, los siguientes ejemplos de formulación son solo para fines ilustrativos, y el alcance de la presente exposición no está limitado por los ejemplos de formulación.
Ejemplo 1 de formulación Cápsula blanda
Se preparó una cápsula blanda mezclando 50 mg de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, 80 140 mg de L-carnitina, 180 mg de aceite de soja, 2 mg de aceite de palma, 8 mg de aceite vegetal hidrogenado,
4 mg de cera de abejas amarilla, y 6 mg de lecitina, e introduciendo 400 mg por cápsula según un procedimiento comúnmente empleado.
Ejemplo 2 de formulación Comprimido
Se preparó un comprimido mezclando 50 mg de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, 200 mg de galactooligosacárido, 60 mg de lactosa, y 140 mg de maltosa, granulando la mezcla usando un secador de lecho fluidizado, añadiendo 6 mg de éster de azúcar, y comprimiendo después usando una máquina para hacer comprimidos.
Ejemplo 3 de formulación Gránulo
Se preparó un gránulo mezclando 50 mg de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, 250 mg de glucosa cristalina anhidra, y 550 mg de almidón, granulando la mezcla usando un granulador de lecho fluidizado, e introduciendo después en una bolsita.
Ejemplo 4 de formulación Bebida
Se preparó una bebida mezclando 50 mg de vesículas similares a exosomas derivadas de ginseng, 10 g de glucosa, 0.6 g de ácido cítrico, y 25 g de jarabe de oligosacáridos, añadiendo 300 ml de agua purificada, e introduciendo 200 ml por botella. Después de llenar la botella, la bebida se esterilizó a 130°C durante 4-5 segundos.
Ejemplo 5 de formulación Loción
Se preparó una loción con la composición descrita en la Tabla 3 según un procedimiento comúnmente empleado.
Tabla 3.
Ejemplo 6 de formulación Crema
Se preparó una crema con la composición descrita en la Tabla 4 según un procedimiento comúnmente empleado.
Tabla 4.
Ejemplo 7 de formulación Paquete
Se preparó un paquete con la composición descrita en la Tabla 5 según un procedimiento comúnmente empleado.
Tabla 5.
Si bien se han mostrado y descrito los ejemplos de formas de realización, los expertos en la materia entenderán que se pueden realizar varios cambios en la forma y detalles sin apartarse del alcance de esta exposición como se define mediante las reivindicaciones adjuntas.
Claims (13)
1. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad de la pigmentación de la piel asociada con el aumento de melanina.
2. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según la reivindicación 1, en la que la vesícula similar a un exosoma presenta un diámetro de 20-500 nm.
3. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según la reivindicación 1 o 2, en la que la vesícula similar a un exosoma presenta un diámetro de 50-100 nm.
4. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la vesícula similar a un exosoma se precipita mediante ultracentrifugación del líquido extracelular de raíz de ginseng a 100,000 x g o más.
5. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la vesícula similar a un exosoma presenta una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml en iodixanol.
6. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la vesícula similar a un exosoma inhibe la producción de melanina.
7. Vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la vesícula similar a un exosoma previene o trata una o más enfermedades de la pigmentación de la piel seleccionadas de entre un grupo que consiste en melasma, pecas, lentigo, nevo, melanoma, pigmentación inducida por fármacos, pigmentación posinflamatoria, y pigmentación inducida por dermatitis.
8. Uso no terapéutico, cosmético o alimentario de una vesícula similar a un exosoma aislada de la raíz de ginseng para blanquear la piel.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que la vesícula similar a un exosoma presenta un diámetro de 20-500 nm.
10. Uso según la reivindicación 8 o 9, en el que la vesícula similar a un exosoma presenta un diámetro de 50 100 nm.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la vesícula similar a un exosoma se precipita mediante ultracentrifugación del líquido extracelular de la raíz de ginseng a 100,000 x g o más.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la vesícula similar a un exosoma presenta una densidad de flotación de 1.00-1.20 g/ml en iodixanol.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que la vesícula similar a un exosoma inhibe la producción de melanina.
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