BG66049B1 - Средство за конкурентно инхибиране и/или блокиране на карциноембрионалния антиген /сеа/ - Google Patents

Abstract

Средството е биологично активен ваксинален комплекс (БАК) срещу СЕА и се използва в комплексната интегрална терапия и за вторична профилактика на рецидиви при карциноми и други злокачествени тумори и намира приложение в онкологията в интегрална терапия и/или самостоятелно в онкологията с клинична имунотерапия на карциномите. Средството намалява биологичните ефекти на СЕА като ключова молекула в пролиферацията, ангиогенезата, апоптозата и метастазаренето на карциномите. Понижава степента на придобит имунен дефицит, постига се усилване на специфичния и неспецифичния клетъчен и хуморален имуненотговор и при други злокачествени заболявания. Използваният комплекс от лизати от инактивирани бактериални тела имат кръстосани неспецифични антигенни реакции и ефекти на мишенно повлияване срещу туморните клетки с таргетен ефект срещу СЕА, поради кръстосана реактивност със СЕА и конкуренция за рецепторите за СЕА. Средството индуцира увеличаване на имунните Т-лимфоцити, разтворимите полизахариднифракции и лактоферинът потенцират терапевтичните ефекти на средството чрез антиоксидантен, антикоагулантен, противовъзпалителен, имуномодулаторен, имуностимулиращ ефект, стимулира се фагоцитозата, Т-клетъчната пролиферация и Т-клетъчния имунитет, има директен антипролиферативен ефект, улеснява апоптозата и се проявява директен антитуморен ефект.

Description

66049 BI (54) СРЕДСТВО ЗА КОНКУРЕНТНО ИНХИ-БИРАНЕИ/ИЛИ БЛОКИРАНЕ НА КАРЦИНО-ЕМБРИОНАЛНИЯ АНТИГЕН (СЕА) ЧРЕЗСПЕЦИФИЧНО И НЕСПЕЦИФИЧНО СТИ-МУЛИРАНЕ ИМУННИЯ ОТГОВОР КЪМ СЕА Област на техниката Имунобиологична терапия на рака Предшестващо състояние на техниката Карциноембрионалият антиген (СЕА) сеотделя от злокачествените тумори-карциноми.Той е мембранен белтък, който лесно се извли-ча с физиологичен разтвор. Имуноелектрофоре-тично попада в зоната на глобулините. Открит еот Gold Р., S. Freedman 1965. Неговото количес-твено определяне в серума служи широко в прак-тиката за прогноза на заболяването, при провеж-дане на динамичен контрол върху ефекта от те-рапията и ранно откриване на рецидиви /RotherМ., 2006/. Неговото персистиране в серума есвързано както със степента на диференциира-ност на тумора, така и с процесите на метастази-ране /Kodera Y, Isobe К, Yamauchi М, Satta T,HasehawaT et al 1993, Gangopadhyay A. BajenovaO, Kell TM, Thomas P. 1996, Ordonez C., ScreatonRA, Ilantzis C. Stanners CP 2000/. Доказани са различни биологични ефек-ти на СЕА, който принадлежи към имуноглобу-линовата супергенна фамилия и включва редицафункции като клетъчна адхезия, свързване набактерии като класически неспецифичен кръс-тосано реагиращ антиген /Thompson JA., GrunertF. Zimmermann W 1991/. Свързването на СЕА с тъканите се осъ-ществява чрез специализирани за нея адхезион-ни молекули, които най-често принадлежат къмсъщата супергенна фамилия на СЕА /Kammerer,R., Stober, D. et al. 2001, Laack, E., Nikbakht, H.,Peters, et al. 2002/. Безконтролната експресия на СЕА е свър-зана с член от фамилията на СЕА, каквато е ад-хезионната молекула - СЕАСАМ6. Тя се явява иантиген и обуславя неспецифичната кръстосанаантигенност на СЕА, участва също в разруша-ване на тъканната архитектура и блокиране надиференциацията на клетките /UantzisC. De MarteL., Screaton RA, et al. 2002/. При карциноми, които са СЕА позитивни,антитяло отговорът към СЕА може да се изпол- зва за имунотерапия /Sarkar К. Bose A. Lascar Set al. 2007/, Mayer A. Francis RG, et al. 2006.

Ha експериментално проучване се нами-рат различни изследвания, които показват роля-та на антителата към карциноембрионалния ан-тиген в общата имунна резистентност на орга-низма към туморния процес. Kuroki М., KurokiМ., Shibaguchi Н, Badran A, et al., 2004 KurokiМ., Hachimine Κ, Huang J, 2005. Установена е възможността да се въздейс-тва върху туморния процес чрез прилагане наваксина срещу СЕА. Чрез повишаване антитя-лообразуването и свързването на СЕА се пони-жава нивото му в серума, повишава се антитялозависимата клетъчна цитотоксичност /АЗКЦТ/,намаляват се биологичните му ефекти, които бла-гоприятстват туморния растеж, да се намали аг-регацията на неутрофилите, да се намали и рис-ка от други неблагоприятни биологични ефекти/Kuijper TW, van der Schoot СЕ, et al. 1993, ZhouH. Stanners CP, Fuks A 1993/. При експериментални и клинични усло-вия са използвани някои ваксини срещу карци-ноебрионален антиген, които удължават прежи-вяемостта и намаляват риска от рецидиви.Създадени са различни видове противотуморниваксини /Chang DZ 2007; Madan RA. Arlen PM,Guller 2007, Silk AW, Finn OL 2007/.

Morse MA, Deng Y, et al. 1999, Kuroki M.,Hachimine K, et al. 2005, A. C. Armstrong, DavidEaton, Joan Ewing 2001, Silk AW, Finn OL, MorseMA, et al. 2003, Paul S. Acres B, Ltmacher JM,Bonnefoy et al. 2007, Nakai N, Asai J, Ueda E, etal. 2006, Madan RA. Arlen PM, et al. 2007, PazdurMP, Jones JL et al. 2007, Pazdur MP, 1995, PazdurMP, 2001. Доказано е, че антигенният комплекс отстрептококи индуцират увеличаване на имунни-те Т-лимфоцити при инфузия с дендритни клет-ки при рак на дебелото черво /Koido S, Hara Е,et al. 2007, Homma S. Torii A. Mitsunaga M., Yan/. Доказано е, че Lactobacillus acidophilus иLactobacillus casei, в частност разтворимите по-лизахаридни фракции имат антиоксидантенефект, противовъзпалителен, имуномодулаторен,имуностимулиращ /стимулира фагоцитозата, Т-клетъчната пролиферация и Т-клетъчния иму-нитет; имат и директен антипролиферативен ефект,улесняват апоптозата при карцином на дебелоточерво и проявяват директен антитуморен афект 2

66049 BI /Lee JW. Shin J. G., Kim EH et al., 2004/.

Choi SS, Kim Y, et al., 2006 Klein A. Friedtich U, et al. 2007; Li YG, Tian FL, et al. 2007

Le Leu RK, Brown IL, et al., 2005, SaideJA, Gililand SE, 2005; Paturi G, Phillips M, et 2007;Matsuzaki T, Yokokura T. et al., 1988. Доказано е, че антигенният комплекс отфрагменти, включващ ваксинални бактериалнитела и лизати от: Escherichia coli, Haemophillusinfluence, Neisseria meningitides, Neisseriagonoreree и CEA имат доказани кръстосани нес-пецифични антигенни реакции или имат ефект намишенно въздействие върху CEA. Leusch, Н. G.,Hefta, S. A. et al. 1990, Virji, М., D., Griffith, J.,Hill, D., et al. 2000 Най-висока степен на кръсто-сана неспецифична антигенност на неспецифич-ния кръстосано реагиращ антиген /NCA 50/90/ едоказано, че се проявява при пациенти с СЕАпозитивни локализации на карциномите в дебе-ло черво, млечна жлеза и бял дроб. /Allard WJ.,Neaman IE, et al. 1994/. Този феномен на кръстосани неспецифич-ни антигенни реакции с мишенно въздействиевърху СЕА не е разработен и използван в ком-бинирана ваксина за блокиране или инхибиранеефектите на СЕА при болни с карциноми или дру-ги солидни злокачествени тумори. Доказано е, че лактоферинът /ЛФ/ еимуномодулатор. Намерени са рецептори за ЛФвърху лимфоцитите /Hammarstrom et al. 1995/ мо-ноцитите и неутрофлините левкоцити /Maneva А. V. Manev et al. 1983/, има изразен антитуморенефект /Beszault et al. 1994/ стимулиращ ефект вър-ху клетъчния имунитет при експериментални мо-дели на тумори /Wang et al. 2000/, има изразенантиоксидантен ефект /Britigan et al. 1991/, анти-коагулантен ефект. ЛФ се свързва с тромбоци-тите /Манева и съавтори 1990/ и инхибира тром-боцитната агрегация Leveugle et al. 1993 /ЛФ сти-мулира фагоцитарната активност Manev V. А.Maneva L. Sirakov Effect of lactoferrin onfagocytic activity of polymorphonuclear cellsisolsted from blood of patients with autoimmunediseases and Staphylococcus aureus allergy Adv.Exp. Med. Biol., 1998, 443321-330/. Доказано е, че повърхностно активни ве-щества /ПАВ/ Туин 85, Линофарм, “Фармахим”/Стимулират Е-рецепторнатапресп./ОКТ 11 или/CD 2-рецепторната активност на Т-лимфоцити-те при болни с карциноми. /Манев В., Д. Шишманов, Н. Алексиев/ Стимулиращ ефект напрепарата “Линофарм” /Фармахим, София/ вър-ху Е-розеткообразуването ин витро при болни снеоплазии на белия дроб Военно-мед. дело, 1985,4, с. 33-36, /В. Манев, Д. Шишманов и сътр./.Влияние на полиоксиетилен /20/ сорбитан три-олеат върху Е-розеткообразуването при бластом-но болни /Експер. мед и морф. 1985, 3, 30-36/.В ниски концентрации Туин 85 стимулира Е-ре-цепторната активност на Т-лимфоцитите и я ос-вобождава от инхибиращия ефект на СЕА. Авто-рите установяват и различна устойчивост на Е-рецептора на Т-лимфоцитите към детергент раз-лична в норма и патология /V. Manev 1998 VarnaBulgaria/. Установено е, че повърхностно активно ве-щество/ПАВ/Туин 85 поддържа дисперсносттана биологичната суспенсия. Нейоногенните по-върхностно активни вещества от типа Туин 85 идр., запазват хомогенността на суспенсията, коетосъстояние на суспенсията позволява по-добре дасе фагоцитират микробите и техните фрагментии се стимулира по-добре имунния отговор /Кри-вошеин, В. А. 1990, 2 38-40/. ПАВ-Tween 85 имат доказан също и про-тивотуморен ефект /Charles G. Crispens, JR. AndJohn RJ. Sorenson /1991/. Анионните детергенти имат протективенефект срещу денатурацията на белтъците WilliamЕ. Stawart II et al. /1974/. Недостатъци на ваксините срещу СЕА 1. Някои особености на СЕА като антигенвъзпрепятстват самостоятелното му използванев практиката като ваксина: 1.1. СЕА е сравнително слаб антиген, за-щото е ембрионален антиген, а в по-големи до-зи би се увеличил риска от негативни ефекти наСЕА. 1.2. СЕА супресира Е-рецепторната актив-ност /CD2, ОКТ 11/, която е свързана със сте-пента на диференцираност и функцията на Т-лим-фоцитите /V. V. Manev, D. S. Shishmanov, 1986/. 2. Недостатък на ваксините срещу СЕА е,че за получаване на ефективен имунен отговорне се използват във ваксиналните комплекси идруги антигенни съставки, които да имат дока-зана кръстосана неспецифична антигенна реак-ция /NAR/ с СЕА и постигане конкуренция зарецепторите за СЕА. Не се използва антигеннияткомплекс от фрагменти, включващ ваксинални 3

66049 BI бактериални тела и лизати от: Escherichia coli,Haemophillus influence, Neisseria meningitides,Neisseria gonoree и CEA, които имат доказаникръстосани неспецифични антигенни реакции илиимат ефект на мишенно въздействие срещу СЕА. 2.1. Не е използван и не е регистрираносредство като биологично активен продукт; койтода използва установения факт, че СЕА върху епи-телните клетки и неутрофилите са освен това ирецептори за неизвестни още протеини на пато-генната бактерия Neisseria, които имат таргетенефект срещу СЕА. /Leusch, Н. G., Hefta, S. A. etal. 1990, Virji, М., D., Griffith, J., Hill, D., et al.2000, Virji, M., Makepeace, K., et al. 1966/. 2.2. Описаните в специализираната лите-ратура ваксини срещу СЕА не включват комби-нации с други биологично активни вещества, скоито да се постига висока ефективност чрез прякили косвен таргетен ефект срещу СЕА. 3. Няма описани ваксини срещу СЕА, ко-ито да използват комплекси от протоплазмениили други бактериални фрагменти, както и дру-ги биологично активни вещества, с които да сестимулира неспецифично едновременно фагоци-тарната активност, хуморалния и клетъчния иму-нен отговор към СЕА, едновременно с това дапритежават супресиращо действие върху проли-ферацията и растежа на туморните клетки, даимат противовъзпалителен, антикоагулантен ипротивотуморен ефект. 4. Няма регистрирани ваксинални комп-лекси към СЕА, които да съчетават комплекс отвещества с взаимно потенциращи се ефектни набиологично активните вещества: не е използванЛактоферин /от коластра/, с оптимализиране наимунния отговор срещу СЕА. За Лактоферина едоказано, че самостоятелно или в съчетание имапозитивни ефекти върху микрооколната клетъч-на среда, локалната фагоцитарна активност, Т-клетьчния имунитет, както и да имат едновре-менно противовъзпалителен, антикоагулантен ипротивотуморен ефект. /Manev V. A. Maneva L. Sirakov Effect oflactoferrin on fagocytic activity ofpolymorphonuclear cells isolsted from blood ofpatients with autoimmune diseases andStaphylococcus aureus allergy Adv. Exp. Med.Biol., 1998, 443, 321-330/. Има доказани изра-зен антитуморен ефект /Beszault et al. 1994/ сти-мулиращ ефект върху клетъчния имунитет при експериментали модели на тумори /Wang et al.2000/, има изразен антиоксидантен ефект /Britiganet al. 1991/, антикоагулантен ефект: ЛФ се свър-зва с тромбоцитите /Манева и съавтори 1990/ иинхибиратромбоцитната агрегация /Leveugle etal. 1993/. 5. Не е известна ваксина срещу СЕА, ко-ято да включва BCG ваксинални бактериални телаедновременно с бактериален лизат за потенци-ране не само на клетъчния, но и на хуморалнияимунен отговор срещу СЕА. За усилване на неспецифичния клетъченимунен отговор при ваксините към туморни ан-тигени или самостоятелно при терапията на ту-морно болни се използват различни адюванти.Най-често се използва BCG ваксина. Нито еднаваксина регистрирана срещу СЕА досега не из-ползва BCG ваксина, която едновременно давключва както цели убити бактериални тела, та-ка и бактериални лизати, за които е доказано, чеизбирателно могат да стимулират не само кле-тъчния имунитет, но и хуморалния. Най-често сеизползва BCG ваксина /Silk AW, Finn OL 2007/Hadjiev S. Kavaklieva-Dimitrova J, et al., 1980;Hadjiev S. Kavaklieva-Dimitrova Jet al. 1980;/Mackaness, G. B. Auclair, P. H. et al. 1973/. 6. Използването на цели живи бактериал-ни тела от BCG ваксината носи повишен риск отразвитието на “ бецежити” при болни с имунендефицит каквито са повечето онкоболни особе-но преминали химио- и лъчетерапия /Hadden JW.2003, Mandulova Р., Madzarova S., et al. 1980;Mackaness, G. B, Auclair, P.H. et al. 1973/. 7. Съвременните биотехнологии са слож-ни и скъпи за получаването на различни вакси-ни с пептиди от СЕА. Рекомбинантните ваксинисе отличават със сложност, трудна достъпностпоради високи технологични изисквания и съ-щевременно все още не са получени трайно по-зитивни и възпроизводими терапевтични резул-тати. Няма регистрирана и не се използва в прак-тиката ваксина срещу СЕА, която да има дос-тъпна и лесна за приложение биотехнология,която да отговаря на всички изброени по-гореизисквания. 8. Няма регистрирано биологично средс-тво срещу СЕА като биологично активен ком-плекс, който да постига взаимно потенциращ сеефект срещу СЕА, едновременно с постигане нанеспецифично и специфично стимулиране на 4

66049 BI имунния отговор срещу СЕА, с ефекти на бло-кирането му и едновременно съставките на би-ологично активния ваксинален комплекс да при-тежават антиоксидантен, антикоагулантен, про-тивовъзпалителен ефект, да подпомага апопто-зата, да има антипролиферативен ефект върху ту-морните клетки, да се стимулира едновременнофагоцитарната активност; да се стимулира Т-кле-тъчния имунитет, вкл. CD2/OKT11-Е-рецептор-на активност на Т-лимфоцитите и благодарениена такъв комплекс се постига краен по-ефекти-вен имунен отговор към СЕА. 9. Няма регистрирана и не се използва впрактиката ваксина срещу СЕА, която да имадостъпна и лесна за приложение биотехнология,която да отговаря на всички изброени по-гореизисквания, да може да се използва самостоя-телно или в комплекс. 10. Не се използва в нито една ваксинасрещу СЕА установения научен факт, че анти-генният комплекс от Стрептококи позволява дасе индуцират увеличаване на имунните Т-лим-фоцити /Koido S, Hara Е, et al. 2007, Homma S.Torii A. Mitsunaga M, Yanagisawa S. et al., 2007/. Поради изброените причини нито една до-сега ваксина срещу СЕА не е намерила широкоприложение в клиничната практика в комплекс-ното лечение на карциномите и други солиднитумори. Задачата на изобретението се постига и из-броените по-горе недостатъци се преодоляватчрез средство за конкурентно инхибиране и/илиблокиране накарциноембрионалния антиген чрезспецифично и неспецифично стимулиране имун-ния отговор към СЕА Задача на изобретението е създаването наваксина срещу СЕА, която чрез специфични инеспецифично стимулиране на имунния отговори с участието на комплекс от биологично актив-ни вещества във ваксиналния комплекс да сепостига взаимно потенциране на следните биоло-гични ефекти: 1. Усилване едновременно на неспецифи-чен и специфичен имунен отговор срещу СЕА,по-висока степен на противотуморен ефект наосновата на кръстосана неспецифична антиген-на реактивност на използвания антигенен ком-плекс. 2. Ваксината да съдържа бактериални про-топлазмени и други клетъчни лизати, които ед- новременно да имат и блокиращ ефект върху СЕАи едновременно супресиращо действие върхуразвитието на тумора. 3. Да съдържа комплекс от биологичноактивни вещества, които да осъществяват еднов-ременно антиоксидантно, антитуморно, антико-агулантно действие, които да стимулират еднов-ременно фагоцитарната активност на неутрофи-лите, неспецифичния Т-клетъчен противотумо-рен имунен отговор, да стимулират CD2 /ОКТ11, Е-рецепторна активност на Т-лимфоцитите/,стимулирайки Е-рецептора на Т-лимфоцитите данамалява супресиращия ефект на СЕА и да имакато краен продукт - противотуморен ефект с тар-гетен ефект към СЕА и да потиска развитието натуморния процес. 4. Да се постигнат високи нива на антите-ла срещу СЕА, което предполага използванетона адювант, който избирателно да стимулира ихуморалния имунитет чрез включване на лизи-рани бактериални тела от BCG ваксината. 5. Средството да е с достъпна биотехно-логия, да може да се прилага в клиничната прак-тика за профилактика и терапия на туморните ре-цидиви при злокачествени тумори, които са СЕАпозитивни и при други злокачествени тумори. Този ефект се постига чрез средство законкурентно инхибиране или блокиране на кар-циноембрионален антиген /СЕА/ чрез специфичнои неспецифично стимулиране имунния отговоркъм СЕА. Техническа същност на изобретението Средството за конкурентно инхибиране и/или блокиране биологичните ефекти на СЕА итуморна цитолиза чрез кръстосано, неспецифич-но и специфично стимулиране на имунния отго-вор към СЕА има следния състав. Карциноембрионален антиген /СЕА/ в ко-личество 0, 01-0, 1 mg, BCG ваксина, която сесъстои от 50-100 ваксинални клетки, а също иот клетъчен лизат, получен също от 150-300 ате-нюирани микробни тела, лизати от други инак-тивирани бактериални тела: Escherichia coli - 8 х10” бактериални тела до 1 х 109 бактериални телаили лиофилизат 1 mg, Streptoccocus pyogenes вконцентрация 1 х 10’ или лиофилизат /1 mg/,Streptoccocus faecalis - 1 х 107 клетки,Haemophillus influence - 0, 010 mg, Neisseria 5

66049 BI catarrhalis - 0, 5-1 mg, Neisseria meningitides no0, 030 mg от група A, C и Y, Lactobacillusacidophilus - 0,5-1 mg, Lactobacillus casei - 0,1-2 mg, Лактоферин в концентрация 1-2 mg/ml,Tween 85 /полиоксиетилен сорбитат триолеат/ вконцентрация 0,5-1,0 mg/ml, стерилна емулсияполиоксиеилен-ЮОО-линолов естер в същатаконцентрация, в които се разтварят или разреж-дат всички други инградиенти в краен обем до1, 0 ml. Пример за изпълнение на изобретението Следващият пример илюстрира получава-нето на средството в общ обем от 100 ml, аименно: В 100 ml изотоничен фосфатен буфер с pH7, 2 при загряване до 60°С и разклащане за 30min се получава фосфатен буфер с 50 mg от по-лиоксиетилен 1000-линолов естер /нейоногенноповърхностно активно вещество/. Охлажда седо стайна температура. Съдържанието на 1 ам-пула с BCG ваксина се загрява на водна баня за2 h на 65°С. След разреждане 10 000-100 000пъти съдържанието на ампула с BCG ваксина сеизброяват в камера на Бюркер, адаптират се дасъдържат около 10 000 микробни тела в 1 cm3 исе прибавят към 100 ml буферен разтвор. Същотоадаптиране с изброяване се извършва още вед-нъж за още една отделна проба, съдържаща съ-що 10 000 микробни тела в 1 ml. Първото коли-чество се заделя за получаването на клетъченлизат, а второто количество се запазва за изпол-зване като цели ваксинални клетки. Пак се преб-рояват микробните тела на микроскоп или лабо-раторен брояч за клетки и ако е нужно пак сеадаптират. За изготвяне на лизат се замразява кле-тъчната суспенсия на -10-15°С, замразяват и серазмразяват още 2-3 пъти. Към ерленмайеровиясъд с обем от 100-150 ml се прибавят в крайнатафаза всички други получени убити с термичнаобработка 65°С за 2 h/бактериални тела, коитосъщо са подложени за клетъчна лиза чрез 2-3пъти замразяване и размразяване, както следва:Escherichia coli в концентрация 8 х 1010 бактери-ални тела или замразен и лиофилизиран лизат отEscherichia coli 1 mg, Streptococcus pyogenes 1 x1011 или замразен и лиофилизиран клетъчен ли-зат /100 mg/, Streptococcus faecalis 1 х 109 клет-ки или замразени и лиофилизирани 1 mg,

Haemophillus influence - замразени и лиофили-зирани -1 mg, Neisseria catarrhalis - 50 mg, зам-разен и изсушен лиофилизат полизахарид отNeisseria meningitides по 3 mg съответно от гру-па А, С и Y, Lactobacillus acidophilus - 50 mgLactobacillus casei - 10 mg, Tween 85 /полиок-сиетилен сорбитат триолеат/ в концентрация 50mg предварително подготвен по същата техно-логия както по-гореописаната за полиоксиети-лен 1000-линолов естер /” Линофарм”/. Получената смес от клетъчните лизати сеобработват допълнително с ултразвук в кварцо-ва епруветка чрез ултразвуков апарат лаборато-рен тип апарат 20 kHz Branson 450 Schwabisch -Gmund, Germany при интензивност 16 W/cc впродължение на 30-40 min. Така обработенитеклетъчни суспенсии и лизати се прехвърлят верленмайеров съд с обем от 100-150 cm3 и от-ново се загряват за 30 min на 60°С. След темпериране на стайна температурасе прибавят Lactoferrin /Лактоферин/ на фирма-та Symbiotics в концентрация 100 mg и карцино-ембрионален антиген в концентрация 10 mg стан-дарт от фирма Аббот САЩ и пробата с цели уби-ти BCG бактериални тела. Хомогенизират се всички прибавени би-ологични компоненти с магнитна бъркалка.Получената биологична активна мултиномпонент-на смес може да се замрази и лиофилизира илида се запази в течно състояние като се прибавиза консервант мертиолат 0, 020 mg/100 ml.Течната фаза се разфасова в стерилни фиолкиили ампули х 1 ml и се съхранява на 4С-8С. Приложение на изобретението Ваксинален комплекс /ВК/ срещу СЕА мо-же да се използва за: 1. В комплексната терапия и вторична про-филактика на рецидиви при карциноми и другизлокачествени заболявания, респ. за вторичнапрофилактика. 2. За повишаване ефекта на обща и спе-цифична клетъчна имунотерапия чрез блокира-не ефектите на СЕА. 3. За подпомагане комплексната интегра-тивна терапия едновременно с класическата /ру-тинна/ терапия при СЕА позитивни карциноми,както и при други злокачествени заболявания ипреди да се включат методите на комплексната 6

66049 BI клетъчна имунотерапия или едновременно с тях,както и за поддържане терапевтичният им ефектслед тях. Показания: За терапия при болни с дока-зан карцином преди и/или след оперативнолечение, както и при други форми на солидниили други злокачествени заболявалия. Терапиятапродължава месеци и години по индивидуалнапреценка, но винаги извън курсовете на химио-и лечетерапията. Начин за приложение: Прилага се подкож-но, перитуморно, периферно интратуморно илипо индивидуални показания пер ос при непре-къснато покачваща се и строго индивидуализи-рана дозировка. Имунизацията продължава посхема за 3 /три/ или повече месеца като се уве-личава или разрежда по преценка на клиниченимунолог. Начин за приложение: Прилага се подкож-но и едновременно периферно около иинтратуморно, не се прилага инжекционно цент-рално на тумора или централно в метастазата, зада се избегне появата на некроза. Инжектиранетосе извършва при непрекъснато покачващитедози. Започва се с две инжекционни места по0.05 ml и се стигне до общо 0.3 ml и повечеспоред индивидуалната поносимост през 3-5 или7 дни. Около 3-4-та инжекция /15-30 ден/, кактои в следващия период от 2-3 месеца следва дасе очакват и да се има готовност в клиничниусловия за овладяване на фебрилни и остро феб-рилни реакции над 40°С, както и други свързанис автоинтоксикационни процеси поради бурнонастъпване на лиза на туморната тъкан или ме-тастазите й. Имунотерапията се провежда по индиви-дуална схема през 5-7 дни като след 3-та ин-жекция или поета пер ос се има готовност запродължаване на терапията само в клинични ус-ловия при контрол на следните показатели: 1. Динамичен контрол на ПКК и биохи-мия като се обръща изключително внимание напоказателите на хемостазата. 2. Контрол на показателите на имуннатасистема /4-5 пъти в годината/ или по индивиду-ална преценка. 3. Туморни маркери/СЕА и други специ-фични параклинични и клинични показатели спо-ред локализацията и състоянието. Противопоказания: Имунотерапията не се провежда при наличие на: фебрилно състояние,инфекциозни заболявалия /вкл. ТБЦ/ или други,при неманифестиран или клинично изразен те-жък придобит имунен дефицит с лимфаденопа-тия или друга характерна симптоматика, нали-чие на параклинични показатели, които доказ-ват тежък придобит имунен дефицит. При дока-зан придобит имунен дефицит се предприемапърво корекция на имунния дефицит и тогава мо-же да се проведе имунопрофилактиката илиимунотерапията. Предимства на изобретението Предимствата на средството са следните. 1. Използват се минимални дози от СЕА,с което се намалява или изключва риска от евен-туални неблагоприятни странични биологичниефекти на СЕА. 2. Постига се усилване на неспецифичнияи специфичен клетъчен имунен отговор към ту-морни антигени при терапията на туморно болни. 3. Постига се усилване и на специфичнияимунен отговор срещу СЕА. 4. Използването на минимален брой бак-териални тела и лизати от убити бактериални те-ла от BCG ваксината се намалява или избягвариска от получаване на страничните ефекти наживата атенюирана ваксина /бецежит и др./. Товаувеличава възможностите за по-широко прило-жение на средството при онкологично болни, чи-ето състояние често се придружава с различнопо дълбочина и трайност на придобит имунендефицит. 5. Антигенният комплекс от фрагменти,който включва ваксинални бактериални тела илизати от: Escherichia coli, Haemophillus influenceи Neisseria meningitides и СЕА притежават кръс-тосани неспецифични антигенни реакции илиимат ефект на мишенно въздействие срещу СЕА. Карциноембрионалните антигени /СЕА/върху епителните клетки и неутрофилите са ос-вен това и рецептори за неизвестни още проте-ини за патогенната бактерия Нейсерия, които иматсъщо таргетен ефект срещу СЕА. 6. Получаването на антитела срещу бакте-риални антигени с неспецифична кръстосана ан-тигенна реактивност с СЕА дава възможност дасе конкурират за рецепторите за СЕА. 7. Антигенният комплекс от стрептококи 7

Claims (7)

1. 66049 BI позволява антигените на стрептококи да инду-цират увеличаване на имунните Т-лимфоцити.
2. 8. Lactobacillus acidophilus и Lactobacilluscasei, в частност разтворимите полизахариднифракции потенцират също терапевтичните ефек-ти на средството чрез антиоксидантен, противо-възпалителен, имуномодулаторен, имуностиму-лиращ ефект /стимулира фагоцитозата, Т-клетьч-ната пролиферация и Т-клетьчния имунитет/,имат директен антипролиферативен ефект, улес-нява апоптозата при карципом на дебелото чер-во и проявява директен антитуморен афект.Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus casei вчастност разтворимите полизахаридни фракциисъщо потенцират терапевтичните ефекти наваксината.
3. 9. Включването на Лактоферин /ЛФ/ катоимуномодулатор във ваксината позволява локал-но в микрооколната клетъчна среда при инжек-тирането да се подобрят условията за фагоцито-зата още на първото стъпало на имунния отговор.ЛФ е имуномодулатор с антиоксидантен, анти-коагулантен и антитуморен ефект.
4. 10. Използването на повърхностно актив-ни нейоногенни вещества/ПАВ/Туин 85 и поли-оксиетилен - 1000-линолов естер /”Линофарм”/имат комплексно позитивно въздействие върхубиологичната активност на комплекса, а именно:1. Допълнително се освобождават и стимулиратЕ-рецепторите /ОКТ 11 или /CD-2-/, респ. ре-цепторната активност на Т-лимфоцитите при бол-ни с карциноми. Повърхностно активно веществоТуин 85 /полиоксиетилен 20 сорбитан триолеат/позволява да се постигне локално деблокиранена рецепторите на Т-лимфоцитите, респ.се деб-локира тяхната контролна функция в противоту-морния имунитет. 2. Под държа се дисперсност-та на биологичната суспенсия. Нейоногенните по-върхностно активни вещества от типа Туин 85 идр., запазват хомогенността на суспенсията, ко-ето позволява по-добре да се фагоцитират мик-робите и техните фрагменти и се стимулира по-добре имунния отговор. 3. С включването наПАВ-Туин 85 се усилва противотуморния ефект;вкл. и директен цитолитичен ефект при интрату-морно приложение, с което се потенцира крайни-ят ефект чрез пряк цитотичен противотуморенефект. 4. Постига се протективен ефект срещуденатурацията на белтъците и повишаване трай-ността на продукта.
5. 11. Комбинираното биологично активносредство повишава специфичния и неспецифи-чен имунен отговор към СЕА, блокират се ефек-тите му, свързани със стимулиране натуморниярастеж. Биологичните ефекти на средството поз-воляват ефективен имунен отговор срещу СЕА,блокиране стимулацията на туморния растеж,подпомагане апоптозата, повишаване на антиок-сидантните, антикоагулантни ефекти, стимулира-не едновременно на фагоцитозата и се деблоки-ра Т-клетъчния имунитет.
6. 12. Целият биологичен комплекс позво-лява включването и на други още възможни ме-ханизми на блокиране ефектите на СЕА, освенчрез стимулиране на антителния /хуморален/имунен отговор срещу СЕА, антитялозависимияклетъчно-медииран /АЗКМИ/, създават се усло-вия за постигане стимулация на противотумор-ния имунитет вероятно и чрез идиотип-антииди-отипната мрежа. Saha A., Bamal RN, et al. 2005 ив резултат деблокиране на противотуморнияимунитет. Патентни претенции
7. 1. Средство за конкурентно инхибиране и/или блокиране биологичните ефекти на карци-ноембрионалния антиген (СЕА) и туморна цито-лиза чрез специфично и неспецифично блоки-ране на СЕА, състоящо се в това, че на основатана известни и доказани кръстосани антигенни ре-акции и мишенни ефекти на някои известни бак-териални антигени с този на СЕА, постигащонеспецифично и специфично стимулиране наимунния отговор към СЕА при използване на би-ологичен комплекс, характеризиращо се съсследния състав: карциноембрионален антиген вколичество от 0,01 до 0,1 mg, BCG ваксина 50-100 убити ваксинални клетки, клетъчен лизат, по-лучен от 150-300 атенюирани BCG микробнитела, лизати от други инактивирани бактериалнитела: Escherichia coli 1 х 108 бактериални тела до1 х 109 бактериални тела или лиофилизат 1 mg,Streptococcus pyogenes в концентрация 1 х 109до 10” или лиофилизат 100 mg, Streptoccocusfaecalis 1 х 106 до 107 клетки, Haemophillusinfluence 0, 005-0, 010 mg, Neisseria catarrhalis0,5-1 mg, Neisseria meningitides no 0,010-0,030mg от група A, C и Y, Lactobacillus acidophilus 0,5-1 mg, Lactobacillus casei 0,1-2 mg, Лактоферин 8 66049 BI в концентрация 1-2 mg/ml, Туин 85 /полиокси-етилен сорбитат триолеат/ в концентрация 0,05-0, 1 mg, полиоксиетилен 1000 - линолов естер0, 05-0,1 mg, в който изотоничен фосфатен бу-ферен разтвор с pH 7, 2 се разреждат всичкидруги инградиенти. Литература Кривошеин, В. А. Шатров Иммуноадю-вантное действие синтетических поверхностноактивнмх веществ Иммунология 1990,238-40. В. Манев, Д. Шишманов и сътр. Влияниена полиоксиетилен /20/ сорбитан триолеат вър-ху Е-розеткообразуването при бластомно болни.Експер. мед и морф. 1985, 3, 30-36. Манев В., Д. Шишманов, Н. АлексиевСтимулиращ ефект на препарата “Линофарм”/Фармахим, София върху Е-розеткообразуване-то ин витро при болни с неоплазии на белия дробВоенно-мед. дело, 1985, 4, с. 33-36/. Манев В. Дисертация 1987 г. Проучваниявърху възможностите за използване на Манева и съавтори 1990 / ЛФ се свързвас тромбоцитите и инхибира тромбоцитната агре-гация Allard WJ., Neaman IE, Elting JJ, BarnettTR, Yoshimura H. Fritse HA, Yeung KK,Nonspecific cross-reacting antigen 50/90 is elevatedin patients with breast, lung, and colon cancerCancer Res. 1994 Mar 1; 54(5): 1227-34. A. C. Armstrong. David Eaton, Joan EwingCellular Immunotherapy For Cancar BMJ vol. 3231 dec. 2001. Beszault et al. 1994 изразен антитуморенефект I стимулиращ ефект върху клетъчния иму-нитет при експериментални модели на тумори /Wang et al. 2000/. Choi SS, Kim Y, Han KS, Oh S, Kim SH.Effect of Lactobacillus strains on cancer cellproliferation and oxidative sress in vivo. Lett Appl.Microbiol. 2006 May; 429% /452-8 Britigan et al.1991/, антикоагулантен ефект: ЛФ се свързва стромбоцитите. Chang DZ The current status of vaccinedevelopment in colorectal cancer Clin Adv HematolOncol. 2007 feb; 5(2): 109-11, 136. Charles G. Crispens, JR. And John RJ.Sorenson. Evaluation of the anticancer Activitiesof Tween 20, 40 and 60 in SJL/J Mice AnticancerResearch 11: 407-408 /1991/. Hadjiev S. Kavaklieva-Dimitrova J,Mandulova P, Madzarova S, Spasova M. RelatedArticles, Books, LinkOut Survival of lung cancerpatients treated with BCG and/or a soluble BCGfraction (F70) after surgery, radiotherapy andchemotherapy Neoplasma, 1980; 27(1): 83-94 PMID7374861 /PubMed - Indexed for MEDLINE/. Hadden JW. Immunodeficiency and cancer:prospect for correction Int Immunopharmacol.2003 Aug; 3(8): 1061-71. Homma S. Torii A. Mitsunaga M,Yanagisawa S. et al. Streptococcal Preparation OK-432 promotes fusion efficiency and enhancesinduction ofh antigen - specific CTL by fusion ofdendritic cells and colorectal cancer cell s Immunol.2007 Jan.; 178 (1): 613-22. IIANTZIS C. DeMarte. L, Screaton RA,Stanners CP Deregulated expression of the humantumor marker CEA and CEA family memberCEACAM6 disrupts tissue architecture and blockscolonocyte differentiation Neoplasia 2002 Mar-Apr.;4(2) 151-63 Laack, E., Nikbakht, H., Peters,Kugler, C., Jasiewicz, Y., et al. Expression ofCEACAMI 1 In adenocarcinoma of the lung: afactor of independent prognostic significance J.Clin. Oncol., 2002, 20, 4279-4284. Gangopadhyay A. Bajenova O, Kell TM,Thomas P. Carcinoembryonic antigen inducescytokine expression in Kuppfer cell: implication forhepatic metastasis from colorectal Cancer Res.1996 Oct 15; 56(20): 4805-10. Gold P., S. Freedman /J. Exp. med. 122,1985, 57/. Kammerer, R., Stober, D., Singer, В. B.,Obrink, B, and Reiman, J. Carcinoembrionicantigen-related cell adhesion molecule 1 on murinedendritic cells is a potent regulator of T cellstimulation J. Immunol., 2001, 166, 6537-6544. Kodera Y, Isobe K, Yamauchi M, Satta T,Hasehawa T et al. Expression of carcinoembryoticantigen / CEA and nonspecific crossreacting antigen/NCA/ in gastrointestinal cancer, the correlation withdegree of diferenciation Br. J. Cancer 1993 Jul;68/1/: 130-6. Koido S, Hara E, Homma S. Torii A.Mitsunaga M, Yanagisawa S. et al. StreptococcalPreparation OK-432 promotes fusion efficiency andenhances induction ofh antigen - specific CTL byfusion of dendritic cells and colorectal cancer cells Immunol. 2007 Jan.; 178 (1): 613-22. 9 66049 BI Klein A. Friedtich U, Vogelsang H., JahreisG. Lactobacillus acidophilus 74-2 andBifidobacterium animals subsp lactis DG CC 420modulate unspecific cellular immune response inhealty adults Eur J. Clin. Nutr. 2007 Apr 18. Kuroki M., Kuroki M. Shibaguchi H, BadranA, et al. Strategies to endow cytotoxic Tlymphocytes or natural killer cells with antibodyactivity against carcinoembryonic antigen TumourBiol., 2004 jul-aug; 25(4): 208-16. Kuroki M., Hachimine K, Huang J,Shibaguchi H. Kinugasa T et al. Re-targeting ofcitotoxic T-lymphocytes and/or natural killer cellsto CEA-expressing tumor cell with anti-CEAantibody activity Anticancer Res, 2005 nov dec;25(6A): 3725-32. Kuijper TW, van der Schoot CE, HoogerwertM. Roos D. Cross-linking of the carcinoembrionicantigen-linke glycoproteins CD 66 and CD 67induces neutrophil aggregation J. Immunol. 1993Niov. 1; 15(9): 4934-40. Laack, E., Nikbakht, H., Peters, Kugler, C.,Jasiewicz, Y, et al. Expression of Ceacami 1 Inadenocarcinoma of the lung: a factor of independentprognostic significance J. Clin. Oncol., 2002, 20,4279-4284. Lactoferin & Hammarstrom et al. 1995 /имаизразен антитуморен ефект и върху моноцититеи неутрофилните левкоцити има изразен антиок-сидантен ефект/. Leveugle et al. 1993 / ЛФ стимулира фаго-цитарната активност. Leusch, Н. G., Hefta, S. A., Drzeniek, Z.,Humel, К., Markos-Pusztai, Z., and Wagner, C.Escherichia coli of human origin binds tocarcinoembrionic antigen /СЕА/ and non specificcrossreacting antigen /NCA/ FEBS Lett., 1990,261,405-409. Lee JW. Shin. J. G,, Kim EH., Kang Η. E.,Ym I. B. et al. Imunomodulatory and antitumoreffects in vivo by the citoplasmatic fraction ofLactobacillus and Bifidobacterium longum J. VetSci 2004 Mar, 5(1): 41-8. Li YG. Tian FL, Gao FS, Tang XS, Xia C.Imune response generated by Lactobacillus as acarrier in DNA immunization against foot-and-mouth disease Virus. Vaccine 2007 Jan 15; 25(5); 902-11. Epub2006 Sep 20. Le Leu RK, Brownil, Hu Y, Bird AR, Jackson M. et al. A symbiotic combination of resistant starchand Bifidobacterium Lactis facilitates apoptoticdelecion of carcinogen damaged cells in rat colonJ. Nutr. 2005 May; 135 (5): 996-1001. Manev V. D. Maneva L. Sirakov Effect oflactoferrin on fagocytic activity ofpolymorphonuclear cells isolsted from blood ofpatients with autoimmune diseases andStaphylococcus aureus allergy Adv. Exp. Med.Biol., 1998, 443, 321-330. Manev V. Immunocytoadherent ability of theE-receptor on the T-lymphocytes in the presenceof detergent: difference between norm andpathology Second Balkan Immunology Conference1-4 October 1998 Varna Bulgaria. Matsuzaki T, Yokokura T. Mutai M.Antitumor effect of intrapleural administration ofLactobacillus casei in mice Cancer Immunol.Immunother. 1988; 26 (93): 209-14. Nurmi JT. Puolakkainen PA, Rautonen NE.Bifidobacterium Lactis sp. 420 up - regulatescyclooxygenase /Cox/-12 and down-regulates Cox-2 gene expression in a Caco-2 cellculture modelNutr Cancer. 2005; 5191: 83-92. Manev V. D. Maneva L. Sirakov Effect oflactoferrin on fagocytic activity ofpolymorphonuclear cells isolsted from blood ofpatients with autoimmune diseases andStaphylococcus aureus allergy Adv. Exp. Med.Biol., 1998, 443, 321-330. Manev V. Immunocytoadherent ability of theE-receptor on the T-lymphocytes in the presenceof detergent: difference between norm andpathology Second Balkan Immunology Conference1-4 October 1998 Varna Bulgaria. Silk AW, Finn OL Cancer vaccines: apromising cancer therapy againt all odds. FutureOncol. 2007 Jun, 3(3): 299-306. Manev V. V., D. S. Shishmanov, Μ. H.Karkumov, A. A. Andreev I. P. Prokopiev Inhibitingeffect of the carcinoembryonal antigen in vitro onE-roseting formation in blastoma patients Comptesrendus de L’Academie bulgar des Sciences Tome39, N9, 1986. Mackaness, G. B. Auclair, P. H. LangrangeJ. Natl. Cancer Inst. 51, 1973. Manev V. V, D. S.Shishmanov, Μ. H. Karkumov, A. A. Andreev I. P.Prokopiev Inhibiting effect of the carcinoembryonalantigen in vitro on E-roseting formation in blastomapatients Comptes rendus de L’Academie bulgar des 10 66049 BI Sciences Tome 39, N9, 1986. Mayer A. Francis RG, Sharma SK., TolnerB, Springer CL et al. A Phase I studi of singladministration of antibody-directed enzymeprodrug therapy with the recombinant anti-carcinoembrionic antigen antibody-enzime fusionprotein MFECP1 and a bis-iodo phenol mustardprodrug. Clin. Cancer Res. 2006 Nov 1; 12(21):6509-16. Madan RA. Arlen PM, Guller JL PANVAC-VF: poxviral based vaccine therapy targeting CEAand MUC1 in carcinoma Expert Opin Biol. Thet.2007 Apr; 7(4): 543-54. Mackaness, G. B. Auclair, P. H. LangrangeJ. Natl. Cancer Inst. 51, 1973. Manev V. V., D. S. Shishmanov, Μ. H.Karkumov, A. A. Andreev I. P. Prokopiev Inhibitingeffect of the carcinoembryonal antigen in vitro onE-roseting formation in blastoma patients Comptesrendus de L’Academie bulgar des Sciences Tome39, N9, 1986. Morse MA, Deng Y, Coleman D, Hull S,Kitrell-Fisher E. Nair S, et al. A Phase I study of active immunotherapywith carcinoembryonic antigen peptide /САР-1/pulsed, autologous human cultured dendritic cellin patients with metastatic malignancies expressingcarcinoembrionic antigen Clin. Cancer Res. 1999jun; 5(6) 1331-8. Morse MA, Clay T, Colling K, Lyerly HKPreparation of peptide-loaded dendrided calls forcancer immunotherapy Mol. Biotechnol. 2003 Sep:25(1): 95-9 Paul S. Acres B, Limacher JM,Bonnefoy JY Cancer vaccines: Challenges andoutlook in the field IDrugs, 2007 may, 10(5): 324-8. Madan RA. Arlen PM, Guller JL Panvac-VF:poxviral based vaccine therapy targeting CEA andMUC1 in carcinoma Expert Opin Biol. Thet. 23007Apr; 7(4): 543-54. Nakai N, Asai J, Ueda Е, Takenaka H, KatohN, Kishimot S. Vaccination of Japanese patientswith advanced melanoma with peptide, tumor orboth peptide and tumor lysate-pulsed mature,monocyte-derived dendritic cells J. ermatol. 2006Jul. 33(7): 462-72. Ordonez C., Screaton RA. Ilantzis C.Stanners CP Human carcinoembryonic antigenfunctions as a general inhibitors of anoikis CancerRes., 2000 Jul 1; 60913: 3419-24. Pazdur MP, Jones JL. Vaccines: AnInnovative Approach to Treating Cancer J. InfusNurs. 2007 May/June, 30(3): 173-178. Pazdur MP Vaccunes in The treatment ofcancer / Am. J. Health Syst. Pharm. 1995. Pazdur MP. Vaccine for colorectal cancer /Trends Mol. Med. 2001. Paturi G, Phillips M, Jones M, KailaspathyK Immune enhancing effects of Lactobacillusacidophilus LAFTIL10 and Lactobacillus paracaseiLAFTI in mice Int. J. Food Microbiol. 2007 Apr 1:115-8 Epub 2006 nov. 28. Rother M. Carcinoembryonic antigenmonitoring for early detection of asiptomaticincurable metastatic colorectal cancer J. Clin.Oncol. 2006 Nov 20; 24(33): 5313-27. Sarkar K. Bose A. Lascar S. Choudhuri SK,Dey S., Roychowdhury PK, Baral R. Int.Immunopharmacol. 2007 mar, 7(3): 306-12 Epub2006 Dec 12. Silk AW, Finn OL Cancer vaccines: apromising cancer therapy againt all odds. FutureOncol. 2007 Jun, 3(3): 299-306. Saha A., Bamal RN, Chatteijee SK, et al. CpGoligonucleotides enhance the tumor antigen-specifice immune response of an anti-idiotypeantibody-based vaccine strategy in CEA CancerImmunol. Immunother. 2005 jun 26: 1-13. Saide JA, Gililand SE Antioxidative activityof Lactobacilli measured by oxygen radicalabsorbance capacity J. Dairy Sci 2005 Apr: 88(4):1352-7. Thompson JA., Grunert F. Zimmermann W.Carcinoembrionic antigen gene family: molecularbiology and clinical perspectives J. Clin. Lab. Ann.1991:5(5): 344-66. Virji, M., D., Griffith, J., Hill D., Serino, L.,Hadfied, A. and Watt, S. M. /2000/Carcinoembrionic antigens are targeted by diversestrains of typable and non - typable Hemophillusinfluenzae Mol. Microbiol., 36,784-795. Virji, M., Makepeace, K., Ferguson, D. J.,and Watt, S. M. /1966/ Carcinoembrionic antigen /CD 66/ on epithelial cells and neutrophils arereceptors for Opa proteins of pathogenic neisseriaeMol. Microbiol., 22, 941-950. Virji, M., D., Griffith, J., Hill, D., Serino,L., Hadfied, A. and Watt, S. M. /2000/Carcinoembrionic antigens are targeted by diversestrains of typable and non - typable Hemophillus 11 66049 BI influenzae Mol. Microbiol., 36,784-795. Wang et al. /2000/ Стимулиращ ефект вър- ху клетъчния имунитет при експериментални мо-дели на тумори. William Е. Stawart II Pier De Somer and 5Erik de Clerck Protective effects of anion detergents on interferons: Reversible denaturation BiochemicaActa. 359 /1974/ 364-368. Zhou H. Stanners CP, Fuks A. Specificity ofanti-carcinoembrionic antigen monoclonal antibodiesand their effects on CEA mediated adhesion CancerRes. 1993 Aug 15; 53(16): 3817-22. Издание на Патентното ведомство на Република България1797 София, бул. "Д-р Г. М. Димитров" 52-Б Експерт: Г. Лъжовска Пор. №67111 Тираж: 40 ЗС 12