TW201444873A - 抗人類ｃｓｆ－１ｒ抗體及ｔｌｒ９促效劑之組合療法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於抗人類CSF-1R抗體與TLR9促效劑之組合療法。

Description

抗人類CSF-1R抗體及TLR9促效劑之組合療法 CSF-1R及CSF-1R抗體
人類CSF-1受體(CSF-1R；群落刺激因子1受體；同義詞：M-CSF受體；巨噬細胞群落刺激因子1受體、Fms原致癌基因、c-fms、SEQ ID NO：62)自1986年以來即為業內已知(Coussens,L.等人，Nature 320(1986)277-280)。CSF-1R係一種生長因子且由c-fms原致癌基因來編碼(例如，綜述於Roth,P.及Stanley,E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181(1992)141-167中)。
CSF-1R係CSF-1(群落刺激因子1，亦稱為M-CSF、巨噬細胞群落刺激因子)之受體，且調介此細胞介素之生物效應(Sherr,C.J.等人，Cell 41(1985)665-676)。群落刺激因子-1受體(CSF-1R)(亦稱為c-fms)之選殖首次闡述於Roussel,M.F.等人，Nature 325(1987)549-552中。在該公開案中顯示CSF-1R具有依賴於結合Cbl且由此調控受體下調之該蛋白質C端尾之變化(包含損失抑制性酪胺酸969磷酸化)的轉化潛能(Lee,P.S.等人，Embo J.18(1999)3616-3628)。最近鑒定出CSF-1R之另一配體(稱為介白素-34(IL-34))(Lin,H.等人，Science 320(2008)807-811)。
目前已知兩種結合至CSF-1R之細胞外結構域之CSF-1R配體。第 一種係CSF-1(群落刺激因子1，亦稱為M-CSF、巨噬細胞；SEQ ID NO：86)且發現在細胞外呈二硫鍵連接之同源二聚體形式(Stanley,E.R.等人，Journal of Cellular Biochemistry 21(1983)151-159；Stanley,E.R.等人，Stem Cells 12增刊1(1995)15-24)。第二種係IL-34(人類IL-34；SEQ ID NO：87)(Hume,D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。CSF-1R信號傳導之主要生物效應係造血前體細胞至巨噬細胞譜系(包含破骨細胞)之分化、增殖、遷移及存活。CSF-1R之活化係由其CSF-1R配體CSF-1(M-CSF)及IL-34來調介。CSF-1(M-CSF)與CSF-1R之結合誘導形成同源二聚體且藉由酪胺酸磷酸化來活化激酶(Li,W.等人，EMBO Journal.10(1991)277-288；Stanley,E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.46(1997)4-10)。
生物活性同源二聚體CSF-1結合至CSF-1R之CSF-1受體之細胞外結構域(CSF-1R-ECD)的子結構域D1至D3內。CSF-1R-ECD包括5個免疫球蛋白樣子結構域(稱為D1至D5)。細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之子結構域D4至D5並不參與CSF-1結合(Wang,Z.等人Molecular and Cellular Biology 13(1993)5348-5359)。子結構域D4參與二聚化(Yeung,Y-G.等人Molecular & Cellular Proteomics 2(2003)1143-1155；Pixley,F.J.等人，Trends Cell Biol 14(2004)628-638)。
另一信號傳導係由分別連結至PI3K/AKT及Ras/MAPK途徑之PI3K之p85亞單位及Grb2來調介。該兩條重要的信號傳導途徑可調控增殖、存活及細胞凋亡。結合CSF-1R之磷酸化細胞內結構域之其他信號傳導分子包含STAT1、STAT3、PLCy及Cbl(Bourette,R.P.及Rohrschneider,L.R.，Growth Factors 17(2000)155-166)。
CSF-1R信號傳導在免疫反應、骨重塑及生殖系統中具有生理學作用。已顯示，CSF-1(Pollard,J.W.,Mol.Reprod.Dev.46(1997)54-61)或CSF-1R(Dai,X.M.等人，Blood 99(2002)111-120)敲除動物具有 骨硬化組織、造血組織巨噬細胞及生殖表型，此與CSF-1R在各別細胞類型中之作用一致。
Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793係關於一些抑制CSF-1活性之抗CSF-1R抗體。Ashmun,R.A.等人，Blood 73(1989)827-837係關於CSF-1R抗體。Lenda,D.等人，Journal of Immunology 170(2003)3254-3262係關於CSF-1缺陷小鼠中之巨噬細胞募集、增殖及活化減少導致腎發炎期間之管狀細胞凋亡減少。Kitaura,H.等人，Journal of Dental Research 87(2008)396-400涉及抑制正畸牙齒移動之抗CSF-1抗體。WO 2001/030381提及CSF-1活性抑制劑(包含反義核苷酸及抗體)，同時僅揭示CSF-1反義核苷酸。WO 2004/045532係關於CSF-1拮抗劑對轉移性癌症之轉移及骨損失預防及治療，其僅揭示抗CSF-1抗體作為拮抗劑。WO 2005/046657係關於抗CSF-1抗體對發炎性腸病之治療。US 2002/0141994係關於群落刺激因子之抑制劑。WO 2006/096489係關於抗CSF-1抗體對類風濕性關節炎之治療。WO 2009/026303及WO 2009/112245係關於某些結合至CSF-1R之細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之前3個子結構域(D1至D3)內之抗CSF-1R抗體。WO2011/123381(A1)係關於抗CSF-1R抗體。WO2011/070024係關於某些結合至CSF-1R之二聚化結構域(D4至D5)內之抗CSF-1R抗體。
TLR、TLR9及TLR9促效劑
用於癌症療法之不同實驗性類鐸受體促效劑經最佳闡述(Galluzzi等人，OncoImmunology,1：5,(2012)699-716)Toll-like receptors(TLRs)in general are prototypic pattern recognition receptors(PRRs)已知其因應保守微生物組份(例如脂多糖及雙鏈RNA)活化固有免疫系統之能力。越來越多的證據指示，TLR之功能並不限於誘發抵抗侵襲性病原體之固有免疫反應。實際上已顯示TLR參與組織修復及損傷引起之再生以及抵抗癌症之適應性免疫反應。具體而言，樹突狀細胞對細 胞相關腫瘤抗原之有效處理及交叉呈遞似乎需要TLR4信號傳導，此事實上成為對一些抗癌藥物之最佳治療反應的基礎。因此，TLR組成用於活化/強化抗癌免疫反應之顯著治療靶。與此觀點一致，長期使用之製劑(例如科利毒素(Coley toxin，殺死細菌釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene)與黏質沙雷氏菌(Serratia marcescen)之混合物)及卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG，牛結核桿菌(Mycobacterium bovis)之減毒菌株，其最初係作為抵抗結核病之疫苗來研發)(二者皆與恆定抗癌反應相關)強效地活化TLR2及TLR4信號傳導。
根據目前公認之模型，TLR以同源或異源二聚體形式來操作，且在質膜(主要結合蛋白質-脂質MAMP之TLR，即TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6及TLR10)上或在胞內體(檢測微生物核酸之TLR，即TLR3、TLR7、TLR8、TLR9)中表現。亦已顯示TLR10(其係人類TLR中唯一的孤受體)與TLR2在吞噬體處共定位，此表明其可與TLR2共享結合醯化脂肽之能力。然而，業內尚未報導關於此問題之結論性數據。TLR11-13並不在人類基因組中編碼。在小鼠中，TLR11-13在中樞神經系統中組成性表現且因應囊蟲症經受數倍誘導。21種TLR11經報導識別由弓蟲(Toxoplasma gondii)表現之抑制蛋白樣蛋白質且定位於內質網處。TLR13亦似乎定位於細胞內，其中其將特異性檢測水泡性口炎病毒。迄今為止，業內仍未探索到TLR12之配體特異性及細胞內定位。
因此，總之，不同類鐸受體具有不同的功能、結構及表現樣式。因此，其配體及促效劑亦具有不同的功能及作用模式。例如TLR2及TLR4之天然配體LPS(亦稱為內毒素)具有抗癌特性，此早在1960年代在甚至未懷疑TLR之存在時即已發現。
TLR9主要發現於B細胞、單核球、巨噬細胞及漿細胞樣樹突狀細 胞DC之胞內體小室中(Galluzzi等人，OncoImmunology,1：5,(2012)699-716)。TLR9之主要配體係細菌/病毒DNA，其與其哺乳動物對應部分之不同之處在於升高頻率之未甲基化CpG寡去氧核苷酸。實際上，哺乳動物DNA不具免疫刺激活性，而投與細菌/病毒DNA會誘導活體內強效的Th1免疫反應，該反應在TLR9-/-小鼠中完全消除。CpG寡去氧核苷酸(或CpG ODN)係含有胞苷三磷酸去氧核苷酸(「C」)其後為鳥苷三磷酸去氧核苷酸(「G」)之短單鏈合成DNA分子。「p」係指連續核苷酸之間之磷酸二酯連接，但一些ODN具有經修飾之硫代磷酸酯(PS)骨架。當該等CpG基序未經甲基化時，其起免疫刺激劑作用(Weiner,GJ等人，PNAS 94(1997)10833-7)。
CpG基序因其在微生物基因組中豐富但其在脊椎動物基因組中稀少而視為病原體相關分子樣式(PAMP)(Bauer,S；Current Topics in Microbiology and Immunology 270(2002)145-54)。CpG PAMP係由樣式識別受體(PRR)類鐸受體9(TLR9)識別，該受體僅在人類及其他高等靈長類動物之B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中組成性表現(Rothenfusser,S等人，Human immunology 63(2002)1111-9)。
合成CpG ODN與微生物DNA之不同之處在於，其具有部分或完全硫代磷酸酯化(PS)之骨架而非典型的磷酸二酯骨架及3'末端、5'末端或二者之聚G尾。PS修飾保護ODN免於被體內之核酸酶(例如DNA酶)降解，且聚G尾增強細胞攝取(Dalpke,AH等人，Immunology 106(2002)102-12)。聚G尾形成產生高分子量聚集物之分子內四分體。該等聚集物負責聚G序列賦予之活性增加而非該序列本身。
已對該等作為佐劑之含有未甲基化CpG基序之合成寡去氧核苷酸(CpG ODN，例如ODN 1826)進行了廣泛研究(Steinhagen F.等人，2011；Vaccine 29(17)：3341-55)。該等CpG基序係以為哺乳動物DNA中20倍之頻率存在於細菌DNA中(Hemmi H.等人，2000.Nature 408： 740-5)。CpG ODN對在人類B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)上表現之TLR9起促效作用，由此誘導Th1主導之免疫反應(Coffman等人，2010.Immunity 33(4)：492-503)。在齧齒類動物及非人類靈長類動物中實施之臨床前研究以及人類臨床試驗已展示，CpG ODN可顯著改良疫苗特異性抗體反應(Steinhagen F.等人，2011；Vaccine 29(17)：3341-55)。
已顯示多種序列可刺激TLR9，其中CpG二聚體之數目及位置以及側接CpG二聚體之精確鹼基序列存在差異。此使得產生多個類別或種類之CpG ODN，其皆係基於CpG ODN之序列、二級結構及對人類外周血單核細胞(PBMC)之效應的TLR9促效劑。CpG ODN之三個主要類別係A類、B類及C類，該等類別之不同之處在於其免疫刺激活性(Krug A.等人，2001,Eur J Immunol,31(7)：2154-63)。此外，CpG ODN係以物種特異性方式活化TLR9(Bauer,S.等人，2001,PNAS,98(16)：9237-42)。第一A類ODN中之一者ODN 2216由Krug等人闡述於2001年(參見上文)。此類ODN與先前所闡述之B類ODN(即ODN 2006)之不同之處在於，其刺激大量I型干擾素(最重要者為IFNα)之產生且誘導pDC之成熟。
A類ODN亦係藉助間接細胞介素信號傳導之NK細胞之強活化劑。A類ODN通常含有在一或兩個末端之7至10個抵抗核酸酶降解且增加ODN壽命之PS經修飾之鹼基。上述規則嚴格地定義了該類別，但序列可在該等「規則」內變化。亦應注意序列之變化影響反應之數量級。例如，內部迴文序列之長度可為4至8個鹼基對且鹼基之順序可變，然而發現樣式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'在與若干其他序列相比時活性最強。在DNA鏈任一末端發現之聚G尾之長度及甚至數目可變，但其存在對分子之活性至關重要。
B類ODN(即ODN 2007)係人類B細胞及單核球成熟之強刺激劑。 其亦刺激pDC之成熟但比A類ODN及極少量IFNα之程度小。此類中之最強ODN具有三個6聚體序列。已對作為治療劑之B類ODN進行了廣泛研究，此乃因其具有誘導強體液免疫反應之能力，此使其作為理想的疫苗佐劑。
ODN 1826係特異性針對小鼠TLR9之B型CpG ODN。B型CpG ODN含有具有一或多個CpG二核苷酸之全硫代磷酸酯骨架且可強烈活化B細胞(Krug A.等人，2001,Eur J Immunol,31(7)：2154-63)。已在多個動物模型中對作為佐劑之ODN 1826(小鼠反應性替代物TLR9促效劑)進行了測試(Bauer,S.等人，2001,PNAS,98(16)：9237-42)。小鼠中之研究展示投與ODN 1826可誘導抗原呈遞細胞之活化及I型IFN抗病毒活性，此指示Th1免疫反應(Longhi Mp.等人，2009,J Exp Med 206：1589-602)。
此外，向具有腫瘤之齧齒類動物投與B型CpG寡核苷酸(單獨或與化學治療劑或肽疫苗組合)經報導發揮強效抗癌效應。測試用於致癌適應症之CpG-7909之安全性及功效的初始I/II期臨床試驗開始於2000年4月。大約在同一時段，開始對作為用於癌症不相關適應症之佐劑(主要為抗病毒疫苗)的CpG-7909進行廣泛研究，此顯示無嚴重的副作用及令人鼓舞之功效。
在過去的十年間，已在大量I/II期臨床試驗中對CpG-7909(作為單獨藥劑或與化學療法及/或疫苗接種方式之組合)之安全性及抗癌潛能進行了研究，該等試驗包含對白血病、淋巴瘤、基底細胞癌、黑素瘤、食道鱗狀細胞癌、NSCLC、腎細胞癌及前列腺癌患者之研究。若干TLR9促效劑為業內已知，且目前在臨床測試中研發：阿托莫德(Agatolimod，含有3個CpG基序之合成24聚體寡核苷酸之二十三鈉鹽；Pfizer)、GNKG168(CpG ODN；SBI Biotech)、IMO-2055(含有未甲基化CpG二核苷酸之合成寡核苷酸；Idera Pharmaceuticals)、 MGN-1703(Mologen)。通常，該等TLR9促效劑係用於治療不同癌症：Schroder K等人(J Leukoc Biol.81(6)(2007)1577-90)係關於TLR促效劑(含有未甲基化CpG之DNA(CpG DNA))對小鼠TlR9表現之調控且定義IFN-γ放大小鼠巨噬細胞對CpG DNA之反應之分子機制。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(包含結合至結構域D1-D3之抗體及結合至結構域D4-D5之抗體，較佳如本文所闡述結合至結構域D4-D5之抗體)與類鐸受體9(TLR9)促效劑之組合療法，其用於治療癌症。
一實施例係結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)，其用於
a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞之細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球至巨噬細胞之細胞分化，其中抗CSF-1R抗體係與TLR9促效劑組合投與。
在一實施例中，TLR9促效劑之特徵在於誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12(提高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)。在一實施例中，TLR9促效劑之特徵在於提高人類漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中IFN-α之含量(如藉由夾心ELISA所量測)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有以下基序之寡去氧核苷酸：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序(CpG ODN)，b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基序(YpG ODN)，或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基序(CpR ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸(CpG ODN)。
結合至人類CSF-1R之結構域D1-D3之CSF-1R抗體闡述於例如WO 2009/026303及WO 2009/112245中，該等專利係關於某些結合至CSF-1R之細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之前三個子結構域(D1至D3)內的抗CSF-1R抗體。WO2011/123381(A1)係關於抗CSF-1R抗體，且Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793(通常，該等抗體之特徵在於抑制CSF-1R配體依賴性而非非CSF-1R配體依賴性CSF-1R增殖及/或信號傳導)。
結合至人類CSF-1R之結構域D4-D5之CSF-1R抗體在本發明內闡述於例如WO2011/070024、PCT/EP2012/075241及Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793中(通常，該等抗體之特徵在於抑制CSF-1R配體依賴性及非CSF-1R配體依賴性CSF-1R增殖及/或信號傳導)。
在一實施例中係結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)。
在本發明之一實施例中，抗CSF-1R抗體之特徵在於，該抗體以1：50或更低之比率結合至人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)與人類CSF-1R細胞外結構域(SEQ ID NO：64)。
在本發明之一實施例中，抗體之特徵在於該抗體並不結合至人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)。
在本發明之一實施例中，抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：7，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：8，b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16；c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84；或其人類化形式。
在本發明之一實施例中，抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：7，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：8，b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16；或其人類化形式。
在本發明之一實施例中，抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48，或e)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：55，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：56。
在本發明之一實施例中，抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO： 50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；或h)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或i)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
本發明之一實施例係結合至人類CSF-1R之抗體，其用於治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加，且其中抗CSF-1R抗體係與TLR9促效劑組合投與。
在本發明之一實施例中，抗體為人類IgG1子類或人類IgG4子類抗體。
本發明進一步包括本發明CSF-1R抗體之用途，其與TLR9促效劑組合用於製造用來治療CSF-1R介導之疾病的藥劑。
本發明進一步包括本發明CSF-1R抗體之用途，其與TLR9促效劑組合用於製造用來治療癌症之藥劑。
本發明進一步包括本發明CSF-1R抗體之用途，其與TLR9促效劑組合用於製造用來治療骨損失之藥劑。
本發明進一步包括本發明CSF-1R抗體之用途，其與TLR9促效劑組合用於製造用來治療轉移之藥劑。
本發明進一步包括本發明CSF-1R抗體之用途，其與TLR9促效劑 組合用於製造用來治療發炎性疾病之藥劑。
本發明進一步包括本發明之CSF-1R抗體，其與TLR9促效劑組合用於治療CSF-1R介導之疾病。
本發明進一步包括本發明之CSF-1R抗體，其與TLR9促效劑組合用於治療癌症。
本發明進一步包括本發明之CSF-1R抗體，其與TLR9促效劑組合用於治療骨損失。
本發明進一步包括本發明之CSF-1R抗體，其與TLR9促效劑組合用於治療轉移。
本發明進一步包括本發明之CSF-1R抗體，其與TLR9促效劑組合用於治療發炎性疾病。
本文所闡述抗體之組合療法顯示對需要CSF-1R靶向療法之患者之益處。
本發明抗體顯示針對非配體依賴性及配體依賴性增殖之有效抗增殖活性，且因此尤其可與TLR9促效劑組合用於治療癌症及轉移。
本發明進一步提供治療患有癌症之患者之方法，其包括向經診斷患有該疾病(且因此需要該療法)之患者投與有效量之本發明CSF-1R抗體與TLR-9促效劑之組合。
已令人驚奇地發現，與抗CSF-1R抗體單療法或TLR9促效劑單療法相比，將TLR9促效劑添加至抗CSF-1R抗體療法中使中值進展時間獲得統計學上顯著之大於加和之改良(參見實例13及圖1)。
圖1 <CSF1R>抗體與TLR9促效劑之組合在MC38小鼠CRC活體內模型中之活體內功效-中值進展時間。與抗CSF-1R抗體單療法或TLR9促效劑單療法相比，將TLR9促效劑添加至抗CSF-1R抗體療法中使中值進展時間(46天)獲得統計學上顯著之大於加和之改良。
圖2a-2b 在濃度為10μg/ml之不同抗CSF-1R單株抗體治療下對3D培養之BeWo腫瘤細胞之生長抑制。
X軸：對應於細胞之ATP含量之活力正規化平均相對光單位(RLU)(CellTiterGlo分析)。
Y軸：所測試探針：基本培養基(0.5% FBS)、小鼠IgG1(mIgG1，10μg/ml)、小鼠IgG2a(mIgG2a 10μg/ml)、僅CSF-1、Mab 2F11、Mab 2E10、Mab2H7、Mab1G10及SC 2-4A5。
利用本發明之抗CSF-1R抗體觀察到對CSF-1誘導之生長的最高抑制。
圖3a 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R片段delD4(包括細胞外子結構域D1-D3及D5)(SEQ ID NO：65)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：儘管抗體Mab 3291及sc 2-4A5明確顯示結合至此delD4片段，但本發明抗體(例如Mab 2F11及Mab 2E10)並不與CSF-1R片段delD4結合。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5亦不與CSF-1R片段delD4結合。
圖3b 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括細胞外子結構域D1-D5)(SEQ ID NO：64)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：所有抗CSF-1R抗體皆顯示結合至CSF-1R-ECD。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5並不與CSF-1R-ECD結合。
圖3c 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R片段delD4(包括細胞外子結構域D1-D3及D5)(SEQ ID NO：65)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：Mab 1G10、Mab 2H7及人類化hMab 2F11-e7並不與CSF-1R片段delD4結合。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5亦不與CSF-1R片段 delD4結合。
圖3d 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括細胞外子結構域D1-D5)(SEQ ID NO：64)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：所有抗CSF-1R抗體Mab 1G10、Mab 2H7及人類化hMab 2F11-e7皆顯示結合至CSF-1R-ECD。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5並不與CSF-1R-ECD結合。
圖3e 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R片段delD4(包括細胞外子結構域D1-D3及D5)(SEQ ID NO：65)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：所有抗CSF-1R抗體1.2.SM、CXIIG6、ab10676及MAB3291皆顯示結合至CSF-1R片段delD4。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5亦不與CSF-1R片段delD4結合。
圖3f 不同抗CSF-1R抗體與固定化人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括細胞外子結構域D1-D5)(SEQ ID NO：64)之結合之Biacore感應圖(y軸：結合信號，以反應單位(RU)表示；基線=0RU；x軸：時間(秒，s))：所有抗CSF-1R抗體1.2.SM、CXIIG6、ab10676及MAB3291皆顯示結合至CSF-1R-ECD。對照抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5並不與CSF-1R-ECD結合。
圖4a-4d 施加不同劑量之本發明抗CSF-1R抗體後食蟹猴(Cynomolgous monkey)中之CSF-1含量。
圖5a-5b 5a：藉由與GM-CSF或CSF-1(100ng/ml配體)共培養將人類單核球分化成巨噬細胞。在分化6天後添加RO7155。在CTG活力分析(CellTiterGlo® Promega)中在抗體治療第7天時量測細胞活力。細胞活力%之計算：用來自經治療細胞之RLU信號除以來自未經治療之不含抗體之對照的RLU信號(n=4)
5b：利用GM-CSF(M1)或M-CSF(M2)經7天分化成巨噬細胞之人類單核球。藉由間接螢光分析分析表型-用經標記之抗CD163-PE、抗CD80-PE或抗HLA-DR/DQ/DP-Zenon-Alexa647染色。每一直方圖中之數值對應於平均比率螢光強度(MRFI)；所計算之經所選抗體染色之細胞(空直方圖)與相應同種型對照(陰性對照；灰色填充直方圖)之平均螢光強度(MFI)之間的比率(平均值±SD；n5)。
許多腫瘤之特徵在於顯著免疫細胞浸潤，包含巨噬細胞。首先，認為免疫細胞係抵抗腫瘤之防禦機制之一部分，但最新數據支持以下觀點：包含巨噬細胞之若干免疫細胞群事實上可促進腫瘤進展。巨噬細胞之特徵在於其可塑性。端視細胞介素微環境，巨噬細胞可展現所謂的M1或M2亞型。M2巨噬細胞參與腫瘤免疫性之阻抑。其亦在由腫瘤指派以支持生長之組織修復功能(例如血管生成及組織重塑)方面起重要作用。與促進M2巨噬細胞之腫瘤不同，M1巨噬細胞經由分泌發炎細胞介素及其參與抗原呈遞及吞噬作用展現抗腫瘤活性(Mantovani,A.等人，Curr.Opin.Immunol.2(2010)231-237)。
藉由分泌多種細胞介素(例如群落刺激因子1(CSF-1)及IL-10)，腫瘤細胞能夠募集巨噬細胞且使其形成M2亞型，而諸如顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、IFN-γ等細胞介素使巨噬細胞程式化為M1亞型。使用免疫組織化學，可區分共表現CD68與CD163之巨噬細胞亞群(其可能富含M2巨噬細胞)與顯示CD68+/MHC II+或CD68+/CD80+免疫表型之亞組(可能包含M1巨噬細胞)。CD68及CD163陽性巨噬細胞之細胞形狀、大小及空間分佈與關於M2巨噬細胞之腫瘤促進作用之所公開假設一致，該促進作用係例如藉由其在腫瘤交叉間質及重要腫瘤區域中優先定位來達成。相比之下，CD68+/MHC II+類巨噬細胞普遍存在。其在吞噬作用中之假設作用係 由CD68+/MHC II+類簇而非在凋亡細胞及壞死腫瘤區域附近之CD163免疫表型來反映。
不同巨噬細胞亞群之亞型及標記物表現與其功能狀態相關。M2巨噬細胞可藉由以下各項來支持腫瘤生成：a)經由分泌血管生成因子(例如VEGF或bFGF)來增強血管生成，b)經由分泌將腫瘤細胞引導至血流並設置轉移生境之基質金屬蛋白酶(MMP)、生長因子及遷移因子來支持轉移形成(Wyckoff,J.等人，Cancer Res.67(2007)2649-2656)，c)藉由分泌進而調控T調控細胞功能之免疫阻抑性細胞介素(例如IL-4、Il-13、IL-1ra及IL-10)在構建免疫阻抑性環境方面起作用。相反，已顯示在臨床前模型中CD4陽性T細胞可增強腫瘤促進巨噬細胞之活性(Mantovani,A.等人，Eur.J.Cancer 40(2004)1660-1667；DeNardo,D.等人，Cancer Cell 16(2009)91-102)。
因此，在若干類型之癌症(例如乳癌、卵巢癌、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma))中，M2亞型腫瘤相關巨噬細胞(TAM)之發病率與較差預後相關(Bingle,L.等人，J.Pathol.3(2002)254-265；Orre,M.及Rogers,P.A.,Gynecol.Oncol.1(1999)47-50；Steidl,C.等人，N.Engl.J.Med.10(2010)875-885)。最新數據顯示CD163陽性巨噬細胞浸潤在腫瘤及腫瘤等級方面之關聯(Kawamura,K.等人，Pathol.Int.59(2009)300-305)。自患者腫瘤分離之TAM具有耐受表型且對腫瘤細胞無細胞毒性(Mantovani,A.等人，Eur.J.Cancer 40(2004)1660-1667)。然而，TAM在細胞毒性T細胞存在下之浸潤與非小細胞肺癌之經改良存活率相關聯，且因此反映此腫瘤類型中更顯著的M1巨噬細胞浸潤(Kawai,O.等人，Cancer 6(2008)1387-1395)。
最近顯示，所謂的免疫特徵(包括較高巨噬細胞及CD4陽性T細胞 數但較低細胞毒性CD8陽性T細胞數)與乳癌患者之總體存活率(OS)下降相關聯，且代表獨立的預後因子(DeNardo,D.等人，Cancer Discovery 1(2011)54-67)。
與CSF-1在驅動M2巨噬細胞之促腫瘤生成功能方面之作用一致，在罕見肉瘤或局部攻擊性結締組織腫瘤(例如色素絨毛結節性滑膜炎(PVNS)及腱鞘巨細胞瘤(TGCT))中部分歸因於CSF-1基因移位之CSF-1之高表現使得表現CSF-1受體(群落刺激因子1受體(CSF-1R))之單核球及巨噬細胞累積，從而形成大部分腫瘤團塊(West,R.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 3(2006)690-695)。隨後使用該等腫瘤藉由基因表現剖析來定義CSF-1依賴性巨噬細胞特徵。在乳癌及平滑肌肉瘤患者腫瘤中，此CSF-1反應基因特徵預示較差預後(Espinosa,I.等人，Am.J.Pathol.6(2009)2347-2356；Beck,A.等人，Clin.Cancer Res.3(2009)778-787)。
CSF-1R屬於受體酪胺酸激酶之第III類子家族且係由c-fms原致癌基因編碼。結合CSF-1或IL-34會誘導受體二聚化，隨後自動磷酸化並活化下游信號傳導級聯。CSF-1R之活化調控單核球及巨噬細胞之存活、增殖及分化(Xiong,Y.等人，J.Biol.Chem.286(2011)952-960)。
除與巨噬細胞源自相同造血前體之單核球譜系細胞及破骨細胞外，亦已發現CSF-1R/c-fms係由若干人類上皮癌(例如卵巢癌及乳癌)並在平滑肌肉瘤及TGCT/PVNS中表現，但與巨噬細胞相比表現量較低。如利用TGCT/PVNS，CSF-1(CSF-1R之配體)在卵巢癌患者之血清以及腹水中之含量升高與較差預後相關聯(Scholl,S.等人，Br.J.Cancer 62(1994)342-346；Price,F.等人，Am.J.Obstet.Gynecol.168(1993)520-527)。此外，CSF 1R之組成型活性突變體形式能夠轉化NIH3T3細胞，此係致癌基因之特性之一(Chambers,S.,Future Oncol 5(2009)1429-1440)。
臨床前模型證實CSF-1R作為腫瘤學靶。阻斷CSF-1以及CSF-1R活性可減少TAM之募集。化學療法可提高腫瘤細胞中之CSF-1表現，從而增強TAM募集。與太平洋紫杉醇(paclitaxel)組合阻斷CSF-1R可活化CD8陽性細胞毒性T細胞，從而減少自發轉基因乳癌模型中之腫瘤生長及轉移負荷(DeNardo,D.等人，Cancer Discovery 1(2011)54-67)。
在一實施例中，本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於該抗體結合至人類CSF-1R細胞外結構域(SEQ ID NO：64))與TLR9促效劑之組合的組合療法，其用於治療癌症。
在一實施例中，本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於該抗體結合至人類CSF-1R細胞外結構域(SEQ ID NO：64)(包括結構域D1至D5)且不與人類CSF-1R細胞外結構域之結構域D1至D3(SEQ ID NO：66)結合)與TLR9促效劑之組合的組合療法，其用於治療癌症。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：7，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：8，b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16；c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84；或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之 特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48，或e)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：55，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：56。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之 特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16，或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84；或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之 特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO： 50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42 之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；或h)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或i)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之 特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之 CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之 特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於，該抗體以1：50或更低之比率結合至人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)及人類CSF-1R-ECD(SEQ ID NO：64)，該抗體之特徵進一步在於不與人類CSF-1R片段D1-D3(SEQ ID NO：66)結合。
術語「抗體」涵蓋多種形式之抗體，包含(但不限於)完整抗體、抗體片段、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、T細胞表位缺失抗體及其他經遺傳改造之抗體，只要保留本發明之特有特性即可。「抗體片段」包括全長抗體之一部分，較佳其可變結構域，或至少其抗原結合位點。抗體片段之實例包含自抗體片段形成之雙價抗體、單鏈抗體分子及多特異性抗體。scFv抗體闡述於例如Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-88)中。此外，抗體片段包括單鏈多肽，其具有VH結構域結合至CSF-1R之特徵，即能夠與VL結構域一起裝配成功能性抗原結合位點；或具有VL結構域結合至CSF-1R之特徵，即能夠與VH結構域一起裝配成功能性抗原結合位點，且藉此提供該特性。
如本文所使用之術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指 具有單一胺基酸組成之抗體分子之製劑。
術語「嵌合抗體」係指包括來自小鼠之可變區(即，結合區)與源自一種不同來源或物種之恆定區的至少一部分之單株抗體，其通常係藉由重組DNA技術來製備。包括小鼠可變區及人類恆定區之嵌合抗體尤佳。該等大鼠/人類嵌合抗體係所表現免疫球蛋白基因之產物，該等基因包括編碼大鼠免疫球蛋白可變區之DNA區段及編碼人類免疫球蛋白恆定區之DNA區段。本發明所涵蓋之其他形式之「嵌合抗體」係彼等類別或子類相對於原始抗體經修飾或改變者。該等「嵌合」抗體亦稱為「類別轉換抗體」。產生嵌合抗體之方法涉及現為業內所熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如，參見Morrison,S.L.等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；US 5,202,238及US 5,204,244。
術語「人類化抗體」係指框架區或「互補決定區」(CDR)已經修飾包括與親代免疫球蛋白CDR相比特異性不同之免疫球蛋白CDR的抗體。在較佳實施例中，將鼠類CDR移植至人類抗體之框架區中來製備「人類化抗體」。例如，參見Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327；及Neuberger,M.S.等人，Nature 314(1985)268-270。框架區可視情況經其他突變修飾。CDR亦可經一或多個突變修飾以藉由基於分子建模之誘變產生本發明抗體，如Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327及Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033或其他中所闡述。尤佳CDR對應於代表識別上述用於嵌合抗體之抗原之序列的彼等。「本發明抗體之人類化形式」(其為例如小鼠源)係指基於小鼠抗體序列之抗體，其中VH及VL係藉由標準技術(包含CDR移植及視情況框架區及CDR中某些胺基酸之隨後誘變)人類化。較佳地，該人類化形式嵌合有人類恆定區(例如，參見序列SEQ ID NO：57-61)。
本發明所涵蓋之其他形式之「人類化抗體」係以下之彼等：其中恆定區相對於原始抗體之恆定區已經額外修飾或改變，以產生本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之特性。
在以下實例中，術語「Mab」或「muMab」係指鼠類單株抗體(例如Mab 2F11或Mab 2E10)，而術語「hMab」係指該等鼠類抗體之人類化單株形式(例如hMab 2F11-c11、hMab 2F11-d8、hMab 2F11-e7、hMab 2F11-f12等)。
如本文所使用之術語「人類抗體」意欲包含具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體為當前業內所熟知(van Dijk,M.A.及van de Winkel,J.G.,Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人類抗體亦可在能夠在免疫後在不產生內源免疫球蛋白下產生人類抗體之全譜或選擇的轉基因動物(例如小鼠)中產生。人類種系免疫球蛋白基因陣列在該等種系突變體小鼠中之轉移將在抗原激發後產生人類抗體(例如，參見Jakobovits,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555；Jakobovits,A.等人，Nature 362(1993)255-258；Brueggemann,M.等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文庫中產生(Hoogenboom,H.R.及Winter,G.J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。亦可使用Cole等人及Boerner等人之技術來製備人類單株抗體(Cole,S.P.C.等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；及Boerner,P.等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。如已針對本發明之嵌合及人類化抗體所提及，如本文所使用之術語「人類抗體」亦包括以下該等抗體：恆定區例如藉由「類別轉換」(即改變或突變Fc部分(例如自IgG1突變成IgG4及/或IgG1/IgG4突變))來修飾以產生本發明之尤其關於C1q結合及/或FcR結合之特性。
如本文所使用之術語「重組人類抗體」意欲包含藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如自諸如NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)分離之抗體或使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈重排形式之可變區及恆定區。本發明之重組人類抗體已經歷活體內體細胞超突變。因此，儘管重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列係源自人類種系VH及VL序列且與其相關之序列，但其可能並不天然存在於人類種系活體內抗體譜內。
本發明抗體另外包含具有「保守序列修飾」、不影響或改變本發明抗體之上文所提及特徵之核苷酸及胺基酸序列修飾之該等抗體。可藉由業內已知之標準技術來引入修飾，例如定點誘變及PCR介導之誘變。保守胺基酸取代包含其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包含具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分枝側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，人類抗CSF-1R抗體中之所預測非必需胺基酸殘基較佳可經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代。
可藉由基於分子建模之誘變來實施胺基酸取代，如由Riechmann,L.等人，Nature 332(1988)323-327及Queen,C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033所闡述。
人類CSF-1R(CSF-1受體；同義詞：M-CSF受體；巨噬細胞群落 刺激因子1受體、Fms原致癌基因、c-fms、SEQ ID NO：22))自1986年以來即為業內已知(Coussens,L.等人，Nature 320(1986)277-280)。CSF-1R係一種生長因子且由c-fms原致癌基因來編碼(例如，綜述於Roth,P.及Stanley,E.R.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.181(1992)141-167中)。
CSF-1R係CSF-1R配體CSF-1(巨噬細胞群落刺激因子，亦稱為M-CSF)(SEQ ID No.：86)及IL-34(SEQ ID No.：87)之受體，且調介該等細胞介素之生物效應(Sherr,C.J.等人，Cell 41(1985)665-676；Lin,H.等人，Science 320(2008)807-811)。群落刺激因子-1受體(亦稱為c-fms)之選殖首次闡述於Roussel,M.F.等人，Nature 325(1987)549-552中。在該公開案中，顯示CSF-1R具有依賴於結合Cbl且由此調控受體下調之該蛋白質C端尾之變化(包含損失抑制性酪胺酸969磷酸化)的轉化潛能(Lee,P.S.等人，Embo J.18(1999)3616-3628)。
CSF-1R係單鏈跨膜受體酪胺酸激酶(RTK)及含有RTK之免疫球蛋白(Ig)基序家族之成員，其特徵在於受體之細胞外結構域(ECD)中之5個重複Ig樣子結構域D1-D5(Wang,Z.等人Molecular and Cellular Biology 13(1993)5348-5359)。人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(SEQ ID NO：64)包括所有5個細胞外Ig樣子結構域D1-D5。人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)包括細胞外Ig樣子結構域D1-D3及D5，但丟失D4子結構域。人類CSF-1R片段D1-D3(SEQ ID NO：66)包括各別子結構域D1-D3。該等序列經列示不含信號肽MGSGPGVLLL LLVATAWHGQ G(SEQ ID NO：67)。人類CSF-1R片段D4-D3(SEQ ID NO：85)包括各別子結構域D4-D3。
目前已知兩種結合至CSF-1R之細胞外結構域之CSF-1R配體。第一種係CSF-1(群落刺激因子1，亦稱為M-CSF、巨噬細胞；人類CSF-1，SEQ ID NO：86)且發現在細胞外呈二硫鍵連接之同源二聚體形式 (Stanley,E.R.等人，Journal of Cellular Biochemistry 21(1983)151-159；Stanley,E.R.等人，Stem Cells 12增刊1(1995)15-24)。第二種係IL-34(人類IL-34；SEQ ID NO：87)(Hume,D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。因此，在一實施例中，術語「CSF-1R配體」係指人類CSF-1(SEQ ID NO：86)及/或人類IL-34(SEQ ID NO：87)。
對於實驗，通常使用人類CSF-1之149胺基酸(aa)活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181)。人類CSF-1之此149 aa活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181)含於所有3種主要形式之CSF-1中且足以調介與CSF-1R之結合(Hume,D.A.等人，Blood 119(2012)1810-1820)。
CSF-1R信號傳導之主要生物效應係造血前體細胞至巨噬細胞譜系(包含破骨細胞)之分化、增殖、遷移及存活。CSF-1R之活化係由其CSF-1R配體CSF-1(M-CSF)及IL-34來調介。CSF-1(M-CSF)與CSF-1R之結合誘導形成同源二聚體且藉由酪胺酸磷酸化來活化激酶(Li,W.等人，EMBO Journal.10(1991)277-288；Stanley,E.R.等人，Mol.Reprod.Dev.46(1997)4-10)。
細胞內蛋白質酪胺酸激酶結構域雜有亦存在於其他相關RTK第III類家族成員中之獨特的插入結構域，該等成員包含血小板源性生長因子受體(PDGFR)、幹細胞生長因子受體(c-Kit)及fms樣細胞介素受體(FLT3)。儘管此生長因子受體家族中存在結構同源性，但其具有不同的組織特異性功能。
CSF-1R主要係在單核球譜系之細胞上以及雌性生殖道及胎盤中表現。此外，CSF-1R之表現已報導於皮膚中之蘭格漢細胞(Langerhans cell，平滑肌細胞之亞組)(Inaba,T.等人，J.Biol.Chem.267(1992)5693-5699)、B細胞(Baker,A.H.等人，Oncogene 8(1993)371-378)及微膠質細胞(Sawada,M.等人，Brain Res.509(1990)119-124)中。已知含有突變體人類CSF-1R((SEQ ID NO：23)之細胞獨立於 配體刺激增殖。
如本文所使用，「結合至人類CSF-1R」或「特異性結合至人類CSF-1R」或「其結合至人類CSF-1R」或「抗CSF-1R抗體」係指特異性結合至人類CSF-1R抗原之抗體，且具有在35℃下KD值為1.0×10-8mol/l或更低、在一實施例中在35℃下KD值為1.0×10-9mol/l或更低之結合親和力。結合親和力係在35℃下藉由標準結合分析(例如表面電漿子共振技術(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden))來測定。用於測定結合親和力之KD值之方法闡述於實例4中。因此，如本文所使用之「結合至人類CSF-1R之抗體」係指特異性結合至人類CSF-1R抗原之抗體，且具有在35℃下KD 1.0×10-8mol/l或更低(較佳1.0×10-8mol/l-1.0×10-12mol/l)、較佳在35℃下KD 1.0×10-9mol/l或更低(較佳1.0×10-9mol/l-1.0×10-12mol/l)之結合親和力。
如本文所使用之「與人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)及人類CSF-1R細胞外結構域(SEQ ID NO：64)之結合」係藉由如實例4中所闡述之表面電漿子共振分析(Biacore分析)來量測。將人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)或人類CSF-1R細胞外結構域(SEQ ID NO：64)分別捕獲至表面(各自捕獲至單獨表面)，且添加測試抗體(各自在單獨量測中)，並測定各別結合信號(反應單位(RU))。減去參考信號(空白表面)。若非結合測試抗體之信號稍低於0，則將該等值設定為0。然後測定各別結合信號之比率(人類CSF-1R片段delD4之結合信號(RU)/人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之結合信號(RU))。本發明抗體之結合信號之比率(RU(delD4)/RU(CSF-1R-ECD)為1：50或更低，較佳1：100或更低(更低者包含末端為0者(例如若RU為0，則比率為0：50或0：100))。
此意味著本發明之該等抗CSF-1R抗體並不與人類CSF-1R片段delD4(如抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5(於2004年8月18日以DSM ACC 2683保藏於DSMZ)結合，且具有結合至人類CSF-1R片段delD4之在抗CCR5抗體m<CCR5>Pz03.1C5範圍內之結合信號，在如實例4中所顯示之表面電漿子共振(BIAcore)分析中該等信號低於20RU(反應單位)，較佳低於10RU。
術語「結合至人類CSF-1R片段D1-D3」係指藉助表面電漿子共振分析(Biacore分析)之結合親和力測定。將測試抗體捕獲至表面，且添加人類CSF-1R片段D1-D3(SEQ ID NO：66)，並測定各別結合親和力。術語「不與人類CSF-1R片段D1-D3結合」或「其並不與人類CSF-1R片段D1-D3結合」表示在該分析中，所檢測信號處於不大於背景信號之1.2倍的區域中，且因此可檢測到無顯著結合且可測定無結合親和力(參見實例10)。
如本文所使用之術語「配體依賴性」係指經由細胞外ECD之非配體依賴性信號傳導(且不包含藉由活化細胞內激酶結構域中之點突變調介之非配體依賴性信號傳導)。
在一實施例中，此背景下之CSF-1R配體係指選自人類CSF-1(SEQ ID No：86)及人類IL-34(SEQ ID No：87)之CSF-1R配體；在一實施例中，CSF-1R配體係人類CSF-1(SEQ ID No：86)；在一實施例中，CSF-1R配體係人類IL-34(SEQ ID No：87)。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體，其用於治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加(在一個實施例中，CSF-1R配體係選自人類CSF-1(SEQ ID No：86)及人類IL-34(SEQ ID No：87)；在一個實施例中，CSF-1R配體係人類CSF-1(SEQ ID No：86)；在一個實施例中，CSF-1R配體係人類IL-34(SEQ ID No：87))(可在血清、尿或腫瘤生檢中檢測到)，其中抗CSF-1R抗體係與TLR9促效劑組合投與。(在一個實施例中，CSF-1R抗體之特徵在於結合至人類CSF- 1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)。
術語「CSF-1R配體增加」係指在治療前人類CSF-1R配體之過度表現(在一個實施例中，CSF-1R配體係選自人類CSF-1(SEQ ID No：86)及人類IL-34(SEQ ID No：87)；在一個實施例中，CSF-1R配體係人類CSF-1(SEQ ID No：86)；在一個實施例中，CSF-1R配體係人類IL-34(SEQ ID No：87))(與正常組織相比)，或由抗CSF-1R抗體治療所誘發之人類CSF-1R配體之過度表現(且與治療前之表現量相比)。在某些實施例中，術語「增加」或「大於」係指本文所述方法檢測之CSF-1R配體含量與參考樣品之CSF-1R配體含量相比大於參考量或總體增加5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%或更大之量。在某些實施例中，術語增加係指CSF-1R配體含量增加，其中增加係與參考樣品之CSF-1R配體含量(例如預定量)相比高至少約1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍、80倍、90倍或100倍。在一個較佳實施例中，術語增加量係指等於或大於參考量之值。
在本發明之一個實施例中，抗CSF-1R抗體之特徵在於該抗體結合至人類CSF-1R之細胞外結構域(SEQ ID NO：64)(包括結構域D1至D5)且結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之結構域D1至D3(SEQ ID NO：66)。
在本發明之一個實施例中，抗CSF-1R抗體之特徵在於該抗體結合至人類CSF-1R之細胞外結構域(SEQ ID NO：64)(包括結構域D1至D5)且不結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之結構域D1至D3(SEQ ID NO：66)。
術語「類鐸受體9」(TLR9、CD289；SEQ ID NO：88)係指在病原體識別及固有免疫性活化方面起基礎性作用之類鐸受體(TLR)家族 蛋白。TLR自果蠅屬(Drosophila)至人類皆高度保守且共享結構及功能相似性。其識別在感染物上表現之病原體相關分子樣式(PAMP)，且調介研發有效免疫性所需之細胞介素之產生。不同TLR展現不同的表現樣式。此基因在富含免疫細胞之組織中優先表現，例如脾、淋巴結、骨髓及外周血白血球。小鼠及人類中之研究指示，此受體調介對細菌DNA中未甲基化CpG二核苷酸之細胞反應以引起固有免疫反應。
TLR9主要發現於B細胞、單核球、巨噬細胞及漿細胞樣樹突狀細胞DC之胞內體小室中(Galluzzi等人，OncoImmunology,1：5,(2012)699-716)。TLR9之主要配體係細菌/病毒DNA，其與其哺乳動物對應部分之不同之處在於升高頻率之未甲基化CpG寡去氧核苷酸。實際上，哺乳動物DNA不具免疫刺激活性，而投與細菌/病毒DNA會誘導活體內強效的Th1免疫反應，該反應在TLR9-/-小鼠中完全消除。CpG寡去氧核苷酸(或CpG ODN)係含有胞苷三磷酸去氧核苷酸(「C」)其後為鳥苷三磷酸去氧核苷酸(「G」)之短單鏈合成DNA分子。「p」係指連續核苷酸之間之磷酸二酯連接，但一些ODN具有經修飾之硫代磷酸酯(PS)骨架。當該等CpG基序未經甲基化時，其起免疫刺激劑作用(Weiner,GJ等人，PNAS 94(1997)10833-7)。因此，「類鐸受體9促效劑」(TLR9促效劑)之特徵在於結合至類鐸受體9且刺激TLR9免疫反應。例如在一實施例中，類鐸受體9促效劑(TLR9促效劑)之特徵在於結合至人類漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)上之類鐸受體9且誘導該等漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12(提高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)。
CpG基序因其在微生物基因組中豐富但其在脊椎動物基因組中稀少而視為病原體相關分子樣式(PAMP)(Bauer,S；Current Topics in Microbiology and Immunology 270(2002)145-54)。CpG PAMP係由樣式識別受體(PRR)類鐸受體9(TLR9)識別，該受體僅在人類及其他高 等靈長類動物之B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中組成性表現(Rothenfusser,S等人，Human immunology 63(2002)1111-9)。
合成CpG ODN與微生物DNA之不同之處在於，其具有部分或完全硫代磷酸酯化(PS)之骨架而非典型的磷酸二酯骨架及3'末端、5'末端或二者之聚G尾。PS修飾保護ODN免於被體內之核酸酶(例如DNA酶)降解，且聚G尾增強細胞攝取(Dalpke,AH等人，Immunology 106(2002)102-12)。聚G尾形成產生高分子量聚集物之分子內四分體。該等聚集物負責聚G序列賦予之活性增加而非該序列本身。
已對該等作為佐劑之含有未甲基化CpG基序之合成寡去氧核苷酸(CpG ODN，例如ODN 1826)進行了廣泛研究(Steinhagen F.等人，2011；Vaccine 29(17)：3341-55)。該等CpG基序係以為哺乳動物DNA中20倍之頻率存在於細菌DNA中(Hemmi H.等人，2000.Nature 408：740-5)。CpG ODN對在人類B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)上表現之TLR9起促效作用，由此誘導Th1主導之免疫反應(Coffman等人，2010.Immunity 33(4)：492-503)。在齧齒類動物及非人類靈長類動物中實施之臨床前研究以及人類臨床試驗已展示，CpG ODN可顯著改良疫苗特異性抗體反應(Steinhagen F.等人，2011；Vaccine 29(17)：3341-55)。
已顯示多種序列可刺激TLR9，其中CpG二聚體之數目及位置以及側接CpG二聚體之精確鹼基序列存在差異。此使得產生多個種類或類別之CpG ODN，其皆係基於CpG ODN之序列、二級結構及對人類外周血單核細胞(PBMC)之效應的TLR9促效劑。CpG ODN之三個主要類別係A類、B類及C類，該等類別之不同之處在於其免疫刺激活性(Krug A.等人，2001,Eur J Immunol,31(7)：2154-63)。此外，CpG ODN係以物種特異性方式活化TLR9(Bauer,S.等人，2001,PNAS,98(16)：9237-42)。第一A類ODN中之一者ODN 2216由Krug等人闡述於 2001年(參見上文)。此類ODN與先前所闡述之B類ODN(即ODN 2006)之不同之處在於，其刺激大量I型干擾素(最重要者為IFNα)之產生且誘導pDC之成熟。
A類ODN亦係藉助間接細胞介素信號傳導之NK細胞之強活化劑。A類ODN通常含有在一或兩個末端之7至10個抵抗核酸酶降解且增加ODN壽命之PS經修飾之鹼基。上述規則嚴格地定義了該類別，但序列可在該等「規則」內變化。亦應注意序列之變化影響反應之數量級。例如，內部迴文序列之長度可為4至8個鹼基對且鹼基之順序可變，然而發現樣式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'在與若干其他序列相比時活性最強。在DNA鏈任一末端發現之聚G尾之長度及甚至數目可變，但其存在對分子之活性至關重要。
B類ODN(即ODN 2007)係人類B細胞及單核球成熟之強刺激劑。 其亦刺激pDC之成熟但比A類ODN及極少量IFNα之程度小。此類中之最強ODN具有三個6聚體序列。已對作為治療劑之B類ODN進行了廣泛研究，此乃因其具有誘導強體液免疫反應之能力，此使其作為理想的疫苗佐劑。
ODN 1826係特異性針對小鼠TLR9之B型CpG ODN。B型CpG ODN含有具有一或多個CpG二核苷酸之全硫代磷酸酯骨架且可強烈活化B細胞(Krug A.等人，2001,Eur J Immunol,31(7)：2154-63)。已在多個動物模型中對作為佐劑之ODN 1826(小鼠反應性替代物TLR9促效劑)進行了測試(Bauer,S.等人，2001,PNAS,98(16)：9237-42)。小鼠中之研究展示投與ODN 1826可誘導抗原呈遞細胞之活化及I型IFN抗病毒活性8-9，此指示Th1免疫反應(Longhi Mp.等人，2009,J Exp Med 206：1589-602)。
此外，向患有腫瘤之齧齒類動物投與B型CpG寡核苷酸(單獨或與化學治療劑或肽疫苗組合)經報導發揮強效抗癌效應。測試用於致癌 適應症之CpG-7909之安全性及功效的初始I/II期臨床試驗開始於2000年4月。大約在同一時段，開始對作為用於癌症不相關適應症之佐劑(主要為抗病毒疫苗)的CpG-7909進行廣泛研究，此顯示無嚴重的副作用及令人鼓舞之功效。
在過去的十年間，已在大量I/II期臨床試驗中對CpG-7909(作為單獨藥劑或與化學療法及/或疫苗接種方式之組合)之安全性及抗癌潛能進行了研究，該等試驗包含對白血病、淋巴瘤、基底細胞癌、1黑素瘤、食道鱗狀細胞癌、NSCLC、腎細胞癌及前列腺癌患者之研究。若干TLR9促效劑為業內已知，且目前在臨床測試中進行研發：阿托莫德(Agatolimod，含有3個CpG基序之合成24聚體寡核苷酸之二十三鈉鹽；Pfizer)、GNKG168(CpG ODN；SBI Biotech)、IMO-2055(含有未甲基化CpG二核苷酸之合成寡核苷酸；Idera Pharmaceuticals)、MGN-1703(Mologen)。通常，該等TLR9促效劑係用於治療不同癌症：
含有未甲基化CpG基序之細菌及合成DNA起TLR9促效劑作用，且誘導Th1型免疫反應譜。TLR9促效劑之免疫刺激效應為多因子的，且端視核苷酸序列、骨架性質及特異性結構基序之存在而定。基於所誘導之細胞介素譜，已闡述三種不同類型之TLR9促效劑：A類、B類及C類。每一類TLR9促效劑係由允許形成產生不同免疫譜之結構(或無結構)的不同核苷酸序列構成。
業內對起TLR9促效劑作用之寡核苷酸之結構-活性關係進行了系統性研究(Kandimalla,E.R.及Agrawal,S.(2005)in Toll and Toll Receptors：An Immunologic Perspective(Rich,T.編輯)，第181-212頁，Kluwer Academic/Plenum Publishers,New York)。TLR9刺激需要寡核苷酸中存在CpG基序。具有磷酸二酯及硫代磷酸酯骨架之寡核苷酸刺激TLR9介導之免疫反應。硫代磷酸酯骨架寡核苷酸因其與磷酸 二酯寡核苷酸相比較不易被普遍存在之核酸酶降解而常用。在核苷酸間磷酸二酯鍵上引入硫原子可形成Rp及Sp非鏡像異構體；硫代磷酸酯連接之Rp非鏡像異構體而非Sp非鏡像異構體刺激較強的TLR9介導之免疫反應。介於胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)之間且與其毗鄰之磷酸鹽上之負電荷亦為TLR9介導之活性所必需。藉由在該等位置處納入甲基膦酸酯連接來中和電荷可使免疫刺激活性受損。此外，TLR9活化亦端視側接CpG二核苷酸之序列、核苷酸骨架之性質及二級結構而定。
側接序列在TLR9刺激方面起重要作用
在CpG基序中之C或G核苷酸之糖環的2'-位置處引入之化學修飾使TLR9促效劑之免疫刺激活性受損。此外，在側接序列中含有化學修飾(例如甲基膦酸酯連接、2'-烷基或3'-去氧或-烷基核糖核苷、非核苷酸連接體或無鹼基核苷酸)之TLR9促效劑之研究指示，在CpG二核苷酸5'之第4至第6核苷酸位置處納入取代顯著增強免疫刺激活性。通常，納入遠離CpG二核苷酸之3'-側接序列中之修飾具有取決於修飾性質之效應。
TLR9需要促效劑之游離5'-末端來刺激
儘管可獲得兩個CpG基序，但兩個經由其5'-末端連接之CpG寡核苷酸並不活化免疫細胞。當相同寡核苷酸係經由其3'-末端連接時，其產生高於且不同於具有單一5'-末端之親代CpG寡核苷酸之細胞介素譜。該等為首次研究，其展示TLR9活化需要可及或游離5'-末端且受體自5'-末端讀取序列。轉錄因子NF-κB由含有兩個5'-末端之TLR9促效劑快速活化，但該等化合物具有與習用TLR9促效劑相同之針對J774細胞中之MAPK(促分裂原活化蛋白質激酶)途徑的活性。
該等研究表明，含有兩個5'-末端之促效劑幫助受體二聚化，從而使免疫反應快速活化。此外，TLR9活化可經由適當呈遞游離5'-末端及合成免疫刺激基序來調節，從而改變下游細胞介素誘導譜。與該 等結果一致，最新研究已顯示，TLR9係以二聚體形式存在且結合至單鏈寡核苷酸。然而，僅含有CpG基序之寡核苷酸使受體構象發生變化，從而活化免疫信號傳導途徑。
寡核苷酸經由其3'-末端之附接不僅提供兩個5'-末端用於TLR9之最佳活化，且亦增加抵抗3'-核酸外切酶之穩定性。具有磷酸二酯骨架且經由其3'-末端連接之短至5及6nt的寡核苷酸起強效TLR9促效劑作用且產生免疫反應。此外，在小鼠模型中，口服投與含有新穎結構之TLR9促效劑會誘導強效的黏膜免疫反應，起含有抗原之佐劑作用，且預防並逆轉花生過敏，此乃因其在胃腸道中具有較高穩定性。
胞嘧啶及鳥嘌呤之官能基為TLR9刺激所必需
如上文所闡述，引入CpG二核苷酸內之改變結構及構型之某些化學修飾使促效劑之免疫刺激活性受損。一種該修飾係替代TLR9促效劑之CpG基序中之胞嘧啶之5-位置處的甲基。脊椎動物利用此特徵來區分自體DNA與含有更多未甲基化CpG基序之細菌DNA。
替代胞嘧啶之多種嘧啶類似物(Y)(例如5-OH-dC、dU、dP、1-(2'-去氧-β-D-呋喃核糖基)-2-側氧基-7-去氮-8-甲基-嘌呤、N3-Me-dC及N4-Et-dC)之效應(Kandimalla,E.R.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9,807-813；Kandimalla,E.R.等人，S.(2003)PNAS.100,14303-14308；或Putta,M.R.等人，S.(2006)Nucleic Acids Res.34,3231-3238)。為理解鳥嘌呤之不同官能基在識別TLR9方面之作用，檢查若干個替代CpG中之鳥嘌呤之嘌呤核鹼基(R)(例如7-去氮-dG、N1-Me-dG、2-胺基-D-嘌呤、水鬆蕈素(nebularine)、2-胺基-dA、7-去氮-D-黃嘌呤、K-鹼基及dI)(Kandimalla,E.R.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9,807-813；Kandimalla,E.R.等人(2003)PNAS.100,14303-14308；Putta,M.R.等人，(2006)Nucleic Acids Res.34,3231-3238；Kandimalla,E.R.等人(2003)Nucleic Acids Res.31,2393-2400；或 Kandimalla,E.R.等人(2005)PNAS.102,6925-6930)。該等研究促進用於免疫調節之替代性合成核苷酸基序(YpG、CpR)之發展且已展示TLR9接受某些雜環鹼基變體。
新穎合成TLR9促效劑(S.Agrawal及E.R.Kandimalla,Biochemical Society Transactions(2007)35,(1461-1467))：新穎結構與上述合成免疫刺激基序之組合提供產生新穎合成TLR9促效劑之組合文庫的工具。在小鼠、人類及猴系統中對具有兩個5'-末端且含有不同核苷酸組成之合成CpR二核苷酸之若干TLR9促效劑的系統性研究表明，核苷酸序列及二級結構在調節免疫反應方面起作用。基於該等研究，已廣義地鑒定出兩組不同的合成TLR9促效劑。
在一實施例中，TLR9促效劑之特徵在於誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12(提高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)。在一實施例中，TLR9促效劑之特徵在於提高人類漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中IFN-α之含量(如藉由下文或例如WO2010/088395中所闡述之夾心ELISA所量測)。
藉由人類pDC中本發明之TLR9促效劑量測IFN-α誘導(提高IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量)之分析：
人類PBMC分離：藉由Ficoll密度梯度離心方法(Histopaque-1077,Sigma)分離來自剛剛抽取之健康志願者血液之外周血單核細胞(PBMC)(CBR Laboratories,Boston,MA)。
人類pDC分離：根據製造商之說明書使用BDC A4細胞分離套組(Miltenyi Biotec)藉由陽性選擇自剛剛獲得之健康人類志願者之血液PBMC分離人類漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)。
使用1×106個細胞/ml將人類pDC平鋪於96孔皿中。將來自表I之個別免疫調節化合物溶解於DPBS(pH 7.4；Mediatech)中，將其以0μg/ml、0.1μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、3.0μg/ml或10.0μg/ml之劑 量添加至細胞培養物中。然後在37℃下將細胞培育24小時，且收集上清液用於luminex多重或ELISA分析。
藉由夾心ELISA量測IFN-α、IL-6及/或IL-12之含量。所需試劑(包含細胞介素抗體及標準物)可購自PharMingen。
許多年以來，業內已知IFN-α作為抗病毒細胞介素。其刺激Th1細胞發育，因此促進含CG之DNA分子之效應。IFN-α亦展現小鼠及人類惡性腫瘤之抗腫瘤活性，且能夠部分地藉由活化細胞毒性T細胞且由此增加腫瘤細胞細胞溶解之可能性來降低所移植腫瘤細胞之致腫瘤性。亦藉由IFN-α增加NK細胞及巨噬細胞活性，二者亦對抗腫瘤細胞毒性至關重要(Brassard等人，J.Leukoc.Biol.2002 71：565-81)。因此，預期在用本發明之DNA構築物刺激後IFN-α之量增加有益於治療癌症。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有以下基序之寡去氧核苷酸：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序(CpG ODN)，b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基序(YpG ODN)，或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基序(CpR ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有以下基序之寡去氧核苷酸：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序(CpG ODN)，b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基序(YpG ODN)，或c)嘌呤-磷酸-鳥苷(RpG)基序(RpG ODN)，其中TLR9促效劑刺激TLR9(在一實施例中，TLR9促效劑誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)之成熟；在一實施例中，TLR9促效劑之特徵在於人類B細胞成熟；在一實施例中)
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸(CpG ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係A類CpG ODN。
在一實施例中，本發明之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其包括
a)處於5'末端或3'末端或兩個末端之聚G序列
b)內部迴文序列；
c)含於內部迴文內之GC二核苷酸，及
d)PS經部分修飾之骨架
A類CpG ODN通常含有在一或兩個末端之7至10個抵抗核酸酶降解且增加ODN壽命之PS經修飾之鹼基。上述規則嚴格地定義了該類別，但序列可在該等「規則」內變化。內部迴文序列之長度可為4至8個鹼基對且鹼基之順序可變，然而發現樣式5'-Pu Pu CG Pu Py CG Py Py-3'在與若干其他序列相比時活性最強。在DNA鏈任一末端發現之聚G尾之長度及數目可變。
在一實施例中，A類CpG ODN(Xueqing Liang等人，Blood.2010年6月17日；115(24)：5041-5052)係選自由以下組成之群：CpG ODN 2216(5'-ggGGGACGATCGTCgggggG-3')(SEQ ID NO：89)、CpG ODN PB4(5'-tcgGACGATCGTCgggggG-3')(SEQ ID NO：90)或CpG ODN 1002(5'-ggGGTCGTTCGTCGTTgggggG-3')(SEQ ID NO：91)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係B類CpG ODN。
在一實施例中，本發明之TLR9促效劑係寡去氧核苷酸，其包括
a)一或多個6聚體未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序5'-Pu Py C G Py Pu-3'(一或多個6聚體5'-RYCGYR-3' 6聚體(R=A或G；Y=T或C))
b)完全硫代磷酸酯化(PS經修飾)骨架；及
c)長度為18至28個核苷酸
在一實施例中，B類CPG ODN係選自由以下組成之群：CpG-28、CpG-685(GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech)、CpG-684及CpG- 7909(CPG-ODN 2006、PF-3512676、阿托莫德)。
CpG-7909(CpG 2006、PF-3512676、阿托莫德)係含有多個胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之合成24聚體硫代磷酸酯寡去氧核苷酸(d(P-硫)(T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T)DNA)(5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3')(SEQ ID NO：92)或其衍生物中之一者(如二十三鈉鹽)。製備闡述於例如WO 9818810或US 7223741中。
CpG-685(GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech)係具有免疫刺激活性之基於未甲基化CpG基序之合成21聚體寡去氧核苷酸(ODN)(685，5'-tcgtcgacgtcgttcgttctc-3')(SEQ ID NO：93)。CpG685(GNKG168)係21聚體完全硫代磷酸酯化寡核苷酸，其經設計以直接靶向調介B細胞中之細胞反應之類鐸受體9，其在SCID小鼠中顯示抗腫瘤效應，且處於SBI Biotech公司對治療人類慢性淋巴球性白血病(B-CLL)之臨床研發下。在本文中，在血漿及細胞溶解物中研發敏感及特異性分析以支持其臨床前藥理學研究。CpG寡去氧核苷酸GNKG168結合至類鐸受體9(TLR9)且使其活化並藉由胞吞作用吸收至細胞中；一旦內在化，其即可活化多種信號傳導轉導途徑，從而釋放多種細胞介素，例如免疫球蛋白(Ig)、干擾素(IFN)、介白素(IL)及腫瘤壞死因子(TNF)。
CpG-684係基於未甲基化CpG基序之合成23聚體寡去氧核苷酸(ODN)684，5'-tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3'(SEQ ID NO：94)；CpG-28係基於未甲基化CpG基序之合成寡去氧核苷酸(ODN)，其含有多個未甲基化CpG基序重複(CpG ODN)，具有免疫刺激活性(5'-TAAACGTTATAACGTTATGACGTCAT-3')(SEQ ID NO：95)，具有完全硫代磷酸酯骨架(Carpentier AF等人Front Biosci.2003；8：e115-e127；Meng Y等人，Int J Cancer.2005；116：992-997；或Carpentier A等人Neuro-Oncology 2006；8：60-66)。在經由胞吞作用進入細胞 後，CpG-28活化多種信號傳導轉導途徑，從而釋放多種細胞介素。CpG-28具有藉由直接活化B淋巴球、樹突及NK細胞刺激固有免疫性及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之免疫調節特性。此外，此藥劑經由釋放細胞介素(IL-12及IFNγ)來間接調節T細胞反應以誘導至Th1(輔助者)表型之優先移位，從而增強CD8+細胞之細胞毒性。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基序之寡去氧核苷酸(YpG ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基序之寡去氧核苷酸(CpR ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係IMO-2055(Idera)(ODN係由3'-3'-連接結構及合成CpR(R=2'-去氧-7-去氮鳥苷)基序組成)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係含有以下基序之寡去氧核苷酸：a)胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序(CpG ODN)，b)嘧啶-磷酸-鳥苷(YpG)基序(YpG ODN)，或c)胞嘧啶-磷酸-嘌呤(CpR)基序(CpR ODN)。
在本發明之一實施例中，本發明之TLR9促效劑係基於dSLIM®技術(此技術闡述於WO2001/07055中)基於含有CpG基序之環狀ODN之寡去氧核苷酸(例如如WO2012/085291中所闡述之來自Mologen之MGN-1703)。
在本發明之一實施例中，TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG ODN 2216、CpG ODN 1002、CpG-28、CpG-685、CpG-684、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。在本發明之一實施例中，TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-685、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。在一實施例中，TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。
在本發明之一實施例中，CSF-1R抗體係選自闡述於以下文獻中之抗體：WO 2009/026303、WO 2009/112245、WO2011/123381(A1)或WO2011/070024；且TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-685、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。
在本發明之一實施例中，CSF-1R抗體係選自結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或 f)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；且TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-685、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。
在本發明之一實施例中，CSF-1R抗體係選自結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40。
且TLR9促效劑係選自由以下組成之群：CpG-685、CpG-7909、IMO-2055或MGN-1703。
通常，業內已知許多適宜的TLR9促效劑。預期該等TLR9促效劑用於本發明之組合療法中。TLR9特異性識別未經甲基化之CpGDNA，且起始信號傳導級聯，從而產生促發炎細胞介素。CpG基序內胞嘧啶之甲基化顯著降低TLR9之親和力。雙鏈(ds)CpG DNA係與其單鏈(ss)對應部分相比較弱的TLR9刺激劑。
天然TLR9促效劑闡述於Smith及Wickstrom(1998)J.Natl.Cancer Inst.90：1146-1154)中，且其在癌症中之作用闡述於Damiano等人(2007)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 104：12468-12473中。
CPG 7909係在l/l I期臨床研究中發現具有良好耐受性之免疫刺激性TLR9促效劑寡去氧核苷酸(Cooper等人，(2004)J.Clin.Immunol., 24(6)：693-701)。在l/l I期臨床研究中發現富含CpG之合成寡去氧核苷酸TLR9促效劑PF-3512676具有抗淋巴瘤活性(Brody等人(2010)J.Clin.Oncol.,28(28)：4324-32)。
某些TLR9促效劑包括含有核心CpR二核苷酸之3-3'連接之DNA結構，其中R為經修飾鳥苷(US 7,276,489)。此外，特異性化學修飾已允許製備產生不同的免疫反應調節之特異性寡核苷酸類似物。具體而言，結構活性關係研究已允許鑒定基於合成基序及新穎DNA之化合物，該等化合物產生特異性免疫反應調節且該等調節不同於由未甲基化CpG二核苷酸所產生之彼等(Kandimalla等人(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：6925-6930；Kandimalla等人(2003)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：14303-14308；Cong等人(2003)Biochem Biophys Res.Commun.310：1133-1139；Kandimalla等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.306：948-953；Kandimalla等人(2003)Nucleic Acids Res.31：2393-2400；Yu,D.等人(2003)Bioorg.Med.Chem.1 1：459-464；Bhagat,L.等人(2003)Biochem.Biophys.Res.Commun.300：853-861；Yu,D.等人(2002)Nucleic Acids Res.30：4460-4469；Yu,D.等人(2002)J.Med.Chem.45：4540-4548；Yu,D.等人(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.297：83-90；Kandimalla.E.等人(2002)Bioconjug.Chem.13：966-974；Yu,D.等人(2002)Nucleic Acids Res.30：1613-1619；Yu,D.等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9：2803-2808；Yu等人(2001)Bioorg.Med.Chem.第1章：2263-2267；Kandimalla等人(2001)Bioorg.Med.Chem.9：807-813；Yu等人(2000)Bioorg.Med.Chem.Lett.10：2585-2588；及Putta等人(2006)Nucleic Acids Res.34：3231-3238)。
US 2009/0053206闡述多種TLR9促效劑、尤其表1中所列示之化合物1-169；US 2008/0292648闡述多種TLR9促效劑、尤其表1中所列 示之化合物1-92；且US 2007/0105800闡述為TLR9促效劑之基於寡核苷酸之化合物(Idera Pharmaceuticals)。適宜TLR9促效劑亦可包含經受1期/2期臨床試驗之選擇性TLR9促效劑IMO-2055、IMO-2125及IMO-2134(Idera Pharmaceuticals)。US 2010/0016250闡述多種TLR9促效劑、尤其式I化合物(Kyowa Hakko Kirin公司)。如上文所提及，US 2009/0041809闡述為TLR9促效劑或為TLR3及TLR9促效劑二者之組合物(Nventa Pharmaceuticals)。
用於本發明組合療法中之不同TLR9促效劑詳細闡述於WO2007/7047396、WO2007/7047396、WO2010088395、WO03035695、WO2012085291、WO 1998/018810、WO 2005/042018、WO2008073959、WO2009018431、WO2007084237中。
術語「表位」表示人類CSF-1R之能夠特異性結合至抗體之蛋白決定簇。表位通常係由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成，且表位通常具有特異性三維結構特徵以及特異性電荷特徵。構象性及非構象性表位之區別在於在變性溶劑存在下喪失與構象性表位之結合，但不喪失與非構象性表位之結合。較佳地，本發明抗體特異性結合至原初及變性CSF-1R。
如本文所使用之「可變區」(輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH))表示直接參與抗體與抗原結合之每一輕鏈與重鏈對。輕鏈及重鏈可變結構域具有相同的一般結構，且每一結構域包括四個框架區(FR)，其序列高度保守且其藉由三個「超變區」(或互補決定區，CDR)連結。框架區採用β-褶板構型且CDR可形成連結β-褶板結構之環。每一鏈中之CDR藉由框架區保持其三維結構並與另一鏈中之CDR一起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈之CDR3區在本發明抗體之特異性結合/親和力方面起尤其重要之作用，且由此提供本發明之另一目標。
術語「抗體之抗原結合部分」在用於本文中時係指抗體之負責 結合抗原之胺基酸殘基。抗體之抗原結合部分包括來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區係彼等除本文所定義之超變區殘基外之可變結構域區。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變結構域自N端至C端包括結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。具體而言，重鏈之CDR3係對抗原結合作用最大且定義抗體特性之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)之標準定義及/或彼等來自「超變環」之殘基來確定。
如本文所使用之術語「核酸」或「核酸分子」意欲包含DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈DNA，但較佳為雙鏈DNA。
如本申請案內所使用之術語「胺基酸」表示天然羧基α-胺基酸之群，其包括丙胺酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸(arg,R)、天冬醯胺(asn,N)、天冬胺酸(asp,D)、半胱胺酸(cys,C)、麩胺醯胺(gln,Q)、麩胺酸(glu,E)、甘胺酸(gly,G)、組胺酸(his,H)、異白胺酸(ile,I)、白胺酸(leu,L)、離胺酸(lys,K)、甲硫胺酸(met,M)、苯丙胺酸(phe,F)、脯胺酸(pro,P)、絲胺酸(ser,S)、蘇胺酸(thr,T)、色胺酸(trp,W)、酪胺酸(tyr,Y)及纈胺酸(val,V)。
本發明抗體較佳係藉由重組方式來產生。因此，該抗體較佳係經分離單株抗體。該等重組方法為業內所熟知，且包括於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離抗體多肽且通常將其純化至醫藥上可接受之純度。對於蛋白質表現，藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈之核酸或其片段插入表現載體中。在適宜原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中進行表現，且自該等細胞(上清液或溶解後之細胞) 回收抗體。
抗體之重組產生為業內所熟知，且闡述於(例如)以下綜述文章中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
該等抗體可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質，該等標準技術包含鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見Ausubel,F.等人編輯Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
在NS0細胞中之表現闡述於(例如)以下文獻中：Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；及Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬時表現闡述於(例如)Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變結構域之選殖闡述於Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；及Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87中。較佳瞬時表現系統(HEK 293)闡述於Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.,Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中。
例如，適用於原核生物之控制序列包含啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及聚腺苷酸化信號。
當將核酸置於與另一核酸序列之功能關係中時，該核酸係「可 操作地連接」。例如，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA可操作地連接至該多肽之DNA上；啟動子或增強子若影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列上；或若核糖體結合位點之定位有助於翻譯，則該核糖體結合位點可操作地連接至該編碼序列上。通常，「可操作地連接」意指所連接DNA序列為鄰接序列，且在分泌前導序列之情形下係鄰接序列且位於閱讀框中。然而，增強子無需鄰接。藉由在方便的限制位點處接合可完成連接。若不存在該等位點，則可根據習用實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。
可藉由習用免疫球蛋白純化程序適當地分離單株抗體與培養基，該等免疫球蛋白純化程序係(例如)蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序容易地分離及測序。可使用雜交瘤細胞作為該DNA及RNA之來源。分離後，可將DNA插入表現載體中，然後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中以在宿主細胞中獲得重組單株抗體之合成。
如本文所使用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包含子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化細胞」包含原代個體細胞及源自其之培養物，而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能由於有意或無意之突變而不精確地相同。本發明包含最初轉化細胞中經篩選具有相同功能或生物活性之變體的子代。
抗體之「Fc部分」不直接參與抗體與抗原之結合，但展現多種效應或功能。「抗體之Fc部分」係熟習此項技術者所熟知之術語且基於抗體之木瓜酶裂解來定義。端視其重鏈恆定區之胺基酸序列，將抗體或免疫球蛋白分成以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將 該等類別中之若干進一步分成多個子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4、IgA1及IgA2。根據重鏈恆定區，不同類別之免疫球蛋白分別稱為α、δ、ε、γ及μ。抗體之Fc部分直接參與基於補體活化、C1q結合及Fc受體結合之ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)。補體活化(CDC)係由補體因子C1q與大多數IgG抗體子類之Fc部分結合來起始。儘管抗體對補體系統之影響取決於某些條件，但與C1q之結合係由Fc部分中之所定義結合位點所致。該等結合位點為業內已知且闡述於例如Boackle,R.J.等人，Nature 282(1979)742-743；Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.及Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virology 75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434中。該等結合位點係例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat,E.A.之EU指數來編號，參見下文)。子類IgG1、IgG2及IgG3抗體通常顯示補體活化以及C1q及C3結合，而IgG4並不活化補體系統且不結合C1q及C3。
在一實施例中，本發明抗體包括源自人類來源之Fc部分及較佳人類恆定區之所有其他部分。如本文所使用，術語「源自人類來源之Fc部分」表示以下Fc部分：人類抗體子類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc部分，較佳人類IgG1子類之Fc部分、人類IgG1子類之突變Fc部分(較佳具有L234A+L235A突變)、人類IgG4子類之Fc部分或人類IgG4子類之突變Fc部分(較佳具有S228P突變)。大部分較佳者係以下序列之人類重鏈恆定區：SEQ ID NO：58(人類IgG1子類)、SEQ ID NO：59(具有突變L234A及L235A之人類IgG1子類)、SEQ ID NO：60(人類 IgG4子類)或SEQ ID NO：61(具有突變S228P之人類IgG4子類)。
較佳地，本發明抗體係人類IgG1子類或人類IgG4子類抗體。在一實施例中，本發明抗體係人類IgG1子類抗體。在一實施例中，本發明抗體係人類IgG4子類抗體。
在一實施例中，本發明抗體之特徵在於恆定鏈具有人類來源。該等恆定鏈為業內所熟知且闡述於例如Kabat,E.A.(例如，參見Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。例如，有用人類重鏈恆定區包括SEQ ID NO：58之胺基酸序列。例如，有用人類輕鏈恆定區包括SEQ ID NO：57之κ-輕鏈恆定區之胺基酸序列。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48，或e)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：55，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：56。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或 b)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或c)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或d)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16，或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84；或其人類化形式。
在一實施例中，用於組合療法中之結合至人類CSF-1R之抗體之特徵在於
a)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括 SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；或h)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或i)重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
在一實施例中，與結合至人類CSF-1R之抗體之組合療法之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區。
在一實施例中，與結合至人類CSF-1R之抗體之組合療法之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區。
在一實施例中，與結合至人類CSF-1R之抗體之組合療法之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區。
在一實施例中，與結合至人類CSF-1R之抗體之組合療法之特徵在於
重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區。
本發明包括治療需要療法之患者之方法，其特徵在於向該患者投與治療有效量之本發明抗體。
本發明包括本發明抗體於所闡述療法之用途。
本發明之一較佳實施例係用於治療「CSF-1R介導之疾病」之本發明CSF-1R抗體或用於製造治療「CSF-1R介導之疾病」之藥劑之本發明CSF-1R抗體，其可如下進行闡述： 存在3種不同的機制，CSF-1R信號傳導可能藉助該等機制參與腫瘤生長及轉移。第一種機制係已在源自雌性生殖系統之腫瘤細胞(乳癌、卵巢癌、子宮內膜癌、子宮頸癌)中發現CSF配體及受體之表現(Scholl,S.M.等人，J.Natl.Cancer Inst.86(1994)120-126；Kacinski,B.M.,Mol.Reprod.Dev.46(1997)71-74；Ngan,H.Y.等人，Eur.J.Cancer 35(1999)1546-1550；Kirma,N.等人，Cancer Res 67(2007)1918-1926)，且該表現與乳癌患者中之乳癌異種移植物生長以及較差預後相關。在一研究中所測試之約10%-20%的急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及骨髓發育不良患者中可見CSF-1R中有兩個點突變，且發現一個突變會破壞受體更新(Ridge,S.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87(1990)1377-1380)。然而，在後期研究中無法確認突變之發生率(Abu-Duhier,F.M.等人，Br.J.Haematol.120(2003)464-470)。亦在肝細胞癌(Yang,D.H.等人，Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.3(2004)86-89)及特發性骨髓纖維化(Abu-Duhier,F.M.等人，Br.J.Haematol.120(2003)464-470)之一些情形下發現突變。最近，在源自髓單核母細胞性白血病患者之GDM-1細胞系中，鑒定出CSF-1R中之Y571D突變(Chase,A.等人，Leukemia 23(2009)358-364)。
色素絨毛結節性滑膜炎(PVNS)及腱鞘巨細胞瘤(TGCT)可因使M-CSF基因融合至膠原基因COL6A3之移位而發生且導致M-CSF過度表現(West,R.B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)690-695)。業內提出景觀效應負責由表現M-CSF之細胞吸引之單核球細胞組成之所得腫瘤團塊。TGCT係可自其多發之手指相對容易地移除之較小腫瘤。PVNS更具攻擊性，此乃因其可在大關節中復發且無法容易地以手術方式來控制。
第二種機制係基於阻斷骨中轉移位點處之誘導破骨細胞生成、骨再吸收及溶骨病灶之經由M-CSF/CSF-1R的信號傳導。乳癌、多發 性骨髓瘤及肺癌係已發現轉移至骨且導致溶骨疾病、從而產生骨骼併發症之癌症的實例。由腫瘤細胞及間質釋放之M-CSF與核因子κ-B配體-RANKL之受體活化劑協同誘導造血骨髓樣單核球祖細胞分化成成熟破骨細胞。在此過程期間，M-CSF藉由給予破骨細胞存活信號起容許因子的作用(Tanaka,S.等人，J.Clin.Invest.91(1993)257-263)。在破骨細胞分化及成熟期間用抗CSF-1R抗體抑制CSF-1R之活性可防止引起溶骨疾病及轉移性疾病中之相關骨骼相關事件的破骨細胞之不平衡活性。而乳癌、肺癌及多發性骨髓瘤通常產生溶骨病灶，前列腺癌中首先至骨之轉移具有成骨細胞外觀，其中增加的骨形成活性產生不同於正常骨之典型片狀結構之「編織骨」。在疾病進展期間，骨病灶展示顯著的溶骨組份以及高血清含量之骨再吸收，且表明可使用抗再吸收療法。已顯示雙磷酸鹽僅在患有激素難治性轉移性前列腺癌之男性中抑制溶骨病灶之形成且減少骨骼相關事件的數目，但目前其對成骨細胞病灶之效應仍有爭議，且迄今為止雙磷酸鹽無益於預防骨轉移或激素反應性前列腺癌。臨床上仍在對混合溶骨/成骨細胞前列腺癌中抗再吸收劑之效應進行研究(Choueiri,M.B.等人，Cancer Metastasis Rev.25(2006)601-609；Vessella,R.L.及Corey,E.,Clin.Cancer Res.12(20 Pt 2)(2006)6285s-6290s)。
第三種機制係基於以下最新觀察：在乳癌、前列腺癌、卵巢癌及子宮頸癌之實體腫瘤中發現腫瘤相關巨噬細胞(TAM)與較差預後相關聯(Bingle,L.等人，J.Pathol.196(2002)254-265；Pollard,J.W.,Nat.Rev.Cancer 4(2004)71-78)。巨噬細胞由M-CSF及其他趨化介素募集至腫瘤。然後巨噬細胞可經由分泌血管生成因子、蛋白酶以及其他生長因子及細胞介素來幫助腫瘤進展且可藉由抑制CSF-1R信號傳導來阻斷。最近，Zins等人(Zins,K.等人，Cancer Res.67(2007)1038-1045)顯示，在小鼠異種移植物模型中在腫瘤內注射各別siRNA 後腫瘤壞死因子α(TNF α)、M-CSF或二者組合之siRNA之表現將使腫瘤生長降低34%至50%。靶向由人類SW620細胞分泌之TNF α之SiRNA降低小鼠M-CSF之含量且減少腫瘤中之巨噬細胞。此外，當與化學治療劑組合給予時，針對M-CSF之抗原結合片段對MCF7腫瘤異種移植物之治療的確抑制了40%的腫瘤生長，逆轉對化學治療劑之抗性且改良小鼠之存活率(Paulus,P.等人，Cancer Res.66(2006)4349-4356)。
TAM僅係慢性發炎與癌症之間發生關聯之一個實例。業內存在關於發炎與癌症之間之關聯的其他證據，此乃因許多慢性疾病與癌症風險增加相關，癌症在慢性發炎位點處發生，在許多癌症中發現發炎之化學調介劑；發炎之細胞或化學調介劑之缺失抑制實驗癌症之發展且長期使用抗發炎劑會降低一些癌症之風險。多種發炎病況與癌症存在關聯，尤其彼等幽門螺旋桿菌(H.pylori)引起之胃炎與胃癌、血吸蟲病與膀胱癌、HHVX與卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、子宮內膜異位症與卵巢癌及前列腺炎與前列腺癌(Balkwill,F.等人，Cancer Cell 7(2005)211-217)。巨噬細胞係慢性發炎中之關鍵細胞且對其微環境之反應不同。有兩種類型之巨噬細胞被視為連續功能狀態中之極端：M1巨噬細胞參與1型反應。該等反應涉及藉助微生物產物活化及因此殺死產生反應性氧中間體之病原微生物。另一末端之極端係參與2型反應之M2巨噬細胞，該等反應促進細胞增殖，調諧發炎及適應性免疫性，且促進組織重塑、血管生成及修復(Mantovani,A.等人，Trends Immunol.25(2004)677-686)。產生已建立贅瘤之慢性發炎通常與M2巨噬細胞相關。調介發炎反應之關鍵細胞介素係TNF α，其名符其實地可在高劑量下刺激抗腫瘤免疫性及出血性壞死，但最近亦已發現其由腫瘤細胞來表現且起腫瘤促進劑作用(Zins,K.等人，Cancer Res.67(2007)1038-1045；Balkwill,F.,Cancer Metastasis Rev.25(2006)409-416)。仍需要較佳地理解巨噬細胞對腫瘤之特異性作用，包含對其功 能潛在的空間及時間依賴性及與特定腫瘤類型之相關性。
因此，本發明之一實施例係用於治療癌症之本發明CSF-1R抗體。如本文所使用之術語「癌症」可係例如肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、扁平細胞癌、垂體腺瘤，包含任一上述癌症之難治性病種或一或多種上述癌症之組合。在一較佳實施例中，該癌症係乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。在一較佳實施例中，該癌症係乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺癌或前列腺癌。在一較佳實施例中，該等癌症之特徵進一步在於CSF-1或CSF-1R表現或過度表現。本發明之另一實施例係用於同時治療原發性腫瘤與新轉移之本發明CSF-1R抗體。
因此，本發明之另一實施例係用於治療以下疾病之本發明CSF-1R抗體：牙周炎、X組織球病、骨質疏鬆症、柏哲德變形性骨炎(PDB，Paget's disease of bone)、由癌症療法所致之骨損失、假體周圍骨溶解、糖皮質素誘導之骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、發炎性關節炎及發炎。
Rabello,D.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.347(2006)791-796已展示，CSF1基因中之SNP展現與攻擊性牙周炎(因齒槽骨之 再吸收導致牙齒損失之牙科組織發炎性疾病)之正相關。
X組織球病(亦稱為蘭格漢細胞組織球病、LCH)係蘭格漢樹突狀細胞之增殖性疾病，該等細胞似乎分化成骨中之破骨細胞及額外骨LCH病灶。蘭格漢細胞係源自循環單核球。發現已在血清及病灶中量測到之M-CSF之含量增加與疾病嚴重程度相關(da Costa,C.E.等人，J.Exp.Med.201(2005)687-693)。當疾病變為全身性或復發時，該疾病主要發生在小兒患者群體中且必須使用化學療法來治療。
骨質疏鬆症之病理生理學係由形成成骨細胞之骨損失及破骨細胞依賴性骨再吸收增加來調介。Cenci等人所闡述之支持數據顯示，在卵巢切除小鼠中抗M-CSF抗體注射維持骨密度且抑制骨再吸收(Cenci,S.等人，J.Clin.Invest.105(2000)1279-1287)。最近，鑒定出停經後骨損失與雌激素缺乏之間之潛在關聯，且發現產生T細胞之TNF α之存在影響骨代謝(Roggia,C.等人，Minerva Med.95(2004)125-132)。可能機制可係在活體內由TNF α誘導M-CSF。藉由針對M-CSF之抗體阻斷小鼠中TNF α誘導之骨溶解的效應且由此製造發炎性關節炎之CSF-1R信號傳導可能靶之抑制劑來確認M-CSF在TNF-α誘導之破骨細胞生成方面之重要作用(Kitaura,H.等人，J.Clin.Invest.115(2005)3418-3427)。
柏哲德變形性骨炎(PDB)係僅次於骨質疏鬆症之第二最常見骨代謝病症，其中增加的骨更新之局灶性異常導致諸如骨痛、畸形、病理性骨折及耳聾等併發症。已鑒定出調控正常破骨細胞功能且使個體易患PDB及相關病症之4種基因之突變：TNFRSF11A中之插入突變，TNFRSF11A編碼核因子(NF)κB(RANK)之受體活化劑，該活化劑係破骨細胞功能之關鍵調控劑，其使TNFRSF11B(編碼骨保護素(RANK配體之誘餌受體))之突變失活；死骨片1基因(SQSTM1)之突變，該基因編碼NFκB途徑中之重要支架蛋白；及含纈酪肽蛋白(VCP)基因之突 變。此基因編碼具有靶向NFκB抑制劑以供蛋白酶體降解之作用的VCP(Daroszewska,A.及Ralston,S.H.,Nat.Clin.Pract.Rheumatol.2(2006)270-277)。所靶向CSF-1R抑制劑提供機會來間接阻斷RANKL信號傳導之去調控且將其他治療選擇添加至目前所用之雙磷酸鹽中。
尤其在乳癌及前列腺癌患者中，癌症療法誘導之骨損失係其中所靶向CSF-1R抑制劑可預防骨損失之其他適應症(Lester,J.E.等人，Br.J.Cancer 94(2006)30-35)。鑒於早期乳癌之經改良預後，佐劑療法之長期結果變得愈發重要，此乃因一些療法(包含化學療法、輻照、芳香酶抑制劑及卵巢剝除)藉由減小骨礦物質密度來影響骨代謝，從而增加骨質疏鬆症及相關骨折之風險(Lester,J.E.等人，Br.J.Cancer 94(2006)30-35)。乳癌中佐劑芳香酶抑制劑療法之等效物在前列腺癌中係雄性激素剝除療法，該療法導致骨礦物質密度損失且顯著增加骨質疏鬆症相關骨折之風險(Stoch,S.A.等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.86(2001)2787-2791)。
CSF-1R信號傳導之所靶向抑制可能在其他適應症以及在所靶向細胞類型包含破骨細胞及巨噬細胞時有益，例如因應類風濕性關節炎所致之關節替代的特定併發症之治療。因假體周圍骨損失及假體後續疏鬆所致之植入物失效係關節替代之主要併發症，且需要對個體患者及健康護理系統而言較高社會經濟負荷之重複手術。迄今為止，業內尚無經批準用於預防或抑制假體周圍骨溶解之藥物療法(Drees,P.等人，Nat.Clin.Pract.Rheumatol.3(2007)165-171)。
糖皮質素誘導之骨質疏鬆症(GIOP)係另一種適應症，其中CSF-1R抑制劑可預防長期使用糖皮質類固醇後之骨損失，該糖皮質類固醇係因患多種病況、尤其彼等慢性阻塞性肺病、氣喘及類風濕性關節炎而給予(Guzman-Clark,J.R.等人，Arthritis Rheum.57(2007)140-146；Feldstein,A.C.等人，Osteoporos.Int.16(2005)2168-2174)。
類風濕性關節炎、乾癬性關節炎及發炎性關節炎自身係CSF-1R信號傳導抑制劑之潛在適應症，此乃因該等疾病係由巨噬細胞組份組成且具有不同程度之骨破壞(Ritchlin,C.T.等人，J.Clin.Invest.111(2003)821-831)。骨關節炎及類風濕性關節炎係由結締組織中之巨噬細胞累積及巨噬細胞浸潤至滑液中(其至少部分地由M-CSF來調介)引起之發炎性自體免疫疾病。Campbell,I.,K.等人，J.Leukoc.Biol.68(2000)144-150展示，M-CSF在活體外係由人類關節組織細胞(軟骨細胞、滑液纖維母細胞)產生且在類風濕性關節炎患者之滑液中發現，此表明其有助於與疾病之發病機制相關之滑液組織增殖及巨噬細胞浸潤。抑制CSF-1R信號傳導可控制關節中巨噬細胞之數目且緩解來自相關骨破壞之疼痛。為使不利效應最小化且進一步理解CSF-1R信號傳導在該等適應症中之影響，一種方法係特異性抑制CSF-1R而不靶向大量其他激酶(例如Raf激酶)。
最新文獻報導，循環M-CSF增加與慢性冠狀動脈疾病之較差預後及動脈粥樣硬化進展相關聯(Saitoh,T.等人，J.Am.Coll.Cardiol.35(2000)655-665；Ikonomidis,I.等人，Eur.Heart.J.26(2005)第1618-1624頁)；M-CSF藉由幫助形成表現CSF-1R且代表初始斑之泡沫細胞(含有所攝取經氧化LDL之巨噬細胞)來影響動脈粥樣硬化過程(Murayama,T.等人，Circulation 99(1999)1740-1746)。
在活化微膠質細胞中發現M-CSF及CSF-1R之表現及信號傳導。微膠質細胞係中樞神經系統之常駐巨噬細胞，其可由多種傷害(包含感染及創傷性損傷)來活化。M-CSF視為腦中發炎反應之關鍵調控劑，且M-CSF含量在HIV-1、腦炎、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，AD)及腦腫瘤中增加。因藉助M-CSF/CSF-1R之自分泌信號傳導所致之微膠神經膠質化誘導發炎性細胞介素且釋放氮氧化物，如藉由例如使用實驗神經元損壞模型來展示(Hao,A.J.等人， Neuroscience 112(2002)889-900；Murphy,G.M.,Jr.等人，J.Biol.Chem.273(1998)20967-20971)。發現在AD及AD之類澱粉前體蛋白V717F轉基因小鼠模型中，CSF-1R之表現增加之微膠質細胞在斑周圍(Murphy,G.M.,Jr.等人，Am.J.Pathol.157(2000)895-904)。另一方面，與正常對照相比，腦中具有極少微膠質細胞之op/op小鼠產生A-β纖維狀沈積及神經元損失，此表明微膠質細胞在op/op小鼠中之AD缺乏研發中的確具有神經保護功能(Kaku,M.等人，Brain Res.Brain Res.Protoc.12(2003)104-108)。
M-CSF及CSF-1R之表現及信號傳導與發炎性腸病(IBD)相關(WO 2005/046657)。術語「發炎性腸病」係指腸道之特徵在於在胃腸道中之多個位點處慢性發炎之嚴重慢性病症，且特異性包含潰瘍性結腸炎(UC)及克羅恩氏病(Crohn's disease)。
因此，本發明之另一實施例係用於治療以下疾病之本發明CSF-1R抗體：牙周炎、X組織球病、骨質疏鬆症、柏哲德變形性骨炎(PDB)、由癌症療法所致之骨損失、假體周圍骨溶解、糖皮質素誘導之骨質疏鬆症、類風濕性關節炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、發炎性關節炎及發炎。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)與TLR9促效劑之組合療法，其用於治療癌症。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)與TLR9促效劑之組合療法，其用於治療骨損失。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)與TLR9促效劑之組合療法，其用於預防或治療轉移。
本發明包括結合至人類CSF-1R之抗體(其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)與TLR9促效劑之組合療法，其用於治療發炎性疾病。
本發明包括抗體(其特徵在於包括結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)之用途，其用於如本文所闡述組合治療癌症或另一選擇為用於製造如本文所闡述與TLR9促效劑組合治療癌症的藥劑。
本發明包括抗體(其特徵在於包括結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)之用途，其用於如本文所闡述組合治療骨損失或另一選擇為用於製造如本文所闡述與TLR9促效劑組合治療骨損失的藥劑。
本發明包括抗體(其特徵在於包括結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)之用途，其利用如本文所闡述之組合預防或治療轉移或另一選擇為用於製造如本文所闡述與TLR9促效劑組合預防或治療轉移的藥劑。
本發明包括抗體(其特徵在於包括結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於上文所提及之表位結合特性或另一選擇為上文所提及之胺基酸序列及胺基酸序列片段)之用途，其用於如本文所闡述組合治療發炎性疾病或另一選擇為用於製造如本文所闡述與TLR9促效劑組合治療發炎性疾病的藥劑。
本發明抗體較佳係由重組方式產生。該等方法為業內所熟知，且包括於原核及真核細胞中表現蛋白質與隨後分離抗體多肽且通常純化至醫藥上可接受之純度。就蛋白質表現而言，藉由標準方法將編碼 輕鏈及重鏈或其片段之核酸插入表現載體中。在適宜原核或真核宿主細胞(例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌細胞)中進行表現，且自該等細胞(由上清液或在細胞溶解後)回收抗體。
抗體之重組產生為業內所熟知，且述於例如以下綜述文章：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
該等抗體可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純形式存在。藉由標準技術實施純化以去除其他細胞組份或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質，該等標準技術包含鹼/SDS處理、CsCl顯帶(banding)、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見Ausubel,F.等人編輯Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
在NS0細胞中之表現述於例如Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；及Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270。瞬時表現闡述於例如Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變結構域之選殖闡述於Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87中。較佳之瞬時表現系統(HEK 293)闡述於Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.,Cytotechnology 30(1999)71-83及Schlaeger,E.-J.,J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中。
編碼抗-CSF-1R抗體之胺基酸序列變體之核酸分子係藉由多種業 內已知方法來製備。該等方法包含(但不限於)自天然來源分離(在天然胺基酸序列變體之情形下)或藉由人類化抗-CSF-1R抗體之先前所製備變體或非變體形式的寡核苷酸介導之(或定點)誘變、PCR誘變及盒式誘變來製備。
將本發明之重鏈及輕鏈可變結構域與啟動子、翻譯起始、恆定區、3'非翻譯區、聚腺苷酸化及轉錄終止之序列組合以形成表現載體構築物。可將重鏈及輕鏈表現構築物組合成單一載體，共轉染、連續轉染或單獨轉染至宿主細胞中，然後融合以形成表現兩條鏈之單一宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供組合物，例如醫藥組合物，其含有本發明之一種單株抗體或單株抗體之組合或其抗原結合部分，與醫藥上可接受之載劑調配在一起。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包含任何及所有溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收/再吸收延遲劑及生理上相容之類似試劑。較佳地，載劑適於注射或輸注。
本發明之組合物可藉由多種業內熟知之方法來投與。如熟習此項技術者將瞭解，投與途徑及/或模式將端視所期望結果而變化。
醫藥上可接受之載劑包含無菌水溶液或分散液及用於製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。該等介質及試劑於醫藥活性物質之應用已為業內已知。除水之外，載劑可為(例如)等滲緩衝鹽水溶液。
無論所選投與途徑如何，可以適宜水合形式使用之本發明化合物及/或本發明之醫藥組合物係藉由彼等熟習此項技術者已知之習用方法調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量值可變化以便獲得可有效達成對具體患者有期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與模式，而對患者無毒(有效量)。所選劑量值將端視多種藥物代謝動力 學因素而定，包含所採用之本發明具體組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所採用具體化合物之排泄速率、與所採用之具體組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、病況、一般健康情況及先前病史以及已為醫療業內所熟知之類似因素。
術語「治療方法」或其等效詞在用於(例如)癌症時係指經設計以減少或清除患者中癌細胞之數目或緩解癌症症狀之活動的程序或進程。癌症或另一增殖性病症之「治療方法」不必意指實際上可清除癌細胞或其他病症，實際上可減少細胞數目或病症，或實際上可緩解癌症或其他病症之症狀。通常，實施治療癌症之方法成功之可能性甚至較低，但考慮到患者之病史及估計之存活期望，認為該方法仍可引起總體有益之作用進程。
術語「與......組合投與」或「共投與(co-administration、co-administering)」或「組合」係指投與呈例如單獨調配物/應用形式(或呈一種單一調配物/應用之形式)之抗CSF-1R與TLR9促效劑。共投與可同時或以任一順序依序實施，其中兩種(或所有)活性劑較佳在一段時間內同時發揮其生物活性。同時或依序共投與(經由連續輸注(例如靜脈內(i.v.)))該抗體與該TLR9促效劑。在依序共投與兩種治療劑時，在同一天以兩次單獨投與投與劑量，或在第1天投與一種藥劑且在第2天至第7天、較佳在第2至4天共投與第二種藥劑。因此，在一實施例中，術語「依序」意指在投用第一種組份後7天內、較佳在投用第一種組份後4天內；且術語「同時」意指在同一時間。就抗CSF-1R抗體之維持劑量而言，術語「共投與」意指若治療週期適於兩種藥物(例如每週)，則可同時共投與維持劑量。或例如每第1至第3天投與例如另一藥劑且每週投與該抗體。或在一天或數天內依序共投與維持劑量。
不言而喻，抗體係以「治療有效量」(或簡言之「有效量」)投與患者，治療有效量係將使組織、系統、動物或人類發出研究者、獸醫、醫師或其他臨床醫師正尋求之生物或醫學反應之各別化合物或組合物之量。
共投與之量及共投與之時間將端視所治療患者之類型(物種、性別、年齡、體重等)及病況以及所治療疾病或病況之嚴重程度而定。該抗CSF-1R抗體與另一藥劑適於一次或經一系列治療例如在同一天或在次日共投與患者。
端視疾病之類型及嚴重程度，該抗CSF-1R抗體之約0.1mg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)係將兩種藥物共投與患者之初始候選劑量。本發明包括本發明抗體於治療患有癌症、尤其結腸癌、肺癌或胰臟癌之患者的用途。
端視疾病之類型及嚴重程度，該抗CSF-1R抗體之約0.1mg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)係將兩種藥物共投與患者之初始候選劑量。本發明包括本發明抗體於治療患有癌症、尤其結腸癌、肺癌或胰臟癌之患者的用途。
除抗CSF-1R抗體與TLR9促效劑之組合外，亦可投與化學治療劑。
在一實施例中，可與抗CSF-1R抗體及TLR9促效劑一起投與之該等其他化學治療劑包含(但不限於)抗腫瘤劑，其包含烷基化劑，其包含：氮芥，例如雙氯乙基甲胺、環磷醯胺、異環磷醯胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)及瘤克寧錠(chlorambucil)；亞硝基脲類，例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)及司莫司汀(semustine，甲基-CCNU)；Temodal(TM)(替莫唑胺(temozolamide))、乙烯亞胺/甲基蜜胺(例如三伸乙基蜜胺(TEM)、三伸乙基硫代磷醯胺(噻替哌(thiotepa))、六甲基蜜胺(HMM、六甲蜜胺(altretamine)))；磺 酸烷基酯，例如白消安(busulfan)；三，例如達卡巴(dacarbazine，DTIC)；抗代謝物，其包含葉酸類似物(例如甲胺喋呤(methotrexate)及三甲曲沙(trimetrexate))、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟去氧尿苷、吉西他濱(gemcitabine)、胞嘧啶阿糖核苷(AraC、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮雜胞苷、2,2'-二氟去氧胞苷)、嘌呤類似物(例如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤、T-去氧柯福黴素(deoxycoformycin，噴司他丁(coformycin))、赤羥壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及2-氯去氧腺苷(克拉曲濱(cladribine)、2-CdA))；天然產物，包含抗有絲分裂藥物，例如太平洋紫杉醇、長春花生物鹼(vinca alkaloid，包含長春鹼(VLB)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine))、泰索帝(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)及磷酸雌莫司汀；鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，例如依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如放線菌素D(daunomycin D)、道諾黴素(daunomycin，紅比黴素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、艾達黴素(idarubicin)、博來黴素(bleomycins)、普卡黴素(plicamycin，光輝黴素(mithramycin))、絲裂黴素C(mitomycin C)及放線菌素；酶，例如L-門冬醯胺酶；生物反應修飾劑，例如干擾素-α、IL-2、G-CSF及GM-CSF；其他藥劑，包含鉑配位錯合物(例如奧沙利鉑(oxaliplatin)、順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin))、蒽醌(例如米托蒽醌)、經取代脲(例如羥基脲)、甲基肼衍生物(包含N-甲基肼(MIH)及丙卡巴肼(procarbazine))、腎上腺皮質阻抑劑(例如米托坦(mitotane，o,p-DDD))及胺魯米特(aminoglutethimide)；激素及拮抗劑，包含腎上腺皮質類固醇拮抗劑，例如潑尼松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)及胺魯米特；Gemzar(TM)(吉西他濱)、黃體素(例如己酸羥孕酮、乙酸甲 羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)及乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))；雌激素，例如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)及乙烯雌二醇等效物；抗雌激素，例如他莫昔芬(tamoxifen)；雄性激素，包含丙酸睪固酮及氟甲睪酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄性激素，例如氟他胺(flutamide)、促性腺激素釋放激素類似物及亮丙瑞林(leuprolide)；及非類固醇抗雄性激素，例如氟他胺。靶向表觀遺傳學機制之療法包含(但不限於)組蛋白去乙醯酶抑制劑，去甲基化劑(例如，維達紮(Vidaza))，且釋放轉錄阻遏(ATRA)療法亦可與抗原結合蛋白組合。 在一實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：紫杉烷(taxane，如例如太平洋紫杉醇(汰癌勝(Taxol))、多西他賽(docetaxel，泰索帝)、經修飾太平洋紫杉醇(例如，阿巴生(Abraxane)及奧帕消(Opaxio))、多柔比星、舒尼替尼(sunitinib，舒癌特(Sutent))、索拉菲尼(sorafenib，蕾莎瓦(Nexavar))及其他多激酶抑制劑、奧沙利鉑、順鉑及卡鉑、依託泊苷、吉西他濱及長春鹼。在一實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：紫杉烷(如例如汰癌勝(太平洋紫杉醇)、多西他賽(泰索帝)、經修飾太平洋紫杉醇(例如阿巴生及奧帕消)。在一實施例中，其他化學治療劑係選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲硫四氫葉酸(leucovorin)、伊立替康(irinotecan)或奧沙利鉑。在一實施例中，化學治療劑為5-氟尿嘧啶、甲硫四氫葉酸及伊立替康(FOLFIRI)。在一實施例中，化學治療劑為5-氟尿嘧啶及奧沙利鉑(FOLFOX)。
與其他化學治療劑之組合療法之特定實例包含例如利用紫杉烷(例如，多西他賽或太平洋紫杉醇)或經修飾太平洋紫杉醇(例如，阿巴生或奧帕消)、多柔比星)、卡培他濱(capecitabine)及/或貝伐單抗(bevacizumab，阿瓦斯汀(Avastin))之療法來治療乳癌；利用卡鉑、奧沙利鉑、順鉑、太平洋紫杉醇、多柔比星(或經修飾多柔比星(Caelyx或Doxil))或托泊替康(topotecan，癌康定(Hycamtin))之療法來治療卵 巢癌；利用多激酶抑制劑、MKI(舒癌特、蕾莎瓦或706)及/或多柔比星之療法來治療腎癌；利用奧沙利鉑、順鉑及/或輻射之療法來治療鱗狀細胞癌；利用汰癌勝及/或卡鉑之療法來治療肺癌。
因此，在一實施例中，其他化學治療劑係選自以下之群：紫杉烷(多西他賽或太平洋紫杉醇或經修飾太平洋紫杉醇(阿巴生或奧帕消)、多柔比星、卡培他濱及/或貝伐單抗用於治療乳癌。
在一實施例中，CSF-1R抗體/TLR9促效劑組合療法並不投與化學治療劑。
本發明亦包括用於治療患有該疾病之患者之方法。
本發明進一步提供製造包括有效量之本發明抗體以及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物的方法及本發明抗體於該方法之用途。
本發明亦提供有效量之本發明抗體較佳與醫藥上可接受之載劑一起於製造醫藥劑之用途，該醫藥劑用於治療患有癌症之患者。
本發明亦提供有效量之本發明抗體較佳與醫藥上可接受之載劑一起於製造醫藥劑之用途，該醫藥劑用於治療患有癌症之患者。
提供以下實例、序列表及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範疇陳述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不偏離本發明之精神下對所述程序作出多種修改。
序列之描述
SEQ ID NO：1 Mab 2F11之重鏈CDR3
SEQ ID NO：2 Mab 2F11之重鏈CDR2
SEQ ID NO：3 Mab 2F11之重鏈CDR1
SEQ ID NO：4 Mab 2F11之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：5 Mab 2F11之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：6 Mab 2F11之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：7 Mab 2F11之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：8 Mab 2F11之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：9 Mab 2E10之重鏈CDR3
SEQ ID NO：10 Mab 2E10之重鏈CDR2
SEQ ID NO：11 Mab 2E10之重鏈CDR1
SEQ ID NO：12 Mab 2E10之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：13 Mab 2E10之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：14 Mab 2E10之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：15 Mab 2E10之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：16 Mab 2E10之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：17 hMab 2F11-c11之重鏈CDR3
SEQ ID NO：18 hMab 2F11-c11之重鏈CDR2
SEQ ID NO：19 hMab 2F11-c11之重鏈CDR1
SEQ ID NO：20 hMab 2F11-c11之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：21 hMab 2F11-c11之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：22 hMab 2F11-c11之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：23 hMab 2F11-c11之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：24 hMab 2F11-c11之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：25 hMab 2F11-d8之重鏈CDR3
SEQ ID NO：26 hMab 2F11-d8之重鏈CDR2
SEQ ID NO：27 hMab 2F11-d8之重鏈CDR1
SEQ ID NO：28 hMab 2F11-d8之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：29 hMab 2F11-d8之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：30 hMab 2F11-d8之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：31 hMab 2F11-d8之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：32 hMab 2F11-d8之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：33 hMab 2F11-e7之重鏈CDR3
SEQ ID NO：34 hMab 2F11-e7之重鏈CDR2
SEQ ID NO：35 hMab 2F11-e7之重鏈CDR1
SEQ ID NO：36 hMab 2F11-e7之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：37 hMab 2F11-e7之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：38 hMab 2F11-e7之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：39 hMab 2F11-e7之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：40 hMab 2F11-e7之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：41 hMab 2F11-f12之重鏈CDR3
SEQ ID NO：42 hMab 2F11-f12之重鏈CDR2
SEQ ID NO：43 hMab 2F11-f12之重鏈CDR1
SEQ ID NO：44 hMab 2F11-f12之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：45 hMab 2F11-f12之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：46 hMab 2F11-f12之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：47 hMab 2F11-f12之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：48 hMab 2F11-f12之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：49 hMab 2F11-g1之重鏈CDR3
SEQ ID NO：50 hMab 2F11-g1之重鏈CDR2
SEQ ID NO：51 hMab 2F11-g1之重鏈CDR1
SEQ ID NO：52 hMab 2F11-g1之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：53 hMab 2F11-g1之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：54 hMab 2F11-g1之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：55 hMab 2F11-g1之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：56 hMab 2F11-g1之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：57 人類κ輕鏈恆定區
SEQ ID NO：58 源自IgG1之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：59 源自L234A及L235A突變之IgG1之人類 重鏈恆定區
SEQ ID NO：60 源自IgG4之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：61 源自S228P突變之IgG4之人類重鏈恆定區
SEQ ID NO：62 人類野生型CSF-1R(wt CSF-1R)
SEQ ID NO：63 人類突變體CSF-1R L301S Y969F
SEQ ID NO：64 人類CSF-1R細胞外結構域(結構域D1-D5)
SEQ ID NO：65 人類CSF-1R片段delD4
SEQ ID NO：66 人類CSF-1R片段結構域D1-D3
SEQ ID NO：67 信號肽
SEQ ID NO：68 引子
SEQ ID NO：69 Mab 1G10之重鏈CDR3
SEQ ID NO：70 Mab 1G10之重鏈CDR2
SEQ ID NO：71 Mab 1G10之重鏈CDR1
SEQ ID NO：72 Mab 1G10之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：73 Mab 1G10之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：74 Mab 1G10之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：75 Mab 1G10之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：76 Mab 1G10之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：77 Mab 2H7之重鏈CDR3
SEQ ID NO：78 Mab 2H7之重鏈CDR2
SEQ ID NO：79 Mab 2H7之重鏈CDR1
SEQ ID NO：80 Mab 2H7之輕鏈CDR3
SEQ ID NO：81 Mab 2H7之輕鏈CDR2
SEQ ID NO：82 Mab 2H7之輕鏈CDR1
SEQ ID NO：83 Mab 2H7之重鏈可變結構域
SEQ ID NO：84 Mab 2H7之輕鏈可變結構域
SEQ ID NO：85 人類CSF-1R片段結構域D4-D5
SEQ ID NO：86 人類CSF-1
SEQ ID NO：87 人類IL-34
SEQ ID NO：88 人類類鐸受體9(TLR9)
SEQ ID NO：89 TLR9促效劑CpG ODN 2216
SEQ ID NO：90 TLR9促效劑CpG ODN PB4
SEQ ID NO：91 TLR9促效劑CpG ODN 1002
SEQ ID NO：92 TLR9促效劑CpG-7909(CpG 2006、PF-3512676、阿托莫德)
SEQ ID NO：93 TLR9促效劑CpG-685(GNKG168；CpG ODN；SBI Biotech)
SEQ ID NO：94 TLR9促效劑CpG-684
SEQ ID NO：95 TLR9促效劑CpG-28
闡述本發明之以下實施例：
1.一種結合至人類CSF-1R之抗體，其中該抗體與類鐸受體9(TLR9)促效劑組合投與用於治療癌症。
2.一種以下組合之用途
i)結合至人類CSF-1R之抗體，及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑
其用於製造用來治療癌症之藥劑。
3.根據實施例1或2之抗體或用途，其中該癌症之特徵進一步在於CSF-1R表現或過度表現。
4.根據實施例1或2中任一者之抗體或用途，其中該癌症係乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。
5.一種結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)，其用 於
a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞的細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球至巨噬細胞之細胞分化，其中該抗體係與TLR9促效劑組合投與。
6.一種以下組合之用途
i)抗體，其結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)，及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑
其用於製造用於以下各項之藥劑
a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞的細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球至巨噬細胞之細胞分化。
7.一種結合至人類CSF-1R之抗體，其用於治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加，且其中該抗CSF-1R抗體係與 TLR9促效劑組合投與。
8.一種以下組合之用途
i)結合至人類CSF-1R之抗體，及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑
其用於製造用來治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤之患者的藥劑，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加。
9.根據實施例1或8中任一者之抗體或用途，其中該TLR9促效劑之特徵在於誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12。
10. 根據實施例1或8中任一者之抗體或用途，其中該TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸(CpG ODN)。
11. 根據實施例1至10中任一者之抗體或用途，其中該抗體之特徵在於結合至人類CSF-1R之該細胞外結構域之該等結構域D4至D5(SEQ ID No：85)。
12. 根據前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體之特徵在於該抗體並不與人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)結合。
13. 根據前述實施例中任一者之抗體，其中a)重鏈可變結構域為SEQ ID NO：7，且輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：8，b)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16；c)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；d)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84； e)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或f)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或g)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或h)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48，或i)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：55，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：56。
14. 根據前述實施例中任一者之抗體，其中a)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30 之CDR1區，或e)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；或h)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或i)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
15. 根據前述實施例中任一者之抗體，其中該抗體係人類IgG1子類或人類IgG4子類抗體。
16. 一種治療方法，其包括向患有癌症之患者投與有效量之結合至人類CSF-1R之抗體，其中該抗體係與類鐸受體9(TLR9)促效劑組合投與。
17. 根據實施例16之方法，其中該癌症之特徵進一步在於CSF-1R表現或過度表現。
18. 根據實施例16之方法，其中該癌症係乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。
19. 一種方法，其包括投與有效量之結合至人類CSF-1R且特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)之抗體，其用於
a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞的細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(以CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性方式)表現CSF-1R之單核球至巨噬細胞之細胞分化，其中該抗體係與有效量之TLR9促效劑組合投與。
20. 一種治療方法，其包括投與有效量之結合至人類CSF-1R之抗體，該抗體用於治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加，且其中該抗CSF-1R抗體係與有效量之TLR9促效劑組合投與。
提供以下實例、序列表及圖以幫助理解本發明，本發明之實際範疇陳述於隨附申請專利範圍中。應理解，可在不偏離本發明之精神下對所述程序作出多種修改。
實例 實例1 產生抗CSF-1R抗體之雜交瘤細胞系之傳代 NMRI小鼠之免疫程序
藉由使用電穿孔用編碼huCSF-1R之細胞外結構域之表現載體pDisplayTM(Invitrogen,USA)對NMRI小鼠實施免疫。用100μg DNA將每隻小鼠免疫4次。當發現抗huCSF-1R之血清效價足夠時，在融合前4天及3天時，另外用於200μl PBS中之50μg 1：1混合物huCSF-1R ECD/huCSF-1R ECDhuFc嵌合體經靜脈內(i.v.)對小鼠實施一次加強免疫。
抗原特異性ELISA
藉由抗原特異性ELISA來測定經免疫小鼠血清中之抗CSF-1R效價。
將0.3μg/ml huCSF-1R-huFc嵌合體(可溶性細胞外結構域)捕獲於抗生蛋白鏈菌素板(MaxiSorb；MicroCoat,DE，目錄號11974998/MC1099)上，且添加以1/800稀釋於PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA中之0.1mg/ml生物素化抗Fcγ(Jackson ImmunoResearch.，目錄號109-066-098)及山葵過氧化物酶(HRP)偶聯之F(ab’)2抗小鼠IgG(GE Healthcare,UK，目錄號NA9310V)。將來自所有TAP之血清以1/40稀釋於PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA中且連續稀釋至1/1638400。將所稀釋血清添加至孔中。使用TAP前之血清作為陰性對照。使用小鼠抗人類CSF-1R Mab3291(R&D Systems,UK)自500ng/ml至0.25ng/ml之連續稀釋物作為陽性對照。將所有組份一起培育1.5小時。用PBST(PBS/0.2% Tween20)將孔洗滌6次，且在室溫下用新鮮製備之ABTS®溶液(1 mg/ml)(ABTS：2,2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)將分析物顯影10分鐘。在405nm下量測吸光度。
雜交瘤傳代
可使用基於PEG之標準方案分離小鼠淋巴球且與小鼠骨髓瘤細胞 系融合以產生雜交瘤。然後篩選所得雜交瘤以產生抗原特異性抗體。例如，使用50% PEG將來自經免疫小鼠之脾源性淋巴球之單細胞懸浮液融合至Ag8非分泌小鼠骨髓瘤細胞P3X63Ag8.653(ATCC,CRL-1580)。將細胞以約104平鋪於96孔平底微量滴定板中，然後在選擇培養基中培育約兩週。然後藉由針對人類抗CSF-1R單株IgM及IgG抗體之ELISA篩選個別孔。一旦出現廣泛性雜交瘤生長，即再平鋪分泌抗體之雜交瘤，再篩選，且若對於人類IgG、抗CSF-1R單株抗體仍呈陽性，則可藉由FACS亞選殖。然後在活體外培養穩定的亞純系以在組織培養基中產生抗體用於表徵。本發明抗體可利用以下方式來選擇：如實例4中所闡述測定抗CSF-1R抗體與人類CSF-1R片段delD4及人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之結合，以及如實例5中所闡述測定在抗CSF-1R單株抗體治療下對轉染有野生型CSF-1R(配體依賴性信號傳導)或突變體CSF-1R L301S Y969F(非配體依賴性信號傳導)之NIH3T3細胞的生長抑制。
雜交瘤之培養
在37℃及5% CO2下，在補充有以下物質之RPMI 1640(PAN-目錄編號(目錄號)PO4-17500)中培養經傳代muMAb雜交瘤：2mM L-麩醯胺酸(GIBCO目錄號35050-038)、1mM丙酮酸鈉(GIBCO目錄號11360-039)、1×NEAA(GIBCO目錄號11140-035)、10% FCS(PAA-目錄號A15-649)、1×Pen Strep(Roche-目錄號1074440)、1×Nutridoma CS(Roche-目錄號1363743)、50μM巰基乙醇(GIBCO目錄號31350-010)及50U/ml小鼠IL 6(Roche-目錄號1 444 581)。所得小鼠抗體中之一些(例如Mab 2F11)已經人類化且以重組方式表現。
實例2 CSF-1與CSF-1R結合之抑制(ELISA)
藉由設置此分析以使抗CSF-1R抗體首先結合至CSF-1R-ECD，然 後檢測未結合至受體之配體，可測試置換抗體之配體及抗CSF-1R抗體之二聚化抑制劑二者。在室溫下在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，目錄號464718)上實施測試。每一培育步驟後，用PBST將板洗滌3次。
開始時，用0.5mg/ml山羊F(ab')2生物素化抗Fcγ(Jackson ImmunoResearch.，目錄號109-006-170)將板包覆1小時(h)。
然後用補充有0.2% Tween®-20及2% BSA(Roche Diagnostics GmbH,DE)之PBS將孔封阻0.5h。將75ng/ml huCSF-1R-huFc嵌合體(其形成huCSF-1R之二聚體可溶性細胞外結構域)固定至板並保持1h。然後將經純化抗體於PBS/0.05% Tween20/0.5% BSA中之稀釋物培育1h。添加3ng/ml hu CSF-1(人類CSF-1之149 aa活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181)；Biomol,DE，目錄號60530)、50ng/ml生物素化抗CSF-1純系BAF216(R&D Systems,UK)及1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE，目錄號11089153001)之混合物並保持1h後，用PBST將板洗滌6次。使用抑制配體-受體相互作用之抗CSF-1R SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US)作為陽性對照。 在室溫下用新鮮製備之BM blue® POD受質溶液(BM blue®：3,3'-5,5'-四甲基聯苯胺，Roche Diagnostics GmbH,DE，目錄號11484281001)將板顯影30分鐘。在370nm下量測吸光度。若抗CSF-1R抗體使得CSF-1自二聚體複合物釋放，則發現吸光度減小。所有抗CSF-1R抗體皆顯示顯著抑制CSF-1與CSF-1R之相互作用(參見表1)。使用抑制配體-受體相互作用之抗CSF-1R SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US，亦參見Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)作為參考對照。
表1：所計算用於抑制CSF-1/CSF-1R相互作用之IC50值
實例3 對NIH3T3-CSF-1R重組細胞中CSF-1誘導之CSF-1R磷酸化之抑制
將4.5×103個藉由逆轉錄病毒感染全長CSF-1R之表現載體之NIH 3T3細胞培養於DMEM(PAA目錄號E15-011)、2mM L-麩醯胺酸(Sigma，目錄號G7513)、2mM丙酮酸鈉、1×非必需胺基酸、10% FKS(PAA，目錄號A15-649)及100μg/ml PenStrep(Sigma，目錄號P4333[10mg/ml])中，直至其達到鋪滿。然後用補充有以下物質之無血清DMEM培養基(PAA目錄號E15-011)洗滌細胞：亞硒酸鈉[5ng/ml](Sigma，目錄號S9133)、運鐵蛋白[10μg/ml](Sigma，目錄號T8158)、BSA[400μg/ml](Roche Diagnostics GmbH，目錄號10735078)、4mM L-麩醯胺酸(Sigma，目錄號G7513)、2mM丙酮酸鈉(Gibco，目錄號11360)、1×非必需胺基酸(Gibco，目錄號：11140-035)、2-巰基乙醇[0.05mM](Merck，目錄號M7522)、100μg/ml PenStrep(Sigma，目錄號P4333)，且在30μl相同培養基中培育16小時以使受體上調。將10μl經稀釋抗CSR-1R抗體添加至細胞中並保持1.5h。然後用10μl 100ng/ml hu CSF-1(人類CSF-1之149 aa活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181)；Biomol,DE，目錄號60530)將細胞刺激5min。培育後，移除上清液，用80μl冰冷PBS將細胞洗滌兩次，且添加50μl新鮮製備之冰冷溶解緩衝液(150mM NaCl/20mM Tris(pH 7.5)/1mM EDTA/1mM EGTA/1% Triton X-100/每10ml緩衝液1種 蛋白酶抑制劑錠劑(Roche Diagnostics GmbH，目錄號1 836 170)/10μl/ml磷酸酶抑制劑混合劑1(Sigma目錄號P-2850,100×儲備溶液)/10μl/ml蛋白酶抑制劑1(Sigma目錄號P-5726,100×儲備溶液)/10μl/ml 1M NaF)。在冰上保持30分鐘後，在板振盪器上將板劇烈振盪3分鐘，且然後在2200rpm下離心10分鐘(Heraeus Megafuge 10)。
使用Elisa分析細胞溶解物中磷酸化之存在及總CSF-1受體。為檢測磷酸化受體，根據供應商之說明書使用來自R&D Systems之套組(目錄號DYC3268-2)。為檢測總CSF-1R，藉由使用套組中所含之捕獲抗體將10μl溶解物固定在板上。然後添加1：750稀釋之生物素化抗CSF-1R抗體BAF329(R&D Systems)及1：1000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP偶聯物。60分鐘後，用新鮮製備之ABTS®溶液將板顯影且檢測吸光度。數據計算為佔不含抗體之陽性對照之%且表示為磷酸/總受體之比值。在不添加M-CSF-1的情況下定義陰性對照。使用抑制配體-受體相互作用之抗CSF-1R SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US，亦參見Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)作為參考對照。
實例4 對抗CSF-1R抗體與人類CSF-1R片段delD4及人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之結合的測定
SEQ ID NO：64之人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括hCSF-1R-ECD之細胞外子結構域D1-D5)之製備：在CMV啟動子控制下，pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD(7836 bp)編碼人類CSF-1R之完整ECD(SEQ ID NO：64)，該ECD C端融合至PreScission蛋白酶裂解位點，其後為人類IgG1之aa100-330及6×His標記。藉由在第一個M後插入胺基酸G及S來改變天然信號肽，以產生BamHI限制位點。
SEQ ID NO：65之人類CSF-1R片段delD4(包括hCSF-1R-delD4之細胞外子結構域D1-D3及D5)之製備：藉助Stratagene QuikChange XL定點誘變方案使用delD4-前置序列CACCTCCATGTTCTTCCGGTACCCCCCAGAGGTAAG(SEQ ID NO：68)作為前置引子及delD4-後置反義互補序列作為後置引子自pCMV-preS-Fc-hCSF-1R-ECD選殖hCSF1R-delD4-V1-PreSc-hFc-His。使用刊登在BioTechniques 26(1999)680中之方案變化形式在規則的Stratagene方案之前在單獨反應中以三個循環延伸兩個引子：根據製造商之手冊設置兩種單獨50μl反應混合物，其各自含有10ng質體pCMV-preS-Fc-hCSF1R-ECD作為模板及10pM引子delD4-前置或delD4-後置中之一者以及如與套組一起提供之0.5μl Pfu DNA聚合酶。運行三個PCR循環95℃ 30秒/55℃ 60秒/68℃ 8min，然後於新管中合併25μl兩種反應混合物中之每一者，且添加0.5μl新鮮Pfu DNA聚合酶。如套組手冊中之Stratagene所指定實施具有18個溫度循環之規則PCR方案，然後用與套組一起提供之Dpn1限制酶最終消化2hr。藉由用Cel II及Not I消化來檢測具有缺失之純系且藉由測序來驗證。
根據製造商之說明書藉由在Hek293 FreeStyle懸浮細胞系統(Invitrogen)中瞬時轉染來製備蛋白質。1週後，將500ml上清液過濾 且裝載至1ml HiTrap MabSelect Xtra(GE healthcare)蛋白質A管柱(0.2ml/min)上。首先用PBS洗滌管柱，然後用50mM Tris/150mM NaCl/1mM EDTA/pH 7.3洗滌。將稀釋於375μl相同緩衝液中之75μl PreScission蛋白酶(GE編號27-0843-01)添加至管柱上，且在4℃下在翻轉的同時將密閉管柱培育過夜。將管柱安裝於1ml GSTrap FF管柱(GE helthcare)之頂部上，且溶析期望蛋白質(0.2ml/min,0.2ml流份)。藉由3k Nanosep離心超濾將所彙集流份自1.8ml濃縮至0.4ml，且經於PBS中之S200 HR SEC(0.5ml/min)層析。
獲得人類CSF-1R片段delD4之兩種流份：二聚體分子(彙集物1，V=1.5ml；c=0.30mg/ml；SDS page上之視質量為83kDa，還原質量為62kDa)及單體(彙集物2，V=1,4ml；c=0.25mg/ml，SDS page上之視質量為62kDa)。將二聚體形式用於所有實驗。
對抗CSF-1R抗體與人類CSF-1R片段delD4及人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之結合(結合信號以反應單位(RU)表示)的測定
儀器：Biacore T100(GE Healthcare)
軟體：T100 Control，2.0.1版
T100 Evaluation，2.0.2版
分析格式 晶片：CM5
溫度：25℃
經由胺偶合固定CSF-1R片段。為比較本發明之不同抗CSF-1R抗體的結合，注射一種濃度之測試抗體。使用抗CSF-1R Mab3291(R&D-Systems)及SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US，亦參見Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)作為參考對照，使用抗CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5(於2004年8月18日以DSM ACC 2683保藏於DSMZ)作為陰性對照，該等對照皆與本發明抗CSF-1R抗體處於相同條件下。
CSF-1R片段之胺偶合
根據製造商之說明書進行標準胺偶合：運行緩衝液：PBS-T(Roche：11 666 789+0.05% Tween20：11 332 465)，經EDC/NHS混合物活化，以流速10μl/min經600秒注射人類CSF-1R片段delD4(包括細胞外子結構域D1-D3及D5)(SEQ ID NO：65)及人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括細胞外子結構域D1-D5)(SEQ ID NO：64)；稀釋於偶合緩衝液NaAc(pH 5.0，c=10μg/mL)中；最後藉由注射1M乙醇胺封阻剩餘的活化羧基。
25℃下<CSF-1R>Mab 2F11、Mab 2E10、Mab 3291及sc2-4A5以及其他抗CSF-1R抗體與人類CSF-1R片段delD4及人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)之結合 運行緩衝液：PBS-T(Roche：11 666 789+0.05% Tween20：11 332 465) 分析物樣品：
藉由以30μL/min之流速注射一次濃度c=10nM之分析物來量測結合。(在第二實驗中，對於Mab 1G10、Mab 2H7及人類化hMab 2F11-e7)。每一注射持續700秒，其後解離期為180秒。在每一循環後使用50mM NaOH、接觸時間60秒、流速30μL/min來實施最終再生。
注射結束後10秒量測報告點之信號。減去參考信號(來自空白參考流動池(僅經EDC/NHS及乙醇胺處理)之信號)以給出結合信號(以RU表示)。若非結合抗體之結合信號稍低於0(Mab 2F11=-3；Mab 2E10=-2；Mab 1G10=- 6，Mab 2H7=-9；且人類化hMab 2F11-e7=-7)，則將該等值設定為0。
表3a：<CSF-1R>MAb與人類CSF-1R片段delD4及CSF-1R-ECD之結合以及在25℃下藉由SPR量測之比率
Mab 2F11及Mab 2E10顯示結合至人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(參見圖3b)；然而，檢測到不與CSF-1R片段delD4結合。(參見圖3a)。
Sc2-4A5及MAB3291顯示結合至CSF-1R-ECD及del D4(參見圖3b及3a)。
因此，抗CSF1R抗體Mab 2F11及Mab 2E10與CSF1R片段delD4結合/與CSF-1R-ECD結合之比率顯著低於1：50(=0.02)，而MAB3291與Sc2-4A5之結合比分別為1.61及1.50，且顯著高於1：50(=0.02)。陰性對照抗體m<CCR5>Pz03.1C5不顯示任何結合(如預期)。
Mab 1G10、Mab 2H7及人類化hMab 2F11-e7顯示結合至人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(參見圖3d)；然而，檢測到不與CSF-1R片段delD4結合。(參見圖3)。因此，抗CSF1R抗體Mab 1G10、Mab 2H7及人類化hMab 2F11-e7與CSF1R片段delD4結合/與CSF-1R-ECD結合之比率顯著低於1：50(=0.02)。
在另一實驗中，研究抗CSF-1R抗體1.2.SM(置換WO2009026303中所闡述CSF-1R抗體之配體)、CXIIG6(置換WO 2009/112245中所闡 述CSF-1R抗體之配體)、山羊多株抗CSF-1R抗體ab10676(abcam)。使用抗CSF-1R抗體Mab3291(R&D-Systems)作為參考對照。使用抗CCR5 m<CCR5>Pz03.1C5(於2004年8月18日以DSM ACC 2683保藏於DSMZ)作為陰性對照。
1.2.SM、CXIIG6、ab10676及MAB3291顯示結合至CSF-1R-ECD及del D4(參見圖3f及3e)。
1.2.SM、CXIIG6、ab10676及MAB3291之結合比顯著高於1：50(=0.02)。陰性對照抗體m<CCR5>Pz03.1C5不顯示任何結合(如預期)。
實例5 在抗CSF-1R單株抗體治療下對3D培養之NIH3T3-CSF-1R重組細胞之生長抑制(CellTiterGlo分析)
將藉由逆轉錄病毒感染全長野生型CSF-1R(SEQ ID NO：62)或突變體CSF-1R L301S Y969F(SEQ ID NO：63)之表現載體之NIH 3T3細胞培養於聚HEMA(聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯))(Polysciences,Warrington,PA,USA))包覆之皿上的補充有2mM L-麩醯胺酸、2mM丙酮酸鈉及非必需胺基酸以及10%胎牛血清(Sigma,Taufkirchen, Germany)之DMEM高葡萄糖培養基(PAA,Pasching,Austria)中，以防止附著至塑膠表面。將細胞接種於將血清更換為5ng/ml亞硒酸鈉、10mg/ml運鐵蛋白、400μg/ml BSA及0.05mM 2-巰基乙醇之培養基中。在用100ng/ml hu CSF-1(人類CSF-1之149 aa活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181)；Biomol,DE，目錄號60530)治療時，表現wtCSF-1R之細胞形成三維生長(此特性稱為錨著獨立性)之緻密球體。該等球體非常類似於三維架構及原位實體腫瘤組織。突變體CSF-1R重組細胞能夠形成獨立於CSF-1配體之球體。在不同濃度之抗體存在下將球體培養物培育3天來測定IC50(抑制50%細胞活力之濃度)。使用CellTiterGlo分析藉由量測細胞之ATP含量來檢測細胞活力。
參考對照Mab R&D-Systems 3291不顯示對突變體CSF-1R重組細胞增殖之抑制。
在另一實驗中，研究本發明之抗CSF-1R抗體hMab 2F11-e7及抗CSF-1R抗體1.2.SM(置換WO 2009/026303中所闡述CSF-1R抗體之配體)、CXIIG6(置換WO 2009/112245中所闡述CSF-1R抗體之配體)、山羊多株抗CSF-1R抗體ab10676(abcam)及SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US，亦參見Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)。
在不同濃度之抗體存在下將球體培養物培育3天來測定IC30(抑 制30%細胞活力之濃度)。最大濃度為20μg/ml。使用CellTiterGlo分析藉由量測細胞之ATP含量來檢測細胞活力。
實例6 在抗CSF-1R單株抗體治療下對3D培養之BeWo腫瘤細胞之生長抑制(CellTiterGlo分析)
將BeWo絨毛膜癌細胞(ATCC CCL-98)培養於補充有10% FBS(Sigma)及2mM L-麩醯胺酸之F12K培養基(Sigma,Steinheim,Germany)中。將5×104個細胞/孔接種於含有補充有0.5% FBS及5% BSA之F12K培養基之96孔聚HEMA(聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯))包覆之板中。同時，添加200ng/ml huCSF-1(人類CSF-1之149 aa活性片段(SEQ ID NO：86之aa 33-181))及10μg/ml不同的抗CSF-1R單株抗體且培育6天。使用CellTiterGlo分析藉由量測細胞之ATP含量(以相對光單位(RLU)表示)來檢測細胞活力。在用不同的抗CSF-1R抗體(10μg/ml)治療BeWo球體培養物時，觀察到對CSF-1誘導之生長之抑制。為計算抗體介導之抑制，自所有樣品減去未受刺激BeWo細胞之平均RLU值。將CSF-1刺激細胞之平均RLU值隨意設定為100%。計算經CSF-1刺激且經抗CSF-1R抗體治療之細胞之平均RLU值，以CSF-1刺激之 RLU的%表示。表6顯示所計算之在抗CSF-1R單株抗體治療下對3D培養之BeWo腫瘤細胞之生長抑制的數據；圖2a及2b繪示正規化平均RLU值。
實例7 在抗CSF-1R單株抗體治療下對人類巨噬細胞分化之抑制(CellTiterGlo分析)
使用RosetteSepTM人類單核球富集混合劑(StemCell Tech.目錄號15028)自外周血分離人類單核球。在37℃及5% CO2下在加濕氣氛中，將所富集單核球群接種於96孔微量滴定板(2.5×104個細胞/孔)中之補充有10% FCS(GIBCO目錄號011-090014M)、4mM L-麩醯胺酸(GIBCO目錄號25030)及1×PenStrep(Roche目錄號1 074 440)之100μl RPMI 1640(Gibco目錄號31870)中。當將150ng/ml huCSF-1添加至培養基中時，可觀察到明顯分化成附著巨噬細胞。可藉由添加抗CSF-1R抗體來抑制此分化。此外，單核球存活率受影響且可藉由CellTiterGlo(CTG)分析來分析。根據抗體治療對單核球存活率之濃度依賴性抑制，計算IC50(參見表7)。
在單獨測試系列中，Mab 2 F11之人類化形式(例如hMab 2F11-c11、hMab 2F11-d8、hMab 2F11-e7、hMab 2F11-f12)顯示以下IC50值：0.07μg/ml(hMab 2F11-c11)、0.07μg/ml(hMab 2F11-d8)、0.04μg/ml(hMab 2F11-e7)及0.09μg/ml(hMab 2F11-f12)。
實例8 在抗CSF-1R單株抗體治療下對食蟹猴巨噬細胞分化之抑制(CellTiterGlo分析)
根據製造商之描述使用CD14微球非人類靈長類動物套組(Miltenyi Biotec目錄號130-091-097)自外周血分離食蟹猴單核球。在37℃及5% CO2下在加濕氣氛中，將所富集單核球群接種於96孔微量滴定板(1-3×104個細胞/孔)中之補充有10% FCS(GIBCO目錄號011-090014M)、4mM L-麩醯胺酸(GIBCO目錄號25030)及1×PenStrep(Roche目錄號1 074 440)之100μl RPMI 1640(Gibco目錄號31870)中。當將150ng/ml huCSF-1添加至培養基中時，可觀察到明顯分化成附著巨噬細胞。可藉由添加抗CSF-1R抗體來抑制此分化。此外，單核球存活率受影響且可藉由CellTiterGlo(CTG)分析來分析。在濃度為5μg/ml之抗體治療下分析活力(參見表8)。
* 4個實驗之平均值(3個實驗使用鼠類，1個實驗使用嵌合mAb)
** 兩個僅使用鼠類mAb之實驗之平均值
實例9 在抗CSF-1R單株抗體治療下對人類M1及M2巨噬細胞分化之抑制(CellTiterGlo分析)
使用RosetteSepTM人類單核球富集混合劑(StemCell Tech.目錄號15028)自外周血分離人類單核球。在37℃及5% CO2下在加濕氣氛中，將所富集單核球群接種於96孔微量滴定板(2.5×104個細胞/孔)中之補充有10% FCS(GIBCO目錄號011-090014M)、4mM L-麩醯胺酸(GIBCO目錄號25030)及1×PenStrep(Roche目錄號1 074 440)之100μl RPMI 1640(Gibco目錄號31870)中。當將100ng/ml huCSF-1添加至培養基中並保持6天時，可觀察到明顯分化成具有延長形態之附著M2巨噬細胞。當將100ng/ml huGM-CSF添加至培養基中並保持6天時，可觀察到明顯分化成具有圓形形態之附著M1巨噬細胞。此分化與某些標記物(例如對於M2巨噬細胞為CD163且對於M1巨噬細胞為CD80或高II類MHC)之如藉由流式細胞術所評價之表現相關。用PBS洗滌細胞，且若附著，則使用於PBS中之5mM EDTA溶液(在37℃下保持20min)分離。然後將細胞充分懸浮，用染色緩衝液(於PBS中之5% FCS)洗滌且在300×g下離心5min。將沈澱物重懸浮於1ml染色緩衝液中，且在Neubauer室中對細胞進行計數。將約1×10e5個細胞轉移至每一FACS管中，在300×g下離心5min且重懸浮於染色緩衝液中。藉由在冰上在染色緩衝液中與1μg人類IgG/2.5×10e4個細胞(JIR目錄號009- 000-003)一起培育20min來封阻Fcγ受體。然後混合細胞與1.5μl抗體/2.5×10e4個細胞用於CD80及CD163檢測，而將5μl抗體/2.5×10e4個細胞用於II類MHC檢測：經PE標記之小鼠抗人類CD163(BD Bioscience目錄號556018)、經PE標記之小鼠抗人類CD80(BD Bioscience目錄號557227)及經Alexa 647標記之小鼠抗人類II類MHC(Dako目錄號M0775)。藉由使用Zenon Alexa 647小鼠IgG標記套組(Invitrogen目錄號Z25008)將Alexa 647標記偶聯至抗體。在冰上培育1小時後，用染色緩衝液將細胞洗滌兩次，重懸浮且在FACS Canto II下量測。
唯一地，可藉由添加人類化抗CSF-1R抗體hMab 2F11-e7來抑制特徵在於表現CD163、不存在CD80及低II類MHC表現之M2巨噬細胞分化。此外，M2而非M1巨噬細胞存活率受影響且可藉由CellTiterGlo(CTG)分析來分析。藉由抗體治療7天對巨噬細胞存活率之濃度依賴性抑制繪示於圖5a中。藉由流式細胞術評價之M1及M2巨噬細胞標記物之表現顯示於圖5b中。
實例10 抗CSF-1R抗體對人類CSF-1R之結合親和力之測定
儀器：BIACORE® A100
晶片：CM5(Biacore BR-1006-68)
偶合：胺偶合
緩衝液：PBS(Biacore BR-1006-72)，pH 7.4，35℃
為進行親和力量測，已將36μg/ml抗小鼠Fcγ抗體(來自山羊，Jackson Immuno Research JIR115-005-071)偶合至晶片表面用於捕獲抗CSF-1R抗體。在溶液中添加不同濃度之人類CSF-1R細胞外結構域(CSF-1R-ECD)(包括細胞外子結構域D1-D5)(SEQ ID NO：64)(R&D-Systems 329-MR或亞選殖之pCMV-presS-HisAvi標記-hCSF-1R-ECD)。藉由在35℃下注射1.5分鐘CSF-1R來量測締合；藉由在35℃下 用緩衝液將晶片表面洗滌10分鐘來量測解離。使用Langmuir 1：1模型來計算動力學參數。
在使用CSF-1R ECD(數據未顯示)之單獨biacore結合分析中，顯示抗體Mab 2F11及Mab 2E10與抗體Ab SC-2-4A5一定程度之競爭。然而，Mab 2F11/Mab 2E10並不與人類CSF-1R片段delD4結合，而AbSC-2-4A5結合至此delD4片段(參見實例4及圖3a)。因此，Mab 2F11/Mab 2E10之結合區明顯不同於Ab SC-2-4A5之結合區，但可能位於相鄰區域中。在該競爭分析中，抗體Mab 2F11及Mab 2E10並不與來自R&D-Systems之Mab3291競爭(數據未顯示)。
實例11 抗CSF-1R抗體與人類CSF-1R片段D1-D3之結合之測定
儀器：Biacore T100(GE Healthcare)
軟體：T100 Control，1.1.11版
B3000 Evaluation，4.01版
Scrubber，2.0a版
分析格式 晶片：CM5晶片
經由胺偶合之捕獲分子捕獲抗CSF-1R抗體。使用單循環動力學，注射5種濃度遞增之人類CSF-1R片段D1-D3(SEQ ID NO：66)。將人類CSF-1R片段D1-D3亞選殖至pCMV-presS-HisAvi標記表現載體 中。
使用抑制配體-受體相互作用之抗CSF-1R SC 2-4A5(Santa Cruz Biotechnology,US；Sherr,C.J.等人，Blood 73(1989)1786-1793)及Mab 3291(R&D-Systems)作為參考對照。
捕獲分子：抗小鼠Fcγ抗體(來自山羊，Jackson Immuno Reasearch JIR115-005-071)用於本發明抗體，且R&D-Systems對照Mab 3291及抗大鼠Fcγ抗體(來自山羊，Jackson Immuno Reasearch JIR112-005-071)用於參考多種抗CSF-1R SC 2-4A5。
捕獲分子之胺偶合
根據製造商之說明書進行標準胺偶合：運行緩衝液：HBS-N緩衝液，由EDC/NHS混合物活化，目標配體密度為2000RU；將捕獲Ab稀釋於偶合緩衝液NaAc(pH 4.5，c=10μg/mL)中；最後藉由注射1M乙醇胺來封阻剩餘之活化羧基。
在37℃下人類CSF-1R片段D1-D3與MAb<CSF-1R>結合之動力學特徵 運行緩衝液：PBS(Biacore BR-1006-72)
Mab<CSF-1R>在流動池2至4上之捕獲：流速為20μL/min，接觸時間90秒，c(Abs<CSF-1R>)=50nM，用運行緩衝液+1mg/mL BSA稀釋；
分析物樣品：
藉由在不再生的情況下以30μL/min之流速以濃度c=7.8nM、31.25nM、125nM、500nM及2000nM連續5次注射分析物來量測單循環動力學。每一注射持續30秒，且其後係120秒解離期(對於前4次注射)，且最後最高濃度(=最後一次注射)之解離期係1200秒。
在每一循環後使用10mM甘胺酸(pH 1.5，Biacore BR-1003-54)、接觸時間60秒、流速30μL/min來實施最終再生。
利用模型「與負荷物(draft)之1：1結合之滴定動力學」藉由使用一 般雙重參考(對照參考：分析物與捕獲分子之結合；流動池：子結構域CSF-1R濃度「0」作為空白對照)及計算來計算動力學參數。
抗體Mab 2F11、Mab 2E10及Mab 1G10顯示不與人類CSF-1R片段D1-D3結合。
參考對照Ab SC-2-4A5亦不與人類CSF-1R片段D1-D3結合。
參考對照Mab R&D-Systems 3291顯示結合至人類CSF-1R片段D1-D3。
實例12 在食蟹猴中抑制CSF-1R期間CSF-1含量增加
血清CSF-1含量提供中和抗人類CSF-1R二聚化抑制劑hMab 2F11-e7之活性之CSF-1R之藥物效應動力學標記物。向每個劑量組(1mg/kg及10mg/kg)之一隻雄性及一隻雌性食蟹猴靜脈內投與抗CSF1R抗體hMab 2F11-e7。在治療前(投藥前)1週、投藥後2小時、24小時、48小時、72小時、96小時、168小時及另外兩週之每週收集血液樣品來分析CSF-1含量。根據製造商之說明書(R&D Systems,UK)使用市售ELISA套組(Quantikine®人類M-CSF)來測定CSF-1含量。藉由與套組中所提供之CSF-1標準曲線樣品進行比較來確定猴CSF-1含量。
投與hMab 2F11-e7使CSF-1顯著增加約1000倍，此端視持續48hr(1mg/kg)抑或或15天(10mg/kg)之投與劑量而定。因此，與置換抗體之配體相比，CSF-1R之二聚化抑制劑提供並不直接與顯著上調之配體競爭結合受體的優點。(結果顯示於圖4中)
實例13 在皮下同基因MC38結腸癌模型中在抗CSF-1R單株抗體與化學療法或癌症免疫療法組合治療下對腫瘤生長之抑制
在37℃下在水飽和氣氛中在5% CO2下，將鼠類結腸直腸腺癌細胞系MC-38之細胞(自Hope市、California,USA之Beckman研究所獲得)培養於補充有10% FCS及2mM L-麩醯胺酸之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM,PAN Biotech)中。在接種當天，用PBS自培養燒瓶收穫MC38腫瘤細胞且及轉移至培養基中，離心，洗滌一次並重懸浮於PBS中。為注射細胞，將最終效價調節至1×107個細胞/ml。隨後，將100μl此懸浮液(1×106個細胞)經皮下接種於7-9週齡雌性C57BL/6N小鼠(自Charles River,Sulzfeld,Germany獲得)中。使用對照抗體(MOPC-21；Bio X Cell,West Lebanon)、抗鼠類CSF-1R mAb<小鼠CSF1R>抗體以30mg/kg之週劑量單獨或與TLR9促效劑CpG ODN 1826(ODN 1826，B類CpG ODN,VacciGrade,InvivoGen,100μg瘤周，1×)組合經腹膜內治療。每週兩次量測腫瘤體積且平行監測動物體重。
在具有相當設置之單獨研究中，對來自所指示治療組之原發性腫瘤實施切除、稱重且使其經歷FACS分析。在如所指示之第20-25個研究日之間收集原發性腫瘤材料。為獲得適用於流式細胞術分析之單細胞懸浮液，藉由使用McIlwain組織切碎機將腫瘤切碎。隨後，將腫瘤小塊重懸浮於補充有膠原酶I、分散酶II及DNA酶I之RPMI培養基中，在37℃下培育且使細胞懸浮液通過網篩。根據製造商之說明書 (Miltenyi)藉由磁性細胞分離來富集CD45陽性細胞。簡言之，用偶聯有APC(BD，目錄號559864)之抗小鼠CD45標記細胞且用抗APC微球分離。為分析CD8+ T細胞，用0.2μg/ml DAPI(Roche，目錄號10236276001)及PE偶聯之CD8抗體(eBioscience目錄號12-0081-83)或PE偶聯之CD4抗體(eBioscience，目錄號2-0041-83)對該等CD45陽性細胞進行染色。用FACS Canto II獲取數據且隨後用FlowJo軟體分析。 僅分析活細胞(對DAPI陰性細胞設門)以排除細胞碎片及死細胞。
當與對照抗體治療相比時，使用<小鼠CSF1R>抗體之單療法抑制原發性腫瘤生長(TGI：67%，TCR：0.38，CI：0.15-0.64)。TLR9促效劑(CpG ODN 1826)單療法亦具有針對MC38原發性腫瘤生長之效應(TGI：74%，TCR：0.28，CI：0.10-0.50)。將<小鼠CSF1R>抗體添加至TLR9促效劑療法中使得抗腫瘤功效明顯優於單獨TLR9促效劑治療(TGI：95%，TCR：0.08，CI：-0.11-0.28)。(參見表11)。
對腫瘤進展之評估
除評價治療2週後之中值腫瘤體積外，隨後研究個別腫瘤直至進展700mm3之進展(圖1(CpG係TLR9促效劑CpG ODN 1826)及表11)。
IgG對照治療組之中值進展時間700mm3為21天。藉由使用 <CSF1R>抗體單療法來治療稍微改良中值進展時間(24天)。
使用TLR9促效劑之單療法產生24天之中值進展時間。與抗CSF-1R抗體單療法或TLR9促效劑單療法相比，將TLR9促效劑(CpG)添加至抗CSF-1R抗體療法中使中值進展時間(46天)獲得統計學上顯著之大於加和之改良。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
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<223> 源自S228P突變之IgG4之人類重鏈恒定區
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<223> 突變體CSF-1R L301S Y969F
<400> 63
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<211> 493
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人類CSF-1R細胞外結構域
<400> 64
<210> 65
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人類CSF-1R片段delD4
<400> 65
<210> 66
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人類CSF-1R片段D1-D3
<400> 66
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 信號肽
<400> 67
<210> 68
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引子
<400> 68
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 69
<210> 70
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 70
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 71
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 72
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 74
<210> 75
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 75
<210> 76
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 76
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 77
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 78
<210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 79
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 80
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 81
<210> 82
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 82
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 83
<210> 84
<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 84
<210> 85
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 人類CSF-1R片段結構域D4-D5
<400> 85
<210> 86
<211> 554
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
<210> 87
<211> 242
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
<210> 88
<211> 1032
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG ODN 2216
<400> 89
<210> 90
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG ODN PB4
<400> 90
<210> 91
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG ODN 1002
<400> 91
<210> 92
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG-7909(阿
托莫德)
<400> 92
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG-685
(GNKG168)
<400> 93
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG-684
<400> 94
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 含有未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸CpG-28
<400> 95

Claims (21)

  1. 一種結合至人類CSF-1R之抗體，其中該抗體與類鐸(Toll-like)受體9(TLR9)促效劑組合投與用於治療癌症。
  2. 如請求項1之抗體，其中該癌症之特徵進一步在於CSF-1R表現或過度表現。
  3. 如請求項1之抗體，其中該癌症係乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。
  4. 一種以下組合之用途i)結合至人類CSF-1R之抗體及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑，其用於製造用來治療癌症之藥劑。
  5. 如請求項4之用途，其中該癌症之特徵進一步在於CSF-1R表現或過度表現。
  6. 如請求項4之用途，其中該癌症係乳癌、結腸直腸癌、黑素瘤、頭頸癌、肺癌或前列腺癌。
  7. 一種結合至人類CSF-1R之抗體，其特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)，其用於a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞的細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性)表 現CSF-1R之單核球細胞分化成巨噬細胞，其中該抗體係與TLR9促效劑組合投與。
  8. 一種以下組合之用途i)結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之(二聚化)結構域D4至D5(SEQ ID No：85)之抗體及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑，其用於製造用於以下之藥劑a)抑制CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1配體依賴性表現CSF-1R之腫瘤細胞的細胞增殖；b)抑制具有CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的細胞增殖；c)抑制(CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性)表現CSF-1R之單核球及巨噬細胞之細胞存活；及/或d)抑制(CSF-1R配體依賴性及/或非CSF-1R配體依賴性)表現CSF-1R之單核球細胞分化成巨噬細胞。
  9. 一種結合至人類CSF-1R之抗體，其用於治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤的患者，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加，且其中該抗CSF-1R抗體係與TLR9促效劑組合投與。
  10. 如請求項1至3、7及9之抗體，其中該TLR9促效劑之特徵在於誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12。
  11. 如請求項1至3、7及9之抗體，其中該TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序(motifs)之寡去氧核苷酸(CpG ODNs)。
  12. 如請求項1至3、7及9之抗體，其中該抗體之特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之結構域D4至D5(SEQ ID No：85)。
  13. 一種以下組合之用途 i)結合至人類CSF-1R之抗體及ii)類鐸受體9(TLR9)促效劑，其用於製造用來治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤之患者的藥劑，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加。
  14. 如請求項4至6、8及13中任一項之用途，其中該TLR9促效劑之特徵在於誘導漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)中之IFN-α、IL-6及/或IL-12。
  15. 如請求項4至6、8及13中任一項之用途，其中該TLR9促效劑係含有胞嘧啶-磷酸-鳥苷(CpG)基序之寡去氧核苷酸(CpG ODNs)。
  16. 如請求項4至6、8及13中任一項之用途，其中該抗體之特徵在於結合至人類CSF-1R之細胞外結構域之結構域D4至D5(SEQ ID No：85)。
  17. 如請求項1至3、7及9中任一項之抗體，其中該抗體之特徵在於該抗體不與人類CSF-1R片段delD4(SEQ ID NO：65)結合。
  18. 如請求項1至3、7及9中任一項之抗體，其中a)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：7，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：8，b)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：15，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：16；c)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：75，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：76；d)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：83，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：84；e)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：23，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：24，或 f)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：31，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：32，或g)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：39，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：40，或h)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：47，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：48，或i)該重鏈可變結構域為SEQ ID NO：55，且該輕鏈可變結構域為SEQ ID NO：56。
  19. 如請求項1至3、7及9中任一項之抗體，其中a)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：1之CDR3區、SEQ ID NO：2之CDR2區及SEQ ID NO：3之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：4之CDR3區、SEQ ID NO：5之CDR2區及SEQ ID NO：6之CDR1區，或b)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：9之CDR3區、SEQ ID NO：10之CDR2區及SEQ ID NO：11之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：12之CDR3區、SEQ ID NO：13之CDR2區及SEQ ID NO：14之CDR1區，或c)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：17之CDR3區、SEQ ID NO：18之CDR2區及SEQ ID NO：19之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：20之CDR3區、SEQ ID NO：21之CDR2區及SEQ ID NO：22之CDR1區，或d)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：25之CDR3區、SEQ ID NO：26之CDR2區及SEQ ID NO：27之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：28之CDR3區、SEQ ID NO：29之CDR2區及SEQ ID NO：30之CDR1區，或e)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：33之CDR3區、SEQ ID NO：34之CDR2區及SEQ ID NO：35之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：36之CDR3區、SEQ ID NO：37之CDR2區及SEQ ID NO：38之CDR1區，或f)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：41之CDR3區、SEQ ID NO：42之CDR2區及SEQ ID NO：43之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：44之CDR3區、SEQ ID NO：45之CDR2區及SEQ ID NO：46之CDR1區，或g)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：49之CDR3區、SEQ ID NO：50之CDR2區及SEQ ID NO：51之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：52之CDR3區、SEQ ID NO：53之CDR2區及SEQ ID NO：54之CDR1區；或h)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：69之CDR3區、SEQ ID NO：70之CDR2區及SEQ ID NO：71之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：72之CDR3區、SEQ ID NO：73之CDR2區及SEQ ID NO：74之CDR1區，或i)該重鏈可變結構域包括SEQ ID NO：77之CDR3區、SEQ ID NO：78之CDR2區及SEQ ID NO：79之CDR1區，且該輕鏈可變結構域包括SEQ ID NO：80之CDR3區、SEQ ID NO：81之CDR2區及SEQ ID NO：82之CDR1區。
  20. 如請求項1至3、7及9中任一項之抗體，其中該抗體係人類IgG1子類或人類IgG4子類抗體。
  21. 一種結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於製造用來治療患有表現CSF-1R之腫瘤或患有具有表現CSF-1R之巨噬細胞浸潤之腫瘤之患者的藥劑，其中該腫瘤之特徵在於CSF-1R配體增加，且其中該抗CSF-1R抗體係與有效量之TLR9促效劑組合投與。
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