TW201526915A - 抗ａｎｇ２抗體與ｃｄ４０促效劑之組合療法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於結合至人類血管生成素2(angiopoietin 2；ANG-2)之抗體與CD40促效劑之組合療法。

Description

抗ANG2抗體與CD40促效劑之組合療法
本發明係關於結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體與CD40促效劑之組合療法。
在血管生成及血管重塑中，起關鍵作用之血管生成素係生長腫瘤之促血管生成物質之部分。重要的是，其係一種導致抗VEGF療法期間之繼發性抗性之主要因素(Saharinen,P.等人，Trends Mol Med 17(2011)347-362)。血管生成素-1(Ang1)及血管生成素-2(Ang2)二者皆係Tie2受體配體。Ang1往往會使血管穩定且成熟(Yancopoulos,G.D.等人，Nature 407(2000)242-248)，而Ang2則藉由使血管去穩定促進腫瘤血管生成及生長。因此，Ang2之功能與Ang1相反(Cascone,T.等人，J Clin Oncol 30(2012)441-444)。據此已觀察到阻斷Ang2而非Ang1會使腫瘤血管正規化(Falcon,B.L.、H.Hashizume等人，Am J Pathol 175(2009)2159-2170)，且有助於克服針對抗VEGF療法之獲得性抗性(Chae,S.S.、W.S.Kamoun等人，Clin Cancer Res 16(2010)3618-3627；Thomas,M.等人，PLoS One 8(2013)e54923)。
免疫調節抗體可提供治療方式且可用於直接加強抗腫瘤免疫反應或用作抗癌疫苗之佐劑(Melero,I.等人，Nat Rev Cancer 7(2007)95-106)。促效性抗CD40抗體是構成該等試劑之一種最有效的類別。 CD40係在抗原呈遞細胞(APC)(例如樹突狀細胞、B細胞及巨噬細胞)上表現之腫瘤壞死因子超家族之細胞表面成員。使用抗CD40促效劑之臨床前研究表明，藉由交聯抗原呈遞細胞(APC)上之抗體觸發CD40可取代通常經由CD40配體提供之CD4輔助T細胞，且有助於CD8效應T細胞之活化以及擴增(Li,F.等人，Science 333(2011)1030-1034)。 另外，CD40活化之巨噬細胞亦可發揮定向殺腫瘤功能(Beatty,G.L.等人，Science 331(2011)1612-1616)；Vonderheide,R.H.等人，Oncoimmunology 2(2013)e23033)。
免疫阻抑性腫瘤微環境會是造成抗腫瘤免疫及免疫治療性治療方式之主要障礙(Beatty,G.L.等人，Science 331(2011)1612-1616)。
本發明者已發現，抗ANG2抗體會增強CD40促效劑治療癌症或延遲腫瘤進展或患有例如具有實體腫瘤之癌症之患者的存活期之效能。延遲進展、較長存活期以及降低的劑量與較低副作用風險之潛能代表針對患者之主要益處。
令人驚奇地，使用抗ANG2抗體與CD40促效劑之組合治療腫瘤展示對腫瘤進展時間及存活時間之強協同效應(而抗VEGF抗體與CD40促效劑組合之組合僅展示較小效應)。
本發明之一態樣係結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與，a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
本發明之另一態樣係CD40促效劑，其中CD40促效劑與結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體組合投與，a)用於治療癌症或延遲癌 症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
在一態樣中，本發明提供用於以下用途之方法：a)治療癌症或延遲癌症之進展，或b)延長患有癌症之患者之存活期，或c)刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感，其中該方法包含向有需要之患者投與有效量之抗ANG2抗體及有效量之CD40促效劑之步驟。
在另一態樣中，本發明提供抗ANG2抗體於製造用來治療癌症之藥劑中之用途，其中該抗體係與CD40促效劑一起投與。
本發明之另一態樣係製造用於以下用途之藥劑中的結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體：a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感；其中該抗體係與CD40促效劑一起投與。
本發明之另一態樣係用於以下用途之藥劑之製造中的CD40促效劑： a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感；其中CD40促效劑係與結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體一起投與。
本發明之另一態樣係結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體與CD40促效劑之組合，a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
本發明之另一態樣係用於以下用途之藥劑之製造中的結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體與CD40促效劑之組合：a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
在一態樣中，本發明提供用於以下用途之方法：a)治療癌症或延遲癌症之進展，或b)延長患有癌症之患者之存活期，或c)刺激免 疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感，其中該方法包含向有需要之患者投與有效量之抗ANG2抗體及有效量之CD40促效劑之步驟。
本發明之另一態樣係結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體及CD40促效劑，其組合用於a)治療癌症或延遲癌症之進展，或b)延長患有癌症之患者之存活期，或c)刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
本發明之另一態樣係結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體及CD40促效劑用於製造用於以下用途之藥劑：a)治療癌症或延遲癌症之進展，或b)延長患有癌症之患者之存活期，或c)刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
本發明之另一態樣係結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體及CD40促效劑組合在製造用於以下用途之藥劑中的用途：a)治療癌症或延遲癌症之進展，或b)延長患有癌症之患者之存活期，或c)刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細 胞活性)，或d)使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
在一實施例中，抗ANG2抗體係人類或人類化抗體。
較佳地，抗ANG2抗體係以小於1.0×10-8mol/l之KD值特異性結合至人類ANG2，如藉由表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。
抗ANG2抗體較佳係IgG抗體，且更佳地抗ANG2抗體為人類IgG1或IgG4子類。
在一較佳實施例中，抗ANG2抗體抑制人類ANG-2與TIE2受體之相互作用，且IC50為15nM或更小。
在一實施例中，CD40促效劑係促效性CD40抗體或促效性CD40L多肽。
在一較佳實施例中，CD40促效劑係促效性CD40抗體。
在一實施例中，i)抗ANG2抗體包含(a)SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)促效性CD40抗體包含(a)SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：7之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變結構域胺基酸序列；在一較佳實施例中
i)抗ANG2抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或且ii)促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或在一較佳實施例中，抗ANG2抗體係結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體。
在一較佳實施例中，i)結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；及SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
在一較佳實施例中
i)結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列；且ii)促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
在一較佳實施例中，癌症包含實體腫瘤。
在一較佳實施例中，癌症係結腸直腸癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌。
圖1 抗ANG2抗體(及抗ANG2+抗VEGF抗體(=抗VEGF/ANG2))與促效性CD40抗體之組合之活體內抗腫瘤效能(延遲癌症之進展(腫瘤生長)並延長所治療患者之存活期)-該圖表示3個獨立實驗之匯總數據。使用圖中所指示之抗體組合治療小鼠。
圖2 抗ANG2抗體(雙特異性)與促效性CD40抗體之組合在皮下同基因MC38結腸癌模型中之活體內抗腫瘤效能。
2A：促效性CD40抗體單療法(未填充之圓形)與對照(經填充正方形)相比之腫瘤生長抑制。
2B：雙特異性ANG2/VEGF抗體單療法(未填充之正方形)與對照(經填充正方形)相比之腫瘤生長抑制。
2C：促效性CD40抗體及雙特異性ANG2/VEGF抗體之組合(未填充之三角形)與對照(經填充正方形)相比之腫瘤生長抑制。
本發明係關於用於治療患者之癌症之方法中的抗ANG2抗體，該方法包含向個體投與抗ANG2抗體及CD40促效劑，且本發明者在本文中展示藥劑之此組合可延遲癌症之進展(腫瘤生長)並延長所治療患者之存活期。
人類血管生成素-2(ANG-2)(另一選擇為縮寫成ANGPT2或ANG2)(SEQ ID No：15)闡述於Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60及Cheung,A.H.等人，Genomics 48(1998)389-91中。發現血管生成素-1及-2(ANG-1(SEQ ID No：108)及ANG-2(SEQ ID No：107)作為在血管內皮內選擇性表現之酪胺酸激酶家族Ties之配體。 Yancopoulos,G.D.等人，Nature 407(2000)242-48。血管生成素家族現存在四個確定成員。血管生成素-3及-4(Ang-3及Ang-4)可代表小鼠及人類中同一基因座之廣泛分叉之對應部分。Kim,I.等人，FEBS Let,443(1999)353-56；Kim,I.等人，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1及ANG-2最初在組織培養實驗中分別鑑別為促效劑及拮抗劑(關於ANG-1參見：Davis,S.等人，Cell,87(1996)1161-1169；且關於ANG-2參見：Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60)。 所有已知血管生成素皆主要結合至Tie2，且Ang-1及-2二者以3nM(Kd)之親和力結合至Tie2。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。展示Ang-1支持EC存活且促進內皮完整性，Davis,S.等人，Cell,87(1996)1161-1169；Kwak,H.J.等人，FEBS Lett 448(1999)249-53；Suri,C.等人，Science 282(1998)468-71；Thurston,G.等人，Science 286(1999)2511-14；Thurston,G.等人，Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反效應且在存活因子VEGF或鹼性纖維母細胞生長因子不存在下促進血管去穩定及消退。Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。然而，對ANG-2功能之許多研究已表明更複雜情形。ANG-2可係在血管出芽及血管消退二者中起作用之血管重塑之複雜調控劑。表現分析揭露在成人血管生成性出芽環境下ANG-2係與VEGF一起快速誘導，而在血管消退環境下ANG-2係在VEGF不存在下被誘導，此支持ANG-2之該等作用。Holash,J.等人，Science 284(1999)1994-98；Holash,J.等人，Oncogene 18(1999)5356-62。與背景依賴性作用一致，ANG-2特異性結合至由Ang-1活化之同一內皮特異性受體Tie-2，但對其活化具有背景依賴性效應。 Maisonpierre,P.C.等人，Science 277(1997)55-60。
術語「人類ANG2」係指人類蛋白質血管生成素2(SEQ ID NO：15)。如本文所使用，「結合至人類ANG2」或「特異性結合至人類 ANG2」或「結合至人類ANG2者」或「抗ANG2抗體」係指以KD值為1.0×10-8mol/l或更低、在一實施例中KD值為1.0×10-9mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類ANG2抗原之抗體。結合親和力係使用標準結合分析(例如表面電漿子共振技術(BIAcore®,GE-Healthcare Uppsala,Sweden))來測定。因此，如本文所使用之「結合至人類ANG2之抗體」係指以KD 1.0×10-8mol/l或更低(在一實施例中1.0×10-8mol/l-1.0×10-13mol/l)、在一實施例中KD 1.0×10-9mol/l或更低(在一實施例中1.0×10-9mol/l-1.0×10-13mol/l)之結合親和力特異性結合至人類ANG2抗原之抗體。
通常，可用於本文所述治療之結合至人類ANG2之抗體詳細揭示並闡述於例如WO2010/069532(例如較佳抗ANG2抗體<ANG-2>Ang2i_LC06、<ANG-2>Ang2i_LC07或<ANG-2>Ang2i_LC10)；WO2011/014469(例如較佳抗ANG2抗體H1 H685P)；US2011/150895(例如抗ANG2抗體SAIT-Ang-2-5、SAIT-Ang-2-6或其人類化形式)；WO2009/097325(例如抗體MEDI 1/5，其特徵在於MEDI 1之VL(WO 2009/097325中之SEQ ID No：3)及MEDI 5之VH(WO2009/097325中之SEQ ID No：7))、WO2009/105269；WO 2006/068953或WO 03/030833中。
在一較佳實施例中，可用於本文所述治療之結合至人類ANG2之抗體之特徵包含(a)SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
在一較佳實施例中，抗ANG2抗體係結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體。
通常，可用於本文所述治療之結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體詳細揭示並闡述於例如WO2010/040508、WO 2011/117329或WO2012/131078中。WO2010/069532、WO2011/014469、US2011/150895、WO2009/097325、WO2009/105269、WO 2006/068953或WO 03/030833中所闡述之ANG2抗體之VH及VL亦可用於使用WO2010/040508、WO 2011/117329或WO2012/131078中所闡述之抗VEGF結合臂及結構的雙特異性抗體內。
在一較佳實施例中，結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；及SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
在一較佳實施例中
結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列。
CD40抗原係屬腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族之50kDa細胞表面糖蛋白。(Stamenkovic等人，EMBO J.8：1403-10(1989)。)CD40在許多正常及腫瘤細胞類型中表現，該等細胞類型包括B淋巴球、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、胸腺上皮、內皮細胞、纖維母細胞及平滑肌細胞。(Paulie S.等人，Cancer Immunol.Immunother.20：23-8(1985)；Banchereau J.等人，Adv.Exp.Med.& Biol.378：79-83(1995)；Alderson M.R.等人，J.of Exp.Med.178：669-74(1993)；Ruggiero G.等人，J.of Immunol.156：3737-46(1996)；Hollenbaugh D. 等人，J.of Exp.Med.182：33-40(1995)；Yellin M.J.等人，J.of Leukocyte Biol.58：209-16(1995)；及Lazaar A.L.等人，J.of Immunol.161：3120-7(1998)。)CD40在所有B淋巴瘤及70%之所有實體腫瘤中表現。儘管組成型表現，但CD40在抗原呈遞細胞中藉助成熟信號(例如LPS、IL-1β、IFN-γ及GM-CSF)上調。
CD40活化在調控體液及細胞免疫反應中起關鍵作用。無CD40活化之抗原呈遞可導致耐受，而CD40信號傳導可逆轉該耐受，增強所有抗原呈遞細胞(APC)之抗原呈遞，分泌輔助細胞介素及趨化因子，增加共刺激分子表現及信號傳導，並刺激免疫細胞之細胞溶解活性。 CD40在B細胞增殖、成熟及類別轉換中起關鍵作用。(Foy T.M.等人，Ann.Rev.of Immunol.14：591-617(1996)。)中斷CD40信號傳導途徑會導致異常血清免疫球蛋白同種型分佈、缺乏CD4+ T細胞引發及二次體液反應缺陷。舉例而言，X連鎖高IgM症候群係與人類CD40L基因之突變相關之疾病，且其特徵在於使受侵襲個體無法產生除IgM同種型抗體外之抗體，此指示CD40與CD40L之間之產生性相互作用為有效免疫反應所必需。
藉助CD40L之CD40接合使得CD40細胞質結構域與TRAF(TNF-R締合因子)締合。(Lee H.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1421-6(1999)；Pullen S.S.等人，Biochemistry 37：11836-45(1998)；Grammar A.C.等人，J.of Immunol.161：1183-93(1998)；Ishida T.K.等人，Proc.Acad Acad.Sci.USA 93：9437-42(1996)；Pullen S.S.等人，J.of Biol.Chem.274：14246-54(1999))。與TRAF之相互作用可使NFκ B及Jun/AP1途徑二者活化。(Tsukamoto N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1234-9(1999)；Sutherland C.L.等人，J.of Immunol.162：4720-30(1999)。)端視細胞類型，此信號傳導可增強以下各項之分泌：細胞介素，例如IL-6(Jeppson J.D.等人，J.of Immunol.161：1738-42(1998)；Uejima Y.等人，Int.Arch.of Allergy & Immunol.110：225-32,(1996)、IL-8(Gruss H.J.等人，Blood 84：2305-14(1994)；von Leoprechting A.等人，Cancer Res.59：1287-94(1999)；Denfeld R.W.等人，Europ.J.of Immunol.26：2329-34(1996))、IL-12(Cella M.等人，J.of Exp.Med.184：747-52(1996)；Ferlin W.G.等人，Europ.J.of Immunol.28：525-31(1998)；Armant M.等人，Europ.J.of Immunol.26：1430-4(1996)；Koch F.等人，J.of Exp.Med.184：741-6(1996)；Seguin R.及L.H.Kasper,J.of Infect.Diseases 179：467-74(1999)；Chaussabel D.等人，Infection & Immunity 67：1929-34(1999))、IL-15(Kuniyoshi J.S.等人，Cellular Immunol.193：48-58(1999))，及趨化因子(MIP1α、MIP1β、RANTES及其他)(McDyer J.F.等人，J.of Immunol.162：3711-7(1999)；Schaniel C.等人，J.of Exp.Med.188：451-63(1998)；Altenburg A.等人，J.of Immunol.162：4140-7(1999)；Deckers J.G.等人，J.of the Am.Society of Nephrology 9：1187-93(1998))；增加I類及II類MHC之表現(Santos-Argumedo L.等人，Cellular Immunol.156：272-85(1994))，並增加黏附分子(例如，ICAM)(Lee H.H.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96：1421-6(1999)；Grousson J.等人，Archives of Dermatol.Res.290：325-30(1998)；Katada Y.等人，Europ.J.of Immunol.26：192-200(1996)；Mayumi M.等人，J.of Allergy & Clin.Immunol.96：1136-44(1995)；Flores-Romo L.等人，Immunol.79：445-51(1993))及共刺激分子(例如，B7)之表現(Roy M.等人，Europ.J.of Immunol.25：596-603(1995)；Jones K.W.及C.J.Hackett,Cellular Immunol.174：42-53(1996)；Caux C.等人，Journal of Exp.Med.180：1263-72(1994)；Kiener P.A.等人，J.of Immunol.155：4917-25(1995))。由CD40接合誘導之細胞介素會增強T細胞存活及活化。
除增強細胞及免疫功能外，CD40活化之效應包括：藉由趨化因子及細胞介素之細胞招募及分化；活化單核球；增加細胞溶解性T淋巴球(CTL)及天然殺傷(NK)細胞之細胞溶解活性；誘導CD40陽性腫瘤之凋亡；增強CD40陽性腫瘤之免疫原性；及產生腫瘤特異性抗體。CD40活化在細胞介導之免疫反應中之作用亦已充分建立，且將其綜述於：Grewal等人，Ann.Rev.of Immunol.16：111-35(1998)；Mackey等人，J.of Leukocyte Biol.63：418-28(1998)；及Noelle R.J.,Agents & Actions--增刊49：17-22(1998)中。
使用交叉引發模型系統之研究展示APC之CD40活化可替代對產生細胞溶解T淋巴球(CTL)之輔助T細胞之需要。(Bennett等人，Nature 393：478-480(1998)。)來自CD40L缺陷性小鼠之證據指示在輔助T細胞引發中明確需要CD40信號傳導。(Grewal I.S.等人，Science 273：1864-7(1996)；Grewal I.S.等人，Nature 378：617-20(1995)。)CD40活化將帶有抗原之原本耐受原性B細胞轉化成勝任APC。(Buhlmann J.E.等人，Immunity 2：645-53(1995)。)CD40活化誘導臍帶血祖細胞成熟並分化成樹突狀細胞。(Flores-Romo L.等人，J.of Exp.Med.185：341-9(1997)；Mackey M.F.等人，J.of Immunol.161：2094-8(1998)。)CD40活化亦誘導單核球分化成功能性樹突狀細胞。(Brossart P.等人，Blood 92：4238-47(1998)。)另外，CD40活化經由APC-CD40誘導之細胞介素增強NK細胞之細胞溶解活性(Carbone E.等人，J.of Exp.Med.185：2053-60(1997)；Martin-Fontecha A.等人，J.of Immunol.162：5910-6(1999)。)該等觀察指示，CD40在藉由誘導APC之成熟起始及增強免疫反應、分泌輔助細胞介素、上調共刺激分子及增強效應物功能方面起重要作用。
CD40信號傳導在體液及細胞毒性免疫反應之起始及成熟中之關鍵作用使得此系統成為用於免疫增強之理想靶。該增強可對引起針對 腫瘤抗原之有效免疫反應尤其重要，該等腫瘤抗原通常係經由活化APC之交叉引發呈遞至免疫系統。(Huang A.Y.等人，Ciba Foundation Symp.187：229-44(1994)；Toes R.E.M.等人，Seminars in Immunol.10：443-8(1998)；Albert M.L.等人，Nature 392：86-9(1998)；Bennett S.R.等人，J.of Exp.Med.186：65-70(1997)。)
若干組已展示CD40活化對活體外及活體內抗腫瘤反應之有效性。(Toes R.E.M.等人，Seminars in Immunol.10：443-8(1998)。)兩個組使用藉助病毒轉化細胞之腎細胞癌及皮下腫瘤之肺轉移模型已獨立地展示CD40活化可逆轉對腫瘤特異性抗原之耐受，從而產生T細胞之有效抗腫瘤引發。(Sotomayor E.M.等人，Nature Medicine 5：780-787(1999)；Diehl L.等人，Nature Medicine 5：774-9(1999)。)在SCID小鼠之人類乳癌系模型中藉由CD40L及抗CD40抗體治療亦報導免疫細胞不存在下之抗腫瘤活性。(Hirano A.等人，Blood 93：2999-3007(1999)。)最近展示，在小鼠模型中藉由抗CD40抗體之CD40活化會消滅CD40+及CD40-淋巴瘤。(French R.R.等人，Nature Medicine 5：548-53(1999)。)另外，Glennie及同事之先前研究推斷出，抗CD40抗體之信號傳導活性比能夠招募效應物之其他抗表面標記物抗體更有效地誘導活體內腫瘤清除。(Tutt A.L.等人，J.of Immunol.161：3176-85(1998)。)與該等觀察一致，當測試抗CD40抗體針對CD40+腫瘤細胞之活體內活性時，大多數但非所有殺腫瘤活性係與CD40信號傳導而非ADCC相關。(Funakoshi S.等人，J.of Immunotherapy with Emphasis on Tumor Immunol.19：93-101(1996)。)在另一研究中，使用多種藥劑離體治療骨髓樹突狀細胞，且測試活體內抗腫瘤活性。該等研究展示CD40L刺激之DC係引起抗腫瘤反應最成熟且最有效的細胞。
藉由比較野生型與CD40-/-小鼠對腫瘤疫苗之反應亦已展示CD40 在抗腫瘤免疫中之重要作用。該等研究展示CD40-/-小鼠無法達成在正常小鼠中觀察到之腫瘤免疫。(Mackey M.F.等人，Cancer Research 57：2569-74(1997)。)在另一研究中，使用腫瘤細胞刺激來自帶有腫瘤之小鼠之脾細胞，並使用活化抗CD40抗體離體治療，且展示具有增強的腫瘤特異性CTL活性。(Donepudi M.等人，Cancer Immunol.Immunother.48：153-164(1999)。)該等研究展示CD40佔據CD40陽性及陰性腫瘤二者之抗腫瘤免疫中之關鍵位置。由於CD40表現於淋巴瘤、白血病、多發性骨髓瘤、大部分鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌及肝癌以及某些乳癌及結腸直腸癌中，故CD40之活化可具有寬範圍之臨床應用。
如本文所使用之「CD40促效劑」包括促效CD40/CD40L相互作用之任何部分。如在此上下文中使用之CD40較佳係指人類CD40，因此CD40促效劑較佳係人類CD40之促效劑。通常，該等部分係促效性CD40抗體或促效性CD40L多肽。該等抗體包括舉例而言人類抗體、嵌合抗體、人類化抗體、雙特異性抗體、scFv及特異性促效CD40/CD40L結合相互作用之抗體片段。在一較佳實施例中，促效性CD40抗體包含嵌合抗體、完整人類或人類化CD40抗體。在另一較佳實施例中，促效性CD40抗體包含嵌合抗體、完整人類或人類化CD40抗體。
「促效劑」會與細胞上之受體組合，並且起動與該受體之天然配體所起動類似或相同之反應或活性。「CD40促效劑」誘導以下(但不限於)反應中之任一者或所有：B細胞增殖及/或分化；經由諸如ICAM-1、E-選擇素、VC AM及諸如此類等分子之細胞內黏附之上調；促發炎細胞介素(例如IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF及諸如此類)之分泌；經由CD40受體藉由諸如以下等途徑之信號轉導：TRAF(例如，TRAF2及/或TRAF3)、MAP激酶(例如NIK(NF-kB誘導激 酶))、I-κ B激酶(IKK/.β.)、轉錄因子NF-kB、Ras及MEK/ERK途徑、PI3K AKT途徑、P38 MAPK途徑及諸如此類；藉由諸如XIAP、mcl-1、bcl-x及諸如此類等分子之抗凋亡信號之轉導；B及/或T細胞記憶體產生；B細胞抗體產生；B細胞同種型轉換、II類MHC及CD80/86之細胞表面表現上調及諸如此類。
促效劑活性意欲係比陰性對照所誘導促效劑活性大至少30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%之促效劑活性，如在B細胞反應分析中所量測。
在一較佳實施例中，CD40促效劑之促效劑活性係陰性對照所誘導促效劑活性的至少2或至少3倍，如在B細胞反應分析中所量測。
因此，例如，當所關注B細胞反應係B細胞增殖時，促效劑活性將誘導為陰性對照所誘導之B細胞增殖程度的至少2倍或至少3倍之B細胞增殖程度。
在一實施例中，不結合至CD40之抗體用作陰性對照。「無顯著促效劑活性」之物質將展現以下促效劑活性：比陰性對照所誘導之促效劑活性大不超過約25%，較佳大不超過約20%、大不超過15%、大不超過10%、大不超過5%、大不超過1%、大不超過0.5%，或甚至比陰性對照所誘導之促效劑活性大不超過約0.1%，如在B細胞反應分析中所量測。
如本文所使用之「促效性CD40抗體」或「活化CD40抗體」或「促效性或活化抗CD40抗體」意指當添加至表現CD40之細胞、組織或生物體中時，結合至人類CD40且使一或多種CD40活性增加至少約20%之抗體。在一些實施例中，抗體使CD40活性活化至少40%、50%、60%、70%、80%、85%。
在一些實施例中，在CD40L存在下添加活化抗體。
在另一較佳實施例中，如下量測促效性CD40抗體之促效劑活 性：
藉由抗CD40抗體增加細胞系Jy之免疫原性
在RPMI培養基中培養並維持CD40陽性JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)(「Jy細胞」)。在完整RPMI培養基中，將JIYOYE細胞與本發明抗CD40抗體(21.4.1)或同種型匹配之抗體(抗KLH)一起培育24小時。然後使用25mg絲裂黴素C(Sigma)/7ml培養基將細胞洗滌並處理60min。然後在37℃(5% CO2)下將該等細胞與經分離之人類T細胞以1：100比率一起培育6天。然後收集、洗滌T細胞，且針對新鮮鉻51(New England Nuclear,Boston,Mass.)標記之JIYOYE細胞測定CTL活性之水準。CTL比活性計算為特異性細胞溶解%=(細胞溶解Jy(cpm)-自發細胞溶解(cpm))/(總細胞溶解(cpm)-自發細胞溶解(cpm))。
在一較佳實施例中，如本文所使用之促效性CD40抗體使CD40陽性JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)中之免疫原性增加至少50%，如(上述)活體外JIYOYE細胞(ATCC CCL 87)分析中所量測。
在本文中亦稱為抗CD40活化抗體之促效性CD40抗體可經由若干重要機制幫助腫瘤消滅。該等機制中之首要者係活化宿主樹突狀細胞以增強腫瘤抗原處理及呈遞，並增強CD40陽性腫瘤細胞自身之抗原呈遞或免疫原性，從而活化腫瘤特異性CD4+及CD8+淋巴球。額外抗腫瘤活性可藉由以下方式來調介：藉由CD40信號傳導之其他免疫增強效應(產生趨化因子及細胞介素、招募並活化單核球以及增強CTL及NK細胞溶解活性)，以及藉由誘導凋亡直接殺死CD40+腫瘤或藉由刺激體液反應引起ADCC。凋亡及瀕死腫瘤細胞亦可變成由CD40活化之APC處理及呈遞之腫瘤特異性抗原之重要來源。
本發明闡述結合人類CD40且起CD40促效劑作用之經分離抗體或其抗原結合部分。
促效性CD40抗體闡述於例如Beatty等人，Science 331(2011) 1612-1616；R.H.Vonderheide等人，J ClinOncol 25,876(2007)；Khalil,M等人，Update Cancer Ther.2007年6月1日；2(2)：61-65中，作為模型抗體之促效劑CD40大鼠抗小鼠IgG2a mAb FGK45闡述於S.P.Schoenberger等人，Nature 393,480(1998))中；小鼠交叉反應性促效性CD40抗體純系1C10闡述於Santos-Argumedo L.等人，Cell Immunol.156(1994)272-285及Heath AW等人，Eur J Immunol 24(1994)1828-34中。臨床試驗中之實例係例如CP-870,893及達西珠單抗(dacetuzumab，促效劑CD40抗體，CAS編號880486-59-9，SGN-40；人類化S2C6抗體)(Khalil,M等人，Update Cancer Ther.2007年6月1日；2(2)：61-65。
在一較佳實施例中，促效性CD40抗體係由Pfizer研發之完整人類IgG2促效性CD40抗體CP-870,893。其以3.48×10-10M之KD結合人類CD40，但並不阻斷CD40L之結合(例如，參見U.S.7,338,660或EP1476185，其中CP-870,893闡述為抗體21.4.1)。CP-870,893(US7,338,660之抗體21.4.1)之特徵在於包含(a)重鏈可變結構域胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO：42)，(b)輕鏈可變結構域胺基酸序列DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：6)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO：44)；及/或具有由具有美國典型培養物收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)登錄號PTA-3605之雜交瘤21.4.1產生之抗體的重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域胺基酸序列。
達西珠單抗及其他人類化S2C6抗體闡述於US6,946,129及US8,303,955中。
因此在一較佳實施例中，與ANG-2或ANG-2/VEGF抗體一起用於組合療法中之促效性CD40抗體之特徵在於包含(a)重鏈可變結構域胺基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：5)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO：42)，(b)輕鏈可變結構域胺基酸序列DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：6)(其對應於US 7,338,660之SEQ ID NO：44)；及/或具有由具有美國典型培養物收集中心(ATCC)登錄號PTA-3605之雜交瘤21.4.1產生之抗體的重鏈可變結構域及輕鏈可變結構域胺基酸序列。
達西珠單抗及其他人類化S2C6抗體闡述於US6,946,129及US8,303,955中。
在一較佳實施例中，與ANG-2或ANG-2/VEGF抗體一起用於組合療法中之促效性CD40抗體係人類化S2C6抗體。人類化S2C6抗體係基於例如鼠類mAB S2C6(以PTA-110保藏於ATCC)之重鏈及輕鏈可變結構域之CDR1、2及3。鼠類mAB S2C6之重鏈及輕鏈可變結構域之CDR1、2及3闡述且揭示於US6,946,129中。在一實施例中，促效劑CD40抗體係達西珠單抗。在一實施例中，促效劑CD40抗體之特徵在於包含(a)重鏈可變結構域胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIPNAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTA VYYCAREGIYWWGQGTLVTVS(SEQ ID NO：7)，(b)輕鏈可變結構域胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHWYQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：8)。
在一實施例中，促效劑CD40抗體係人類抗體。如本文所使用，術語「人類抗體」意指其中可變及恆定結構域序列係源自人類序列之抗體。人類促效性CD40抗體詳細闡述於WO 03/040170中，該文獻之全部揭示內容皆以引用方式併入本文中。人類抗體在本發明治療方法中提供實質性優點，此乃因預期其最小化人類患者中與使用非人類抗體相關之免疫原性及過敏反應。
可用於本發明之其他實例性人類抗CD40抗體包括具有WO03/040170中所闡述命名為3.1.1、3.1.1 H-A78T、3.1.1 H-A78T-V88A-V97A、7.1.2、10.8.3、15.1.1、21.4.1、21.2.1、22.1.1、22.1.1 H-C109A、23.5.1、23.25.1、23.28.1、23.28.1H-D16E、23.29.1、24.2.1、3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V及23.28.1L-C92A之抗體之胺基酸序列的抗體以及包含任一實例性抗體之CDR或可變區的抗體。
在某些實施例中，癌症或腫瘤治療抑制癌症細胞增殖，抑制或防止腫瘤重量或體積之增加及/或使腫瘤重量或體積減小。在一些實施例中，癌症治療延長患者存活期。在某些實施例中，腫瘤生長與未經治療之彼等相比抑制至少50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實施例中，癌症或腫瘤為CD40陽性。
在本發明中，如業內另外已知之術語「CD40L」或「CD154」包括結合至至少相應的哺乳動物CD40多肽(例如人類CD40)之所有哺乳動物CD40L，例如人類、大鼠、非人類靈長類動物、鼠類以及其片 段、變體、寡聚物及偶聯物。在本發明中，所投與之CD40L可包含CD40L多肽或編碼該CD40L多肽之DNA。該等CD40L多肽及DNA尤其包括如Immunex美國專利第6,410,711號；美國專利第6,391,637號；美國專利第5,981,724號；美國專利第5,961,974號及美國公開申請案第20040006006號中所揭示之天然CD40L序列及其片段、變體及寡聚物，該等專利及申請案中之所有及其中所揭示之CD40L序列之全文皆以引用方式併入本文中。
CD40L多肽可用作本發明之CD40促效劑，且尤其包括如Immunex美國專利第6,410,711號；美國專利第6,391,637號；美國專利第5,981,724號；美國專利第5,961,974號及美國公開申請案第20040006006號中所揭示之天然CD40L序列及其片段、變體及寡聚物，該等專利及申請案中之所有及其中所揭示之CD40L序列之全文皆以引用方式併入本文中。
術語「表位」表示能夠特異性結合至抗體之抗原之蛋白決定子。表位通常係由分子之化學活性表面基團(例如胺基酸或糖側鏈)組成，且表位通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。構象及非構象表位之不同之處在於，在變性溶劑存在下不與前者而非後者結合。
如本文所使用，「可變結構域」(輕鏈可變結構域VL、重鏈可變結構域VH)表示每一對直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鏈結構域。輕鏈及重鏈可變結構域具有相同的一般結構，且每一結構域包含藉由三個「超變區」(或互補決定區，CDR)連接之四個序列高度保守之框架區(FR)。框架區採用β-摺疊構象，且CDR可形成連接β-摺疊結構之環。每一鏈中之CDR藉由框架區保持其三維結構並與另一鏈之CDR一起形成抗原結合位點。抗體之重鏈及輕鏈CDR3區在本發明抗體之結合特異性/親和力方面起尤其重要的作用，且因此提供本發明 之又一目標。
術語「抗體之抗原結合部分」在用於本文中時係指抗體之負責抗原結合之胺基酸殘基。抗體之抗原結合部分包含來自「互補決定區」或「CDR」之胺基酸殘基。「框架」或「FR」區係除如本文所定義之超變區殘基外之彼等可變結構域區。因此，抗體之輕鏈及重鏈可變結構域自N端至C端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。特定而言，重鏈之CDR3係對抗原結合貢獻最大且定義抗體之特性之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)之標準定義來確定。
如本文所使用，術語「核酸」或「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈DNA，但較佳為雙鏈DNA。
如本申請案內所使用之術語「胺基酸」表示天然羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸(arg,R)、天冬醯胺(asn,N)、天冬胺酸(asp,D)、半胱胺酸(cys,C)、麩醯胺酸(gln,Q)、麩胺酸(glu,E)、甘胺酸(gly,G)、組胺酸(his,H)、異白胺酸(ile,I)、白胺酸(leu,L)、離胺酸(lys,K)、甲硫胺酸(met,M)、苯丙胺酸(phe,F)、脯胺酸(pro,P)、絲胺酸(ser,S)、蘇胺酸(thr,T)、色胺酸(trp,W)、酪胺酸(tyr,Y)及纈胺酸(val,V)。
抗體之「Fc部分」並不直接參與抗體與抗原之結合，但展現多種效應物功能。「抗體之Fc部分」係熟習此項技術者所熟知且基於抗體之木瓜蛋白酶裂解定義之術語。端視其重鏈恆定區之胺基酸序列，抗體或免疫球蛋白分成以下類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等中之若干可進一步分成子類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、及IgG4、IgA1及IgA2。根據重鏈恆定區，不同類別之免疫球蛋白分別 稱為α、δ、ε、γ及μ。抗體之Fc部分基於補體活化、C1q結合及Fc受體結合直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導之細胞毒性)及CDC(補體依賴性細胞毒性)。補體活化(CDC)係藉由補體因子C1q與大多數IgG抗體子類之Fc部分結合來起始。儘管抗體對補體系統之影響取決於某些條件，但與C1q之結合係由Fc部分中之經定義結合位點來引起。該等結合位點為業內已知且闡述於例如Boackle,R.J.等人，Nature 282(1979)742-743；Lukas,T.J.等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.及Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人，Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人，J.Virology 75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人，Immunology 86(1995)319-324；EP 0 307 434中。該等結合位點係例如L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及P329(根據Kabat,E.A.之EU指數進行編號，參見下文)。子類IgG1、IgG2及IgG3之抗體通常展示補體活化及C1q及C3結合，而IgG4並不活化補體系統且不會結合C1q及C3。
在一實施例中，本文所闡述之抗體為人類IgG類別(即為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4子類)。
在較佳實施例中，本文所闡述之抗體為人類IgG1子類或人類IgG4子類。在一實施例中，本文所闡述之抗體為人類IgG1子類。在一實施例中，本文所闡述之抗體為人類IgG4子類。
在一實施例中，本發明抗體包含源自人類來源之Fc部分及較佳人類恆定區之所有其他部分。如本文所使用，術語「源自人類來源之Fc部分」表示為人類抗體之子類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之Fc部分的Fc部分，較佳來自人類IgG1子類之Fc部分、來自人類IgG1子類之突 變Fc部分(在一實施例中在L234A+L235A上具有突變)、來自人類IgG4子類之Fc部分或來自人類IgG4子類之突變Fc部分(在一實施例中在S228P上具有突變)。
在一實施例中，本文所闡述抗體之特徵在於恆定鏈具有人類來源。該等恆定鏈為業內所熟知且由例如Kabat,E.A.予以闡述(例如，參見Johnson,G.及Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218)。
本發明包含用於治療需要療法之患者之方法，其特徵在於向患者投與治療有效量之本文所述抗ANG2抗體與治療有效量之CD40促效劑(例如促效性CD40抗體)。本發明包含本文所述抗ANG2抗體與CD40促效劑(例如促效性CD40抗體)於所述療法中之用途。
本文所闡述之抗體較佳係藉由重組方式產生。該等方法已為業內所熟知，且包含於原核及真核細胞中表現蛋白質以及隨後分離抗體多肽並通常將其純化至醫藥上可接受之純度。就蛋白質表現而言，藉由標準方法將編碼輕鏈及重鏈或其片段之核酸插入表現載體中。在適宜原核或真核宿主細胞(例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中實施表現，且自該等細胞(上清液或細胞溶解後)回收抗體。
抗體之重組產生已為業內所熟知，且闡述於例如以下綜述文章中：Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse,S.等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880。
該等抗體可存在於完整細胞、細胞溶解物中，或以部分純化或基本純淨之形式存在。藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl分級、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及其他業內熟知之技術)實施純化，以消除細胞組份或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質。參見 Ausubel,F.等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
於NS0細胞中之表現闡述於例如Barnes,L.M.等人，Cytotechnology 32(2000)109-123；Barnes,L.M.等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270中。瞬時表現闡述於例如Durocher,Y.等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9中。可變結構域之選殖闡述於Orlandi,R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833-3837；Carter,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289；Norderhaug,L.等人，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87中。較佳瞬時表現系統(HEK 293)闡述於Schlaeger,E.-J.及Christensen,K.，Cytotechnology 30(1999)71-83以及Schlaeger,E.-J.，J.Immunol.Methods 194(1996)191-199中。
將本發明之重鏈及輕鏈可變結構域與啟動子、轉譯起始、恆定區、3'非轉譯區、多腺苷酸化及轉錄終止之序列組合以形成表現載體構築物。可將重鏈及輕鏈表現構築物組合成單一載體，共轉染、連續轉染或單獨轉染至宿主細胞中，隨後融合以形成表現兩條鏈之單一宿主細胞。
例如，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞可利用啟動子、增強子及多腺苷酸化信號。
當核酸與另一核酸序列具有功能關係時，該核酸為「可操作地連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌前導序列之DNA可操作地連接至該多肽之DNA；若啟動子或增強子影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操作地連接至該序列；或若核糖體結合位點之定位有助於轉譯，則該核糖體結合位點可操作地連接至該編碼序列。通常，「可 操作地連接」意指所連接之DNA序列係鄰接序列，且在分泌前導序列之情形下係鄰接序列且位於閱讀框中。然而，增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合可完成連接。若該等位點不存在，則依照習用實踐使用合成寡核苷酸銜接子或連接體。
藉由習用免疫球蛋白純化程序適宜地將單株抗體與培養基分離，該等純化程序係例如蛋白質A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序容易地分離及測序。雜交瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後，可將DNA立即插入表現載體中，然後將其轉染至原本不產生免疫球蛋白之宿主細胞(例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以在宿主細胞中合成重組單株抗體。
如本文所使用，表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用，且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物，而不考慮轉移次數。亦應理解，所有子代之DNA含量可能由於有意或無意突變而不精確地相同。包括在最初轉化細胞中經篩選具有相同功能或生物活性之變體子代。
在另一態樣中，本發明提供含有一種本發明單株抗體或其組合或其抗原結合部分與醫藥上可接受之載劑調配在一起之組合物，例如醫藥組合物。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收/再吸收延遲劑以及生理上相容之類似試劑。較佳地，載劑適於注射或輸注。
本發明之組合物可藉由業內已知之多種方法來投與。如熟習此項技術者應瞭解，投藥途徑及/或模式應端視期望結果而變化。
醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於製備無菌 可注射溶液或分散液之無菌粉末。業內已知將該等培養基及藥劑用於醫藥活性物質。除水之外，載劑可係例如等滲緩衝鹽水溶液。
無論所選投與途徑如何，藉由熟習此項技術者已知之習用方法將可以適宜水合形式使用之本發明化合物及/或本發明醫藥組合物調配成醫藥上可接受之劑型。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量值可變化，以獲得可有效地達成對具體患者之期望治療反應之活性成份量、組合物及投與模式，而對患者無毒(有效量)。所選劑量值將端視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所用本發明具體組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用具體化合物之排泄速率、與所用具體組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體重、狀況、一般健康情況及先前病史以及為醫學業內所熟知之類似因素。
術語「治療方法」或其等效物在應用於(例如)癌症時係指經設計以減少或清除患者中癌細胞之數量或減輕癌症症狀之活動的程序或進程。癌症或另一增殖性病症之「治療方法」不一定指實際上消除癌細胞或其他病症，實際上減少細胞數量或病症，或實際上減輕癌症或其他病症之症狀。通常，實施治療癌症之方法成功之可能性甚至較低，但考慮到患者之病史及估計之存活期望，認為該方法仍可引起總體有益之作用進程。
術語「與......組合投與」或「共投與(co-administration)」、「共投與(co-administering)」、「組合療法」、「投與......」或「組合治療」係指投與例如呈單獨調配物/應用形式(或呈一種單一調配物/應用)形式之如本文所闡述之抗ANG2抗體及如本文所闡述之促效性CD40抗體。共投與可同時或以任一順序依序實施，其中兩種(或所有)活性劑較佳在一段時間內同時發揮其生物活性。經由連續輸注同時或 依序共投與(例如靜脈內(i.v.)該抗體與該另一藥劑。當依序共投與兩種治療劑時，劑量係在同一天分兩次單獨投與來投與，或在第1天投與一種藥劑且在第2天至第7天、較佳在第2天至第4天共投與另一藥劑。因此在一實施例中，術語「依序」意指在投用第一組份後7天內、較佳在投用第一組份後4天內；且術語「同時」意指在同一時間。關於抗ANG2抗體及/或促效性CD40抗體之維持劑量之術語「共投與」意指若治療週期適用於兩種藥物(例如每週)，則可同時共投與維持劑量。或例如每第一至第三天例如投與另一藥劑，且每週投與該抗體。或在一天或在若干天內依序共投與維持劑量。
不言而喻，抗體係以「治療有效量」(或簡稱為「有效量」)投與患者，該治療有效量係各別化合物或組合將引發研究者、獸醫、醫師或其他臨床醫師所尋求之組織、系統、動物或人類之生物學或醫學反應之量。
如本文所使用術語「患者」或「個體」較佳係指需要治療癌症或癌前病況或病灶之人類。然而，術語「患者」亦可指需要治療之非人類動物，尤其例如哺乳動物，例如小鼠、狗、貓、馬、母牛、豬、綿羊及非人類靈長類動物。
共投與之量及共投與之時間將端視所治療患者之類型(物種、性別、年齡、體重等)及狀況以及所治療疾病或病況之嚴重程度而定。 將該抗ANG2抗體及另一藥劑適宜地一次性或在一系列治療內、例如在同一天或次日共投與患者。
端視疾病之類型及嚴重程度，約0.1mg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)該抗ANG2抗體及/或促效性CD40抗體係用於向患者共投與兩種藥物之初始候選劑量。本發明包含使用本發明抗體來治療患有癌症、尤其結腸癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌之患者。
除抗ANG2抗體與促效性CD40抗體之組合外，亦可投與化學治療劑。
在一實施例中，可與如本文所闡述之抗ANG2抗體及如本文所闡述之促效性CD40抗體一起投與之該等其他化學治療劑包括(但不限於)抗腫瘤劑，其包括烷基化劑，其包括：氮芥，例如甲基二氯乙基胺、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖(melphalan)及氮芥苯丁酸；亞硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)、洛莫司汀(lomustine，CCNU)及司莫司汀(semustine，甲基-CCNU)；Temodal(TM)(替莫唑胺(temozolamide))、乙烯亞胺/甲基三聚氰胺(例如三伸乙基三聚氰胺(TEM))、三乙烯、三胺硫磷(噻替派(thiotepa))、六甲基三聚氰胺(HMM、六甲蜜胺)；磺酸烷基酯，例如白消安(busulfan)；三嗪，例如達卡巴嗪(dacarbazine，DTIC)；抗代謝藥，包括葉酸類似物(例如胺甲喋呤及三甲曲沙(trimetrexate))、嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、氟去氧尿苷、吉西他濱(gemcitabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(AraC、阿糖胞苷(cytarabine))、5-氮雜胞苷、2,2'-二氟去氧胞苷)、嘌呤類似物(例如6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤、T-去氧柯福黴素(deoxycoformycin，噴司他汀(pentostatin))、赤羥壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine，EHNA)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)及2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine)、2-CdA))；天然產物，包括抗有絲分裂藥物，例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、長春花生物鹼(vinca alkaloid，包括長春鹼(vinblastine，VLB)、長春新鹼(vincristine)及長春瑞濱(vinorelbine))、多西他賽(taxotere)、雌莫司汀(estramustine)及磷酸雌莫司汀；鬼臼毒素(pipodophylotoxin)，例如依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide)；抗生素，例如放線菌素D(actinomycin D)、道諾黴素(daunomycin，紅比黴素(rubidomycin))、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊達比星 (idarubicin)、博來黴素(bleomycin)、普卡黴素(plicamycin，光輝黴素(mithramycin))、絲裂黴素C(mitomycin C)及放線菌素；酶，例如L-門冬醯胺酶；生物反應改質劑，例如干擾素-α、IL-2、G-CSF及GM-CSF；其他藥劑，包括鉑配位錯合物(例如奧利沙鉑(oxaliplatin)、順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin))、蒽二酮(例如米托蒽醌)、經取代脲(例如羥基脲)、甲基肼衍生物(包括N-甲基肼(MIH)及丙卡巴肼(procarbazine))、腎上腺皮質阻抑劑(例如米托坦(mitotane，o,p-DDD)及胺魯米特(aminoglutethimide))；激素及拮抗劑，包括腎上腺皮質類固醇拮抗劑，例如潑尼松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)及胺魯米特；Gemzar(TM)(吉西他濱)、黃體素(例如己酸羥孕酮、乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate)及乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))；雌激素，例如乙烯雌酚(diethylstilbestrol)及乙烯雌二醇等效物；抗雌激素，例如他莫昔芬(tamoxifen)；雄性激素，包含丙酸睪固酮及氟甲睪酮(fluoxymesterone)/等效物；抗雄性激素，例如氟他胺(flutamide)、促性腺激素釋放激素類似物及亮丙瑞林(leuprolide)；及非類固醇抗雄性激素，例如氟他胺。靶向表觀遺傳學機制之療法包括(但不限於)組蛋白去乙醯酶抑制劑、去甲基化劑(例如，維達紮(Vidaza))，且釋放轉錄阻遏(ATRA)療法亦可與抗原結合蛋白組合。在一實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：紫杉烷(taxane，如例如太平洋紫杉醇(汰癌勝(Taxol))、多西他賽(泰索帝(Taxotere))、經修飾太平洋紫杉醇(例如，阿巴生(Abraxane)及奧帕消(Opaxio))、多柔比星、舒尼替尼(sunitinib，舒癌特(Sutent))、索拉菲尼(sorafenib，蕾莎瓦(Nexavar))及其他多激酶抑制劑、奧沙利鉑、順鉑及卡鉑、依託泊苷、吉西他濱及長春鹼。在一實施例中，化學治療劑係選自由以下組成之群：紫杉烷(如例如汰癌勝(太平洋紫杉醇)、多西他賽(多西他賽)、經修飾太平洋紫杉醇(例如阿巴生及奧帕消)。在 一實施例中，另一化學治療劑係選自5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲醯四氫葉酸、伊立替康或奧利沙鉑。在一實施例中，化學治療劑係5-氟尿嘧啶、甲醯四氫葉酸及伊立替康(FOLFIRI)。在一實施例中，化學治療劑係5-氟尿嘧啶及奧利沙鉑(FOLFOX)。
與其他化學治療劑之組合療法之特定實例包括例如利用紫杉烷(例如，多西他賽或太平洋紫杉醇)或經修飾太平洋紫杉醇(例如，阿巴生或奧帕消)、多柔比星)、卡培他濱及/或貝伐珠單抗(bevacizumab，阿瓦斯汀(Avastin))之療法來治療乳癌；利用卡鉑、奧利沙鉑、順鉑、太平洋紫杉醇、多柔比星(或經修飾多柔比星(Caelyx或Doxil))或托泊替康(癌康定(Avastin))之療法來治療卵巢癌；利用多激酶抑制劑、MKI、(舒癌特、蕾莎瓦或706)及/或多柔比星之療法來治療腎癌；利用奧利沙鉑、順鉑及/或輻射之療法來治療鱗狀細胞癌；利用汰癌勝及/或卡鉑之療法來治療肺癌。
因此，在一實施例中，另一化學治療劑係選自紫杉烷(多西他賽或太平洋紫杉醇或經修飾太平洋紫杉醇(阿巴生或奧帕消)、多柔比星、卡培他濱及/或貝伐珠單抗之群來治療乳癌。
在抗ANG2抗體/促效性CD40抗體組合療法之一實施例中，不投與其他化學治療劑。
本發明亦包含用於治療患有該疾病之患者之方法。
本發明進一步提供製造包含有效量之本發明抗體以及醫藥上可接受之載劑之醫藥組合物的方法及本發明抗體於此一方法之用途。
本發明進一步提供使用有效量之本發明抗體來製造較佳與醫藥上可接受之載劑一起治療患有癌症之患者的醫藥劑。
本發明亦提供使用有效量之本發明抗體來製造較佳與醫藥上可接受之載劑一起治療患有癌症之患者的醫藥劑。
下文列示本發明之一些特定實施例：
1.一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與
a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
2.一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與
a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，b)用於延長患有癌症之患者之存活期。
3.根據實施例1或2使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係單株抗體。
4.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係人類或人類化抗體。
5.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係以小於1.0×10-8mol/l之KD值特異性結合至人類ANG2，如藉由表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。
6.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係IgG抗體。
7.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係以15nM或更小之IC50抑制人類ANG-2與TIE2受體之相互作用。
8.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中CD40促效劑係促效性CD40抗體或促效性CD40L多肽。
9.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體，其中CD40 促效劑係促效性CD40抗體。
10.根據實施例9之結合至人類ANG-2之抗體，i)其中該抗ANG2抗體包含(a)SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)其中促效性CD40抗體包含(a)SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：7之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
11.根據實施例9之結合至人類ANG-2之抗體，i)其中該抗ANG2抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
12.根據實施例9使用之抗ANG2抗體，其中該抗ANG2抗體係結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體。
13.根據實施例10之結合至人類ANG-2之抗體，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含 SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；及SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
14.根據實施例10之結合至人類ANG-2之抗體，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列；且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
15.根據前述實施例中之任一者使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體或用途，其中癌症係肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer、gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細胞 癌、垂體腺瘤、淋巴瘤或淋巴球性白血病。
16.根據實施例15使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中癌症包含實體腫瘤。
17.根據實施例15或16使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中癌症係結腸癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌。
18.根據前述實施例中之任一者使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中在治療方法中，抗ANG2抗體與CD40促效劑係同時、單獨或依序投與個體。
胺基酸序列之描述
SEQ ID NO：1 <ANG-2>E6Q之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO：2 <ANG-2>E6Q之輕鏈可變結構域VL
SEQ ID NO：3 <ANG-2>Ang2i_LC06之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO：4 <ANG-2>Ang2i_LC06之輕鏈可變結構域VL
SEQ ID NO：5 CP-870,893(U.S.7,338,660之抗體21.4.1)之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO：6 CP-870,893(U.S.7,338,660之抗體21.4.1)之輕鏈可變結構域VL
SEQ ID NO：7 人類化S2C6重鏈可變結構域VH變體
SEQ ID NO：8 人類化S2C6輕鏈可變結構域VL變體
SEQ ID NO：9 <VEGF>貝伐珠單抗之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO：10 <VEGF>貝伐珠單抗之輕鏈可變結構域VL
SEQ ID NO：11 雙特異性ANG2/VEGF抗體XMab1-<VEGF>輕鏈
SEQ ID NO：12 雙特異性ANG2/VEGF抗體XMab1-<ANG2>輕鏈
SEQ ID NO：13 雙特異性ANG2/VEGF抗體XMab1-<VEGF>重鏈
SEQ ID NO：14 雙特異性ANG2/VEGF抗體XMab1-<ANG2>重鏈
SEQ ID NO：15 人類血管生成素-2(ANG-2)
SEQ ID NO：16 人類血管內皮生長因子(VEGF)
SEQ ID NO：17 <VEGF>B20-4.1之重鏈可變結構域VH
SEQ ID NO：18 <VEGF>B20-4.1之輕鏈可變結構域VL
在下文中闡述本發明實施例：
1.一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
2.一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，b)用於延長患有癌症之患者之存活期。
3.一種以下組合之用途i)結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體與ii)CD40促效劑，其用於製造用於以下用途之藥劑：a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
4.一種以下組合之用途 i)結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體與ii)CD40促效劑，其用於製造用於以下用途之藥劑：a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，b)用於延長患有癌症之患者之存活期。
5.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中該抗ANG2抗體係人類或人類化抗體。
6.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中該抗ANG2抗體係以小於1.0×10-8mol/l之KD值特異性結合至人類ANG2，如藉由表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。
7.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中該抗ANG2抗體係IgG抗體。
8.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中該抗ANG2抗體係以15nM或更小之IC50抑制人類ANG-2與TIE2受體之相互作用。
9.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中CD40促效劑係促效性CD40抗體或促效性CD40L多肽。
10.根據前述實施例中之任一者使用之抗ANG2抗體或用途，其中CD40促效劑係促效性CD40抗體。
11.根據實施例10之結合至人類ANG-2之抗體或用途，i)其中該抗ANG2抗體包含(a)SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且 ii)其中促效性CD40抗體包含(a)SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：7之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
12.根據實施例10之結合至人類ANG-2之抗體或用途，i)其中該抗ANG2抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或
13.根據實施例10使用之抗ANG2抗體或用途，其中該抗ANG2抗體係結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體。
14.根據實施例10使用之抗ANG2抗體或用途，其中結合至人類VEGF之抗體另外係與CD40促效劑組合投與或與CD40促效劑組合使用。
15.根據實施例13之結合至人類ANG-2之抗體或用途，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；及SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且 ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
16.根據實施例13之結合至人類ANG-2之抗體或用途，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列；且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
17.根據實施例14之結合至人類ANG-2之抗體或用途，i)其中結合至人類VEGF之抗體包含SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)其中促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
18.根據前述實施例中之任一者使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體或用途，其中癌症係肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer、gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間 皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤或淋巴球性白血病。
19.根據實施例18之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體或用途，其中癌症包含實體腫瘤。
20.根據實施例18或19之抗體或用途，其中癌症之特徵進一步在於ANG-2表現或過表現。
21.根據實施例18至20中之任一者使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中癌症係結腸癌、卵巢癌、神經膠母細胞瘤、胃癌、胰臟癌、乳癌、肺癌、肝細胞癌。
22.根據前述實施例中之任一者使用之結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中在治療方法中，抗ANG2抗體與CD40促效劑係同時、單獨或依序投與個體。
實例1 人類ANG-2與TIE2受體之相互作用之抑制(實驗A)
人類ANG-2/人類Tie2相互作用之阻斷係藉由受體相互作用ELISA來展示。在室溫下用0.5μg/ml人類Tie2(R&D Systems,UK，目錄號313-TI或內部生產之材料)將384孔Maxisorp板(Nunc)包覆2h，且在室溫下在振盪下使用補充有0.2% Tween-20及2% BSA(Roche Diagnostics GmbH,DE)之PBS阻斷1h。同時，在室溫下，將經純化抗體於PBS中之稀釋物與0.2μg/ml hu血管生成素-1/2(R&D Systems編號923-AN/CF,R&D Systems,UK，目錄號623-AN或內部生產之材料)一起培育1小時。洗滌後，經1h添加0.5μg/ml生物素化抗血管生成素-1/2純系(R&D Systems編號BAF923,BAM0981 R&D Systems,UK)及以1：3000稀釋之鏈黴抗生物素蛋白HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE， 目錄號11089153001)之混合物。此後用PBST將板洗滌6次。在室溫下，用新鮮製備之ABTS試劑(Roche Diagnostics GmbH,DE，緩衝液編號204 530 001，錠劑編號11 112 422 001)將板顯影30分鐘。在405nm下量測吸光度。
所獲得抑制濃度概述於下表中。
人類ANG-2與TIE2受體之相互作用之抑制(實驗B)
在室溫下在384孔微量滴定板(MicroCoat,DE，目錄號464718)上實施相互作用ELISA。每一培育步驟後，用PBST將板洗滌3次。用5μg/ml Tie-2蛋白將ELISA板包覆1小時(h)。此後用補充有0.2% Tween-20及2% BSA(Roche Diagnostics GmbH,DE)之PBS將孔阻斷1h。在室溫下，將經純化雙特異性Xmab抗體於PBS中之稀釋物與0.2μg/ml hu血管生成素-2(R&D Systems,UK，目錄號623-AN)一起培育1h。洗滌後，經1h添加0.5μg/ml生物素化抗血管生成素-2純系BAM0981(R&D Systems,UK)及以1：3000稀釋之鏈黴抗生物素蛋白HRP(Roche Diagnostics GmbH,DE，目錄號11089153001)之混合物。此後用PBST將板洗滌3次。在室溫下，用新鮮製備之ABTS試劑(Roche Diagnostics GmbH,DE，緩衝液編號204 530 001，錠劑編號11 112 422 001)將板顯影30分鐘。在405nm下量測吸光度且確定IC50。
結合至人類ANG2及人類VEGF之雙特異性抗體XMab1(參見WO2011/117329及序列SEQ ID NO：11-14)展示抑制ANG-2與Tie-2之結合(ANG2/Tie2受體相互作用抑制)，且IC50為12nM。
實例2 抗ANG2抗體與促效性CD40抗體之組合之活體內抗腫瘤效能(延遲癌症之進展(腫瘤生長)並延長所治療患者之存活期) 方法
向C57BL/6小鼠皮下注射500.000個同基因MC-38腫瘤細胞，且在腫瘤達到40-60mm3之大小時之第16天開始治療。
當腫瘤達到1500mm3之大小(終點)時，根據獸醫條例對小鼠實施安樂死。作為抗ANG2抗體，使用基於<ANG-2>Ang2i_LC06之VH及VL(SEQ ID NO：3-4)之單特異性IgG1抗體。作為小鼠交叉反應性替代物，使用基於<VEGF>B20-4.1之VH及VL(SEQ ID NO：17-18)之VEGF抗體替代<VEGF>貝伐珠單抗之VH及VL(SEQ ID NO：9-10)，此乃因貝伐珠單抗不具小鼠交叉反應性。該等抗體係單獨或以組合使用。出於類似原因，特定而言在aa小鼠IgG1格式(其可自純系1C10之可變區VH及VL與小鼠IgG1恆定區之組合產生或其亦可自Rockefeller大學獲得)中，使用小鼠交叉反應性促效性CD40抗體純系1C10(參見Santos-Argumedo L.等人，Cell Immunol.156(1994)272-285；Heath AW等人，Eur J Immunol 24(1994)1828-34；可自例如Abnova獲得，目錄號MAB5607)替代促效性CD40抗體CP-870,893(U.S.7,338,660之抗體21.4.1)(參見SEQ ID NO：5-6之VH及VL)。為進行比較，亦檢查與單特異性抗VEGF抗體<VEGF>B20-4.1(SEQ ID NO：17-18)之組合。然而，可使用促效性CD40抗體CP-870,893(U.S.7,338,660之抗體21.4.1)及雙特異性ANG2/VEGF抗體XMab1((SEQ ID NO：11-14)實施使用轉基因人類化小鼠之類似實驗或臨床試驗，以預期基於該作用機制之類似結果。
根據以下方案以所指示之劑量施用治療。
結果
結果展示於圖1中。該圖代表3個獨立實驗之匯總數據。使用圖中所指示之抗體組合治療小鼠。
概述
數據展示所有所用試劑本身確實顯示抗腫瘤活性。儘管在與抗VEGF抗體組合時促效性抗CD40抗體之組合確實僅顯示較小效應，但促效性CD40抗體與抗ANG2抗體之組合(單特異性ANG2抗體或抗ANG2/抗VEGF抗體之組合)展示關於腫瘤細胞生長、延遲進展及延長存活期之強協同效應。對促效性CD40抗體之組合及抗ANG2/抗VEGF抗體之組合可觀察到最強效應。藉由使用抗Ang-2及抗CD40或抗ANG2/抗VEGF抗體(抗VEGF/Ang-2)及抗CD40之組合進行組合治療會治癒較大比例之帶有腫瘤之小鼠。因此，該等組合可為癌症患者提供大量治療益處。
實例3 抗ANG2抗體(雙特異性)與促效性CD40抗體之組合在皮下同基因MC38結腸癌模型中之活體內抗腫瘤效能
在37℃下在水飽和氣氛中在5% CO2下，於補充有10% FCS及2mM L-麩醯胺酸之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM,PAN Biotech)中培養鼠類結腸直腸腺癌細胞系MC-38(自希望之城貝克曼研究所(Beckman Research Institute of the City of Hope),California,USA獲得)之細胞。在接種當天，使用PBS自培養燒瓶收穫MC38腫瘤細胞且轉移至培養基中，離心，洗滌一次，且重懸浮於PBS中。為注射細胞，將最終效價調節至1×107個細胞/ml。隨後，將100μl此懸浮液(1×106個細胞)皮下接種至6-10週齡雌性C57BL/6N小鼠中。使用對照抗體(MOPC-21(10mg/kg腹膜內，每週一次)及/或2A3(100μg腹膜內，一次；Bio X Cell,West Lebanon)，及雙特異性抗ANG2抗體與抗CD40單株抗體FGK45(促效劑CD40大鼠抗小鼠IgG2a mAb FGK45(S.P.Schoenberger等人，Nature,393,480(1998)，可自BioXcell購得)CD40純系FGK.45，100μg，腹膜內，與第一劑量之雙特異性ANG2/VEGF抗體同時一次投與)之組合治療各組動物。該雙特異性抗體係ANG2結合臂基於<ANG-2>E6Q之VH及VL(SEQ ID NO：1-2)之雙特異性ANG2/VEGF抗體。作為VEGF結合臂之小鼠交叉反應性替代物，對雙特異性抗體使用<VEGF>B20-4.1之VH及VL(SEQ ID NO：17-18)替代<VEGF>貝伐珠單抗之VH及VL(SEQ ID NO：9-10)。然而，結構與XMab1之結構相同(僅將VH/VL<VEGF>更換為B20-4.1之小鼠交叉反應性VH/VL))
在腫瘤建立且達到50mm3至80mm3(對於單療法)或200mm3(對於組合)之平均大小後開始治療。每週量測兩次腫瘤體積且平行監測動物體重。結果展示於圖2中。雙特異性ANG2/VEGF抗體與促效性 CD40 mAb之組合展示在異體同質MC38小鼠腺癌模型中與單療法相比改良之抗腫瘤效能，且腫瘤在第21天時消退(TGI>100%)。在第32天，10個動物中之5個無腫瘤。
<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
<120> 抗ANG2抗體與CD40促效劑之組合療法
<130> P31903 FT
<150> EP13198753.9
<151> 2013-12-20
<150> EP14158331.0
<151> 2014-03-07
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工
<220>
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <ANG-2>E6Q之輕鏈可變結構域VL
<400> 2
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> <ANG-2>Ang2i_LC06之重鏈可變結構域VH
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工
<220>
<223> <VEGF>B20-4.1之輕鏈可變結構域VL
<400> 18

Claims (15)

  1. 一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與，a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，或b)用於延長患有癌症之患者之存活期，或c)用於刺激免疫反應或功能，例如T細胞活性(在一實施例中為CD8效應T細胞活性)或巨噬細胞活性(在一實施例中為CD40活化之巨噬細胞活性)，或d)用於使癌症對使用結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體之治療敏感。
  2. 一種結合至人類血管生成素2(ANG-2)之抗體，其中該抗體與CD40促效劑組合投與，a)用於治療癌症或延遲癌症之進展，b)用於延長患有癌症之患者之存活期。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗ANG2抗體係人類或人類化抗體。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗ANG2抗體係以小於1.0×10-8mol/l之KD值特異性結合至人類ANG2，如藉由表面電漿子共振(BiacoreTM)所測定。
  5. 如請求項1或2之抗體，其中該抗ANG2抗體係IgG抗體。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗ANG2抗體以15nM或更小之IC50抑制人類ANG-2與TIE2受體之相互作用。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該CD40促效劑係促效性CD40抗體或促效性CD40L多肽。
  8. 如請求項1或2之抗體，其中該CD40促效劑係促效性CD40抗體。
  9. 如請求項8之抗體，i)其中該抗ANG2抗體包含 (a)SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：3之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：4之輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)其中該促效性CD40抗體包含(a)SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或(b)SEQ ID NO：7之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：8之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
  10. 如請求項8之抗體，i)其中該抗ANG2抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；或且ii)其中該促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
  11. 如請求項8之抗體，其中該抗ANG2抗體係結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之雙特異性抗體。
  12. 如請求項11之抗體，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之該雙特異性抗體包含SEQ ID NO：1之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：2之輕鏈可變結構域胺基酸序列；及SEQ ID NO：9之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：10之 輕鏈可變結構域胺基酸序列；且ii)其中該促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
  13. 如請求項11之抗體，i)其中結合至人類ANG-2且結合至人類VEGF之該雙特異性抗體包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14之胺基酸序列；且ii)其中該促效性CD40抗體包含SEQ ID NO：5之重鏈可變結構域胺基酸序列及SEQ ID NO：6之輕鏈可變結構域胺基酸序列。
  14. 如請求項1或2之抗體，其中該癌症係肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer、gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤、淋巴瘤或淋巴球性白血病。
  15. 如請求項14之抗體，其中該癌症包含實體腫瘤。
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