TW201608021A - 活化發酵的製程及使用該製程製備發酵液和飲料 - Google Patents

Abstract

製備發酵液的方法包括以下步驟：分離並選擇一個合適的細菌菌株的菌落，製備含有該活性培養菌落的種子液，及將種子液加入大規模液體培養液中培養以得到發酵液。合適的細菌菌株是醋酸杆菌(Acetobacter)或葡糖杆菌(Gluconobacter)屬內的物種。種子液的製備是先透過在斜面固體培養基上培養菌落，接著進入多階段活化液體培養所製得而成。該多階段活化液體培養，包含有初始階段的小規模活化液體培養和至少一階段的放大比例的活化液體培養。

Description

活化發酵的製程及使用該製程製備發酵液和飲料

本發明是一種有關於發酵液之製備方法，尤其係有關於使用活化液體培養(active liquid culture)來製備發酵液。

紅茶菌是一種具有琥珀黃色和柔和的酸蘋果酒味道的液體飲料。紅茶菌是由含茶液體經過紅茶菌"蘑菇"所發酵製成。術語“紅茶菌”在不同的文化和語言中的同義詞包括：comboucha，cajnyj KVAS(俄羅斯)、克瓦斯、Combuchagetränk(德國)、Kargasoktee(德國)，komboecha-drank(荷蘭)、Kombuchakwass(德國)、茶啤酒、茶蘋果酒(英語)。紅茶菌具有抗菌性能，並含有葡糖酸，維生素B1，B2，B3，B6，B12，葉酸，和乳酸D(+)等營養素。紅茶菌對健康的益處在東亞，東歐和俄羅斯為世世代代所知和享用。在亞洲和俄羅斯，紅茶菌的治療效果得到測試，並作為天然的治療手段使用。近年來紅茶菌在美國流行，商業化生產的紅茶菌飲料在全國各地隨處可見。

紅茶菌“蘑菇”是指一種蘑菇狀的共生纖維素體，主要成份含：酵母菌(yeast)、醋酸杆菌(acetobacter)、葡萄糖酸杆菌(glucobacter)和時有少量的乳酸菌(Lactobacillus bulgaricum)。從紅茶菌中分離出的細菌包 括：木醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)、擬木醋酸杆菌(Acetobacter xylinoides)、葡萄糖酸杆菌(Bacterium gluconicum)、產酮醋酸杆菌(Acetobacter ketogenum)、弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)、葡萄糖醋酸杆菌(Gluconobacter liquefaciens)、醋化醋酸杆菌(Acetobacter aceti)和巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurianus)，其中，木醋酸杆菌最為重要。此外，從紅茶菌中也分離出酵母，包括：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、不顯酵母(Saccharomyces inconspicus)、路德類酵母(Saccharomycodes ludwigii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、熱帶假絲酵母(Candida tropicans)、克魯斯假絲酵母(Candida crusei)、漢遜德巴利酵母(debaryomyces hansenii)、酒香酵母(Brettanyomyces)、克勒克酵母(Kloeckera)和拜耳接合酵母(Zygosaccharomyces bailii)。

在傳統的發酵方法製備紅茶菌的過程中，一種或多種乳酸菌和酵母菌株在發酵液中形成共生關係。在發酵初始階段，酵母菌將糖分解為葡萄糖和果糖，並進一步將其發酵為乙醇；這些發酵產物供給培養液中的醋酸杆菌使其大量繁殖。然後醋酸杆菌氧化葡萄糖和果糖分別生成葡糖酸和乙酸，同時氧化乙醇生成乙酸。研究表明由酵母菌產生的乙醇刺激醋酸杆菌生長以產生更多的乙酸纖維素膜和乙酸，而乙酸反過來刺激酵母菌生成更多乙醇。乙酸和乙醇的存在下可保護醋酸杆菌和酵母菌不被其它微生物污染。此外，由醋酸杆菌產生的乙酸纖維素膜形成蘑菇狀體浮在發酵液體頂部，對酵母菌和醋酸杆菌提供物理環境支持，使其更好地暴露接觸發酵所需的空氣中的氧氣。

傳統的發酵方法製備紅茶菌的過程中，係取決於酵母菌和 細菌在培養液中的組合，產出紅茶菌的味道，質量和內容在不同批次中有所不同。產品質量的不穩定性阻礙了工業化大規模生產紅茶菌。此外，傳統使用酵母菌和細菌的組合的發酵製備一般需約7天至2周，使大規模生產變得更加困難。在發酵製備中，紅茶菌蘑菇體的生長及進一步培養製備的再利用，最終即在數月內無法產出具有相同的味道和質量的發酵飲料而失敗，因此需要不斷由新的培養物補充。此外，紅茶菌發酵飲料可能會有強烈的醋酸或酒精味而阻止了一些消費者的飲用和享受。

本發明為了解決上述問題，提供了一種製備發酵液的方法。本發明方法提供的發酵液飲料具有一致的和更好的風味和有益的效果。本發明的方法安全，快速，高效，並且適合大規模工業化生產。

本發明目的在於提出一種製備發酵液的方法，包括以下步驟：分離並選擇一個合適的細菌菌株的菌落，製備含有該活性培養菌落的種子液，及將種子液加入大規模液體培養液中培養以得到發酵液。其中合適的菌株為醋酸杆菌(Acetobacter)或葡糖杆菌(Gluconobacter)屬內的物種。種子液的製備是先在斜面固體培養基上培養菌落，接著透過多階段活化液體培養以得到種子液。其中該多階段活化的液體培養係包含有初始階段的小規模活化液體培養和至少一階段的放大比例活化液體培養。初始階段的小規模活化液體培養和每階段放大比例的化液體培養各自在有氧和連續空氣通風的條件下攪拌進行約18小時至約24小時。種子液係為選自放大比例的活化液體的培養液，選擇的基準在於豐富和芳香的水果味道和氣味，且pH值在培養期結束時降到約2.5至2.8。此外，在放大比例活化液體培養結束 時，OD值640nm值為約0.15至0.20。而在大規模液體培養的製備，則是在有氧和連續空氣通風的條件下攪拌進行，時間少於約30小時，pH值在結束培養時為達到約2.6至2.8。此外，在大規模液體培養結束時，發酵液的OD值640nm達到約0.10至0.13。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，合適的菌株為培養於約28℃至30℃的水平培養皿上，培養約48小時至72小時，且pH值為約6.0至6.5的條件下生長和挑選菌落。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，在選擇菌落之前，可進一步包括先於固體培養基上活化保存的細菌菌株。其中該固體培養基含有維生素B群，於培養溫度約在28℃至30℃下，起始pH值為約6.0至6.5的斜面上進行培養，培養時間約24小時至48小時。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，菌落的斜面培養在含有維生素B群的斜面固體培養基上進行，pH值為約6.0至6.5，培養的溫度在約28℃至30℃下進行約48小時。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，所述的多階段活化液體培養以製備種子液，係包括初始階段的小規模活化液體培養，和接下來的至少一階段的放大比例活化液體培養。其中該初始階段的小規模活化液體培養在小型容器中進行，溫度為約28℃至30℃，pH值約6.0至6.5；而放大比例活化液體培養在中等規模的種子液製備罐中進行，溫度約28℃至30℃，pH值約4.8至5.2，且液體培養的培養基中含有茶萃取液。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，培養體積在各個放大比例活化液體培養的階段比前一級培養放大了約20倍。

根據上述本發明製備發酵液的方法程中，大規模液體培養在溫度約28℃至30℃，通風速率約0.5V/V/M，和起始pH值為約4.8至5.2的條件下進行。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，每階段放大比例活化液體培養和大規模液體培養所得的液體培養基含有茶萃取液，並且可以進一步包含中草藥成分，例如：枸杞子(Wolfberry，Lycium Chinese Mill)、黃芪(Radix Astragali)、人參(Ginseng)或山楂(Hawthorn berry)。此外，在上述本發明製備發酵液的過程中，每階段放大比例活化液體培養和大規模液體培養所得的液體培養基也可以含中草藥成分，其中包括：枸杞子、黃芪、人參或山楂。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，糖源可進一步加入每階段放大比例活化液體培養和大規模液體培養的培養液中，所述糖源占高達培養液體積的約10%，糖源為葡萄糖，蔗糖，或蜂蜜，並可含果糖。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，進一步包括透過過濾方式除去發酵液中細菌菌株的步驟。

根據上述本發明製備發酵液的方法中，進一步包括調節該發酵液的酸度，風味和質地來製備發酵飲料。

另外，本發明一目地提供由該方法製成的發酵液和補品飲料。

此外，根據上述本發明製備發酵液的方法，可以進一步包括使發酵液乾燥的步驟以得到乾燥的發酵液物質。此外，本發明也提供一種膳食補充劑，其包含由該方法製得的乾燥的發酵液物質。

第1圖為製備發酵飲料的方法之流程圖，描述本發明活化發酵的方法及發酵生產之前和之後的配製及產物

第2圖為保存菌株及活化保存菌株的菌落用於製備種子液之流程圖

本發明的生產過程被稱為“活化發酵(active fermentation)”或“活化培養(active culture)”是一個獨一無二的深層發酵的過程，其中細菌菌株經過精心篩選，透過在燒瓶/搖床、種子罐和發酵罐中的逐漸擴大培養，以確保最終發酵液產品的質量和均一。在活化發酵的製備方法中，微生物菌體由於連續的通風和攪拌，均勻地分布在液體培養的培養基中，使其充分利用溶解在培養基中的營養物。整個培養液為均勻的培養液，具有良好的傳熱性，與傳統的靜態製備方法製備紅茶菌含有蘑菇狀纖維素體漂浮在液體的頂部形成對比。在本發明中，所有的菌體充分參與合成代謝，從而加快發酵速度，比傳統方法制造紅茶菌的效率更高。在本發明的發酵過程中，液體頂部沒有紅茶菌蘑菇，整個培養液不斷被攪拌通氣來製備液體。

發酵容器可被密封以減少來自其它細菌的污染。此外，該方法操作和管理方便並且可以連續進行。一但選擇和製備合適的種子液，大規模發酵過程就不需要超過30小時。在最後的發酵液中含有大量的活性培養菌落並保持充裕的青蘋果香味和酶活性。

如第1圖所示，發酵的製程始於合適的細菌菌株。本發明中 使用的細菌菌株從醋酸杆菌和葡糖杆菌屬的單一物種中選擇。具體物種主要包括：醋化醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、木醋酸杆菌(Acetobacter xylinum)、氧化醋酸杆菌(Acetobacter suboxydans)、葡萄糖醋酸杆菌cerinus(Gluconobacter cerinus)和該兩個屬內的其它物種。合適的細菌菌株被預先選擇、分離、培養或處理。優選地，所選擇的菌株必須擁有以下特徵：發酵周期短和代謝產物豐富，以生產具有很高的營養價值和豐富的味道的發酵飲料。選擇合適的細菌菌株作為發酵製程的起點是非常重要的。一旦理想的細菌菌株，通常是從醋酸杆菌和葡糖杆菌屬內的單一物種中被選擇，接下來，就容易調整和優化發酵培養的生長條件，以實現具有一致的風味和口感的產品。

細菌菌株的保存過程為本領域已知的技術。傳統方法包括在沙或粘土中儲存，在斜面培養基上用石蠟密封儲存，或儲存在已被使用的甘油中。現代科技的方法還包括真空乾燥冷凍和液氮低溫儲存。優選地，該菌株被保存在-20℃真空乾燥冷凍，可保存約4至5年。如第2圖所示，用於生產的細菌菌株可以由石蠟和甘油密封保存2至3年，而車間生產和實驗室使用的細菌菌株可在4℃下斜面培養基上保存2至3個月。

如第1圖所示，如有需要，儲存在冰箱中的菌株可被活化。在斜面固體培養基上培養該細菌菌株。該固體培養基包含維生素B群，培養的條件包含：培養溫度約28℃至30℃、起始pH值約6.0至6.5，及培養時間約24小時至48小時。

接著，從於水平培養皿上活化的細菌菌株或培養任何其他來源的菌株並選擇菌落，培養條件包含：培養溫度約28℃至30℃、起始pH 值約在6.0至6.5，及培養時間約48小時至72小時。接著將這些菌落接種至固體培養基上以作為進一步的發酵製備，該菌落通常包含醋酸杆菌屬或葡糖杆菌屬的單一物種的細菌菌株，偶爾可能含有兩個或多個物種。

用於製備發酵飲料的方法可包括在多級活化液體培養制備種子液之前，先在斜面固體培養基上培養從水平培養皿上所挑選的菌落。斜面培養為保存和繁殖細菌菌株世代的主要手段。斜面培養可以被視作製備用作工業生產的種子液的起點。該培養可在各種尺寸的試管斜面或燒瓶中進行。為了優化生長和工業化生產，優選使用已培養了約24小時至48小時的新鮮細菌菌株而需避免使用一直使用在斜面培養的舊菌株。斜面培養的固體培養基含維生素B群，培養條件包含：培養溫度約28℃至30℃、pH值約6.0至6.5，及培養時間約48小時。

接下來，將斜面培養的細菌用無菌水從斜面洗下並加入到合適的燒瓶中並放置在搖床底座上進行活化液體培養，播種量為約1%至5%。優選地，該燒瓶包含100毫升液體培養基和1%體積百分比的含有合適細菌菌株之無菌水用於初始培養。培養溫度是約28℃至30℃，搖床速度優選設定為轉速約180rpm至210rpm進行約24小時，pH值為約6.0至6.5。

接著，透過多階段活化液體發酵製備適合大規模工業化生產的種子液。多階段活化液體培養中的每階段培養放大了上一階段的液體培養體積，每一階段培養使用大約1%至10%的上一階段活化液體培養中含細菌菌株的培養基。優選地，對於初始的小規模液體培養，接種量為之前液體培養的培養基約1%至5%，並且更優選為1%。在接下來的放大比例的和大規模的培養基中，優選地，接種量為之前的液體培養的培養基的 約5%，使得活性培養以約20倍的規模擴大培養。每次多階段活化液體培養的培養時間被控制為約24小時或更少的時間周期，並在有氧及連續空氣通風和攪拌的條件下進行。

多階段活化液體培養可進一步在相同的培養條件下，包括連續進行的一階段或多階段液體培養，且每階段液體培養的培養體積為上一級的培養體積的放大進行。例如，第一階段液體培養在種子罐中進行，體積為50ml至100ml的液體培養基，而第二階段液體培養在500ml至1000ml的種子罐中進行。兩種階段培養均在約28℃至30℃的溫度和約4.8至5.2的pH值下進行，時間為約18小時至24小時。

放大比例的活化液體發酵在中等規模的種子液製備罐中進行，該步驟對於選擇和製備有效的種子液用於大規模的活化發酵十分重要。那些在製藥，食品和酶學工業一般使用的發酵罐可用於該目的。現代發酵罐通常配備有自動控制和連續發酵設備，提高了產品的產量和質量。放大比例的活化液體培養可於相同的培養條件下，包含連續進行一階段或多階段的液體發酵製程，且每一階段液體發酵對比上一階段的液體發酵，其培養體積為放大進行。液體培養基中含有茶的萃取液，在約28℃至30℃的溫度下及pH值約4.8至5.2的液體培養基中進行。在該製備種子液的階段，茶萃取液被加入到液體培養基中，而當中有效的細菌菌株是取決於發酵後液體的味道和顏色來進行選擇。

透過連續的活化液體培養和挑選，本發明可從單種菌株得到一種能提供最有效益的細菌菌落方法，即能在約24小時至30小時內完成發酵，且得到口感豐富和營養益處高的發酵產物。本發明的關鍵是選擇合 適的細菌菌株，隨後製備有效益的種子液並用於大規模生產。種子液必須不含有其它污染的細菌，僅含有所挑選的菌株，具有高發酵效率和淡黃色，發酵液為半透明並含有豐富的水果香味和味道。種子液在放大比例的活化液體培養結束時取得。優選地，選擇在放大比例的活化液體培養中，640nm的光密度(OD)達到約0.15~0.20和pH值減小到約2.5至2.8的範圍時結束發酵。精心准備的種子液在擴大規模的發酵結束時發酵液有著豐富的水果香味和口感。

以OD值作為細菌在發酵液體中濃度的標識的原理和測試程序為本領域已知技術。在本發明中，OD值可設定在420-660奈米(nm)波長的分光光度計測試。測試波長必須標准化並根據欲測試材料的需求作調整。不同細菌菌株可能具有不同的最大吸收波長。在本發明的實施例中，波長640nm用於測試OD值。

隨後，大規模發酵在有氧和連續空氣通風和攪拌的條件下進行，發酵時間控制在約小於30小時，優選約24小時。種子液加入大規模發酵液體培養是該大規模發酵液體培養的總體積約3%至10%體積百分比，優選大約5%體積百分比。大規模發酵在含茶萃取液的液體培養基中進行，培養溫度為約28℃至30℃，空氣通風率為約0.5V/V/m，液體培養的起始pH值約4.8至5.2。在大規模發酵結束時，發酵液的pH值降到約2.6至2.8，OD值波長640nm細菌濁度為大約0.10~0.13。在大規模培養結束時，發酵液應保有充足水果芳香和種子液的氣味。

進一步地，大規模發酵可以多階段進行。例如，大規模發酵可分2個階段進行，其中第一階段在一個1噸的發酵罐中進行，第二階段 在20噸的發酵罐中進行。

在本發明製備發酵飲料的方法中，用於製造發酵飲料的茶葉的來源和品種不限，特別是，茶樹Camellia sinensis或者Camellia sinensis var.assamica的品種均可。所有品種的綠茶、半發酵茶、紅茶、熏紅茶、黃茶、黑茶、白茶、植物或水果的草藥茶、浸漬物，均可使用為制造發酵飲料的原料，優選地，綠茶的茶葉萃取液和水為優先選擇。當細菌在發酵液體培養中生長繁殖時，該茶萃取物提供了微量礦物質和營養素以促進細菌生長，這是糖和其它碳源所不能供給的益處。加入茶萃取液為優化細菌生長所必需。茶萃取液在一般使用的工業設備中以約1克茶：25毫升水的比率在水中浸泡兩次，並將兩次的溶液混合，使最終比為1克左右茶：50毫升水而製成。對茶葉的質量沒有嚴格的要求，質量較次級的茶也可以使用。優選地，使用綠茶。種子發酵罐中所用的茶萃取液的量較高，每100升液體培養基使用25升茶萃取液(約500克乾燥的茶萃取液)，而在大規模發酵罐中，每100升液體培養基使用10升茶萃取液(約200克乾燥的茶萃取液)。

此外，茶萃取液可以由在傳統中醫中一般使用的草藥補充或替代，如：枸杞、黃芪、人參及山楂等，以製備滋補飲料。這些草藥可以是常見的水萃取物或乾草藥的形式添加。

在液體發酵培養中，糖源作為養料來源需要供給細菌生長。已知糖源包括葡萄糖，蔗糖或蜂蜜，可以加入到培養液中。此外，各種水果可加入以提供糖源。在培養液中的糖含量高達約10%的體積百分比。

進一步地，本發明用於製備發酵飲料的方法中，包括透過過濾將發酵液中的細菌菌株除去的步驟。由於發酵液中含大量細菌菌落，這些菌落含有益於人體的豐富蛋白質。然而為了保持發酵飲料穩定和儲存安全，有必要停止生產結束後的進一步發酵和穩定飲料酸度。因此，將細菌從發酵飲料中除去以保留飲料中的酶活性和風味，保存期可長達一年。優選地將細菌透過低溫過濾從發酵飲料中除去。例如庫諾有限公司的Zeta S系列過濾器可被用作預濾器，0.5μ Zetapor ER過濾膜被用於次級過濾，得到無細菌的發酵飲料。發酵飲料經過過濾除去細菌後，具有非常淺及微黃半透明的琥珀色和新鮮的青蘋果香味。

任選地，在本發明製備發酵飲料的方法中，發酵液的酸度，風味和質感可調，以製得更為可口的發酵飲料。發酵過程依賴於微生物的繁殖和代謝。在製備發酵飲料的方法中，儘管嚴格控制生產參數，產品品質仍然可能不同，其不同於具有統一內容物的化學混合飲料。為了使得飲品品質均一，發酵飲料可混合並調整風味，質地和酸度。不同批次或發酵罐的飲料產品可以混合，並根據消費者的口味進一步調整其甜度，酸度，濃度和香味。酸度可以略為稀釋調整到2%以保持飲料的微妙風味和香味。如果需要強烈的味道，可以添加某些天然香料添加劑，如天然草莓調味劑，來取悅消費者。無論用什麼以混合和調整最終飲料產品，本產品總是基於天然釀造和發酵的飲料，與大多數的完全依賴於人工成分的混合物的市售飲料不同。此外，本發明的發酵飲料還可像酒一樣儲存。經過長時間的儲存，發酵飲料可獲得更豐富的風味和具有更高的品質和口感。

本發明進一步提供一種發酵液、種子液和發酵飲料，均由 本發明的方法製成。發酵飲料可以被乾燥制成乾燥物質，加入或用於各種膳食補充劑。本發明製備的發酵飲料，其味道、風味和營養價值均優於現有市售任何飲料。在發酵和繁殖過程中，微生物產生大量的代謝物，包括：氨基酸、維生素、有機酸和酶，可保留充足風味和口感，同時對人體有益。

本發明透過下面的實施例進一步說明。所述實施例不限制本發明的範圍，作為本領域技術人員可以修改實施例而不脫離本發明的範圍。

實施例1活化細菌菌株

起始菌株或已保存在冰箱或冷凍乾燥的細菌菌株在進一步培養和選擇單一菌落之前需要被活化。固體斜面培養基製備方法如下：在含1000ml水的大容器中加熱溶解20.0克葡萄糖、10.0克酵母粉、3.0克牛肉膏、10.0克碳酸鈣、20毫克維生素群混合物和20.0克瓊脂，溶液天然的pH值為6.0至6.5；於每25毫升的小試管中倒入4毫升至5毫升溶解的溶液；接著將試管用棉花密封置於120℃巴氏殺菌加熱30分鐘；趁熱放置試管並傾一個角度，使該固體培養基的表面頂部形成斜面。最後將細菌菌株用接種環接種於斜面上，並放置於28℃至30℃的保溫培養箱培養24至48小時。

實施例2純化和篩選單個菌落

水平固體培養基製備如下：在含1000ml水的大容器中溶解20.0克葡萄糖、10.0克酵母粉、3.0克牛肉膏、10.0克碳酸鈣、20毫克維生素群混合物和20.0克瓊脂，溶液天然的pH值為6.0至6.5；於每個500毫升燒瓶中倒入200毫升溶解的溶液；接著將燒瓶用棉花密封和巴氏殺菌30分鐘；將 殺菌後的溶液冷卻至50℃至60℃，並傾倒20毫升溶液於直徑9cm的水平培養基上降溫形成水平固體培養基。

接下來，從實施例1中活化細菌的培養方法中利用接種環取得幾個細菌菌落，接種在水平的培養基上透過繪製分隔線。接著將水平培養基放置在溫度28℃至30℃的保溫培養箱下進行48至72小時的培養。單菌將落在固體培養基上生長並被挑選出用於進一步的製備。

實施例3斜面培養單一菌落

從實施例2活性培養得到的單一菌落將進一步在斜面培養基上培養。生長在水平培養基上的單一菌落被接種環取出並接種在實施例1制備的斜面培養基上。周圍具有較大的透明圈的單一菌落為健康菌落，可優選使用。當細菌生長時會產生酸，酸與介質中的碳酸鈣反應；由於碳酸鈣的減少，菌落周圍會形成透明圈，其表明成長健康。

每個單一菌落接種在2至3個斜面培養基上，試管置於保溫培養箱溫度28℃至30℃下培養約48小時。沒有污染且生長良好的單個菌落被保存在冰箱中以供進一步使用。

實施例4多階段搖床液體培養

液體培養基經由以下步驟制備：在含1000ml水的容器中溶解20.0克葡萄糖、10.0克酵母粉、3.0克牛肉膏及1.0克KH₂PO₃，溶液天然的pH值為6.0至6.5；接著將該溶液100毫升加入500毫升三角瓶中；三角瓶用棉花密封並在溫度120℃下巴氏殺菌30分鐘。待液體培養基冷卻下來即完成製備。從實施例3斜面培養得到的細菌菌落，以5毫升無菌水洗滌，然後接種到500毫升的三角燒瓶其中包含100毫升的液體培養基中。將該培養基置於 溫度28℃至30℃，以搖床搖速180rpm至210rpm的條件下進行發酵培養，時間約24小時。

接著，取上述500毫升的三角燒瓶其中1%的液體培養基，接種於1000毫升的三角燒瓶其中包含200毫升的液體培養基，該培養基的製備與上述相同，只有放大比例跟體積不同，接著將該培養基置於溫度28℃至30℃，以搖床搖速180rpm至210rpm的條件下進行發酵培養，時間約24小時。得到的活性培養菌落可用於種子液的製備。

實施例5種子罐液體培養發酵

液體培養基經由以下步驟製備：在消毒後的發酵罐中溶解3.0千克葡萄糖和6.5千克的蔗糖於75千克的無菌水。發酵罐加熱至溫度100℃維持15分鐘。待溫度冷卻下來，在罐中加入25千克茶萃取液和900毫升食用酒精。實施例4得到的活性培養菌落的培養液以1%的體積比加入罐中。接著加入氫氧化鈉將pH值調到5.0±0.2。並將培養罐置於溫度28℃至30℃，搖床搖速為57rpm的條件下進行發酵培養，時間約18小時至24小時。發酵條件為空氣通風且每分鐘通氣量達到大約0.5空氣體積/培養體積/分鐘(v/v/m)。在本階段結束時，該液體培養基的細菌濁度OD值為約0.150至0.200，pH值降到約2.5至2.8，並含有水果香味和豐富的口感。此時，種子液製備完畢。

實施例6大規模發酵培養

液體培養基經由以下步驟製備：在消毒後的發酵罐中溶解1.0千克葡萄糖和11.0千克的蔗糖於80千克的無菌水中。發酵罐加熱至溫度100℃維持15分鐘。待溫度冷卻下來，在罐中加入10千克茶萃取液和450毫 升食用酒精。實施例5得到的種子液以5%的體積比加入罐中。接著加入氫氧化鈉將pH值調到5.0。並將培養罐置於溫度28℃至30℃，攪拌發酵培養，培養時間約24小時。發酵條件為空氣通風且每分鐘通氣量達到大約0.5v/v/m。在發酵結束時，該液體培養基的細菌濁度OD值(OD640)為約0.10至0.13，pH值降到約2.6至2.8，並含有水果香味和豐富的口感，培養基的顏色為半透明淡黃色。此時，發酵飲料製備完畢。

Claims (12)

1. 一種製備發酵液的方法，包括以下步驟：分離並選擇一個合適的細菌菌株的菌落，製備含有該活性培養菌落的種子液，及將該種子液加入大規模液體培養液中培養以得到發酵液；其中該合適的細菌菌株是醋酸杆菌(Acetobacter)或葡糖杆菌(Gluconobacter)的屬內的物種；種子液的製備是先在斜面固體培養基上培養菌落，接著透過多階段活性液體培養以得到種子液；其中該多階段活化液體培養包含初始階段的小規模活化液體培養和至少一級的放大比例活化液體培養；初始階段的小規模活化液體培養和每階段放大比例的活化液體培養各自在有氧和連續空氣通風的條件下攪拌進行約18至約24小時；種子液選自放大比例的活化液體培養液，其pH值在培養期結束時降到約2.5至2.8；及大規模液體培養則在有氧和連續空氣通風的條件下攪拌進行，培養時間少於約30小時，pH值在培養結束時為約2.6至2.8。
2. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法，在選擇單一菌落之前，進一步包括先在固體培養基上活化保存的細菌菌株。
3. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法中，該放大比例活化液體培養包含兩個或以上的活化液體培養階段，培養體積在各個放大比例活化液體培養的階段比前一階段培養放大了約20倍。
4. 根據專利申請範圍第1項所述的製備發酵液的方法中，該放大比例活化液體在培養結束時，OD值640nm為約0.150至0.20。
5. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法中，該大規模液體在培養結束時，發酵液的OD值640nm將達到約0.10至0.13。
6. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法中，每個放大比例活化液體培養和大規模液體培養所用的液體培養基均含有茶萃取液。
7. 根據申請專利範圍第6項所述的製備發酵液的方法中，該液體培養基可進一步包含中草藥成分為枸杞子、黃芪、人參或山楂。
8. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法，進一步包括透過過濾方式除去發酵液中細菌菌株的步驟。
9. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法進一步包括調節該發酵液液的酸度，風味和質地來制備發酵飲料。
10. 一種發酵液，其製備方法係如申請專利範圍第1項所述。
11. 根據申請專利範圍第1項所述的製備發酵液的方法，可進一步包括使該發酵液乾燥的步驟以得到乾燥的發酵液物質。
12. 一種膳食補充劑，含有如申請專利範圍第11項所述的乾燥的發酵液物質。