CN104936983A

CN104936983A - 对单核细胞或其前体分化的调节

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Publication number: CN104936983A
Application number: CN201380058255.7A
Authority: CN
Inventors: H·埃热尔; R·阿莱
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 2012-11-09
Filing date: 2013-11-08
Publication date: 2015-09-23
Also published as: US20150252115A1; TW201436802A; WO2014072441A1; US9676859B2; AU2013343556B2; SG11201502827RA; TWI539961B; EP2938635A1; CA2891000A1; AU2013343556A1

Abstract

本发明总体上涉及通过施用调节巨噬细胞极化的化合物促进树突细胞(DC)免疫反应和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)免疫反应。本发明涉及能够与CSF-1R结合的抗体用于调节巨噬细胞极化的用途。本发明也涉及通过评估巨噬细胞的体内或体外极化，在患者中评价能够与CSF-1R结合的抗体的剂量功效的方法。本发明还涉及评估能够与CSF-1R结合的抗体对正在治疗的受试者影响的治疗后伴随检验和分析。

Description

对单核细胞或其前体分化的调节

发明概述

本发明总体上涉及通过施用调节单核细胞或其前体分化的化合物促进树突细胞(DC)驱动的免疫反应和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)免疫反应。本发明涉及能够与CSF-1R结合的抗体用于调节单核细胞或其前体分化、更具体地用于诱导单核细胞或其前体向树突细胞和/或M1极化巨噬细胞而非M2极化巨噬细胞分化的用途。本发明也涉及通过评估在体内或在体外评估单核细胞或其前体分化成巨噬细胞(M1型或M2型)和/或树突细胞，在患者中评价能够与CSF-1R结合的抗体的剂量功效的方法。

本发明还涉及评估能够与CSF-1R结合的抗体对正在治疗的受试者影响的治疗后伴随检验和分析。

在炎症期间，循环型单核细胞被募集至炎症部位，在那里，它们采取由特定细胞因子和生长因子的存在所决定的巨噬细胞表型。成熟的巨噬细胞分裂为两个群体，M1极化或“经典活化”和M2极化或“旁路活化”。巨噬细胞是重要的肿瘤浸润性细胞并且在肿瘤生长和转移中发挥关键作用。在大部分实体瘤中，巨噬细胞的存在有利于肿瘤生长和转移。最近的研究显示肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)显示M2表型。这些肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)产生白介素IL-10和转化生长因子(TGF)β以抑制总体抗肿瘤免疫反应。同时，TAM通过分泌促血管生成因子促进肿瘤新生血管生成并限定侵入性微环境以促进肿瘤转移和散播。出于这些理由，已经将选择性耗尽M2TAM视为抗癌疗法的新方案(Sica等人，2006，European Journal ofCancer，42,717-727)。

巨噬细胞以极化方式参与针对肿瘤的免疫反应。M1分化由GM-CSF触发并进一步受干扰素-γ(IFN-γ)、细菌脂多糖(LPS)或肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激，并且由涉及信号转导蛋白和转录激活物(STAT)、活化性B细胞的核因子κ-轻链促进子(NFκB)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的几条信号转导途径介导。这些事件增强如活性氧类和一氧化氮(NO)之类的物质的产生并通过增加抗原呈递能力并借助细胞因子如IL12的产生诱导Th1免疫力，促进后续的炎性免疫反应。相比，M2巨噬细胞极化用来描述以M1极化之外的方式活化的巨噬细胞，所述巨噬细胞包括IL4/IL13刺激的巨噬细胞、IL10诱导的巨噬细胞和免疫复合物触发的巨噬细胞。在M1极化与M2极化之间的许多分子差异当中，IL12和IL10的产生比对区分M1和M2巨噬细胞至关重要。明显地，TAM分享许多M2巨噬细胞特性。

TAM显示这样的M2谱，其特征不仅在于IL-12^低IL-10^高表型，还在于与调节功能相关的高的FcR介导吞噬能力(Schmieder等人,2012，SeminCancerBiol.,22,289-297)。已经鉴定血红蛋白清道夫受体(CD163)为TAM表达的M2极化巨噬细胞的标志物(Ambarus等人,2012,375,196-206)。TAM可以代表肿瘤微环境中由CSF-1和CCL-2(MCP-1)募集的最丰富免疫抑制性细胞群体(Sica等人,2006,EurJCancer.,42,717-727)。

类似地，旁路活化的M2巨噬细胞已经涉及几种病理学，其中最明显的是过敏反应和哮喘(Duffield,2003,Clin.Sci.104,27；Gordon,2003,Nat.Rev.Immunol.,3,23；Dagupta和Keegan,J.Innate Immun.,2012,4,478)。

发明人已经现在显示，通过施用调节单核细胞或其前体分化的化合物，某些单克隆抗体能够促进DC免疫反应和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)免疫反应。他们已经显示所述单克隆抗体能够下调表面FcγRI(CD64)和FcγRIII(CD16)以下调MCP-1(巨噬细胞趋化蛋白1，也称作CCL-2)、IL-6、MMP9和/或IL-10产生，并且以促进IL-12、IL-1α、TNF-α产生。他们已经进一步显示所述单克隆抗体抑制来自人单核细胞的CD163⁺M2型巨噬细胞的分化并反而促进单核细胞分化成DC，并任选地促进巨噬细胞M1极化。

发明公开

本发明广泛地涉及通过调节单核细胞分化用于免疫调节的方法。

本发明更具体地涉及通过使合适前体细胞(通常单核细胞或其前体)暴露于有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体，体内或离体产生树突细胞的方法。因此生成的树突细胞可以特征在于表达树突细胞标志物，如CD1a、CD14、CD86、CD1b等。

在本发明的方法中，通过使前体细胞(通常单核细胞)与有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体接触，从前体细胞产生树突细胞。前体细胞可以通过本领域已知的方法从合适的生物样品分离，并且可以是分离的或在复杂的细胞群体中提供。

除非上下文另外清楚地说明，否则如完整申请书通篇范围内所用，术语“一(a)”和“一个(an)”以这样的意思使用，从而它们意指“至少一个”、“至少第一个”、“一个或多个”或“多个”所指示的组分或步骤。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。

无论在本文中何处使用，术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的意思。

如本文中所用的术语“约”或“大约”意指在给定值或区间的20％范围内，优选10％范围内并且更优选5％范围内。术语“约x”还包括x值。

本文中所用，“包含着”和“包含”意在表示组件套装、产物、组合物和方法包括所指的组分或步骤，但不排除其他组分或步骤。例如，“一种包含x和y的组合物”涵盖含有x和y的任何组合物，无论其他组分是否可能存在于该组合物中。同样地，“一种包括步骤x的方法”涵盖其中实施x的任何方法，无论x是否为该方法中的唯一步骤或它仅是步骤之一，无论其中可能有多少其他步骤并且无论x与之相比多么简单或复杂。

当用来定义产物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应当排除具有任何实质意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所提及组分组成的组合物不会排除痕量污染物和可药用载体。“由……组成”应当意指排除其他组分或步骤的超过痕量的要素。

根据第一实施方案，本发明涉及一种通过调节患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状的患者中的单核细胞或其前体分化进行免疫调节的方法，其中所述方法包括步骤：向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体。本发明更具体地涉及这种用于免疫调节的方法，其中所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病状。

根据一个具体实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体用于调节单核细胞或其前体分化，特别地在患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状的患者中调节的用途。根据一个具体实施方案，所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病状。

本申请涉及“调节单核细胞或其前体分化”。这个术语意指本发明的调节性抗体引起M2巨噬细胞极化库减少和/或树突细胞(DC)库增加和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)库增加，优选地M2巨噬细胞极化库减少和树突细胞(DC)库增加。如本文中公开，这可以由与M2巨噬细胞相关因子的水平的变化指示。这类因子的例子是膜标志物如CD64或CD163、细胞因子如IL6、IL10或IL12、MCP-1、MMP9等。这种在患者中“调节单核细胞或其前体分化”可以例如通过向患者施用能够与CSF-1R结合的本发明抗体之后测量到IL12/IL10比、MCP-1或IL-6水平增加来理解。

如本文所用，树突细胞(DC)指在淋巴样组织或非淋巴样组织中存在的具有形态相似的细胞类型的多样性群体的任何成员。树突细胞(DC)是用于启动T细胞的介导免疫反应的特化抗原呈递细胞(APC)。DC在诱导免疫力方面的效率在组织培养和完整动物模型中是明显的。当T细胞是静息的或与特定抗原(Ag)反应的T细胞的前体频率低时，这是特别明显的。DC富含I类和II类主要组织相容性复合体(MHC)分子，并且它们的共刺激分子和粘附分子为其提供比其他APC的这些分子更成熟和更有力的辅助特性。

DC表达高水平的I类和II类MHC分子产物。这些分子用于向T淋巴细胞呈递来自蛋白质的肽片段。抗原呈递本身不产生免疫力。需要额外的“第二信号”或辅助分子。这些辅助分子中许多是与T细胞上特定受体相互作用的膜糖蛋白。这些辅助分子在DC上以高水平表达并且包括：LFA-3(CD58)、B7-1(CD80)和B7-2(CD86)、ICAM-1(CD54)和ICAM-3(CD50)和CD40。其他APC可以表达这些辅助分子，但是DC上的水平特别高。

DC具有比它们的髓样近亲低得多的吞噬能力性，并因此缺乏针对免疫复合物(FcγR)或C3及其片段的受体。低水平的CD32FcγR和CD11bC3biR可能存在，特别地当DC未完全成熟时。终末分化的DC表达标志物CD1a并缺少CD14，一种在巨噬细胞上更丰富并且介导吞噬细胞对脂多糖(LPS)和LPS结合蛋白反应的受体。实质上，为了作为高效呈递抗原至静息T细胞之基础的极高水平的MHC产物和辅助分子，DC分化途径牺牲了吞噬细胞的许多清除特性和抗微生物特性。

根据本发明分析细胞表面以表征/或鉴定/或追踪DC出现可以根据一个实施方案使用单克隆抗体，使用流式细胞仪、磁力分选等进行。简而言之，将细胞与直接缀合于荧光染料的单克隆抗体组合或与未缀合的第一抗体和随后与缀合于荧光染料的市售第二抗体组合。使用例如流式细胞仪(例如，如从Becton Dickinson,Mountain View,Calif.可获得)，分析染色的细胞。DC的额外表型特征还可以通过基因表达概况分析表征，例如通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)表征。

根据另一个实施方案，本发明涉及一种在患者、特别地患有与不希望的M2极化相关的病状的患者中增加树突细胞(DC)库并且任选地M1型巨噬细胞库的方法，其中所述方法包括步骤：向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体。本发明更具体地涉及这种用于免疫调节的方法，其中所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病状。

根据具体实施方案，所述在患有与不希望的M2极化相关的病状的患者中增加树突细胞(DC)库和任选地M1型巨噬细胞库的方法还减少巨噬细胞M2库。

“患者”意指脊椎动物，如哺乳动物，如人。哺乳动物包括但不限于人、犬、猫、马、奶牛和猪。根据本发明的，“患者”正患有与不希望的M2极化相关的病状，并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状。

本发明是还更具体地涉及一种在患者中、特别在患有与不利巨噬细胞分化和M2极化相关的病状和/或患有与CSF-1R活性和/或癌症诱导的免疫抑制相关的病状的患者中减少、尤其通过使其分化偏向DC而减少巨噬细胞促肿瘤功能(即致瘤性)和/或增加肿瘤抑制活性的方法，其中所述方法包括步骤：向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体。

根据具体实施方案，本发明的方法阻遏在肿瘤侵入、转移、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤存活、新生血管生成、抑制天然免疫或适应性免疫和胞外基质重塑组成的组中选出的至少一种巨噬细胞促肿瘤功能。

因此，就本发明而言，“调节单核细胞或其前体分化”还可以意指本发明的调节性抗体减少在肿瘤侵入、转移、肿瘤细胞增殖、肿瘤生长、肿瘤存活、新生血管生成、抑制适应性免疫或天然免疫和胞外基质重塑组成的组中选出的至少一种巨噬细胞促肿瘤功能(即致瘤性)。

根据具体实施方案，本发明的方法通过分化单核细胞或其前体，抑制MCP-1、MMP-9和IL-6产生。

根据具体实施方案，本发明的方法下调正在分化的单核细胞或其前体上的表面FcγRI(CD64)和FcγRIII(CD16)表达。

根据具体实施方案，本发明的方法通过分化单核细胞或其前体促进IL-12(更具体地IL-12P70形式)产生和/或上调IL-12/IL-10比。

根据具体实施方案，本发明的方法借助分泌的因子，调节单核细胞或其前体分化。

根据具体实施方案，本发明的方法减少患者中，特别地在患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状的患者中以下至少一个种情况：

＊TAM募集入肿瘤；

＊至少一种巨噬细胞促肿瘤功能；

＊肿瘤血管生成；

＊肿瘤侵入和转移；

＊肿瘤生长；

＊肿瘤细胞增殖。

根据具体实施方案，所述患者还患有与CSF-1R活性相关的病状。

本发明也涉及在患者中、特别在患有与不希望的巨噬细胞分化和M2巨噬细胞极化相关的病状的患者中或在患有与CSF-1R活性和/或癌症诱导的免疫抑制相关的病状的患者中驱动巨噬细胞趋向树突细胞(DC)免疫反应和任选地M1型巨噬细胞免疫反应和/或远离M2型(巨噬细胞M2极化)免疫反应的方法，其中所述方法包括步骤：向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体。

本发明也涉及在患者中、特别在患有与不希望的巨噬细胞分化和M2巨噬细胞极化相关的病状的患者中或在患有与CSF-1R活性和/或癌症诱导的免疫抑制相关的病状的患者中驱动巨噬细胞趋向Th1免疫反应或远离Th2免疫反应的方法，其中所述方法包括步骤：向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体。

本发明也涉及能够与CSF-1R结合的抗体用于调节单核细胞或其前体分化成DC和任选地M1型巨噬细胞的用途。本发明也涉及能够与CSF-1R结合的抗体用于驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞分化以刺激免疫反应的用途。本发明也涉及能够与CSF-1R结合的抗体用于诱导正在分化的单核细胞或其前体以刺激Th1型免疫反应的用途。本发明也涉及包含能够结合CSF-1R的抗体的组合物，如药物组合物用于调节单核细胞或其前体分化、用于驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞分化和/或诱导正在分化的单核细胞或其前体以刺激Th1型免疫反应的用途。

如本文所用，术语“能够结合”指在蛋白质和其他生物制品的异质群体存在下决定靶蛋白的存在的结合反应。因此，在指定的测定条件下，本发明抗体偏好地与CSF-1R的至少部分结合并且优选地不以明显的量与试验样品中存在的其它组分结合。本发明抗体与CSF-1R靶之间的特异性结合意指结合亲和力是至少10³M^-1并且优选地是10⁵M^-1、10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1。

如本文所用，术语“CSF-1R”指人CSF1受体。

如本文中所用，“抗体”或“Ab”以最广泛的含义使用。因此，“抗体”或“Ab”可以是天然存在的或人造的，如通过常规杂交瘤技术、重组技术产生的单克隆抗体(mAbs)和/或其功能片段。本发明的抗体优选地是单克隆抗体(mAb)。

如本文中所用，术语“可变区”指轻链(VL)或重链(VH)的可变区或结构域，其含有结合识别作用特异性的决定簇。可变结构域参与抗原识别并形成抗原结合位点。如Kabat数据库中所定义，重链和轻链的可变区均划分成包含被三段超变序列或互补决定区(CDR)隔断的4个构架亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的区段，CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间并且CDR3位于FR3和FR4之间。在不规定具体亚区域为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其他人所称的构架区代表在单个、天然存在的免疫球蛋白链的可变区范围内的组合的FR。如本文中所用，FR代表四个亚区域之一，并且FR'代表构成构架区的四个亚区域的两个或多个亚区域。抗体的构架区是组成性轻链和重链的联合构架区并且起到定位和对齐CDR的作用。CDR主要负责形成抗体的结合位点，该结合位点赋予针对抗原表位的结合特异性和亲和力。在提供抗原结合区的H链或L链可变区内部是称为“高变”的更小序列，原因是它们在具有不同特异性的抗体之间具有极端可变性。这类高变区也称作“互补决定区”或“CDR”区。这些CDR区构成抗体对特定抗原决定簇结构的基础特异性。全部抗体的可变重链和可变轻链对于相应轻链(L)和重链(H)而言均具有3个CDR区，每个CDR区与其余CDR区是不连续的(称作L1、L2、L3、H1、H2、H3)。

“共同施用”意指彼此结合在一起、共同、协调地施用，包括同时或依次施用两种或更多种物质。

“有效量”通常意指这样的量，所述量提供所需的局部或全身作用，例如，有效改善炎症的不良影响，包括调节巨噬细胞的极化等。例如，有效量是足以实现有益或所需临床结果的量。有效量可以在单次施用时一次性提供或以在几次施用时提供该有效量的部分量提供。将视为有效量的精确决定可以基于每位受试者各自的因素，包括他们的体格、年龄、损伤和/或正在治疗的疾病或损伤和自损伤出现或疾病开始以来的时间量。本领域技术人员将能够基于本领域中常规的这些考虑确定给定受试者的有效量。如本文所用，“有效剂量”意指与“有效量”相同。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者中、特别地患有与不希望的M2极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状的患者中减少至少一种巨噬细胞促肿瘤功能的用途，所述巨噬细胞促肿瘤功能选自由肿瘤侵入、转移、肿瘤生长、肿瘤存活、新生血管生成、抑制天然免疫或适应性免疫和基质重塑(即致瘤性)和/或增加巨噬细胞肿瘤抑制活性组成的组。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体用于抑制巨噬细胞、特别地人巨噬细胞产生MCP-1、MMP-9和IL-6的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体用于下调巨噬细胞、特别地人巨噬细胞上的表面FcγRI(CD64)和/或FcγRIII(CD16)表达的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体用于促进巨噬细胞、特别地人巨噬细胞产生IL-12(更具体地IL-12P70形式)和/或上调IL-12/IL-10比的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体借助分泌型因子调节巨噬细胞的极化状态的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者、特别地患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状的患者中减少TAM募集和/或肿瘤血管生成的用途。

本发明还更具体地涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者、特别地患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状的患者中减少TAM募集和/或肿瘤侵入和转移的用途。

本发明还更具体地涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者、特别地患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状的患者中减少TAM募集和/或肿瘤生长的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者、特别地患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性相关的病状的患者中驱动单核细胞或其前体向树突细胞(DC)免疫反应和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)免疫反应分化和/或远离M2型(巨噬细胞M2极化))免疫反应的用途。

根据另一个实施方案，本发明涉及能够与人CSF-1R结合的抗体在患者、特别地患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状并且根据具体实施方案还患有与CSF-1R活性和/或癌症诱导的免疫抑制相关的病状的患者中驱动巨噬细胞趋向Th1免疫反应和/或远离Th2免疫反应的用途。

根据优选实施方案，能够与人CSF-1R结合的所述抗体是与位于SEQID NO:23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域D1的N端部分)的至少一个表位结合的抗体。在优选的实施方案中，本发明的抗体与位于SEQ IDNO:23的氨基酸位置20至39之间(即人结构域D1的N端部分)的一个表位结合、与SEQ ID NO:23的氨基酸Asn72、Ser94-Ala95-Ala96、Lys102、Asp131-Pro132-Val133和Trp159结合。

在另一个实施方案中，本发明的抗体与位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域D1的N端部分)的一个表位结合并且不与位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置42至90之间和/或氨基酸位置91至104之间和/或氨基酸位置105至199之间和/或氨基酸位置200至298之间的任何表位结合。根据优选的实施方案，本发明的抗体能够识别位于SEQ IDNO:23的氨基酸位置20至41之间(即人结构域D1的N端部分)的最小表位，优选地能够识别SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至39之间表的表位。

在优选的实施方案中，能够与人CSF-1R结合的所述抗体是不与IL-34配体竞争结合至CSF-1R受体的抗体。如本文所用，术语“不与IL-34配体竞争”指不抑制IL34配体与其受体CSF-1R结合。

在优选的实施方案中，能够与人CSF-1R结合的所述抗体是部分地与CSF-1配体竞争结合至CSF-1R受体的抗体。如本文所用，术语“部分地与CSF-1配体竞争”指抑制CSF-1配体与其受体CSF-1R结合，所述抑制小于100％、优选地小于50％并且甚至更优选地小于20％，并且有利地小于10％。这种部分抑制剂仅减少但是不完全排除配体结合作用，这种抑制称作部分抑制。在优选的实施方案中，能够与CSF-1R结合的所述抗体是能够部分阻止CSF1与其受体CSF-1R结合并且不能够完全抑制所述结合的抗体。更具体地，本发明的抗体能够减少CSF-1与CSF-1R结合大约5％至10％。

根据一个实施方案，所述能够与人CSF-1R结合的抗体是包含以下的抗体：

(i)至少一个CDR，其中所述CDR包含始于SEQID NO:1的位置45并止于位置54的序列、始于SEQ IDNO:1的位置66并止于位置87的序列或始于SEQ IDNO:1的位置117并止于位置126的序列的至少5个连续氨基酸；

或，

(ii)至少一个CDR，其中所述CDR包含始于SEQID NO:2的位置44并止于位置56的序列、始于SEQ IDNO:2的位置66并止于位置76的序列或始于SEQ IDNO:2的位置109并止于位置117的序列的至少5个连续氨基酸。

根据一个优选实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含以下序列的至少五个连续氨基酸的以下CDR：

-始于SEQ ID NO:1的位置45并止于位置54的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置66并止于位置87的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置117并止于位置126的序列；

-始于SEQ ID NO:2的位置44并止于位置56的序列，

-始于SEQ ID NO:2的位置66并止于位置76的序列

-或始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列；

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含在如以下序列中所述的CDR中彼此独立选出的至少一个CDR：

-始于SEQ ID NO:1的位置45并止于位置54的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置66并止于位置87的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置117并止于位置126的序列；

-始于SEQ ID NO:2的位置44并止于位置56的序列，

-始于SEQ ID NO:2的位置66并止于位置76的序列，和

-始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含如以下序列中所述的CDR：

-始于SEQ ID NO:1的位置45并止于位置54的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置66并止于位置87的序列，

-始于SEQ ID NO:1的位置117并止于位置126的序列；

-始于SEQ ID NO:2的位置44并止于位置56的序列，

-始于SEQ ID NO:2的位置66并止于位置76的序列，和

-始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列；

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:5、6、7、8、9或10任一者中所述的氨基酸序列。

根据一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含这样的CDR，所述CDR包含如SEQID NOs:5、6、7、8、9或10中所述的氨基酸序列。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含(i)至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:11、12或13任一者中所述的氨基酸序列；或(ii)至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:14、15或16任一者中所述的氨基酸序列。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含这样的CDR，所述CDR包含如SEQID NOs:11、12、13、14、15或16中所述的氨基酸序列的CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含(i)至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:17、18或19任一者中所述的氨基酸序列；或(ii)至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:20、21或22任一者中所述的氨基酸序列。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含至少一个CDR，所述CDR包含如SEQ ID NOs:17、18、19、20、21或22任一者中所述的氨基酸序列。

根据一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含这样的CDR，所述CDR包含如SEQID NOs:17、18、19、20、21或22中所述的氨基酸序列的CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs:5、6和7中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs:8、9和10中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含在SEQ ID NOs:11、12和13中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs:14、15和16中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs:17、18和19中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中所述可变区包含如SEQ ID NOs:20、21和22中所述的三个CDR。

根据一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中可变区包含如SEQ IDNO:3中所述的氨基酸序列。

在一个更优选的实施方案中，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中可变区如SEQ IDNO:3中所述。

在另一个优选实施方案中，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，其中可变区包含如SEQ ID NO:4中所述的氨基酸序列。

在另一个更优选的实施方案中，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含可变区，其中可变区如SEQ IDNO:4中所述。

根据一个优选实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含：

-包含如SEQ ID NOs:5、6和7中所述的3个CDR的可变区，和

-包含如SEQ ID NOs:8、9和10中所述的3个CDR的可变区。

-包含如SEQ ID NOs:11、12和13中所述的3个CDR的可变区，和

-包含如SEQ ID NOs:14、15和16中所述的3个CDR的可变区。

-包含如SEQ ID NOs:17、18和19中所述的3个CDR的可变区，和

-包含如SEQ ID NOs:20、21和22中所述的3个CDR的可变区。

-如SEQ ID NO:3中所述的可变区和

-如SEQ ID NO:4中所述的可变区。

(i)重链可变区，包含：

-以始于SEQ ID NO:1的位置45并止于位置54的序列限定的CDR1，

-以始于SEQ ID NO:1的位置66并止于位置87的序列限定的CDR2，和

-以始于SEQ ID NO:1的位置117并止于位置126的序列限定的CDR3；

和

(ii)轻链可变区，包含：

-以始于SEQ ID NO:2的位置44并止于位置56的序列限定的CDR1，

-以始于SEQ ID NO:2的位置66并止于位置76的序列限定的CDR2，和

-以始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列限定的CDR3。

技术人员可以通过使用以下的熟知教导，容易地确定一个已知抗体氨基酸序列中的CDR：Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196,901-917，或Kabat和Wu,1991,J.of Immunology,147,1709-1719或Lefranc等人,2003,Development and Comparative Immunology,27,55-77，或Lefranc等人,1999,Nucleic Acid Research,27,209-212。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含(i)重链可变区，其包含如SEQ IDNOs:5、6和7中所述的三个CDR，和(ii)轻链可变区，包含如SEQ ID NOs:8、9和10中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，本发明的抗体与CSF-1R特异性结合并且包含(i)重链可变区，其包含如SEQ ID NOs:11、12和13中所述的三个CDR，和(ii)轻链可变区，包含如SEQ ID NOs:14、15和16中所述的三个CDR。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含(i)重链可变区，其包含如SEQ IDNOs:17、18和19中所述的三个CDR，和(ii)轻链可变区，包含如SEQ IDNOs:20、21和22中所述的三个CDR。

根据一个优选实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，并且包含(i)如SEQ ID NO:3中所述的重链可变区和(ii)如SEQ ID NO:4中所述的轻链可变区。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含：

(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:1的位置45并止于位置54的序列限定；

CDR2具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:1的位置66并止于位置87的序列限定；并且

CDR3具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:1的位置117并止于位置126的序列限定；

和

(b)由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:2的位置44并止于位置56的序列限定；

CDR2具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:2的位置66并止于位置76的序列限定；并且

CDR3具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列限定；

(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、11和17；

CDR2具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、12和18；并且

CDR3具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、13和19；

和

(b)由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:8、14和20；

CDR2具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、15和21；并且

CDR3具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:10、16和22。

根据另一个实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含以下(i)、(ii)或(iii)的任一个：

(i)

(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:5中所述；

CDR2如SEQ ID NO:6中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:7中所述；

和

(b)由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:8中所述；

CDR2如SEQ ID NO:9中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:10中所述；

或

(ii)(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:11中所述；

CDR2如SEQ ID NO:12中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:13中所述；

并且

(b)由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:14中所述；

CDR2如SEQ ID NO:15中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:16中所述；

或

(iii)(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:17中所述；

CDR2如SEQ ID NO:18中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:19中所述；

和

(b)由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR1如SEQ ID NO:20中所述；

CDR2如SEQ ID NO:21中所述；并且

CDR3如SEQ ID NO:22。

-包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第一可变区；和

-包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第二可变区。

-包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第一可变区；和

-包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的第二可变区。

-在SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25组成的组中选出的重链，和

-在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28组成的组中选出的轻链。

-在SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30组成的组中选出的第一可变区；和

-在SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33组成的组中选出的第二可变区。

根据一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:24组成的重链，和(b)由SEQ ID NO:26组成的轻链。

根据另一个优选实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:25组成的重链，和(b)由SEQ ID NO:27组成的轻链。

根据一个有利的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:24组成的重链，和(b)由SEQ ID NO:28组成的轻链。所述单克隆抗体的例子是单克隆抗体H27K15。

根据一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:29组成的第一可变区，和(b)由SEQ ID NO:31组成的第二可变区。

根据另一个优选的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:30组成的第一可变区，和(b)由SEQ ID NO:32组成的第二可变区。

根据一个有利的实施方案，能够与CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，包含(a)由SEQ ID NO:29组成的第一可变区，和(b)由SEQ ID NO:33组成的第二可变区。所述单克隆抗体的例子是单克隆抗体H27K15。

本发明的抗体，更具体地人抗体，可以具有不同的同种型，如IgG、IgA、IgM或IgE。在优选的实施方案中，本发明的抗体，更具体地人抗体，是IgG。

本发明的抗体可以是糖基化或非糖基化的。

如本文所用，术语“糖基化”指存在与抗体共价连接的糖单位。

根据具体实施方案，本发明涉及通过使合适前体细胞(通常单核细胞或其前体)暴露于有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体，体内或离体产生树突细胞的方法。可以在体内或离体接触细胞。

出于离体目的，有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体可以与细胞接触约6小时、约12小时、约24小时、约48小时或更长时间。细胞可以在离体培养物中维持1、2、3、4、5、6、7或更多日。

前体细胞可以从淋巴样组织获得，所述淋巴样组织包括骨髓、血液、动员的外周血、脾、淋巴结和脐带血。前体细胞例如单核细胞、单核细胞前体或包含单核细胞和/或单核细胞前体的复杂群体可以处于多种发育状态如干细胞、髓样定型祖细胞、单核细胞等。

对于体内目的，该剂量可以根据递送途径、患者体格大小、状况、抗原等变动。施用可以是靶向的，例如至感染的病灶、肿瘤、肺、皮肤等或可以是全身性的，例如肌内、静脉内、腹膜内、真皮内、口服等。

施用可以在联合制剂中或在单独的共存制剂中与目的抗原组合。能够与CSF-1R结合的抗体的施用可以根据需要重复，例如每半日、每日、每半周等，1、2、3、4、5、6次或更多次施用。

可以将通过本发明方法离体产生的DC在任何生理可接受的培养基中施用至受试者，正常情况下以血管内方式施用，不过也可以将它们引入靶向的部位中，其中细胞定居至炎症部位。所施用细胞的数目可以根据正在治疗的疾病的性质和/或目的抗原广泛地变动。

因而，所施用DC的数目可以包括至少约1x10⁵个DC、至少约1x10⁶个DC、至少约1x10⁷个DC、至少约1x10⁸个DC、至少约1x10⁹个DC。此外，DC可以在单次剂量中或以定时的时间间距施用。细胞可以通过注射、导管等引入。细胞可以在液氮温度冷冻并且长时间储藏，能够在解冻时使用。

随本发明离体方法使用的特定目的病状涉及缺少T细胞介导的针对抗原的反应，例如慢性病毒或细菌性感染，缺少针对肿瘤抗原的免疫反应等。在本发明的一个方面，抗原是肿瘤抗原并且用来增强针对身体中存在的肿瘤细胞的宿主免疫反应。

本发明的方法，特别地通过使合适的前体细胞(通常单核细胞或其前体)暴露于有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体在体内产生树突细胞的那些方法，还可用于治疗与不希望的巨噬细胞分化和/或M2极化相关并与CSF-1R相关的病状。本发明的方法可用于治疗涉及癌症诱导的免疫抑制和与CSF-1R相关的疾病。

根据本发明，“患有与不希望的M2巨噬细胞极化相关的病状的患者指癌症、尤其转移癌、进行性纤维化疾病如例如特发性肺纤维化(IPF)、肝纤维化或全身性硬化症(Wynn和Barron，,2010,Semin.Liver Dis.,30,245)、过敏反应和哮喘、动脉粥样硬化以及阿尔茨海默氏病。

根据另一个实施方案，本发明涉及在患有癌症的患者中驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞(M1极化)分化以刺激免疫反应并且抑制M2型巨噬细胞(M2极化)驱动的免疫反应的方法。

根据另一个实施方案，本发明涉及在患有进行性纤维化疾病的患者中驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞(M1极化)分化以刺激免疫反应并且抑制M2型巨噬细胞(M2极化)驱动的免疫反应的方法。

根据另一个实施方案，本发明涉及在患有过敏反应的患者中驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞(M1极化)分化以刺激免疫反应并且抑制M2型(巨噬细胞M2极化)驱动的免疫反应的方法。

根据另一个实施方案，本发明涉及在患有哮喘的患者中驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞(M1极化)分化以刺激免疫反应并且抑制M2型巨噬细胞(M2极化)驱动的免疫反应的方法。

如本文中所用，术语“癌”指，但不限于腺癌、腺泡细胞腺癌、肾上腺皮质癌、肺泡细胞癌、间变癌、基底细胞样癌、基底细胞癌、细支气管癌、支气管源癌、renaladinol癌、胚胎性癌、anometroid癌、纤维板层型肝细胞癌(fibrolamolar liver cell carcinoma)、滤泡性癌、巨细胞癌、肝细胞癌、表皮内癌、上皮内癌、柔脑脊膜癌、髓样癌、黑素癌、脑脊膜癌(menigual carcinoma)、中后肾癌、燕麦形细胞癌、鳞状细胞癌、汗腺癌、移行细胞癌、管状细胞癌、成釉细胞肉瘤、血管结石性肉瘤(angiolithic sarcoma)、葡萄样肉瘤、子宫内膜基质肉瘤、尤因肉瘤、梭细胞肉瘤、巨细胞肉瘤、粒细胞肉瘤(granulositic sarcoma)、免疫母细胞肉瘤、近皮质骨源性肉瘤(juxaccordial osteogenic sarcoma)、矮林肉瘤(coppices sarcoma)、白细胞肉瘤(白血病)、淋巴肉瘤(淋巴肉瘤(lymphosarcoma))、髓样肉瘤、髓细胞样肉瘤(粒细胞肉瘤)、成骨肉瘤(austiogencisarcoma)、骨膜肉瘤、网状细胞肉瘤(组织细胞淋巴瘤)、圆形细胞肉瘤、梭形细胞肉瘤、滑膜肉瘤、毛细管扩张性听源肉瘤(telangiectaticaudiogenic sarcoma)、伯基特淋巴瘤、NPDL、NML、NH和弥漫性淋巴瘤。根据优选的实施方案，本发明的方法涉及治疗至骨的转移癌，其中转移癌是乳腺癌、肺癌、肾癌、多发性骨髓瘤、甲状腺癌、前列腺癌、腺癌、血细胞恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤；头和颈癌；胃肠道癌，包括食管癌、胃癌、结肠癌、肠癌、结直肠癌、直肠癌、胰腺癌、肝癌、胆管或胆囊癌；女性生殖道恶性肿瘤，包括卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌和子宫颈癌；膀胱癌；脑癌，包括神经母细胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；和皮肤癌，包括恶性黑素瘤或鳞状细胞癌。

本发明还涉及用于改善癌症患者治疗的方法，所述的癌症患者正在接受采用癌症治疗剂的化疗，所述方法包括用如上所公开的方法一起共同治疗所述患者。

本发明还涉及用于改善癌症患者治疗的方法，所述的癌症患者正在接受采用癌症治疗性疫苗的免疫疗法，所述方法包括用如上所公开的方法一起共同治疗所述患者。根据优选的实施方案，所述癌症治疗性疫苗是基于病毒的治疗性疫苗。更优选地，所述基于病毒的治疗性疫苗是基于MVA的治疗性疫苗。甚至更优选地，所述基于MVA的治疗性疫苗正携带并表达人乳头瘤病毒16(HPV16)E6和E7癌蛋白和人白介素-2(例如TG4001产物)或正表达Muc1抗原和人白介素-2(例如TG4010产物)。

本发明还包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后的治疗后监测分析，以评估所述治疗的功效和/或评价所述治疗的临床结果。

监测分析包括但不限于，分析由DC和任选地M1型或M2极化巨噬细胞表达和/或分泌的循环型因子。

巨噬细胞M2型极化状态中表达的因子包括但不限于IL-10、IL-6和MCP-1。也可以测定在DC和任选地M1型(巨噬细胞M1极化)状态下表达的因子，例如通过测量IL-12水平，更具体地测量IL-12P70形式水平。通过向患者施用能够与CSF-1R结合的本发明抗体之后测量IL12/IL10比的增加可以理解驱动单核细胞或其前体向DC和任选地M1型巨噬细胞(M1极化)分化并远离M2型巨噬细胞(M2极化)以刺激患者中的免疫反应。

这些检验结果可以来自患者的血清、血液、组织等。

本发明进一步包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后的治疗后监测分析，以监测单核细胞或其前体分化并且建立和/或维持正确的剂量方案。

在这种情况下，可以通过直接分析或借助活化的巨噬细胞表达和/或分泌的因子分析树突细胞(DC)、巨噬细胞M1和/或M2在组织中的存在，获得基线水平，并且在治疗期间施用能够与CSF-1R结合的抗体之后接着一次或多次监测DC和/或M1与M2巨噬细胞在组织中的存在(肿瘤或正常组织)。随后可以确定治疗的优化剂量，所述剂量将导致从M2型巨噬细胞偏向DC和/或M1型巨噬细胞反应。

本发明提供了使用生物标记(生物标记物)评估涉及向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体的治疗的功效的材料和方法，其中已经确定所述生物标记是与所需免疫反应相关的基本上可靠的标识。这些生物标记物存在于从患者获得的生物样品中。治疗启动后马上预测其临床结果的能力将使临床医生和患者能确定无效治疗，告知关于疗程的决定，包括是否放弃或允许执行备选治疗。

本发明提供用于评估涉及向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体的治疗的功效的离体方法。

根据本发明，术语“评估”应当理解为“监测、调整或调节”向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体的治疗。

在某些方面，该方法包括基于免疫疗法治疗之后患者中干扰素γ的水平，评估能够与CSF-1R结合的抗体的功效。

监测分析包括但不限于，分析由DCs和/或M1型和/或M2型巨噬细胞表达和/或分泌的循环型因子。

巨噬细胞M2型极化状态中表达的因子包括但不限于IL-6、MMP9和MCP-1。也可以测定在巨噬细胞M1型极化状态下表达的因子，例如通过测量IL-12水平，更具体地测量IL-12P70形式水平或IL-12/IL-10比。

在某些方面，该方法包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后测量患者的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平；并且基于白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平评估治疗的功效。

在某些方面，该方法包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后数周至少一次测量患者的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平；并且基于白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平评估免疫疗法治疗的功效。

在某些方面，该方法还可以包括在施用能够与CSF-1R结合的抗体之前测量患者的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平。根据优选的实施方案，在所述施用能够与CSF-1R结合的抗体之前所测量的患者的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平值是本发明的“临界值”。

在施用能够与CSF-1R结合的抗体和白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1测量之间的时间可以是1日至约48周或更长(例如，从约1日至约1周、从约1周至约2周、从约2周至约4周、从约4周至约8周、从约8周至约12周、从约12周至约16周、从约16周至约24周、从约24周至约48周或更长)。在本发明的一个优选实施方案中，该时间区间是约5周。类似地，额外的测量(即，第三次、第四次、第五次测量等)可以在第二次测量之后以相似的时间间隔进行。

在相关的方面，该方法包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后确定患者中的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平；将所述水平与临界值比较；并基于与“临界值”相比的白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平，评估免疫疗法治疗的功效。

根据具体实施方案，本发明涉及一种用于评估涉及向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体的治疗的功效的方法，所述方法包括：

(i)向所述受试者施用一个或多个剂量的所述能够与CSF-1R结合的抗体；

(ii)测量至少一次所述施用之后所述受试者的身体内白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平。

根据本发明的备选实施方案，本发明的方法还包含初始步骤，在于测量施用能够与CSF-1R结合的抗体之前患者的身体内白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平。

根据本发明，在从患者获得的生物样品中测量白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平。生物样品包括但不限于血液、血清，组织，和生物来源的其他液体样品、固态组织样品如活组织检查标本。在一个优选实施方案中，生物样品是血液、血浆或血清，其中从患者获得样品是相对简单和非侵入的程序。获得血液或血清的方法是本领域熟知的，不是本发明的部分。

此外，用于检测并定量多肽(包括本发明生物标记物)的许多方法是已知的。这类方法包括但是不是限于基于抗体方法，更具体地基于单克隆抗体的方法。检测并定量生物标记物的具体方法对本发明而言不重要。例如，本发明的材料和方法可以随Luminex技术(Luminex Corporation,Austin,Tex.)或酶联免疫吸附测定(ELISA，许多ELISA试剂盒是市售的，例如由CliniScience,Diaclone,Biosource市售)一起使用。

根据本发明的一个实施方案，通过使用抗体，确定白介素-6、白介素-12、MMP9和/或MCP-1水平。

根据本发明的一个具体实施方案，所述抗体是白介素-6、白介素-12、MMP9或MCP-1特异的。

根据本发明的一个具体实施方案，所述抗体是单克隆抗体。

根据本发明的一个具体实施方案，所述的抗体是经标记的，例如通过荧光素、放射标记物、酶、生物素或通过设计旨在使得用所述抗体标记的细胞可被检测到的任何其他方法标记。这些技术广泛地使用并且是本领域已知的。

在施用能够与CSF-1R结合的抗体之后的患者中测量的白介素-6、MMP9和/或MCP-1水平分别低于所述施用之前的患者中测量的白介素-6和/或MCP-1水平(即临界值)时，将认为本发明的免疫疗法治疗是有效的。

备选地，在施用能够与CSF-1R结合的抗体之后的患者中测量的白介素-12水平高于所述施用之前的患者中测量的白介素-12水平(即临界值)时，将认为本发明的免疫疗法治疗有效。

本发明进一步包括向患者施用能够与CSF-1R结合的抗体之后的治疗后监测分析，以监测巨噬细胞极化并且建立和/或维持正确的剂量方案。

根据这种情况，可以通过直接分析或借助活化的巨噬细胞表达和/或分泌的因子分析DC和/或M1和/或M2巨噬细胞在循环中的存在，获得基线水平，并且在治疗期间施用能够与CSF-1R结合的抗体之后接着一次或多次监测巨噬细胞在循环中的存在。

然后可以确定治疗的优化剂量，所述剂量将导致单核细胞或其前体从M2型巨噬细胞明显地偏向分化成DC和/或M1型巨噬细胞以刺激免疫反应。

本发明的方法可用于治疗涉及炎症和与CSF-1R相关的疾病。

附图说明

图1：H27K15对正在分化的巨噬细胞无细胞毒性，而其他抗CD115mAb引起大量细胞死亡

细胞在单核细胞或其前体在抗CD115mAb或F(ab’)₂存在或不存在时与GM-CSF和CSF-1一起或与GW2580一起培养6日之后计数。对照包括用利妥昔单抗或利妥昔单抗F(ab’)₂处理或不添加任何化合物情况下的培养物。显示了每种培养条件下获得的5个显微镜视野中细胞计数的平均数±标准差。

图2：抑制在单克隆抗体H27K15存在下分化的人巨噬细胞中的CD64(FcγRI)表达

通过IC/FC分析巨噬细胞的CD64表面表达，其中所述巨噬细胞在来自3位不同血液供体的单核细胞或其前体与GM-CSF和CSF-1一起培养6日之后获得。上半小图：在来自用单克隆抗体H27K15(左，粗线)或用GW2580(右，粗线)治疗或其相应阴性对照利妥昔单抗(左，细线)治疗或无治疗(右，细线)的供体1的培养物中的CD64染色。下半小图：用10、1或0.1μg/ml的测试化合物处理的巨噬细胞培养物中与荧光强度的中位数与相应阴性对照中的那些中位数比较：H27K15对利妥昔单抗、H27K15衍生的F(ab’)₂对利妥昔单抗衍生的F(ab’)₂、mAb2-4A5或9-4D2对大鼠IgG1、GW2580对无处理。将CD64表达减少的百分数计算为：100-[100x使用测试化合物的荧光强度中位数/使用对照的荧光强度中位数]。显示来自3位血液供体的CD64表达减少的平均百分数。＊例外是按等摩尔浓度：6.6、0.6和0.06μg/ml使用的F(ab’)₂。

图3：通过H27K15诱导CD86^bright SSC^low巨噬细胞群体

上半小图：显示来自供体3的巨噬细胞的CD86染色(x-轴)和侧向散射(SSC，y-轴)的点图，所述巨噬细胞在H27K15(左)或阴性对照利妥昔单抗(右)存在下分化6日。对H27K15诱导的CD86^bright SSC^low细胞群体设置门。下半小图：采用10、1或0.1μg/ml测试化合物时CD86^bright SSC^low细胞的百分数与相应阴性对照中的那些百分数比较：H27K15对利妥昔单抗、H27K15衍生的F(ab’)₂对利妥昔单抗衍生的F(ab’)₂、GW2580对无处理。将CD86^bright SSC^low细胞群体增加的百分数计算为：100x采用测试化合物时CD86^bright SSC^low细胞百分数/采用对照时CD86^bright SSC^low细胞的百分数。显示来自3位血液供体的CD86^bright SSC^low细胞群体增加的平均百分数。＊例外是F(ab’)₂：6.6、0.6和0.06μg/ml。

图4：H27K15诱导IL-12p70分泌并增加巨噬细胞IL-12/IL-10比

在来自巨噬细胞的培养上清液中滴定IL-12p70和IL-10，其中所述巨噬细胞在mAb H27K15(1μg/ml)、GW2580(1μM)或它们的相应阴性对照利妥昔单抗存在下或无处理时分化6日。左小图：来自3位血液供体的巨噬细胞培养物中的IL-12p70水平和IL-10水平(pg/mL)。右：对每位血液供体和每种培养条件计算IL-12p70(pg/mL)/IL-10(pg/mL)。在其中不可检出IL-12p70的样品中(低于检测限11pg/ml)，其水平是任意地设在1pg/ml以计算IL-12p70/IL-10比。

图5：H27K15抑制巨噬细胞分泌MCP-1/CCL2和IL-6

在来自巨噬细胞的培养上清液中滴定MCP-1和IL-6，其中所述巨噬细胞在mAb H27K15(1μg/ml)、GW2580(1μM)或它们的相应阴性对照利妥昔单抗存在下或无处理时分化6日。对于3位血液供体，将MCP-1产生(上半小图)或IL-6产生(下半小图)减少的百分数计算为：100-[100x采用测试化合物时的细胞因子浓度(pg/mL)/采用对照时细胞因子浓度(pg/mL)]。

图6.通过mAb H27K15下调MMP-9产生

从3位不同血液供体分离的单核细胞在GM-CSF和CSF-1存在下，在具有或没有mAb H27K15、利妥昔单抗或GW2580的情况下分化6日。将MAb H27K15或利妥昔单抗(0.1、1或10μg/ml)或等摩尔浓度衍生自两种mAb的F(ab)’₂添加至培养物。通过ELISA(R&D Systems)滴定6日培养上清液中的MMP-9。

图7.MAb H27K15抑制CD163⁺M2型巨噬细胞的分化。

收获与GM-CSF和CSF-1一起培养6日后所获得的细胞并且与含有人IgG Fc片段以饱和Fc受体的PBS在4℃温育20分钟。随后将荧光染料缀合的mAb(抗CD14-PerCP-Cy5.5、抗CD163-PE、抗CD206-APC、抗CD1a-CD1a-FITC，BD Biosciences)在4℃与每份样品温育20分钟。使用具有DIVA软件的FACSLSR-II(BD biosciences)进行FCM分析。展示来自3位不同血液供体的数据。

图8.通过mAb H27K15上调M1:M2巨噬细胞比。

来自2位不同供体的单核细胞与GM-CSF和CSF-1一起在1μg/ml的抗CD115mAb H27K5或对照IgG₁利妥昔单抗存在或不存在下培养。在细胞分化6日后确定巨噬细胞群体当中M1(CD14⁺CD163^-)型巨噬细胞和M2(CD14⁺CD163⁺)型巨噬细胞之间的比例。

图9.MAb H27K15使得单核细胞分化偏向DC而非巨噬细胞。

收获与GM-CSF和CSF-1一起培养6日后所获得的细胞并且与含有人IgG Fc片段以饱和Fc受体的PBS在4℃温育20分钟。随后将荧光染料缀合的mAb(抗CD14-PerCP-Cy5.5、抗CD163-PE、抗CD206-APC、抗CD1a-CD1a-FITC，BD Biosciences)在4℃与每份样品温育20分钟。使用具有DIVA软件的FACSLSR-II(BD biosciences)进行FCM分析。展示来自6位不同血液供体的数据。

图10.H27K15处理增加以GM-CSF和CSF-1分化的单核细胞的免疫刺激能力。

在同种异型PBMC和来自用GM-CSF和CSF-1分化并用mAbH27K15或利妥昔单抗按4个不同浓度处理6日的单核细胞中的细胞之间的MLR。T(-)：未刺激的PBMC。T(+):用抗CD3mAb(BD Pharmingen)和IL-2(125UI/ml)刺激的PBMC，对应于100％增殖。正在增殖的PBMC的百分数计算为：采用测试mAb时的％CFSE低细胞x100/采用T(+)时的％CFSE-低细胞。

图11.单克隆抗体H27K15抑制与CSF-1或IL-34一起培养的单核细胞产生MCP-1/CCL2

图11A：在48孔平板中与CSF-1或IL-34一起在单克隆抗体H27K15或同种型对照利妥昔单抗(二者均在1μg/ml)存在或不存在下培养6日后，滴定来自单核细胞衍生细胞的培养上清液中的MCP-1/CCL2。使用来自测试的3位血液供体中一位血液供体代表的细胞，获得所示的结果。

图11B：使用来自相同供体的在96孔板中以相似条件培养的细胞，平行评估细胞生存力。生存力仅略微受H27K15抗体影响。

实施例

在本研究自始至终使用以下商业单克隆抗体：抗人CD115mAb2-4A5-4(大鼠IgG1_.Κ，Santa Cruz)、9-4D2(大鼠IgG1，Biolegend)和同种型对照大鼠IgG1(R&D Systems)。mAb1.2SM是专利申请WO 2009/026303中公开的序列1.2SM的抗CD115mAb。利妥昔单抗从Roche获得。通过胃蛋白酶消单克隆抗体，随后通过凝胶过滤法纯化在Transgene产生F(ab’)₂。

人巨噬细胞分化分析：方案

暗黄覆盖层由Etablissementdu Sang(EFS，Strasbourg)提供。通过在ficoll梯度上离心获得外周血单核细胞(PBMC)。使用CD14抗体包被的小珠(Miltenyii)，通过免疫磁力细胞分选法纯化单核细胞。富集的单核细胞悬液纯度超过95％。单核细胞在48孔平板(3x10⁵个细胞/孔)在补充有10％热灭活的胎牛血清和1％三抗生素混合物(青霉素、链霉素、新霉素)的RPMI-Glutamax^TM培养基中分化6日。从第0日至第3日在细胞培养基中添加GM-CSF(10ng/ml)。在第0日添加H27K15、其他抗体或内部对照GW2580(LC Labs)。在分离后第3日，将单核细胞用PBS洗涤并且在补充有CSF-1(10ng/ml)和GM-CSF(2ng/ml)的培养基中，在抗体或GW2580存在或不存在下进一步培育。在第6日，将上清液收集并且储存在-20℃。使细胞从塑料板脱离并且通过IC/FC(免疫细胞化学/流式细胞术)，对三次重复的库分析细胞大小和FcγR和CD86的表达。通过multiplex(Bioplex，Bio-Rad)或通过ELISA，对培养上清液中的细胞因子和趋化因子定量。

结果

抗CD115mAbH27K15对巨噬细胞无细胞毒性，但使其分化向M1型极化

为了研究mAb H27K15是否可能影响巨噬细胞分化，将纯化的CD14⁺单核细胞在已知分别诱导M1巨噬细胞和M2型巨噬细胞的GM-CSF和CSF-1存在下培养7日(Akagawa K.S.,2002；Verreck F.A.等人,2004)。将三个不同剂量的mab H27K15或同种型对照利妥昔单抗(0.1、1或10μg/ml)在培养开始时并在3日后添加至培养基。在相等的摩尔浓度平行测试从H27K15或从利妥昔单抗产生的F(ab’)₂。测试从mAb1.2SM(WO2009/026303)产生的F(ab’)₂以便与衍生自H27K15或利妥昔单抗的F(ab’)₂比较。分析针对人CD115的已知阻断性mAb、2-4A5或非阻断性mAb9-4D2(Sherr C.J.等人，1989)并且与同种型对照大鼠IgG1比较。作为另一个对照，将小分子CD115酪氨酸激酶抑制剂GW2580以1μM(先前显示体外抑制人单核细胞的CSF-1依赖性增殖和鼠巨噬细胞分化的浓度)添加至某些培养物(Conway J.G.等人,2005；Paniagua R.T.等人,2010)。

6日培养物的显微镜观察结果显示，与未处理的细胞相比，在用H27K15、利妥昔单抗、mAb9-4D2、IgG1、H27K15F(ab’)₂或利妥昔单抗F(ab’)₂处理的孔之间无明显差异，与血液供体无关。就mAb SM1.2F(ab’)₂处理的孔而言，对于所评价的3个剂量(0.066、0.66和6.6μg/ml)，观察到全部供体的完全细胞毒性。就mAb2-4A5处理的孔而言，对于测试的2个最高剂量(1μg/ml和10μg/ml)，观察到全部供体的完全细胞毒性。对于最低剂量(0.1μg/ml)，细胞毒性仅是部分的。总之，这些结果没有揭示除mAbSM1.2F(ab’)₂和mAb2-4A5之外的任何抗体的任何毒性。对于采用1μM对照GW2580的细胞，取决于显微镜视野，将相对细胞毒性可视化为残片，并且在全部血液供体中观察到较低细胞密度。在第6日通过计数平板每个孔中的5个显微镜视野(孔中心内一个视野和在中心和孔侧面之间一半距离处4个视野)，分析细胞生存力。基于以上观察结果，还对显示部分或完全细胞毒性的化合物(mAb SM1.2F(ab’)₂、mAb2-4A5和GW2580)处理的孔进行计数。图1显示通过各个孔计数的5个视野的平均数±标准差。一些抗体显示部分或完全细胞毒性。因此，与其相应对照相比，衍生自mAbSM1.2的F(ab’)₂在全部浓度均引起严重细胞死亡，并且mAb2-4A5也大幅度减少巨噬细胞数目。在GW2580存在下，与未处理的培养物相比，在第6日保留大约70％的巨噬细胞数目。

通过IC/FC对第6日培养物分析活化性FcγR CD64(FcγRI)的表面表达和活化标志物CD86的表面表达。如图2上显示，用H27K15或用GW2580处理时，CD64的表面表达大幅度减少。H27K15在测试的全部剂量几乎完全抑制CD64表达。大鼠抗人CD115mAb2-4A5还减少CD64表面表达，但是以剂量依赖性方式减少表达。非CD115阻断性mAb9-4D2不调整CD64表达水平。有趣地，衍生自H27K15的F(ab’)₂还下调CD64表达，但是比完整mAb力度更弱并且仅在1μg/ml或10μg/ml测试时如此，显示H27K15的作用部分地依赖Fc。

在第6日巨噬细胞中分析激活标志物/共刺激分子CD86的表达时，我们发现以CD86^bright SSC^low表型为特征的细胞亚群出现在用mAb H27K15或用GW2580处理的培养物中(图3)。未观察到用H27K15衍生的F(ab’)₂诱导这个圆形细胞群体表达高水平的CD86，提示这个现象中H27K15Fc区的功能。对这个群体设门显示CD86^bright SSC^low细胞主要是CD64^低至CD64-阴性(数据未显示)。

滴定第6日培养上清液中的IL-12p70和IL-10。与人IgG₁利妥昔单抗一起培养或无试剂情况下培养之后，来自所测试的3位供体的巨噬细胞不产生任何可检测的IL-12p70。在mAb H27K15存在下的培养诱导来自3位血液供体中2位供体的巨噬细胞分泌IL-12p70。相反，用GW2580处理后检测不到IL-12p70(图4)。由来自全部供体的静息性巨噬细胞产生的IL-10因H27K15在来自供体1的巨噬细胞中上调，但是在供体2中不上调，并且在供体3中仅微弱增加。因此，IL-12p70/IL-10比在测试的3位血液供体中上调(图4，右小图)。小分子GW2580还增加IL-12p70/IL-10比，但是还归因于抑制IL-10产生。

这些结果显示，用mAb H27K15靶向正在分化的巨噬细胞上的CD115不仅大幅度下调CD64/FcγRI的表达，还诱导表达高水平CD86活化标志物的SSC^low细胞群体。此外，H27K15可以在全部供体中诱导IL-12p70产生并上调IL-12p70/IL-10比，表示巨噬细胞向M1型极化。

令人震惊地，发现当巨噬细胞在mAb H27K15或GW2580存在下分化时，趋化因子MCP-1/CCL2的产生几乎被完全抑制(图5，上半小图)。在测试的3位供体中，通过H27K15对MCP-1分泌的抑制是有效并且范围是74％至99％。小分子GW2580在抑制MCP-1产生方面与H27K15同样有效。在全部供体中，第6日巨噬细胞培养上清液中的IL-6水平也因H27K15或GW2580降低(图5，下半小图)。与采用GW2580(从75％至96％)相比，H27K15抑制IL-6产生的幅度较小(从27％至70％)。H27K15介导对巨噬细胞产生MCP-1和IL-6(Roca H.等人，2009)(两种涉及M2巨噬细胞极化的可溶性因子)的抑制是另一项表明抗CD115mAb使巨噬细胞向M1再极化的证据。

抗CD115mAb H27K15抑制与GM-CSF和CSF-1一起培养的单核细胞产生MMP-9

已知肿瘤相关的巨噬细胞产生MMP-9(基质金属蛋白酶9)，所述MMP-9既通过降解胞外基质促进肿瘤细胞转移，又通过肿瘤微环境中诱导VEGF释放促进新生血管化。由巨噬细胞产生的MMP-9是肿瘤中血管生成开关的主要调节物。

允许来自3位不同供体的CD14⁺单核细胞在已知诱导巨噬细胞分别向M1型和M2型分化的GM-CSF和CSF-1二者存在下分化。将MAbH27K15或利妥昔单抗(作为阴性对照使用)以0.1、1或10μg/ml添加至培养物。平行分析等摩尔浓度衍生自两种mAb的F(ab)’₂。在相同测定法中测试酪氨酸激酶抑制剂GW2580，先前显示所述GW2580在体外抑制人单核细胞的CSF-1依赖性增殖和鼠巨噬细胞的分化。在6日培养后，通过ELISA测量上清液中的MMP-9浓度(图6)。在3位已测试供体的2位中，当培养物用mAb H27K15或用GW2580处理时，存在MMP-9产生的剂量依赖性减少。采用衍生自H27K15的F(ab)’₂时，在这两位相同供体中存在抑制作用。因此，mAb H27K15能够减少正在分化的M2巨噬细胞分泌MMP-9。

这些在巨噬细胞培养物中的观察结果表明，向癌症患者施用的H27K15可以下调肿瘤微环境中的MMP-9浓度。

MAb H27K15抑制CD163阳性M2型巨噬细胞的分化。

已经鉴定血红蛋白清道夫受体(CD163)为TAM表达的M2极化巨噬细胞的标志物，尤其在乳腺癌中如此。在从与GM-CSF和CSF-1一起培养的人单核细胞衍生的第6日巨噬细胞中，通过流式细胞术分析CD163的表面表达。图7显示分化的培养物中CD163-阳性细胞的百分数。与mAbH27K15一起培养抑制全部3位测试的供体中CD163⁺巨噬细胞群体的分化。在1μg/ml H27K15存在下，与利妥昔单抗处理的对照培养物相比，CD163-阳性细胞百分数减少2.5倍至4倍。GW2580在仅2/3供体中具有相同作用。衍生自H27K15的F(ab)’₂对CD163表达的影响微弱或无影响，表明抗CD115mAb的Fc区参与其作用模式。

如借助表面CD163表达的这些变化所佐证并且与先前结果一致，用mAb H27K15靶向CD115抑制M2型巨噬细胞的分化。

MAbH27K15使单核细胞分化从M2巨噬细胞偏向M1巨噬细胞

在衍生自单核细胞的细胞中分析M1巨噬细胞和M2巨噬细胞之间的比率，其中所述单核细胞在mAb H27K15或利妥昔单抗存在或不存在下与GM-CSF和CSF-1一起培养。在培养来自3位不同血液供体的细胞6日后，通过流式细胞术对M1(CD14⁺CD163^-)巨噬细胞对比M2(CD14⁺CD163⁺)巨噬细胞定量。图8显示对于每种培养条件而言CD14⁺巨噬细胞群体之间计算的M1/M2巨噬细胞比。与相同浓度的对照IgG₁利妥昔单抗或与未处理的培养物相比，1μg/ml的MAb H27K15增加来自所测试的3位供体的巨噬细胞中的M1/M2比。

Mab H27K15使单核细胞分化从M2巨噬细胞偏向树突细胞(DC)

通过FC对GM-CSF和CSF-1存在下培养6日后获得的单核细胞衍生性细胞表型分析单核细胞-巨噬细胞标志物CD14和M2型巨噬细胞的常见标志物CD163及CD206的表达(Porcheray等人,2005,ClinExpImmunol.；142(3):481-489.；Schmieder等人,2012.SeminCancerBiol.；22(4):289-297)。因为已经报道，CSF-1，与IL-6一起，抑制DC的分化(Menetrier-Caux等人,1998,Blood.；92(12):4778-4791)，所以对培养物分析DC标志物CD1a的细胞表面表达。图9A显示尽管CD14⁺CD163⁺CD206⁺M2-巨噬细胞已经在H27K15处理的培养物中消失，但同时诱导CD1a⁺CD14^-细胞群体。图9B显示在第6日在来自3位不同血液供体的培养物中测量的CD14⁺CD1a^-群体与CD14^-CD1a⁺群体的百分数。在3/3位供体中，在采用mAb H27K15分化单核细胞后CD1a⁺CD14^-树突细胞替换CD1a^-CD14⁺巨噬细胞。

这些结果显示mAb H27K15可以使M2极化巨噬细胞的分化偏向DC。

在mAb H27K15存在下用GM-CSF和CSF-1分化的单核细胞具有增加的免疫刺激能力

在mAb H27K15存在下与GM-CSF和CSF-1一起培养6日的单核细胞产生缺少M2型巨噬细胞但是包含DC的细胞群体。已知DC或M1型巨噬细胞比M2极化巨噬细胞在刺激T细胞反应方面更有力(Chomarat等人,2000,NatImmunol.；1(6):510-514；Duluc等人,2007Blood.；110(13):4319-4330)。我们因此测试第6日培养物在混合淋巴细胞反应(MLR)中刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力。用LPS刺激与mAbH27K15或利妥昔单抗一起培养后获得的单核细胞衍生性细胞48小时，收获并与CFSE标记的同种异型PBMC一起共培养5日。通过对CFSE-低细胞设门，使用FC测量已经在共培养时增殖的PBMC的百分数。图10显示与利妥昔单抗相比，与H27K15存在下分化的单核细胞共培养时，正在增殖的PBMC的百分数增加。

这个结果显示在mAb H27K15存在下用GM-CSF和CSF-1分化的单核细胞具有增加的诱导淋巴细胞增殖能力，这与抑制M2型巨噬细胞和诱导DC相关。这些数据表明mAb H27K15可以在治疗的患者中促进免疫反应。

MAb H27K15抑制与CSF-1或IL-34一起培养的单核细胞产生MCP-1/CCL2

已经鉴定白介素-34(IL-34)为另一种CD115配体，其生物学作用可比于CSF-1的那些作用(Droin和Solary，2010,J；Leukoc Biol 87:745-7)。纯化的CD14⁺单核细胞在48孔板或96孔板的补充有CSF-1或IL-34(50ng/ml，Peprotech)的培养基中培养。在第0日和第3日，将MAb H27K15或利妥昔单抗添加至一些孔。在第6日，对来自48孔平板的培养上清液采样并通过ELISA(R&D Systems)滴定趋化因子MCP-1/CCL2。在96孔板中使用发光细胞生存力测定法(Promega)测量细胞生存力。

图11A显示能够诱导单核细胞产生MCP-1/CCL2的IL-34以及CSF-1。与同种型对照(利妥昔单抗)或未处理的培养物相比，MAb H27K15在两种培养条件下大幅度降低趋化因子水平。这个结果显示mAb H27K15可以通过CSF-1或IL-34抑制CD115刺激作用，并且有力地下调MCP-1/CCL2的产生。已知这种趋化因子在募集M2极化的TAM中发挥主要作用(Sica等人,2006,Eur J Cancer 42:717-27)。

这种对MCP-1/CCL2产生的抑制作用不归因于细胞毒性，如细胞生存力测量所显示(图11B)。如前文对GM-CSF和CSF-1存在下分化的单核细胞所显示(图1和图5)，在不耗尽与CSF-1或IL-34单独培养的单核细胞情况下mAb H27K15下调MCP-1产生。

Akagawa K.S.Internationaljournalofhematology.(2002)76(1):27-34.

Chomarat P,Banchereau J,Davoust J,Palucka AK.IL-6switches the differentiation of monocytes from dendritic cells tomacrophages.NatImmunol.2000；1(6):510-514

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Verreck等人,.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.(2004)101(13):4560-4565.

Claims

1.一种体内或离体产生树突细胞的方法，其通过使合适前体细胞暴露于有效剂量的能够与CSF-1R结合的抗体实现。

2.权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于增加患有与不希望的巨噬细胞分化和M2极化相关的病状的患者中树突细胞库的体内方法，其中所述方法包括向所述患者施用有效量的能够与CSF-1R结合的抗体的步骤。

3.权利要求2所述的方法，其中患者还患有与CSF-1R活性相关的病状。

4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法减少巨噬细胞M2库。

5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还增加M1型巨噬细胞库。

6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法抑制巨噬细胞MCP-1、IL10和IL-6的产生。

7.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法下调巨噬细胞上的表面FcγRI(CD64)和FcγRIII(CD16)表达。

8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法上调患者样品例如血液样品中的IL-12/IL10比。

9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法减少以下至少一种：

(i)TAM募集入肿瘤；

(ii)至少一种巨噬细胞促肿瘤功能；

(iii)肿瘤血管生成；

(iv)肿瘤侵入和转移；

(v)肿瘤生长；

(vi)肿瘤细胞增殖。

10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中与不希望的M2极化相关的所述病状选自癌症、哮喘、过敏反应和进行性纤维化疾病。

11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与CSF-1R结合的所述抗体是与位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至41之间的至少一个表位结合的抗体。

12.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与CSF-1R结合的所述抗体是与位于SEQ ID NO:23的氨基酸位置20至39之间的一个表位、与SEQ ID NO:23的氨基酸Asn72、Ser94-Ala95-Ala96、Lys102、Asp131-Pro132-Val133和Trp159结合的抗体。

13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与人CSF-1R结合的所述抗体是不与IL-34配体竞争结合至CSF-1R受体的抗体。

14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与人CSF-1R结合的所述抗体是部分地与CSF-1配体竞争结合至CSF-1R受体的抗体。

15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与人CSF-1R结合的所述抗体是与人CSF-1R特异性结合的抗体，所述抗体包含：

(a)由以下式限定的第一可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

并且

(b由以下式限定的第二可变区

FR1-CDR1–FR2–CDR2–FR3–CDR3–FR4

其中：

FR1、FR2、FR3和FR4各自是构架区；

CDR1、CDR2和CDR3各自是互补决定区；

其中：

CDR3具有至少五个连续氨基酸并且以始于SEQ ID NO:2的位置109并止于位置117的序列限定。

16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中能够与CSF-1R结合的所述抗体包含(a)由SEQ ID NO:24组成的重链，和(b)由SEQ IDNO:28组成的轻链。