KR102403660B1 - CLEVER-1, TNF-α 및 HLA-DR 결합제를 사용하는 면역 활성화의 진단 - Google Patents

CLEVER-1, TNF-α 및 HLA-DR 결합제를 사용하는 면역 활성화의 진단 Download PDF

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Abstract

개체에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 그들의 표현형을 M2 대식세포로부터 M1 대식세포로 전환시키기 위해 대식세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 그들의 표현형을 전환시키는 대식세포 능력을 사용하는 방법에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 본 발명은 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제가 환자에게 투여될 경우 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 모니터링하여 항-CLEVER-1 요법의 효능을 평가하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 증가된 TNF-알파 분비 또는 HLA-DR 발현은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타낸다.

Description

CLEVER-1, TNF-α 및 HLA-DR 결합제를 사용하는 면역 활성화의 진단
본 발명은 면역 활성화에 사용하기 위한 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 및 이에 기초하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 배경을 밝히기 위해 본원에 사용된 공보 및 다른 자료, 특히 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하는 경우는 참고로 포함된다.
CLEVER-1은 스타빌린-1 또는 Feel-1로서 공지되기도 한, WO 03/057130, 일반적인 림프 내피 및 혈관 내피 수용체-1에 개시된 단백질이다. CLEVER-1은 또한 문헌(참조: Kzhyshkowska J. (2010), TheScientificWorldJOURNAL 10, 2039-2053)에 의해 검토되었다. CLEVER-1은 림프구 내피 세포, 특정 혈관 내피 세포에서 발현되지만, 대식세포의 하위집단에서도 발현된다. CLEVER-1은 2형 대식세포 및 인간 단핵구의 서브세트에 소거 능력을 부여하는 다작용성 분자이다.
대식세포는 종양의 성장 또는 퇴화에 중요한 역할을 한다. 종양 관련 대식세포(TAM)의 기전은, 예를 들면, 공보(참조: Noy R. and Pollard J. W., "Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy", published in Immunity 41, July 17, 2014, p. 49-61)에 개시되어 있다. M2 대식세포는 인간의 암에서 우세하고, 종양 성장을 자극하지만, 이러한 종양 촉진성 대식세포는 암 성장을 늦추거나 정지시키는 것을 목표로 하는 M1 대식세포 또는 전염증성 대식세포로도 칭명되는 종양 성장 억제 대식세포로 조절될 수 있다. 결과적으로, 대식세포 표현형의 조절은 다양한 암의 면역요법에서 유망한 접근법이다. 그러나, TAM의 표적화를 목표로 하는 현재 이용 가능한 치료제로 암을 치료하려는 시도는 바람직하지 않은 부작용을 동반했다, 예를 들면, 대식세포 치료 접근법은 모든 대식세포를 표적으로 할 때 전신 독성을 갖거나 역설적으로 종양 성장을 촉진시킬 수 있다는 것이 주시되었다.
인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제가 그들의 표현형을 M2 대식세포로부터 M1 대식세포로 전환시키기 위해 대식세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특히, TAM 상의 CLEVR-1에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항체 및 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자를 사용하여 종양 촉진성 대식세포(M2)의 전염증성 대식세포(M1)로의 조절을 달성할 수 있다. 본 발명은 표현형을 전환시키는 대식세포 능력을 이용하는 방법에 관한 것이다.
이제, M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절이 대식세포/단핵구 TNF-α 분비 및/또는 HLA-DR 발현을 측정함으로써 모니터링될 수 있다는 것을 밝혀내었다. 결론적으로, 본 발명은 환자에서 항-CLEVER-1 요법의 효능을 모니터링하고/하거나 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명은 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 환자에게 투여한 후 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절 발달을 모니터링함으로써 항-CLEVER-1 요법의 효능을 평가하는 방법으로서,
(a) 상기 환자로부터 채취된 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구(PBL)를 수득하는 단계;
(b) 상기 PBL의 TNF-α 분비를 측정하는 단계, 및/또는
(c) CD14 양성 PBL 상의 HLA-DR 발현을 측정하는 단계, 및
(e) 단계 (b) 및 (c)에서 측정된 TNF-α 분비 및/또는 HLA-DR 발현의 값을 항-CLEVER-1 치료 효능의 평가를 위한 대조군 값과 비교하는 단계로서, 상기 대조군 값이 상기 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값이며, 증가된 TNF-알파 분비 또는 HLA-DR 발현이 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내는, 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 개체 중 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하여 종양 또는 항원 면역 억제를 제거하는 데 사용하기에 적합하다. 바람직하게는, 본 발명은 CLEVER-1 분자 상의 에피토프에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항체 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자(들)에 관한 것으로서, 상기 에피토프는 불연속적이고, 인간 CLEVER-1의 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함한다.
대식세포 표현형의 조절은 T-세포 활성화를 증가시키고, 결국, 예를 들면, 암 유래된 면역 억제의 제거를 유도한다. 결과적으로, 본 발견은 개체에서 면역계에 영향을 미치는 방법을 제공하고, 특히 암을 치료하거나 전이를 예방하는 데 유용하지만, 이 접근법에 국한되지 않는다. 따라서, TAM 상의 CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항체 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자는 개체에서 암을 치료하거나 전이를 예방하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 악성 성장 주위의 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항체 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자(들)는 또한 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 감염성 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
따라서, 항-CLEVER-1 요법의 효능을 평가하기 위한 본 발명에 따르는 방법은 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제가 환자에게 투여될 때, 암을 치료하거나 전이를 예방하는 데 또는 만성 감염을 치료하는 데 사용하기 위해 특히 적용될 수 있다.
또한, CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제는 또한 백신의 보조제로서 사용하기에 적합하고, 여기서 백신 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CLEVER-1에 결합할 수 있는, 바람직하게는 본원에 개시된 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 개체에서 암을 치료하거나 전이를 예방하는 데 또는 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 있어서 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하는 상기 방법의 사용에 관한 것이다.
도 1a는 CD14 양성 세포로부터 HLA-DR 발현의 결정 결과를 도시한다. 세포는 인간화 항체 VH3/VK5를 표적화하는 인간 IgG 또는 CLEVER-1로 처리했다. CD14 양성 세포로부터 HLA-DR 발현을 결정하는데 사용된 방법은 실험 파트에서 상세하게 제시된다.
도 1b는 TNF-α ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 배양 배지로부터 측정된 가용성 TNF-α의 결과를 도시한다.
도 2a는 CLEVER-1에 결합하는 항체 투여 후 동계 E0771 유방 암종에서 TAM 재분극화를 도시한다. TAM 재분극화는 유동 세포 계측법에 의해 MHCII(인간 HLA-DR에서)를 발현하는 증가된 대식세포 집단에 의해 측정된다. 각 점은 하나의 마우스에서 MHCII고 CD11b+F4/80+ TAM의 백분율을 나타낸다.
도 2b는 CLEVER-1에 결합하는 항체 투여 후 E0771 동계 유방 암종으로부터 TAM 상의 TNF-α의 증가된 분비를 도시한다. 각 점은 하나의 마우스로부터 단리된 TAM를 나타낸다.
정의 및 본 발명의 상세한 설명
용어 "CLEVER-1"은 WO 03/057130, 일반적인 림프 내피 및 혈관 내피 수용체-1에 개시된 단백질을 나타내기 위해 사용된다.
용어 "인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제"는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 항체 및 이의 단편 또는 펩티드 등을 포함하는 제제를 의미한다. 상기 제제는 또한 본원에서 정의된 인간 CLEVER-1의 특정 에피토프에 결합하기에 적절한 친화도를 갖는 임의의 다른 거대분자일 수 있다.
용어 "항체 또는 이의 단편"은 개체에서 CLEVER-1 분자를 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포괄하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 특히, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편 및 단일 쇄 항체(예: Fab, Fv)뿐만 아니라 키메라, 인간화 또는 영장류 항체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
모두 특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig로 기탁된 특히 바람직한 CLEVER-1 길항제 모노클로날 항체 3-266(DSM ACC2519) 및 3-372(DSM ACC2520)는 WO 03/057130에 개시되어 있다.
용어 "환자" 또는 "개체"는 인간을 의미한다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 완전한 치료뿐만 아니라 상기 질환의 개선 또는 완화를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "예방"은 완전한 예방, 예방뿐만 아니라 상기 질환 또는 장애를 갖는 질병에 걸릴 개체의 위험을 감소시키는 것을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
대식세포는 다음 두 개의 별개의 표현형으로 구분될 수 있다: M1 및 M2 대식세포. M1 대식세포는 전염증성 사이토카인 및 보조 자극 분자를 대량 생산하는 고전적인 전염증성 대식세포이며, T-세포 반응의 활성화에 매우 효과적이다. 대조적으로, M2 대식세포는 항염증성 사이토카인을 합성하고 조절 T 세포를 유도하여 항원-구동된 T 세포 활성화를 크게 저해하는 면역 억제 세포이다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 종양 환경 내에서 M2 대식세포(종양 촉진성 대식세포)로 성숙하고 항종양 면역 반응을 억제하고 암 성장에서 중요한 단계인 혈관신생 전환을 중재함에 따라 해로운 것으로 간주된다. M2 대식세포는 M1 대식세포(전염증성 대식세포)로 조절될 수 있고, M2에서 M1로의 이러한 표현형 전환은 직접적으로 또는 간접적으로 종양 거부를 유발할 수 있다.
본 맥락에서, "M1 대식세포" 또는 "전염증성 대식세포"라는 표현은 대식세포/단핵구 TNF-알파(TNF-α) 분비 또는 HLA-DR 발현의 증가된 측정 수준을 특징으로하는 대식세포를 의미한다. M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절은 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 대조군 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교하여 단핵구 TNF-α 분비 및 또한 HLA-DR 발현을 증가시킬 것이다. 이러한 마커의 수준은 개체마다 다를 수 있고, 예를 들면, 인터페론 감마와 같은 사이토카인 및 LPS 활성화가 M2 대식세포에 의한 TNF-α 발현을 증가시킬 수 있기 때문에, 단핵구 TNF-α 분비와 HLA-DR 발현의 측정 값을 동일한 환자의 값과 비교하는 것이 중요하다.
놀랍게도, M2 대식세포는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제에 의해 상기 대식세포를 접촉시킴으로써 M1 대식세포를 조절하도록 활성화될 수 있음이 밝혀졌다. 특히, 악성 종양과 관련된 M2 대식세포는 TAM 상의 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제에 의해 상기 대식세포를 접촉시킴으로써 M1 대식세포로 조절되거나 재분극될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 두 표현형이 동시에 존재할 수 있으며, 표현형 모두가 종양에서 발견될 수 있다.
제제, 예를 들면, 항원 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자는 대식세포 표현형의 상기 조절 또는 재분극화를 달성하기 위한 인간 CLEVER-1에 결합된다. CLEVER-1 단백질에 특이적인 항체와 같은 제제가 특정 CLEVER-1 에피토프를 인식한다는 것이 동정되었다. 결과적으로, 제제는 바람직하게는 대식세포 표현형의 상기 조절을 달성하기 위한 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열, 즉 에피토프에 결합되고, 여기서 상기 에피토프는 불연속적이고, 인간 CLEVER-1의 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
인간 CLEVER-1의 QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 불연속적 에피토프는
인간 CLEVER-1의 ATQTGRVFLQ (서열 번호 3),
DSLRDGRLIYLF (서열 번호 4),
SKGRILTMANQVL (서열 번호 5) 및
LCVYQKPGQAFCTCR (서열 번호 6)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
표적 단백질 인간 CLEVER-1의 일부, 즉 인간 스타빌린-1은 서열 번호 7에 정의된다. CLEVER-1 분자 상의 에피토프 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6은 서열 번호 7에 정의된 표적 단백질 인간 CLEVER-1의 아미노산 420-434, 473-484, 390-399, 576-587, 615-627 및 313-327에 상응한다. 인간 CLEVER-1의 불연속 에피토프 맵핑은 핀란드 특허 출원 제20165335호에 보다 상세히 개시되어 있다.
TAM 상의 CLEVER-1 상의 2개 이상의 상기 에피토프에 대한 특이적 결합은 치료가 대식세포 표현형의 목적하는 조절을 달성하기 위한 특정 에피토프로 표적화될 수 있기 때문에 유해한 부작용 없이 암을 치료하거나 전이를 예방하기 위한 새로운 방법을 제공할 것이다. 결과적으로, 여기에 기재된 발견은 증가된 양의 종양 촉진성 대식세포 또는 개체가 면역 억제의 우위를 나타내는 만성 염증과 같은 다른 병리학과 관련된 모든 종류의 악성 종양의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. 결과적으로, 암을 치료하거나 전이를 예방하는 방법은 개체에게 CLEVER-1, 바람직하게는 상기 정의된 CLEVER-1 분자 상의 특정 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 개체에서 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제하여 암을 치료하거나 예방함을 포함한다. 따라서, 임의의 양성 또는 악성 종양 또는 악성 종양의 전이, 예를 들면, 피부암 및 결장암을 치료할 수 있다. 또한, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종도 치료할 수 있다. 특히, 흑색종 및 림프종은 동물 모델에 기초한 치료에 매우 잘 반응할 것으로 기대된다.
대식세포 표현형을 조절하는 방법은 모든 종류의 육종, 예를 들면, 섬유 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 혈관 육종, 림프관 육종, 평활근 육종 및 횡문근 육종, 중피종, 수막종, 백혈병, 림프종뿐만 아니라 모든 종류의 암종, 예를 들면, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 유두상 암종, 낭선 암종, 기관지 암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 간세포 암종, 이행 세포 암종, 융모 암종, 준 종양 및 배아 암종을 치료하거나 예방하는 데 유용한 것으로 간주된다.
대식세포는 또한 종양의 성장 또는 퇴화에 영향을 주는 것 외에 염증 및 감염 이완 동안 중요한 역할을 한다. 감염에서, M1에서 M2 대식세포로의 전환이 발생하여 이펙터 면역을 파괴하는 억압 환경을 생성할 수 있다. 결론적으로, 대식세포 표현형을 조절하기 위해 여기에 기재된 발견은 감염성 항원에 대한 면역 억제를 제거하기 위해 만성 감염의 치료에도 유용하다. 만성 감염을 치료하는 방법은 CLEVER-1, 특히 상기 정의된 CLEVER-1 분자 상의 2개 이상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 제제는 그들의 표현형을 M2에서 M1으로 전환시키기 위해 대식세포를 활성화시킬 수 있다.
또한, 대식세포 및 단핵구 상의 CLEVER-1 분자에 결합할 수 있는 제제는 백신의 보조제로서 사용할 수 있다. 상기 제제는 대식세포의 재분극화를 달성하고, 따라서 백신 항원에 대한 면역 억제를 제거하거나 적어도 감소시킨다. 숙주 또는 백신 접종 부위가 면역 억제 요소로부터 일시적으로 제거될 수 있다면 임의의 항원 유도 백신 접종이 도움이 될 수 있다.
CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 및 적합한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물은 암을 치료하거나 예방하는 데, 또는 만성 감염을 치료하는 데 사용하기에 적합하다. 본 발명에서 사용되는 약제학적 조성물은 그들의 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 정맥내, 관절내, 종양내 또는 피하일 수 있다. 약리학적 활성 화합물 이외에, 화합물의 약제학적 제제는 바람직하게는 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 처리를 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.
M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 TNF-알파 분비를 측정함으로써 확인할 수 있다. 결과적으로, TNF-알파의 증가된 분비는 개체의 치료 반응을 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. TNF-알파 분비는 환자로부터 채취된 혈액으로부터 농축된 말초 혈액 단핵구로부터 결정될 수 있다. 수준이 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 상기 제제를 투여하기 전에 동일 환자로부터 측정된 대조군 수준 또는 동일 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교되는 경우, 측정된 TNF-알파의 수준은 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 치료에 대한 환자 반응의 마커로서 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따라서, CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 상의 상기 둘 이상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 제제가 환자에게 투여될 때, M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절 발달을 모니터링함으로써 항-CLEVER-1 요법의 효능을 평가하는 방법은
(a) 상기 환자로부터 채취된 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구(PBL)를 수득하는 단계;
(b) 상기 PBL의 TNF-α 분비를 측정하는 단계, 및/또는
(c) CD14 양성 PBL 상의 HLA-DR 발현을 측정하는 단계, 및
(e) 단계 (b) 및 (c)에서 측정된 TNF-α 분비 및/또는 HLA-DR 발현의 값을 항-CLEVER-1 치료 효능의 평가를 위한 대조군 값과 비교하는 단계로서, 상기 대조군 값이 상기 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값이며, 증가된 TNF-알파 분비 또는 HLA-DR 발현이 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내는, 단계를 포함한다.
환자로부터 체취된 혈액 샘플로부터 수득된 말초 혈액 단핵구로부터 TNF-α 분비의 결정은 통상적으로 공지된 방법, 예를 들면, 시판 중인 TNF-알파 ELISA 키트를 사용하여 수행할 수 있다. CD14 양성 단핵구 상의 HLA-DR 발현은 또한 유동 세포 계측법에 의한 공지된 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다.
M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절 발달은 단핵구 TNF-알파 분비의 측정된 수준을 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 대조군 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 이전 측정 결과 또는 대조군에 비해 단핵구 TNF-알파 분비의 감소된 수준을 사용하여 M2 대식세포의 보다 높은 발현을 나타낼 수 있지만, 이전 측정 결과 또는 대조군과 비교하여 TNF-알파의 증가된 수준은 M1 대식세포의 더 많은 발현이 M2 대식세포의 더 낮은 발현을 갖는다는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 이는 또한 항-CLEVER-1 치료의 효능을 나타내기 위해 사용될 수 있다. TNF-알파의 증가된 수준은 M2 대식세포의 발현이 낮은 M1 대식세포의 더 많은 발현을 나타내고, 즉 상기 요법에 대한 반응성을 부여한다. CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 M1 대식세포로 재분극화하기 위해 M2 대식세포의 적어도 일부를 활성화시키고, 상기 제제의 투여 후 두 대식세포 표현형이 존재할 수 있지만, 상기 제제의 투여 전 상황과 비교하여 M1 대식세포의 증가된 발현이 관찰될 수 있다.
본 발명의 구현예에 따라서, 대조군 값과 비교하여 측정된 TNF-알파 분비의 적어도 2배 증가는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내고, 따라서 요법에 대한 환자의 반응성을 나타낸다.
본 발명은 다음 비제한적인 실시예로 예시된다. 상기 상세한 설명 및 실시예에 제공된 구현예는 단지 예시적 목적을 위한 것이고 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다는 것이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1: 시험관내 항체 결합
건강한 공여자로부터 인간 말초 혈액 단핵구를 수집하고, 그들을 피콜-구배 원심분리에 의해 말초 혈액 약 9ml로부터 농축시켰다. 그 후, 그들은 1% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 1.2 × 106 세포/웰의 밀도로 낮은 부착 96-웰 플레이트에 도말된다. 세포를 1㎍/ml 또는 10㎍/ml의 항-CLEVER-1 항체 3-372(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520) 또는 VH3/VK5(상기 특정 CLEVER-1 에피토프를 인식하는 인간화 항-CLEVER-1 항체, 항체의 상세함은 이하 보다 상세히 제시된다)로 48시간 동안 처리했다. HLA-DR 발현은 LSR Fortessa 유동 세포 계측법을 사용하여 48시간 후 CD14 양성 세포로부터 결정했다. 죽은 세포는 7-AAD 세포 생존 능력 염료에 대한 양성 신호에 기초한 분석으로부터 제거했다.
인간 IgG는 참조로서 사용했다.
도 1a는 CD14 양성 세포로부터 HLA-DR 발현의 결정 결과를 도시한다. CD14 양성 세포 상의 HLA-DR 발현은 인간 IgG의 참조와 비교하여 인간화 항-CLEVER-1 항체 VH3/VK5의 처리로 증가했다.
처리 사이의 세포 생존율의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, CLEVER-1 표적화 항체는 단핵구 생존에 영향을 미치지 않는다고 결론지을 수 있다.
인간화 항-CLEVER-1 항체 VH3/VK5
인간화 항-CLEVER-1 항체 VH3/VK5는 핀란드 특허 출원 FI 제20165335호에 보다 상세히 개시되어 있는 복합 인간 항체TM 기술을 사용하여 3-372 마우스 모노클로 날 항체(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520)로부터 생성된다. 인간 CLEVER-1의 에피토프 서열을 인식하는 인간화 항-CLEVER-1 항체 VH3/VK5는 본원에서 정의된다.
실시예 2: TNF-α의 측정
실시예 1에 기재된 바와 같이 건강한 공여자로부터 인간 말초 혈액 단핵구를 수집하고 농축시켰다. 적혈구 용해 완충액 처리된 혈액 3ml로부터의 단핵구를 6-웰 플레이트에 밤새 접착시키고, PBS로 한 번 세척한 후 10㎍/ml의 항-CLEVER-1 항체 3-372 또는 AK-1과 함께 3일 동안 배양했다.
가용성 TNF-알파는 상업적 TNF-α ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 배양 배지로부터 측정했다. 측정 결과는 도 1b에 도시된다. 증가된 TNF-알파 분비는 미처리 샘플 또는 AK-1과 함께 대조군 처리된 샘플과 비교하여 항-CLEVER-1 항체로 처리된 샘플들에 의해 주시되었다.
실시예 3: 마우스 동계 암 모델
확립된 E0771 마우스 유방 암종을 종양이 1mm3 크기에 도달할 때까지 3 내지 4일 마다 5mg/kg의 항-CLEVER-1(mStab1) 또는 이소타입 대조군으로 처리했다. TAM, 상이한 단핵구 부분 집합 및 종양 침윤성 백혈구의 모집 및 표현형에 대한 항-CLEVER-1 치료의 효과를 유동 세포 계측법을 사용하여 평가했다.
도 2a는 CLEVER-1에 결합하는 항체의 투여 후 동계 E0771 유방 암종에서의 TAM 재분극화를 도시한다. 항-CLEVER-1로 처리된 종양은 대조군 처리된 종양과 비교하여 유사한 수준의 TAM (CD11b+F4/80+)을 나타냈다. 그러나, 항-CLEVER-1 종양 중의 TAM 집단은 II형 마커인 CD206의 발현이 낮은 더욱 전염증성 대식세포(Ly6CloMHCIIhi)로 구성되었다.
항-CLEVER-1 처리된 TAM은 도 2b에 도시된 바와 같이, IgG 처리된 TAM과 비교하여 유의하게 많은 TNF-알파를 분비했다. 이것과 일치하여, FoxP3+ 종양 침윤성 백혈구의 감소도 또한 관찰되었다.
결과는 CLEVER-1이 대식세포 지시된 면역요법의 잠재적 표적이고, 항-CLEVER-1 치료의 효율이 단핵구 TNF-α 분비에 의해 모니터링될 수 있었다는 것을 나타낸다.
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Claims (5)

  1. 인간 공통 림프 내피 및 혈관 내피 수용체-1(CLEVER-1)의 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편(들)이 투여된 환자에서, 항-CLEVER-1 요법의 효능을 나타내는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 모니터링하는 방법으로서, 상기 항체는 항-CLEVER-1 항체 3-372 또는 VH3/VK5이고,
    상기 모니터링하는 방법은:
    (a) 상기 환자로부터 채취된 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구(PBL)를 수득하는 단계;
    (b) 상기 PBL의 TNF-α 분비 및 CD14 양성 PBL 상의 HLA-DR 발현을 측정하는 단계; 및
    (c) M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 모니터링하기 위해, 단계 (b)에서 측정된 TNF-α 분비 및 HLA-DR 발현의 값을, 대조군 값과 비교하는 단계로서, 상기 대조군 값은 CLEVER-1에 결합할 수 있는 상기 항체 또는 이의 단편(들)을 상기 환자에게 투여하기 전에 측정된 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정의 값이며, 증가된 TNF-α 분비 및 HLA-DR 발현은 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내는, 상기 비교하는 단계
    를 포함하는, M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 모니터링하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대조군 값에 비하여 상기 측정된 TNF-α 분비의 적어도 2배 증가는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내는, M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 모니터링하는 방법.
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